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TWI633119B - 抗－ｉｌ－３３抗體及其用途 - Google Patents

抗－ｉｌ－３３抗體及其用途 Download PDF

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TWI633119B
TWI633119B TW103108304A TW103108304A TWI633119B TW I633119 B TWI633119 B TW I633119B TW 103108304 A TW103108304 A TW 103108304A TW 103108304 A TW103108304 A TW 103108304A TW I633119 B TWI633119 B TW I633119B
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安德魯 莫菲
尼古拉斯 帕帕多普洛斯
傑米 奧倫哥
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美商再生元醫藥公司
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Abstract

本發明係提供與介白素-33(IL-33)結合之抗體及其使用方法。本發明包括抑制或減弱IL-33-媒介的訊號傳遞之抗體。本發明之抗體可進行阻斷IL-33和ST2間交互作用。另外，特定的本發明抗體係在無阻斷IL-33/ST2相互作用下，抑制或減弱IL-33-媒介的訊號傳遞。根據特定的本發明實施例，此等抗體為以高親和力與人類IL-33結合之全人類抗體。本發明之抗體可用於治療與IL-33訊號傳遞及/或IL-33細胞表現有關的疾病和病症，例如發炎性疾病或過敏性疾病。

Description

抗-IL-33抗體及其用途
本發明係關於對人類IL-33具專一性之抗體、其抗原結合片段及其使用方法。
介白素-33(IL-33)為ST2之配體，一種與輔助蛋白IL-1RAcP(accessory protein)有關之類-toll/介白素-1受體超家族成員(就回顧文獻，參見，例如Kakkar and Lee,Nature Reviews-Drug Discovery 7(10)：827-840(2008),Schmitz等人，Immunity 23：479-490(2005)；Liew等人，Nature Reviews-Immunology 10：103-110(2010)；US 2010/0260770；US 2009/0041718)。當ST2/IL-1RAcP被IL-33活化時，經由下游分子例如MyD88(髓樣分化因子88)和TRAF6(TNF受體相關因子6)引發訊號傳遞集聯，使得(其中包括)NFκB(核因子-κB)活化。IL-33訊號傳遞已意味著為涉及各種疾病和病症之因子(Liew等人，Nature Reviews-Immunology 10：103-110(2010))。
本發明係提供結合人類介白素-33("IL-33")之抗體。本發明之抗體可用於，其中包括，抑制IL-33-媒介的訊號傳遞及用於治療IL-33活性及/或訊號傳遞所造成或與其相關之疾病和病症。
本發明之抗體可為全長(例如，IgG1或IgG4抗體)或可僅包括一抗原結合蛋白(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，及可經修飾以影響功能性，例如消除殘基效應子功能(Reddy等人，2000,J.Immunol.164： 1925-1933)。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體為分離之全長人類單株抗體。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段係抑制或減弱IL-33-媒介的訊號傳遞。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段係阻斷IL-33和ST2之相互作用。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段，如以活體外受體/配體結合分析於25℃所測量，係以低於約10nM之IC50值阻斷IL-33和ST2之相互作用，或阻斷大於約50%之IL-33和ST2的相互作用。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段並未阻斷，或僅部分阻斷IL-33和ST2之相互作用。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段，如以表面電漿共振分析於37℃所測量，係以低於約1nM之結合解離平衡常數(KD)與人類IL-33結合。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段，如以表面電漿共振分析於37℃所測量，係以大於約8分鐘之分離半衰期(t½)與人類IL-33結合。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段係抑制IL-33-媒介的人類嗜鹼性粒細胞之脫粒作用。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段，如以活體外嗜鹼性粒細胞活化試驗(BAT)所測量，係以低於約600pM之IC50值抑制IL-33-媒介的人類嗜鹼性粒細胞之脫粒作用。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段係抑制IL-33-媒介的IFN-γ從人類PBMC產生。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段，如以活體外PBMC IFN-γ產生分析所測量，係以低於約25nM之IC50值抑制IL-33-媒介的IFN-γ從人類PBMC產生。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段，如以活體外PBMC IFN-γ產生分析所測量，係以低於約3nM之IC50值抑制IL-33-媒介的IFN-γ從人類PBMC產生。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段，如以活體外PBMC IFN-γ產生分析所測量，係以低於約0.5nM之IC50值抑制IL-33-媒介的IFN-γ從人類PBMC產生。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段，當投予過敏引發的肺發炎之動物模型時，係降低肺中CD4+ T細胞、嗜酸性粒細胞和ILC2細胞之出現率。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段，當投予過敏原引發的肺發炎之動物模型時，係降低肺中IL-4和IL-5之量。
在一實施例中，專一與人類介白素-33結合之抗體或其抗原結合片段，當投予過敏原引發的肺發炎之動物模型時，相較於接受同型對照抗體之過敏原-挑戰動物，係造成IL-4量至少4倍降低及/或IL-5量至少5倍降低。
本發明係提供包括一重鏈可變區(HCVR)之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區係具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、 210、226、242、258、274、290和308，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供包括一輕鏈可變區(LCVR)之抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區係具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298和316，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供一包括由下列組成之群中選出之HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列對的抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298和308/316。
本發明亦提供一抗體或其抗原結合片段，其係包括一具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)區：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296和314，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列；及具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的輕鏈LDR3(LCDR3)區：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304和322，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列。
在特定的實施例中，此抗體或抗體之抗原結合部分係包括由下列組成之群中選出之HCDR3/LCDR3胺基酸序列對：SEQ ID NO：8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160、 168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、264/272、280/288、296/304和314/322。
本發明亦提供一抗體或其抗原結合片段，其進一步係包括一具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的重鏈CDR1(HCDR1)區：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292和310，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列；具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)區：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294和312，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列；具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的輕鏈CDR1(LCDR1)區：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300和318，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列；及具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的輕鏈CDR2(LCDR2)區：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302和320，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列。
本發明之特定的非限定示例性抗體及其抗原結合片段係包括HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3區，其分別具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列：SEQ ID NO：4-6-8-12-14-16(例如H1M9559N)；20-22-24-28-30-32(例如H1M9566N)；36-38-40-44-46-48(例如H1M9568N)；52-54-56-60-62-64(例如H4H9629P)；68-70-72-76-78-80(例如H4H9633P)；84-86-88-92-94-96(例如H4H9640P)；100-102-104-108-110-112 (例如H4H9659P)；116-118-120-124-126-128(例如H4H9660P)；132-134-136-140-142-144(例如H4H9662P)；148-150-152-156-158-160(例如H4H9663P)；164-166-168-172-174-176(例如H4H9664P)；180-182-184-188-190-192(例如H4H9665P)；196-198-200-204-206-208(例如H4H9666P)；212-214-216-220-222-224(例如H4H9667P)；228-230-232-236-238-240(例如H4H9670P)；244-246-248-252-254-256(例如H4H9671P)；260-262-264-268-270-272(例如H4H9672P)；276-278-280-284-286-288(例如H4H9675P)；292-294-296-300-302-304(例如H4H9676P)；及310-312-314-318-320-322(H1M9565N)。
在一相關的實施例中，本發明係包括專一與IL-33結合之抗體或抗體之抗原結合片段，其中該抗體或片段係包括重鏈和輕鏈CDR區，其係包含在由下列組成之群中選出的重鏈和輕鏈可變區(HCVR/LCVR)序列內：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298和308/316。用於鑑別HCVR和LCVR胺基酸序列內的CDR之方法和技術已為本項技術所熟知並可用於鑑別文中所揭示之特定HCVR及/或LCVR胺基酸序列內的CDR。可用於鑑別CDR範圍之示例性慣用法包括，例如Kabat定義、Chothia定義及AbM定義。一般而言，Kabat定義係以序列的變異性為基礎，Chothia定義係以結構環區域之位置為基礎，而AbM定義為介於Kabat和Chothia方法間之折衷。參見，例如Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。亦可取得公開的資料庫供辨識抗體內的CDR序列。
在另一方面，本發明係提供編碼抗-IL-33抗體或其抗原結合片段之核酸。帶有本發明核酸之重組的表現載體，及其中已導入此等載體之宿主細胞，以及藉由在得以產生抗體之條件下培養宿主細胞，並回收所產生的抗體來製造抗體之方法，亦涵蓋在本發明中。
在一實施例中，本發明係提供包括一HCVR之抗體或其片段，其中該HCVR係由下列組成之群中選出的核酸序列所編碼：SEQ ID NO：1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289和307，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之實質上相同的序列。
本發明亦提供包括一LCVR之抗體或其片段，其中該LCVR係由下列組成之群中選出的核酸序列所編碼：SEQ ID NO：9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297和315，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之實質上相同的序列。
本發明亦提供一抗體或抗體之抗原結合片段，其係包括由SEQ ID NO：7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、295和313組成之群中選出的核苷酸序列或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之實質上相同序列所編碼的HCDR3區；及由SEQ ID NO：15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303和321組成之群中選出的核苷酸序列或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之實質上相同序列所編碼的LCDR3區。
本發明亦提供一抗體或其抗原結合片段，其進一步係包括由SEQ ID NO：3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、 211、227、243、259、275、291和309組成之群中選出之核苷酸序列或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之實質上相同序列所編碼的HCDR1區；由SEQ ID NO：5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293和311組成之群中選出之核苷酸序列或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之實質上相同序列所編碼的HCDR2區；由SEQ ID NO：11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299和317組成之群中選出之核苷酸序列或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之實質上相同序列所編碼的LCDR1區；及由SEQ ID NO：13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301和319組成之群中選出之核苷酸序列或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之實質上相同序列所編碼的LCDR2區。
根據特定的實施例，此抗體或其片段係包括由下列核酸序列所編碼的重鏈和輕鏈CDR：SEQ ID NO：1和9(例如H1M9559N)、17和25(例如H1M9566N)、33和41(例如H1M9568N)、49和57(例如H4H9629P)、65和73(例如H4H9633P)、81和89(例如H4H9640P)、97和105(例如H4H9659P)、113和121(例如H4H9660P)、129和137(例如H4H9662P)、145和153(例如H4H9663P)、161和169(例如H4H9664P)、177和185(例如H4H9665P)、193和201(例如H4H9666P)、209和217(例如H4H9667P)、225和233(例如H4H9670P)、241和249(例如H4H9671P)、257和265(例如H4H9672P)、273和281(例如H4H9675P)、289和297(例如H4H9676P)或307和315(H1M9565N)。
本發明包括具有修飾糖基化模式之抗-IL-33抗體。在某些應 用中，移除不欲的糖基化位置之修飾作用，或寡糖鏈上缺乏岩藻糖基團存在的抗體可能為有用的，例如用以增加抗體依賴的細胞毒殺(ADCC)功能(參見Shield等人(2002)JBC 277：26733)。在其他的應用上，可進行半乳糖基化之修飾作用以修改補體依賴的細胞毒殺作用(CDC)。
在另外方面，本發明係提供包括專一與IL-33結合之重組的人類抗體或其片段及醫藥上可接受載劑的醫藥組成物。在一相關的方面，本發明之特徵為組合抗-IL-33抗體和第二治療劑之組成物。在一實施例中，此第二治療劑為任何有利地與抗-IL-33抗體組合之試劑。可有利地與抗-IL-33抗體組合之示例性試劑係包括(不限於)抑制IL-33活性之其他試劑(包括其他抗體或其抗原結合片段、胜肽抑制劑、小分子拮抗劑等)及/或不會直接與IL-33結合但會干擾、阻斷或減弱IL-33媒介的訊號傳遞之試劑。在一實施例中，此第二治療劑可由下列組成之群中選出：非類固醇抗發炎藥(NSAID)、皮質類固醇、支氣管擴張劑、抗組織胺、腎上腺素、去充血劑、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)拮抗劑、IL-13拮抗劑、IL-4拮抗劑、IL-5拮抗劑、IL-6拮抗劑、IL-25拮抗劑、IL-17拮抗劑及另外的IL-33拮抗劑，或不同的IL-33之抗體。在特定的實施例中，細胞激素拮抗劑可為小分子抑制劑(合成的或天然衍生)，或與細胞激素本身作用之蛋白(例如抗體)，或細胞激素之受體，或包括細胞激素及其受體之複合物(例如抗IL-4或IL-6之抗體，或IL-4或IL-6之受體的抗體)。涉及本發明抗-IL-33抗體之另外的組合治療及共調配物係揭示於文中的他處。
又在另外的方面，本發明係提供使用本發明之抗-IL-33抗體或抗體之抗原結合部分來抑制IL-33活性之治療方法，其中該治療方法係包括投予一治療上有效量之包括本發明抗體或抗體之抗原結合片段的醫藥組成物。所治療的病症為任何藉由移除、抑制或降低IL-33活性或訊號傳遞加 以改善、減輕、抑制或預防之疾病或症狀。本發明之抗-IL-33抗體或抗體片段可進行阻斷IL-33和IL-3結合配偶體(例如IL-33受體組份)之間的相互作用，或另外抑制IL-33的訊號傳遞活性。
在一實施例中，本發明係提供治療發炎性疾病或病症，或至少一種與發炎性疾病或病症有關的癥候之方法，該方法係包括將專一與IL-33結合之抗體或其抗原結合片段，或包括專一與IL-33結合之抗體的醫藥組成物，投予有此需要的病患，其中該發炎性疾病或病症，在發生的嚴重度、持續時間及/或頻率係得以減緩或降低，或至少一種與發炎疾病或病症有關的癥候，在發生的嚴重度、持續時間及/或頻率上係得以減緩或降低。
在一實施例中，發炎性疾病或症狀係由下列組成之群中選出：氣喘、異位性皮膚炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、發炎性腸疾病、多發性硬化症、關節炎、過敏性鼻炎、嗜酸性粒細胞食道炎和乾癬。
在一實施例中，本發明係提供治療對過敏原顯現敏感性之病患的方法，該方法包括將一有效量之專一與IL-33結合的抗體或其抗原結合片段，或包括專一與IL-33結合之抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物，投予有此需要之病患，其中該病患在投予抗體或包括此抗體的組成物後，係對過敏原顯示敏感性降低，或減少對過敏原的過敏反應，或不會經歷任何敏感或過敏(allergic)反應，或過敏性(anaphylactic)反應。
在一實施例中，本發明係提供一有效量之可用於減緩發炎性疾病或病症，或至少一種與發炎性疾病或病症有關的癥候，或減少對過敏原之過敏反應的第二治療劑。如上所示，第二治療劑可由下列組成之群中選出：非類固醇抗發炎藥(NSAID)、皮質類固醇、支氣管擴張劑、抗組織胺、腎上腺素、去充血劑、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)拮抗劑、IL-13拮抗劑、IL-4拮抗劑、IL-5拮抗劑、IL-6拮抗劑、IL-25拮抗劑、IL-17拮抗劑 及另外的IL-33拮抗劑，或不同的IL-33之抗體。
在一相關的方面，本發明係提供本發明之抗IL-33抗體或其抗原結合片段，或包括此抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物，供於一病患中用於治療與IL-33活性有關或由其所造成之疾病或病症。在一實施例中，病患中與IL-33活性有關或由其所造成之疾病或病症為發炎性疾病或病症，其中該發炎性疾病或病症係由下列組成之群中選出：氣喘、異位性皮膚炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、發炎性腸疾病、多發性硬化症、關節炎、過敏性鼻炎、嗜酸性粒細胞食道炎和乾癬。
本發明亦包括本發明之抗-IL-33抗體或抗體之抗原結合部份用於製造醫藥品供治療一病患中與IL-33活性有關或由其所造成之疾病或病症之用途。在一實施例中，一病患中與IL-33活性有關或由其所造成之疾病或病症為發炎性疾病或病症，其中該發炎性疾病或病症係由下列組成之群中選出：氣喘、異位性皮膚炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、發炎性腸疾病、多發性硬化症、關節炎、過敏性鼻炎、嗜酸性粒細胞食道炎和乾癬。
從確認詳細說明之論述中其他的實施例將變得顯而易見。
詳細說明
在描述本發明之前，應了解，本發明不限於所述的特定方法和實驗條件，因為此等方法和條件可改變。亦應了解，文中所用的術語僅作為描述特定實施例之目的，且不希望受限，因為本發明之範圍將僅受限於所附的申請專利範圍。
除非另有說明，否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本發明所屬技術之一般技術者所正常理解之相同意義。如文中所用，術語「大約」當用於有關特定引述的數值時，係指該值可從該引述值做不大於1%的變化。例如，如文中所用，「約100」一詞係包括99和101及所有 介於之間的值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
雖然在施行或試驗本發明時可使用任何該等與文中所述的方法和物質類似或相當者，但較佳的方法和物質為目前所述。
定義
詞語「介白素-33」、「IL-33」及其類似詞語，如文中所用，係指具有SEQ ID NO：307胺基酸序列之人類IL-33蛋白。除非明確地指出係來自非人類物種(例如「小鼠IL-33」、「猴子IL-33」等)，否則所有關於文中之蛋白、多肽和蛋白片段希望係指人類版本的各蛋白、多肽和蛋白片段。
如文中所用，「與IL-33結合之抗體」或「抗-IL-33抗體」係包括與IL-33蛋白之可溶性片段結合之抗體及其抗原結合片段。可溶性IL-33分子包括天然的IL-33蛋白及重組的IL-33蛋白變體，例如單一和二聚化IL-33構造。
術語「抗體」如文中所用，係指包括至少一個與特定抗原(例如IL-33)專一結合或相互作用之互補決定區(CDR)的任何抗原結合分子或分子複合物。術語「抗體」係包括：包含藉由雙硫鍵相連接的四條多肽鏈(二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈)之免疫球蛋白分子以及其多聚體(例如IgM)。各重鏈係包括一重鏈可變區(文中縮寫為HCVR或VH)及一重鏈恆定區。重鏈恆定區係包括三個區，CH1、CH2和CH3。各輕鏈係包括一輕鏈可變區(文中縮寫為LCVR或VL)及一輕鏈恆定區。輕鏈恆定區係包括一個區(CL1)。VH和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著較保守性區域，稱為框架區(FR)。各VH和VL係由三個CDR和四個FR所組成，以下列順序由胺基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明不同的實施例中，抗-IL-33抗體(或其抗原結合部分)之FR 可與人類生殖系序列相同，或可為天然的或經人工修飾。胺基酸共有序列可以二或多個CDR之並排(side-by-side)分析為基準來定義。
術語「抗體」，如文中所用，亦包括全抗體分子之抗原結合片段。術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」等等，如文中所用，包括任何與抗原專一性結合形成複合物之天然生成、酵素製得、合成或基因工程化的多肽或糖蛋白。抗體之抗原結合片段可使用任何適合的標準技術，例如蛋白質水解消化作用或涉及編碼抗體可變區和(視需要)恆定區之DNA操作和表現的重組基因工程技術，衍生自例如全抗體分子。此DNA為已知的及/或可容易地從例如市面來源、DNA資料庫(包括，例如噬菌體-抗體資料庫)取得或可經合成。此DNA可用化學或藉由使用分子生物技術來定序和操作，例如將一或多個可變及/或恆定區排列成適合的組態，或導入密碼子，產生半胱胺酸殘基，修飾、增添或刪除胺基酸等。
抗原結合片段之非限定實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模擬抗體高變區之胺基酸殘基所組成的最小識別單位(例如分離的互補決定區(CDR)，例如CDR3胜肽)或限制性FR3-CDR3-FR4胜肽。其他工程化分子，例如區域專一性抗體、單區抗體、區域刪除抗體、嵌合抗體、CDR-嫁接抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小模組免疫醫藥(SMIP)及鯊可變IgNAR區，亦涵蓋在文中所用的「抗原結合片段」之詞語內。
抗體之抗原結合片段典型地將包括至少一可變區。可變區可為任何大小或胺基酸組成之區域且一般應包括與一或多個框架序列相鄰或在其框架內之CDR。在具有VL區與VH區結合之抗原結合片段中，VH和VL區可以任何適合的排列位於彼此相對處。例如可變區可為二聚化並含有 VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。另外，抗體之抗原結合片段可含有單一VH或VL區。
在特定的實施例中，抗體之抗原結合片段可含有至少一個可變區與至少一個恆定區共價連接。在本發明之抗體的抗原結合片段內可發現的可變區和恆定區之非限定、示例性組態包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在任何可變區和恆定區之組態中，包括上列任何的示例性組態，可變區和恆定區可直接彼此相連接或可藉由完整或部分的絞鏈區或連接子區相連接。絞鏈區可由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所組成，使其在單一多肽分子中相鄰的可變及/或恆定區間產生柔性和半柔性連結。再者，在本發明之抗體的抗原結合片段可包括以非共價彼此相互連結及/或與一或多個單一VH或VL區相連結(例如以雙硫鍵)之任何上列的可變和恆定區組態之同源二聚體或異源二聚體(或其他多聚體)。
如同全抗體分子，抗原結合片段可為單專一性或多專一性(例如雙專一性)。抗體之多專一性抗原結合片段典型地應包括至少二個不同的可變區，其中各可變區能專一與個別的抗原結合或與相同抗原上不同的表位結合。任何多專一性抗體型式，包括文中所揭示的示例性雙專一性抗體型式，可使用本項技術中可取得的習用技術來改造，使其適用於本發明抗體之抗原結合片段狀況。
本發明之抗體可經由補體-依賴的細胞毒殺作用(CDC)或抗體-依賴的細胞媒介之細胞毒殺作用(ADCC)來作用。「補體-依賴的細胞毒殺作用(CDC)」係指在補體的存在下藉由本發明之抗體解離抗原-表現細胞。 「抗體-依賴的細胞媒介之細胞毒殺作用(ADCC)」係指細胞媒介的反應，其中表現Fc受體(FcR)之非專一性細胞毒性細胞(例如天然的殺手(NK)細胞、嗜中性細胞和巨噬細胞)辨識出目標細胞上的結合抗體並據此導致目標細胞的解離。CDC和ADCC可使用本項技術所熟知和可取得的分析來測量。(參見，例如美國專利第5,500,362號和第5,821,337號，及Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656)。抗體的恆定區對於抗體固定補體和媒介細胞-依賴的細胞毒殺作用之能力很重要。因此，同型之抗體可依其是否為抗體所欲的媒介細胞毒殺作用為基準來選擇。
在本發明特定的實施例中，本發明之抗-IL-33抗體為人類抗體。術語「人類抗體」，如文中所用，希望係包括具有衍生自人類生殖系列免疫球蛋白序列之可變區和恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(例如藉由隨機或活體外位置專一性誘變所導入之突變或活體內體細胞突變)，例如在CDR中及特別是CDR3。然而，術語「人類抗體」，如文中所用，不希望包括其中衍生自另外哺乳動物物種(例如小鼠)之生殖系的CDR序列已稼接在人類框架序列上之抗體。
本發明之抗體，在某些實施例中可為重組的人類抗體。術語「重組的人類抗體」，如文中所用，希望包括藉由重組方法，例如使用重組的表現載體轉染至宿主細胞(進一步詳述於下)所製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，由重組的組合人類抗體庫(進一步詳述於下)分離出之抗體，由經轉殖人類免疫球蛋白基因之動物(例如小鼠)分離出的抗體(參見，例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列與DNA序列拼接之方法所製備、表現、產生或分離之抗體。此等重組的人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可 變區和恆定區。然而，在特定的實施例中，此等重組的人類抗體係在活體外經誘發突變(或當使用以人類Ig序列基因轉殖之動物時，為活體內體細胞誘發突變)，且因此重組抗體之VH和VL區的胺基酸序列(當衍生自人類生殖系VH和VL序列或與其有關時)其為可能非天然存在於活體內人類抗體生殖系庫中之序列。
人類抗體可以二種與絞鏈異質性有關之形式存在。第一種形式，包括約150-160kDa之安定四鏈結構的免疫球蛋白分子，其中此二聚體係藉由鏈間重鏈雙硫鍵聚集一起。第二種形式，二聚體並非經由雙硫鍵相連接且約75-80kDa之分子係由共價偶合的輕鏈和重鏈(半抗體)所組成。這些形式極難分離，即使在親和純化後。
在各種完整的IgG同型中，第二種形式出現的頻率係由於(但不限於)與抗體之絞鏈區同型有關之結構差異所致。在人類IgG4絞鏈之絞鏈區中單一胺基酸取代可顯著地降低第二種形式出現(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30：105)至典型地使用人類IgG1絞鏈所觀察到的程度。本發明係涵蓋絞鏈、CH2或CH3區中具有一或多個突變之抗體，該突變例如在製造上可能為所希望的，用以改善所欲的抗體形式之產率。
本發明之抗體可為分離的抗體。「分離的抗體」，如文中所用，係指經鑑定及從至少一種其天然環境之組成份分離及/或回收之抗體。例如，從至少一種生物體，或從組織或細胞之組成份分離或移出之抗體，其中就本發明之目的，該存在自然界或為自然產生的抗體為一「分離的抗體」。分離的抗體亦包括重組細胞內原位抗體。分離的抗體為歷經至少一純化或分離步驟之抗體。根據特定的實施例，分離的抗體可能實質上無其他細胞物質及/或化學物。
本發明係包括中和及/或阻斷抗-IL-33抗體。「中和」或「阻 斷」抗體，如文中所用係指與IL-33A結合之抗體，其：(i)干擾IL-33或IL-33片段與IL-33受體組份(例如ST2、IL-1RAcP等)間的相互作用；及/或(ii)產生抑制至少一種IL-33生物功能。由IL-33之中和或阻斷抗體所造成的抑制作用不需完整，只要可使用適當的分析偵測即可。用於偵測IL-33抑制作用之示例性分析係描述於文中之操作實例中。
相較於可從其衍生抗體之對應的生殖系序列，文中所揭示的抗-IL-33抗體可在重鏈和輕鏈可變區之框架及/或CDR區中包括一或多個胺基酸取代、插入及/或刪除。此等突變可藉由將文中所揭示之胺基酸序列與得自，例如公開的抗體序列資料庫之生殖系序列相比較，容易地確定。本發明包括由任何文中所揭示的胺基酸序列所衍生之抗體及其抗原結合片段，其中在一或多個框架及/或CDR區中的一或多個胺基酸係突變成從其衍生抗體之生殖系序列的對應殘基，或另一種人類生殖系序列之對應殘基，或對應生殖系殘基之保守胺基酸取代(此等序列之改變在文中統稱為「生殖系突變」)。本項技術之一般技術者，由文中所揭示之重鏈和輕鏈可變區序列開始，可容易地製造許多包括一或多個個別的生殖系突變或其組合之抗體和抗原結合片段。在特定的實施例中，VH及/或VL區內的所有框架及/或CDR殘基係突變回到衍生此抗體之原始生殖系序列中所發現的殘基。在其他實施例中，僅特定的殘基突變回到原始的生殖系序列，例如僅在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中發現突變的殘基，或僅在CDR1、CDR2或CDR3內發現突變的殘基。在其他的實施例中，一或多個框架及/或CDR殘基係突變成不同生殖系序列之對應殘基(亦即與最初從其衍生抗體之生殖系序列不同的生殖系序列)。再者，本發明之抗體在框架及/或CDR區內可含有任何二或多個生殖系突變之組合，例如，其中特定的個別殘基係突變成特定生殖系序列之對應殘基，而與原始生殖系序列不同的其他殘 基係維持原樣或突變成不同生殖系序列之對應殘基。一旦得到後，含有一或多個生殖系突變之抗體和抗原結合片段可容易地測試其一或多種所欲的性質，例如結合專一性改善、結合親和力增加、拮抗或促效性生物性質改善或增進(視情況而定)、致免疫力降低等。以此通用方法所得的抗體和抗原結合片段係涵蓋在本發明中。
本發明亦包括抗-IL-33抗體，其包含任何具有一或多個保守取代之文中所揭示的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的變體。例如，本發明包括抗-IL-33抗體，其相對於文中所揭示之任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列，係具有含例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少之保守性胺基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列。
術語「表位」係指與抗體分子可變區中稱為補位(paratope)的特定抗原結合位置相互作用之抗原決定位。單一抗原可具有一個以上的表位。因此，不同的抗體可與抗原上不同的區域結合並可具有不同的生物效應。表位可為構型或線性。構型表位係由直鏈多肽鏈不同線段之空間上並列的胺基酸所產生。線性表位係由多肽鏈相鄰的胺基酸殘基所產生。在特定的情況下，表位可包括抗原上的醣類基團、磷醯基或磺醯基。
術語「實質類似」或「實質上類似」係指二個胜肽序列，當以GAP或BESTFIT程式使用內建缺位權重最佳化對齊時，享有至少95%序列一致性，甚佳地至少98%或99%序列一致性。較佳地，不同的殘基位置係相差在保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」為其中一胺基酸殘基係經另一帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)側鏈(R基)之胺基酸殘基所取代。一般而言，保守性胺基酸取代實質上不會改變蛋白的功能特性。在其中彼此有二或多個保守性取代之不同胺基酸序列的案例中，可上調序列一致性之百分比或類似程度以修正此取代作用之保守性質。調整之方法 已為熟習本項技術者所熟知。參見，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331。具有類似化學性質之側鏈的胺基酸基團實例包括(1)脂系側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂系-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含醯胺側鏈：天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；(4)芳香側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側鏈：天門冬胺酸和麩胺酸，及(7)含硫側鏈有半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸取代基群有：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。另外，保守性置換為在Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445所揭示的PAM250對數似然矩陣中具有正值之任何變化。「中度保守性」置換為在PAM250對數似然矩陣中具有非負值之任何變化。
多肽之序列類似性，其亦指序列一致性，典型地係使用序列分析軟體來測量。蛋白分析軟體使用分配至各種取代、刪除和其他修飾作用(包括保守性胺基酸取代)之類似度量值配出類似的序列。例如，GCG軟體含有例如Gap和Bestfit程式，其可使用內定參數，測定密切相關的多肽間，例如來自不同生物物種之同源多肽，或野生型和其突變蛋白間之序列同源性或序列一致性。參見，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA，利用內定或建議參數，一種GCG Version 6.1內的程式，作比較。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查詢序列和搜尋序列間最佳重疊區之比對和序列一致性百分比(Pearson(2000)supra)。當本發明序列與含有較大量來自不同生物體的序列資料庫作比較時，另一較佳的演算法為使用內定參數之電腦程式BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN。參見，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402。
「發炎性疾病或病症」如文中所用，係指其中病理係全部或部份由例如免疫系統細胞之數目改變、遷移速率改變或活化改變所造成之疾病、病症或病理狀態。免疫系統之細胞係包括，例如T細胞、B細胞、單核細胞或巨噬細胞、抗原呈現細胞(APC)、樹突細胞、微膠細胞、NK細胞、嗜中性細胞、嗜酸性細胞、肥大細胞或其他特別與免疫學有關的細胞，例如產生細胞激素之內皮或表皮細胞。如文中所用，在一實施例中，「發炎性疾病或病症」為由下列組成之群中選出之免疫病症或症狀：氣喘(包括類固醇阻抗氣喘、類固醇敏感性氣喘、嗜酸性粒細胞氣喘或非-嗜酸性粒細胞氣喘、過敏、過敏、多發性硬化症、發炎性腸病症(例如克隆氏症或潰瘍性大腸炎)、慢性阻塞性肺疾病(COPD，其可能與吸菸或暴露於二手菸有關或無關，或部份由其所造成)、狼瘡、異位性皮膚炎、乾癬、硬皮病及其他纖維化疾病、修格連氏症候群(貝西氏病、巨細胞血管炎、過敏性紫斑症(Henoch-Schonlein purpura)和Churg Strauss症候群)和關節炎。在另外的實施例中，關節炎係由類風濕性關節炎、骨關節炎和乾癬性關節炎組成之群中選出。在另外的實施例中，「發炎性疾病或病症」為一包括TH1-型反應或TH2-型反應之免疫病症或症狀。
「抑制或減弱IL-33-媒介的訊號傳遞」，如文中所用，係指相對於在缺乏拮抗劑例如文中所述之IL-33抗體的存在下，IL-33經由ST2和IL-1RAcP刺激訊號轉導之程度，其在拮抗劑例如文中所述之IL-33抗體的存在下，IL-33經由ST2和IL-1RAcP刺激訊號轉導之程度減低。就檢測抑制之程度，係將樣本以可能的抑制劑/拮抗劑處理並與無抑制劑/拮抗劑之對照樣本相比較。對照樣本，亦即未經拮抗劑處理，係指定為100%之相對活性值。當相對於對照組其活性值為約90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%或20%或更低時，即達到 抑制作用。抑制作用之終點指標可包括測定發炎或細胞之脫粒、分泌或活化作用，例如細胞激素釋放之量或百分比。抑制IL-33經由ST2和IL-1RAcP之訊號轉導可以活體外分析藉由針對IL-33訊號轉導之分析來測定，例如實例6中所述。此外，活體內分析可用於測定一分子是否為IL-33之拮抗劑。例如，活體內分析，如實例11和12中所描述，可於同型表現人類IL-33之過敏原-敏化動物的肺發炎上用於評估抗體對IL-33之效應。在以過敏原敏化動物後，將一亞群的動物以本發明之抗-IL-33抗體或負性同型對照抗體處理。之後，將動物安樂死並收取肺供細胞浸潤評估，以及測量細胞激素(IL-4和IL-5)。肺中發炎細胞趨向減少，以及細胞激素例如IL-4和IL-5趨向降低，應可證明IL-33抗體可有效作為拮抗劑。
抗體之生物特性
本發明包括與人類IL-33結合及抑制或減弱IL-33-媒介的訊號傳遞之抗-IL-33抗體及其抗原結合片段。若此抗體具有一或多種由下列組成之群中選出之特性，則此抗-IL-33抗體係視為「抑制或減弱IL-33-媒介的訊號傳遞」：(1)於一細胞為基礎的生物分析中抑制IL-33媒介的訊號傳遞；(2)抑制IL-33-引發的人類嗜鹼性粒細胞之脫粒作用；(3)抑制IL-33-引發的IFNγ從人類PBMC產生；(4)降低一動物中因暴露於過敏原所導致之細胞激素量升高，例如IL-4或IL-5；及(5)抑制因急性或慢性暴露於過敏原(例如塵蟎(HDM))所產生之肺發炎。
於細胞為基礎的生物分析中抑制IL-33-媒介的訊號傳遞係指，抗-IL-33抗體或其抗原結合片段抑制或降低一表現IL-33受體之細胞及回應IL-33結合產生可偵測訊號之受體元件中所產生的訊號，例如使用如文中實例6中所定義之分析形式或實質上類似的分析。例如，本發明包括，如以細胞為基礎的阻斷分析中使用如文中實例5所定義的分析形式或實質 上類似的分析所測量，係以低於約2nM，低於約1nM，低於約900pM，低於約800pM，低於約700pM，低於約600pM，低於約500pM，低於約400pM，低於約350pM，低於約300pM，低於約250pM，低於約200pM，低於約150pM，低於約100pM，低於約90pM，低於約80pM，低於約70pM，低於約60pM，低於約50pM，低於約40pM，低於約30pM，低於約20pM或低於約10pM之IC50，於表現ST2之細胞中阻斷IL-33-媒介的訊號傳遞之抗體及其抗原結合片段。
抑制IL-33-引發的人類嗜鹼性粒細胞之脫粒作用係指，例如使用實例7之分析系統或實質上類似的分析所測量，抗-IL-33抗體或其抗原結合片段於活體外抑制或降低IL-33-引發的嗜鹼性粒細胞脫粒。例如，本發明係包括，如以活體外人類嗜鹼性粒細胞脫粒分析中使用如文中實例7所定義的分析形式或實質上類似的分析所測量，係以低於約500pM，低於約400pM，低於約350pM，低於約300pM，低於約250pM，低於約200pM，低於約150pM，低於約100pM，低於約90pM，低於約80pM，低於約70pM，低於約60pM，低於約50pM，低於約40pM，低於約30pM，低於約20pM或低於約10pM之IC50，在人類IL-33之存下抑制人類嗜鹼性粒細胞脫粒(例如，約100pM最終濃度)之抗體及其抗原結合片段。。
抑制IL-33-引發的IFNγ從人類PBMC產生係指，如使用實例8之分析系統或實質上類似的分析所測量，抗-IL-33抗體或其抗原結合片段抑制或降低在人類IL-12之存在下從經人類IL-33處理之PBMC中所釋放的IFNγ。例如，本發明係包括，如以IL-33-引發的IFNγ釋放分析中(例如)使用如文中實例8所定義的分析形式或實質上類似的分析所測量，係以低於約50nM，低於約25nM，低於約20nM，低於約15nM，低於約10nM，低於約5nM，低於約1nM，低於約900pM，低於約800pM，低於約700pM， 低於約600pM，低於約500pM，低於約400pM或低於約300pM之IC50，在人類IL-12之存在下抑制IL-33引發的IFNγ釋放之抗體及其抗原結合片段。
在特定的實施例中，本發明之抗-IL-33抗體及抗原結合片段係阻斷IL-33與IL-33受體(例如ST2)之結合。例如，本發明係包括，如藉由ELISA-為基礎的免疫分析，例如使用文中實例4所定義的分析形式或實質上類似的分析所測量，以低於約15nM之IC50值於活體外阻斷IL-33與ST2結合之抗-IL-33抗體。在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如藉由ELISA-為基礎的免疫分析，例如使用文中實例4所定義的分析形式或實質上類似的分析所測，係以低於約10nM，低於約5nM，低於約900pM，低於約800pM，低於約700pM，低於約600pM，低於約500pM，低於約400pM，低於約300pM，低於約280pM，低於約260pM，低於約250pM，低於約240pM，低於約230pM，低於約220pM，低於約200pM，低於約180pM，低於約160pM或低於約150pM之IC50值於活體外阻斷IL-33與ST2結合。
然而，在其他的實施例中，本發明之特定的抗-IL-33抗體及抗原結合片段，雖然具有抑制或減弱IL-33-媒介的訊號傳遞之能力，但不會阻斷或僅部分阻斷IL-33和ST2之相互作用。此等抗體及其抗原結合片段，在文中可稱為「間接阻斷劑」。不受限於理論，咸信本發明之間接阻斷劑係藉由與IL-33之ST2-結合區重疊、僅部分重疊的表位上與IL-33結合來進行其作用，但在無直接阻斷IL-33/ST2相互作用下，干擾IL-33-媒介的訊號傳遞。
本發明包括以高親和力與可溶性IL-33分子結合之抗-IL-33抗體及其抗原結合片段。例如，本發明包括抗體及抗體之抗原結合片段， 其如藉由表面電漿共振，例如使用文中實例3所定義的分析形式所測量(例如於25℃或37℃)，係以低於約10nM之KD與IL-33結合。在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如以表面電漿共振，例如使用文中實例3所定義的分析形式或實質上類似的分析所測量，係以低於約5nM，低於約2nM，低於約1nM，低於約800pM，低於約600pM，低於約500pM，低於約400pM，低於約300pM，低於約200pM，低於約180pM或低於約160pM之KD與IL-33結合。
本發明亦包括抗-IL-33抗體及其抗原結合片段，其如藉由表面電漿共振於25℃或37℃，例如使用文中實例3所定義的分析形式或實質上類似的分析所測量，係以大於約10分鐘之解離半衰期(t½)與IL-33專一結合。在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如藉由表面電漿共振於25℃或37℃，例如使用文中實例3所定義的分析形式或實質上類似的分析所測量，係以大於約20分鐘，大於約30分鐘，大於約40分鐘，大於約50分鐘，大於約60分鐘，大於約70分鐘，大於約80分鐘，大於約90分鐘，大於約100分鐘之t½與IL-33結合。
本發明之抗體可具有一或多種前述生物特性或其任何組合。本發明抗體之其他的生物特性，熟習技術之一般技術者由包括文中操作實例之本揭示文的論述中，應顯而易見。
包括Fc變體之抗-IL-33抗體
根據本發明特定的實施例，係提供包括一Fc區之抗-IL-33抗體，而該Fc區係包括一或多個，例如相較於中性pH，於酸性pH時增進或減低抗體與FcRn受體結合之突變。例如，本發明係包括於Fc區域之CH2或CH3區包括一突變之抗-IL-33抗體，其中該突變係增加Fc區於酸性環境中對FcRn之親和力(例如於其中pH範圍約5.5至約6.0之核內體中)。此突 變可在投予動物時使抗體之血清半衰期增加。此等Fc修飾之非限定實例包括，例如於位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)之修飾；或位置428及/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如H/F或Y)之修飾；或位置250及/或428之修飾；或位置307或308(例如308F,V308F)和434之修飾。在一實施例中，此修飾係包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾(例如T250Q and M428L)；以及307及/或308修飾(例如308F或308P)。又在另外的實施例中，此修飾係包括265A(例如D265A)及/或297A(例如D297A)修飾。
例如，本發明係包括包含一Fc區之抗-IL-33抗體，而該Fc區係包括一或多對(或組)由下列組成之群中選出的突變：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；以及433K和434F(例如H433K和N434F)。所有可能的前述Fc區突變之組合，及其他揭示於文中之抗體可變區內的突變係涵蓋在本發明之範圍內。
本發明亦包括包含嵌合重鏈恆定(CH)區之抗-IL-33抗體，其中該嵌合CH區係包括衍生自一個以上的免疫球蛋白同型之CH區的片段。例如，本發明之抗體可包括一嵌合的CH區，其係包括部份或全部衍生自人類IgG2或人類IgG4分子之CH2區，與部份或全部衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4分子之CH3區組合。根據特定的實施例，本發明之抗體係包括一具有嵌合絞鏈區之嵌合CH區。例如，嵌合絞鏈可包括一衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4絞鏈區之「上絞鏈」序列(根據EU編號， 從位置216至227之胺基酸殘基)，與衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4絞鏈區之「下絞鏈」序列(根據EU編號，從位置228至236之胺基酸殘基)組合。根據特定的實施例，此嵌合絞鏈係包括衍生自人類IgG1或人類IgG4上絞鏈之胺基酸殘基以及衍生自人類IgG2下絞鏈之胺基酸殘基。包括如文中所述之嵌合CH區的抗體，在特定的實施例中，在對抗體之治療或藥物動力學性質無不利的影響下，可具有修飾的Fc效應子功能。(參見，例如2013年2月1日申請的美國臨時申請案第61/759,578號)。
表位定位及相關技術
本發明係包括與一或多個IL-33之胺基酸相互作用之抗-IL-33抗體。例如，本發明係包括與位於IL-33之ST2-相互作用區內的一或多個胺基酸相互作用之抗-IL-33抗體。與抗體結合之表位可由3或更多個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個)的IL-33胺基酸之單一連續序列所組成。另外，表位可由多數個IL-33之非連續胺基酸(或胺基酸序列)所組成。
各種本項技術之一般技術者已知的技術皆可用於測定抗體是否與多肽或蛋白內的「一或多個胺基酸相互作用」。示例的技術包括，例如，如如描述於Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中之習用交叉阻斷分析，丙胺酸掃描突變分析、胜肽墨點分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248：443-463)及胜肽裂解分析。此外，可使用例如表位切除、表位萃取及抗原之化學修飾等方法(Tomer,2000,Protein Science 9：487-496)。可用於辨識多肽內與抗體相互作用之胺基酸的另外方法係以質譜偵測氫/氘交換。一般而言，氫/氘交換方法係包括以氘標定有關的蛋白，接著讓抗體與氘標定的蛋白結合。接著，將蛋白/抗體複合物轉置於水中，讓除了受抗體保護的殘基(其仍為氘標定)以外的所有 殘基發生氫-氘交換。解離抗體後，將目標蛋白以蛋白酶裂解並以質譜分析，藉此找出氘標定殘基，其係相當於與抗體相互作用之專一性胺基酸。參見，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。
本發明進一步係包括與任何文中所述之特定示例性抗體相同之表位結合的抗-IL-33抗體(例如H1M9559N、H1M9566N、H1M9568N、H4H9629P、H4H9633P、H4H9640P、H4H9659P、H4H9660P、H4H9662P、H4H9663P、H4H9664P、H4H9665P、H4H9666P、H4H9667P、H4H9670P、H4H9671P、H4H9672P、H4H9675P、H4H9676P、H1M9565N等)。同樣的，本發明亦包括與任何文中所述之特定示例性抗體(例如H1M9559N、H1M9566N、H1M9568N、H4H9629P、H4H9633P、H4H9640P、H4H9659P、H4H9660P、H4H9662P、H4H9663P、H4H9664P、H4H9665P、H4H9666P、H4H9667P、H4H9670P、H4H9671P、H4H9672P、H4H9675P、H4H9676P、H1M9565N等)競爭與IL-33相結合之抗-IL-33抗體。
藉由使用本項技術中已知及文中作為示例的習用方法，可容易地測定一抗體是否與參照的抗-IL-33抗體相同之表位結合或是與其競爭結合。例如，測定試驗抗體是否與本發明之參照抗-IL-33抗體上相同的表位結合，首先係讓參照抗體與IL-33蛋白結合。接著，評估試驗抗體與IL-33分子結合之能力。若試驗抗體在與參照的抗-IL-33抗體飽和結合後，能與IL-33結合，則其可結論出，該試驗抗體係與參照的抗-IL-33抗體不同的表位結合。另一方面，若試驗抗體在與參照的抗-IL-33抗體飽和結合後，不能與IL-33分子結合，則試驗抗體可能與和本發明之參照的抗-IL-33抗體結合的表位相同之表位結合。然後可進行另外例行的實驗(例如胜肽突變和結合分析)，以確定所觀察到無試驗抗體結合是否事實上係由於與和參照抗體相 同的表位結合所致，或是否係因立體阻斷(或另外的現象)造成無觀察到結合。此類實驗可使用ELISA、RIA、Biacore、流式細胞儀或本項技術中可取得的另外其他量性或質性抗體-結合分析來進行。依照本發明特定的實施例，如於競爭性結合分析中所測，若例如一1-、5-、10-、20-或100-倍過量的抗體抑制另一抗體之結合至少50%，但較佳地75%、90%或甚至99%，則二種抗體係與相同(或重疊)的表位結合(參見，例如Junghans等人，Cancer Res.1990 50：1495-1502)。另外，若基本上降低或消除一抗體之結合的抗原中所有的胺基酸突變，係降低或消除另一種抗體之結合，則二種抗體被認為係與相同的表位結合。若僅一亞群降低或消除一抗體結合之胺基酸突變降低或消除另一種抗體之結合，則二種抗原結合蛋白被認為具有「重疊的表位」。
為了測定一抗體是否與參照的抗-IL-33抗體競爭結合(或交叉競爭結合)，係以二個方向進行上述結合方法：第一個方向：讓參照的抗體在飽和的條件下與IL-33蛋白結合，接著評估試驗抗體與IL-33分子之結合。第二個方向：讓試驗抗體在飽和的條件下與IL-33分子結合，接著評估參照的抗體與IL-33分子之結合。若在二個方向中，僅有第一(飽和)抗體能與IL-33分子結合，則結論出試驗抗體係和參照的抗體競爭與IL-33結合。本項技術之一般技術者應了解，與參照的抗體競爭結合之抗體可能不一定係與參照抗體相同之表位結合，但可能係藉由與重疊或相鄰的表位結合，在立體上阻斷參照抗體之結合。
製備人類抗體
用於製造單株抗體，包括全人類單株抗體之方法已為本項技術所知。任何此等已知的方法可用於本發明內文中來製造專一與人類IL-33結合之人類抗體。
例如，使用VELOCIMMUNETM技術，或用於產生全人類單株抗體之任何其他已知方法，起初先分離對IL-33具高親和力之具有人類可變區和小鼠恆定區的嵌合抗體。如下文實驗部分，將抗體定性並就所欲的特性作選擇，包括親和力、選擇性、表位等。若需要，以所欲的人類恆定區置換小鼠恆定區，例如野生型或經修飾的IgG1或IgG4，產生全人類抗-IL-33抗體。及/或輕鏈其可併入本發明之雙專一性抗原結合分子中。當所選的恆定區可根據特定的用途改變時，高親和力抗原-結合和目標特異性特性係留在可變區中。在特定情況下，全人類抗-IL-33抗體係直接由抗原-陽性的B細胞分離出。
生物等效性
本發明之抗-IL-33抗體及抗體片段係涵蓋具有與所述的抗體不同但保留與人類IL-33結合能力之胺基酸序列的蛋白。此等變異抗體及抗體片段，當與親代序列相比較時，係包括一或多個胺基酸之添加、刪除或取代，但具有與所述的抗體基本上相當之生物活性。同樣的，本發明之編碼抗-IL-33抗體的DNA序列，當與所揭示的序列相比較時，係涵蓋包括一或多個核苷酸之添加、刪除或取代之序列，但編碼抗-IL-33抗體或抗體片段者其基本上與本發明之抗-IL-33抗體或抗體片段為生物等效的。此等變異的胺基酸和DNA序列之實例係如上所論述。
二種抗原結合蛋白或抗體，若例如其為醫藥同等物或醫藥替代品，當於類似的實驗條件下以單一劑量或多劑量之相同的莫耳劑量投予時，其吸收速率和程度並無顯示顯著的差異，則係視為生物等效的。某些抗體若其吸收程度相當但是吸收速率不同應可視為等效物或醫藥替代品，且仍可視為生物等效，因為此等吸收速率上的差異為故意的並反映在標示上，對於達到例如長期使用之有效體藥濃度並非必要的，且就特定藥物產 品的研究上被視為無醫療上的顯著性。
在一實施例中，二種抗原結合蛋白若在其安全性、純度及效力上不具有臨床上有意義的差異，則為生物等效的。
在一實施例中，二種抗原結合蛋白，若相較於無此變更之持續治療，病患可在參照產品和生物產品間作一或多次變更而無預期的有害效應之風險增加(包括臨床上致免疫性之明顯改變或效用減低)，則為生物等效的。
在一實施例中，若二種抗原結合蛋白係藉由共同的機制或作用機制作用於症狀或所用症狀，而達到此等機制已知的程度，則二者係為生物等效的。
生物等效性可藉由活體內和活體外方法來驗證。生物等效性測量包括，例如(a)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中係測量血液、血漿、血清或其他生物體液中隨著時間變化之抗體或其代謝物濃度；(b)與人類活體內生物可利用性數據有相互關係及可合理預測此數據之活體外試驗；(c)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中係測量隨時間變化之抗體(或其目標)的適當急性藥理效用；及(d)以建立抗原結合蛋白之安全性、效力或生物可利用性或生物等效性之良好對照的臨床試驗。
本發明之抗-IL-33抗體的生物等效變體可藉由，例如製造各種殘基或序列之取代，或刪除生物活性不需要的末端或內部殘基或序列來建構。例如，生物活性不需要的半胱胺酸殘基可刪除或以其他的胺基酸置換，以防止因變性而形成不必要或不正確的分子內雙硫橋。在其他內容中，生物等效的抗體可包括抗-IL-33抗體變體，其係包含修飾抗體之糖基化特性的胺基酸改變，例如消除或移除糖基化之突變。
物種選擇性和物種交叉反應
根據特定的實施例，本發明係提供與人類IL-33結合但不與其他物種IL-33結合之抗-IL-33抗體。本發明亦包括與人類IL-33及來自一或多種非人類物種之IL-33結合的抗-IL-33抗體。例如，本發明之抗-IL-33抗體可與人類IL-33結合，以及可或不可(視情況而定)與一或多種小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、獼猴、絨猴、恆河猴或黑猩猩IL-33結合。根據本發明特定的示例性實施例，係提供專一與人類IL-33和食蟹獼猴IL-33結合之抗-IL-33抗體。
免疫接合物
本發明涵蓋與療效成份，例如細胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素接合之抗-IL-33抗體(免疫接合物)。細胞毒性劑包括任何對細胞有害之試劑。用於形成免疫接合物之適合的細胞毒性劑及化療劑實例已為本項技術所知(參見，例如WO 05/103081)。
多專一性抗體
本發明之抗體可為單專一性、雙專一性或多專一性。多專一性抗體可對一目標多肽之不同的表位具專一性或可含有對一個以上的目標多肽具專一性之抗原結合區。參見，例如Tutt等人，1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer等人，2004,Trends Biotechnol.22：238-244。本發明之抗-IL-33抗體可與另外的功能分子，例如另外的胜肽或蛋白相連結或共表現。例如，抗體或其片段可與一或多個其他的分子實體，例如另外的抗體或抗體片段功能性連接(例如以化學偶合、基因融合、非共價連結或其他)，產生帶有第二結合專一性之雙專一性或多專一性抗體。例如，本發明係包括雙專一性抗體，其中免疫球蛋白之一臂係對人類IL-33具專一性，而免疫球蛋白之另一臂係對第二治療目標具專一性，或與第二療效成份接合。
可用於本發明內容中之示例性雙專一抗體形式係包括使用 第一免疫球蛋白(Ig)CH3區和第二Ig CH3區，其中該第一和第二Ig CH3區彼此至少有一個胺基酸不同，且相較於缺乏此胺基酸差異之雙專一性抗體，其中至少一個胺基酸的差異降低了此雙專一性抗體與蛋白A之結合。在一實施例中，第一Ig CH3區與蛋白A結合而第二Ig CH3區含有降低或消除蛋白A結合之突變，例如H95R修飾(IMGT之外顯子編號；EU編號為H435R)。第二CH3可進一步包括Y96F修飾(IMGT；EU為Y436F)。在第二CH3中可發現的另外修飾作用，就IgG1抗體之情況而言係包括：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；就IgG2抗體之情況為N44S、K52N和V82I(IMGT；EU為N384S、K392N和V422I)；及就IgG4抗體之情況為Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述之雙專一性抗體形式之變異係涵蓋在本發明的範圍內。
可用於本發明內容中之其他示例性雙專一抗體形式係包括(不限於)，例如scFv-為基礎或雙抗體雙專一性形式、IgG-scFv融合、雙可變區(DVD)-Ig、細胞雜交瘤(Quadroma)、knobs-into-holes、共同輕鏈(例如帶有knobs-into-holes之共同輕鏈等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、白胺酸拉鏈、Duobody、IgG1/IgG2、雙作用Fab(DAF)-IgG和Mab2雙專一形式(參見，例如Klein等人2012,mAbs 4：6,1-11及文中所引述的參考文獻，作為前述形式之審視)。雙專一性抗體亦可使用胜肽/核酸接合來建構，例如其中係使用具有垂質化學反應性之非天然胺基酸來產生位點-專一性之抗體-寡核苷接合物，然後其可自我組合成帶有定義組成、價數和幾何形狀之多聚合複合物(參見，例如Kazane等人，J.Am.Chem.Soc.[Epub：Dec.4,2012])。
pH-依賴之結合
本發明係提供以pH-依賴方式與IL-33結合之抗-IL-33抗體及其抗原結合片段。例如，本發明之抗-IL-33抗體在酸性pH時，相較於中性pH，可能出現與IL-33結合降低。另外，本發明之抗-IL-33抗體在酸性pH時，相較於中性pH，可能出現增加與其抗原之結合。
在特定的情況下，「相較於中性pH，在酸性pH時與IL-33之結合降低」係就在酸性pH時抗體與IL-33結合之KD值和在中性pH時抗體與IL-33結合之KD值的比率(或反之亦然)來表示。例如，相較於中性pH，抗體或其抗原結合片段在酸性pH時，就本發明之目的，若抗體或其抗原結合片段出現約3.0或更大之酸性/中性KD比率，可能被視為具有「相較於中性pH，在酸性pH時與IL-33之結合降低」。在特定的示例性實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段的酸性/中性KD比率可為約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0.25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。
具有pH-依賴結合特性之抗體可，例如藉由在酸性pH時，相較於中性pH，針對與特定抗原之結合降低(或提高)，篩選一抗體群組來取得。另外，胺基酸層級之抗原結合區的修飾作用可能產生具有pH-依賴結合特性之抗體。例如，藉由將一或多個抗原結合區的胺基酸(例如在CDR內)以組胺酸殘基取代，可得到相對於中性pH，在酸性pH時具有抗原結合降低之抗體。如文中所用，「酸性pH」一詞係包括低於約6.0或更低，約5.5或更低，或約5.0或更低之pH值。「酸性pH」一詞係包括約6.0、5.95、5.9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更低之pH。如文中所用，「中性pH」 一詞係指約7.0至約7.4之pH。「中性pH」一詞係包括約7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35及7.4之pH值。
治療調配物及給藥
本發明係提供包括本發明之抗-IL-33抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物。本發明之醫藥組成物係以適合的載劑、賦形劑和其他提供改善轉移、運送、耐受性及類似性質之試劑所調配。許多適合的調配物可參見所有醫藥化學家已知的處方集：賓州伊斯頓馬克出版公司之Remington's Pharmaceutical Sciences。這些調配物包括，例如散劑、糊膏、軟膏、軟凍、蠟、油、脂質、含脂質(陽離子或陰離子)之囊泡(例如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA接合物、無水吸收糊膏、水包油和油包水乳劑、乳劑碳蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠及含碳蠟(carbowax)之半固體混合物。亦參見Powell等人"Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
投予病患之抗原結合分子劑量可依照病患的年齡和體型大小、目標疾病、症狀、給藥路徑及其類似因素而不同。較佳的劑量典型地係根據體重或體表面積來計算。當本發明之抗體係用於成人病患供治療與IL-33活性有關的症狀或疾病時，有利的一般可以單一劑量由靜脈投予約0.01至約20毫克/kg體重，更佳地約0.02至約7，約0.03至約5，或約0.05至約3毫克/kg體重之本發明抗體。依照症狀之嚴重度，治療之頻率和作用期可調整。給予抗-IL-33抗體之有效劑量和時程可依經驗來決定；例如可藉由定期評估來監看病患進步，並據此調整劑量。再者，物種間劑量之衡量可使用本項技術中熟知的方法來進行(例如Mordenti等人，1991,Pharmaceut.Res.8：1351)。
各種的遞送系統已為所知並可用於投予本發明之醫藥組成物，例如包膠之微脂體、微粒、微膠囊、能表現突變病毒之重組細胞、受體媒介的內吞作用(參見，例如Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。導入方法包括(但不限於)皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服路徑。組成物可以任何方便的路徑，例如以輸注或團注、以經由上皮或黏膜層(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收來給藥，並可與其他生物活性劑共同給藥。給藥可為全身性或局部的。
本發明之醫藥組成物可以標準針或注射器由皮下或靜脈內來遞送。此外，就皮下遞送而言，筆型遞送裝置可容易地用於遞送本發明之醫藥組成物。此筆型遞送裝置可為重複使用型或拋棄型。可重複使用的筆型遞送裝置一般係利用含有醫藥組成物之可更換補充匣。一旦匣內的所有醫藥組成物投予後而補充匣變空，則此空匣可容易丟棄並更換新的含醫藥組成物之補充匣。然後此筆型遞送裝置便可再使用。在拋棄型筆型遞送裝置中無可置換的補充匣。取而代之的，拋棄型筆型遞送裝置係預先填充醫藥組成物收藏在裝置內的儲槽中。一旦醫藥組成物的儲槽變空，整個裝置便可丟棄。
許多可重複使用的筆型和自動注射器遞送裝置已應用於皮下遞送本發明之醫藥組成物。實例包括(但不限於)AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM筆(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM筆、HUMALOGTM pen,HUMALIN 70/30TM筆、(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。OPTIPENTM,OPTIPEN PROTM。OPTIPEN STARLETTM和 OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，僅提出一些。用於皮下遞送本發明醫藥組成物之拋棄型筆型遞送裝置包括(但不限於)SOLOSTARTM筆(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自動注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)及HUMIRATM筆(Abbott Labs,Abbott Park IL)僅提出一些。
在特定的情況下，醫藥組成物可以控制釋放系統來遞送。在一實施例中，可使用幫浦(參見Langer,supra；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另外的實施例中，可使用聚合物質；參見Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。又在另外的實施例中，控制釋放系統可放置在靠近組成物的目標處，因此僅需要全身劑量之一部分(參見,例如Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138)。其他的控制釋放系統係論述於Langer,1990,Science 249：1527-1533之評論中。
可注射的製備物可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等之劑型。這些可注射製備物可以公開已知的方法來製備。例如，可注射製備物可，例如藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於注射上習用的無菌水性媒劑或油性媒劑中來製備。注射用之水性媒劑有，例如生理食鹽水、含葡萄糖之等張溶液和其他佐劑等，其可與適合的增溶劑例如醇(例如乙醇)、多醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子介面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚環氧乙烷(50莫耳)加合物)]等組合使用。油性媒劑，可使用的有芝麻油、大豆油等，其可與增溶劑例如苯甲酸苯甲基酯、苯甲醇等組合使用。由此所製備的注射液較佳地係填充於適當的安瓶中
有利地，上述之口服或非經腸用途之醫藥組成物係製備成適合活性成份劑量之單位劑型。此等單位劑量之劑型包括，例如錠劑、片劑、膠囊、注射劑(安瓶)、栓劑等。所含的前述抗體之量一般每單位劑量之劑型為約5至約500毫克；特別是注射形式，較佳的前述抗體係含有約5至約100毫而其他劑型為約10至約250毫克。
抗體之治療用途
由本發明者們使用小鼠模型系統所進行的實驗已得以鑑別出各種可藉由IL-33拮抗作用治療、預防及/或改善之疾病和症狀。例如，水動力遞送小鼠IL-33 DNA造成引發肺黏液堆積及小鼠中總血清IgE增加。此外，mIL-33 DNA遞送，如微陣列分析所測量，造成ST2和各種下游細胞激素上調。由本發明者們使用IL-33剔除小鼠所進行的實驗亦顯示IL-33拮抗作用之各種可能的治療利益。例如，在IMQ-引發的乾癬模型中，已發現野生型小鼠和IL-33-/-小鼠肉眼間之觀察評分和皮膚浸潤為相當的。再者，在過敏原-引發的肺發炎模型中，IL-33-/-小鼠顯示嗜酸性粒細胞和殘餘黏液堆積下降。
本發明之抗體可用於(其中包括)治療、預防及/或改善任何與IL-33表現、訊號傳遞或活性有關或由其所媒介的疾病或病症，或藉由阻斷IL-33和IL-33配體(例如ST2)間的相互作用，或另外抑制IL-33活性及/或訊號傳遞為可治療的疾病或病症。例如，本發明係提供治療氣喘(例如過敏性氣喘、非過敏性氣喘、嚴重難治性氣喘、氣喘惡化、類固醇阻抗氣喘、類固醇敏感性氣喘、嗜酸性細胞氣喘或非-嗜酸性細胞氣喘等)、異位性皮膚炎、乾癬其他發炎病症、過敏、過敏、心血管疾病、中樞神經系統疾病、疼痛、關節炎(例如類風濕性關節炎、骨關節炎和乾癬性關節炎等)、巨細胞血管炎、血管炎(貝西氏病和Churg Strauss症候群)、過敏性紫斑症 (Henoch-Schonlein purpura)、多發性硬化症、發炎性腸病症(例如克隆氏症或潰瘍性大腸炎)、狼瘡和修格連氏症候群之方法。
本發明之抗體亦可用於治療、預防及/或改善一或多種纖維化疾病。藉由投予本發明之抗-IL-33抗體可治療之示例性纖維化疾病包括肺纖維化(例如特發性肺纖維化、博來黴素引起的肺纖維化、石棉引起的肺纖維化和阻塞性細支氣管炎症候群)、慢性氣喘、與急性肺損傷和急性呼吸窘迫有關之纖維化(例如細菌性肺炎引發的纖維化、創傷引發的纖維化、病毒性肺炎引發的纖維化、呼吸器引發的纖維化、非肺性敗血症引發的纖維化和吸入引發的纖維化)、矽肺、放射線引發的纖維化、慢性阻塞性肺疾病(COPD，其可能係與部份或由吸菸或暴露於二手菸所造成相關或不相關)、硬皮病、眼睛纖維化、皮膚纖維化(例如硬皮病)、肝纖維化(例如肝硬化、酒精引起的肝纖維化、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、膽管損傷、原發性膽汁性肝硬化、感染或病毒引發的肝纖維化、自體免疫性肝炎、腎纖維化、心纖維化、動脈粥樣硬化、支架內再狹窄和骨髓纖維化。
在文中所述的治療方法之內容中，抗-IL-33抗體可作為單一治療(亦即作為唯一的治療劑)或與一或多種另外的治療劑(其實例係描述於文中的他處)組合給藥。
組合治療及調配物
本發明係包括包含任何如文中所述的抗-IL-33抗體與一或多種另外的治療活性組份組合之組成物和治療調配物，以及包括將此等組合物投予有此需要的患者之治療方法。
本發明之抗-IL-33抗體可與，例如細胞激素抑制劑，包括小分子細胞激素抑制劑和與細胞激素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-25、IL-26) 結合之抗體，或其各別的受體之拮抗劑組合，共調配或給藥。
本發明之抗-IL-33抗體亦可與抗病毒劑、抗生素、鎮痛劑、皮質類固醇、類固醇、氧、抗氧化劑、金屬螯合劑、IFN-γ及/或NSAID組合給藥或共調配。
另外的治療活性組份可在投予本發明抗-IL-33抗體之前、同時或之後不久給藥(就本揭示文之目的，此等給藥療法係被視為抗-IL-33抗體與另外的治療活性組份「組合」給藥)。本發明包括醫藥組成物，其中本發明之抗-IL-33抗體係與一或多種文中他處所述之另外的治療活性組份共調配。
給藥療法
根據本發明特定的實施例，可於一定義的時程將多劑量的抗-IL-33抗體(或包括抗-IL-33抗體與任何文中所提之另外的治療活性劑組合之醫藥組成物)投予一對象。根據本發明此方面之方法係包括先後將多劑量之本發明抗-IL-33抗體投予一患者。如文中所用，「先後給藥」係指各劑量之抗-IL-33抗體係於不同的時間點投予該患者，例如以預計的間隔隔開之不同日(例如小時、日、週或月)。本發明係包括，包含將一單一起始劑量之抗-IL-33抗體先後投予病患，接著一或多個第二劑量之抗-IL-33抗體及視需要接著一或多個第三劑量之抗-IL-33抗體之方法。
術語「起始劑量」、「第二劑量」和「第三劑量」係指投予本發明抗-IL-33抗體之暫時順序。因此，「起始劑量」為治療療法開始時所投予之劑量(亦稱為「基線」劑量)；「第二劑量」為在起始劑量之後所投予之劑量；而「第三劑量」為在第二劑量之後所投予之劑量。起始、第二和第三劑量皆可含有相同量之抗-IL-33抗體，但就給藥的頻率而言，一般可彼此不同。然而，在特定的實施例中，包含在起始、第二及/或第三劑量中之 抗-IL-33抗體之量，在治療期間可互不相同(例如，若適當經上調或下調)。在特定的實施例中，係在治療療法開始時投予二或多個(例如2、3、4或5個)劑量為「承載劑量」，接著以較低頻率為基礎，投予後續劑量(例如「維持劑量」)。
在本發明特定的示例性實施例中，各第二及/或第三劑量係緊接前面劑量之後的1至26週(例如1、1½、2、2½、3、3½、4、4½、5、5½、6、6½、7、7½、8、8½、9、9½、10、10½、11、11½、12、12½、13、13½、14、14½、15、15½、16、16½、17、17½、18、18½、19、19½、20、20½、21、21½、22、22½、23、23½、24、24½、25、25½、26、26½或更久)給藥。「緊接前面劑量」一詞，如文中所用，係指在一多重給藥之順序中，抗-IL-33抗體之劑量，在每個相鄰接的劑量給藥之前係以無插入劑量之順序投予患者。
根據本發明此方面之方法可包括將任何數目之第二及/或第三劑量之抗-IL-33抗體，投予一病患。例如，在特定的實施例中，僅將一單一第二劑量投予該病患。在其他實施例中，係將二或多個(例如2、3、4、5、6、7、8或更多個)第二劑量投予該病患。同樣的，在特定的實施例中，僅將一單一第三劑量投予該病患。在其他實施例中，係將二或多個(例如2、3、4、5、6、7、8或更多個)第三劑量投予該病患。
在涉及多重第二劑量之實施例中，各第二劑量可以相同的頻率與其他第二劑量來給藥。例如，各第二劑量可在緊接前面劑量後1至2週或1至2個月，投予該病患。同樣的，在涉及多重第三劑量之實施例中，各第三劑量可以相同的頻率與其他第三劑量來給藥。例如，各第三劑量可在緊接前面劑量後2至12週，投予該病患。在特定的本發明之實施例中，投予病患之第二及/或第三劑量的頻率，在治療療法期間可不同。在治療期 間，給藥頻率亦可依照個別病患之需求在臨床檢查後由醫師做調整。
本發明係包括其中以第一頻率將2至6個承載劑量投予病患(例如每週一次、每二週一次、每三週一次、每月一次、每二個月一次)，接著以較低頻率為基礎將二或多個維持劑量投予病患之給藥療法。例如，根據本發明此方面，若承載劑量係以每月一次的頻率給藥，則維持劑量可每六周一次、每二個月一次、每三個月一次等，投予病患。
抗體之診斷用途
本發明之抗-IL-33抗體亦可用於偵測或測量樣本中之IL-33或IL-33表現細胞，例如供作診斷目的。例如抗-IL-33抗體或其片段可用於診斷特徵為IL-33異常表現(例如過度表現，表現不足，無表現等)之症狀或疾病。IL-33之示例性診斷分析可包括，例如將得自病患的樣本與本發明之抗-IL-33抗體接觸，其中該抗-IL-33抗體係經可偵測的標記或受體分子標定。另外，未標定的抗-IL-33抗體可與本身經可偵測標記標定之第二抗體組合用於診斷用途。可偵測標記或報導分子可為放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或125I；螢光或化學螢光基團，例如螢光素異硫氰酸酯或羅丹明(rhodamine)；或酵素例如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶或螢光素酶(luciferase)。可用於偵測或測量樣本之IL-33的特定示例性分析包括酵素連結免疫吸附法(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)及螢光活化細胞分類(FACS)。
根據本發明可用於IL-33診斷分析之樣本包括含有可偵測量之IL-33蛋白或其片段，其係在正常或病理條件下由病患所得來之任何組織或液體樣本。一般而言，係測量得自健康病患(例如未罹患與異常的IL-33量或活性有關的疾病或症狀之病患)之特定樣本中IL-33的量以先建立一基線或標準的IL-33量。然後可將IL-33之基線量與得自疑似患有IL-33相關 疾病或症狀之個體樣本中所測量的IL-33量相比較。
圖1.抗-IL-33抗體間對人類IL-33之交叉競爭。
圖2.抗-IL-33抗體間對重組的猴子IL-33之交叉競爭。
實例
提出下列實例以提供本項技術之一般技術者如何製造及使用本發明方法和組合物之完整揭示和說明，但不希望限制發明者所認為之發明範圍。雖已盡力確保所用的相關數字(例如量、溫度等)之正確性，但仍應考量某些實驗誤差和偏差。除非另有指出，否則份數係為重量份，分子量為平均分子量，溫度係以攝氏度數表示，而壓力係為或接近大氣壓。
實例1.產生抗人類IL-33之人類抗體
將一包括人類IL-33之免疫原直接投予包括編碼人類免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈可變區之DNA的VELOCIMMUNE®小鼠，幫助刺激免疫反應。以IL-33-專一性免疫分析監測抗體免疫反應。當達到所欲的免疫反應時，收取脾臟細胞並與小鼠骨髓瘤細胞融合以保留其生存力及形成雜交瘤細胞株。篩選及選擇雜交瘤細胞株用以鑑別產生IL-33-專一性抗體之細胞株。使用此技術得到數種抗-IL-33嵌合抗體(亦即，具有人類可變區和小鼠恆定區之抗體)；以此方式產生的示例性抗體係稱為：H1M9559N、H1M9566N、H1M9568N和H1M9565N。隨後將來自嵌合抗體之人類可變區選殖至人類恆定區以製造如文中所述之全人類抗-IL-33抗體。
如US 2007/0280945A1中所述，直接從沒有與骨髓瘤細胞融合的抗原陽性B細胞分離全人類抗-IL-33抗體。使用此法，得到數種全人 類抗-IL-33抗體(亦即具有人類可變區和人類恆定區之抗體)；以此方式產生的示例性抗體係稱為：H4H9629P、H4H9633P、H4H6940P、H4H9659P、H4H9660P、H4H9662P、H4H9663P、H4H9664P、H4H9665P、H4H9666P、H4H9667P、H4H9670P、H4H9671P、H4H9672P、H4H9675P和H4H9676P。
依照此實例之方法所產生的示例性抗-IL-33抗體之特定生物性質係詳述於下文所述的實例中。
實例2.重鏈和輕鏈可變區胺基酸和核酸序列
表1係列出所選的抗-IL-33抗體之重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列對和CDR序列及其對應的抗體識別碼。
抗體典型地在文中係根據下列命名法來命名：Fc字首(例如 「H1M」或「H4H」)，接著數字識別碼(例如，如表1中所示之「9559」、「9566」或「9629」等)，接著「P」或「N」字尾。因此，根據此命名法，一抗體在文中可稱為，例如「H1M9559N」、「H1M9566N」、「H4H9629P」等。在用於文中之抗體命名上H1M和H4H字首係指抗體特定的Fc區同型。例如，「H1M」抗體係具有小鼠IgG1 Fc，而「H2H」抗體係具有人類IgG4 Fc。本項技術之一般技術者應了解，具有特定Fc同型之抗體可轉變為具有不同Fc同型之抗體(例如帶有小鼠IgG1 Fc之抗體可轉變為帶有人類IgG4之抗體等)，但在任何情況下，可變區(包括CDR)-其係以如表1所示的數字識別碼表示-則仍不變，且結合性質預期為相同的或實質上類似的，與Fc之性質無關。
實例3.以表面電漿共振測定人類IL-33與抗體之結合
r IL-33與純化的抗-IL-33單株抗體結合之平衡解離常數(KD值)係使用即時表面電漿共振生物感測器使用Biacore 4000儀器來測定。將Biacore感測器表面先以與多株兔抗-小鼠抗體(GE,# BR-1008-38)偶合或與單株小鼠抗-人類Fc抗體(GE,# BR-1008-39)偶合之胺衍生化，以捕捉分別以小鼠或人類IgG4恆定區表現的抗-IL-33單株抗體。所有的Biacore結合研究係於0.01M ADA pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA和0.05% v/v界面活性劑Tween-20(ABS-ET電泳緩衝液)中進行。將於ABS-ET電泳緩衝液(範圍從100nM至3.7nM,3-倍稀釋)中所製備之以C-端六聚組胺酸標籤(MfIL-33-6His；SEQ ID NO：xx)表現之不同濃度的人類IL-33(hIL-33；R&D Systems,# 3625-IL-010/CF)或食蟹獼猴IL-33，以30μL/分鐘之速率注射於抗-IL-33單株抗體捕捉表面。監測hIL-33或MfIL-33-6His與捕捉單株抗體之結合4分鐘及監測其於ABS-ET電泳緩衝液中的解離10分鐘。使用線上pH追逐分析形式，於0.01M ADA pH 6.0,0.15M NaCl,3mM EDTA和0.05% v/v 界面活性劑Tween-20(ABS-ET pH6緩衝液)中研究pH降低對各抗-IL-33抗體與hIL-33或MfIL-33-6His結合之效應。為了進行此項，係於ABS-ET電泳緩衝液中監測hIL-33或MfIL-33-6His與捕捉的單株抗體之結合歷時4分鐘。在hIL-33或MfIL-33-6His於ABS-ET電泳緩衝液中解離30秒後，注射ABS-ET pH6緩衝液3分鐘，並於低-pH條件下測量分析物之解離。所有的結合動力實驗係於25℃和37℃時進行。動力結合(ka)和解離(kd)常數係藉由將即時感應圖與1：1結合模型，使用Scrubber 2.0曲線擬合軟體擬合所測定。結合解離平衡常數(KD)和解離半衰期(t1/2)係由動力學速率常數如下所計算：KD(M)=kd/ka及t1/2(min)=ln(2)/(60*kd)
於25℃和37℃時hIL-33和MfIL-33-6His與不同抗-IL-33單株抗體結合之結合動力參數係如表2至5所示。如表2所示，在25℃時，hIL-33與抗-IL-33抗體結合，具有範圍從78pM至757pM之KD。如表3所示，在37℃時，hIL-33與抗-IL-33抗體結合，具有範圍從411pM至2.03nM之KD。在25℃和37℃時，一抗-IL-33抗體顯現弱的結合且因此其結合動力參數無法使用1：1結合模形擬合。如表4所示，在25℃時，MfIL-33-6His與抗-IL-33抗體結合，具有範圍從333pM至38nM之KD。如表5所示，在37℃時，MfIL-33-6His與抗-IL-33抗體結合，具有範圍從1nM至48.6nM之KD。
*IC：不確定，因為在實驗條件下觀察到非常弱的結合，且即時結合數據無法與1：1結合模型可靠擬合。**在實驗條件下無觀察到IL33從捕捉的單株抗體解離，因此kd值固定為1.00E-05，且衍生的t½和KD值分別代表下限和上限。
*IC：不確定，因為在實驗條件下觀察到非常弱的結合，且即時結合數據無法與1：1結合模型可靠擬合。
*FT：快速t½，使MfIL-33-6His與抗-IL-33單株抗體得以結合
實例4.抗-IL-33抗體阻斷IL-33與人類ST2受體結合
抗-IL-33抗體阻斷人類IL-33(hIL-33)或食蟹獼猴IL-33與人類ST2受體結合之能力係使用競爭三明治ELISA來測量。將以C-端人類IgG1 Fc標籤(hST2-hFc；SEQ ID NO：306)表現之人類ST2蛋白ecto區部分，於4℃以1μg/mL於PBS緩衝液中之濃度塗覆於96-孔微量盤上至隔夜。隨後使用0.5%(w/v)之BSA於PBS中溶液阻斷非專一結合位置。將以六組胺酸標籤(MfIL-33-6His；SEQ ID NO：305)表現之恆定濃度30pM生物素化hIL-33蛋白(R&D systems,Cat #3625-IL/CF)(biotin-hIL-33)或150pM食蟹獼猴IL-33分開加到抗體的連續稀釋液中，使得抗體的最終濃度範圍為0至100nM。將抗體/IL-33混合物於室溫培養1小時，之後將其轉置於塗覆hST2-hFc-的微量滴定盤。於室溫培養1小時後，然後清洗孔槽並以接合辣根過氧化酶(HRP)的鏈黴親和素(Thermo Scientific,Cat # N200)偵測盤-結合生物素-hIL-33，及以接合抗-His單株抗體之HRP(Qiagen,#34460)偵測盤-結合MfIL-33-6His。將所有的樣本以TMB溶液(BD biosciences,# 51-2607KC)展開，產生比色反應及然後以1M硫酸酸化停止反應，之後於Victor X5盤式判讀儀上以450nm測量吸收度。使用PrismTM軟體內的反曲型劑量反應模型進行數據分析。使用所計算的IC50值(係以從最大訊號的生物素-hIL-33或MfIL-33-6His與盤-塗覆hST2-hFc結合降低50%所需之抗體濃度來定義)，作為阻斷效用的指示劑。計算阻斷之百分比作為抗體存在下所觀察之訊號降低相對於單獨IL-33和背景訊號(來自結合HRP-第二抗體或單獨的鏈黴親 和素之訊號)間的差異之比率。恆定濃度的單獨生物素-hIL-33或MfIL-33-6His所測量的吸收度係定義為0%阻斷而無添加IL-33所測量的吸收度係定義為100%阻斷。使用對各抗體含有最高濃度之孔槽的吸收值定為最大阻斷的百分比。
N/A=不適用NB1=非阻斷劑*=每隔一天進行實驗
對20個抗體之結合實驗係每隔二天進行，如表6所示。所 有20種抗-IL-33抗體係以範圍從140pM至22nM之IC50值阻斷生物素-hIL-33與hST2-hFc之結合而最大阻斷百分比範圍係從46%至88%。如表6所示，20種抗-IL-33抗體中有18種以範圍從220pM至13nM之IC50值阻斷MfIL-33-6His與hST2-hFc之結合而最大阻斷百分比範圍係從38%至92%。二種試驗抗體，H4H9629P和H4H9633P，並未顯現可測量的阻斷MfIL-33-6His與hST2-hFc之結合。
實例5.如Biacore分析所示，以ST2抑制IL-33與抗-IL-33單株抗體結合
抗-IL-33抗體與IL-33和ST2之預形成複合物的結合能力係使用配置有即時表面電漿共振生物感測器之Biacore T-200儀器來測試。實驗係於25℃以由0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA和0.05% v/v界面活性劑Tween-20(HBS-ET)所組成的電泳緩衝液來進行。將感測器先以胺偶合抗-my標籤-專一性單株抗體(Clone# 9E10)衍生化，及於此衍生化的感測器上捕捉大約160個反應單位(RU)之以C-端myc-myc-六組胺酸標籤表現之人類ST2蛋白(hST2-MMH；SEQ ID NO：323)。然後將捕捉的hST2-MMH表面藉由注射100nM的人類IL-33(hIL-33；R&D Systems,# 3625-IL-010/CF)歷時3分鐘使其飽和，接著注射3分鐘的100nM之抗-IL-33單株抗體溶液。在整個實驗期間監測即時結合反應，及將抗-IL-33抗體注射至hIL-33之預形成複合物後3分鐘時所觀察的結合反應和捕捉的hST2-MMH記錄和製表，並如表7所示。並無觀察到抗-IL-33單株抗體與抗-myc標籤捕捉表面之非專一性結合。如表7中所示，試驗抗體中有17種，在與hST2-MMH預複合後並未顯現可測量的hIL-33之結合，而三種抗體(H1M9565N、H1M9566N和H1M9568N)，在與hST2-MMH預複合後係與hIL-33結合。
表7：抗-IL-33抗體與hIL-33和hST2-MMH之預形成複合物的結合
實例6.以抗-IL-33抗體抑制IL-33-媒介的受體訊號傳遞
介白素-33(IL-33)為一ST2之配體，一種與輔助蛋白IL-1RAcP有關之類-toll/介白素-1受體超家族成員(就回顧文獻，參見Kakkar and Lee,2008)。當ST2/IL-1RAcP被IL-33活化時，經由下游分子例如MyD88(髓樣分化因子88)和TRAF6(TNF受體相關因子6)引發訊號傳遞集聯，使得其中NFκB(核因子-κB)活化。為了發展一試驗抗-IL-33抗體之生物相關的生物分析系統，係將人類胚胎腎細胞(HEK293)穩定地轉染以表現人類ST2(登錄號NP_057316之1-556胺基酸)以及螢光素酶受體[NFκB反應元素(5x)-螢光素酶-IRES-GFP](HEK293/hST2/NFkB-螢光素酶細胞株)。HEK293細胞株內源性表現IL-1RAcP及於HEK293中藉由IL-33活化NFκB已如先 前所示(Schmitz等人.,Immunity 23：479-490(2005))。將穩定的細胞株分離並保持在10% FBS、DMEM、NEAA、青黴素/鏈黴素及G418中。
就此生物分析，係將HEK293/hST2/NFkB-螢光素酶細胞以每孔10,000個細胞[溶於含0.1% w/v FBS和OPTIMEM之低血清培養基(Invitrogen,#31985-070)]，植入96-孔分析盤上，及然後於37℃及5% CO2中培養至隔夜。隔天，就測量IL-33之劑量反應，係將人類IL-33(hIL-33；R&D Systems,#3625-IL)或以六組胺酸標籤表現之食蟹獼猴IL-33(MfIL-33-6His；SEQ ID NO：305)以1：3連續稀釋並由10nM開始範圍下至0.0002nM，以及不含IL-33之對照樣本加到細胞中。將抗體連續稀釋並加到細胞中，接著加入恆定濃度的IL-33(人類分析為10pM hIL-33而猴子分析為5pM MfIL-33-6His)，用以測量抑制作用。進行3-倍的抗體連續稀釋，之後加到細胞，從100nM開始且範圍下至0.002nM，或從10nM開始且範圍下至0.0002nM。除了抗體連續稀釋外，亦包括含有恆定濃度的IL-33但無抗體之孔槽。於37℃及5% CO2中培養5.5小時後，使用Victor X(Perkin Elmer)盤式判讀儀偵測螢光素酶活性，使用非線性迴歸(4-參數邏輯)以Prism 5分析結果。結果係如表8所示。
如表8所示，20種抗-IL33抗體中有18種以範圍從7.5pM至29nM之IC50值阻斷人類IL-33刺激HEK293/hST2/NFkB-螢光素酶細胞。二種試驗的抗體H1M9566N和H1M9568N，以48%和66%之最大抑制部份抑制hIL-33，其中IC50值分別為950pM和250pM。20種抗-IL33抗體中有18種以範圍從660pM至130nM之IC50值阻斷MfIL-33-6His刺激HEK293/hST2/NFkB-螢光素酶細胞。二種試驗的抗體H1M9566N和H1M9568N以61%和64%之最大抑制部份抑制MfIL-33-6His，其中IC50值分別為1.5nM和3.5nM。
實例7.以抗-IL-33抗體抑制IL-33-引發的人類嗜鹼性粒細胞之脫粒作用
就進一步評估本發明之選擇的抗-IL-33抗體之活體外特性， 係測量其阻斷IL-33-引發的人類嗜鹼性粒細胞之脫粒作用的能力。從來自二個不同人類捐贈者之新鮮全血，以密度梯度離心純化周邊血液單核細胞(PBMC)。將K2 EDTA全血以1：1於RPMI 1640中稀釋，小心地於Ficoll-Paque(GE Healthcare,# 17-1440-03)上分層並離心以分離PBMC。將含PBMC的界面層吸出，轉置於新的試管，並以MACS緩衝液清洗二次，其中該MACS緩衝液係由溶於MACS沖洗液(Militenyi Biotec,#130-091-222)之1：20稀釋度之MACS BSA溶液(Militenyi Biotec,#130-091-376)所組成。然後將純化的PBMC以溶於100μL的MACS緩衝液之~3.0x106細胞/mL的最終濃度置於v-底96-孔盤中。就引出包含在PBMC群族中的嗜鹼性粒細胞，係將1ng之IL-3(Sigma,# H7166-10UG)溶於50μL無Ca++或Mg++(DPBS)的Dulbecco's磷酸緩衝食鹽水中溶液加到細胞懸浮液中，及然後於37℃培養10分鐘。
製造二種本發明之不同示例性抗-IL-33抗體(H4H9675P和H4H9659P)或同型對照抗體之連續稀釋液(1：3)，範圍從10nM至4.6pM，以及無抗體之對照組。將溶液與固定濃度之100pM(最終濃度)的人類IL-33(R&D Systems,# 6325-IL/CF)或無IL-33負性對照組混合，之後加到PBMC中。所有的條件係以雙重複進行試驗。
將人類IL-33和抗體加至細胞後，將細胞於37℃培養20分鐘，以幫助嗜鹼性粒細胞脫粒。然後藉由將分析盤於濕冰上冷卻5分鐘，停止脫粒作用。為了使嗜鹼性粒細胞族群之分析能用於測量脫粒作用，係將20μL的各(依照製造商說明)抗-HLA-DR-FITC(Beckman Coulter,# IM0463U)、抗-CD123-APC(BD,# 560087)和抗-CD203c-PE(Beckman Coulter,# IM3575)加到各樣本中，並將樣本於黑暗中放置在4℃歷時20分鐘。然後將細胞離心，以DPBS清洗，及然後於4℃懸浮於2%甲醛(固定 緩衝液)中。隔天，將於FACSCanto II上分析固定的細胞，用以測定嗜鹼性粒細胞脫粒之量。結果係彙整於表9和10中。
如表9所示，在100pM時，在二個不同捐贈者中人類IL-33引發的嗜鹼性粒細胞脫粒作用就捐贈者655687為68.8%之平均脫粒百分比，而捐贈者655688為61.6%。
如表10所示，一抗-IL33抗體H4H9675P，就捐贈者655687係以132.9pM之IC50值，而就捐贈者655688係以97.12pM之IC50值阻斷由100pM人類IL-33挑戰所引發的嗜鹼性粒細胞脫粒作用。另外的抗-IL33抗體H4H9659P，就捐贈者655687係以578.6pM之IC50值，而就捐贈者655688以446.5pM之IC50值阻斷由100pM人類IL-33挑戰所引發的嗜鹼性粒細胞脫粒作用。相反的，同型對照組並未阻斷任何試驗的捐贈者之嗜鹼性粒細胞脫粒作用。
實例8.以抗-IL-33抗體抑制人類PBMC之IL-33-引發的IFN-γ
利用以初代細胞為基礎之分析使用周邊血液單核細胞(PBMC)，用以進一步定出本發明之抗-IL-33抗體特性。用於此實例之分析係以Smithgall等人於International Immunology,2008,vol.20(8)pp. 1019-1030中所公開的結果為基礎。就此分析，係從來自三個不同人類捐贈者之新鮮全血，以密度梯度離心純化PBMC。簡言之，將K2 EDTA全血於RPMI 1640中稀釋2倍，小心地於Ficoll-Paque(GE Healthcare,# 17-1440-03)上分層並離心20分鐘。將含PBMC的界面層吸出，轉置於新的試管，並以PBS緩衝液清洗二次。將分離的PBMC以溶於添加10% FBS、2mM L-麩醯胺酸、100U/mL青黴素和100μg/mL鏈黴素之RPMI 1640中，最終濃度5x105細胞/mL鋪於圓底96-孔盤中。然後將細胞以單獨10nM至0.64pM之50g/mL人類IL-12(hIL-12；R&D Systems,#219-IL-025/CF)和人類IL-33之連續稀釋液(hIL-33；R&D Systems,#3625-IL-010/CF)，或以與100nM至6.4pM之抗體連續稀釋液組合之260pM的hIL-33培養。每孔最終體積為200μL。各條件係以三重複進行試驗。當有抗體存在時，係於以hIL-33預培養30分鐘後，將其加到細胞中。
將細胞於37℃於濕化的培養箱中以5% CO2培養至隔夜，及然後以ELISA(R&D Systems,#DY285)測量培養上清液中IFNγ量。就ELISA，係根據製造商的說明將96-孔平底盤塗覆上捕捉抗體。清洗及阻斷後，將100μL未稀釋的培養上清液加到盤中並培養2小時。依照製造商的說明進行後續的清洗和偵測。
如表11中所示，人類IL-33，在hIL-12的存在下，以介於274pM至39pM之EC50值引發IFNγ從來自三個不同試驗捐贈者之人類總PBMC中釋放。使用來自捐贈者#603486和#603487之PBMC測試11種抗-IL-33抗體，而以來自捐贈者#603491之PBMC測試3種抗-IL-33抗體。如表12所示，於捐贈者#603486和#603487中試驗之所有抗-IL-33抗體，係以範圍從175pM至22nM之IC50值阻斷由260pM IL-33所引發的IFNγ從PBMC釋放。捐贈者#603491上所試驗的三種IL-33抗體皆未阻斷由260pM IL-33所引發的IFNγ從PBMC釋放且取而代之的係造成以介於56.1pM至189nM之EC50值增加了IFNγ釋放。
本發明並不希望被限制於文中所述的特定實施例之範圍中。實際上，除了該等文中所述之外，由前述說明及伴隨的圖示，各種本發明之修改對熟習本項技術者為顯而易見。此等修改係希望落在所附的申請專利範圍內。
實例9.使用生物膜干涉術之人類IL-33交叉競爭
使用即時、無標定生物膜干涉術分析於Octet® HTX生物感測器(ForteBio,A Division of Pall Life Sciences)上測定一組不同的抗-IL-33單株抗體間之結合競爭。此實驗係於25℃使用0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、0.05% v/v界面活性劑Tween-20和0.1mg/ml BSA(HBS-ET動力學緩衝液)之緩衝液，將測定盤以1000rpm之速度震盪下來進行。就評估二種抗體是否能彼此競爭與人類IL-33相結合，係使用預混合分析形式，其中係將100nM的人類IL-33(R&D Systems；# 3625-IL-010/CF)與500nM不同的抗-IL-33單株抗體(後續稱為mAb-2)預混合至少2小時，之後進行結合競爭分析。將塗覆抗-小鼠Fc多株抗體(Pall ForteBio Corp.,# 18-5088；後續稱為AMC)或抗-人類Fc多株抗體(Pall ForteBio Corp.,# 18-5060；後續稱為AHC)的Octet生物感測器先浸入含20μg/mL的個別抗-IL-33單株抗體之孔槽中歷時3分鐘，用以捕捉分別以小鼠Fc表現或以人類Fc表現之抗-IL-33單株抗體(後續稱為mAb-1)。依照捕捉步驟，將生物感測器上未被佔據之抗-小鼠Fc多株抗體和抗-人類Fc多株抗體藉由將其浸入含200μg/mL非專一單株抗體(非別帶有小鼠Fc或帶有人類Fc)之孔槽中歷時4分鐘，使其飽和。最後，將Octet生物感測器浸入含100nM人類IL-33和500nM mAb-2之預混合樣本的孔槽中歷時4分鐘。在各週期結束時，使用3次交替的20秒浸入10mM HCl中，接著浸入HBS-ET動力緩衝液中，將非共價捕捉的抗-IL-33抗體與結合的人類IL-33和mAb-2之預複合物從生物感測器移出。在每個實驗步驟間，以HBS-ET動力緩衝液清洗生物感測器。於結合事件期間監測即時結合反應，及在每個步驟結束時記錄結合反應(以nm為單位)。在分析期間，將觀察到的所有mAb-2結合事件之訊號(在交叉競爭矩陣中橫列)，減去特定的mAb-2(其中mAb-1=mAb-2，亦即沿著矩陣地對角線)之自我-自我背景結合訊號，且此背景-校正的結果係如圖1所示。測量人類IL-33和各個 不同mAb-2樣本之預複合物結合的反應，用以決定不同的抗-IL-33單株抗體有關彼此之競爭/非競爭行為。
如圖1所示，帶有黑色字體之淡灰色格子係代表自我競爭。以雙向相互競爭之抗體，與結合的順序無關，係以黑色格子和白色字體表示。帶有黑色字體以深灰色標出的格子係代表與人類IL-33微弱結合，導致觀察到單向交叉-競爭之抗-IL-33單株抗體。用於本實驗的同型對照組係以帶有白色字體之深灰色格子表示。帶有黑色字體之白色格子係代表抗體間無競爭，其顯示各抗體具有不同的結合表位。
實例10.用生物膜干涉術之猴子IL-33交叉競爭
使用即時、無標定生物膜干涉術分析於Octet® HTX生物感測器(ForteBio,A Division of Pall Life Sciences)上測定一組不同的抗-IL-33單株抗體間之結合競爭。此實驗係於25℃使用0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v界面活性劑Tween-20和0.1mg/ml BSA(HBS-ET動力學緩衝液)之緩衝液，將測定盤以1000rpm之速度震盪下來進行。就評估二種抗體是否能彼此競爭與以C-端六組胺酸標籤表現之重組的猴子IL-33(MfIL-33-6His；SEQ ID：xx)相結合，係藉由將生物感測器浸入含2μg/mL的MfIL-33-6His之孔槽中歷時85秒，將大約0.15nm結合單位的MfIL-33-6His先捕捉至塗覆抗-五-His抗體之生物感測器(Fortebio Inc,# 18-5079)上。然後將抗原-捕捉的生物感測器以第一抗-IL-33單株抗體(後續稱為mAb-1)藉由浸入含50μg/mL mAb-1溶液之孔槽5分鐘，使其飽和。然後將生物感測器浸入含50μg/mL第二抗-IL-33單株抗體溶液(後續稱為mAb-2)之孔槽中歷時4分鐘。在每個實驗步驟間，以HBS-ET動力緩衝液清洗生物感測器。於結合事件期間監測即時結合反應，及在每個步驟結束時記錄最大結合反應(以nm為單位)。測量mAb-2和與mAb-1預複合之 MfIL-33-6His結合之反應，並測定不同的抗-IL-33單株抗體有關彼此之競爭/非競爭行為。
如圖2所示，帶有黑色字體之淡灰色格子(沿著對角線)係代表自我競爭(其中mAb-1=mAb-2)。以雙向競爭之抗體，與結合的順序無關，係以黑色格子和白色字體表示。帶有黑色字體之白色格子係代表抗體間無競爭，其顯示各抗體具有不同的結合表位。帶有白色字體之深灰色格子係代表用於本實驗之同型對照組。
實例11.以活體內模型試驗之mAb；急性HDM-引發的發炎模型用以研究IL-33於肺發炎中之角色
於小鼠中進行一相關活體模型，一急性HDM-引發的肺發炎研究，用以測定抗-IL-33抗體H4H9675P之效用，其中小鼠為人類IL-33代替小鼠IL-33(IL-33 HumIn小鼠)表現之同型。
將IL-33 HumIn小鼠由鼻內投予經20μL的1X磷酸緩衝食鹽水(PBS)(n=17)或20μL的1X PBS(n=3)稀釋之50μg的塵蟎萃取物(HDM；Greer,#XPB70D3A2.5)每週5天歷時2週。由第一次HDM投予的3天前開始，將一亞群經HDM挑戰的小鼠以皮下注射25mg/kg的抗-IL-33抗體H4H9675(n=6)或同型對照抗體(n=6)，然後每週一次，直到HDM挑戰結束。在第一次鼻內給予HDM後的15天，將所有的小鼠進行安樂死並收取其肺。就各組小鼠之實驗給劑和治療方案係如表14所示。
收取肺供細胞激素分析：
放血後，將右肺的前葉和中葉從小鼠中移出並放入含有添加1X Halt蛋白酶抑制劑混合液(Pierce,#78430)之組織蛋白萃取試劑(1X T-PER試劑；Pierce,#78510)溶液的試管中。所有進一步的步驟係於冰上進行。就各樣本調整T-PER試劑(含有蛋白酶抑制劑混合液)之量以符合1：8(w/v)組織與T-PER比率。使用拋棄式研杵(Kimble Chase,# 749625-0010)以手動於試管中將肺樣本均質。將產生的溶離物離心成團塊碎片。將含有可溶性蛋白萃取物之上清液轉置於新的試管並於4℃儲存，直到進一步分析。
使用Bradford分析測量肺蛋白萃取物中的總蛋白含量。就此分析，係將10μL稀釋的萃取物樣本以雙重複置入96孔盤中並與200μL的1X染劑(Biorad,#500-0006)混合。使用牛血清白蛋白(Sigma,#A7979)之連續稀釋液，由700μg/mL溶於1X T-Per試劑之溶液開始，作為標準測量萃取物之萃取蛋白濃度。於室溫培養5分鐘後，於Molecular Devices SpectraMax M5盤式判讀儀上以595nm測量吸收度。使用GraphPad PrismTM軟體進行測定總蛋白含量之數據分析。
肺蛋白萃取物中的細胞激素濃度係使用促發炎盤板1(小鼠)多重免疫分析套組(MesoScale Discovery,# K15048D-2)，根據製造商說明來測量。簡言之，將50μL/孔的校準液和樣本(以稀釋劑41稀釋)加到預先塗覆捕捉抗體之盤中並於室溫同時以700rpm震盪下培養2小時。然後以含0.05%(w/v)Tween-20之1X PBS將測定盤清洗3次，接著加入以稀釋劑45稀釋之25μL的偵測抗體溶液。於震盪和室溫下另再培養2小時後，將測定盤清洗3次，並於各孔槽中加入150μL的2X判讀緩衝液。立即於MSD Spector®儀器上判讀電化學發光。使用GraphPadPrismTM軟體進行數據分 析。
將來自各組所有小鼠之肺總蛋白萃取物中的各細胞激素濃度正常化至以Bradford分析所測量的萃取物之總蛋白含量，且表示各組每mg總肺蛋白之細胞激素的平均pg(pg/mg肺蛋白，±SD)係如表15所示。
收取肺供細胞激素分析：
在接受HDM 2週之IL-33 HumIn小鼠肺中釋放的細胞激素IL-4和IL-5之量明顯地高於以食鹽水緩衝液挑戰的IL-33 HumIn小鼠。相反的，相較於投予HDM而無治療或經同型對照物治療之IL-33 HumIn小鼠，在急性HDM挑戰期間經抗-IL-33抗體治療的IL-33 HumIn小鼠肺中，IL-4和IL-5量趨向於減低。
注意：指出藉由Kruskal-Wallis單因子ANOVA以鄧恩(Dunn’s)多重比較法事後試驗所測定之統計上顯著性(*=p<0.05,**=p<0.01，相較於第1組：IL33 HumIn小鼠，食鹽水挑戰)。
收取肺供肺細胞浸潤分析
放血後，將右肺尾葉從各小鼠中移出，切成約2至3mm大小的方塊，及然後置入含有以漢克(Hank’s)平衡鹽溶液(HBSS)(Gibco,#14025)稀釋之20μg/mL DNA酶(Roche,#10104159001)和0.7U/mL釋放酶 TH(Roche,#05401151001)溶液之試管中，將其於37℃水浴中培養20分鐘並每5分鐘進行渦旋。以10mM之最終濃度加入乙二胺四乙酸(Gibco,#15575)停止反應。隨後使用gentleMACS dissociator®(Miltenyi Biotec,#130-095-937)解離各肺，然後經由70μm過濾器過濾並離心。將生成的肺團塊懸浮於1mL的1X紅血球溶離緩衝液(Sigma,#R7757)中，以移除紅血球細胞。於室溫培養3分鐘後，加入3mL的1X DMEM以解除紅血球細胞溶離緩衝液。然後將細胞懸浮液離心，並將生成的細胞團塊懸浮於5mL的MACS緩衝液(autoMACS電泳緩衝液；Miltenyi Biotec,#130-091-221)。將懸浮的樣本經由70μm過濾器過濾並以每孔1x106個細胞置入96-孔V形底的盤中。然後將細胞離心並以1X PBS清洗團塊。第二次離心後，將細胞團塊懸浮於以1：1000於1X PBS中稀釋的100μL之LIVE/DEAD® Fixable Aqua Dead Cell Stain(Life Technologies,#L34957)，用以測定細胞存活力並於室溫同時避光培養20分鐘。以1X PBS清洗1次後，將細胞以含有10μg/mL純化的大鼠-抗-小鼠CD16/CD32 Fc Block(選殖株：2.4G2；BD Biosciences,#553142)之MACS緩衝液溶液於4℃培養10分鐘。將細胞清洗1次及然後以經MACS緩衝液稀釋之適當的抗體混合物(描述於表16中)於4℃同時避光培養30分鐘。抗體培養後，將細胞以MACS緩衝液清洗2次，再懸浮於BD cytofix(BD Biosciences,#554655)及然後於4℃同時避光培養15分鐘。隨後清洗細胞，在懸浮於MACS緩衝液中，及然後轉置於BD FACS試管(BD Biosciences,#352235)以流式細胞儀進行嗜鹼性粒細胞、第2型先天性淋巴細胞和淋巴細胞之分析。
活化的CD4 T細胞係定義為活的、CD45+、SSCLo、FSCLo、CD3+、CD19-、CD4+、CD8-和CD69+之細胞。活化的B細胞係定義為活的、CD45+、SSCLo、FSCLo、CD3-、CD19+和CD69+之細胞。嗜鹼性粒細胞係定 義為活的、CD45+、GR1-、CD11clo、SiglecFhi之細胞。ILC2細胞係定義為活的、CD45+、血統-(血統：CD19、CD3、CD11b、CD11c、F4/80)、CD127+、Sca-1+、ST2+。活化的CD4細胞之數據係以母群族(CD4，±SD)中活化細胞(CD69+)之出現率表示，如表1所示。
肺細胞浸潤分析：
如表17所示，在接受HDM 2週之IL-33 HumIn小鼠肺中，活化的CD4+ T細胞、嗜鹼性粒細胞和ILC2之出現率顯著高於以1X PBS對照物挑戰之IL-33 HumIn小鼠。相反的，相較於投予HDM而無治療或經同型對照物治療之IL-33 HumIn小鼠，在急性HDM挑戰期間經抗-IL-33抗體治療的IL-33 HumIn小鼠中觀察到這些浸潤的出現率趨向降低。
相較於以1X PBS對照物挑戰之IL-33 HumIn小鼠，在經HDM挑戰2週之IL-33 HumIn小鼠肺中觀察到活化B細胞的出現率趨向增加。相較於投予HDM而無治療或經同型對照物治療之IL-33 HumIn小鼠，因抗-IL-33抗體治療，在經HDM挑戰之IL-33 HumIn小鼠肺中觀察到肺活化B細胞的出現率顯著降低。
注意：指出藉由Kruskal-Wallis單因子ANOVA以鄧恩(Dunn’s)多重比較法事後試驗所測定之統計上顯著性(*=p<0.05,**=p<0.01，相較於第1組：IL33 HumIn小鼠，食鹽水挑戰；†p<0.05，相較於第3組：IL33小鼠，HDM挑戰2週+同型對照抗體)。
實例12：於活體內模型測試mAb；慢性HDM-引發的纖維化及嚴重肺發炎模型用以研究IL-33在肺發炎中的角色
於小鼠中進行一相關活體內模型，一急性HDM-引發的纖維化及嚴重肺發炎研究，用以測定抗-IL-33抗體H4H9675P之效用，其中該小鼠為表現人類IL-33代替小鼠IL-33(IL-33 HumIn小鼠)之同型。
將IL-33 HumIn小鼠由鼻內投予經20μL的1X磷酸緩衝食鹽水(PBS)(n=17)或20μL的1X PBS(n=3)稀釋之50μg的塵蟎萃取物(HDM；Greer,#XPB70D3A2.5)每週5天共計12週。將第二對照組之IL33 HumIn小鼠投予經20μL的1X PBS稀釋之50μg的HDM萃取物每週5天共計4週，以評估在開始抗體治療時疾病的嚴重度。
於HDM挑戰4週後，開始將二組經HDM挑戰的小鼠以皮下注射25mg/kg的抗-IL-33抗體H4H9675或同型對照抗體，及然後每週二次，直到HDM挑戰結束(抗體治療組8週)。在研究的第85天，將所有的小鼠進行安樂死並收取其肺。就各組小鼠之實驗給劑和治療方案係如表18所示。
收取肺供細胞激素分析
放血後，將右肺的前葉和中葉從各小鼠中移出並放入含有添加1X Halt蛋白酶抑制劑混合液(Pierce,#78430)之組織蛋白萃取試劑(1X T-PER試劑；Pierce,#78510)溶液的試管中。所有進一步的步驟係於冰上進行。就各樣本調整T-PER試劑(含有蛋白酶抑制劑混合液)之量以符合1：8(w/v)組織與T-PER比率。使用拋棄式研杵(Kimble Chase,# 749625-0010)以 手動於試管中將肺樣本均質。將產生的溶離物離心成團塊碎片。將含有可溶性蛋白萃取物之上清液轉置於新的試管並於4℃儲存，直到進一步分析。
使用Bradford分析測量肺蛋白萃取物中的總蛋白含量。就此分析，係將10μL稀釋的萃取物樣本以雙重複置入96孔盤中並與200μL的1X染劑試劑(Biorad,#500-0006)混合。使用牛血清白蛋白(Sigma,#A7979)之連續稀釋液，由700μg/mL溶於1X T-Per試劑之溶液開始，作為標準測量萃取物之蛋白濃度。於室溫培養5分鐘後，於Molecular Devices SpectraMax M5盤式判讀儀上以595nm測量吸收度。使用GraphPad PrismTM軟體進行用以測定以BSA標準為基礎之總肺萃取蛋白含量的數據分析。
肺蛋白萃取物中的細胞激素濃度係使用促發炎盤1(Proinflammatory Panel 1)(小鼠)多重免疫分析套組(MesoScale Discovery,# K15048D-2)，根據製造商說明來測量。簡言之，將50μL/孔的校準液和樣本(以稀釋劑41稀釋)加到預先塗覆捕捉抗體之盤中並於室溫同時於700rpm震盪下培養2小時。然後以含0.05%(w/v)Tween-20之1X PBS將測定盤清洗3次，接著加入以稀釋劑45稀釋之25μL的偵測抗體溶液。於室溫同時震盪下另再培養2小時後，將測定盤清洗3次，並於各孔槽中加入150μL的2X判讀緩衝液。立即於MSD Spector®儀器上判讀電化學發光。使用GraphPadPrismTM軟體進行數據分析。
將來自各組所有小鼠之肺總蛋白萃取物中的各細胞激素濃度正常化至以Bradford分析所測量的萃取物之總蛋白含量，而表示各組每mg總肺蛋白之細胞激素的平均pg(pg/mg肺蛋白，±SD)係如表19所示。
注意：指出藉由Kruskal-Wallis單因子ANOVA以鄧恩(Dunn’s)多重比較法事後試驗所測定之統計上顯著性(*=p<0.05,**=p<0.01，相較於第1組：IL33 HumIn小鼠，食鹽水挑戰)。
肺細胞激素分析：
在接受HDM 4週和12週之IL-33 HumIn小鼠肺中釋放的細胞激素IL-4和IL-5之量明顯地高於以1X PBS挑戰的IL-33 HumIn小鼠。相反的，相較於投予HDM而無治療或經同型對照物治療之IL-33 HumIn小鼠，在慢性HDM挑戰期間經抗-IL-33抗體治療的IL-33 HumIn小鼠肺中，IL-4和IL-5量有減低傾向。
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
胺基酸1-310：人類ST2(K19-S328之登錄號NP_057316.3)
胺基酸311-338：Myc-Myc-六組胺酸標籤
<400> 323

Claims (24)

  1. 一種與人類介白素33(IL-33)結合之分離的人類單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係抑制或減弱IL-33-媒介的訊號傳遞，並包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：274之重鏈可變區(HCVR)的互補決定區(CDRs)與具有胺基酸序列SEQ ID NO：282之輕鏈可變區(LCVR)的互補決定區。
  2. 如申請專利範圍第1項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係阻斷IL-33和ST2之相互作用。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係如活體外受體/配體結合分析於25℃所測量，以低於約10nM之IC50值阻斷IL-33和ST2之相互作用，或阻斷大於約50%的IL-33和ST2之相互作用。
  4. 如前申請專利範圍中任一項之分離的抗體或抗原結合片段，其中：(a)該抗體或其抗原結合片段，如以表面電漿共振分析於37℃所測量，係以低於約1nM之結合解離平衡常數(KD)與人類IL-33結合；及/或(b)該抗體或其抗原結合片段，如以表面電漿共振分析於37℃所測量，係以大於約8分鐘之解離半衰期(t½)與人類IL-33結合；及或(c)該抗體或其抗原結合片段，如以活體外嗜鹼性粒細胞活化試驗(BAT)所測量，係以低於約600pM之IC50抑制IL-33-媒介的人類嗜鹼性粒細胞之脫粒作用；及/或(d)該抗體或其抗原結合片段係抑制IL-33-媒介的IFN-γ從人類PBMC產生，係以低於約25nM、低於約3nM或低於約0.5nM之IC50抑制IL-33-媒介的IFN-γ從人類PBMC產生，如以活體外PBMC IFN-γ產生分析所測量；及/或(e)該抗體或其抗原結合片段，當投予過敏原-引發的肺發炎之動物模型時，係降低CD4+ T細胞、嗜鹼性粒細胞和ILC2細胞之出現率；及/或(f)該抗體或其抗原結合片段，當投予過敏原-引發的肺發炎之動物模型時，係降低肺中IL-4和IL-5之量，其中該抗體或其抗原結合片段，當投予過敏原-引發的肺發炎之動物模型時，相較於接受同型對照抗體之過敏原-挑戰的動物，係造成IL-4量至少4倍降低及/或IL-5量至少5倍降低。
  5. 如申請專利範圍第1項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係包括分別含有胺基酸序列SEQ ID NO：276-278-280-284-286-288的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3區。
  6. 如申請專利範圍第1項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包括含有胺基酸序列SEQ ID NO：274/282的HCVR/LCVR胺基酸序列對。
  7. 如申請專利範圍第6項之分離的抗體，其為IgG1或IgG4抗體。
  8. 一種分離的核酸分子，其係編碼如申請專利範圍第1至7項中任一項之抗體或抗原結合片段。
  9. 一種表現載體，其係包括如申請專利範圍第8項之核酸分子。
  10. 一種宿主細胞，其係包括如申請專利範圍第9項之表現載體。
  11. 一種醫藥組成物，其係包括如申請專利範圍第1至7項中任一項之抗體或抗原結合片段，以及醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
  12. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之專一與IL-33結合的抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第11項之醫藥組成物，係用於治療發炎疾病或病症，或至少一種與發炎疾病或病症有關的癥候，其中該發炎疾病或病症在發生的嚴重度、持續時間或頻率係得以減緩或降低，或至少一種與發炎疾病或病症有關的癥候，在發生的嚴重度、持續時間及/或頻率上係得以減緩或降低之方法。
  13. 如申請專利範圍第12項之抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物，其中該發炎疾病或病症係由下列組成之群中選出：氣喘、異位性皮膚炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、發炎性腸疾病、多發性硬化症、關節炎、過敏性鼻炎、嗜酸性粒細胞食道炎和乾癬。
  14. 如申請專利範圍第13項之抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物，其中該發炎疾病或病症為氣喘。
  15. 如申請專利範圍第14項之抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物，其中該氣喘為嗜酸性粒細胞氣喘或非-嗜酸性粒細胞氣喘。
  16. 如申請專利範圍第14項之抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物，其中該氣喘為類固醇阻抗性或類固醇敏感性氣喘。
  17. 如申請專利範圍第14項之抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物，其中該氣喘包含氣喘惡化。
  18. 如申請專利範圍第13項之抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物，其中該發炎疾病或病症為慢性阻塞性肺疾病(COPD)。
  19. 如申請專利範圍第18項之抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物，其中該慢性阻塞性肺疾病係由吸菸所致或部份由吸菸所造成。
  20. 如申請專利範圍第1-7項中任一項的抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第11項之醫藥組成物，其係用於治療對過敏原顯現敏感性之病患之方法，其中該方法包含投予有效量之該抗體、抗原結合片段或醫藥組成物至病患，且其中投予有效量之該抗體、抗原結合片段或醫藥組成物至病患後該病患係對過敏原顯現敏感性降低，或過敏反應減低，或不會經歷任何對過敏原之敏感性或過敏(allergic)反應或過敏性(anaphylactic)反應。
  21. 如申請專利範圍第12-20項中任一項之抗體、抗原結合片段或醫藥組成物，其進一步係包括投予一有效治療量之可用於減輕發炎疾病或病症，或至少一種與發炎疾病或病症有關的癥候，或用於減低對過敏原之過敏反應的第二治療劑，其中該第二治療劑係由下列組成之群中選出：非類固醇抗發炎藥(NSAID)、皮質類固醇、支氣管擴張劑、抗組織胺、腎上腺素、去充血劑、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)拮抗劑、IL-13拮抗劑、IL-4拮抗劑、IL-5拮抗劑、IL-6拮抗劑、IL-25拮抗劑、IL-17拮抗劑及另外的IL-33拮抗劑，或不同的IL-33之抗體。
  22. 一種申請專利範圍第1-7項中任一項的抗體或抗原結合片段於製造用以治療IL-33-媒介的發炎疾病或病症之藥物的用途，其中該發炎疾病或病症係選自以下組成之群組：氣喘、異位性皮膚炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、發炎性腸疾病、多發性硬化症、關節炎、過敏性鼻炎、嗜酸性粒細胞食道炎和乾癬。
  23. 如申請專利範圍第22項之用途，其中該疾病或病症係氣喘。
  24. 如申請專利範圍第22項之用途，其中該疾病或病症係慢性阻塞性肺疾病(COPD)。
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