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TWI617569B - 製備生理活性多肽複合物之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種藉由使用有機溶劑，透過共價鍵連結生理活性多肽，與非胜肽聚合物而製備生理活性多肽和非胜肽聚合物之接合物的方法，以及藉由連結該接合物與載體而製備生理活性多肽複合物之方法，以改善生理活性多肽之活體內(invivo)持續時間和穩定性。本發明之方法能製備具有高純度和高產率之該生理活性多肽與非胜肽聚合物之接合物，且利用此法製備之生理活性多肽複合物，可提供生產成本的減少，和於相對高程度延長活體內活性並顯著增加血液半衰期的優勢，因此可被有效地用於生理活性多肽之持續釋放型製劑的發展，其能提高使用該藥物之患者的適應性。

Description

製備生理活性多肽複合物之方法
本發明係關於一種藉由使用有機溶劑，透過共價鍵連結生理活性多肽，與非胜肽聚合物而製備生理活性多肽和非胜肽聚合物之接合物，以及藉由連結該接合物與載體製備而生理活性多肽複合物之方法，以改善生理活性多肽之活體內持續時間和穩定性。
一般而言，生理活性多肽由於它的低穩定性而容易變性且藉由蛋白質水解酶而分解，容易透過腎臟或肝臟移除。因此，為了維持含有作為藥理活性成分之生理活性多肽之蛋白質藥物的血液濃度和效力，必須頻繁地投藥蛋白質藥物給患者。然而，主要以可注射的製劑形式投藥蛋白質藥物給患者的情況下，頻繁地注射以維持該活性多肽之血液濃度，可能會導致患者過多的痛苦。為了解決此問題，已持續致力於藉由增加蛋白質藥物的血液穩定性並維持較長時間的血液藥物濃度來最大化藥理功效。這種製劑的持續發展需要增加蛋白質藥物的穩定性，並同時使藥物本身的效力保持在一個足夠高程度，以及不引起患者的免疫反 應。
在先前技術中，已使用一種化學添加具有高溶解度之聚合物(如聚乙二醇，以下簡稱為PEG)至蛋白質藥物表面之方法，來穩定蛋白質和抑制與蛋白質水解酶接觸和通過腎臟損失。已知PEG係有效地藉由非專一性結合PEG至該目標蛋白質的特定位置或各種位置來增加該蛋白質之溶解度，進而穩定蛋白質並預防該蛋白質之水解，且不會引起任何不良副作用(Sada等人，J.Fermentation Bioengineering 71：137-139,1991)。然而，雖然此PEG結合可以增加蛋白質的穩定性，其後果為顯著地降低該生理活性多肽之效力，以及於PEG分子量增加的同時造成該PEG與蛋白質的反應性降低，進而減少該結合產率。因此，本案發明人已提供藉由以非胜肽聚合物連結生理活性多肽與載體所形成的接合物。然而，對於具有高產率和純度之該接合物之製備方法的需求已增加，且先接合載體與非胜肽聚合物之早先方法，具有產生極大費用的缺點。
同時，胰島素係一種自人胰臟之β細胞分泌的多肽，其作為在身體中調控血液葡萄糖水平一事扮演非常重要角色之材料。在胰島素不正常分泌或胰島素分泌不正常地作用在身體的情況下，身體血液中的葡萄糖無法被調控並且會增加，從而誘導俗稱為糖尿病之狀態。如上所述之情況稱為第2型糖尿病，而該胰島素不會自胰臟分泌進而增加血液葡萄糖之情況稱為第1型糖尿病。
以一種口服降血糖劑治療第2型糖尿病，該降血糖劑 包含作為主要成分的化學材料，並在某些患者也用胰島素治療。另一方面，第1型糖尿病的治療一定需要胰島素之投藥。
目前廣泛使用的胰島素治療是在用餐前與後通過注射胰島素而投藥之方法。然而，這種胰島素治療需要每日三次不斷地投藥，因此導致了痛苦和不便。為了克服這種問題，已作出各種嘗試。其中一種已試圖藉由增加胜肽藥物之生物膜浸透性而通過口腔或鼻腔之吸入方法將肽藥物遞送進入身體。然而，這種方法相較於注射，在身體內具有顯著較低的遞送效率，因此在該所需的條件下保持胜肽藥物之體內活性尚有許多困難。
此外，已嘗試過量藥物之皮下投藥後用於延遲吸收之方法。據此，已發明僅透過單次投藥維持血液藥物濃度的方法。某些目前已核准作為醫藥產品(例如：來得時，賽諾菲-安萬特(Lantus,Sanofi-aventis))且投藥給患者。已進行以脂肪酸修飾胰島素，以透過結合投藥位置和血液中存在的白蛋白來加強該胰島素聚合物的結合並延長該持續時間之研究，且使用這種方法生產的藥物已被核准為醫藥產品(諾和平，諾和諾德(Levemir,NovoNordisk))。但是，這些方法在投藥部位引起疼痛的副作用，另外，每天單次注射的投藥間隔仍對患者而言為沈重的負擔。
此外，已不斷地致力於藉由增加在胜肽藥物吸收至身體後血液穩定度和長時間維持高水平的血液藥物濃度使其功效最大化。需要這種胜肽製劑的持續發展以提高胜肽藥 物的穩定性，並同時保持藥物本身的效力於足夠高的水平，以及不會誘導患者的免疫反應。已有藉由化學添加具有高的溶解度之聚合物材料(如聚乙二醇(PEG))至胜肽表面之方法而製備此胜肽藥物之製劑。
PEG係有效地藉由非專一性結合至該目標胜肽的特定位置或各種位置來增加該胜肽之分子量，進而抑制通過腎臟之胜肽的損失並預防水解，另外地不會引起任何不良副作用。例如，WO 2006/076471描述B型排鈉利尿胜肽(B-type natriuretic peptides(BNP))(其藉由結合至NPR-A而活化cGMP之製造以降低該動脈血壓且因而作為用於治療充血性心臟衰竭的試劑)。係其與PEG接合以保持這些胜肽的生物活性。US 6,924,264揭露藉由Exendin-4之賴胺酸殘基與PEG接合而增加活體內持續時間之方法。然而，這些方法能藉由增加該PEG之分子量而延長胜肽藥物的活體內的持續時間，但具有該胜肽藥物之功效明顯地下降，以及隨著分子量增加，該PEG與胜肽之反應性下降，從而導致產率下降的問題。
WO 02/46227揭露藉由重組基因技術之GLP-1和艾塞那肽-4(Exendin-4)或其類似物與人血清白蛋白或免疫球蛋白片段(Fc)之融合蛋白，且US 6,756,480揭露副甲狀腺激素(PTH)及其類似物與Fc之融合蛋白。其中所公開的方法可克服低聚乙二醇化產率和非專一性的問題，但具有與預期相反之血中半衰期之增加不顯著高，並在某些情況下具有低力價(titer)的問題。為了最大化增加血中半衰期的效 果，也可使用各種胜肽連接子，但可能有誘導免疫反應的可能性。除此外之還有的問題為，在使用如BNP之具有二硫鍵之胜肽的情況下，由於高的錯誤折疊(misfolding)機率，其應用係困難的，以及在非天然胺基酸殘基存在的情況下，不可能製造基因重組之形式。
本發明人致力於發現一種同時最大化增加血中半衰期並保持生理活性多肽(包括胰島素)之活體內活性的方法。 結果，他們已發現，在含有有機溶劑之反應溶液中生理活性多肽首先連接到非胜肽聚合物的情況下，可降低生產成本且可製備具有高產率和純度之生理活性多肽與非胜肽聚合物的接合物，以及確定下列事實：相較於已知框融合(inframe fusion)方法，當使用該接合物製備生理活性多肽複合物時，該接合物在活體內的活性保持在高的水平且增加血中半衰期的功效係大幅地改善，從而完成本發明。
本發明的目的係提供一種用於製備生理活性多肽與非胜肽聚合物之接合物的方法，以延長生理活性多肽之血中半衰期同時保持其活體內活性。
本發明的另一目的係提供一種藉由共價連結載體與該生理活性多肽和非胜肽聚合物之接合物而製備生理活性多肽複合物的方法。
本發明之方法可製備具有高純度和產率之生理活性多肽與非胜肽聚合物的接合物，且利用此優勢所製備之生理活性多肽複合物可提供後續生產成本的減少，和延長活體內活性在較高的水平且顯著增加該血中半衰期，因此可以有效地用於可增加患者的藥物給藥能力之持續釋放型製劑的發展。
第1圖顯示以SEC HPLC鑑定出胰島素-PEG接合物於β鏈進行修飾的分析結果。A：胰島素之還原條件，B：PEG-胰島素之還原條件。
第2圖顯示以胜肽圖譜鑑定出胰島素-PEG接合物對於β鏈的1號苯基丙胺酸(B1F)之修飾為95%或更多的分析結果。A：胰島素的胜肽圖譜結果，B：PEG-胰島素的胜肽圖譜結果，C：胜肽圖譜中PEG-胰島素序列和預測的裂解位置(紅色線)。
第3圖顯示胰島素-PEG接合物在各個緩衝溶液之條件下，以RP-HPLC和SE-HPLC分析的結果。實線箭頭表示單-聚乙二醇化的胰島素之峰，以及虛線箭頭表示以橋接形式聚乙二醇化的雜質之峰。各個緩衝溶液之條件如下所示。
A：(a)100mM磷酸鉀(pH6.0)的緩衝溶液，(b)100mM磷酸鉀(pH 6.0)，30%異丙醇的緩衝溶液；(c)100mM磷酸鉀(pH 6.0)中，45%異丙醇的緩衝溶液；(d)100mM磷酸鉀(pH 6.0)，55%異丙醇的緩衝溶液； B：(a)50mM檸檬酸鈉(pH6.0)，45%異丙醇的緩衝溶 液；(b)50mM檸檬酸鈉(pH6.0)，55%異丙醇的緩衝溶液； C：(a)50mM乙酸鈉(pH4.0)的緩衝溶液；(b)50mM乙酸鈉(pH4.0)，10%異丙醇的緩衝溶液；(c)50mM乙酸鈉(pH4.0)，20%異丙醇的緩衝溶液；(d)50mM乙酸鈉(pH4.0)，30%異丙醇的緩衝溶液；(e)50mM乙酸鈉(pH4.0)，40%異丙醇的緩衝溶液；(f)50mM乙酸鈉(pH4.0)，45%異丙醇的緩衝溶液；(g)50mM乙酸鈉(pH4.0)，50%異丙醇的緩衝溶液。
第4圖顯示胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物以RP HPLC分析(A)和SE HPLC分析(B)之結果。
第5圖顯示胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物以SDS PAGE分析之結果。M：標記物尺寸，1：胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物之還原條件，2：胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物之非還原條件。
第6圖顯示藥物動力學試驗的結果以鑑定出判斷胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物的活體內持續時間。iv：靜脈內給藥，sc：皮下給藥。
第7圖顯示胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物之活體內效力試驗的結果。
最佳模式
於實現上述目的之一方面，本發明提供製備生理活性多肽和非胜肽聚合物之接合物的方法，包括：(1)在包括有機溶劑之反應溶液中反應該生理活性多肽與非胜肽聚合物 以連結生理活性多肽與非胜肽聚合物；以及(2)自該步驟(1)之反應混合物分離和純化該生理活性多肽共價連結至非胜肽聚合物之接合物。
本發明中使用的有機溶劑表示能夠溶解固體、液體和氣體的液體有機化合物，並且可以被包括在該反應溶液中，以便非胜肽聚合物可以共價結合到具有高產率和純度的生理活性多肽之N-末端，為本發明之目的。
可施用任何在本領域中常規使用之有機溶劑至本發明。本發明所使用之有機溶劑較佳地包括，但不限於，所有的一級、二級和三級醇類。可使用具有1至10個碳原子之醇類。更佳地，該醇可為異丙醇、乙醇或甲醇。根據生理活性多肽的類型，可自由地選擇任何合適的有機溶劑。
有機溶劑係包含在反應溶液中，以用於連接於生理活性多肽和非胜肽聚合物之間，且基於反應溶液的總體積，其之量可佔10至60體積%，較佳量為30至55體積%，更佳量為45至55體積%，但不限於此。此外，該反應溶液的pH可較佳為，但不限於，4.5至7.0，更較佳為5.5至6.5。在此情況下，雖然生理活性多肽在具有弱酸性pH的反應溶液中，一般顯示溶解度降低的傾向，使用根據本發明之有機溶劑，其具有可解決所述溶解性之問題的優點，以順利地進行該反應。
本發明之一具體實施例中，為了選擇性地接合PEG至胰島素β鏈的N-末端，作為有機溶劑之異丙醇係包括在該反應溶液中，以在各種pH進行胰島素的聚乙二醇化。然 後，發現在有機溶劑包括在反應溶液中的情況下，能有效地減少各種雜質，以製備具有高純度和產率之生理活性多肽和非胜肽聚合物的接合物(表1)，利用這個發現，終於可以製備均勻和高度純化的生理活性多肽複合物。本發明之具體實施例中，雜質的含量和單-聚乙二醇化之胰島素的比例，可依該異丙醇的含量和反應溶液的pH而改變。具體而言，在pH 6.0，基於該反應溶液之總量，當含有45至55%水平之異丙醇，已確定單-聚乙二醇化之胰島素的含量達到最大可達到的水平(表1)。
本發明中所使用的術語「生理活性多肽」表示在生物體內具有任何生理功能之多肽的一般概念，並具有具多肽結構之共同特徵，且亦有各種生理活性。該生理活性扮演糾正異常病理的角色，該異常病理係由於有關藉由調控基因表現和生理功能而調節生物體之生理功能之物質分泌缺乏和過多所致。該生理活性多肽可包括一般的蛋白質治療劑。
本發明中所使用的生理活性多肽，包括所有在生物體中具有生理活性的物質，不限於且可包括，例如胰島素、黃體激素(LTH)、卵泡刺激素(FSH)、凝血因子VIII、凝血因子VII、脂聯素、抗體、抗體片段scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、或鬆弛素等，較佳為胰島素。生理活性多肽可以有兩個或更多個N-末端(胺基末端)。
本發明中所使用的胰島素為具有根據下列機制調控血糖之功能之胜肽：在身體中高血糖的條件下，自該胰臟分 泌胰島素，並吸收糖於肝臟、肌肉和脂肪組織中並待呈肝醣儲存在之，且抑制脂肪的分解和其用作為能量來源。這種胜肽包括胰島素促效劑(agonist)、前體(precursor)、衍生物、片段和變異體(variant)等，較佳為天然胰島素、即釋型(immediate-releasing)胰島素，持續釋放型(sustained-releasing)胰島素。
該天然胰島素為從胰臟分泌的激素，且一般扮演藉由促進細胞內葡萄糖的吸收和抑制脂肪分解而調控活體內血糖的角色。胰島素係透過一系列的過程，藉由從不具有調控血糖之胰島素原前體變成為具有調控血糖的功能之胰島素之方式製造。該胰島素的胺基酸序列如下所示。
α鏈：Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID No：1)
β鏈：Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID No：2)
胰島素促效劑意指其係結合至活體內之胰島素受體而顯示與胰島素相同生物活性之物質，不論胰島素的結構為何。
胰島素衍生物表示相較於天然胰島素，衍生物之胺基酸序列中顯示至少80%的序列相同性之胜肽，其胺基酸殘基之基團上具有一些化學取代(如α-甲基化、α-羥基化)、 移除(例如脫胺)或修飾(如N-甲基化、糖基化、脂肪酸)之形式改變，並具有調控身體內血糖的功能。
胰島素片段表示其中一個或多個胺基酸被添加至、或自胰島素之胺基端或羧基端刪除之胰島素的類型，且該所添加之胺基酸亦可為非天然的胺基酸(例如，D型胺基酸)。這種胰島素片段保留調控身體內血糖的功能。
胰島素變異體表示其與胰島素不同於一個或多個胺基酸序列，並保留調控身體內血糖功能之胜肽。
可單獨或組合使用分別用於胰島素促效劑、衍生物、片段和變異體之製備的方法。例如，本發明包括其中一個或多個胺基酸序列不同於胰島素所具者，以及其中具有在N-末端胺基酸殘基之脫胺，且亦具有調控制身體內血糖之功能的胜肽。
作為具體的實施例，本發明中所使用之胰島素可透過重組方法製造，且亦可自合成方法(包括固相合成)製造。
另外，本發明中所使用之胰島素，其特徵在於非胜肽聚合物係與β鏈之N-末端(胺基末端)接合。在胰島素的情況下，因為α鏈之修飾導致降低的活性與減低的穩定性，本發明可連接非胜肽聚合物至胰島素之β鏈N-末端，以維持該胰島素之活性，同時改善該胰島素之穩定性。
本發明中所使用的術語「凝血因子」表示該參與凝血的蛋白，其在發生因受傷而出血的情況下，透過血液凝固的作用保護身體。血液凝固為涉及12個因子之一系列反應。其中，凝血因子VIII也稱為抗血友病因子，其係由於 其遺傳缺陷而提高血友病之因子，以及凝血因子VII也稱為血清凝血酶原(proconvertin)，且為可作為血液凝固劑，以透過其活化以造成血液凝固之因子。
本發明中所使用的術語「脂聯素」表示該自脂肪細胞分泌之蛋白，且其為涉及脂肪和糖之代謝的物質。脂聯素為已知具有在成年期減少心臟病和糖尿病風險且藉由讓肌肉將脂肪轉化為能量而抑制食慾之功能的蛋白。此外術語「鬆弛素」表示一種自卵巢黃體分泌，並放鬆恥骨聯合和促進分娩的荷爾蒙。弛緩素為一種扮演放鬆整個身體的骨骼和關節之角色的荷爾蒙。
本發明中所使用的術語「非胜肽聚合物」表示該藉由組合兩個或更多個重複單元形成之生物相容性聚合物，其中該重複單元係透過視需要之共價鍵(而不是胜肽鍵)相互連結。
可用於本發明之非胜肽聚合物可選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇之共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡萄聚醣、聚乙烯基乙基醚、可生物降解的聚合物，如聚乳酸(PLA)和聚乳酸-甘醇酸(PLGA)、脂質聚合物、甲殼素、透明質酸和其組合所組成之群組，較佳為聚乙二醇。本發明之範圍包括本領域中已知的所有其等之衍生物，且該衍生物在本領域之技術水平可輕易製備。
使用於根據現有框融合方法所製備之融合蛋白之胜肽連接子具有下列缺點：其藉由蛋白分解酵素容易在活體內裂解，因此，任何由於使用相應載體之活性藥物之血中半 衰期的增加低於預期。然而，發現本發明中之胜肽之血液半衰期係類似於載體之血液半衰期，這是由於使用的聚合物為抵抗蛋白分解酵素者。因此，本發明中任何具有該功能(即具有活體內抵抗蛋白分解酵素功能)的聚合物，可用作為非胜肽聚合物，沒有任何限制。該非胜肽聚合物具有較佳範圍為1至100 kDa，且較佳範圍為1至20 kDa的分子量。此外，雖然係與該生理活性多肽接合之非胜肽聚合物可為一種聚合物，不同種聚合物的組合亦可用於本發明中。
本發明所使用之非胜肽聚合物可在2個端或3個端具有反應基，其可與生理活性多肽和載體接合。
該非胜肽聚合物的反應基較佳可為，但不限於，反應性醛基、丙醛基、丁醛基、馬來醯亞胺基、鄰-吡啶二硫醚、硫醇或琥珀醯亞胺衍生物。上述中亦可使用該琥珀醯亞胺衍生物：丙酸琥珀醯亞胺酯、羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺基羧甲基或碳酸琥珀醯亞胺酯。特別是，當非胜肽聚合物之端具有反應性醛基作為反應基團，有效地最小化非專一性反應，並用於使非胜肽聚合物之端點分別與生理活性多肽和載體接合。自以醛鍵還原烷化所製備之最終產物係較自以胺鍵連結所製備者來得更穩定。醛反應基團可在低pH水平選擇性地與胺基末端反應，並能在低pH水平(例如，pH 9.0的條件)與賴胺酸殘基形成共價鍵。
該反應基團存在於非胜肽聚合物的兩個端或三個端，彼此可為相同或不同。例如，馬來醯亞胺基可存在於一個 端，且醛基、丙醛基或丁醛基可存在於另一個端。當使用兩個端皆具有羥基反應基團之聚(乙二醇)作為非胜肽聚合物，可藉由已知的化學反應或使用市售的具有經修飾之反應基的聚(乙二醇)活化羥基成為各種反應基團，可製備本發明之蛋白接合物。
在此期間，用於分離和純化該包括其N-末端與非胜肽聚合物共價連結之生理活性多肽之接合物的步驟，本發明之步驟(2)中可以使用本領域中已知的任何方法，沒有任何限制，且較佳為採用離子交換色層分析。
於另一方面，本發明提供一種用於製備生理活性多肽複合物的方法，包括：(1)根據該方法製備該生理活性多肽和非胜肽聚合物的接合物；以及(2)共價連接選自免疫球蛋白Fc區、抗體、白蛋白和運鐵蛋白(transferrin)所組成群組之載體與該接合物之該非胜肽聚合物，以製造胜肽複合物，其中非肽聚合物之諸端分別連結至該生理活性多肽和載體。
本發明中所使用的術語「複合物」係指有關一種由至少一種生理活性多肽，至少一種非胜肽聚合物和至少一種載體透過它們之間的共價鍵互連所組成之結構。為了將之與「複合物」區分，本文中所使用的「接合物」係指有關一種結構，其只有生理活性多肽和非胜肽聚合物對透過共價鍵相互連接。
本發明中，「載體」表示一種連結至藥物之物質，且一般為連結至藥物以增加、減少或刪除該藥物之生理活性之 物質。用於本發明之目的，該與載體連結之藥物較佳為生理活性多肽(其亦可連結至非胜肽聚合物)。該載體是一種最小化待與其連結之生理活性多肽在活體內之活性下降，且同時增加該藥物在活體內之穩定性之物質。該載體可較佳地包括，但不限於，免疫球蛋白Fc區、抗體、白蛋白和運鐵蛋白。
該免疫球蛋白Fc區是一種生物體中可代謝之可生物降解的多肽，因此作為藥物的載體係安全的。此外，由於免疫球蛋白Fc區具有小於整體免疫球蛋白分子的分子量，其在接合物之製備、純化及產量的觀點係有利的。另外，由於每個抗體之胺基酸序列不同，藉由除去顯示出高異質性(heterogeneity)之Fab部分，可預期提供大幅增加該物質之同質性和降低誘導該血液抗原性之可能性之效果。
本發明中，「免疫球蛋白Fc區」表示免疫球蛋白之重鏈恆定區2(CH 2)和重鏈恆定區3(CH 3)部分，除了免疫球蛋白之重鏈和輕鏈可變區，重鏈恆定區1(CH1)和輕鏈恆定區1(CL1)，亦可包括重鏈恆定區中的樞紐(hinge)部分。此外，若本發明之免疫球蛋白Fc區相較於天然形式，具有基本上相當或改善之效果，除了免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區，它可為包括該重鏈恆定區1(CH1)和/或輕鏈恆定區1(CL1)的一部分或全部之擴大的Fc區。另外，它亦可為其中除去對應於CH 2和/或CH 3之顯著長的胺基酸序列之區域。亦即，本發明之免疫球蛋白Fc區可為：(1)CH1域、CH2域、CH3域和CH4域，(2)CH1域和CH2域，(3)CH1 域和CH3域，(4)CH2域和CH3域，(5)一個或兩個或更多個域和免疫球蛋白樞紐區(或樞紐區之一部分)之組合，以及(6)重鏈恆定區和輕鏈恆定區之各個域的二聚體。
另外，本發明之免疫球蛋白Fc區域包括天然胺基酸序列以及它們的序列突變體。該胺基酸序列的突變體表示那些具有由於在天然胺基酸序列中之一個或多個胺基殘基之缺失(deletion)、插入(insertion)、非保留或保留取代和其組合之不同序列。例如，在IgG Fc的情況下，存在於214至238、297至299、318至322或327至331位置之胺基酸殘基可被用作為適合修飾的位置。此外，其中除去能夠形成二硫鍵位置之各種突變體，自N-末端天然的Fc刪除某些胺基酸，或可添加甲硫胺酸殘基到N-末端天然的Fc。另外，為了除去效應物(effector)功能補體(complement)結合位置，例如，可除去C1q的結合位置，亦可除去ADCC位置。用於製備這種免疫球蛋白Fc區域之序列突變體的技術已被揭露在國際專利申請案公開第97/34631號，和國際專利申請案公開第96/32478號等。
本域中(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)已進行了在蛋白和胜肽中之胺基酸之一些交換，其不完全改變分子的活性。於胺基酸殘基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu或Asp/Gly之間之交換係最經常發生的交換。
如果合適，它們可經磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙醯化、醯胺化等修飾。
如上所述的Fc突變體係顯示如本發明之Fc區相同生物活性的突變體，且具有Fc區對熱、pH等之增強的結構穩定性。
另外，這種Fc區可自人類和動物(包括牛、羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、天竺鼠等)之生物體中分離的天然形式獲得，亦可為該得自經轉形的動物細胞或微生物，或其衍生物之重組體。在此，從天然形式取得之Fc片段可從人類或動物生物體分離整個免疫球蛋白，以及以蛋白分解酵素處理整個免疫球蛋白而獲得。當免疫球蛋白用木瓜酶處理時，它被裂解成Fab和Fc，而在胃蛋白酶處理免疫球蛋白的情況下，可被裂解成pF'c和F(ab)2。然後，該反應混合物可進行尺寸排阻層析(size-exclusion chromatography)而分離Fc或pF’c。
較佳係使用微生物自人衍生的Fc區獲得該重組免疫球蛋白Fc區。
此外，免疫球蛋白Fc區可呈具有天然糖基鏈的形式，其相較於天然形式增加該糖基鏈，相較於天然形式減少該糖基鏈，或去糖基化。這樣的免疫球蛋白Fc糖基鏈的增加、減少或移除，可透過傳統的方法(包括化學方法、酶學方法和利用微生物之基因工程方法)完成。於此，由於免疫球蛋白Fc區中，自Fc除去糖基鏈，顯示該補體(Clq)的結 合力顯著地降低，並提供抗體依賴性細胞毒性或補體依賴性細胞毒性之減少或去除，它們不誘導生物體中任何必要的免疫反應。有鑑於此，更適合用於本發明主要目的作為藥物之載體的形式可去糖基化或無糖基化免疫球蛋白Fc區。
本發明中「去糖基化」係指以酶除去Fc區之糖基，以及「無糖基化」表示從原核動物(較佳為自大腸桿菌)產生的且未經糖基化的Fc區。
此外，免疫球蛋白Fc區可為衍生自IgG，IgA，IgD，IgE或IgM之Fc區，或衍生自它們的組合或其融合物之Fc區。較佳地，免疫球蛋白Fc區可衍生自IgG或IgM，其為人體血液中含量最豐富的，且最佳地衍生自已知改善該配體-接合的蛋白質之半衰期之IgG。
同時，本發明中「組合」表示於二聚體和多聚體的製造中形成編碼衍生自相同起源之單鏈免疫球蛋白Fc區之多肽與衍生自不同起源之單鏈多肽之結合。亦即，自選自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段所組成群組之兩種或更多種片段製備二聚體或多聚體係可能的。
本發明中，該術語「融合物」表示存在於單鏈免疫球蛋白Fc區中存在有對應於兩個或更多個衍生自不同來源的免疫球蛋白Fc片段的序列。本發明之具體實施例中，可用各種類型之融合物。亦即，可用包括選自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgD Fc之CH1、CH2、CH3和CH4所組成群組之一至四種域之融合物，其可進一步包括樞紐 部分。
另外，IgG亦可以被分類成為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4之亞型(subclass)，且本發明中可使用其組合或融合物。較佳為IgG2和IgG4亞型，且最佳為該IgG4之Fc區實際上沒有效應物功能，如最佳為補體依賴性細胞毒性(CDC)。
亦即，最佳用作為本發明藥物之載體之免疫球蛋白Fc區係人類IgG4衍生的無糖基化Fc區。人類衍生的Fc區於人體內作為抗原，因此更佳於可能會導致不欲之免疫反應(例如新抗體的形成)之非人類衍生的Fc區。
根據本發明之方法可製備具有高純度和產率之本發明之生理活性多肽複合物，並能顯示改善活體內的持續時間和穩定性，因此對以生理活性多肽治療而言，對服藥之適應性之改善可更多。本發明之一實施例中，使用根據本發明之方法所製備之胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物以確認其在活體內消失之半衰期。結果，我們已確定在靜脈內給藥的情況下，它們顯示15.73小時之持續時間，以及在皮下給藥的情況下為16.98小時，其較在天然的胰島素的情況下為約0.5小時的持續時間長30倍(第6圖)。另外，按照在活體內效力試驗的結果，我們還發現，它們的血糖降低效力持續約4天(第7圖)。
本發明亦可提供一種包括該生理活性多肽複合物的生理活性多肽之持續型製劑。
在本發明中，術語「給藥」係指透過任何適合的方法引入給定之藥物給患者。該複合物可透過任何傳統途徑給 藥，只要該途徑能允許該藥物抵達至目標組織。該複合物之給藥包括，但不限於，腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內和直腸內給藥等。然而，在口服給藥的情況下由於胜肽藥物被消化，該口服組成物係較佳藉由塗覆該活性藥物製劑以避免胃之消化。較佳地，本發明之複合物可以注射形式給藥。此外，持續釋放型製劑可透過任何視需要之可以允許活性物質移到目標細胞之裝置給藥。
該包括本發明複合物之持續釋放型製劑可包括藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體包括可用於口服給藥之黏合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、色料和香料等；可呈下列之組合用於注射之緩衝劑、防腐劑、無痛劑、增溶劑、等滲劑和穩定劑等；以及可用於局部給藥之鹼、賦形劑、潤滑劑和防腐劑等。本發明之持續釋放型製劑可藉由已與上述藥學上可接受的載體混合不同地製備。例如，該製劑可以製備成用於口服給藥之片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮液、漿劑、片劑(wafer)等的形式，和用於注射之單次或多次給藥之安瓿的形式。本發明之複合物亦可製劑成其他形式，包括溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊劑、持續釋放型製劑等。
同時，適合用於製劑之載體、賦形劑和稀釋劑之可用實例為乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚 乙烯吡咯烷酮、水、甲基羥基苯甲酸酯、丙基羥基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸鎂或礦物油等。此外，可以額外地使用填料，抗凝結劑、潤滑劑、潤濕劑、香料、防腐劑等。
本發明之持續釋放型製劑的給藥可以根據作為活性成分之藥物的種類與各種相關因素來決定，包括治療的疾病、給藥途徑、患者的年齡、性別和體重，疾病嚴重程度等。本發明之持續釋放型製劑具有良好的活體內持續時間和效力，因此可使本發明之藥物製劑的給藥頻率顯著減少。此外，持續釋放型製劑可以維持生理活性多肽之活體內的持續時間和穩定度，因此可以有效地使用於疾病之治療。
下文中之目的係藉由實施例更具體地解釋本發明。然而，所提供之實施例僅更詳細地說明本發明，並不以任何方面之實施例侷限本發明之範疇。
實施例1：胰島素之聚乙二醇化(PEGylation)反應和單-聚乙二醇化之胰島素之純化
胰島素粉末溶解在10mM HCl中，然後在4至8℃，於下列條件(包括胰島素：PEG之莫耳比為1：2至4，及3至5 mg/ml胰島素濃度)與3.4K二乙基酮-ALD2 PEG(具有2個丙醛基之PEG,IDB，韓國)反應2小時，以聚乙二醇化該胰島素β鏈之N-末端。在50 mM檸檬酸鈉pH 6.0，和加入4至20 mM NaCNBH3還原劑之45%異丙醇下進行該反應。該反應溶液以使用含有檸檬酸鈉(pH 3.0)和45% EtOH和KCl的濃度梯度之緩衝劑之SP-HP(GE Healthcare)管柱純化。
其經由SE-HPLC及胜肽圖譜分析鑑定，如是製備的單-聚乙二醇化之胰島素在β鏈之1號苯基丙胺酸(B1F)有98%或更多的聚乙二醇化(第1圖和第2圖)。
實施例2：取決於反應溶液之pH和該有機溶劑之濃度之單PEG-胰島素之產率和雜質含量之變化
為了比較於製備期間，當這種(如異丙醇)有機溶劑包含在胰島素與PEG之反應的反應溶液中時，該單PEG-胰島素之反應產率和該雜質之產量，其中係在4℃；胰島素和3.4K二乙基酮-ALD2 PEG之莫耳比為1：2；與3 mg/ml胰島素濃度的條件下反應4小時。於此，分別使用50mM檸檬酸鈉pH 6.0，45%異丙醇的緩衝溶液；50mM檸檬酸鈉pH 6.0，55%異丙醇的緩衝溶液；100mM磷酸鉀pH 6.0的緩衝溶液；100mM磷酸鉀pH6.0，30%異丙醇的緩衝溶液；100mM磷酸鉀pH 6.0，45%異丙醇的緩衝液；100mM磷酸鉀pH 6.0，55%異丙醇的緩衝溶液；50mM的乙酸鈉pH 4.0的緩衝溶液；50mM乙酸鈉pH 4.0，10%異丙醇的緩衝溶液；50mM乙酸鈉pH4.0，20%異丙醇的緩衝溶液；50mM乙酸鈉pH 4.0，30%異丙醇的緩衝溶液；50mM乙酸鈉pH4.0，40%異丙醇的緩衝溶液；乙酸鈉pH 4.0，45%異丙醇的緩衝溶液；以及50mM乙酸鈉pH 4.0，50%異丙醇的緩衝溶液作為反應溶液，添加20 mM NaCNBH3至其中作為還原劑。分別以實施例1所使用的相同方法純化各反應溶液，且其純化曲線顯示於第3圖。當胰島素的α鏈和β鏈之N-末端兩者同時以橋接的形式與PEG反應時，單-聚乙 二醇化的胰島素與免疫球蛋白Fc之偶合(coupling)反應係不可能發生。因此，這種雜質的比率顯示於表1。從表1可見，該單-聚乙二醇化的胰島素之比率係隨反應溶液中異丙醇之含量和pH條件而改變，且當異丙醇之含量為約45至55%時，於pH 6.0該單-聚乙二醇化的胰島素之含量到達最大值。當異丙醇的含量升高，低pH條件導致該橋型聚乙二醇化的雜質增加，從而導致單-聚乙二醇化的胰島素之產量減少。
實施例3：單-聚乙二醇化的胰島素和免疫球蛋白F之複合物的製備
為了製備胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物，於25℃將如實施例1之方法製備之單-聚乙二醇化的胰島素和免疫球蛋白Fc於莫耳比率1：1與總蛋白含量為20至50 mg/ml條件反應15至17小時。在此反應中，該反應溶液包括100mM HEPES，22mM磷酸鉀，10%乙醇，pH8.2，並進一步含有20mM NaCNBH3作為還原劑。
在反應完成後，首先將反應溶液經由Source 15Q(GE Healthcar)管柱純化以除去任何殘留的免疫球蛋白Fc和單-聚乙二醇化的胰島素。在這種情況下，使用Tris-HCl緩衝液(pH為7.5)和NaCl濃度梯度進行洗析。
然後，使用Source 15ISO(GE Healthcare公司)作為第二管柱以除去任何殘餘免疫球蛋白Fc和多-聚乙二醇化的胰島素之複合物，從而得到胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物。在這種情況下，使用含有Tris-HCl(pH7.5)之硫酸銨的濃度梯度進行洗析。
以RP-HPLC、SE-HPLC和SDS PAGE分析該經洗析的胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物，然後證實已經製備具有至少為98%之高純度(第4圖和第5圖)。
實施例4：測量持續釋放型胰島素複合物在活體內消失的半衰期
為了確認實施例3所製備之胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物形式之持續釋放型胰島素複合物在活體內的持 續時間，使用正常雄性大鼠(正常SD大鼠)以確定透過靜脈內和皮下途徑給藥之藥物的藥物動力學曲線。0.1 mg/kg(基於胰島素)之持續釋放型胰島素複合物以靜脈內和皮下一次給藥至正常雄性大鼠，然後以胰島素ELISA套組測量血液濃度隨著時間的變化。從該測量值，使用WinNonlin 5.2計算該藥物動學參數。其結果為，在靜脈內給藥的情況下，確認持續釋放型胰島素複合在活體內消失的半衰期為15.73小時，以及在皮下給藥的情況下為16.98小時，其較在天然的胰島素的情況下為約0.5小時的持續時間長30倍。此外，亦確定在皮下給藥的情況下的生物可利用性為約54%(第6圖)。
實施例5：胰島素複合物之活體內效力試驗
為了比較胰島素複合物在活體內之效力，在具有鏈佐黴素(streptozotocin)誘導之糖尿病的大鼠中進行比較降低血糖效力之試驗。藉由腹腔內給藥溶解在10mM檸檬酸緩衝液(pH為4.5)之鏈佐黴素(60 mg/kg)至已禁食16小時之正常大鼠而誘導糖尿病。然後，該胰島素複合物一次皮下給藥0.5 mg/kg之劑量至血糖水平上升至500 mg/dl或以上之大鼠，然後比較該降低血糖之效力。其結果為，觀測到該胰島素複合物降低血糖之效力維持4天，且在第5天該血糖上升至相當於該劑體之水平(第7圖)。
<110> 韓美科學股份有限公司(Hanmi Science Co.,Ltd.)
<120> 製備生理活性多肽複合物之方法
<130> OPA12119
<150> KR10-2011-0114828
<151> 2011-11-04
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該代表圖無元件符號及其所代表之意義。

Claims (20)

  1. 一種製備生理活性蛋白與非胜肽聚合物之接合物的方法，包括：(1)在包括有機溶劑之反應溶液中反應生理活性蛋白與非胜肽聚合物以連結該生理活性蛋白與該非胜肽聚合物；以及(2)自該步驟(1)之反應混合物單離和純化該生理活性蛋白共價連結至非胜肽聚合物之接合物，其中該非胜肽聚合物的兩個端或三個端具有反應基團，且係選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯基乙基醚或其組合所組成群組；該生理活性蛋白具有兩個或更多個N-末端；基於該反應溶液的總體積，該反應溶液包括45至55體積%之量的該有機溶劑；該有機溶劑為具有1至10個碳原子之醇；以及該反應溶液具有4.5至7.0之pH。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該有機溶劑係選自異丙醇、乙醇和甲醇所組成之群組。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該生理活性蛋白係選自胰島素、黃體激素(LTH)、卵泡刺激素(FSH)、凝血因子VIII、凝血因子VII、脂聯素、抗體、抗體片段scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、或鬆弛素所組成 之群組。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該生理活性蛋白係胰島素。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該胰島素為天然胰島素、變異體(variant)或藉由在天然胰島素或其片段之一個或多個胺基酸進行取代、添加、刪除、修飾或其組合之任一種而製備之衍生物。
  6. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該非胜肽聚合物係連結至該胰島素的β鏈的N-末端。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該非胜肽聚合物係連結至該胰島素或胰島素衍生物的胺基或巰基。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該非胜肽聚合物具有選自醛基，丙醛基，丁醛基，馬來醯亞胺基，鄰-吡啶二硫醚，硫醇和琥珀醯亞胺衍生物所組成群組之反應基。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該琥珀醯亞胺衍生物為丙酸琥珀醯亞胺酯、琥珀醯亞胺基羧甲基、羥基琥珀醯亞胺基或碳酸琥珀醯亞胺酯。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該非胜肽聚合物在二端具有醛基作為該反應基團。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該單離和純化係經由離子交換層析完成。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該反應溶液 包括檸檬酸鈉。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該生理活性蛋白係胰島素，且該有機溶劑係選自異丙醇、乙醇和甲醇所組成之群組。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該生理活性蛋白係胰島素，且該有機溶劑係異丙醇。
  15. 一種製備生理活性蛋白複合物之方法，包括：(1)根據申請專利範圍第1項至第14項中任一項所述之方法製備該生理活性蛋白與非胜肽聚合物之接合物；以及(2)共價連結選自免疫球蛋白Fc區、抗體、白蛋白和運鐵蛋白所組成群組之載體與該接合物之非胜肽聚合物以製造肽複合物，其中非胜肽聚合物的諸端分別結合至該生理活性蛋白和該載體。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該免疫球蛋白Fc區係由選自CH1、CH2、CH3和CH4域(domain)所組成群組之1至4個域所組成。
  17. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該免疫球蛋白Fc區復包括樞紐區(hinge region)。
  18. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該免疫球蛋白Fc區為衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM之Fc區。
  19. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該免疫球蛋白Fc區為IgG4 Fc區。
  20. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該免疫球蛋 白Fc區為人類無糖基化IgG4 Fc區。
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MX (1) MX369480B (zh)
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RU (1) RU2624129C2 (zh)
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WO (1) WO2013066106A1 (zh)
ZA (1) ZA201403189B (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) * 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
AR096891A1 (es) 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
AR096890A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
EA201691795A1 (ru) * 2014-03-31 2017-03-31 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Способ улучшения растворимости белка и пептида за счет использования связывания с фрагментом fc иммуноглобулина
US11123436B2 (en) * 2015-07-24 2021-09-21 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method of preparing physiologically active polypeptide conjugate
CA2992602A1 (en) 2015-09-23 2017-03-30 Genentech, Inc. Optimized variants of anti-vegf antibodies
EP3689914A4 (en) * 2017-09-29 2021-08-25 Hanmi Pharm. Co., Ltd. ENHANCED PERSISTENT PROTEIN CONJUGATE
WO2019219048A1 (zh) * 2018-05-18 2019-11-21 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 具有延长半衰期的融合多肽缀合物
CN110964116A (zh) * 2018-09-26 2020-04-07 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物
CN109384840A (zh) * 2018-10-23 2019-02-26 福州大学 蛋白质的修饰与分离纯化以及巯基蛋白酶的酶活调控方法
CN112521481B (zh) * 2020-12-08 2022-11-04 武汉市工程科学技术研究院 表面修饰物及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010107256A2 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate
CN102112493A (zh) * 2008-07-23 2011-06-29 韩美控股株式会社 包含具有三个官能性末端的非肽基聚合物的多肽复合物

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5110906A (en) 1986-08-21 1992-05-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Derivatives of soluble T-4
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US6924264B1 (en) 1999-04-30 2005-08-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Modified exendins and exendin agonists
US6756480B2 (en) 2000-04-27 2004-06-29 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
WO2002028437A1 (en) * 2000-10-05 2002-04-11 Ares Trading S.A. Regioselective liquid phase pegylation
BR0116024A (pt) 2000-12-07 2005-12-13 Lilly Co Eli Proteìna de fusão heteróloga e uso da mesma
US7312192B2 (en) 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7737260B2 (en) 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Protein complex using an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof
SE526711C2 (sv) 2003-01-31 2005-10-25 Probi Ab Nya stammar av Bifidobacterium med förmåga att överleva i magtarmkanalen och producera glutamin in vivo, samt kompositioner och användningar därav
US20050176108A1 (en) 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20040180054A1 (en) 2003-03-13 2004-09-16 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
EP1613272B1 (en) 2003-04-11 2013-12-18 Antriabio, Inc. Method for preparation of site-specific protein conjugates
ATE525395T1 (de) 2003-06-12 2011-10-15 Lilly Co Eli Fusions proteine von glp-1-analoga
US8263084B2 (en) 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
KR101135244B1 (ko) 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
HRP20070268B1 (hr) * 2004-11-12 2018-04-20 Bayer Healthcare Llc Ciljana modifikacija faktora viii
ATE435235T1 (de) 2004-12-22 2009-07-15 Lilly Co Eli Formulierungen glp-1-analoger fusionsproteine
US20080207505A1 (en) 2005-01-12 2008-08-28 James Kenneth D Bna Conjugates and Methods of Use
TWI376234B (en) 2005-02-01 2012-11-11 Msd Oss Bv Conjugates of a polypeptide and an oligosaccharide
KR100754667B1 (ko) * 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
GB2427360A (en) 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
WO2007012188A1 (en) 2005-07-27 2007-02-01 Qinghua Wang GLP/1/EXENDM 4 IgG Fc FUSION CONSTRUCTS FOR TREATMENT OF DIABETES
KR100824505B1 (ko) 2005-08-16 2008-04-22 한미약품 주식회사 개시 메티오닌 잔기가 제거된 면역글로불린 Ｆｃ 영역의대량 생산방법
DK1928910T3 (en) 2005-08-16 2014-03-10 Hanmi Science Co Ltd A method for mass production of an immunoglobulin Fc region without the initiating methionine residues
WO2008051383A2 (en) * 2006-10-19 2008-05-02 Amgen Inc. Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields
JP2008169195A (ja) * 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
DK2662449T3 (en) 2007-05-30 2017-05-15 Postech Academy-Industry- Found immunoglobulin fusion proteins
JP2009019027A (ja) 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体
JPWO2009020094A1 (ja) 2007-08-09 2010-11-04 第一三共株式会社 疎水性分子で修飾した抗体
AU2009210570B2 (en) 2008-01-30 2014-11-20 Indiana University Research And Technology Corporation Ester-based insulin prodrugs
EP2376520B1 (en) 2008-12-19 2014-02-12 Indiana University Research&Technology Corporation Insulin analogs
WO2011011073A1 (en) * 2009-07-22 2011-01-27 Ipsen Pharma S.A.S. Site-specific pegylated or site-specific lipidated igf-1 and analogues of igf-1
US9795683B2 (en) 2009-07-27 2017-10-24 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
WO2011064758A2 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Pfizer Limited Fusion protein
US8829163B2 (en) 2010-01-19 2014-09-09 Hanmi Science Co., Ltd Liquid formulations for long-acting erythropoietin conjugate
CN102740840A (zh) 2010-01-19 2012-10-17 韩美科学株式会社 长效g-csf缀合物的液体制剂
AR081755A1 (es) * 2010-04-02 2012-10-17 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de la hormona estimuladora de los foliculos donde se usa un fragmento de inmunoglobulina, metodo de preparacion y metodo para tratar a un sujeto que sufre un trastorno reproductivo
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
AR080993A1 (es) 2010-04-02 2012-05-30 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
KR101330868B1 (ko) * 2010-06-08 2013-11-18 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 인슐린 유도체 약물 결합체
KR101337797B1 (ko) 2010-07-14 2013-12-06 한미사이언스 주식회사 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR101303388B1 (ko) 2010-10-26 2013-09-03 한미사이언스 주식회사 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제
KR101830344B1 (ko) 2010-10-26 2018-02-22 한미사이언스 주식회사 피브로넥틴 단편 및 면역글로불린 단편의 융합 단백질 및 이의 용도
CA2832148A1 (en) 2011-04-04 2012-10-11 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Peptide which can induce antibody capable of recognizing stereostructure of hiv
UA113626C2 (xx) 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
CA2838503C (en) 2011-06-10 2020-02-18 Hanmi Science Co., Ltd. Novel oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
ES2710356T3 (es) 2011-06-17 2019-04-24 Hanmi Science Co Ltd Conjugado que comprende oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina, y uso del mismo
JP6284478B2 (ja) 2011-09-05 2018-02-28 ハンミ サイエンス カンパニー リミテッド インターフェロンアルファ結合体を含む癌治療用医薬組成物
WO2013051900A2 (en) 2011-10-06 2013-04-11 Hanmi Science Co., Ltd. Blood coagulation factor ⅶ and ⅶa derivatives, conjugates and complexes comprising the same, and use thereof
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
KR101895047B1 (ko) 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
KR102041412B1 (ko) 2011-12-30 2019-11-11 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 Ｆｃ 단편 유도체
AU2013216943B2 (en) 2012-02-10 2018-04-19 Research Corporation Technologies, Inc. Fusion proteins comprising immunoglobulin constant domain-derived scaffolds
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
US10064951B2 (en) 2012-03-30 2018-09-04 Hanmi Science Co., Ltd. Liquid formulation of highly concentrated long-acting human growth hormone conjugate
CN103509118B (zh) 2012-06-15 2016-03-23 郭怀祖 胰岛素-Fc融合蛋白
WO2014013262A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme construct
AR092862A1 (es) 2012-07-25 2015-05-06 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de insulina de accion prolongada y un peptido insulinotropico y metodo de preparacion
US10441665B2 (en) 2012-07-25 2019-10-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of long acting insulinotropic peptide conjugate
AR094821A1 (es) 2012-07-25 2015-09-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada
AR091902A1 (es) 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
KR101968344B1 (ko) 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
MY197849A (en) 2012-11-06 2023-07-20 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Liquid formulation of protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment
KR101993393B1 (ko) 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
TR201910929T4 (tr) 2013-02-26 2019-08-21 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Bölgeye özel insülin konjugatı.
MY186990A (en) 2013-02-26 2021-08-26 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Novel insulin analog and use thereof
US10660940B2 (en) 2013-03-05 2020-05-26 Hanmi Pharm. Co., Ltd Preparation method for high-yield production of physiologically active polypeptide conjugate
AR096890A1 (es) 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
AR096891A1 (es) 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
RU2683823C2 (ru) 2013-09-27 2019-04-02 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Препарат гормона роста человека длительного типа
TWI684458B (zh) 2014-05-30 2020-02-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 包含胰島素及ｇｌｐ-１/昇糖素雙重促效劑之治療糖尿病之組成物
KR20150140177A (ko) 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
EA038544B1 (ru) 2015-12-31 2021-09-13 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Тройной агонист рецепторов глюкагона/glp-1/gip
UA126662C2 (uk) 2016-06-29 2023-01-11 Ханмі Фарм. Ко., Лтд. Похідна глюкагону, її кон'югат, композиція, яка її містить, та її терапевтичне застосування

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102112493A (zh) * 2008-07-23 2011-06-29 韩美控股株式会社 包含具有三个官能性末端的非肽基聚合物的多肽复合物
WO2010107256A2 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate

Also Published As

Publication number Publication date
CN108210934A (zh) 2018-06-29
RU2624129C2 (ru) 2017-06-30
TW201323435A (zh) 2013-06-16
PH12014500926B1 (en) 2018-04-06
CN103930447A (zh) 2014-07-16
JP6336394B2 (ja) 2018-06-06
EP2773672A4 (en) 2015-03-18
ZA201403189B (en) 2015-08-26
MX369480B (es) 2019-11-08
WO2013066106A1 (en) 2013-05-10
IL232387A0 (en) 2014-06-30
ES2898718T3 (es) 2022-03-08
MX2014005353A (es) 2014-05-28
IL232387B (en) 2019-11-28
NZ624338A (en) 2016-11-25
AU2012331750A1 (en) 2014-05-22
JP2018150332A (ja) 2018-09-27
AU2012331750B2 (en) 2017-06-15
KR20130049671A (ko) 2013-05-14
BR112014010818A2 (pt) 2017-06-13
US20140296475A1 (en) 2014-10-02
EP2773672B1 (en) 2021-09-15
SG11201401677VA (en) 2014-05-29
RU2014117563A (ru) 2015-12-10
JP2014532695A (ja) 2014-12-08
PH12014500926A1 (en) 2014-06-09
CA2854078A1 (en) 2013-05-10
US11434271B2 (en) 2022-09-06
AR088619A1 (es) 2014-06-25
EP2773672A1 (en) 2014-09-10

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