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TWI601741B - 利用前列腺素受體ｅｐ４－拮抗劑誘導幹細胞製造含有高囊泡含物之外泌體囊泡的方法及其應用 - Google Patents

利用前列腺素受體ｅｐ４－拮抗劑誘導幹細胞製造含有高囊泡含物之外泌體囊泡的方法及其應用 Download PDF

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TWI601741B
TWI601741B TW105121824A TW105121824A TWI601741B TW I601741 B TWI601741 B TW I601741B TW 105121824 A TW105121824 A TW 105121824A TW 105121824 A TW105121824 A TW 105121824A TW I601741 B TWI601741 B TW I601741B
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李華容
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Description

利用前列腺素受體EP 4 -拮抗劑誘導幹細胞製造含有高囊泡含物 之外泌體囊泡的方法及其應用
本發明係關於一種經由幹細胞分化為非幹細胞之過程，製造外泌體囊泡的方法。更特別地，本發明係關於一種利用前列腺素受體拮抗劑誘導幹細胞分化為非幹細胞，並大量釋放出含有高囊泡含物之外泌體囊泡的方法。
外泌體囊泡(Exosomes)已知可藉由在細胞間轉移細胞膜及細胞質蛋白、脂質及RNA分子等，而介導細胞間的訊息傳遞作用(Simons and Raposo,2009)。此等轉移的分子會進而在受者細胞中執行其特殊功能(Skog et al.,2008；Valadi et al.,2007)。雖然外泌體囊泡-介導之細胞訊息傳遞已證明涉及抗原展現、耐受性發展及腫瘤進展，但對於外泌體囊泡的確切功能及調節作用仍不清楚。
WO2013150303 A1揭露一種分離自特定神經幹細胞株(neural stem cell line；NSCL)培養物之外泌體囊泡，其能增進纖維母細胞遷移、分枝及軸突生長。該文獻之外泌體囊泡係收集自以“基礎培養條件”培養的特定神經幹細胞株，所謂之基礎培養條件係指能維持NSCL的幹細胞特性之培養條件。於WO2013150303 A1之說明書，僅提供活體外添加NSCL外泌體囊泡促進PC-12細胞株之纖維母細胞遷移、分枝及軸突生長的數據，並未提及NSCL外泌體囊泡對於PC-12細胞或非-幹細胞之細胞特性改變，且並無增加活體動物神經修復，促進腦部記憶認知之數據。
已有文獻指出，前列腺素E2(PGE2)在使細胞維持於幹細胞(SC)及癌幹細胞(CSC)狀態上扮演著關鍵角色(W.Goessling等人，Cell 136,1136-1147(2009)；R.L.Porter等人，Stem Cells 31,372-383(2013))。缺乏環氧化酶-2(COX-2，為一種進行PGE2生合成的重要酵素)之小鼠，其造血譜系之再生亦受損害。同樣，在斑 馬魚中，可調節細胞的自我再生。但是，關於PGE2信號傳遞有助於在造血系統以外組織中的SC/CSC功能之證據一直難以實現。故本發明探討阻斷前列腺素E受體4(EP4)介導之傳訊作用對於幹細胞特性改變及外泌體囊泡釋放之影響。
本發明基於以上之目的發現，前列腺素受體拮抗劑可誘導幹細胞大量釋放外泌體囊泡達十倍以上，並同時失去原有的幹性胞特性而轉變為非-幹細胞；而且經誘導釋出的外泌體囊泡中含有高含量的囊泡含物，並在被組織非-幹細胞攝入後，能夠促使該組織非-幹細胞轉變為組織幹細胞。
於是，本發明之一方面係關於，一種製造誘導性外泌體囊泡的方法，特徵在於包含將一幹細胞與一有效量之前列腺素受體EP4-拮抗劑接觸，使該幹細胞經誘導而釋放出外泌體囊泡；及將所釋放出的外泌體囊泡從培養物上清液分離出。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之誘導性外泌體囊泡製造方法包含：將幹細胞培養於含有一有效量前列腺素受體EP4-拮抗劑之培養基中數天，以誘導該幹細胞分化為非幹細胞，並將外泌體囊泡釋放至細胞培養物中；及從所述之細胞培養物上清液分離得到所釋放出的外泌體囊泡。於本發明之一些項具體實施態樣，係將所述之幹細胞與有效量之前列腺素受體EP4-拮抗劑培養4-8天，視所使用之幹細胞種類及前列腺素E受體4拮抗劑的劑量而定。於本發明之其他具體實施態樣，所述之有效量前列腺素受體EP4-拮抗劑係使用劑量1.0-40μg/ml，視所使用之幹細胞及前列腺素E受體4拮抗劑的種類而定。
於本發明之一較佳具體實施態樣，所述之誘導步驟係將乳腺幹細胞培養於含有1.0-10μg/ml EP4-拮抗劑GW627368X之培養基中4天。於本發明之另一較佳具體實施態樣，所述之誘導步驟係將間質幹細胞培養於含有20μg/ml EP4-拮抗劑GW627368X之培養基中8天。於本發明之又一較佳具體實施態樣， 所述之誘導步驟係將神經幹細胞培養於含有20-30μg/ml EP4-拮抗劑GW627368X之培養基中4天。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之分離步驟包含以超高速離心法分離，得到由經前列腺素受體EP4-拮抗劑處理之幹細胞所釋放出的外泌體囊泡。
於本發明之製造誘導性外泌體囊泡的方法，可使用之幹細胞為任何具有分化潛能之幹細胞，包括(但不限定於)胚胎幹細胞、誘導之高能幹細胞、癌幹細胞、組織幹細胞等。所述之組織幹細胞包括(但不限定於)間質幹細胞、造血幹細胞、乳腺幹細胞、神經幹細胞、小腸幹細胞、皮膚幹細胞、臍帶血幹細胞、角膜緣幹細胞、毛囊幹細胞、脂肪組織衍生之幹細胞、骨髓幹細胞、角膜幹細胞、卵原幹細胞等。
用於本發明，所述之“前列腺素E受體4(EP4)拮抗劑”係指(1)具有或抑制前列腺素受體EP4表現功能的分子，如siRNA分子、shRNA分子，拮抗劑等，或(2)抑制受體EP4其配體(ligand)PGE2作用之分子，包括(但不限定於)PGE2中和抗體、阻斷PGE2製造之COX-2抑制劑、阻斷PGE2製造之mPGES-1抑制劑等。
於本發明之方法，可使用之前列腺素受體EP4-拮抗劑包括(但不限定於)siRNA分子、GW627368X、AH23848、L-161、982、CJ-023,423、ONO AE3 208、BGC 20-1531、MF498及CJ-42794等。
本發明之另一方面，係關於一種包含由本發明之方法所製備之外泌體囊泡的組成物。於本發明之組成物，所述之外泌體囊泡具有粒徑為50nm至150nm，且含有較高含量之用以維持幹細胞特性所需的分子。
於本發明之其他具體實施態樣，所述之用以維持幹細胞特性所需的分子係指維持幹細胞特性所需之蛋白分子及miRNA。於本發明之一具體實施態樣，所述之維持幹細胞特性所需之蛋白分子包括(但不限定於)CD44、CD90、整合蛋白β 1(integrin β 1)、整合蛋白α 6(integrin α 6)、CD81、GAPDH、N-cadherin、 纖連蛋白(fibronectin)、CD146、CD91、切絲蛋白(cofilin)、細絲蛋白A(filamin A)、CD91、CNP、塔林(talin)、原肌球蛋白(tropomyosin)、Gelectin 3、Rap1、CD146、β-環連蛋白(β-catenin)、TGF β 1、TGF β 2、LRP6、FZD5、EGFR、HER2、Met、EP2、PI3K、PDK1、Akt、p-Akt、c-Src、p-Src及SAPK/JNK。於本發明之另一具體實施態樣，所述之維持幹細胞特性所需之miRNA分子包括(但不限定於)，mir-17-92、mir-106a-363、mir-106b-25叢、mir-24、mir-130、mir-17、mir-18a、mir-20a、mir-20b、mir-24、mir-25、mir-29a、mir-106b、mir-130a及mir-130b。於本發明之又另一具體實施態樣，所述之維持幹細胞特性所需之蛋白分子包括(但不限定於)，PSA、VCAM1、VEGFR2、VEGFR3、PDGF β、NGFR、IL-2R β、IL-18R β、BMP-7、MIP-3 α或RANTES。於本發明之其他具體實施態樣，所述之外泌體囊泡含有較低含量之E-鈣黏蛋白(E-cadherin)。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之組成物可應用於誘導組織幹細胞之細胞重新編程(cell reprogramming)，可使用於誘導組織幹細胞生成，以及用於退化性疾病的治療，例如：促進乳腺發育或預防及/或治療神經退化疾病。
本發明之另一方面，係關於一種產生誘導性幹細胞之方法，包含將一組織非-幹細胞與一有效量之包含本發明之外泌體囊泡的組成物接觸，以誘導該組織非-幹細胞轉變成一組織幹細胞。用於本發明，“非-幹細胞”係指，於自然情況下無法再進一步分化成特定細胞的終極-分化生物細胞(terminal-differentiated biological cells)。在某些狀況，所述之非-幹細胞可以進行分裂而產生更多細胞。而所謂的“誘導性幹細胞”係指，一類能夠直接從成熟非-幹細胞經過誘導而產生的幹細胞，具有幹細胞之可分化特性。舉例而言，本發明之EP4拮抗劑誘導釋放之幹細胞外泌體囊泡能夠將非-幹細胞性乳腺上皮細胞誘導轉變成乳腺幹細胞，並可應用於活體內分化而形成乳腺。
本發明用於產生誘導性幹細胞之方法可應用於活體外及活體內誘導生成幹細胞。活體內產生誘導性幹細胞之方法 可應用於幹細胞療法，例如治療及/或預防神經退化性疾病、腦與脊髓創傷、中風、學習障礙、阿茲海默氏症、巴金森氏症、心肌梗塞、肌肉萎縮症、促進心肌細胞生成、刺激血管新生、血液細胞形成、禿頭、耳聾、視力損害、糖尿病、整形外科及傷口癒合等。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之方法包含將本發明之外泌體囊泡的組成物以全身或局部方式施用於需進行幹細胞療法之部位。於本發明之另一些具體實施態樣，所述之組織幹細胞係源自需要治療之患者本身，或取自於其他個體。
圖1A為以EP4-拮抗劑GW627368X(GW)處理4天乳腺幹細胞(以下簡稱NAMEC)之培養液P4離心部分的電子顯微鏡TEM影像。圖1B係使用NanoSight Nanoparticle Tracking分析NAMEC之培養液P4離心分離物CM-P4中的粒子數目。該圖下表中之P4顆粒數係使用奈米粒子追蹤分析進行計量。該圖B上表為所釋出外泌體囊泡標記的定量係以[P4 GAPDH標記蛋白濃度]/[細胞數]比值表示。數據為平均值±SEM(n=3)。*P0.05，**P0.005。
圖2A及2B係使用NanoSight奈米粒子追蹤分析(NTA)及動態光掃描/Zeta電位分析(DLS)，測定經過EP4-拮抗劑GW處理之NAMEC培養液P4離心部分的顆粒大小與數目。NTA數據係顯示顆粒大小與絕對粒子濃度，DLS數據係顯示顆粒大小、平均直徑與相對粒子數。D：顆粒直徑(nm)；RN：相對數目。圖2C係顯示於所指定之NAMEC之培養液P4離心分離物CM-P4部分中所測得之CD44幹細胞標記蛋白，及外泌體囊泡標記蛋白CD81、CD9、TSG101、Alix、HSP70與GAPDH的含量。細胞培養液P4離心分離物係收集自相同數量之經過載體(Crl)、GW627368X(GW)或PGE2(1μM)處理4天之細胞。圖2D係顯示於經過載體(Crl)或GW處理2天之NAMEC或乳腺非幹細胞(以下簡稱HMLE細胞)的培養液 P4離心分離物(CM-P4)部分中，所測得之GAPDH與CD81外泌體囊泡標記蛋白，及CD44幹細胞標記蛋白的含量。1X：由1 x 106個細胞所釋出之P4外泌體囊泡；2X：由2 x 106個細胞所釋出之P4外泌體囊泡。長時間曝光片顯示在HMLE細胞樣本中的GAPDH訊號薄弱，且在HMLE細胞GAPDH訊號並未受GW處理而增加。圖2E係顯示於經載體(Crl)、GW、AH23848(EP4拮抗劑；0.4,2,4μg/ml)或AH6809(EP1/2/3拮抗劑；0.8,4,8μg/ml)處理之NAMEC細胞的培養基P4離心部分中，所測得之CD44幹細胞標記蛋白，及GAPDH與CD81外泌體囊泡標記蛋白的含量。圖2F為經載體或多西環素(Dox,2μg/ml)處理之NAMEC、NAMEC-shEP4-1及NAMEC-shEP4-2等細胞的CM-P4離心部分中，所測得之HSP70、GAPDH與CD81外泌體囊泡標記蛋白的含量。多西環素可於NAMEC-shEP4-1及NAMEC-shEP4-2細胞中引發EP4 shRNA產生。
圖3A為經過載體、GW627368X、Dynasore(1μM)或GW627368X加Dynasore(0.5,1,1.5μM)處理4天之NAMEC的光學顯微鏡明視野影像。尺標線段為100μm。圖3B係顯示經過載體、GW627368X、Dynasore(1μM)或GW627368X加Dynasore(0.75及1μM)處理4天之NAMEC對於0.05%胰蛋白酶具有抗性之細胞百分比例。數據為平均值±SEM(n=3)。***P0.001。圖3C係顯示經過載體(Crl)、GW627368X、Dynasore(1μM)或GW627368X加Dynasore(0.5,0.75,1μM)處理4天之NAMEC的Boyden小室移動分析結果。數據為平均值±SEM(n=3)。**P0.005，***P0.001。
圖4為於外泌體囊泡部分或於細胞溶解產物中所測得之蛋白質。培養物上清液與細胞溶解產係收集自經過載體(Crl)、GW627368X或PGE2處理4天之NAMEC細胞。1X：由2.5 x 105個細胞所釋出之P4外泌體囊泡；5X：由12.5 x 105個細胞所釋出之P4外泌體囊泡。Hg：Hg-整合蛋白β 1，Lg：Lg-整合蛋白β 1，H：H-整合蛋白α 6，L：L-整合蛋白α 6，pg：pg-LRP6，g：g-LRP6，Ng：Ng-LRP6。
圖5A係顯示針對NAMEC細胞之表面受體分布受EP4-拮抗劑 影響的分析結果。將載體(Crl)、GW627368X(1μg/ml)或PGE2(1μM)處理4天之NAMEC細胞的表面蛋白生物素化(biotinylation)，並進行親和素拉下(avidin pull-down)處理。藉由西方轉漬分析，於拉下部分及整體細胞溶解產物的部分，測得HER2、c-Met、LRP6及EGFR蛋白。N：對照組NAMEC。NB：生物素化之NAMEC。圖5B係顯示於經過載體或GW627368X處理4天之NAMEC細胞中的細胞表面HER2、c-Met、LRP6、Frizzled-5、TGF β R1、TGF β R2及EGFR蛋白。淺色線表示以特異性初級抗體+Alexa 488-共軛之次級抗體染色的細胞；深色線表示僅以Alexa 488-共軛之次級抗體染色的細胞。
圖6係顯示藉由PCR分析於NAMEC及經GW627368X-處理(48小時後)之NAMEC中的mRNA表現情形。於圖中呈現在經GW627368X-處理之NAMEC中受抑制、未變化或受活化之標靶基因的百分比例(相對於NAMEC對照組細胞)。
圖7A係顯示使用電泳分析GW-誘導(GW Exo)及PGE2-誘導(PGE2 Exo)之NAMEC外泌體囊泡的RNA。圖7B為分離自相同數量之經過GW627368X或PGE2處理4天之NAMEC細胞所釋出之外泌體囊泡(Exo-GW及Exo-PGE)，使用進行Agilent 2100 Bioanalyzer分析的總體RNA電色譜圖(Electropherogram)。箭號所指為mi RNA部分。
圖8係顯示使用Affymetrix miRNA 3.0列陣測定GW-誘導之NAMEC(GW-in-NA)外泌體囊泡相較於PGE2-誘導之NAMEC(PGE2-in-NA)外泌體囊泡的miRNA差異表現。深色虛線為5-倍變化截斷；灰色虛線為2-倍變化截斷。表現量係以外泌體囊泡的GAPDH標記蛋白校正。
圖9A係藉由西方轉漬分析顯示富含於脂筏(LRF，流份2-5)或非-脂筏(non-LRF，流份7-9)中之所指定蛋白質。同時偵測脂筏標記蛋白神經節脂苷GM-1(點漬法分析)與caveolin-1(Cav-1)，以及非-脂筏標記蛋白GAPDH。C：細胞；E：外泌體囊泡。右列方框指出從非-脂筏消失的蛋白質。左列方框指出在脂筏出現的蛋白 質。圖9B係顯示於GW-及PGE2-誘導之NAMEC外泌體囊泡的脂筏中所測得之蛋白質。使用西方轉漬分析GW-誘導之及PGE2--誘導之外泌體囊泡之脂筏(流份2-5)中的蛋白質。脂筏裝載係以GM1與Cav-1濃度定量。圖9C為存在於GW-誘導由NAMEC、siCav1 NAMEC或siCav1+2 NAMEC細胞釋出之外泌體囊泡中所測定之指定蛋白含量。外泌體囊泡加樣量以外泌體囊泡之GAPDH校正。圖9D為存在於GW-誘導由經過載體或M β CD處理之NAMEC細胞釋出之外泌體囊泡中所測定之指定蛋白含量。外泌體囊泡加樣量以外泌體囊泡之GAPDH校正。圖9E係顯示使用Affymetrix miRNA 4.0列陣測定於GWM β-in-NA外泌體囊泡中之miRNA，相較於GW-in-NA外泌體囊泡的差異表現。紅色部份表示於GWM β-in-NA外泌體囊泡中受到增量調節之miRNA，而受到減量調節之miRNA以綠色表示。已知涉及SC恆定性及細胞移動性之miRNA以藍色表示。表現量係以外泌體囊泡的GAPDH標記蛋白校正。圖9F係藉由西方轉漬分析顯示存在NAMEC細胞中脂筏(LRF，流份2-5)或非-脂筏(non-LRF，流份7-9)中之TGF β R1、TGF β R2、p-Akt、Akt及Ago2細胞膜部分蛋白的含量。NAMEC以載體(Crl)、GW627368X(1μg/ml)或PGE2(1μM)處理4天。同時偵測偵測脂筏標記蛋白神經節脂苷GM-1(點漬法分析)與caveolin-1(Cav-1)，以及非-脂筏標記蛋白GAPDH。右列方框指出從經過GW處理之NAMEC的非-LRF消失的蛋白質。左列方框表示出現在經過GW處理之NAMEC的LRF中的蛋白質。
圖10A係顯示使用NanoSight奈米粒子追蹤分析(NTA)，測定經過載體(MSC)或EP4-拮抗劑GW(MSCGW)誘導之人類間質幹細胞(MSC)外泌體囊泡數目。釋出之定量係以[外泌體囊泡數]/[細胞數]的比值表示。數據為平均值±SEM(n=3)。***P0.001。圖10B係顯示於經DMSO(Crl)或EP4拮抗劑誘導之MSC外泌體囊泡中，所測得之蛋白質含量。將從經過載體(Crl)或GW處理8天之MSC細胞的培養物上清液P4離心部分(D1-4：第1天至第4天之條件培養基P4離心部分；D5-8：第5天至第8天之條件培養基P4離心部分) 進行西方轉漬分析。圖10C為測量於經DMSO(Crl)或EP4拮抗劑處理之神經幹細胞的細胞(NSC)部分及其外泌體囊泡部分(NSC released EV)中的蛋白質含量。從經過載體(Crl)或GW處理4天之NSC培養物收集細胞溶解產物及培養基，並以由相同數量之NSC釋出的外泌體囊泡進行西方轉漬分析。
圖11A及11B係比較MSC與經EP4拮抗劑處理之MSC(GW-MSC)的成骨性分化情形。MSC培養於成骨性分化培養基中，然後以Alizarin Red S進行染色。成骨性分化係經由測量Alizarin Red S染色結果之OD值定量。圖11C係比較MSC與經EP4拮抗劑處理之MSC(GW-MSC)的成脂性分化情形。MSC培養於成脂性分化培養基中，然後以油紅O進行染色(Oil-red O staining)。圖11D係比較MSC與經EP4拮抗劑處理之MSC(GW-MSC)的神經分化情形。MSC培養於神經分化培養基中7或14天，然後使用西方轉漬法分析神經細胞標記蛋白tublin β 3及NeuN之表現。
圖12A係後來以PBS或以GW-誘導之NAMEC外泌體囊泡(1μg/ml)處理之GW-預處理的NAMEC細胞(GW-pretreated NAMEC)之明視野影像。GW/PBS：以GW處理4天然後再以PBS處理4天；GW/GW：以GW處理8天；GW/Exo：以GW處理4天然後再以GW-誘導之NAMEC外泌體囊泡處理4天。箭號所指為上皮小島(epithelial island)。尺標線段為100μm。圖12B係顯示後來以PBS(GW/PBS)、以GW-誘導之NAMEC外泌體囊泡(1μg/ml)(GW/Exo)或以GW第二次(GW/GW)處理之GW-預處理的NAMEC細胞對於0.05%胰蛋白酶具有抗性之細胞百分比例。“Crl”為未經處理之NAMEC。細胞依所指示的條件處理，然後以0.05%胰蛋白酶進行脫離。數據為平均值±SEM(n=3)。***P0.005。圖12C係顯示後來以PBS(Crl)或以GW-誘導之NAMEC外泌體囊泡處理之GW-預處理的NAMEC細胞之Boyden小室移動分析結果。NAMEC細胞之處理如圖12A所述，進行分析期間暫停處理。數據為平均值±SEM(n=3)。*P0.05，***P0.001。圖12D係顯示後來以PBS(Crl)或以GW-誘導之NAMEC外泌體囊泡處理之GW-預處理的NAMEC細胞之乳 腺球(mammosphere)形成。NAMEC細胞之處理如圖12A所述，進行分析期間暫停處理。數據為平均值±SEM(n=4)。***P0.001。
圖13A為以PBS(Crl)或1μg/ml GW627368X-誘導之NAMEC外泌體囊泡前處理(EV)之HMLE細胞的明視野影像。每兩天補充新鮮外泌體囊泡(1μg/ml)與培養基達2週。細胞每4天進行繼代。於開始PBS或外泌體囊泡處理後14天，從泌體囊泡-處理組(EV)及PBS-處理組(Crl)之定時短片截錄影像。尺標線段為100μm。圖13B係顯示以PBS(Crl)或GW-誘導之NAMEC外泌體囊泡前處理(EV)之HMLE細胞的移動距離。使用定時短片影像追蹤細胞移動。數據為平均值±SEM(n=20)。***P0.001。圖13C係顯示以PBS(Crl)或1μg/ml GW627368X-誘導之NAMEC外泌體囊泡前處理之HMLE細胞的Boyden小室移動分析結果。HMLE細胞之處理如下：HMLE+EV：於72-小時移動分析期間加入1μg/ml外泌體囊泡；EV-HMLE：HMLE細胞以外泌體囊泡前處理7天，並於移動分析期間暫停囊泡處理。數據為平均值±SEM(n=3)。*P0.05，**P0.005。圖13D係顯示以PBS(Crl)或GW-誘導之NAMEC外泌體囊泡處理7天之HMLE細胞的乳腺球(mammosphere)形成。進行乳腺球分析期間暫停處理。數據為平均值±SEM(n=5)。*P0.05。。
圖14係顯示初級小鼠乳腺細胞之乳腺形成。將源自小鼠初級乳腺上皮細胞之初級小鼠EpCAMhi/整合蛋白α 6(CD49f)lo乳腺非幹細胞以PGE2-誘導或GW-誘導之初級小鼠乳腺細胞外泌體囊泡(1μg/ml)處理10天。經處理後，將細胞以表中所指定之數量(每墊之細胞數)植入3-週齡小鼠之經過清理的脂肪墊(fat pad)中。8週後解剖小鼠分析乳腺形成。灰色點為經過注射之脂肪墊無乳腺形成；黑色點為經過注射之脂肪墊有完整的乳腺形成；部分黑色點為經過注射之脂肪墊有部分乳腺形成。使用ELDA(Extremelimiting dilution analysis)從圖中結果計算MRU(mammary repopulating unit)頻率。尺標線段為0.75cm。
圖15A係顯示以PBS(Crl)、GW-in-NA外泌體囊泡(1μg/ml)、 PGE2-in-NA外泌體囊泡(2μg/ml)或GWM β-in-NA外泌體囊泡(1μg/ml)前處理7天之HMLE細胞的Boyden小室移動分析結果。於移動分析期間暫停外泌體囊泡處理。數據為平均值±SEM(n=3)。*P0.05，***P0.001。圖15B係顯示以PBS(Crl)、GW-in-NA外泌體囊泡(1μg/ml)、PGE2-in-NA外泌體囊泡(2μg/ml)或GWM β-in-NA外泌體囊泡(1μg/ml)前處理7天之HMLE細胞的乳腺球形成。進行乳腺球分析期間暫停處理。數據為平均值±SEM(n=5)。*P0.05。圖15C係顯示初級小鼠乳腺細胞之乳腺形成。初級小鼠EpCAMhi/整合蛋白α 6(CD49f)lo乳腺細胞以PBS、GW-in-NA外泌體囊泡(1μg/ml)、PGE2-in-NA外泌體囊泡(2μg/ml)或GWM β-in-NA外泌體囊泡(1μg/ml)於活體外處理10天。將細胞以表中所指定之數量(每墊之細胞數)植入3-週齡小鼠之經過清理的脂肪墊(fat pad)中。8週後解剖小鼠分析乳腺形成。灰色點為經過注射之脂肪墊無乳腺形成；黑色點為經過注射之脂肪墊有完整的乳腺形成；部分黑色點為經過注射之脂肪墊有部分乳腺形成。使用ELDA從圖中結果計算MRU頻率。尺標線段為0.75cm。
圖16係顯示EP4拮抗劑誘導之MSC外泌體囊泡能將NSC細胞特性一神經球形成能力轉移給組織非-幹細胞。利用神經球分析檢測經過PBS(Crl)、MSC外泌體囊泡(MSCEV)、GW-誘導之MSC外泌體囊泡(MSCGWEV)或GW-誘導之NAMEC外泌體囊泡(NAMECGWEV)處理之NE4C神經外胚層細胞的神經球形成。進行神經球分析期間暫停處理。數據為平均值±SEM(n=5)。**P0.01。
圖17係顯示EP4拮抗劑誘導之MSC外泌體囊泡能增進神經外胚層細胞分化成神經元。將預先經過PBS、MSC外泌體囊泡(MSCEV)、GW-誘導之MSC EV(MSCGWEV)或GW-誘導之NAMEC EV(NAMECGWEV)處理之NE4C神經外胚層細胞，以維生素A酸(RA)處理誘導神經元分化。經RA處理後，經過誘導之神經元可以抗-β 3-tubulin抗體染色。數據為平均值±SEM(n=4)。*P0.05，***P0.001。
圖18係使用Morris水迷宮評估有經PBS或EP4拮抗劑誘導之MSC外泌體囊泡處理有海馬迴損傷小鼠或正常小鼠的學習與記憶能力。學習與記憶能力係以經過訓練後，小鼠找到目標所需花費的時間做為評估基準。NI-PBS：PBS處理之正常鼠，NI-Exo：外泌體囊泡處理之正常鼠，I-PBS：PBS處理之損傷鼠，I-EXO：外泌體囊泡處理之損傷鼠。
本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。
實施例一、利用前列腺素受體EP 4 拮抗劑誘導幹細胞大量製造並釋放外泌體囊泡
於乳腺上皮幹細胞(NAMEC)誘導外泌體囊泡之製造及分離
使用Mroue等人(Mroue and Bissell,2013)所述之方法，從12週齡處女C57BL/6小鼠分離得到小鼠乳腺上皮幹細胞或從人類乳腺組織分離得到人類乳腺上皮幹細胞。經3-天培養後，以胰酶替代物accutase(eBioscience)處理20分鐘進行細胞脫離，然後以含5%FBS之PBS緩衝液中和。再將細胞團塊以Dispase(STEMCELL)處理20分鐘，而獲得單細胞。
將分離之人類乳腺上皮幹細胞(簡稱NAMEC)培養於有或無包含EP4拮抗劑(GW627368X,1μg/ml；或AH23848,4μg/ml，以下簡稱GW及AH)之乳腺上皮基礎培養基(250ml MCDB-170,250ml DMEM-F12,1.2g碳酸氫鈉，2.5μg EGF,0.25mg氫化可的松，2.5mg胰島素，35mg BPE)中4天。其中於第三天補充GW 0.5μg/ml或AH23848,2μg/ml加入培養基中。對於小鼠乳腺上皮幹細胞之誘導條件，係與10μg/ml GW培養四天。
將培養物於300g下離心5分鐘(P1)去除死細胞，接著於2,000g下離心20分鐘(P2)去除細胞碎片，然後於10,000g下 離心30分鐘(P3)取得上清液。所有離心步驟皆於4℃下進行。最後將上清液於110,000g下離心60分鐘，分離出釋放於培養基中的外泌體囊泡(P4)。將外泌體囊泡之離心團塊以PBS清洗一次，然後懸浮於PBS中備用。
於間質幹細胞(MSC)誘導外泌體囊泡之製造及分離
將分離之間質幹細胞培養於有或無包含EP4拮抗劑(GW627368X,20μg/ml，以下簡稱GW)之MSC培養基(475ml低葡萄糖DMEM,25ml已清除囊泡之牛血清(vesicle-depleted Bovine serum,1% GlutaMAX)中8天，其中於第三天補充10ug/ml GW於培養基，於第四天更新培養基並加入新鮮20μg/ml GW，且第七天補充10μg/ml GW於培養基。將培養物於300g下離心5分鐘(P1)去除死細胞，接著於2,000g下離心20分鐘(P2)去除細胞碎片，然後於10,000g下離心30分鐘(P3)取得上清液。所有離心步驟皆於4℃下進行。最後將上清液於110,000g下離心60分鐘，分離出釋放於培養基中的外泌體囊泡(P4)。將外泌體囊泡之離心團塊以PBS清洗一次，然後懸浮於PBS中備用。
於神經幹細胞(NSC)誘導外泌體囊泡之製造及分離
將分離之神經幹細胞(NSC)培養於有或無包含EP4拮抗劑(GW627368X,20-30μg/ml，以下簡稱GW)之NSC培養基(225ml高葡萄糖DMEM,225ml F12,50ml已清除囊泡之牛血清(vesicle-depleted Bovine serum)中4天，其中第三天補充10-15μg/ml之GW於培養基。將培養物於300g下離心5分鐘(P1)去除死細胞，接著於2,000g下離心20分鐘(P2)去除細胞碎片，然後於10,000g下離心30分鐘(P3)取得上清液。所有離心步驟皆於4℃下進行。最後將上清液於110,000g下離心60分鐘，分離出釋放於培養基中的外泌體囊泡(P4)。將外泌體囊泡之離心團塊以PBS清洗一次，然後懸浮於PBS中備用。
將如上所製備得之外泌體囊泡(P4)進行電子顯微鏡分析，分析方法主要係參照van Niel等人(van Niel et al.,2001)所述的方法。簡述之，將純化之外泌體囊泡以4%多聚甲醛(PFA)PBS 溶液固定，並滴於經formvar/carbon-塗佈之銅網(Polysciences,Inc.)上。清洗步驟後，將樣本以2%磷鎢酸進行染色，然後使用穿透式電子顯微鏡(HT7700,Hitachi)進行觀察。
結果如圖1所示，經EP4拮抗劑GW處理之幹細胞培養物的P4中含有大量的囊泡(圖1A)。使用NanoSight Nanoparticle Tracking分析CM-P4分離物中的粒子數目，結果顯示其外泌體囊泡數量，與未經處理之對照組及PGE2(1μM)處理的細胞培養物相比明顯超出(圖1B)。
NanoSight奈米粒子追蹤分析(NTA)之結果顯示，EP4拮抗劑誘導釋放之外泌體囊泡其粒徑大小分布介於80-120nm，濃度約5.4 x 104個粒子/細胞，平均粒徑為97nm(圖1B、2A、2B)。而NAMECs與PGE2-處理之NAMECs釋出較少且較大的囊泡，濃度約~0.5x 104個粒子/細胞，平均粒徑為173nm及201nm。於經EP4拮抗劑GW處理之NAMEC培養物的P4中，偵測到大量外泌體囊泡標記物CD81、CD9、TSG101、Alix、HSP70與GAPDH(圖2C)，表示此等外泌體囊泡標記物，經由EP4拮抗劑誘導之外泌體囊泡而被釋放出來。
從外泌體囊泡標記物CD81,CD44與GAPDH之偵測結果顯示，EP4拮抗劑GW處理並未促使人類乳腺上皮非幹細胞(HMLE cells)增加外泌體囊泡的釋放(圖2D)。由另一EP4拮抗劑AH23848之處理亦顯示，EP4拮抗劑可以劑量依賴型式誘導NAMEC釋放出外泌體囊泡，而以AH6809(為一種EP1/EP2/EP3拮抗劑)則無此顯著的誘導釋出效果(圖2E)。同樣，使用拮抗EP4之shRNA阻斷EP4傳訊，亦可促使NAMEC釋放出外泌體囊泡。將表現多西環素(doxycycline，dox)-可誘導性EP4shRNA之NAMEC細胞(NAMEC-shEP4-1與NAMEC-shEP4-2)以多西環素處理，而抑制EP4蛋白表現。由圖2F之結果顯示，經過dox處理96小時，在細胞的培養液P4離心分離物(CM-P4)中偵測到外泌體囊泡標記物CD81、HSP70與GAPDH的量增加，表示NAMEC-shEP4-1與NAMEC-shEP4-2被誘導釋出大量的外泌體囊泡，此等結果顯示，經 由EP4拮抗劑或EP4 shRNAs阻斷PGE2訊號傳遞，皆能夠誘導乳腺上皮幹細胞釋放出外泌體囊泡。
此外，經過EP4拮抗劑處理之間質性/基本非附著性乳腺上皮幹細胞(NAMEC)，相較於未處理之NAMEC，其細胞形態上形成鵝卵石狀上皮小島(epithelial islands)(圖3A)，且對0.05%胰蛋白酶(trypsin)處理之抗性增加，顯示其對於培養盤表面之附著性增加(圖3B)。表示阻斷EP4訊號傳遞會誘導NAMEC發生間質性-至-上皮性轉移作用(MET)。此外，經EP4拮抗劑處理後，遷移性細胞數量減少約60%(圖3C)，顯示阻斷EP4訊號傳遞已造成NAMEC的間質性形態特徵與遷移能力喪失，轉為呈現非-幹細胞特性。
為進一步證明EP4拮抗劑處理所造成NAMEC發生MET，及遷移能力喪失是經由外泌體囊泡釋放的過程，遂以Dynasore(為一種細胞內吞作用阻斷劑可抑制外泌體囊泡的形成，以下簡稱Dy)處理有或無經過GW-處理之NAMEC細胞，觀察Dy對於EP4拮抗劑誘導乳腺上皮幹細胞發生MET的影響。參照圖3A-3C之結果，Dy處理會使NAMEC維持其細胞形態，逆轉EP4拮抗劑GW對於NAMEC細胞附著性增加的作用，以及回復NAMEC的遷移能力。表示，阻止外泌體囊泡釋出，則EP4拮抗劑無法引起NAMEC發生間質性-至-上皮性轉移作用，遷移能力喪失，及轉為呈現非-幹細胞。
實施例二、前列腺素受體EP 4 拮抗劑誘導釋放之外泌體囊泡的特性及內含物分析
本實例進一步分析前列腺素受體EP4拮抗劑GW及PGE2-誘導之外泌體囊泡內含物，以了解彼等負責轉移乳腺幹細胞狀態之不同能力的蛋白質差異性。由圖4之結果顯示，由GW-處理之NAMEC所釋出的外泌體囊泡蛋白質總量，比經過對照組載體(Crl)或PGE2處理之NAMEC所釋出的外泌體囊泡蛋白質總量高出許多。此外，各種蛋白質於GW及PGE2-誘導之外泌體囊泡內之相對含量亦有差異。
其中，GW-誘導之外泌體囊泡攜帶有維持間質性/幹 細胞特性所必需的蛋白質，即N-鈣黏蛋白(N-cad)、纖連蛋白(FN1)、CD146及CD91。反之，PGE2-誘導之外泌體囊泡則攜帶有上皮細胞標記物E-鈣黏蛋白(E-cad)，此蛋白質未出現在GW-誘導之外泌體囊泡中。此等結果顯示，PGE2/EP4傳訊途徑係以雙向方式調節NAMEC之形態與性狀；EP4拮抗劑藉由增加透過外泌體囊泡之間質性標記物的釋放，及減少外泌體囊泡之E-鈣黏蛋白(E-cad)釋放，而促進MET現象發生。
經過GW-處理之NAMEC亦透過外泌體囊泡，釋放出有助於細胞遷移之蛋白質(例如整合蛋白β 1、整合蛋白α 6、切絲蛋白、細絲蛋白A、CD91、CNP、塔林(talin)、原肌球蛋白、Gelectin 3、RAP1、CD146)、基本SC標記物(例如CD44、CD90、整合蛋白α 6)及β-環連蛋白(β-catenin)。總合之結果顯示，EP4拮抗劑透過促進外泌體囊泡形成及釋放，而將維持幹細胞特性所必需的蛋白質帶離幹細胞，藉而改變受處理幹細胞之間質性形態、細胞移動性及幹細胞特性(SC identity)。
於GW-誘導之NAMEC外泌體囊泡中亦偵測到訊號傳遞受體，例如TGF β 1、TGF β 2、LRP6、FZD5、EGFR、HER2、Met及、EP2(圖4)。此外，由細胞表面蛋白質生物素化(biotinylation)分析及流式細胞術之測量結果(圖5A，5B)顯示，經過GW-處理之NAMEC細胞表面上的此等訊號傳遞受體含量減少，反映出阻斷PGE2/EP4傳訊途徑，會導致訊號傳遞受體被釋放出來。
另外，參與PI3K傳訊作用(PI3K、PDK1、Akt、p-Akt)、正規Wnt傳訊作用(β-catenin)、EGF傳訊作用(c-Src、p-Src)及MAPK/非正規Wnt傳訊作用(SAPK/JNK)之訊號傳遞蛋白，亦透過GW-誘導之外泌體囊泡，從NAMEC細胞釋放出來。經由比較於GW-處理之細胞中，與被釋放出之外泌體囊泡中的p-Akt對總體Akt之比例發現，相對於Akt，p-Akt係被優先被納入GW-誘導之外泌體囊泡中(圖4)。
為評估是否有選擇性釋放出替代訊號傳遞途徑的組成蛋白，遂使用列陣分析經過GW-處理之NAMEC細胞中訊號傳 遞途徑的活化及抑制。結果顯示，最受到GW抑制之訊號傳遞途徑為PI3K/Akt、TGF-β、Wnt及androgen途徑(圖6)。由存在GW-處理之NAMEC細胞中的p-Akt含量減少，而存在GW-誘導之外泌體囊泡中p-Akt含量增多的結果，反映出PI3K/Akt-傳訊作用受到去活化。因此，EP4拮抗劑似乎是藉由通過釋出外泌體囊泡的方式減低細胞中p-Akt含量，而干擾Akt-依賴性訊號傳遞途徑。
此外，由存在GW-處理之NAMEC中之細胞表面受體EGFR、HER2、c-Met、TGFR β 1、TGFR β 2、LRP6與FZD5含量減少(被釋放到GW-誘導之外泌體囊泡中)，亦反映出PI3K/Akt、TGF-β及正規/非正規Wnt傳訊作用受到去活化。由此等數據表示，阻斷EP4訊號傳遞能通過釋出外泌體囊泡的方式，藉由減少表面受體及/或訊號傳遞組成蛋白，而間接影響其他細胞傳訊途徑，並進而誘導NAMEC由間質性/幹細胞狀態轉向上皮非幹細胞狀態。
除了前述之幹細胞標記、受體、及訊號傳遞蛋白之外，miRNA執行功能時所必需之argonaute蛋白(例如Ago1與Ago2)亦發現存在GW-誘導之NAMEC外泌體囊泡中，表示GW-誘導之NAMEC外泌體囊泡可含有miRNA。經由比較於NAMEC細胞中與GW-處理之NAMEC細胞中的miRNA對18S/26S RNA之比例發現，相對於總體RNA，miRNA係被優先被納入GW-誘導之外泌體囊泡中(圖7A)。而且，雖然GW-誘導之外泌體囊泡中含有大量miRNA，在PGE2-誘導之外泌體囊泡中卻只偵測到少量的miRNA(圖7B)。
使用miRNA列陣分析GW-誘導之外泌體囊泡與PGE2-誘導之外泌體囊泡中之miRNA含量。由圖8之結果發現，在GW-誘導之外泌體囊泡中，所分析1733種miRNAs中有24%的含量增加(2倍)，相較於PGE2-誘導之外泌體囊泡(其中無miRNA受到增量調節)。於GW-誘導之外泌體囊泡中受到增量調節之miRNA的前10%(5倍)含有許多已知參與幹細胞特性維持及移動性的miRNA(例如，mir-17-92、mir-106a-363與mir-106b-25叢、mir-24及mir-130)。涉及幹細胞特性維持之miRNA(即mir-17、mir-18a、mir-20a、mir-20b、mir-24、mir-25、mir-29a、mir-106b、mir-130a 與mir-130b)，亦顯示在GW-誘導之外泌體囊泡中具有高含量。此等數據表示，GW-誘導之外泌體囊泡可藉由攜帶出調節幹細胞特性(幹細胞恆定性及移動性)的miRNA，而介導乳腺幹細胞特性的改變。
已知蛋白質(例如CD44、CD90、整合蛋白、EGFR、c-Met、HER2、LRP6、Akt、TGF β R等)，當存在脂筏(lipid raft，以下簡稱LRF)或非-脂筏(非-LRF))中時會呈現不同的功能。該等蛋白質在細胞膜上之LRF-締合形式，通常可以活化方式介導訊號傳遞。由圖4顯示，NAMEC幹細胞會表現不同形式之整合蛋白β 1(Hg-整合蛋白β 1與Lg-整合蛋白β 1)、整合蛋白α 6(H-整合蛋白α 6與L-整合蛋白α 6)及LRP6(LRP6、pg-LRP6、g-LRP6及Ng-LRP6)。此等不同形式係由於不同的磷酸化及糖苷化狀態所造成。於NAMEC，Hg-整合蛋白β、H-整合蛋白α 6與pg-LRP出現在中，而Lg-整合蛋白β 1、整合蛋白α 6及Ng-LRP6僅存在非-脂筏中。
於圖4之外泌體囊泡蛋白分析結果，觀察到具有不同LRF-締合形式與非-LRF-締合形式之蛋白質(例如，整合蛋白β 1、整合蛋白α 6、LRP6及Akt/p-Akt)，其LRF-締合形式(例如，Hg整合蛋白β 1、H-整合蛋白α 6、pg-LRP6及p-Akt)會優先被分選入GW-誘導之外泌體囊泡中。
為證實LRF-締合形式之蛋白質優先被分選入外泌體囊泡是否也發生在其他外泌體囊泡蛋白質，遂使用密度梯度分層法進一步分析及比較分離自GW-處理之NAMEC的細胞及外泌體囊泡隔室之蛋白質。比較於GW-處理之NAMEC的細胞及外泌體囊泡隔室之LRF與非-LRF間的蛋白質分佈，觀察到例如整合蛋白β 1、整合蛋白α 6、HER2、c-Met、EGFR、LRP6、p-Akt、Src、Ago1及Ago2等蛋白質之LRF-締合形式大量存在外泌體囊泡隔室中(圖9A)。顯示許多蛋白質之LRF-締合形式，相對於非LRF-形式，優先被納入GW-誘導之外泌體囊泡中。相較於GW-誘導之外泌體囊泡的脂筏中攜帶有大量蛋白質，PGE2-誘導之外泌體囊泡的脂筏 含有少量的蛋白質(圖9B)。顯示，脂筏似乎是造成GW-誘導之外泌體囊泡與PGE2-誘導之外泌體囊泡間的蛋白質含量差異之重要關鍵。
小窩(Caveolae)是形態上可鑑定的脂筏結構，其形成及維持主要是由caveolin蛋白決定。從已抑制caveolin蛋白表現之NAMEC細胞釋出的GW-誘導之外泌體囊泡(siCav1及siCav1+2；圖9C)，顯示已大量喪失LRF-締合之蛋白質，例如CD44、CD90,整合蛋白β 1、整合蛋白α 6、EGFR、HER2、c-Met、LRP6、TGF β-R1、TGF β-R2、p-Akt、Akt、Ago1及Ago2等，表示caveolin蛋白所維持的脂筏結構為蛋白質分選入GW-誘導之外泌體囊泡過程所必需。
另外，膽固醇為脂筏的重要組成，若清除細胞膜-締合之膽固醇則會破壞細胞膜上之脂筏。故以M β CD破壞NAMEC之脂筏，並比較由NAMEC細胞釋出的GW-誘導之外泌體囊泡(GW-in-NA外泌體囊泡)與經過M β CD破壞脂筏處理之NAMEC釋出的GW-誘導之外泌體囊泡(GWM β-in-NA外泌體囊泡)中蛋白含量，結果顯示，因去除膽固醇造成之細胞脂筏破壞，會導致GWM β-in-NA外泌體囊泡中，LRF-締合之蛋白質含量明顯減少，而外泌體囊泡中非-脂筏膜標記蛋白CD71/Trf R及細胞質蛋白的量，並未受到M β CD處理影響(圖9D)。
經由M β CD破壞細胞的脂筏，亦減弱argonaute蛋白(Ago1與Ago2)選入EP4拮抗劑-誘導之外泌體囊泡中。而argonaute蛋白為miRNA執行功能之必要組成，因此外泌體囊泡中argonaute蛋白含量減少表示，外泌體囊泡中的miRNA含量亦可能因細胞的脂筏破壞而受影響。故比較GW-in-NA外泌體囊泡與GWM β-in-NA外泌體囊泡中之miRNA表現差異，圖9E之結果顯示，破壞NAMEC細胞脂筏確實會改變miRNA存在GW-誘導之外泌體囊泡中的含量。使用miRNA列陣進一步分析並比較存在GW-in-NA外泌體囊泡與GWM β-in-NA外泌體囊泡中的miRNA。相較於GW-in-NA外泌體囊泡，GWM β-in-NA外泌體囊泡中的miRNA減少了80%， 其中包括富含於GW-in-NA外泌體囊泡中之幹細胞恆定性-相關的miRNAs，例如mi-17、mir-18a、mir19b、mir-20a、mir-20b、mir-24、mir-25、mir-29a、mir-92a、mir-93、mir-106a、mir-106b、mir-130a及mir-130b(圖9E)。此等數據表示，細胞的脂筏為miRNA選入GW-誘導之外泌體囊泡所必需。
比較於GW-處理之NAMEC的LRF與非-LRF間的蛋白質分佈，觀察到EP4拮抗作用會促使細胞表面受體及訊號傳遞組成，由非-脂筏部份轉移至脂筏部份(圖9 F)，然後隨著脂筏被內化。表示從細胞膜之脂筏內化作用，會造成EP4拮抗劑-處理之NAMEC中的幹細胞標記物及訊號傳遞受體含量減少。
同樣，在經過GW-處理之間質幹細胞(mesenchymal stem cell,MCS)及亦得到與NAMEC細胞相似的結果(圖10A及圖10B)。以EP4拮抗劑阻斷EP4-介導之訊號傳遞，可增加外泌體囊泡的釋出量，且GW-誘導之外泌體囊泡中維持幹細胞特性所需之蛋白質含量增加，包括細胞表面幹細胞標記蛋白、細胞表面受體、訊號傳遞蛋白，及細胞激素PSA、VCAM1、VEGFR2、VEGFR3、PDGF β、NGFR、MPIF1、IL-2R β、IL-18R β、BMP-7、MIP-3 α、RANTES等。
由圖11之結果顯示，經過GW-處理之MSC分別培養於成骨、成脂肪及神經分化培養基，被誘導分化成骨細胞、脂肪細胞或神經細胞的能力，比未經處理之間質幹細胞低很多(圖11A-D)。此結果亦表示，經過GW-處理之MSC明顯喪失其原本的幹細胞特性。
同樣，在經過GW-處理之神經幹細胞(Neural stem cell；NSC)及亦得到與NAMEC細胞相似的結果。經過GW-處理之神經幹細胞(NSC)培養物中外泌體囊泡標記物CD81與GAPDH的含量增加(圖10C)，表示以EP4拮抗劑阻斷EP4-介導之訊號傳遞，可增加外泌體囊泡的釋出量，而且由NSC所釋出GW-誘導之外泌體囊泡中，維持NSC幹細胞特性所需之蛋白質含量增加(圖10C)。另外，由經過GW-處理之神經幹細胞，其神經幹細胞特有標記 SOX2表現量，比未經處理之神經幹細胞低很多的結果表示，經過GW-處理之NSC已喪失其原本的幹細胞特性(圖10C)。
為進一步證明經過GW-處理之幹細胞喪失其原本的幹細胞特性(包括維持幹細胞恆定性及移動性等)係經由釋出外泌體囊泡的過程而造成的，遂將GW-處理之NAMEC與GW-in-NA外泌體囊泡培養，觀察其是否逆轉EP4拮抗劑-誘導之MET現象。由圖12之結果顯示，當與GW-in-NA外泌體囊泡共培養時，GW-處理之NAMEC可恢復其間質性外表型(圖12A，12B)、細胞移動性(圖12C)及乳腺球形成能力(圖12D)。表示，攝入GW-誘導釋出之幹細胞外泌體囊，可使經過EP4拮抗劑-處理之NAMEC重新獲得其原本的幹細胞特性。
綜合上述結果，經由本發明方法利用EP4拮抗劑刺激釋放的外泌體囊泡，獨特地帶有維持幹細胞特性所需之蛋白分子及miRNAs，且透過外泌體囊泡之釋出，可使原先之幹細胞失去其幹細胞特性，而轉變成非-幹細胞狀態的細胞。
實施例三、前列腺素受體EP 4 拮抗劑誘導釋放之外泌體囊泡藉由細胞重新編程誘導非-幹細胞性組織細胞轉為幹細胞
EP4拮抗劑誘導從乳腺幹細胞釋放之外泌體囊泡增加HMLE乳腺上皮細胞之移動性及乳腺球細胞形成能力
將乳腺非幹細胞HMLE細胞與GW-in-NA外泌體囊泡共培養7天，然後分析其在無進一步外泌體囊泡處理下的幹細胞特性，以確定非幹細胞攝入乳腺幹細胞釋出的外泌體囊泡之後，是否會轉變成乳腺幹細胞細胞。圖13A之結果顯示，GW-in-NA外泌體囊泡可誘導乳腺非-幹細胞HMLE的細胞形態發生變化，與未處理對照組相比，攝入GW-in-NA外泌體囊泡之HMLE細胞產生可分辨的間質性形態。此等經過GW-in-NA外泌體囊泡處理之HMLE細胞，較對照組細胞更具有移動性，反之，以載體-處理之HMLE細胞的細胞移動性很低。經過GW-in-NA外泌體囊泡處理之HMLE細胞的平均移動距離，較HMLE細胞多出6倍(圖13B)。表示，攝入GW-in-NA乳腺幹細胞外泌體囊泡可促進HMLE細胞發生形態上 的上皮性-至-間質性轉移作用(EMT)，且增加細胞移動能力。
此外，攝入GW-in-NA乳腺幹細胞外泌體囊泡的HMLE細胞(HMLE+EV,EV-HMLE)之移動性細胞數量，相較於對照組增加了~4-倍(圖13C)，且經過GW-in-NA外泌體囊泡預先處理之HMLE細胞(Exo)形成之乳腺球數目增加~3-倍(圖13D)。此等結果表示，乳腺上皮非幹細胞攝入EP4拮抗劑-誘導乳腺幹細胞釋出之外泌體囊泡，能增加其細胞移動性及乳腺球形成能力。
EP 4 拮抗劑誘導之外泌體囊泡可將乳腺形成能力轉送至初級乳腺管腔非-幹細胞
從小鼠脂肪墊(fat pad)分離出初級乳腺細胞，進行乳腺幹細胞及非-幹細胞分選。並用以乳腺幹細胞產生之EP4拮抗劑誘導外泌體囊泡，評估EP4拮抗劑誘導之外泌體囊泡是否能夠將非幹細胞轉變成，能夠形成乳腺之乳腺幹細胞，稱為乳腺再生單元(MRU)。利用上皮細胞黏附分子(EpCAM)與整合蛋白α 6(CD49f)之差異表現，分選出小鼠EpCAMlo/CD49fhi乳腺幹細胞及EpCAMhi/CD49flo管腔非幹細胞。此外，從小鼠初級乳腺上皮細胞收集PGE2-誘導之外泌體囊泡及GW-誘導之外泌體囊泡。
圖14結果顯示，EpCAMhi/整合蛋白α 6(CD49f)lo管腔非幹細胞之MRU出現頻率很低(腺體形成效率：1/6,0/6,<2/6)。經由GW-誘導之外泌體囊泡預先處理10天，EpCAMhi/CD49flo管腔非幹細胞的MRU頻率增加~20-倍(腺體形成效率：5/6,6/6,4/6)。此等結果顯示，EP4拮抗劑誘導之乳腺上皮細胞外泌體囊泡可將乳腺再生能力轉送至管腔非幹細胞。
EP 4 拮抗劑誘導之外泌體囊泡係經由脂筏-締合因子(lipid raft-associated factors)轉送乳腺幹細胞之特性
為進一步確認脂筏-締合因子是否負責，EP4拮抗劑誘導之外泌體囊泡對於乳腺幹細胞特性的傳送能力，遂將HMLE乳腺非幹細胞與相同數量之GW-、PGE2-或GW+M β CD-誘導的NAMEC外泌體囊泡(簡稱GW-in-NA Exo、PGE2-in-NA Exo或GWM β-in-NA Exo)共同培養，並觀察經處理細胞之移動性及乳腺 球形成能力。圖15A顯示，經過GW-in-NA Exo前處理的HMLE非幹細胞，其移動性細胞數量增加~10-倍，而PGE2-in-NA Exo僅使移動性細胞數量增加3-倍。而且，GWM β-in-NA Exo對於移動性細胞數量增加的影響，相較於GW-in-NA Exo處理組顯著降低。
同樣，經過GW-in-NA Exo前處理7天的HMLE細胞，其形成乳腺球的數目增加~4-倍，而PGE2-in-NA Exo及GWM β-in-NA Exo處理，對於HMLE細胞之乳腺球形成力並無影響(圖15B)。此等結果表示，攝入EP4拮抗劑-誘導之乳腺幹細胞外泌體囊泡，能藉由外泌體囊泡中的脂筏-締合因子，而增加HMLE細胞之細胞移動性及乳腺球形成能力。
此外，外泌體囊泡中的脂筏-締合因子亦為使管腔非幹細胞(luminal cell)具有乳腺形成能力所必需。圖15C之結果顯示，EpCAMlo/整合蛋白α 6hi幹細胞(EpCAMlo/CD49fhi basal cell)之MRU出現頻率(腺體形成效率：3/4,3/4,3/3)比EpCAMhi/整合蛋白α 6lo管腔非幹細胞(EpCAMhi/CD49flo luminal cell)之MRU頻率(腺體形成效率：3/12,3/22,2/30)高出七倍。而在非幹細胞進行植入前先以GW-in-NA外泌體囊泡前處理10天，可使非幹細胞有效轉變成可形成乳腺的乳腺幹細胞(腺體形成效率：6/12,15/24,15/30)。表示，管腔非幹細胞之乳腺形成效率因GW-in-NA外泌體囊泡前處理而增加了~6-倍，等同於乳腺幹細胞之乳腺形成效率。而以PGE2-in-NA EV及GWM β-in-NA EV前處理，對於乳腺非幹細胞則無此功效(腺體形成效率分別為0/6,0/18,0/24及0/6,1/12,3/24)。此等結果表示，EP4拮抗劑誘導之乳腺幹細胞外泌體囊泡將乳腺再生能力(mammary repopulating ability)轉移給管腔非幹細胞的能力，是藉由存在外泌體囊泡中的脂筏-締合因子達成。
攝入本發明誘導之間質幹細胞外泌體囊泡(MSCEVs)轉化之神經外胚層細胞具有分化成神經細胞的能力
EP4拮抗劑GW-誘導之間質幹細胞外泌體囊泡(MSCGWEVs)應用於神經組織，亦可將非-幹細胞轉化為神經幹細胞，具有進而分化成神經細胞的能力。由圖16之結果顯示，神經 外胚層細胞與EP4拮抗劑GW-誘導之間質幹細胞外泌體囊泡(MSCGWEVs)共培養後，其形成神經球的數量增加，表示EP4拮抗劑GW-誘導之間質幹細胞外泌體囊泡(MSCGWEVs)已將幹細胞的特性轉移給不具有幹細胞特性的神經外胚層細胞，而使攝入EP4拮抗劑-誘導之(MSCGWEVs)的神經外胚層細胞轉化為神經幹細胞(NSC)。
進一步將預先經過PBS、基本間質幹細胞外泌體囊泡(MSCEVs)、GW-誘導之MSC外泌體囊泡或GW-誘導之NAMEC外泌體囊泡(MSCGWEVs)處理之NE-4C神經外胚層細胞，以維生素A酸(RA)處理誘導進行神經細胞分化，並將誘導分化之神經細胞以抗-β 3-微管蛋白抗體進行染色。圖17之結果顯示，相較於其他預先處理組，經過GW-誘導之間質幹細胞外泌體囊泡(MSCGWEVs)預先處理之神經外胚層細胞能分化成具有較多神經軸突及較長神經軸突的神經元。表示，EP4拮抗劑-誘導之間質幹細胞外泌體囊泡可增加神經外胚層細胞分化成神經元的潛能。
實施例四、前列腺素受體EP 4 拮抗劑誘導之間質幹細胞外泌體囊泡修復海馬迴退化所引起的學習與記憶缺陷
本實例係使用Morris水迷宮試驗，評估有(I-PBS及I-EXO)或無(NI-PBS及NI-EXO)海馬迴損傷之小鼠的學習與記憶能力。經過訓練後，評估小鼠找到目標所需花費的時間，結果發現注射EP4拮抗劑誘導之間質幹細胞外泌體囊泡之海馬迴損傷小鼠(I-EXO)的學習與記憶能力，顯著較僅注射PBS之海馬迴損傷小鼠(I-PBS)佳(圖18)。該等數據證明，注射EP4拮抗劑誘導之間質幹細胞外泌體囊泡，對於因海馬迴退化所引起的神經退化疾病，例如阿茲海默氏症、巴金森氏症等具有治療功效。
綜合上述，本發明之方法係利用EP4拮抗劑，誘導幹細胞大量製造攜帶有維持幹細胞特性所需組成物的外泌體囊泡。因此，EP4拮抗劑-誘導之幹細胞外泌體囊泡，較非誘導性(基本程度之)幹細胞外泌體囊泡，具有更優的幹細胞誘導能力。此可由EP4拮抗劑-誘導之乳腺幹細胞外泌體囊泡能夠將非-幹細胞乳腺上皮 細胞轉變成，能夠於活體內分化形成乳腺之乳腺幹細胞，而從處於基礎培養條件及經EP4促進劑處理之幹細胞所收集得到的外泌體囊泡則不具有此等功效之結果獲得證明。此外，EP4拮抗劑-誘導之MSC外泌體囊泡誘導神經幹細胞的能力，亦顯著較分離自基礎培養條件之間質幹細胞外泌體囊泡更佳。
於是，本發明EP4拮抗劑-誘導之幹細胞外泌體囊泡可應用於退化性疾病的治療，例如促進乳腺發育及預防或治療神經退化。

Claims (16)

  1. 一種製造誘導性外泌體囊泡的方法，特徵在於包含：將一幹細胞與一有效量之前列腺素受體EP4-拮抗劑接觸，使該幹細胞經該前列腺素受體EP4-拮抗劑誘導而釋放出外泌體囊泡；及從該細胞培養物上清液分離得到所釋放出的外泌體囊泡；其中該幹細胞之種類係為上皮幹細胞、間質幹細胞、神經幹細胞或癌幹細胞。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該接觸步驟係將該幹細胞培養於含有該前列腺素受體EP4-拮抗劑之培養基中一段時間，足以使該幹細胞將外泌體囊泡釋放至細胞培養物中。
  3. 如請求項1或2所述之方法，其中該前列腺素受體EP4-拮抗劑係選自GW627368x、AH23848、L-161、982、CJ-023、423、ONO AE3 208、BGC 20-1531、MF498及CJ-42794。
  4. 如請求項1或2所述之方法，其中該前列腺素受體EP4-拮抗劑為一分子、一抗體或一專一抑制EP4功能之分子。
  5. 如請求項1或2所述之方法，其中該所釋出的誘導性外泌體囊泡具有下列一或多項特性：(1)具有粒徑為50nm至150nm，(2)較由未經誘導之幹細胞所釋出的外泌體囊泡含有較高含量的一或多種選自CD44、CD90、整合蛋白β 1(integrin β 1)、整合蛋白α 6(integrin α 6)、CD81、GAPDH、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、纖連蛋白(fibronectin)、CD146、CD91、切絲蛋白(cofilin)、細絲蛋 白A(filamin A)、CD91、CNP、塔林(talin)、原肌球蛋白(tropomyosin)、gelectin 3、Rap1、CD146、β-環連蛋白(β-catenin)、TGF β 1、TGF β 2、LRP6、FZD5、EGFR、HER2、Met、EP2、twist、PI3K、PDK1、Akt、p-Akt、c-Src、p-Src及SAPK/JNK的組成，(3)較由未經誘導之幹細胞所釋出的外泌體囊泡含有較低含量的E-鈣黏蛋白(E-cadherin)，(4)較由未經誘導之幹細胞所釋出的外泌體囊泡含有較高含量的miRNA，(5)較由未經誘導之幹細胞所釋出的外泌體囊泡含有較高含量的一或多種選自mir-17-92、mir-106a-363、mir-106b-25叢、mir-24、mir-130、mir-17、mir-18a、mir-20a、mir-20b、mir-24、mir-25、mir-29a、mir-106b、mir-130a及mir-130b的組成，(6)較由未經誘導之幹細胞所釋出的外泌體囊泡含有較高含量的脂筏-締合形式蛋白質，(7)較由未經誘導之幹細胞所釋出的外泌體囊泡含有較高含量的細胞激素(cytokines)，(8)較由未經誘導之幹細胞所釋出的外泌體囊泡含有較高含量的一或多種選自PSA、VCAM1、VEGFR2、VEGFR3、PDGF β、NGFR、IL-2R β、IL-18R β、BMP-7、MIP-3 α及RANTES的組成。
  6. 如請求項5所述之方法，其中該未經誘導之幹細胞係經過EP4-促進劑處理者。
  7. 如請求項5或6所述之方法，其中該幹細胞為乳腺上皮幹細胞、間質幹細胞或神經幹細胞。
  8. 一種組成物，包含如請求項1或2所述之方法製得之誘導性外泌體囊泡。
  9. 如請求項8所述之組成物，其中該組成物不含細胞。
  10. 一種如請求項8所述之組成物用於製備誘導非-幹細胞族群轉化為幹細胞之醫藥品的用途，其中該組成物係用於活體外或活體內接觸一非-幹細胞族群而藉以誘導幹細胞產生。
  11. 如請求項10所述之用途，其中該醫藥品係以全身或局部方式施用於需進行幹細胞療法之患者或部位。
  12. 如請求項11所述之用途，其中該患者具有退化性疾病、組織或器官損傷、或細胞缺陷。
  13. 如請求項11所述之用途，其中該患者具有神經退化性疾病、腦與脊髓創傷、中風、學習障礙、阿茲海默氏症、巴金森氏症、心肌梗塞或肌肉萎縮症。
  14. 如請求項10-13所述之用途，其中該幹細胞族群係源自需要治療之患者本身，或取自於其他個體。
  15. 如請求項10所述之用途，其中該醫藥品係不含細胞。
  16. 如請求項10所述之用途，其中該醫藥品係用於進一步使誘導產生的幹細胞分化為組織或器官。
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