TW202122572A - 胞外體的產生方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種方法，包含：將細胞應用於細胞培養模組以培養細胞的步驟；及藉由細胞產生胞外體的步驟；其中該細胞培養模組，具備：聚合物多孔質膜；及殼體，具有2個以上的培養基流出入口且收納該聚合物多孔質膜。
Description
本發明係關於使用細胞產生胞外體的方法。
胞外體係細胞分泌於細胞外的50～300nm的膜囊泡（membrane vesicle）結構的一種，其係胞內體的膜陷入由內吞作用（endocytosis）所形成之多囊泡胞內體的內部而形成，表面含有源自細胞膜的表面蛋白質，內部含有源自細胞質的核酸及蛋白質。近年來有人報告與下述內容相關的技術：在各種細胞之中，蛋白質及核酸之構成經過精密控制的胞內體與附近或遠端的細胞之間的訊息傳遞有關（非專利文獻1）。
胞外體主要被預期用作診斷標記、藥物傳送載體及生物醫藥。癌細胞或疾病細胞會分泌反映其病理狀態的胞外體，因此藉由剖析（profiling）胞外體的特徵而能夠診斷疾病（非專利文獻2）。亦可將載持有藥物的胞外體用於以接收該胞外體之細胞為目的地的藥物傳送。作為載持藥物的方法，具有將藥物與所分泌之胞外體結合或摻入其中的方法、使在細胞質內含有藥物的細胞分泌含藥物之胞外體的方法（非專利文獻3）。
亦有報告提出胞外體本身可發揮作為生物活性物質的功能。其中顯示，從培養神經幹細胞株分離出來的胞外體，在體外誘導纖維母細胞的移動、人類臍帶靜脈內皮細胞的分叉及神經突的伸長（專利文獻1）。有報告提出骨髓樹突細胞的胞外體具有免疫調節功能，在小鼠模型中，試驗了對於感染症、過敏、自我免疫疾病等的治療效果(非專利文獻4及5)。
胞外體所具有的生物活性，被認為係由作為胞外體之來源的細胞所控制的核酸及蛋白質之構成所支撐。尤其是胞外體所含有之miRNA與生物活性的關連性受到矚目，專利文獻2中記載，從心肌球（cardiosphere）或源自心肌之細胞（CDC）分離出來的胞外體，包含miR-146a、miR-210、miR-22及miR-24，此等具有治療損傷或患病之心臟組織的效果。又，專利文獻3中記載，包含miR-34b、miR-132、miR-137、miR-193a及miR-203中至少1種以上之miRNA的脂質體，發揮作為口腔鱗狀上皮細胞癌之抑制劑的功用。再者，非專利文獻6中記載miR-26a及miR-26b阻礙胃細胞癌的細胞移動及潤濕，非專利文獻7中記載miR-23b、miR-27b及miR-24優異地阻礙前列腺癌細胞的細胞移動及潤濕。
為了將胞外體用於藥物傳送載體及生物活性物質，必須確立足量生產品質均勻之胞外體的方法。一般係藉由超離心回收培養細胞在培養系統中所分泌之胞外體來取得胞外體。提出胞外體之利用方法的上述文獻等以往技術中，雖分別使用了回收試驗所需之胞外體的適當方法，但皆未預期能夠以工業規模生產醫藥品水準的胞外體而開發穩定且高效率的生產方法。
專利文獻4揭示了生產胞外體的方法。此方法之特徵係藉由使前列腺E受體4（EP4）拮抗物接觸幹細胞而誘導胞外體分泌。作為用以高效率地生產具有良好生物活性的胞外體而構成的細胞培養系統的例子，非專利文獻8提出一種將間葉系幹細胞的3D培養系統與切流式過濾（TFF，Tangential Flow Filtration）組合的系統。
如上所述，賦予胞外體特徵的核酸、蛋白質及各種信號分子（Signal molecule）的構成，可藉由作為胞外體之來源的細胞來控制，據認為在細胞培養中的誘導期、對數增殖期、靜止期及死亡期的各階段產生之胞外體的品質有所變化。然而，考量以工業規模生產胞外體的情況，胞外體的特性隨著培養時間變化在品質管理上並不佳，因此要求一旦確立生產系統即可長期產生品質均勻的胞外體。使用以往的培養細胞來產生胞外體的技術中，並未充分對應這種細胞培養系統中胞外體的品質隨著時間經過而有所變化的問題，此成為了技術屏障而阻礙了品質穩定之胞外體的供給及以工業規模產生胞外體之系統的確立。
不只是胞外體，使用培養細胞來生產物質時，建立高效率且穩定生產預期物質的最佳細胞培養方法係為重要。細胞在生物體內一般係作為形成三維結構的集合體而存在。另一方面，在人工環境中培養細胞的情況，一般係使用在培養容器底部將細胞鋪設為單層狀的型態以進行二維培養的古典平面培養法、以及在將細胞分散於液體培養液的狀態下進行培養的漂浮培養法。就平面培養法中所使用的細胞而言，適合接著性較高的細胞，但即便使用適合的細胞，根據培養環境的不同，細胞的性質也可能大幅變化。就漂浮培養法而言，亦存在適合的細胞與不適合的細胞。
隨著對於醫療用途中所使用的生物體內蛋白質等的需求提高，使用細胞培養大量產生生物體內蛋白質等開始受到矚目。針對大腸菌等的漂浮細胞，已有人研究以大型培養槽進行大量培養的技術。使用大型培養槽大量培養漂浮細胞的過程中，需要大量的培養液與攪拌裝置。另一方面，使用附著細胞（adherent cell）來產生物質的研究，隨著所使用之細胞的研究發展，亦引起許多注意。附著細胞的情況，在古典的平面培養法中，細胞只能二維展開，而需要大量的培養面積。為了大量產生生物體內蛋白質等，應更立體地培養大量的細胞，亦有許多細胞培養載體與生物反應器的研究正積極地進行。
作為代表性的細胞培養用載體，可使細胞附著而進行育成的小粒子，即微載體（microcarrier）成為廣泛研究的對象（專利文獻5）。已有人研究、開發各種微載體，且已有多種在市面上販售。作為大量用於製造疫苗及蛋白質並且可對應規模升級的系統，其廣泛地被採用作為方法理論。然而，微載體培養中，為了避免凝集而必須將微載體充分攪拌、擴散，因此細胞培養數量具有上限。此外，例如進行物質產生的情況，為了將載體本體分離，而必須以分辨細微粒子的過濾器等進行分離等，就方法理論而言，需要繁瑣的作業。同時，在微載體培養中，微載體這種粒子狀物質其形狀有所限定，因此無法避免因形狀所造成的性質。再者，因為容易由剪切力引起細胞的剝離，攪拌條件亦極受到限定，完全不適合在大腸菌所使用各種強勁流路的培養條件。
作為與微載體培養不同的方法，亦發現了以使用甲基纖維素及結蘭膠（Gellan Gum）的3維培養法持續地大量培養球狀細胞的方法。藉由使用纖維素海綿體的生物反應器等，確實能夠培養大量的細胞。然而，其系統為大型封閉系統，無法簡單地接觸培養環境等，作業上的限制亦多。
為了以簡便且適合自動化的系統長期有效率地使細胞產生品質均勻的胞外體，建構新型系統的必要性提高。
＜聚醯亞胺多孔質膜＞
有報告提出一種細胞的培養方法，包含將細胞應用於聚醯亞胺多孔質膜並進行培養的步驟（專利文獻6）。
聚醯亞胺係重複單元中包含醯亞胺鍵的聚合物之統稱。芳香族聚醯亞胺，意指芳香族化合物直接由醯亞胺鍵連結而成的聚合物。芳香族聚醯亞胺中，芳香族與芳香族隔著醯亞胺鍵而具有共軛結構，因此具有剛性（rigid）且牢固的分子結構，且醯亞胺鍵具有強力的分子間力，因而具有非常高水準的熱性質、機械性質、化學性質。
聚醯亞胺多孔質膜，在本申請案之前，係用於以過濾器、低介電常數膜、燃料電池用電解質膜等、尤其是電池相關為中心的用途。專利文獻7～9記載了一種具有大量巨孔的聚醯亞胺多孔質膜，其氣體等物質穿透性尤其優良、空孔率高、兩個表面的平滑性優良、相對強度高、且儘管為高空孔率其對於膜厚方向上的壓縮應力之耐力仍優良。此等皆為經由醯胺酸製作而成的聚醯亞胺多孔質膜。
［先前技術文献］
［專利文献］
［專利文獻1］國際公開第2013/150303號
［專利文獻2］日本特開2019-38840號公報
［專利文獻3］日本特開2009-171876號公報
［專利文獻4］日本特開2018-064550號公報
［專利文獻5］國際公開第2003/054174號
［專利文獻6］國際公開第2015/012415號
［專利文獻7］國際公開第2010/038873號
［專利文獻8］日本特開2011-219585號公報
［專利文獻9］日本特開2011-219586號公報
［專利文獻10］國際公開第2018/021368號
［非專利文献］
［非專利文獻1］J. of Extracellular Vesicles, 2015, 4, Article: 27066
［非專利文獻2］AMA Oncology, 2016, 2, p882-889
［非專利文獻3］Trends in Biotechnology, 2017, 7, p665-676
［非專利文獻4］Transplantation 2003, 76: 1503-10
［非專利文獻5］Am. J. Transplant. 2006, 6:1541-50
［非專利文獻6］Int J Oncol. 2016 May;48(5):1837-46
［非專利文獻7］Oncotarget. 2014; 5:7748-7759
［非專利文獻8］Molecular Therapy Vol. 26 No 12 2018 2838-2847
［發明所欲解決之課題］
本發明之目的係提供一種使用細胞長期持續以高產率產生品質均勻之胞外體的方法、胞外體產生裝置、套組、及此等的用途，以及使用此等所生產的胞外體。
［解決課題之手段］
本案發明人已發現了將聚合物多孔質膜收納於殼體所構成的模組適用於細胞的大量培養及細胞的去除（專利文獻10）。本案發明人，為了解決「提供一種可簡便且有效率地使細胞產生胞外體的方法、細胞培養系統及藉由細胞培養系統所產生之品質穩定的胞外體」這樣的上述課題而致力於詳細研究，結果發現藉由使用具備該聚合物多孔質膜及殼體的模組來培養細胞，可長期產生具有穩定產量與品質的胞外體，進而完成本發明。
並驚訝地發現，藉由使用本發明的方法，培養細胞可在數個月間持續產生品質均勻的胞外體。這從一旦確立生產具有預期性質之胞外體的系統即可長期持續使用的觀點、以及可大量製備具有均勻品質的胞外體的觀點來看，就以工業規模產生用作生物活性物質之胞外體而言極為有利。
因此，本發明的特徵之一，係使用具備聚合物多孔質膜及殼體的模組來培養細胞。
活用聚合物多孔質膜所具有的、細胞可通過的大孔徑連通孔而穩定且立體地進行培育，相較於平面培養，即使在包含大量細胞的狀態，亦確保該連通孔與培養基接觸，藉此可穩定地持續培育細胞。再者，藉由聚合物多孔質膜所具有的薄膜特性、可撓特性、形狀穩定性、自由形態性，可使大量的片材在狹小的單元空間內共存，或是可將大量的膜積層，除此之外，因為聚合物多孔質膜所具有的超耐熱性、耐溶劑性，而能夠以多種手段簡便且迅速地進行片材的殺菌。再者，因為聚合物多孔質膜所具有的立體立足點結構，相較於平面性培養的情況，亦能夠期待提升每個細胞的胞外體產生量。
雖未限定，但本發明較佳係包含以下態樣。
1.一種方法，其係使用細胞產生胞外體的方法，包含：
將細胞應用於細胞培養模組以培養細胞的步驟；及
藉由細胞產生胞外體的步驟；
其中，該細胞培養模組具備：
聚合物多孔質膜；及
殼體，具有2個以上的培養基流出入口且收納該聚合物多孔質膜。
2. 如第1項之方法，其中該聚合物多孔質膜，係包含具有複數個孔的表面層A及表面層B與夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚合物多孔質膜，其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑小於存在於該表面層B的孔的平均孔徑，該巨孔層具有與該表面層A及B連結的分隔壁以及由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的複數個巨孔，該表面層A及B中的孔與該巨孔連通；
其中，在該殼體內，
（i）2片以上獨立的該聚合物多孔質膜集中收納於其中；
（ii）該聚合物多孔質膜經摺疊而收納於其中；
（iii）該聚合物多孔質膜捲成滾筒狀而收納於其中；及/或
（iv）該聚合物多孔質膜綁成繩狀而收納於其中。
3. 如第1或2項之方法，其中該培養基流出入口的直徑大於細胞的直徑，且小於該聚合物多孔質膜流出的直徑。
4. 如第1至3項中任一項之方法，其中該殼體具有網格狀結構。
5. 如第1至4項中任一項之方法，其中該殼體係由非可撓性材料所構成。
6. 如第1至5項中任一項之方法，其中該聚合物多孔質膜具有平均孔徑0.01～100μm的複數個細孔。
7. 如第2至6項中任一項之方法，其中該表面層A的平均孔徑為0.01～50μm。
8. 如第2至7項中任一項之方法，其中該表面層B的平均孔徑為20～100μm。
9. 如第1至8項中任一項之方法，其中該聚合物多孔質膜的總膜厚為5～500μm。
10. 如第1至9項中任一項之方法，其中該聚合物多孔質膜為聚醯亞胺多孔質膜。
11. 如第10項之方法，其中該聚醯亞胺多孔質膜係包含由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯亞胺的聚醯亞胺多孔質膜。
12. 如第10或11項之方法，其中該聚醯亞胺多孔質膜，係在將包含由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯胺酸溶液與著色前驅物的聚醯胺酸溶液組成物成形後以250℃以上進行熱處理所得到的經著色之聚醯亞胺多孔質膜。
13. 如第1至12項中任一項之方法，其中該培養細胞的步驟係在靜置培養條件下進行。
14. 如第1至12項中任一項之方法，其中該培養細胞的步驟係在旋轉培養或攪拌條件下進行。
15. 如第1至14項中任一項之方法，其中該培養細胞的步驟係連續進行。
16. 如第1至15項中任一項之方法，其中該培養細胞的步驟係在設置於恆溫箱內的細胞培養裝置中進行，其中，該細胞培養裝置包含：培養單元，收納載持細胞的該細胞培養模組，其具備培養基供給口及培養基排出口；及培養基供給單元，具備培養基收納容器、培養基供給線、透過培養基供給線輸送培養基的送液泵，其中培養基供給線的第一端部與培養基收納容器內的培養基接觸，培養基供給線的第二端部透過培養單元的培養基供給口與培養單元內連通。
17. 如第16項之方法，其中該細胞培養裝置不具有培養基供給線、送液泵、空氣供給口、空氣排出口及透氧膜。
18. 如第1至17項中任一項之方法，其中該細胞係選自由多功能幹細胞、組織幹細胞、體細胞、生殖細胞、肉瘤細胞、株化細胞及轉型細胞所構成之群組。
19. 如第1至18項中任一項之方法，其中該細胞為人類間葉系幹細胞。
20. 如第1至19項中任一項之方法，其中該產生胞外體的步驟，與該培養細胞的步驟的至少一部分重複。
21. 如第1至20項中任一項之方法，其中該產生胞外體的步驟持續1個月、2個月、3個月或6個月或其以上的期間。
22.一種胞外體產生裝置，其係用於如第1至21項中任一項之方法，其包含該細胞培養模組。
23.一種套組，其係用於如第1至21項中任一項之方法，其包含該細胞培養模組。
24.一種用途，其係將該細胞培養模組用於如第1至21項中任一項之方法。
25.一種胞外體，其係由包含使用該細胞培養模組之如第1至21項中任一項之方法所取得。
［發明之效果］
藉由使用收納於殼體而經過模組化的聚合物多孔質膜，可有效率地吸附懸浮的細胞，並使用以往的漂浮培養容器等長期穩定培養細胞。因為可在適當條件下長期穩定地連續大量培養細胞，而可建構穩定且有效率的胞外體生產系統。
I.產生胞外體的方法
本發明係關於使用細胞產生胞外體的方法。本發明之方法，包含在殼體中收納聚合物多孔質膜而構成的模組內培養細胞而藉由細胞產生胞外體的步驟。
1.細胞
可用於本發明之方法的細胞種類，只要會產生胞外體則未特別限定。已知胞外體係由各種細胞所生產，此等生產出來的胞外體的形貌根據來源的細胞及產生時的條件而有所不同。因此，本發明中，能夠以預期的品質及產率產生胞外體的細胞，可根據各實施態樣適當選擇。
一態樣中，本發明係使用多功能幹細胞作為培養細胞。多功能幹細胞意指具有可分化為所有組織之細胞之能力（多潛能性（multipotency））的幹細胞的統稱。雖未限定，但多功能幹細胞包含胚胎幹細胞（ES細胞）、人工誘導多能幹細胞（iPS細胞）、胚胎生殖幹細胞（EG細胞）、生殖幹細胞（GS細胞）等。較佳為ES細胞或iPS細胞。iPS細胞因為無倫理上之問題等理由而特佳。作為多功能幹細胞，可使用習知的任意者，例如可使用國際公開第WO2009/123349號（PCT/JP2009/057041）之多功能幹細胞。
一態樣中，本發明係使用組織幹細胞作為培養細胞。組織幹細胞中，可分化的細胞系列雖限定於特定的組織，但意指具有可分化為多樣細胞種類之能力（多潛能性）的幹細胞。例如骨髓中的造血幹細胞成為血球的來源，神經幹細胞分化為神經細胞。此外亦具有製作肝臟的肝臟幹細胞、成為皮膚組織的皮膚幹細胞等各個種類。組織幹細胞較佳為選自間葉系幹細胞、肝臟幹細胞、胰臟幹細胞、神經幹細胞、皮膚幹細胞或造血幹細胞。
一態樣中，本發明係使用體細胞作為培養細胞。體細胞係指構成多細胞生物的細胞之中除了生殖細胞以外的細胞。在有性生殖中無法遺傳給下一代。體細胞較佳係選自肝臟細胞、胰臟細胞、肌肉細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、纖維母細胞、胰臟細胞、腎臟細胞、肺臟細胞或淋巴球、紅血球、白血球、單核球、巨噬細胞或巨核球的血球細胞。
一態樣中，本發明係使用生殖細胞作為培養細胞。生殖細胞意指具有在生殖中將遺傳訊息傳遞給下一代之功能的細胞。例如包含用於有性生殖的配子（Gametes），即卵子、卵細胞、精子、精細胞、用於無性生殖的胞子等。
細胞亦可選自肉瘤細胞、株化細胞（established cell）及轉型細胞（transformed cell）所構成之群組。「肉瘤」係指在源自骨、軟骨、脂肪、肌肉、血液等非上皮性細胞的結締組織細胞發生的癌，包含軟組織肉瘤、惡性骨腫瘤等。肉瘤細胞係源自肉瘤的細胞。「株化細胞」係指長期在體外維持、具有一定的穩定性質而能夠半永久繼代培養的培養細胞。存在下述細胞株：PC12細胞（源自大鼠副腎髓質）、CHO細胞（源自中國倉鼠卵巢）、HEK293細胞（源自人類胎兒腎臟）、HL-60細胞（源自人類白血球細胞）、HeLa細胞（源自人類子宮頸癌）、Vero細胞（源自非洲綠猴腎臟上皮細胞）、MDCK細胞（源自狗腎臟尿細管上皮細胞）、HepG2細胞（源自人類肝癌）等源自包含人類的各種生物之各種組織的細胞株。「轉型細胞」意指從細胞外部導入核酸（DNA等）而使遺傳性質變化的細胞。
已知胞外體積極地在幹細胞或癌細胞等未分化之細胞中產生，有利的情況，本發明的方法中係使用幹細胞作為培養細胞。
2.胞外體
胞外體，在本發明中，係指細胞分泌至細胞外的50～300nm的膜囊泡結構。作為胞外體之來源的細胞種類及產生時的條件會影響胞外體的品質，因此在本發明的方法中，可適當選擇能夠以預期品質及產率產生胞外體的條件。有利的情況，作為藥物傳送載體或生物活性物質等使用，而評估所取得之胞外體是否具備適合其用途的品質。
3.細胞培養模組
本發明的方法中所使用的細胞培養模組，具備：
聚合物多孔質膜；
殼體，具有2個以上的培養基流出入口，收納該聚合物多孔質膜；
其中該聚合物多孔質膜，係包含具有複數個孔的表面層A及表面層B與夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚合物多孔質膜，其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑小於存在於該表面層B的孔的平均孔徑，該巨孔層具有與該表面層A及B連結的分隔壁與由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的複數個巨孔，該表面層A及B中的孔與該巨孔連通，其中在該殼體內，
（i）2片以上獨立的該聚合物多孔質膜集中；
（ii）該聚合物多孔質膜經摺疊；
（iii）該聚合物多孔質膜捲成滾筒狀；及/或
（iv）該聚合物多孔質膜綁成繩狀；
而收納於其中。
以下亦將該細胞培養模組稱為「本發明的細胞培養模組」。另外，本說明書中，「細胞培養模組」的記載，可僅記載為「模組」，其表示即使彼此替換亦相同。
本說明書中，「細胞培養模組」係指可應用於細胞培養容器、細胞培養裝置及細胞培養系統、尤其是漂浮培養中所使用的細胞培養容器、細胞培養裝置及細胞培養系統的細胞培養基材。細胞培養模組的幾個實施態樣顯示於圖1至3及圖16（A）。本發明的細胞培養模組可根據如圖4～6及8～17的實施態樣而使用。又，亦可根據後述實施例所示的態樣而使用。
本發明的細胞培養模組中，藉由將聚合物多孔質膜收納於殼體，可防止膜狀的聚合物多孔質膜的形態在殼體內持續性地變形。藉此，可防止對於在聚合物多孔質膜內培育的細胞施加壓力，而可抑制凋亡等，進而可穩定地培養大量的細胞。
本發明的細胞培養模組所具備的殼體，具有2個以上的培養基流出入口，藉此可將細胞培養基供給至殼體的內部以及將其排出至外部。為了使細胞能夠流入殼體的內部，該殼體的培養基流出入口的直徑較佳係大於該細胞的直徑。又，培養基流出入口的直徑較佳係小於聚合物多孔質膜從該培養基流出入口流出的直徑。比聚合物多孔質膜流出的直徑更小的直徑，可根據收納於殼體的聚合物多孔質膜的形狀、尺寸適當選擇。例如，聚合物多孔質膜為帶狀的情況，只要係小於該聚合物多孔質膜的短邊寬度而成為該聚合物多孔質膜無法流出的適當直徑，則未特別限定。該培養基流出入口的數量，為了使細胞培養基容易供給至殼體內及/或排出其外，盡量設置越多越好。較佳為5以上，較佳為10以上，較佳為20以上，較佳為50以上，較佳為100以上。培養基流出入口亦可為殼體的一部分或全部具有網格狀的結構。又，亦可為該殼體本體即為網格狀。本發明中，網格形狀的結構，例如係具有縱向、橫向及/或斜向格狀之結構者，各孔徑係以流體可通過之程度而形成培養基流出入口，但不限於此。
本發明的細胞培養模組所具備的殼體，其所具有的強度較佳係達到不會因為一般的培養條件，例如攪拌培養、振動培養條件中的培養基之擾動而變形的程度，較佳係由非可撓性材料形成。又，殼體較佳係由在細胞培養中不會影響細胞培育的材料所形成。作為這樣的材料，可列舉例如：聚乙烯、聚丙烯、尼龍、聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚對苯二甲酸乙二酯等的聚合物、不銹鋼、鈦等金屬，但不限於此。因為殼體強度到達某種程度，而可防止殼體內部的聚合物多孔質膜的形狀持續性變化，進一步發揮本發明之效果。本說明書中，「殼體不變形」係指在一般培養環境下所受到的負載中不變形，並非是絕對不變形。
本發明的細胞培養模組，在該殼體內
（i）2片以上獨立的該聚合物多孔質膜集中；
（ii）該聚合物多孔質膜經摺疊；
（iii）該聚合物多孔質膜捲成滾筒狀；及/或
（iv）該聚合物多孔質膜綁成繩狀；
而收納於其中。
本說明書中，「2片以上獨立的該聚合物多孔質膜集中收納於殼體內」，係指互相獨立的2片以上的聚合物多孔性膜，集中收納於被殼體所圍住的固定空間內的狀態。本發明中，2片以上獨立的該聚合物多孔質膜，亦可為以任意方法將該聚合物多孔質膜的至少1處與該殼體內的至少1處固定，而成為該聚合物多孔質膜被固定成在殼體內不會移動之狀態者。又，2片以上獨立的聚合物多孔質膜亦可為小片。小片的形狀，例如可形成圓、橢圓形、四角形、三角形、多角形、帶狀等任意的形狀，但較佳為略正方形。本發明中，小片的尺寸可為任意尺寸，略正方形的情況，長度可為任意的長度，例如可為80mm以下，較佳可為50mm以下，更佳可為30mm以下，再佳可為20mm以下，亦可為10mm以下。又，聚合物多孔性膜的小片為略正方形的情況，其一邊的長度亦可沿著殼體的內壁或是以比內壁之一邊的長度更短（例如短0.1mm～1mm左右）來形成，讓聚合物多孔質膜在殼體內處於不會移動之狀態。藉此，可防止對於在聚合物多孔質膜內培育之細胞施加壓力，而可抑制凋亡等，進而能夠穩定地培養大量的細胞。另外，帶狀的聚合物多孔質膜的情況，如後所述，（ii）該聚合物多孔質膜可經摺疊；（iii）該聚合物多孔質膜可捲成滾筒狀；及/或（iv）該聚合物多孔質膜可綁成繩狀；而收納於該殼體內。又，為了將2片以上的獨立聚合物多孔質膜集中收納於殼體內，亦可將任意片數的聚合物多孔質膜積層。此情況中，亦可在聚合物多孔質膜與聚合物多孔質膜之間設置夾層。藉由設置夾層，可有效率地將培養基供給至經過積層的聚合物多孔質膜之間。夾層只要是在經過積層的聚合物多孔質膜之間形成任意的空間而具有使培養基能夠有效率地進行供給之功能者，則未特別限定，例如，可使用具有網格結構的平面結構體。夾層的材質，例如，可使用聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚對苯二甲酸乙二酯、不銹鋼製的網格，但不限於此。含有具有網格結構之夾層的情況，只要具有可將培養基供給至經積層之聚合物多孔質膜間之程度的孔徑即可，可適當選擇。
本說明書中，「經摺疊的聚合物多孔質膜」，係因為摺疊在該殼體內，藉此與聚合物多孔質膜的各面及/或殼體內的表面之摩擦力而成為在殼體內不會移動之狀態的聚合物多孔質膜。本說明書中，「經摺疊」可為在聚合物多孔膜上附有折線的狀態，亦可為不具有折線的狀態。
本說明書中，「捲成滾筒狀的聚合物多孔質膜」，係指因為聚合物多孔質膜捲成滾筒狀，藉此與聚合物多孔質膜的各面及/或殼體內的表面的摩擦力而成為在殼體內不會移動之狀態的聚合物多孔質膜。又，本發明中，編織成繩狀的聚合物多孔質膜，係指例如以任意方法將短片狀的複數個聚合物多孔質膜編織成繩狀，藉由聚合物多孔質膜彼此的摩擦力成為不會相互移動之狀態的聚合物多孔質膜。（i）2片以上獨立的該聚合物多孔質膜集中而成的聚合物多孔質膜、（ii）經摺疊的聚合物多孔質膜、（iii）捲成滾筒狀的聚合物多孔質膜及（iv）綁成繩狀的聚合物多孔質膜亦可組合而收納於殼體內。
本說明書中，「該聚合物多孔質膜在殼體內不會移動的狀態」，係指在細胞培養基中對於該細胞培養模組進行培養的情況，將該聚合物多孔質膜以成為其形態不會持續性變化之狀態的方式收納於殼體內的狀態。換言之，該聚合物多孔質膜本體被抑制成不會因為流體而持續性擺動的狀態。因為保持「聚合物多孔質膜在殼體內不會移動」的狀態，而可防止對於在聚合物多孔質膜內培育的細胞施加壓力，進而能夠在不會因為凋亡造成細胞死亡的情況下穩定培養細胞。
本發明的細胞培養模組，只要是培養細胞的培養裝置及系統等，亦可使用市售的產品。例如，可應用於培養容器由可撓性袋所構成的培養裝置，並可在使其漂浮於該培養容器內的狀態下使用。又，本發明的細胞培養模組，例如可應用於玻璃旋轉瓶等攪拌培養型容器而進行培養。此外，作為培養容器，亦可應用於開放容器，亦可應用於封閉容器。例如，從細胞培養用的培養皿、燒瓶、塑膠袋、試管至大型的槽皆可適當使用。包含例如BD Falcon公司製的Cell Culture Dish及Thermo Scientific公司製的Nunc cell factory等。
4.將細胞培養模組應用於細胞培養裝置
本說明書中，「細胞培養裝置」一般係視為與細胞培養系統、生物反應器或反應器同義的術語，即使相互替換亦具有相同的意思。本發明的細胞培養模組，可應用於以下例示的細胞培養裝置。又，亦可應用於以下例示之裝置以外的市售裝置中。
（1）虹吸式培養裝置
本發明的細胞培養模組，如圖8及9所示，可應用於虹吸式培養裝置。虹吸式培養裝置，係下述的細胞培養裝置，其特徵為具備：聚合物多孔質膜；細胞培養部，收納該聚合物多孔質膜；液體儲存部，內部收置有該細胞培養部；培養基供給手段，配置於該液體儲存部上部；倒U形管，在該液體儲存部的底部連通；培養基回收手段，設置於該倒U形管之另一端下方；及培養基排出手段，配置於該培養基回收手段；其中該聚合物多孔質膜係包含具有複數個孔的表面層A及表面層B、與夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚合物多孔質膜，其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑小於存在於該表面層B的孔的平均孔徑，該巨孔層具有與該表面層A及B連結的分隔壁與由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的複數個巨孔，該表面層A及B中的孔與該巨孔連通，其中從該培養基供給手段供給至該液體儲存部的培養基之液面到達該倒U形管的頂部時，培養基因為虹吸的原理而間歇性地被吐出至該培養基回收手段。該裝置中，可將聚合物多孔質膜替換為細胞培養模組而使用。
（2）筒型氣相培養裝置
本發明的細胞培養模組，可應用於圖10、圖11及圖17所示的筒型氣相培養裝置。一實施型態中，筒型氣相培養裝置，係下述的細胞培養裝置，其特徵為具備：聚合物多孔質膜；細胞培養部，收納該聚合物多孔質膜；培養基供給手段，配置於該細胞培養部的上部；及培養基回收手段，配置於該細胞培養部的下方；其中該聚合物多孔質膜係包含具有複數個孔的表面層A及表面層B、與夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚合物多孔質膜，其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑小於存在於該表面層B的孔的平均孔徑，該巨孔層具有與該表面層A及B連結的分隔壁與由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的複數個巨孔，其中該細胞培養部具備具有1個以上之培養基排出口的底部與配置在大致垂直於該底部的側部。又，一實施型態中，筒型氣相培養裝置，係下述的細胞培養裝置，其特徵為具備：聚合物多孔質膜；細胞培養部，收納該聚合物多孔質膜；培養基供給手段，配置於該細胞培養部的上部；及培養基回收手段，配置於該細胞培養部的下方；其中該聚合物多孔質膜係包含具有複數個孔的表面層A及表面層B、與夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚合物多孔質膜，其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑小於存在於該表面層B的孔的平均孔徑，該巨孔層具有與該表面層A及B連結的分隔壁與由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的複數個巨孔，該表面層A及B中的孔與該巨孔連通，其中該培養基回收手段為收納該細胞培養部之外筒的一部分。該裝置中，可將聚合物多孔質膜替換為細胞培養模組而使用。
（3）噴霧及沖淋型培養裝置
本發明的細胞培養模組，如圖12所示，可應用於噴霧及沖淋型培養裝置。噴霧及沖淋型培養裝置，係下述的細胞培養裝置，其特徵為具備：聚合物多孔質膜；聚合物多孔質膜載置部，載置該聚合物多孔質膜；框體，收納該聚合物多孔質膜載置部；液滴化培養基供給部，配置於該框體的內部；培養基供給線，與該液滴化培養基供給部連通；培養基儲存部，與該培養基供給線連通；及泵，設於該培養基供給線上的一處；其中該聚合物多孔質膜係包含具有複數個孔的表面層A及表面層B、與夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚合物多孔質膜，其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑小於存在於該表面層B的孔的平均孔徑，該巨孔層具有與該表面層A及B連結的分隔壁及由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的複數個巨孔，該表面層A及B中的孔與該巨孔連通，其中該聚合物多孔質膜載置部具備狹縫狀或網格狀的複數個培養基排出口。該裝置中，可將聚合物多孔質膜替換為細胞培養模組而使用。
（4）氣相露出型旋轉培養裝置
本發明的細胞培養模組可應用於圖13、14及圖16所示的旋轉培養裝置。氣相露出型旋轉培養裝置，係下述的細胞培養裝置，其特徵為具備：聚合物多孔質膜；細胞培養部，具有該聚合物多孔質膜；軸，貫通該細胞培養部；旋轉馬達，用以使該軸旋轉；及培養基槽，使該細胞培養部的至少一部浸漬於其中；其中該聚合物多孔質膜，係包含具有複數個孔的表面層A及表面層B、與夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚合物多孔質膜，其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑小於存在於該表面層B的孔的平均孔徑，該巨孔層具有與該表面層A及B連結的分隔壁與由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的複數個巨孔，該表面層A及B中的孔與該巨孔連通，該細胞培養部以該軸為中心而旋轉，該聚合物多孔質膜上所載持的細胞在氣相及液相中交互培養。該裝置中，可將聚合物多孔質膜替換為細胞培養模組而使用。
5.聚合物多孔質膜
本發明中所使用之聚合物多孔質膜中的表面層A（以下亦稱為「A面」或「網格面」）中所存在的孔的平均孔徑並未特別限定，例如，0.01μm以上且小於200μm、0.01～150μm、0.01～100μm、0.01～50μm、0.01μm～40μm、0.01μm～30μm、0.01μm～20μm、或0.01μm～15μm，較佳為0.01μm～15μm。
本發明中所使用之聚合物多孔質膜中的表面層B（以下亦稱為「B面」或「大孔面」）中所存在的孔的平均孔徑，只要大於表面層A中所存在的孔的平均孔徑，則未特別限定，例如，超過5μm且在200μm以下、20μm～100μm、30μm～100μm、40μm～100μm、50μm～100μm、或60μm～100μm，較佳為20μm～100μm。
聚合物多孔質膜表面的平均孔徑，可以下述方式求得：從多孔質膜表面的掃描式電子顯微鏡影像針對200個點以上的開孔部測量孔面積，從該孔面積的平均值，依照下式（1）計算將孔的形狀視為正圓時的平均直徑。
【數1】
（式中，Sa意指孔面積的平均值）。
表面層A及B的厚度並未特別限定，例如為0.01～50μm，較佳為0.01～20μm。
聚合物多孔質膜中的巨孔層中的巨孔在膜平面方向上的平均孔徑並未特別限定，例如為10～500μm，較佳為10～100μm，更佳為10～80μm。又，該巨孔層中的分隔壁的厚度並未特別限定，例如0.01～50μm，較佳為0.01～20μm。一實施型態中，該巨孔層中的至少1個分隔壁具有將鄰接之巨孔彼此連通且平均孔徑為0.01～100μm、較佳為0.01～50μm的1個或複數個孔。另一實施型態中，該巨孔層中的分隔壁不具有孔。
本發明中所使用之聚合物多孔質膜表面的總膜厚並未特別限定，亦可為5μm以上、10μm以上、20μm以上或25μm以上，亦可為500μm以下、300μm以下、100μm以下、75μm以下或50μm以下。較佳為5～500μm，更佳為25～75μm。
本發明中所使用之聚合物多孔質膜之膜厚的測量，可以接觸式的厚度計進行。
本發明中所使用之聚合物多孔質膜的空孔率並未特別限定，例如為40%以上且小於95%。
本發明中所使用的聚合物多孔質膜的空孔率，可藉由測量裁切為既定尺寸的多孔質膜之膜厚及質量，並從單位面積質量依照下式（2）求得。
【數2】
（式中，S表示多孔質膜的面積，d表示總膜厚，w表示測量質量，D表示聚合物的密度；聚合物為聚醯亞胺的情況，密度為1.34g/cm3
。）
本發明中所使用的聚合物多孔質膜，較佳為係包含具有複數個孔的表面層A及表面層B與夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚合物多孔質膜，其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑為0.01μm～15μm，存在於該表面層B的孔的平均孔徑為20μm～100μm，該巨孔層具有與該表面層A及B連結的分隔壁與由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的複數個巨孔，該巨孔層的分隔壁以及該表面層A及B的厚度為0.01～20μm，該表面層A及B中的孔與巨孔連通，總膜厚為5～500μm，空孔率為40%以上且小於95%。一實施型態中，巨孔層中的至少1個分隔壁，具有將鄰接的巨孔彼此連通且平均孔徑為0.01～100μm、較佳為0.01～50μm的1個或複數個孔。另一實施型態中，分隔壁不具有這樣的孔。
本發明中所使用的聚合物多孔質膜較佳係經過殺菌。作為殺菌處理，並未特別限定，可列舉：熱殺菌、蒸氣殺菌、以乙醇等消毒劑所進行的殺菌、紫外線或γ射線等電磁波殺菌等任意的殺菌處理等。
本發明中所使用之聚合物多孔質膜，只要具備上述結構的特徵則未特別限定，較佳為聚醯亞胺多孔質膜、或聚醚碸（PES）多孔質膜。
5-1.聚醯亞胺多孔質膜
聚醯亞胺，係重複單元中包含醯亞胺鍵的聚合物之統稱，通常意指芳香族化合物直接由醯亞胺鍵連結而成的芳香族聚醯亞胺。芳香族聚醯亞胺中，芳香族與芳香族透過醯亞胺鍵而具有共軛結構，因此具有剛性且牢固的分子結構，且醯亞胺鍵具有強大的分子間力，因此具有極高水準的熱性質、機械性質、化學性質。
本發明中可使用的聚醯亞胺多孔質膜，較佳為包含由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯亞胺（作為主要成分）的聚醯亞胺多孔質膜，更佳為由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯亞胺所構成之聚醯亞胺多孔質膜。「包含其作為主要成分」，係指作為聚醯亞胺多孔質膜的構成成分，本質上不包含由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯亞胺以外的成分，或是雖可包含，但其為不對於由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯亞胺的性質造成影響的附加成分。
一實施型態中，本發明中可使用的聚醯亞胺多孔質膜，亦包含在使包含由四羧酸成分與二胺成分所得之聚醯胺酸溶液與著色前驅物之聚醯胺酸溶液組成物成形後，以250℃以上進行熱處理所得到的經著色之聚醯亞胺多孔質膜。
聚醯胺酸係將四羧酸成分與二胺成分聚合而得。聚醯胺酸，係可藉由熱醯亞胺化或化學醯亞胺化進行閉環而得以成為聚醯亞胺的聚醯亞胺前驅物。
聚醯胺酸中，即使醯胺酸的一部分醯亞胺化，只要在不影響本發明的範圍內即可使用。亦即，聚醯胺酸亦可部分地熱醯亞胺化或化學醯亞胺化。
將聚醯胺酸熱醯亞胺化的情況，可因應需求，在聚醯胺酸溶液中添加醯亞胺化觸媒、含有機磷之化合物、無機微粒子、有機微粒子等微粒子等。又，將聚醯胺酸化學醯亞胺化的情況，亦可因應需求在聚醯胺酸溶液中添加化學醯亞胺化劑、脫水劑、無機微粒子、有機微粒子等微粒子等。在聚醯胺酸溶液中摻合前述成分，較佳係在著色前驅物不會析出的條件下進行。
本說明書中，「著色前驅物」係指藉由250℃以上的熱處理而一部分或全部碳化進而生成著色化物的前驅物。
作為上述聚醯亞胺多孔質膜的製造中可使用的著色前驅物，較佳係在聚醯胺酸溶液或聚醯亞胺溶液中均勻地溶解或分散，藉由250℃以上、較佳為260℃以上、再佳為280℃以上、更佳為300℃以上的熱處理，較佳在空氣等的氧存在下於250℃以上、較佳為260℃以上、再佳為280℃以上、更佳為300℃以上的熱處理進行熱分解、碳化而生成著色化物者，更佳為生成黑色系的著色化物者，更佳為碳系著色前驅物。
著色前驅物，若開始加熱乍看之下會成為看起來像碳化物者，但就組織而言，包含碳以外的不同元素，其包含層結構、芳香族交聯結構、含有四面體碳之無序結構者。
碳系著色前驅物未特別限制，可列舉例如：石油溚（petroleum tar）、石油瀝青、煤溚（coal tar）、煤瀝青等的溚或瀝青、煤焦、由包含丙烯腈之單體所得之聚合物、二茂鐵化合物（二茂鐵及二茂鐵衍生物）等。此等之中，較佳為由包含丙烯腈的單體所得之聚合物及/或二茂鐵化合物，作為由包含丙烯腈之單體所得之聚合物，較佳為聚丙烯腈。
又，另一實施型態中，本發明中可使用的聚醯亞胺多孔質膜，亦包含不使用上述著色前驅物而是使由四羧酸成分與二胺成分所得之聚醯胺酸溶液成形後藉由熱處理所得到的聚醯亞胺多孔質膜。
不使用著色前驅物而製造的聚醯亞胺多孔質膜，例如，亦可藉由下述方法製造：將由極限黏度數值為1.0～3.0的聚醯胺酸3～60質量%與有機極性溶劑40～97質量%所構成之聚醯胺酸溶液澆注為膜狀，使其浸漬於或接觸以水作為必要成分的凝固溶劑，以製作聚醯胺酸的多孔質膜，之後對於該聚醯胺酸的多孔質膜進行熱處理以進行醯亞胺化。此方法中，以水為必要成分的凝固溶劑，可為水、或是5質量%以上、小於100質量%的水與超過0質量%且在95質量%以下的有機極性溶劑的混合液。又，上述醯亞胺化之後，亦可對於所得之多孔質聚醯亞胺膜的至少單面實施電漿處理。
上述聚醯亞胺多孔質膜的製造中可使用的四羧酸二酐，可使用任意的四羧酸二酐，可因應預期的特性等適當選擇。作為四羧酸二酐的具體例，可列舉：苯均四酸二酐、3,3’,4,4’-聯苯四羧酸二酐（s-BPDA）、2,3,3’,4’-聯苯四羧酸二酐（a-BPDA）等聯苯四羧酸二酐、氧基二鄰苯二甲酸二酐、二苯碸-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、雙（3,4-二羧基苯基）硫醚二酐、2,2-雙（3,4-二羧基苯基）-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷二酐、2,3,3’,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、3,3’,4,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、雙（3,4-二羧基苯基）甲烷二酐、2,2-雙（3,4-二羧基苯基）丙烷二酐、對伸苯基雙（苯偏三酸單酯酸酐）、對聯伸苯基雙（苯偏三酸單酯酸酐）、間三聯苯基-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、對三聯苯基-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、1,3-雙（3,4-二羧基苯氧基）苯二酐、1,4-雙（3,4-二羧基苯氧基）苯二酐、1,4-雙（3,4-二羧基苯氧基）聯苯二酐、2,2-雙［（3,4-二羧基苯氧基）苯基］丙烷二酐、2,3,6,7-萘四羧酸二酐、1,4,5,8-萘四羧酸二酐、4,4’-（2,2-六氟異亞丙基）二鄰苯二甲酸二酐等。又，較佳係使用2,3,3’,4’-二苯碸四羧酸等芳香族四羧酸。此等可單獨亦可組合2種以上使用。
此等之中，特佳係選自由聯苯四羧酸二酐及苯均四酸二酐所構成之群組中的至少一種芳香族四羧酸二酐。作為聯苯四羧酸二酐，可理想地使用3,3’,4,4’-聯苯四羧酸二酐。
上述聚醯亞胺多孔質膜的製造中可使用的二胺，可使用任意的二胺。作為二胺的具體例，可舉出以下的化合物。
1）1,4-二胺基苯（對伸苯基二胺）、1,3-二胺基苯、2,4-二胺基甲苯、2,6-二胺基甲苯等具有1個苯核的苯二胺；
2）4,4’-二胺基二苯醚、3,4’-二胺基二苯醚等二胺基二苯醚、4,4’-二胺基二苯基甲烷、3,3’-二甲基-4,4’-二胺基聯苯、2,2’-二甲基-4,4’-二胺基聯苯、2,2’-雙（三氟甲基）-4,4’-二胺基聯苯、3,3’-二甲基-4,4’-二胺基二苯基甲烷、3,3’-二羧基-4,4’-二胺基二苯基甲烷、3,3’,5,5’-四甲基-4,4’-二胺基二苯基甲烷、雙（4-胺基苯基）硫醚、4,4’-二胺基苯并醯胺苯、3,3’-二氯聯苯胺、3,3’-二甲基聯苯胺、2,2’-二甲基聯苯胺、3,3’-二甲氧基聯苯胺、2,2’-二甲氧基聯苯胺、3,3’-二胺基二苯醚、3,4’-二胺基二苯醚、4,4’-二胺基二苯醚、3,3’-二胺基二苯硫醚、3,4’-二胺基二苯硫醚、4,4’-二胺基二苯硫醚、3,3’-二胺基二苯碸、3,4’-二胺基二苯碸、4,4’-二胺基二苯碸、3,3’-二胺基二苯甲酮、3,3’-二胺基-4,4’-二氯二苯甲酮、3,3’-二胺基-4,4’-二甲氧基二苯甲酮、3,3’-二胺基二苯基甲烷、3,4’-二胺基二苯基甲烷、4,4’-二胺基二苯基甲烷、2,2-雙（3-胺基苯基）丙烷、2,2-雙（4-胺基苯基）丙烷、2,2-雙（3-胺基苯基）-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-雙（4-胺基苯基）-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、3,3’-二胺基二苯亞碸、3,4’-二胺基二苯亞碸、4,4’-二胺基二苯亞碸等具有2個苯核的二胺；
3）1,3-雙（3-胺基苯基）苯、1,3-雙（4-胺基苯基）苯、1,4-雙（3-胺基苯基）苯、1,4-雙（4-胺基苯基）苯、1,3-雙（4-胺基苯氧基）苯、1,4-雙（3-胺基苯氧基）苯、1,4-雙（4-胺基苯氧基）苯、1,3-雙（3-胺基苯氧基）-4-三氟甲基苯、3,3’-二胺基-4-（4-苯基）苯氧基二苯甲酮、3,3’-二胺基-4,4’-二(4-苯基苯氧基）二苯甲酮、1,3-雙（3-胺基苯基硫）苯、1,3-雙（4-胺基苯基硫）苯、1,4-雙（4-胺基苯基硫）苯、1,3-雙（3-胺基苯碸）苯、1,3-雙（4-胺基苯碸）苯、1,4-雙（4-胺基苯碸）苯、1,3-雙［2-（4-胺基苯基）異丙基］苯、1,4-雙［2-（3-胺基苯基）異丙基］苯、1,4-雙［2-（4-胺基苯基）異丙基］苯等具有3個苯核的二胺；
4）3,3’-雙（3-胺基苯氧基）聯苯、3,3’-雙（4-胺基苯氧基）聯苯、4,4’-雙（3-胺基苯氧基）聯苯、4,4’-雙（4-胺基苯氧基）聯苯、雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］醚、雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］醚、雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］醚、雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］醚、雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］酮、雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］酮、雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］酮、雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］酮、雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］硫、雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］硫、雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］硫、雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］硫、雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］碸、雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］碸、雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］碸、雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］碸、雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］甲烷、雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］甲烷、雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］甲烷、雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］甲烷、2,2-雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］丙烷、2,2-雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］丙烷、2,2-雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］丙烷、2,2-雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］丙烷、2,2-雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷等具有4個苯核的二胺。
此等可單獨亦可混合2種以上使用。所使用之二胺，可因應預期的特性等適當選擇。
此等之中，較佳為芳香族二胺化合物，理想係使用3,3’-二胺基二苯醚、3,4’-二胺基二苯醚、4,4’-二胺基二苯醚及對伸苯基二胺、1,3-雙（3-胺基苯基）苯、1,3-雙（4-胺基苯基）苯、1,4-雙（3-胺基苯基）苯、1,4-雙（4-胺基苯基）苯、1,3-雙（4-胺基苯氧基）苯、1,4-雙（3-胺基苯氧基）苯。特佳為選自由苯二胺、二胺基二苯醚及雙（胺基苯氧基）苯基所構成之群組中的至少一種二胺。
本發明中可使用的聚醯亞胺多孔質膜，從耐熱性、高溫下的尺寸穩定性的觀點來看，較佳係由將玻璃轉移溫度在240℃以上或是在300℃以上且無明確之轉移點的四羧酸二酐與二胺組合而得到的聚醯亞胺來形成。
本發明中可使用的聚醯亞胺多孔質膜，從耐熱性、高溫下的尺寸穩定性的觀點來看，較佳為以下的芳香族聚醯亞胺所構成之聚醯亞胺多孔質膜。
（i）選自由聯苯四羧酸單元及苯均四酸單元所構成之群組的至少一種四羧酸單元與芳香族二胺單元所構成之芳香族聚醯亞胺；
（ii）四羧酸單元與選自由苯二胺單元、二胺基二苯醚單元及雙（胺基苯氧基）苯基單元所構成之群組中的至少一種芳香族二胺單元所構成之芳香族聚醯亞胺；及/或
（iii）選自由聯苯四羧酸單元及苯均四酸單元所構成之群組中的至少一種四羧酸單元與選自由苯二胺單元、二胺基二苯醚單元及雙（胺基苯氧基）苯基單元所構成之群組中的至少一種芳香族二胺單元所構成之芳香族聚醯亞胺。
本發明中所使用的聚醯亞胺多孔質膜，較佳為包含具有複數個孔的表面層A及表面層B與夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚醯亞胺多孔質膜，其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑為0.01μm～25μm，存在於該表面層B的孔的平均孔徑為20μm～100μm，該巨孔層具有與該表面層A及B連結的分隔壁與由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的複數個巨孔，該巨孔層的分隔壁、以及該表面層A及B的厚度為0.01～20μm，該表面層A及B中的孔與巨孔連通，總膜厚為5～500μm，空孔率為40%以上且小於95%。其中，巨孔層中的至少1個分隔壁，具有將鄰接之巨孔彼此連通且平均孔徑為0.01～100μm、較佳為0.01～50μm的1個或複數個孔。
例如，國際公開第2010/038873號、日本特開2011-219585號公報或日本特開2011-219586號公報中所記載的聚醯亞胺多孔質膜亦可用於本發明。
5-2.聚醚碸（PES）多孔質膜
本發明中可使用的PES多孔質膜包含聚醚碸，典型而言，實質上係由聚醚碸所構成。聚醚碸可為由本領域從業者以習知方法所合成者，例如，可藉由使二價酚、鹼金屬化合物及二鹵代二苯基化合物在有機極性溶劑中進行聚縮合反應的方法、預先合成二價酚之鹼金屬二鹽並在二鹵代二苯基化合物與有機極性溶劑中使其進行聚縮合反應的方法等來製造。
作為鹼金屬化合物，可列舉：鹼金屬碳酸鹽、鹼金屬氫氧化物、鹼金屬氫化物、鹼金屬烷氧化物等。特佳為碳酸鈉及碳酸鉀。
作為二價酚化合物，可列舉：對苯二酚、兒茶酚、間苯二酚、4,4’-聯苯酚、雙（羥基苯基）烷類（例如2,2-雙（羥基苯基）丙烷、及2,2-雙（羥基苯基）甲烷）、二羥基二苯碸類、二羥基二苯醚類，或此等的苯環的至少1個氫被甲基、乙基、丙基等低級烷基或是甲氧基、乙氧基等低級烷氧基所取代者。作為二價酚化合物，可將上述化合物混合二種以上來使用。
聚醚碸亦可為市售品。作為市售品的例子，可列舉：Sumika Excel 7600P、Sumika Excel 5900P（以上為住友化學股份有限公司製）等。
聚醚碸的對數黏度，從良好地形成多孔質聚醚碸膜之巨孔的觀點來看，較佳為0.5以上，更佳為0.55以上，從多孔質聚醚碸膜的製造容易性的觀點來看，較佳為1.0以下，更佳為0.9以下，再佳為0.8以下，特佳為0.75以下。
又，PES多孔質膜或作為其原料的聚醚碸，從耐熱性、高溫下的尺寸穩定性的觀點來看，玻璃轉移溫度較佳為200℃以上，或是無法觀察到明確的玻璃轉移溫度。
本發明中可使用的PES多孔質膜的製造方法並未特別限定，例如，可以包含下述步驟的方法製造：
將包含0.3質量%～60質量%的對數黏度0.5～1.0之聚醚碸與40質量%～99.7質量%之有機極性溶劑的聚醚碸溶液澆注成膜狀，浸漬於或接觸以聚醚碸之不良溶劑或非溶劑作為必要成分的凝固溶劑，以製作具有空孔之凝固膜的步驟；及
對於前述步驟中所得之具有空孔的凝固膜進行熱處理以使該空孔粗大化而得到PES多孔質膜的步驟；
其中，該熱處理包含將該具有空孔之凝固膜升溫至該聚醚碸的玻璃轉移溫度以上或240℃以上的步驟。
本發明中可使用的PES多孔質膜，較佳為包含具有表面層A、表面層B及夾在該表面層A與該表面層B之間的巨孔層的PES多孔質膜，其中，
該巨孔層，具有與該表面層A及B連結的分隔壁與由該分隔壁以及由該表面層A及B所圍住的在膜平面方向上之平均孔徑為10μm～500μm的複數個巨孔，
該巨孔層的分隔壁厚度為0.1μm～50μm，
該表面層A及B的厚度分別為0.1μm～50μm，
該表面層A及B之中，一者具有平均孔徑超過5μm且在200μm以下的複數個細孔，且另一者具有平均孔徑在0.01μm以上且小於200μm的複數個細孔；
表面層A及表面層B中，一者的表面開口率為15%以上，另一表面層的表面開口率為10%以上；
該表面層A及該表面層B之該細孔與該巨孔連通，
該PES多孔質膜，總膜厚為5μm～500μm，且空孔率為50%～95%。
6.將細胞應用於細胞培養模組
將細胞應用於細胞培養模組的具體步驟並未特別限定。可採用本說明書之步驟或是適合將細胞應用於膜狀載體的任何方法。雖未限定，但本發明的方法中，將細胞應用於細胞培養模組，例如，包含如以下的態樣。
其包含下述步驟：
（1）將包含懸浮之細胞的第一培養基應用於細胞培養模組的步驟；
（2）使該細胞培養模組維持於可培養細胞之溫度，使該細胞吸附於該細胞培養模組中的聚合物多孔質膜；及
（3）在培養容器中以第二培養基培養已吸附該細胞的該細胞培養模組的步驟。
使用了細胞培養模組的細胞培養的模型圖顯示於圖7。圖7係用以幫助理解的圖，各要件並非實際尺寸。本發明的細胞的培養方法中，將細胞應用於細胞培養模組，藉由進行培養，在聚合物多孔質膜所具有的內部多面性連結之多孔部分及表面上培育大量的細胞，因此可簡便地培養大量的細胞。又，本發明的細胞的培養方法，相較於以往的方法，一方面大幅減少細胞培養中所使用之培養基的量，一方面可培養大量的細胞。例如，聚合物多孔質膜的一部分或整體，即使在不與細胞培養基的液相接觸的狀態下，亦可長期培養大量細胞。又，相對於包含細胞生存區域的聚合物多孔質膜體積的總和，可明顯減少細胞培養容器中所包含的細胞培養基的總體積。
本說明書中，不含細胞的聚合物多孔質膜包含其內部間隙之體積在內，其在空間中所占的體積稱為「外觀上的聚合物多孔質膜體積」（參照圖7）。然後，將細胞應用於聚合物多孔質膜，聚合物多孔質膜的表面及內部載持有細胞的狀態下，聚合物多孔質膜、細胞及浸潤至聚合物多孔質膜內部的培養基，整體在空間中占的體積稱為「包含細胞生存區域的聚合物多孔質膜體積」（參照圖1）。膜厚為25μm的聚合物多孔質膜的情況，包含細胞生存區域的聚合物多孔質膜體積，其值最多比外觀上的聚合物多孔質膜多出50%左右。本發明的方法中，1個細胞培養容器中可收納複數個聚合物多孔質膜以進行培養，但此情況中，有時僅將「針對各載持有細胞的複數個聚合物多孔質膜而言包含細胞生存區域之聚合物多孔質膜體積的總和」記載為「包含細胞生存區域之聚合物多孔質膜體積的總和」。
藉由使用該細胞培養模組，即使在細胞培養容器中所包含的細胞培養基的總體積為包含細胞生存區域之聚合物多孔質膜體積之總和的10000倍或比其更少的條件下，亦可長期良好地培養細胞。又，即使在細胞培養容器中所包含的細胞培養基的總體積為包含細胞生存區域之聚合物多孔質膜體積之總和的1000倍或比其更少的條件下，亦可長期良好地培養細胞。再者，即使在細胞培養容器中所包含的細胞培養基的總體積為包含細胞生存區域之聚合物多孔質膜體積之總和的100倍或比其更少的條件下，亦可長期良好地培養細胞。然後，即使在細胞培養容器中所包含的細胞培養基的總體積為包含細胞生存區域之聚合物多孔質膜體積之總和的10倍或比其更少的條件下，亦可長期良好地培養細胞。
亦即，根據本發明，培養細胞的空間（容器）相較於以往進行二維培養的細胞培養裝置，可小型化至極限。又，欲增加所培養之細胞數量的情況，藉由增加所積層之聚合物多孔質膜的片數等簡便的操作，即可彈性地增加培養細胞的體積。只要是具備本發明中所使用的聚合物多孔質膜的細胞培養裝置，即可將培養細胞的空間（容器）與儲存細胞培養基的空間（容器）分離，而能夠因應欲培養之細胞數量準備所需之量的細胞培養基。儲存細胞培養基的空間（容器），可因應目的大型化或小型化，或亦可為可替換的容器，並未特別限定。
本發明的方法中，例如，使用聚合物多孔質膜進行培養後細胞培養容器中所包含的細胞之數量，就細胞全部均勻分散在細胞培養容器中所包含的細胞培養基的情況而言，係指在培養基每一公升中，可培養至成為1.0×105
個以上、1.0×106
個以上、2.0×106
個以上、5.0×106
個以上、1.0×107
個以上、2.0×107
個以上、5.0×107
個以上、1.0×108
個以上、2.0×108
個以上、5.0×108
個以上、1.0×109
個以上、2.0×109
個以上、或5.0×109
個以上為止。
本說明書中，「培養基」係指用以培養細胞、尤其是動物細胞的細胞培養基。培養基與細胞培養液係以相同的意思使用。因此，本發明中所使用的培養基係指液體培養基。培養基的種類可使用一般常用的培養基，可根據培養的細胞種類而適當決定。
本發明的細胞培養中，該步驟（1）中所使用的第一培養基，只要係可培養細胞的培養基則未特別限定，例如，若為培養CHO細胞的情況，則可使用Irvine Scientific公司製的BalanCD（商標）CHO GROWTH A。
本發明的細胞的培養中，該步驟（2）中可培養細胞的溫度，只要是細胞可吸附於聚合物多孔質膜的溫度即可，可為10℃～45℃，較佳為15℃～42℃，更佳為20℃～40℃，再佳為25℃～39℃。又，本發明的細胞培養方法中，使該步驟（2）的細胞吸附的時間，例如為5分鐘～24小時，較佳為10分鐘～12小時，更佳為15分鐘～500分鐘。
本發明的細胞的培養中，該步驟（2）中，可一邊振動及/或攪拌，一邊使細胞吸附於該細胞培養模組的該聚合物多孔質膜，亦可靜置而使細胞吸附於該細胞培養模組的該聚合物多孔質膜。振動的方法並未特別限定，例如，可在市售的振動裝置上載置包含本發明之細胞培養模組與細胞的培養容器並進行振動。振動可持續性或斷續性進行，例如，可交互重複振動與靜置，只要適當調整即可。攪拌的方法並未特別限定，例如，可將本發明的細胞培養模組與細胞放入市售的玻璃旋轉瓶內，使攪拌器旋轉以進行攪拌。攪拌可持續性或斷續性進行，例如，可交互重複攪拌與靜置，只要適當調整即可。
本發明的細胞的培養中，該步驟（3）中所使用的第二培養基，可選擇在接著細胞的培養中所使用的培養基，例如，可使用D-MEM、E-MEM、IMDM、Ham’s F-12等，但不限於此。第二培養基，較佳係不含阻礙細胞接著於基材的成分、例如界面活性劑的培養基。所使用之第二培養基可根據細胞種類適當選擇。該步驟（3）中，以第二培養基進行培養，藉此促進在該步驟（2）中吸附於聚合物多孔質膜的細胞接著於該聚合物多孔性膜內。藉此，細胞不會從該聚合物多孔質膜脫落而能夠穩定地進行培養。又，本發明的細胞的培養方法，係使用具備該聚合物多孔質膜的細胞培養模組。本發明的細胞的培養方法中所使用的細胞培養模組中，藉由將聚合物多孔質膜收納於殼體，而防止膜狀的聚合物多孔質膜的形態在殼體內持續性變形。藉此，防止對於在聚合物多孔質膜內培育的細胞施加壓力而抑制凋亡，可穩定地培養大量的細胞。
本發明的細胞的培養中，該步驟（3）中，只要是可培養細胞的培養裝置及系統等，則可應用市售者。例如，培養容器可為可撓性袋型培養容器，又，亦可為攪拌型培養容器，例如可以玻璃旋轉瓶等的培養容器進行培養。另外，作為培養容器，亦可應用開放容器，亦可應用封閉容器。例如，從細胞培養用的培養皿、燒瓶、塑膠袋、試管至大型的槽皆可適當地使用。包含例如，BD Falcon公司製的Cell Culture Dish及Thermo Scientific公司製的Nunc cell factory等。又，本發明的細胞的培養方法中，藉由使用細胞培養模組，針對無法進行自然漂浮培養的細胞，亦可以適合漂浮培養的裝置，以與漂浮培養類似的狀態進行培養。作為漂浮培養用的裝置，例如，可使用Corning公司製的玻璃旋轉瓶或旋轉培養等。又，該步驟（3），亦可以本說明書之細胞培養裝置實施。
本發明的細胞的培養中，該步驟（3）可使用連續循環型的裝置來執行，對於包含該細胞培養模組的培養容器連續地添加或回收培養基。
本發明的細胞的培養中，該步驟（3），亦可為從設置於包含該細胞培養模組之培養容器以外的細胞培養基供給手段連續或間歇地對於細胞培養容器供給細胞培養基的系統。此時，細胞培養基可作為在細胞培養基供給手段與細胞培養容器之間循環的系統。
7.細胞的培養、胞外體產生系統及培養條件
本發明的方法中，細胞的培養、胞外體產生系統及培養條件，可因應細胞的種類等而適當決定。各細胞所適合的培養方法已為習知，本領域從業者可使用任意習知的方法來培養應用於細胞培養模組的細胞。細胞培養基亦可因應細胞種類適當製備。
本發明的方法中，用於培養的系統其形狀、規模等並未特別限定，從細胞培養用的培養皿、燒瓶、塑膠袋、試管至大型的槽皆可適當地使用。包含例如BD Falcon公司製的Cell Culture Dish及Thermo Scientific公司製的Nunc cell factory等。另外，本發明中藉由使用聚醯亞胺多孔質膜，針對無法進行自然漂浮培養的細胞，亦可以適合漂浮培養的裝置，以與漂浮培養類似的狀態進行培養。作為漂浮培養用的裝置，例如可使用Corning公司製的玻璃旋轉瓶或旋轉培養等。
本發明中，亦可在靜置培養條件下培養細胞。亦可藉由間歇性更換培養基來分離所產生之胞外體。又，本發明中亦可在旋轉培養或攪拌條件下培養細胞。旋轉培養、在玻璃旋轉瓶中的攪拌培養亦相同。又，此等的各方法中，藉由安裝連續或間歇性地更換培養基的系統，亦能夠適用於長期培養。
本發明中，亦可連續地培養細胞。例如，本發明之方法中的培養，亦可使用細胞培養模組連續地添加或回收培養基的連續循環或開放型的裝置，以使聚合物多孔質膜在空氣中露出的型式執行。
本發明中，細胞的培養，亦可以從設置於細胞培養容器外的細胞培養基供給手段連續或間歇性地對於細胞培養容器供給細胞培養基的系統來進行。此時，細胞培養基可作為在細胞培養基供給手段與細胞培養容器之間循環的系統。
本發明包含將細胞培養裝置設置於恆溫箱內以培養細胞的態樣。以從設於細胞培養容器外的細胞培養基供給手段連續或間歇性地對於細胞培養容器供給細胞培養基的系統進行的情況，該系統可為一種細胞培養裝置，其係包含作為細胞培養容器的培養單元與作為細胞培養基供給手段的培養基供給單元的細胞培養裝置，其中培養單元收納用以載持細胞的一或複數個細胞培養模組，並且具備培養基供給口及培養基排出口；培養基供給單元則具備培養基收納容器、培養基供給線、及透過培養基供給線輸送培養基的送液泵，其中培養基供給線的第一端部與培養基收納容器內的培養基接觸，培養基供給線的第二端部透過培養單元的培養基供給口連通至培養單元內。
又，上述細胞培養裝置中，培養單元可為不具備培養基供給線、送液泵、空氣供給口及空氣排出口的培養單元，又可為具備培養基供給線、送液泵、空氣供給口及空氣排出口的培養單元。培養單元亦可不具備空氣供給口及空氣排出口。再者，上述細胞培養裝置中，培養單元更具備培養基排出線，其中培養基排出線的第一端部與培養基收納容器連接，培養基排出線的第二端部透過培養單元的培養基排出口連通至培養單元內，培養基亦可在培養基供給單元與培養單元之間循環。
8.藉由細胞產生胞外體
本發明中，藉由如上述培養細胞，可從細胞產生胞外體。所產生之胞外體可藉由習知的方法回收。胞外體係從細胞分泌而來，因此可從細胞培養基回收物質。
本發明的方法中，細胞培養步驟與胞外體產生步驟可為各別的步驟，亦可不為各別的步驟。例如，在將細胞應用於細胞培養模組而開始細胞培養的時間點，細胞產生胞外體，因此以從培養開始到結束為止持續從細胞回收胞外體的方式設計生產系統的情況，係同時實施細胞培養步驟與胞外體產生步驟。或是在細胞培養與胞外體產生之間，例如培養基組成或培養裝置的設定等不同的情況，為了在細胞培養步驟結束後切換至設計用以產生胞外體的培養條件，而將兩個步驟分開。
本發明的方法中，培養細胞可長期持續產生品質均勻的胞外體。本發明的方法中，產生胞外體的步驟較佳係持續1個月、2個月、3個月或6個月或其以上的期間。本發明的方法中，在產生胞外體的期間，較佳係對於細胞所產生之胞外體的分子形貌及生物活性進行評估。
II.胞外體產生裝置
本發明又關於一種藉由細胞培養而產生胞外體的裝置，其包含細胞培養模組，並且用於本發明之方法。本發明的胞外體產生裝置中，細胞培養模組可固定來使用，或可在細胞培養基中漂浮來使用，可放置於培養基中，亦可從培養基露出。
作為本發明之細胞培養中的胞外體產生裝置，只要為包含細胞培養模組者則可為任何形態，可使用習知的細胞培養裝置。培養裝置的形狀、規模等並未特別限定，從培養皿、試管至大型的槽皆可適當地利用。包含例如BD Falcon公司製的Cell Culture Dish及Thermo Scientific公司製的Nunc cell factory等。另外，本發明中藉由使用聚合物多孔質膜，針對無法進行自然漂浮培養的細胞，亦可以適合漂浮培養的裝置，以與漂浮培養類似的狀態進行培養。作為漂浮培養用的裝置，例如可使用Corning公司製的玻璃旋轉瓶或旋轉培養等。
以本發明的培養細胞來產生胞外體的裝置，亦可使用細胞培養模組上連續地添加或回收培養基的連續循環或開放型的裝置，以使聚合物多孔質膜片露出至空氣中的型態實施。
本發明的方法中，亦可進一步設置用以更高濃度地回收細胞所產生之胞外體的手段。例如，藉由使半透膜等與循環式添加培養基直接結合，一方面去除乳酸等廢物，一方面追加糖質或胺基酸類，而可同時建構效率良好的長時間培養法與去除廢物的方法。
III.套組
本發明更關於一種包含細胞培養模組並且用於本發明之方法的套組。本發明的套組，除了細胞培養模組以外，亦可適當包含細胞培養、胞外體產生、胞外體回收所需的構成要件。例如包含：應用於細胞培養模組的細胞、細胞培養基、連續供給培養基的裝置、使培養基連續循環的裝置、細胞培養裝置、用以確認胞外體產生的評估手段、胞外體回收手段（例如，超離心、超過濾、免疫沉澱、層析等）、套組的操作說明書等。
IV.用途
本發明更包含一種用途，其係將細胞培養模組用於上述本發明的方法。
V.胞外體
本發明更包含由本發明之方法所取得之胞外體。
以下根據實施例詳細說明本發明，但本發明不限於此等的實施例。本領域從業者可根據本說明書的記載輕易對於本發明施加修飾、變化，此等亦包含於本發明的技術範圍。
[實施例]
以下實施例中所使用之聚合物多孔質膜為聚醯亞胺多孔質膜，其係在使包含由作為四羧酸成分之3,3’,4,4’-聯苯四羧酸二酐（s-BPDA）與作為二胺成分之4,4’-二胺基二苯醚（ODA）所得之聚醯胺酸溶液與作為著色前驅物之聚丙烯醯胺的聚醯胺酸溶液組成物成形後，藉由於250℃以上進行熱處理而製備。所得之聚醯亞胺多孔質膜，係包含具有複數個孔的表面層A及表面層B與夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚醯亞胺多孔質膜，存在於表面層A的孔的平均孔徑為19μm，存在於表面層B的孔的平均孔徑為42μm，膜厚為25μm，空孔率為74%。
又，以下的實施例中所使用的模組化聚合物多孔質膜（以下的實施例中稱為「模組」），係使用在單面具有16個2mm×2mm之培養基流出入口的聚乙烯製殼體中，以下述順序積層並收納：1.0×1.0cm的正方形聚醯亞胺多孔質膜6片；1.0×1.0cm之夾層（聚丙烯/聚乙烯，NBC Meshtec公司製，產品編號：ESP10TC）；1.0×1.0cm的正方形聚醯亞胺多孔質膜6片；1.0×1.0cm之夾層（聚丙烯/聚乙烯，NBC Meshtec公司製，產品編號：ESP10TC ）；1.0×1.0cm的正方形聚醯亞胺多孔質膜6片而成者。未特別記載的情況，模組係指上述結構。
又，記載中特定「第二型模組」的實施例中，係使用在單面具有16個2mm×2mm之培養基流出入口的聚乙烯製殼體中，以下述順序積層而收納：1.0×1.0cm的正方形聚醯亞胺多孔質膜4片；1.0×1.0cm之夾層（聚丙烯/聚乙烯，NBC Meshtec公司製，產品編號：ESP10TC）；1.0×1.0cm的正方形聚醯亞胺多孔質膜4片；1.0×1.0cm之夾層（聚丙烯/聚乙烯，NBC Meshtec公司製，產品編號：ESP10TC ）；1.0×1.0cm的正方形聚醯亞胺多孔質膜4片；1.0×1.0cm之夾層（聚丙烯/聚乙烯，NBC Meshtec公司製，產品編號：ESP10TC）；1.0×1.0cm的正方形聚醯亞胺多孔質膜4片；1.0×1.0cm之夾層（聚丙烯/聚乙烯，NBC Meshtec公司製，產品編號：ESP10TC ）；1.0×1.0cm的正方形聚醯亞胺多孔質膜4片而成者。
比較例1：使用培養碟的細胞培養法
對於在IWAKI Collagen I Coat Dish上進行培養的第二次繼代的間葉系幹細胞（Y25 male_451491），使用Thermo Fisher Scientific公司製TrypLE（商標）Select將細胞剝離，使在培養基（Kohjin Bio股份有限公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4）中懸浮。將細胞懸浮液（Total；3.0×105
cells）接種至IWAKI Collagen I Coat Dish 60cm2
，在設定CO2
5%、37℃的CO2
恆溫箱內靜置約16小時以使細胞接著後，以12mL的該培養基（KBM ADSC-4）進行培養基更換。之後，在培養開始後第6天更換培養基，持續培養13天。
以後述「使用界面電位（zeta-potential）/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量」的程序測量培養天數第6天及第13天回收的細胞培養液中所包含的每日產生的胞外體數，結果顯示於圖18A，培養天數第13天的粒徑分布測量的結果顯示於圖18B。
實施例1：在Corning製150mL圓形保存瓶中使用模組的細胞培養法（Bottle（5%氧））
在放入有5個模組的Corning製150mL圓形保存瓶中加注50mL的培養基（Kohjin Bio股份有限公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4）後，設置於設定CO2
5%、O2
5%、37℃的kuhner公司製恆溫振盪箱（Lab-Therm LT-XC）內約1小時，以旋轉速度100rpm攪拌以使模組潤濕。
對於在IWAKI Collagen I Coat Dish中進行培養的第二次繼代的間葉系幹細胞（Y25 male_451491），使用Thermo Fisher Scientific公司製TrypLE（商標）Select將細胞剝離，使其在該培養基（KBM ADSC-4）中懸浮。將模組內部的培養基材聚醯亞胺多孔質膜的面積每一平方公分為2.0×104
cells（Total；1.80×106
cells）的細胞懸浮液加注至保存瓶內，一方面以旋轉速度100rpm攪拌約16小時，一方面使間細胞吸附於模組後，以50mL的該培養基（KBM ADSC-4）進行培養基更換。培養開始6天後進行培養基更換，之後以3天或4天一次的頻率進行培養基更換。
以後述「使用界面電位/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量」的程序測量從培養開始到培養天數第27天為止的細胞培養液中所包含的胞外體每日產生數量，結果顯示於圖19A，培養天數第27天的粒徑分布測量的結果顯示於圖19B。確認在約1個月的長期連續培養中，皆穩定地產生胞外體。
實施例2：在Corning製150mL圓形保存瓶中使用模組的細胞培養法（Bottle（一般氧））
在設定CO2
5%、37℃的N-BIOTEK公司製搭載可加濕之振盪器的CO2
恆溫箱（aniCell）內，設置Corning製150mL圓形保存瓶，除此之外，以與實施例1（Bottle（5%氧））相同的操作進行細胞培養。
以後述的「使用界面電位/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量」的程序測量從培養開始到培養天數第27天為止的細胞培養液中所包含的胞外體每日產生數量，結果顯示於圖20A，培養天數第27天的粒徑分布測量的結果顯示於圖20B。確認在約1個月的長期連續培養中，皆穩定地產生胞外體。
實施例3：在溢流反應器中使用模組的細胞培養法（Reactor（5%氧））
在放入有40個模組的溢流反應器培養容器內，加注40mL的培養基（Kohjin Bio股份有限公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4），在設置於設定CO2
5%、O2
5%、37℃的kuhner公司製恆溫振盪箱（Lab-Therm LT-XC）內之後，以旋轉速度80rpm攪拌約1小時，使模組潤濕。
使用Thermo Fisher Scientific公司製TrypL（商標）Select將在IWAKI Collagen I Coat Dish上進行培養的第二次繼代之間葉系幹細胞（Y25 male_451491）剝離，使其在該培養基（KBM ADSC-4）中懸浮。將模組內部的培養基材聚醯亞胺多孔質膜的面積每一平方公分為2.0×104
cells（Total；1.44×107
cells）的細胞懸浮液加注至溢流反應器培養容器內之後，以使溢流反應器培養容器內的液體量成為80mL的方式追加培養基，在旋轉速度80rpm的攪拌條件下使細胞吸附約26小時。
細胞吸附後，對於該培養基（KBM ADSC-4）加注葡萄糖液（Fuji Film Wako Pure Chemical股份有限公司製；45w/v% D（+）-葡萄糖溶液），藉由管泵，以40mL/day的速度開始將總葡萄糖濃度調整至2000mg/L的液體（葡萄糖調整KBM ADSC-4）輸送至溢流反應器培養容器內，以回收液儲存瓶回收從設於培養容器壁面的培養基回收口溢出的培養基。對於所回收之培養基，使用Roche公司製CedexBio，以回收液的各代謝參數的變化觀察細胞培育行為，因應細胞的葡萄糖等的消耗狀況適時改變輸液量、旋轉速度，進行長期細胞培養。葡萄糖消耗量及乳酸產生量的經時變化顯示於圖21A，使用溢流反應器培養細胞的態樣顯示於圖21B。觀察到長期穩定的細胞增殖/培育。
以後述「使用界面電位/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量」的程序測量所回收之細胞培養液中所包含的胞外體每日產生數量，結果顯示於圖22A，培養天數第85天的粒徑分布測量的結果顯示於圖22B。確認在約3個月的長期連續培養中穩定產生胞外體。
實施例4：在溢流反應器中使用模組的細胞培養法（Reactor（一般氧））
將溢流反應器設置於設定CO2
5%、37℃的N-BIOTEK公司製搭載可加濕之振盪器的CO2
恆溫箱（aniCell）內，除此之外，以與實施例3（Reactor（5%氧））相同的操作培養細胞。葡萄糖消耗量及乳酸產生量的經時變化顯示於圖23A，使用溢流反應器培養細胞的態樣顯示於圖23B。觀察到長期穩定的細胞增殖/培育。
以後述「使用界面電位/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量」的程序測量所回收之細胞培養液中所包含的胞外體每日產生數量，結果顯示於圖24A，培養天數第85天的粒徑分布測量的結果顯示於圖24B。確認在約3個月的長期連續培養中皆穩定產生胞外體。
實施例5：在WAVE反應器中使用模組的細胞培養
為了連續排出培養基，在GE公司製WAVE培養袋（CELLBAG DISPOSABLE BIOREACTOR Part＃ CB0002L11-33）的蓋部，於殺菌的情況下，替換成設有排液管並經過γ射線殺菌的Nalgene HDPE蓋（產品編號:342151-0384），並與採收管泵連接。此外，以下的實施例中，以WAVE反應器執行連續培養的情況，設置相同的排出線而執行培養。
在殺菌的情況下，將預先以包含Ham’s F-12培養基（Fuji Film Wako Pure Chemical公司製_麩醯胺酸･酚紅）潤濕24小時以上的200個模組移入該袋內，加注200mL的培養基（Kohjin Bio公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4），並將其設置於GE公司製 WAVE反應器（ReadyToProcess WAVE25）後，以CO2
5%、溫度37℃、振動速度15rpm、振動角度9°的條件攪拌約1小時，以使模組潤濕。
使用Gibco公司製Trypsin-EDTA（0.05%）含酚紅將在培養碟上進行培養的第三次繼代之間葉系幹細胞（Y25 male_18TL262066）剝離，使其在培養基（Fuji Film Wako Pure Chemical公司製；DMEM）中懸浮。將模組內部的培養基材聚醯亞胺多孔質膜的面積每一平方公分為2.0×104
cells（Total：7.20×107
cells）的細胞懸浮液接種之後，立即以使GE公司製WAVE培養袋內的液量成為300mL的方式追加培養基（Kohjin Bio股份有限公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4），以與模組潤濕時相同的振動條件使細胞吸附約27小時。
之後，利用反應器的灌注功能（袋重量管理功能），從GE公司製WAVE培養袋內，經由採收（Harvest）管泵，以350mL/day的速度將細胞培養液排出，並經由輸入（Feed）管泵以與採收相同的量將該培養基（KBM ADSC-4）輸送至GE公司製WAVE培養袋內。所回收之培養基，係使用Roche公司製CedexBio，以各代謝參數的變化觀察細胞培育行為，觀察到長期穩定的細胞的增殖/培育。葡萄糖消耗及乳酸產生量的經時變化顯示於圖25A。
以後述「使用界面電位/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量」的程序測量所回收之細胞培養液中所包含的胞外體每日產生數量，結果顯示於圖25B，培養天數第39天的粒徑分布測量結果顯示於圖25C。確認在約1個月的長期連續培養中皆穩定產生胞外體。
比較例及實施例所示的細胞培養天數第13天的各種培養法中一個細胞每日產生的胞外體數量的比較顯示於圖26。確認相較於Dish培養，模組培養中，每一個細胞的胞外體產生力極高。
使用界面電位/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量
對於以比較例1及實施例1至5的培養條件所回收之細胞培養液，使用高速冷卻離心機（久保田商事股份有限公司製，Model 6000），於4℃，以10,000g進行離心分離30分鐘，以去除碎屑（製備液1）。使用藉由0.025μm的過濾器（Merck公司製，產品名稱：MF- milliporetm membrane filter，型號：VSWP04700）進行吸引過濾以去除微粒子的PBS（-）（Fuji Film Wako Pure Chemical股份有限公司製，原販售編號：166-23555），將「製備液1」稀釋為既定濃度（製備液2）。接著對於「製備液2」使用0.2μm的針筒過濾器（Sartorius公司製，產品名稱：Minisart，型號：16534K）去除200nm以上的粒子（製備液3）。使用界面電位/粒徑分布測量裝置（Microtec股份有限公司製，ZEECOM ZC-3000），從布朗運動軌跡解析，測量「製備液3」所包含的粒子的粒徑分布及胞外體組分的粒子數。
在回收測量胞外體之培養基的時機，使用同仁化學研究所股份有限公司製的Cell Counting Kit-8測量細胞數量，藉由下述「式1」算出一個細胞每日產生的胞外體數量，比較各細胞培養條件中細胞的胞外體產生能力。
式1：
粒子數×樣本稀釋倍率×150nm以下之粒子的比例×回收培養基量/總細胞數/培養基留置天數
藉由下述「式2」計算各細胞培養條件中胞外體每日生產量之經時變化。
式2：
粒子數×樣本稀釋率×150nm以下的粒子的比例/培養基留置天數
使用GeneChip（商標）miRNA 4.0 Array的miRNA陣列解析
對於以比較例1及實施例1～5的培養條件所回收之細胞培養液，使用高速冷卻離心機（久保田商事股份有限公司製，Model 6000），於4℃，以10,000g進行離心分離30分鐘，以去除碎屑。對於所得之上清液8mL，使用Total Exosome Isolation Regent（從細胞培養基）（Thermo Fisher Scientific公司製，Cat.＃4478359），藉由聚合物沉澱法，從上清液中萃取出胞外體。接著，使用Total Exosome RNA and Protein Isolation Kit（Thermo Fisher Scientific公司製，Cat.＃4478545）從胞外體萃取液中萃取以及精製Total RNA後，以Nano Drop 2000（Thermo Fisher Scientific公司製）測量Total RNA溶液的濃度。使用所得之Total RNA 390ng，藉由GeneChip（商標）miRNA 4.0 Array（Thermo Fisher Scientific公司製，Cat.＃902445），進行人類型miRNA陣列解析。
比較例1（Dish_Day6）與實施例1（Bottle（5%氧）_Day27）的胞外體產生量比較及miRNA陣列解析
比較例1（Dish_Day6）與實施例1（Bottle（5%氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較顯示於圖27。相對於Dish_Day6，確認使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（5%氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，亦為胞外體產生能力高至其2.8倍的狀態。
比較例1（Dish_Day6）與實施例1（Bottle（5%氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖顯示於圖28，觀察到miRNA之表現比相差10倍以上的miRNA顯示於表1。
[表1]
| 表1.觀察到表現比相差10倍以上的miRNA | |
| microRNA的種類 | 將Dish_Day6的表現量設為1時， Bottle（5%氧）_Day27的表現量 |
| hsa-miR-23a-3p | 38.85 |
| hsa-miR-24a-3p | 17.54 |
| hsa-miR-26a-5p | 36.57 |
| hsa-miR-31a-5p | 12.37 |
| hsa-miR-214-3p | 75.00 |
| hsa-miR-23b-3p | 15.36 |
| hsa-miR-320c | 10.19 |
| hsa-miR-1290 | 77.69 |
| hsa-miR-1246 | 121.72 |
| hsa-miR-320d | 18.89 |
| hsa-miR-3124-5p | 18.83 |
| hsa-miR-3128 | 17.72 |
| hsa-miR-7641 | 1/22.29 |
專利文獻2中所記載的有效治療損傷或患病之心臟組織的miRNA，即hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的散點圖顯示於圖29。相對於Dish_Day6，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（5%氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下， hsa-miR-210-3p亦顯示了4.0倍、hsa-miR-24a-3p亦顯示了17.5倍的高產生量，而關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
專利文獻3中所記載的有效抑制口腔鱗狀上皮癌的miRNA，即hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果顯示於圖30。相對於Dish_Day6，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（5%氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態，hsa-miR-193a-5p亦顯示了5.8倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
非專利文獻6及非專利文獻7中所記載的有效抑制胃細胞癌或前立腺癌細胞的miRNA，即hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果顯示於圖31。相對於Dish_Day6，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（5%氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態，hsa-miR-26a-5p亦顯示了36.6倍、hsa-miR-23b-3p亦顯示了15.4倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
比較例1（Dish_Day13）與實施例1（Bottle（5%氧）_Day27）的胞外體產生量比較及miRNA陣列解析
比較例1（Dish_Day13）與實施例1（Bottle（5%氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較顯示於圖32。相對於Dish_Day13，確認使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（5%氧）培養中，即使在長期連續穩定的培養狀態下，亦為胞外體產生能力高至其2.9倍的狀態。
比較例1（Dish_Day13）與實施例1（Bottle（5%氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖顯示於圖33，觀察到miRNA之表現比相差10倍以上的miRNA顯示於表2。
[表2]
| 表2.觀察到表現比相差10倍以上的miRNA | |
| microRNA的種類 | 將Dish_Day13的表現量設為1時， Bottle（5%氧）_Day27的表現量 |
| hsa-miR-23a-3p | 21.90 |
| hsa-miR-26a-5p | 29.14 |
| hsa-miR-199a-3p | 41.33 |
| hsa-miR-199b-3p | 41.33 |
| hsa-miR-1246 | 19.04 |
| hsa-miR-3201 | 18.11 |
| hsa-miR-1273g-3p | 1/17.75 |
| hsa-miR-6780b-5p | 1/10.17 |
專利文獻2中所記載的有效治療損傷或患病的心臟組織的miRNA，即hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果顯示於圖34。相對於即將到達匯合（Confluent）之前的Dish_Day13，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（5%氧）培養中，即使在長期連續穩定培養狀態下，hsa-miR-24-3p亦顯示了5.3倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
專利文獻3中所記載的有效抑制口腔鱗狀上皮癌的miRNA，即hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果顯示於圖35。相對於即將到達匯合之前的Dish_Day13，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（5%氧）培養中，即使在長期連續穩定的培養狀態下，亦顯示了與Dish_Day13同等的結果。
非專利文獻6及非專利文獻7中所記載的有效抑制胃細胞癌或前列腺癌細胞的miRNA，即hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果顯示於圖36。相對於即將到達匯合之前的Dish_Day13，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（5%氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，hsa-miR-26a-5p亦顯示了29.1倍、hsa-miR-23b-3p亦顯示了6.1倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
比較例1（Dish_Day6）與實施例2（Bottle（一般氧）_Day27）的胞外體產生量比較及miRNA解析
比較例1（Dish_Day6）與實施例2（Bottle（一般氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較顯示於圖37。相對於Dish_Day6，確認使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（一般氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，亦為胞外體產生能力高至其2.5倍的狀態。
比較例1（Dish_Day6）與實施例2（Bottle（一般氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖顯示於圖38，觀察到miRNA之表現比相差10倍以上的miRNA顯示於表3。
[表3]
| 表3.觀察到表現比相差10倍以上的miRNA | |
| microRNA的種類 | 將Dish_Day6的表現量設為1時， Bottle（一般氧）_Day27的表現量 |
| hsa-let-7a-5p | 1/13.61 |
| hsa-let-7c-5p | 1/148.62 |
| hsa-miR-214-3p | 21.03 |
| hsa-miR-1246 | 19.99 |
| hsa-miR-3124-5p | 70.38 |
| hsa-miR-3128 | 42.78 |
| hsa-miR-3201 | 64.28 |
| hsa-miR-4423-3p | 20.25 |
| hsa-miR-4484 | 1/12.12 |
| hsa-miR-1273g-3p | 1/10.52 |
| hsa-miR-6126 | 1/13.36 |
| hsa-miR-7641 | 1/40.37 |
| hsa-miR-8084 | 30.04 |
專利文獻2中所記載的有效治療損傷或患病的心臟組織的miRNA，即hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果顯示於圖39。相對於Dish_Day6，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（一般氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態，hsa-miR-24-3p亦顯示了3.9倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
專利文獻3中所記載的有效抑制口腔鱗狀上皮癌的miRNA，即hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果顯示於圖40。使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（一般氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態，亦顯示了與Dish_Day6相同程度的產生量。
非專利文獻6及非專利文獻7中所記載的有效抑制胃細胞癌或前列腺癌細胞的miRNA，即hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果顯示於圖41。使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（一般氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態，亦為與Dish_Day6相同程度的表現量。
比較例1（Dish_Day13）與實施例2（Bottle（一般氧）_Day27）的胞外體產生量比較及miRNA陣列解析
比較例1（Dish_Day13）與實施例2（Bottle（一般氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較顯示於圖42。相對於Dish_Day13，確認使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（一般氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，亦為胞外體產生能力高至其2.6倍的狀態。
比較例1（Dish_Day13）與實施例2（Bottle（一般氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖顯示於圖43，觀察到miRNA之表現比相差10倍以上的miRNA顯示於表4。
[表4]
| 表4.觀察到表現比相差10倍以上的miRNA | |
| microRNA的種類 | 將Dish_Day13的表現量設為1時， Bottle（一般氧）_Day27的表現量 |
| hsa-miR-21-5p | 37.23 |
| hsa-miR-23a-3p | 18.07 |
| hsa-miR-26a-5p | 43.80 |
| hsa-miR-199a-3p | 39.87 |
| hsa-miR-199b-3p | 39.87 |
| hsa-miR-320a | 1/16.21 |
| hsa-miR-423-5p | 1/10.48 |
| hsa-miR-92b-5p | 1/16.97 |
| hsa-miR-320c | 1/11.52 |
| hsa-miR-1207-5p | 1/10.73 |
| hsa-miR-3201 | 125.77 |
| hsa-miR-4270 | 1/17.88 |
| hsa-miR-4532 | 1/13.67 |
| hsa-miR-3960 | 1/13.24 |
| hsa-miR-4739 | 1/21.41 |
| hsa-miR-1273g-3p | 1/19.38 |
| hsa-miR-6087 | 1/17.19 |
| hsa-miR-6126 | 1/18.14 |
| hsa-miR-6780b-5p | 1/19.16 |
| hsa-miR-7704 | 1/11.96 |
| hsa-miR-4433b-3p | 1/11.71 |
| hsa-miR-7845-5p | 1/12.01 |
| hsa-miR-8084 | 76.74 |
專利文獻2中所記載的有效治療損傷或患病的心臟組織的miRNA，即hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果顯示於圖44。相對於即將到達匯合之前的Dish_Day13，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（一般氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態， hsa-miR-24-3p亦顯示了3.4倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
專利文獻3中所記載的有效抑制口腔鱗狀上皮癌的miRNA，即hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果顯示於圖45。相對於使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（一般氧）培養的長期連續穩定的培養狀態，即將到達匯合之前的Dish_Day13中，hsa-miR-193a-5p顯示了7.0倍、hsa-miR-193b-5p顯示了4.6倍及hsa-miR-193b-3p顯示了4.4倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
非專利文獻6及非專利文獻7中所記載的有效抑制胃細胞癌或前列腺癌細胞的miRNA，即hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果顯示於圖46。相對於即將到達匯合之前的Dish_Day13，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Bottle（一般氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，hsa-miR-26a-5p亦顯示了43.8倍、hsa-miR-23b-3p亦顯示了9.7倍、hsa-miR-26a-3p亦顯示了3.4倍、hsa-miR-27b-3p亦顯示了3.1倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
比較例1（Dish_Day6）與實施例3（Reactor（5%氧）_Day27）的胞外體產生量比較及miRNA陣列解析
比較例1（Dish_Day6）與實施例3（Reactor（5%氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較顯示於圖47。相對於Dish_Day6，確認使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（5%氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態，亦為胞外體產生能力高至其1.7倍的狀態。
比較例1（Dish_Day6）與實施例3（Reactor（5%氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖顯示於圖48，觀察到miRNA之表現比相差10倍以上的miRNA顯示於表5。
[表5]
| 表5.觀察到表現比相差10倍以上的miRNA | |
| microRNA的種類 | 將Dish_Day6的表現量設為1時， Reactor（5%氧）_Day27的表現量 |
| hsa-miR-23a-3p | 11.83 |
| hsa-miR-24a-3p | 10.32 |
| hsa-miR-214-3p | 22.27 |
| hsa-miR-1246 | 10.46 |
| hsa-miR-3124-5p | 67.93 |
| hsa-miR-3128 | 24.38 |
| hsa-miR-3201 | 22.57 |
| hsa-miR-1273g-3p | 1/15.73 |
| hsa-miR-5681a | 11.29 |
| hsa-miR-7641 | 1/35.73 |
專利文獻2中所記載的有效治療損傷或患病的心臟組織的miRNA，即hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果顯示於圖49。相對於Dish_Day6，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（5%氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，hsa-miR-24a-3p亦顯示了10.3倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
專利文獻3中所記載的有效抑制口腔鱗狀上皮癌的miRNA，即hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果顯示於圖50。使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（5%氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態，亦顯示了與Dish_Day6相同程度的產生量。
非專利文獻6及非專利文獻7中所記載的有效抑制胃細胞癌或前列腺癌細胞的miRNA，即hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果顯示於圖51。相對於Dish_Day6，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（5%氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，hsa-miR-26a-5p亦顯示了5.0倍、hsa-miR-23b-3p亦顯示了5.4倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
比較例1（Dish_Day13）與實施例3（Reactor（5%氧）_Day27）的胞外體產生量比較及miRNA陣列解析
比較例1（Dish_Day13）與實施例3（Reactor（5%氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較顯示於圖52。相對於Dish_Day13，確認使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（5%氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態，亦為胞外體產生能力高至其1.8倍的狀態。
比較例1（Dish_Day13）與實施例3（Reactor（5%氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖顯示於圖53，觀察到miRNA之表現比相差10倍以上的miRNA顯示於表6。
[表6]
| 表6.觀察到表現比相差10倍以上的miRNA | |
| microRNA的種類 | 將Dish_Day13的表現量設為1時， Reactor（5%氧）_Day27的表現量 |
| hsa-let-7e-5p | 1/14.59 |
| hsa-miR-92a-3p | 1/12.44 |
| hsa-miR-3201 | 43.49 |
| hsa-miR-3613-3p | 11.35 |
| hsa-miR-4668-5p | 11.42 |
| hsa-miR-1273g-3p | 1/43.27 |
| hsa-miR-6087 | 1/10.47 |
| hsa-miR-6126 | 1/36.77 |
| hsa-miR-6780b-5p | 1/20.50 |
專利文獻2中所記載的有效治療損傷或患病的心臟組織的miRNA，即hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果顯示於圖54。相對於即將到達匯合之前的Dish_Day13，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（5%氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，hsa-miR-24-3p亦顯示了3.4倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
專利文獻3中所記載的有效抑制口腔鱗狀上皮癌的miRNA，即hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果顯示於圖55。相對於使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（5%氧）培養的長期連續穩定的培養狀態，即將到達匯合之前的Dish_Day13中，hsa-miR-193a-5p顯示了5.2倍、hsa-miR-193b-5p顯示了2.9倍及hsa-miR-193b-3p顯示了5.4倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
非專利文獻6及非專利文獻7中所記載的有效抑制胃細胞癌或前列腺癌細胞的miRNA，即hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果顯示於圖56。相對於即將到達匯合之前的Dish_Day13，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（5%氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，hsa-miR-26a-5p亦顯示了4.0倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
比較例1（Dish_Day6）與實施例4（Reactor（一般氧）_Day27）的胞外體產生量比較及miRNA陣列解析
比較例1（Dish_Day6）與實施例4（Reactor（一般氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較顯示於圖57。相對於Dish_Day6，確認使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（一般氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，亦為胞外體產生能力高至其2.6倍的狀態。
比較例1（Dish_Day6）與實施例4（Reactor（一般氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖顯示於圖58。觀察到miRNA之表現比相差10倍以上的miRNA顯示於表7。
[表7]
| 表7.觀察到表現比相差10倍以上的miRNA | |
| microRNA的種類 | 將Dish_Day6的表現量設為1時， Reactor（一般氧）_Day27的表現量 |
| hsa-miR-21a-5p | 35.17 |
| hsa-miR-23a-3p | 32.06 |
| hsa-miR-24-3p | 10.10 |
| hsa-miR-26a-5p | 54.97 |
| hsa-miR-214-3p | 15.63 |
| hsa-miR-23b-3p | 24.23 |
| hsa-miR-606 | 12.07 |
| hsa-miR-1246 | 19.88 |
| hsa-miR-548h-3p | 13.06 |
| hsa-miR-3124-5p | 33.19 |
| hsa-miR-3128 | 43.32 |
| hsa-miR-3201 | 65.26 |
| hsa-miR-548z | 13.06 |
| hsa-miR-4423-3p | 25.95 |
| hsa-miR-7641 | 1/18.81 |
| hsa-miR-8084 | 48.44 |
專利文獻2中所記載的有效治療損傷或患病的心臟組織的miRNA，即hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果顯示於圖59。相對於Dish_Day6，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（一般氧）培養，在長期連續穩定的培養狀態中，hsa-miR-24-3p顯示了10.1倍的產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
專利文獻3中所記載的有效抑制口腔鱗狀上皮癌的miRNA，即hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果顯示於圖60。相對於Dish_Day6，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（一般氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，亦顯示了同等的產生量。
非專利文獻6及非專利文獻7中所記載的有效抑制胃細胞癌或前列腺癌細胞的miRNA，即hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果顯示於圖61。相對於Dish_Day6，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（一般氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，hsa-miR-26a-5p亦顯示了55.0倍、hsa-miR-23b-3p亦顯示了24.2倍、hsa-miR-27b-3p亦顯示了4.2倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
比較例1（Dish_Day13）與實施例4（Reactor（一般氧）_Day27）胞外體產生量比較及miRNA陣列解析
比較例1（Dish_Day13）與實施例4（Reactor（一般氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較顯示於圖62。相對於Dish_Day13，確認使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（一般氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，亦為胞外體產生能力高至其2.7倍的狀態。
比較例1（Dish_Day13）與實施例4（Reactor（一般氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖顯示於圖63，觀察到miRNA之表現比相差10倍以上的miRNA顯示於表8。
[表8]
| 表8.觀察到表現比相差10倍以上的miRNA | |
| microRNA的種類 | 將Dish_Day13的表現量設為1時， Reactor（一般氧）_Day27的表現量 |
| hsa-miR-21a-5p | 37.23 |
| hsa-miR-23a-3p | 18.07 |
| hsa-miR-26a-5p | 43.80 |
| hsa-miR-199a-3p | 39.87 |
| hsa-miR-199b-3p | 39.87 |
| hsa-miR-320a | 1/16.21 |
| hsa-miR-423-5p | 1/10.48 |
| hsa-miR-92b-5p | 1/16.97 |
| hsa-miR-320c | 1/11.52 |
| hsa-miR-1207-5p | 1/10.73 |
| hsa-miR-3201 | 125.77 |
| hsa-miR-4270 | 1/17.88 |
| hsa-miR-4532 | 1/13.67 |
| hsa-miR-3960 | 1/13.24 |
| hsa-miR-4739 | 1/21.40 |
| hsa-miR-1273g-3p | 1/19.38 |
| hsa-miR-6087 | 1/17.19 |
| hsa-miR-6126 | 1/18.14 |
| hsa-miR-6780b-5p | 1/19.15 |
| hsa-miR-7704 | 1/11.96 |
| hsa-miR-4433b-3p | 1/11.71 |
| hsa-miR-7845-5p | 1/12.01 |
| hsa-miR-8084 | 76.74 |
專利文獻2中所記載的有效治療損傷或患病的心臟組織的miRNA，即hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果顯示於圖64。相對於Dish_Day13，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（一般氧）培養，在長期連續穩定的培養狀態下，hsa-miR-24-3p亦顯示了3.4倍的產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
專利文獻3中所記載的有效抑制口腔鱗狀上皮癌的miRNA，即hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果顯示於圖65。相對於即將到達匯合之前的Dish_Day13，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（一般氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，hsa-miR-193a-5p亦顯示了7.0倍、hsa-miR-193b-5p亦顯示了4.6倍及hsa-miR-193b-3p亦顯示了4.4倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
非專利文獻6及非專利文獻7中所記載的有效抑制胃細胞癌或前列腺癌細胞的miRNA，即hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果顯示於圖66。相對於即將到達匯合之前的Dish_Day13，使用聚醯亞胺多孔質膜模組的Reactor（一般氧）培養，即使在長期連續穩定的培養狀態下，hsa-miR-26a-5p亦顯示了43.8倍、hsa-miR-23b-3p亦顯示了9.7倍、hsa-miR-26b-3p亦顯示了3.4倍、hsa-miR-27b-3p亦顯示了3.2倍的高產生量，關於其他的miRNA則為相同程度的表現量。
實施例6：在WAVE反應器中使用模組的細胞培養
以與實施例5類似的方法，在放入有事先以培養基（包含Ham’s F-12培養基；Fuji Film Wako Pure Chemical公司製_麩醯胺酸･酚紅）潤濕2天以上的60個模組的GE公司製WAVE培養袋（CELLBAG DISPOSABLE BIOREACTOR Part＃ CB0002L11-33）內加注250mL的培養基（Kohjin Bio公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4R），並將其設置於GE公司製 WAVE反應器（ReadyToProcess WAVE25）後，於CO2
5%、溫度37℃、振動速度15rpm、振動角度9°的條件攪拌約1小時，使模組振盪。
使用Gibco公司製Trypsin-EDTA（0.05%）含酚紅將在培養碟上進行培養的第4次繼代之間葉系幹細胞（21Y Male；ATCC公司製Lot 70011721）剝離，使其在培養基（Kohjin Bio公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4R）11mL中懸浮。將模組內部的培養基材聚醯亞胺多孔質膜的面積每一平方公分為1.0×104
cells（Total：1.1×107
cells）的細胞懸浮液接種，以與模組潤濕時相同的振動條件使細胞吸附，開始長期培養。
以相同條件持續振動培養3天後，利用反應器的灌注功能（袋重量管理功能），經由採收管泵，以110mL/day的速度從GE公司製WAVE培養袋內將細胞培養液排出，並經由輸入管泵，以與採收相同的量，將培養基（葡萄糖調整KBM ADSC-4R）輸送至GE公司製WAVE培養袋內。另外，因為WAVE25附屬的泵中採收速度太快，因此使用AS ONE製 micro tube pump set FP100-1來實施培養基採收。所回收之培養基，係使用Roche公司製CedexBio，以各代謝參數的變化觀察細胞培育行為，觀察到長期穩定的細胞的增殖/培育。又，在必要的產生時期，利用同仁化學研究所製Cell Counting Kit-8所形成的顯色反應，測量袋內模組所培育的總細胞數，確認細胞的培育狀況。葡萄糖消耗及乳酸產生量的經時變化顯示於圖67。此外，因為葡萄糖消耗量增加而預期不足的情況，為了避免枯竭，可藉由添加葡萄糖液調整葡萄糖濃度。
為了測量所回收之細胞培養液中包含的胞外體每日產生數量，將約每20天的回收培養基統整為1個批次，製作5批回收液。以0.2μm的過濾器去除異物後，以前述「使用界面電位/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量」的程序測量各液體，結果顯示於表9。確認代表培養天數100天的5批回收液中，持續穩定產生胞外體。
[表9]
| 回收原液的胞外體量評估 | ||
| 樣本名稱 | 培養期間 | 胞外體粒子數 ZEECOM測量 |
| W25-MSC 01 EX1 | Day 0 ～ Day 24 | 1322 |
| W25-MSC 01 EX2 | Day 25 ～ Day 42 | 1309 |
| W25-MSC 01 EX3 | Day 43 ～ Day 63 | 1109 |
| W25-MSC 01 EX4 | Day 64 ～ Day 82 | 1323 |
| W25-MSC 01 EX5 | Day 83 ～ Day 100 | 1224 |
再者，以切流式過濾(Tangential Flow filtration)法（Sartorius公司製VIVAFLOW 200 100,000MWCO HY）將此等的5批樣本（培養回收液）濃縮30倍～50倍左右之後，以濃縮液一半的量添加ThermoFisher公司製Total Exosome Isolation Reagent (從細胞培養基)，以攪拌/整夜冷藏靜置/離心（10000G/60min）將所產生的沉澱物分離。對於此沉澱物加注與已去除之液相同程度量的DPBS以進行懸浮溶解，再以0.2μm過濾器去除異物，將所取得的液體作為胞外體液。如此針對各培養期間逐一取得胞外體液的5批樣本。
針對這5批樣本，以前述「使用界面電位/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量」的程序進行測量。又，使用源自人類的胞外體定量用CD9/CD63ELISA 套組（Cosmo Bio公司製；產品編號_EXH0102EL），將胞外體量作為CD63的蛋白質量以進行定量。胞外體量評估結果顯示於表10，胞外體粒度分布結果顯示於圖68。
[表10]
| 精製濃縮取得液的胞外體量評估 | |||
| 樣本名 | 培養期間 | 胞外體粒子數 ZEECOM測量 | ELISA測量值* （pg/ml） |
| W25-MSC 01 EX1 | Day 0 ～ Day 24 | 32063 | 2523 |
| W25-MSC 01 EX2 | Day 25 ～ Day 42 | 117850 | 7725 |
| W25-MSC 01 EX3 | Day 43 ～ Day 63 | 73769 | 4284 |
| W25-MSC 01 EX4 | Day 64 ～ Day 82 | 92408 | 3938 |
| W25-MSC 01 EX5 | Day 83 ～ Day 100 | 71850 | 4003 |
| *Cosmo Bio股份有限公司製 CD9/CD63 Exosome ELISA kit，Human Cat. No EXH01 02EL |
關於上述各胞外體樣本，實施使用了實施例5中所示之GeneChip（商標）miRNA 4.0 Array的miRNA陣列解析。進行基因表現比較解析，結果無論培養期間為何，皆可確認穩定的胞外體內之基因表現。
對於以與上述實施例相同的方法所得之胞外體，以凝膠過濾管柱（HiLoad 16/600Superdex200 prep grade）精製後，使用超過濾膜進行濃縮後，進行TEM（穿透式電子顯微鏡）觀察。對於附有碳支持膜的Cu網格，使試片溶液吸附後，進行洗淨、染色、洗淨、乾燥，製作TEM觀察用試片。使用日本電子製 JEM-2100F型場發射穿透式電子顯微鏡拍攝。測量例顯示於圖69。
實施例7：在WAVE反應器中使用模組的細胞培養
以與實施例5類似的方法，在放入有事先以培養基（包含Ham’s F-12培養基；Fuji Film Wako Pure Chemical公司製_麩醯胺酸/酚紅）潤濕2天以上的70個模組的GE公司製WAVE培養袋（CELLBAG DISPOSABLE BIOREACTOR Part＃ CB0002L11-03）內加注250mL的培養基（Kohjin Bio公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4R），並將其設置於GE公司製 WAVE反應器（Xuri Cell Expansion System W5）後，於CO2
5%、溫度37℃、振動速度11rpm、振動角度9°的條件攪拌約1小時，以使模組振盪。
使用Gibco公司製Trypsin-EDTA（0.05%）含酚紅將在培養碟上進行培養的第2次繼代之間葉系幹細胞（21Y Male；ATCC公司製Lot 70011721）剝離，使其在培養基（Kohjin Bio公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4R）11mL中懸浮。將模組內部的培養基材聚醯亞胺多孔質膜的面積每一平方公分為1.0×104
cells（Total：1.3×107
cells）的細胞懸浮液接種，以與模組潤濕時相同的振動條件使細胞吸附，開始長期培養。又，在對於模組接種間葉系幹細胞的同時，亦對於IWAKI製 Collagen I Coat Dish進行繼代接種，實施用以作為胞外體產生比較實驗的培養。
以相同條件持續振動培養3天後，利用反應加速器（Xuri Cell Expansion System W5 Perfusion Controller）的灌注功能（袋重量管理功能），放置約3小時，經由採收管泵，從GE公司製WAVE培養袋內將細胞培養液排出約20mL，並經由輸入管泵，以與採收相同的量，將培養基（葡萄糖調整KBM ADSC-4R）輸送至GE公司製WAVE培養袋內，實施150mL/day的液體更換。所回收之培養基，使用Roche公司製CedexBio，以各代謝參數的變化觀察細胞培育行為，觀察到長期穩定的細胞之增殖/培育。又，在第14天/第21天/第28天/第50天，利用同仁化學研究所製Cell Counting Kit-8所形成之顯色反應，測量在袋內模組進行培育的人類間葉系幹細胞每一平方公分的細胞密度及袋內的總細胞數，確認細胞的培育狀況。表11顯示測量結果。
[表11]
| 表11.培養期間與培育細胞數量的比較 | ||
| 培養期間（天） | 細胞密度（cells/cm2 ） | 總細胞數（cells） |
| 14 | 6.1×104 | 7.7×107 |
| 21 | 8.4×104 | 1.1×108 |
| 28 | 9.4×104 | 1.2×108 |
| 50 | 8.5×104 | 8.5×107 |
測量所回收之細胞培養液中包含的胞外體每日產生數量，定期取出樣本，以0.2μm的過濾器去除異物後，以前述「使用界面電位/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量」的程序測量各液體。測量結果、包含以其他細胞運作的結果顯示於圖70。圖中，人類間葉系幹細胞WAVE反應器（1）顯示了該實驗結果。從結果明確顯示，確認在本培養方法中，在培養天數50天內持續穩定產生胞外體。
又，為了比較胞外體，使用在培養第14天從在IWAKI製 Collagen I Coat Dish上以Kohjin Bio公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4R所培養的相同間葉系幹細胞所回收的培養上清液、與以上述WAVE反應器進行的連續培養系統中第50天回收的培養基，實施使用了實施例5中所示之GeneChip（商標）miRNA 4.0 Array的miRNA陣列解析。結果顯示於圖71。
針對2種不同培養條件，將miRNA表現量的比較在同量的RNA間進行平準化而作為分布顯示。左側係顯示人類型miRNA的整體分布，右側係顯示限定於miR21至24之部分的分布。從左側的圖的比較明確顯示，確認即使RNA量相同，整體而言，模組培養系統中miRNA的表現量變多。又，與此傾向相反，確認相較於模組培養，miR-22-3p的表現量在培養盤培養中增加。miR-22係已知表現量隨著細胞老化而增加的miRNA。儘管在模組培養的期間培養了比作為比較對象的在培養盤中平面培養多出3倍以上的期間，但發現該老化相關miRNA的表現量在培養盤培養系統的情況中多出3倍以上。確認藉由模組培養可良好地維持特性而可長期進行細胞培養。
實施例8：在WAVE反應器中使用模組的細胞培養
以與實施例5類似的方法，在放入有事先以培養基（包含Ham’s F-12培養基；Fuji Film Wako Pure Chemical公司製_麩醯胺酸/酚紅）中潤濕2天以上的55個模組及55個第二型模組的2個GE公司製WAVE培養袋（CELLBAG DISPOSABLE BIOREACTOR Part＃ CB0002L11-03）內加注250mL的培養基（Kohjin Bio公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4R），並將其設置於GE公司製 WAVE反應器（Xuri Cell Expansion System W5）後，以CO2
5%、溫度37℃、振動速度13rpm、振動角度9°的條件攪拌約1小時，以使模組振盪。
使用Gibco公司製Trypsin-EDTA（0.05%）含酚紅將在培養碟上進行培養的第2次繼代之間葉系幹細胞（25Y Male；Lonza公司製Lot 00451491）剝離，使其在培養基（Kohjin Bio公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4R）11mL中懸浮。將模組內部的培養基材聚醯亞胺多孔質膜的面積每一平方公分為1.0×104
cells（Total：1.3×107
cells）的細胞懸浮液接種，以與模組潤濕時相同的振動條件使細胞吸附，開始長期培養。
以相同條件持續振動培養3天後，利用反應器配件（Xuri Cell Expansion System W5 Perfusion Controller）的灌注功能（袋重量管理功能），放置約3小時，經由採收管泵，從GE公司製WAVE培養袋內將細胞培養液排出約20mL，並經由輸入管泵，以與採收相同的量，將培養基（葡萄糖調整KBM ADSC-4R）輸送至GE公司製WAVE培養袋內，實施150mL/day的液體更換。所回收之培養基，使用Roche公司製CedexBio，以各代謝參數的變化觀察細胞培育行為，觀察到長期穩定的細胞的增殖/培育。又，在第7天/第14天/第21天/第29天/第48天，利用由同仁化學研究所製Cell Counting Kit-8所形成之顯色反應，將在袋內模組進行培育的細胞每一平方公分的培育數量顯示為細胞密度，測量在測量時釋放至回收培養基內的胞外體之粒子數，藉此確認細胞的培育狀況與連續的胞外體產生行為。表12中顯示測量結果。
[表12]
| 表12.培養期間與培育細胞密度及胞外體產生量的比較 | ||||
| 培養期間（天） | 一般模式 | 第二型模式 | ||
| 細胞密度 （cells/cm2 ） | 胞外體粒子數 ZEECOM測量 | 細胞密度 （cells/cm2 ） | 胞外體粒子數 ZEECOM測量 | |
| 7 | 4.3×104 | 975 | 4.0×104 | 767 |
| 14 | 8.7×104 | 841 | 9.1×104 | 932 |
| 21 | 9.7×104 | 未實施評估 | 1.2×104 | 未實施評估 |
| 29 | 1.2×104 | 1200 | 1.3×104 | 1272 |
| 48 | 未實施評估 | 1041 | 未實施評估 | 1211 |
另外，為了確認與其他實驗的整合性，圖70中顯示了胞外體產生行為。圖中將一般模組實驗結果顯示為人類間葉系幹細胞WAVE反應器（2），將第二型模組實驗結果顯示為人類間葉系幹細胞WAVE反應器（3）。
實施例9：溢流反應器中的成骨細胞長期模組培養
在放入有事先以培養基（Ham’s F-12培養基；Fuji Film Wako Pure Chemical公司製_含有麩醯胺酸･酚紅）潤濕2天以上的50個模組的溢流反應器培養容器內加注100mL的培養基（Kohjin Bio股份有限公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4），並將其設置在設定CO2
5%、37℃的N-BIOTEK公司製搭載可加濕之振盪器的CO2
恆溫箱（aniCell）內後，以旋轉速度80rpm攪拌震盪模組約1小時。
使用Gibco公司製Trypsin-EDTA（0.05%）含酚紅將在Corning公司製細胞培養Falcon dish上進行培養的第6次繼代的PromoCell公司製人類成骨細胞（Y30 female_439Z037.2）剝離，在離心/細胞回收後，使其在該培養基（KBM ADSC-4）9ml中懸浮。將模組內部的培養基材聚醯亞胺多孔質膜的面積每一平方公分為1.0×104
cells（Total；9.0×106
cells）的細胞懸浮液加注至溢流反應器培養容器內後，在旋轉速度80rpm的攪拌條件下開始細胞的吸附與培養。
細胞吸附後，藉由管泵，以100mL/day的速度，開始將培養基（葡萄糖調整KBM ADSC-4）輸送至溢流反應器培養容器內，並以回收液儲存瓶將從設於培養容器壁面的培養基回收口溢出的培養基回收。所回收之培養基，使用Roche公司製CedexBio，以回收液的各代謝參數的變化，觀察細胞培育行為，因應細胞消耗葡萄糖等的狀況，適時改變送液量、旋轉速度，以進行長期細胞培養。葡萄糖消耗量及乳酸產生量的經時變化顯示於圖72。在200天的長期培養中觀察到穩定的葡萄糖消耗及乳酸產生。
為了測量回收培養基內的胞外體產生量，以前述「使用界面電位/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量」的程序進行測量，結果顯示於表13。確認與代謝行為相同，在100天以上的長期培養中穩定產生胞外體的行為。
整個培養期間回收的培養基，在針對各個時期整理後，以過濾器過濾，再以切流式過濾(Tangential Flow filtration)法（Sartorius公司製VIVAFLOW 200 100,000MWCO HY）濃縮後，添加ThermoFisher公司製Total Exosome Isolation Reagent （從細胞培養基）並進行攪拌/冷藏靜置/離心（10000G/60min），藉此作為沉澱物而得到胞外體前驅物。其中加注適量的DPBS，並以0.2μm過濾器去除異物，將所得之液體作為胞外體液。如此取得各培養期間的胞外體液。
從其中選擇Day72至Day93以及Day108～Day122的2組樣本，以miRNA陣列測量進行各miRNA的表現量比較。結果顯示於圖73。
[表13]
| 表13.培養期間與胞外體產生行為的關係 | |
| 培養期間（天） | 胞外體粒子數 ZEECOM測量 |
| 24 | 1413 |
| 56 | 491 |
| 87 | 826 |
| 122 | 937 |
| 133 | 1180 |
從試驗結果明確顯示，關於兩組胞外體樣本，miRNA表現量幾乎未見差異，清楚顯示可長期得到穩定品質的胞外體。
實施例10：在WAVE反應器中的成骨細胞長期模組培養
在放入有事先以培養基（Ham’s F-12培養基；Fuji Film Wako Pure Chemical公司製_含有麩醯胺酸･酚紅）潤濕2天以上的70個模組的WAVE反應器培養容器內加注100mL的培養基（Kohjin Bio股份有限公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4R），在GE公司製WAVE培養袋（CELLBAG DISPOSABLE BIOREACTOR Part＃ CB0002L11-03）內加注250mL的培養基（Kohjin Bio公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4R），並將其設置於GE公司製 WAVE反應器（Xuri Cell Expansion System W5）後，以CO2
5%、溫度37℃，振動速度15rpm，振動角度9°的條件攪拌約1小時，以使模組振盪。
使用Gibco公司製Trypsin-EDTA（0.05%）含酚紅將在Corning公司製細胞培養Falcon dish上進行培養的第3次繼代的PromoCell公司製人類成骨細胞（Y30 female_439Z03.2）剝離，並在離心/細胞回收後使其在該培養基（KBM ADSC-4R）13ml中懸浮。將模組內部的培養基材聚醯亞胺多孔質膜的面積每一平方公分為1.0×104
cells（Total；1.3×107
cells）的細胞懸浮液加注至WAVE反應器培養容器內後，在振動速度15rpm、振動角度9°的振動條件下，開始細胞的吸附與培養。
以相同條件持續振動培養3天後，利用反應器配件（Xuri Cell Expansion System W5 Perfusion Controller）的灌注功能（袋重量管理功能），放置約3小時，經由採收管泵，從GE公司製WAVE培養袋內將細胞培養液排出約20mL，並經由輸入管泵，以與採收相同的量，將培養基（葡萄糖調整KBM ADSC-4R）輸送至GE公司製WAVE培養袋內，實施150mL/day的液體更換。所回收之培養基，使用Roche公司製CedexBio，以各代謝參數的變化，觀察細胞培育行為，觀察到長期穩定的細胞的增殖/培育。又，在第8天/第22天/第36天/第58天，利用由同仁化學研究所製Cell Counting Kit-8所形成之顯色反應，測量在袋內模組培育的人類成骨細胞的每一平方公分的細胞密度及袋內的總細胞數，確認細胞的培育狀況。結果顯示於表14。又，為了測量回收培養基內的胞外體產生量，以前述「使用界面電位/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量」的程序進行測量，結果顯示於表15。確認與代謝行為相同，在130天以上的長期培養中穩定產生胞外體的行為。
[表14]
[表15]
| 表14.培養期間與培育細胞數的比較 | ||
| 培養期間（天） | 細胞密度 （cells/cm2 ） | 總細胞數 （cells） |
| 8 | 1.7×104 | 2.1×107 |
| 22 | 1.9×104 | 2.4×107 |
| 36 | 2.5×104 | 3.2×107 |
| 58 | 2.6×104 | 3.3×107 |
| 表15.培養期間與胞外體產生行為的關係 | |
| 培養期間（天） | 胞外體粒子數 ZEECOM測量 |
| 14 | 838 |
| 22 | 967 |
| 50 | 759 |
| 140 | 558 |
實施例11：在溢流反應器中的胎兒心肌細胞長期模組培養
在放入有事先以培養基（Ham’s F-12培養基；Fuji Film Wako Pure Chemical公司製_含有麩醯胺酸･酚紅）潤濕2天以上的40個模組的溢流反應器培養容器內加注100mL的培養基（Kohjin Bio股份有限公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4），並將其設置於設定CO2
5%、37℃的N-BIOTEK公司製搭載可加濕之振盪器的CO2
恆溫箱（aniCell）內之後，以旋轉速度80rpm攪拌振盪模組約1小時。
使用Gibco公司製Trypsin-EDTA（0.05%）含酚紅將在Corning公司製細胞培養Falcon dish上進行培養的第1次繼代的SicenCell公司製人類胎兒心肌細胞（Lot.No.21757）剝離，並在進行離心/細胞回收後，使其在該培養基（KBM ADSC-4）7.2ml中懸浮。將模組內部的培養基材聚醯亞胺多孔質膜的面積每一平方公分為1.0×104
cells（Total；7.2×106
cells）的細胞懸浮液加注至溢流反應器培養容器內之後，在旋轉速度80rpm的攪拌條件下，開始細胞的吸附與培養。
24小時後，藉由管泵以100mL/day的速度開始將培養基（葡萄糖調整KBM ADSC-4）輸送至溢流反應器培養容器內，以回收液儲存瓶回收從設於培養容器壁面的培養基回收口溢出的培養基。所回收之培養基，使用Roche公司製CedexBio回收液，以各代謝參數的變化，觀察細胞培育行為，因應細胞消耗葡萄糖等的狀況，適時改變送液量、旋轉速度，進行長期細胞培養。葡萄糖消耗量及乳酸產生量的經時變化顯示於圖74。在80天的長期培養中觀察到穩定的葡萄糖消耗及乳酸產生。
在第14天、第38天、第93天、第114天，利用同仁化學研究所製Cell Counting Kit-8所形成之顯色反應，測量袋內模組培育的人類胎兒心肌細胞的每一平方公分的細胞密度及反應器內的總細胞數，確認細胞的培育狀況。結果顯示於表16。從最初即呈現極高的增殖性，因此由測量顯示出整個培養期間幾乎維持相同數量程度的細胞密度。由葡萄糖消耗及乳酸產生量亦可推論出相同的行為。
為了測量回收培養基內的胞外體產生量，以前述「使用界面電位/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量」的程序進行測量，結果顯示於表17。確認與代謝行為相同，在100天以上的長期培養中觀察到穩定的產生胞外體的行為。
[表16]
[表17]
| 培養期間（天） | 細胞密度 （cells/cm2 ） | 總細胞數 （cells） |
| 14 | 3.6×104 | 2.6×107 |
| 38 | 2.4×104 | 1.7×107 |
| 93 | 3.5×104 | 2.5×107 |
| 114 | 3.4×104 | 2.4×107 |
| 培養期間（天） | 胞外體粒子數 ZEECOM測量 |
| 14 | 722 |
| 22 | 1068 |
| 53 | 767 |
| 74 | 924 |
實施例12：在WAVE反應器中的胎兒心肌細胞長期模組培養
在放入有事先以DPBS（Fuji Film Wako Pure Chemical公司製）潤濕2天以上的50個第二型模組的GE公司製WAVE培養袋（CELLBAG DISPOSABLE BIOREACTOR Part＃ CB0002L11-03）內加注250mL的培養基（Kohjin Bio公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4R），並將其設置於GE公司製 WAVE反應器（Xuri Cell Expansion System W5）之後，以CO2
5%、溫度37℃、振動速度15rpm、振動角度9°的條件攪拌約1小時，以使模組振盪。
使用Gibco公司製Trypsin-EDTA（0.05%）含酚紅將在 Corning公司製細胞培養Falcon dish上進行培養的第4次繼代的SicenCell公司製人類胎兒心肌細胞（Lot.No.21757）剝離，並在進行離心/細胞回收後，使其在該培養基（KBM ADSC-4R）10ml中懸浮。將模組內部的培養基材聚醯亞胺多孔質膜的面積每一平方公分為1.0×104
cells（Total；1.0×107
cells）的細胞懸浮液加注於WAVE反應器培養容器內之後，以振動速度15rpm、振動角度9°的振動條件，開始細胞的吸附與培養。
以相同條件持續振動培養3天之後，利用反應器配件（Xuri Cell Expansion System W5 Perfusion Controller）的灌注功能（袋重量管理功能），放置約3小時，經由採收管泵，從GE公司製WAVE培養袋內將細胞培養液排出約20mL，並經由輸入管泵，以與採收相同的量，將培養基（葡萄糖調整KBM ADSC-4R）輸送至GE公司製WAVE培養袋內，實施150mL/day的液體更換。所回收之培養基，使用Roche公司製CedexBio，以各代謝參數的變化觀察細胞培育行為，觀察到長期穩定的細胞的增殖/培育。又，在第7天、第14天、第21天、第35天，利用同仁化學研究所製Cell Counting Kit-8所形成之顯色反應，測量袋內模組培育的人類胎兒心肌細胞的每一平方公分的細胞密度及袋內的總細胞數，確認胎兒心肌細胞特有的良好細胞培育狀況。結果顯示於表18。
[表18]
| 培養期間（天） | 細胞密度 （cells/cm2 ） | 總細胞數 （cells） |
| 7 | 1.4×104 | 1.4×107 |
| 14 | 8.1×104 | 8.1×107 |
| 21 | 7.8×104 | 7.8×107 |
| 35 | 7.9×104 | 7.9×107 |
又，為了測量回收培養基內的胞外體產生量，以每20天為單位整理排出培養基，而準備3個批次的回收原液。將此等以過濾器過濾後，與實施例6相同地，以「使用界面電位/粒徑分布測量裝置來測量胞外體數量」的程序進行測量，並且以ELISA法測量胞外體產生量以作為CD63的蛋白質量，結果顯示於表19。除了培養開始時期以外，確認穩定的胞外體產生行為。
[表19]
| 樣本名稱 | 培養期間（天） | 胞外體粒子數 ZEECOM測量 | ELISA測量值* （pg/ml） |
| W5-CMF 01 EX1 | Day 0 ～ Day 17 | 1807 | 169 |
| W5-CMF 01 EX2 | Day 18 ～ Day 34 | 1512 | 335 |
| W5-CMF 01 EX3 | Day 35 ～ Day 56 | 1537 | 406 |
實施例13：以錐形燒瓶及小片多孔膜進行軟骨細胞模組培養
準備放入有事先以DPBS（Fuji Film Wako Pure Chemical公司製）潤濕2天以上的5個第二型模組的Thermo Fisher Scientific公司製125mL錐形燒瓶及相同的250mL錐形燒瓶、放入有已殺菌的聚醯亞胺多孔質膜小片（1mm×1mm）120cm2
的Corning公司製125ml方型PET製保存瓶（附45mm蓋）。對於錐形燒瓶加注葡萄糖值調整為3000mg/L的培養基（Kohjin Bio公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4R）20mL，在放入有小片多孔膜的Corning公司製方形瓶中，加注相同的培養基30ml。
使用Gibco公司製Trypsin-EDTA（0.05%）,phenol red 將在IWAKI Collagen I Coat Dish上進行培養的第4次繼代的PromoCell公司製人類軟骨細胞（Y30 female_439Z037.3）剝離，並在進行離心/細胞回收後，使其在培養基（葡萄糖經調整之KBM ADSC-4R）中懸浮。以每一毫升為1.0×106
cells的懸浮細胞密度，加注在模組內部的培養基材聚醯亞胺多孔質膜及聚醯亞胺多孔質膜小片的面積每一平方公分為1.0×104
cells（錐形燒瓶中Total；1.0×106
cells，又在小片多孔膜中Total；1.2×106
cells）的細胞懸浮液。在錐形燒瓶中的培養係使用前述aniCell中的振盪培養器來進行，又，在小片多孔膜中的軟骨細胞培養係來使用CO2
恆溫箱的靜置培養來進行。
培養隔天，再於錐形燒瓶內加入10ml的葡萄糖經調整之KBM ADSC-4R培養基，使用前述aniCell，以80rpm進行旋轉振盪培養，一方面進行每週2次左右的培養基更換，一方面持續培養。在錐形燒瓶中的模組培養（第二型模組5個）及小片多孔膜培養（聚醯亞胺多孔質膜小片120cm2
）的同時，以30ml的培養基進行培養。在第8天/第15天/第20天/第35天，利用同仁化學研究所製Cell Counting Kit-8所形成之顯色反應，測量各反應器內模組及多孔膜小片培育的總細胞數。以各反應器特有的增殖行為，確認人類軟骨細胞為良好的細胞培育狀況。細胞密度及總細胞數顯示於圖75。顯示了可使用小的培養容器輕易以多種形態穩定且長期培養大量的細胞。
又，以ELISA法測量培養第19天時的回收培養基內的胞外體產生量，將胞外體產生量作為CD63的蛋白質量，結果確認留置3天的情況，在使用錐形燒瓶125ml容器的模組中產生218pg/ml的胞外體，又在使用250ml容器的模組中產生141pg/ml的胞外體，在以小片多孔膜進行的培養系統中產生117pg/ml的胞外體。與前述連續培養系統相同地，在間歇培養系統中，亦確認有效率且穩定產生胞外體。
無
圖1係顯示細胞培養模組的一實施態樣。殼體內收納有聚合物多孔質膜。
圖2係顯示細胞培養模組的一實施態樣。殼體內收納有聚合物多孔質膜。
圖3係顯示細胞培養模組的一實施態樣。（A）網格狀的殼體內收納有聚合物多孔質膜。（B）係顯示由網格狀的網與骨架所構成之殼體的一實施態樣。
圖4係顯示在玻璃旋轉瓶（Spinner flask）內應用細胞培養模組時所併用之裝置的實施態樣。（A）為旋轉型裝置，其係將應用了細胞培養模組的該裝置設置於玻璃旋轉瓶內，使該旋轉型裝置自轉來使用。（B）為固定型裝置，其係將應用了細胞培養模組的該裝置設置於玻璃旋轉瓶的底部，並使玻璃旋轉瓶的攪拌器在裝置中央的空間中旋轉來使用。
圖5係顯示將細胞培養模組應用於可撓性袋型培養容器而進行培養的一實施態樣。培養開始（左）1小時內培養液的酚紅變化為黃色（右）。
圖6係顯示在振動培養時使用網格模組的一實施態樣。
圖7係顯示使用聚醯亞胺多孔質膜進行細胞培養的模型圖。
圖8係顯示乾熱殺菌型虹吸式細胞培養裝置（耐熱虹吸型反應器）的圖。
圖9係顯示虹吸式細胞培養裝置的圖。
圖10係顯示筒型氣相培養裝置。（A）係顯示細胞培養裝置之構成的圖。（B）係顯示（A）中載置細胞培養裝置的細胞培養部的圖。
圖11係顯示筒型氣相培養裝置。基本的構成與圖10共通，但各段的培養基排出口係逐一以30度逆時針選轉而錯開，成為培養基容易排出的結構。
圖12係顯示噴霧及沖淋型培養裝置。
圖13係顯示氣相露出型旋轉培養裝置。（A）係顯示氣相露出型旋轉培養裝置的構成。（B）係顯示氣相露出型旋轉培養裝置之使用態樣的圖。
圖14係顯示氣相露出型旋轉培養裝置的細胞培養部。（A）係顯示該細胞培養部的示意圖，（B）係顯示該培養部的使用態樣的圖。
（A）靜置培養2天後，（B）振動培養2天後（無網格）。
圖15係顯示應用了一實施型態中的本發明之細胞培養模組的WAVE型生物反應器的圖。（A）係顯示封入有細胞培養模組的袋，（B）係顯示細胞吸附於使用了WAVE25的細胞培養模組的步驟。
圖16係顯示本發明的一實施型態中的細胞培養裝置的圖。（A）係顯示細胞培養模組，（B）係顯示細胞培養部，（C）係顯示一實施型態中的細胞培養裝置。
圖17係顯示一實施型態中的細胞培養裝置的圖。
圖18係顯示在使用培養碟（dish）的細胞培養中胞外體產生試驗的結果，（A）係顯示在培養天數第6天及第13天回收的細胞培養液中所包含的胞外體每日產生數量的測量結果，（B）為培養天數第13天的粒徑分布測量的結果。
圖19係顯示在150mL圓形保存瓶中（5%氧）使用模組的細胞培養中的胞外體產生試驗的結果，（A）為培養天數27天為止的細胞培養液中所包含的胞外體每日產生數量的測量結果，（B）為培養天數第27天的粒徑分布測量的結果。
圖20係顯示在150mL圓形保存瓶中（一般氧）使用模組的細胞培養中的胞外體產生試驗的結果，（A）為培養天數27天為止的細胞培養液中所包含的每日產生之胞外體數的測量結果，（B）為培養天數第27天的粒徑分布測量的結果。
圖21係顯示在溢流反應器中使用模組的細胞培養系統（5%氧），（A）係葡萄糖消耗量及乳酸產生量的經時變化，（B）係顯示細胞培養的態樣。
圖22係顯示在溢流反應器中使用模組的細胞培養系統（5%氧）中的胞外體產生試驗的結果，（A）係培養天數85天為止的細胞培養液中所包含的胞外體每日產生數量的測量結果，（B）係顯示培養天數第85天的粒徑分布測量的結果。
圖23係顯示在溢流反應器中使用模組的細胞培養系統（一般氧），（A）係葡萄糖消耗量及乳酸產生量的經時變化，（B）係顯示細胞培養的態樣。
圖24係顯示在溢流反應器中使用模組的細胞培養系統（一般氧）中的胞外體產生試驗的結果，（A）係培養天數85天為止的細胞培養液中所包含的胞外體每日產生數量的測量結果，（B）係顯示培養天數第85天的粒徑分布測量的結果。
圖25（A）係顯示在WAVE反應器中使用模組的細胞培養系統中，葡萄糖消耗量及乳酸產生量的經時變化。圖25（B）及（C）係顯示在WAVE反應器中使用模組的細胞培養中的胞外體產生試驗的結果，（B）係培養天數39天為止的細胞培養液中所包含的胞外體每日產生數量的測量結果，（C）係在培養天數第39天的粒徑分布測量的結果。
圖26係顯示比較例1及實施例1至4在培養天數第13天時一個細胞產生胞外體之能力的比較。
圖27係顯示比較例1（Dish_Day6）與實施例1（Bottle（5%氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較。
圖28係顯示比較例1（Dish_Day6）與實施例1（Bottle（5%氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖（Scatterplot）。
圖29係顯示hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的散點圖。
圖30係顯示hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果。
圖31係顯示hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果。
圖32係顯示比較例1（Dish_Day13）與實施例1（Bottle（5%氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較。
圖33係顯示比較例1（Dish_Day13）與實施例1（Bottle（5%氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖。
圖34係顯示hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果。
圖35係顯示hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果。
圖36係顯示hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果。
圖37係顯示比較例1（Dish_Day6）與實施例2（Bottle（一般氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較。
圖38係顯示比較例1（Dish_Day6）與實施例2（Bottle（一般氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖。
圖39係顯示hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果。
圖40係顯示hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果。
圖41係顯示hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果。
圖42係顯示比較例1（Dish_Day13）與實施例2（Bottle（一般氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較。
圖43係顯示比較例1（Dish_Day13）與實施例2（Bottle（一般氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖。
圖44係顯示hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果。
圖45係顯示hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果。
圖46係顯示hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果。
圖47係顯示比較例1（Dish_Day6）與實施例3（Reactor（5%氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較。
圖48係顯示比較例1（Dish_Day6）與實施例3（Reactor（5%氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖。
圖49係顯示hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果。
圖50係顯示hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果。
圖51係顯示hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果。
圖52係顯示比較例1（Dish_Day13）與實施例3（Reactor（5%氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較。
圖53係顯示比較例1（Dish_Day13）與實施例3（Reactor（5%氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖。
圖54係顯示hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果。
圖55係顯示hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果。
圖56係顯示hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果。
圖57係顯示比較例1（Dish_Day6）與實施例4（Reactor（一般氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較。
圖58係顯示比較例1（Dish_Day6）與實施例4（Reactor（一般氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖。
圖59係顯示hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果。
圖60係顯示hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果。
圖61係顯示hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果。
圖62係顯示比較例1（Dish_Day13）與實施例4（Reactor（一般氧）_Day27）的每一個細胞產生胞外體之數量的比較。
圖63係顯示比較例1（Dish_Day13）與實施例4（Reactor（一般氧）_Day27）的miRNA陣列解析的散點圖。
圖64係顯示hsa-miR-146a、hsa-miR-210、hsa-miR-22及hsa-miR-24的miRNA陣列解析的結果。
圖65係顯示hsa-miR-34b、hsa-miR-132、hsa-miR-203、hsa-miR-137及hsa-miR-193的miRNA陣列解析的結果。
圖66係顯示hsa-miR-26a/b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b及hsa-miR-24-1的miRNA陣列解析的結果。
圖67係顯示乳酸產生量及葡萄糖消耗的經時變化的圖表。
圖68係顯示五種所取得之胞外體樣本的粒度分布的圖表。
圖69係顯示藉由一實施態樣中的本發明之方法所得到的胞外體之穿透式電子顯微鏡影像。
圖70係顯示在各種反應器中經時的胞外體產生量的圖表。
圖71係顯示miRNA陣列解析的結果（左：人類型miRNA整體圖；右：選出miR-21、22、23、24）。
圖72係顯示乳酸產生量及葡萄糖消耗的經時變化的圖表。
圖73係顯示miRNA陣列解析的結果（左：人類型miRNA整體圖；右：選出miR-21、22、23、24）。
圖74係顯示乳酸產生量及葡萄糖消耗的經時變化的圖表。
圖75係顯示經過模組培養或小片多孔膜培養的人類軟骨細胞的細胞密度（左）及總細胞數的經時變化的圖表。
無
Claims (25)
- 一種方法，其係使用細胞產生胞外體的方法，包含： 將細胞應用於細胞培養模組以培養細胞的步驟；及 藉由細胞產生胞外體的步驟； 其中，該細胞培養模組具備： 聚合物多孔質膜；及 殼體，具有2個以上的培養基流出入口，並收納該聚合物多孔質膜。
- 如請求項1之方法，其中該聚合物多孔質膜，係包含具有複數個孔的表面層A及表面層B與夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚合物多孔質膜，其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑小於存在於該表面層B的孔的平均孔徑，該巨孔層具有與該表面層A及B連結的分隔壁與由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的複數個巨孔，該表面層A及B中的孔與該巨孔連通； 其中在該殼體內， （i）2片以上獨立的該聚合物多孔質膜集中； （ii）該聚合物多孔質膜經摺疊； （iii）該聚合物多孔質膜捲成滾筒狀；及/或 （iv）該聚合物多孔質膜綁成繩狀； 而收納於其中。
- 如請求項1或2之方法，其中該培養基流出入口的直徑大於細胞的直徑且小於該聚合物多孔質膜流出的直徑。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該殼體具有網格狀的結構。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該殼體係由非可撓性材料所構成。
- 如請求項1至5中任一項之方法，其中該聚合物多孔質膜具有平均孔徑0.01～100μm的複數個細孔。
- 如請求項2至6中任一項之方法，其中該表面層A的平均孔徑為0.01～50μm。
- 如請求項2至7中任一項之方法，其中該表面層B的平均孔徑為20～100μm。
- 如請求項1至8中任一項之方法，其中該聚合物多孔質膜的總膜厚為5～500μm。
- 如請求項1至9中任一項之方法，其中該聚合物多孔質膜為聚醯亞胺多孔質膜。
- 如請求項10之方法，其中該聚醯亞胺多孔質膜係包含由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯亞胺的聚醯亞胺多孔質膜。
- 如請求項10或11之方法，其中該聚醯亞胺多孔質膜，係在使包含由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯胺酸溶液與著色前驅物的聚醯胺酸溶液組成物成形後，以250℃以上進行熱處理所得到的經著色之聚醯亞胺多孔質膜。
- 如請求項1至12中任一項之方法，其中該培養細胞的步驟係在靜置培養條件下進行。
- 如請求項1至12中任一項之方法，其中該培養細胞的步驟係在旋轉培養或攪拌條件下進行。
- 如請求項1至14中任一項之方法，其中該培養細胞的步驟係連續進行。
- 如請求項1至15中任一項之方法，其中該培養細胞的步驟，係在設置於恆溫箱內的細胞培養裝置中進行，其中，該細胞培養裝置包含：培養單元，其收納載持細胞的該細胞培養模組，並具備培養基供給口及培養基排出口；及培養基供給單元，具備培養基收納容器、培養基供給線、透過培養基供給線輸送培養基的送液泵，其中該培養基供給線的第一端部與該培養基收納容器內的培養基接觸，該培養基供給線的第二端部透過該培養單元的該培養基供給口連通至該培養單元內。
- 如請求項16之方法，其中該細胞培養裝置不具有培養基供給線、送液泵、空氣供給口、空氣排出口及透氧膜。
- 如請求項1至17中任一項之方法，其中該細胞係選自由多功能幹細胞、組織幹細胞、體細胞、生殖細胞、肉瘤細胞、株化細胞及轉型細胞所構成之群組。
- 如請求項1至18中任一項之方法，其中該細胞為人類間葉系幹細胞。
- 如請求項1至19中任一項之方法，其中該產生胞外體的步驟與該培養細胞步驟的至少一部分重複。
- 如請求項1至20中任一項之方法，其中該產生胞外體的步驟持續1個月、2個月、3個月或6個月或其以上的期間。
- 一種胞外體產生裝置，包含該細胞培養模組，用於如請求項1至21中任一項之方法。
- 一種套組，包含該細胞培養模組，用於如請求項1至21中任一項之方法。
- 一種用途，其係將該細胞培養模組用於如請求項1至21中任一項之方法。
- 一種胞外體，其係由包含該細胞培養模組之如請求項1至21中任一項之方法所取得。
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