TWI695685B - 培養液組成物及其作為益生素之用途 - Google Patents
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Abstract
自家禽製得之培養液組成物被證明藉由增強個體之益生菌微生物群而可充當益生素。本發明揭示自所選家禽原材料製備此等培養液組成物之方法及使用培養液組成物之方法。
Description
本申請案主張2015年1月26日申請之美國專利申請案62/108,008之優先權，該案之整體內容以引用的方式併入本申請案中。
本發明係關於營養及膳食補充劑之領域以及微生物學之一般領域。
已知微生物會在哺乳動物之胃腸道中增生繁殖。一些微生物對宿主具有特定益處。此等有益的微生物亦稱為「益生微生物」或「益生菌(probiotics)」。有益的細菌(或「好的」細菌)亦稱為「益生菌(probiotic bacteria)」。有些益生微生物自然性地存於宿主的腸道中。其他益生微生物則可藉由膳食補充劑引入至宿主中。
術語「益生素」一般係指會引發益生微生物(例如，細菌或真菌)之生長(及因此活菌計數或CFU)或活性之物質。然而，倘若不是全部，大多數益生素係以碳水化合物為基礎的，且可能包含來自各種植物來源之麩質。
本發明藉由提供自家禽製得之組成物來增進該技藝，該自家禽製得之組成物可用作益生素以增強個體微生物群。更特定言之，在一個實施例中，所揭示的益生素組成物係不含麩質的。
在一個實施例中，該組成物可自家禽諸如雞、火雞或其他鳥類製得。在另一實施例中，所揭示的組成物可使用來自其他動物來源之部位來製得。在另一實施例中，所揭示的組成物可呈培養液、原液、提取物或粉末之形式。
在另一實施例中，揭示藉由向個體投與有效量之自家禽部位製得之組成物增強個體中一或多種益生菌之方法。在一個態樣中，有效量為可有效增強個體中至少一種益生菌之量。在另一態樣中，增強益生菌意指改良個體之胃腸道(或腸)中益生菌之健康或增加個體之胃腸道(或腸)中益生菌之活菌計數(亦即，菌落形成單位或CFU)。可直接或間接地測量個體中細菌之CFU。間接測量可包括(但不限於)測量來自個體之糞便樣品中細菌之CFU。在一個態樣中，總體基因組序列計數之方法可用於測量樣品中細菌之CFU。
在另一實施例中，意欲投與的有效量可為培養液組成物之在將組成物投與個體後使得個體之腸中至少一種益生菌之活菌計數增加2至200倍、5至200倍、10至200倍、20至200倍或約200倍之量。在另一態樣中，有效量可為培養液組成物之增加個體之腸微生物群中至少一種益生菌之比率(或百分率)(亦即，選擇性地增加至少一種有益的益生菌之計數)之量。在另一態樣中，有效量可為培養液組成物之增加個體中腸微生物群之多樣性之量。
在一個實施例中，所揭示的培養液組成物可連續地以有效量每天投與個體持續1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或14天或更多天。在另一實施例中，該組成物可非連續地，例如，在4天、6天、8天、10天、12天、14天或更多天時間內每隔一天地投與個體。
在一個實施例中，根據所揭示的方法製得之組成物可具有更高濃度之特定有益組分。在一個態樣中，該等組成物可包含可溶性膠原纖維。就本發明之目的而言，術語「可溶性膠原纖維」用於指膠原蛋
白之在進行製備培養液之製程後可溶於培養液中之片段。在一個態樣中，該等片段可代表膠原蛋白之全部長度或部分長度。在另一態樣中，該等片段可包含衍生自膠原之小肽或單一胺基酸。在另一態樣中，可溶性膠原纖維之至少20%、30%、40%或至少50%包含20個或更多個胺基酸長之片段或肽。在另一態樣中，該等可溶性膠原纖維可在增強或提升個體中益生菌上充作益生素。在另一態樣中，該等可溶性膠原纖維主要係源自於家禽軟骨。在另一態樣中，該等可溶性膠原纖維可佔最終培養液組成物至少20%(w/w，以固體計)。在另一態樣中，該等可溶性膠原纖維可佔最終培養液組成物至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或至少90%(w/w，以固體計)或高達100%。在另一態樣中，該等可溶性膠原纖維可源自於I型、II型或III型膠原。
在另一實施例中，某些有益的化合物可在相比其他的目前可在市場上取得之培養液產品更大的程度上富含於所揭示的組成物中。
在另一實施例中，培養液中可補充一或多種成分以達成某些一般與雞培養液無關之益處。此等補充劑之實例可包括(但不限於)薑、咖啡提取物、人參、綠茶、其他植物製劑(諸如柳皮或乳香)、薑黃素/薑黃、ω-3脂肪酸、魚油、磷蝦油、海藻油、法國碧蘿芷海岸松(Pycnogenol French maritime pine)樹皮提取物、葡萄籽提取物、亞麻籽提取物、核糖核酸酶、血管生長素、乳鐵蛋白、富含核糖核酸酶之乳鐵蛋白、S-腺苷甲硫胺酸、膠原、膠原蛋白(例如，I型、II型或III型膠原)或膠原肽、明膠、鱷梨/大豆未皂化物(ASU)、啤酒花之提取物、卵殼膜、衍生自乳之多肽(諸如酪蛋白或乳清)、MSM(甲基磺醯基甲烷)、絲蘭、爪鉤草、鳳梨酵素(Bromelain)、麩胺酸、可可、蕁麻、維生素E、維生素D3、核桃提取物等。在一個態樣中，所揭示的培養液可包含顯著量之膠原、膠原蛋白及/或膠原肽。在另一態樣中，顯著量之膠原、膠原蛋白及/或膠原肽可自然地存於所揭示的培
養液中。在另一態樣中，顯著量之膠原、膠原蛋白及/或膠原肽可作為補充劑添加至所揭示的培養液中。
在另一實施例中，根據所揭示的方法，先鑑別需要增加益生菌之計數之個體，然後向該個體投與培養液組成物。此等需要所揭示的培養液組成物之個體可包括(但不限於)其胃腸系統中具有不平衡微生物群之其等個體及需要某些所需益生菌諸如產生乳酸之細菌之更高數量(CFU)之其等個體。此等所需細菌之實例可包括(但不限於)乳桿菌(Lactobacillus)、假薩特氏菌(Parasutterella)、摩根氏菌(Morganella)、顫螺菌(Oscillospira)、糞球菌(Coprococcus)、顫桿菌(Oscillibacter)、奧德瑞菌(Odoribacter)、甘斯曲菲利斯菌(Gastranaerophilales)、阿拉菌(Allabaculum)或柔嫩梭菌(Faecalibacterium)。在另一實施例中，所需益生菌之一個實例可為鼠李糖乳桿菌。在另一實施例中，培養液組成物不僅提供作為營養物之蛋白質(及胺基酸)，而且提供呈膠原纖維之形式之蛋白質(及胺基酸)，其會幫助增加個體之腸微生物群中益生菌之數量及百分率。因此，在本發明之一個態樣中，投與所揭示的培養液組成物可免除對連續補充益生菌否則將必須定期服用益生補充劑之個體之需求。術語「定期」意指每月至少一次、每週一次或每天至少一次。
就本發明之目的而言，術語「增強」意指增加微生物之生長(及因此活菌計數或CFU)或活性。在一個實施例中，所揭示的組成物可增強一或多種在個體中為天然之益生菌。術語「天然」意指天然存在於個體之腸中之微生物。在另一實施例中，所揭示的組成物可增強一或多種在個體中為非天然之益生菌。天然或非天然益生菌均可補充給個體。
在一個態樣中，所揭示的組成物可經口投餵投與個體。在另一態樣中，所揭示的組成物可與一或多種益生菌一起投與。在另一態樣
中，可將所揭示的組成物與一或多種益生菌混合且呈混合物投與個體。
在另一態樣中，可根據本文中所揭示的方法製備益生素組成物且接著製備呈意欲呈膳食補充劑服用之液體或固體(例如，粉末)形式。
在一個實施例中，該一或多種藉由所揭示的組成物增強的益生菌可包括至少一種產生乳酸之細菌。在另一實施例中，該產生乳酸之細菌可包括(例如)乳桿菌。在另一實施例中，該產生乳酸之細菌可包括鼠李糖乳桿菌。
在自製型蒸煮中，雞或火雞培養液可藉由在開放式容器中或在高溫下於加壓容器中蒸煮較長時間來製備。相反地，本發明提供具有獨特組成之培養液產品及製備該等培養液產品之方法。本文亦揭示選擇及製備原材料、蒸煮原材料、及分離並純化所得培養液之方法。
在一個實施例中，來自家禽或其他動物來源之原材料可大程度地粉碎化以最大化提取各種有益化合物。在一個態樣中，原材料可減小至小於約2cm、1cm、5mm、4mm、3mm、2mm或小於2mm之尺寸。在蒸煮之前機械處理家禽部位成較小尺寸顆粒可幫助最大化提取某些化合物。在另一實施例中，因為家禽部位在蒸煮之前已經過機械處理成極小尺寸顆粒，故可採用更溫和的蒸煮條件(例如，60至100℃之溫度)及更短的蒸煮時間(約8分鐘至300分鐘)以自經處理之家禽部位獲得培養液。此種溫和且較短暫之蒸煮可幫助防止某些否則若採用習知的處理及蒸煮方法則將失活之化合物失去活性。此等化合物之保存可解釋當所揭示的培養液對比其他的不依照本發明所揭示的方法製得之培養液產品測試時所觀察到的優異效益。
在另一實施例中，具有骨骼及軟骨之家禽部位可經機械分離並粉碎化成尺寸小於5mm(毫米)、4mm、3mm、2mm或1mm的小塊。
在一個態樣中，未進行自骨骼除去殘餘肉的步驟。此等小塊可在約70℃、100℃、110℃、120℃或高達150℃下蒸煮至少8分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時或6小時或更長時間以最大化提取某些培養液部分及/或化合物。
在另一實施例中，根據所揭示的方法製得之培養液當藉由SDS-PAGE分析時展示與彼等自其他市售培養液產品獲得者不同的蛋白質譜。在一個態樣中，所揭示的組成物中總蛋白質之至少10%、20%、30%、40%、50%、70%或90%具有介於10kD(千道爾頓)與70kD之間之分子量。在另一態樣中，所揭示的組成物中蛋白質之至少95%具有小於100kD之分子量。在另一態樣中，該等方法可用於進一步減小培養液中蛋白質之分子量至小於10kD、5kD或甚至小於3kD以增強個體同化。例如，一或多種消化蛋白質之酵素可用於減小培養液中蛋白質之分子量。
在另一實施例中，所揭示的組成物可包含至少40%蛋白質(以總固體之重量計)。例如，所揭示的組成物可包含50%、60%、70%或80%或80%以上蛋白質(以組成物中總固體之重量計)。在另一實施例中，所揭示的組成物可包含小於10%碳水化合物(以總固體之重量計)。例如，所揭示的組成物可包含8%、5%、2%或1%或1%以下碳水化合物(以組成物中總固體之重量計)。在另一實施例中，所揭示的組成物係自動物來源製得且不含任何來自植物來源之蛋白質。在另一實施例中，所揭示的益生素組成物不含可檢測量之麩質。在另一實施例中，所揭示的益生素組成物不含將引起對麩質敏感或過敏的個體中不良反應之顯著量之麩質。
在另一實施例中，所揭示的組成物可包含胺基酸脯胺酸及組胺酸，其中脯胺酸與組胺酸之比為至少4：1(以重量計)。在一個態樣中，脯胺酸以固體計至少8%(w/w)、10%或10%以上存在於組成物中。在
另一態樣中，脯胺酸與組胺酸之比為至少6：1(以重量計)。
在另一實施例中，所揭示的組成物可包含胺基酸甘胺酸及組胺酸，其中甘胺酸與組胺酸之比為至少6：1(以重量計)。在一個態樣中，甘胺酸以固體計至少12%、14%或14%以上(w/w)存在於所揭示組成物之總胺基酸中。在另一態樣中，甘胺酸與組胺酸之比為至少10：1(以重量計)。
在另一實施例中，所揭示的組成物可包含胺基酸羥脯胺酸及組胺酸，其中羥脯胺酸與組胺酸之比為至少4：1(以重量計)。在一個態樣中，羥脯胺酸以固體計至少7%、8%或8%以上(w/w)存在於組成物之總胺基酸中。在另一態樣中，羥脯胺酸與組胺酸之比為至少6：1(以重量計)。
在另一實施例中，所揭示的組成物可包含脯胺酸、甘胺酸、羥脯胺酸及組胺酸。在一個態樣中，甘胺酸與組胺酸之比為至少6：1(以重量計)。在另一態樣中，甘胺酸係以至少12%(w/w)(以固體計)存於組成物中。在另一態樣中，脯胺酸與組胺酸之比為至少4：1(以重量計)。在另一態樣中，羥脯胺酸與組胺酸之比為至少6：1(以重量計)。
在另一實施例中，所揭示的組成物可包含脯胺酸及其他胺基酸，及脯胺酸的量為組成物中總胺基酸之至少8重量%、10重量%或10重量%以上。在另一實施例中，所揭示的組成物可包含甘胺酸及其他胺基酸，及甘胺酸的量為組成物中總胺基酸之至少20重量%。在另一實施例中，所揭示的組成物可包含羥脯胺酸及其他胺基酸，及羥脯胺酸的量為組成物中總胺基酸之至少8重量%。
在另一實施例中，所揭示的組成物可包含一或多種分支鏈胺基酸(BCAA)(例如，纈胺酸、白胺酸及異白胺酸)，及該等組成物中之BCAA係以相比其他培養液產品中BCAA之水平更高的水平存在。在一個態樣中，總BCAA(包括纈胺酸、白胺酸及異白胺酸)的量為組成
物中總胺基酸之至少5重量%、6重量%或7重量%。
在另一實施例中，根據本發明製得之培養液產品可具有介於999：1與1：999之間或介於200：1與10：1之間之水分蛋白質比(MPR)。例如，200：1之MPR意指產品含有200份水及1份肉(蛋白質)。在另一實施例中，根據本發明製得之培養液產品可具有介於150：1與40：1之間或介於135：1與67：1之間之水分蛋白質比(MPR)。
硫酸軟骨素(CS)係於軟骨中富含且已報告有益於關節健康。原材料之選擇及製備培養液之方法可造成所揭示的組成物中硫酸軟骨素之水平相對高的結果。在本發明之一個實施例中，培養液組成物可包含如藉由使用酵素消化及LC-UV檢測分析測得之以組成物中總乾固體之重量計至少6%、7%、8%或10%硫酸軟骨素。參見，例如，Ji等人，Journal of AOAC International，第90卷，第3期，659-69(2007)，其係以引用的方式併入本發明中。
在一個態樣中，該組成物可呈可準備消耗之液體形式或其可呈濃縮液體形式，諸如原液。在另一態樣中，該組成物可呈固體形式，諸如粉末或膏劑。
在一個實施例中，該組成物可包含一或多種多元酚，其中基於福林-西奧卡特(Folin-Ciocalteu)分析，該多元酚之濃度為至少4,000μg/ml GAE(沒食子酸當量)。
在另一實施例中，該組成物可包含胺基酸甘胺酸、脯胺酸及羥脯胺酸，及其中甘胺酸佔組成物之總胺基酸至少12%(w/w)，脯胺酸佔至少8%(w/w)，及羥脯胺酸佔至少7%(w/w)。
益生菌在其被收穫及用作膳食補充劑之前通常生長於培養基上。在一個實施例中，所揭示的益生素組成物可用於培養益生菌。益生菌可生長於尤其包含所揭示的自家禽製得之益生素組成物之培養基上。在一個態樣中，所揭示的益生素組成物包含自家禽製得之可溶性
膠原纖維。
本文中所揭示之培養液組成物可藉由如本文中所述之獨特組成來表徵。培養液組成物亦可藉由製備其之方法來表徵。除此之外，所揭示的組成物在其可提供給個體之益處上亦具獨特性。個體可分成兩個組，一個組每天攝取(或消耗)有效量之所揭示的培養液產品，而另一個組攝取水或其他培養液產品。可接著測量各種指標物及在這兩個組間進行比較。
圖1展示糞便樣品之UPGMA(非加權算術平均對群法)樹狀圖。
圖2展示盲腸樣品之UPGMA樹狀圖。
圖3展示針對選擇代表藉由添加AAC1至飲食中受影響之物種之DNA帶所生成之DGGE(變性梯度凝膠電泳)譜。編號的帶指示可能的受關注區域。泳道如下：(1)腸-水；(2)盲腸-AAC1；(3)盲腸-市售產品；(4)盲腸-自製；(5)糞便-水；(6)糞便-AAC1；(7)糞便-市售產品。
圖4展示不同的雞培養液產品不會顯著地改變擬桿菌：厚壁菌比。
圖5展示AAC1係選擇用於下胃腸道中變形菌(Proteobacteria)。
圖6展示AAC1係選擇用於或供養下胃腸道中之乳桿菌(Lactobacillus)。
圖7展示AAC1係選擇用於或供養盲腸中之乳桿菌。
圖8展示AAC1增加腸中微生物群之多樣性。
雞湯及雞培養液用於人類消費已有幾個世紀。研究已證明雞湯或雞培養液之各種益處。根據習知的自製型方法，藉由在一鍋水中蒸煮整隻雞或大的雞部位一段較長時間製得雞湯或培養液。根據此種自製型方法製得之湯或培養液可因一些化合物可能會在蒸煮期間或處理期間喪失而無法最大化湯或培養液之促進健康之效應，而其他化合物
可不自雞部位提取。
在一個實施例中，本發明提供使用雞培養液作為益生素之方法。益生素與益生菌(亦即，所謂的「好的細菌」)的不同之處在於益生素不是活的生物體而是可供養或增強益生菌之成分。益生素通常繞過上消化道系統並在攝入之後完整到達腸。亦可能是益生素可影響上胃腸段中之細菌使得上胃腸段中之此等細菌開始發酵營養素，此繼而提供選擇性地供養腸下段中之「好的細菌」之代謝產物。一旦其等到達腸，益生素可在正常腸微生物群之發酵中發揮重要作用。發酵製程可刺激並促進「好的細菌」諸如乳桿菌之增殖。
如本文中所使用，術語「益生菌」可指許多的可呈補充劑由個體服用以使個體獲益之微生物。術語「益生菌」亦可指許多不同的自然存在於宿主體內並提供益處給宿主之微生物。此等所需細菌之實例可包括(但不限於)乳桿菌、假薩特氏菌、摩根氏菌、顫螺菌、糞球菌、顫桿菌、奧德瑞菌、甘斯曲菲利斯菌、阿拉菌或柔嫩梭菌。例如，已顯示許多乳桿菌對人類有益。亦已顯示柔嫩梭菌係抗發炎。參見「Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients.」美國國家科學院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America).105(43)：16731-6(2008)。
所揭示的方法可藉由在蒸煮之前處理雞部位及藉由控制處理溫度及蒸煮時間以最大化提取有益化合物而同時使因嚴苛的處理條件所致之活性之損失減至最低來幫助保持某些組分。
可依所揭示的方法處理自家禽特定選擇之原材料以獲得具有高蛋白質含量之培養液。某些胺基酸係以相比自製培養液或其他市售產品相對更高的濃度存在。在一個態樣中，如本文中所述的各種動物研究中所顯示，所揭示的培養液組成物可證明在增強宿主的益生菌之健
康中有效。在另一態樣中，所揭示的培養液組成物可增加宿主中益生菌之活菌計數。在另一態樣中，所揭示的培養液組成物可選擇性地增強特定微生物，但不增強其他微生物。在另一態樣中，所揭示的培養液組成物可增加宿主之腸中微生物之多樣性。
術語「培養液」及「湯」係指含有至少一種溶質之液體組成物及亦可用於指呈液體或固體形式中任一形式之即用形式、濃縮物、原液。
本發明之家禽培養液可包含顯著量之不同胺基酸。此等胺基酸可呈蛋白質之形式或呈游離胺基酸存於培養液中。總胺基酸不但包括呈蛋白質之形式存在之胺基酸而且包括彼等呈游離胺基酸存在者。就本發明之目的而言，培養液組成物中不同胺基酸之比係指總胺基酸之間之比。
如本文中所使用，術語「乾固體」或「固體」係指液體組成物之在自液體組成物移除所有游離液體之後留存的組分。就水性培養液而言，游離液體為水。
術語「投與」意指諸如藉由經口攝入遞送材料給個體。
術語「不可檢測」意指可以此種小的使得化學品或成分無法藉由當前可用分析儀器測量的量存在之化學品或成分。
術語「個體(subject)」或「個體(individual)」用於指哺乳動物，包括人類。
術語「實質上」意指至少10至20%。
以下實例僅提供用於闡釋實施例之目的而非意欲具限制性。原材料、試劑、化學品及其他材料作為例示性組分或試劑呈現，及可基於本發明範疇內之前述論述進行各種修改。除非本發明中另作指明，否則用於如實例中所述之系統及分析中之組分、試劑、方案及其他方
法僅用於闡釋之目的。
實例1 自火雞部位製備培養液
在該實例中，使用火雞部位以製備培養液及確定培養液之總體品質及潛在效益。簡言之，以機械方式分離生火雞及將各部位細磨為尺寸小於2mm以最大化提取。在蒸汽中溫和地烹煮火雞之該等小尺寸部位至195℉持續約15分鐘或更短。接著傾倒使培養液與不溶性部分分離。亦藉由離心式分離器自培養液移除培養液中的釋放脂肪。在市售蒸發器中濃縮培養液，冷凍，然後包裝待售。
實例2 自雞部位製備培養液
在該研究中，在高於250℉之溫度下於水中蒸煮含有雞骨頭及軟骨之斬碎雞部位6小時以上以最大化提取特定培養液部分及/或化合物。由此製程獲得之培養液命名為「AAC1」以用於內部參考。更特定言之，在大型市售不鏽鋼烹飪罐中於水中蒸煮移除主要肌肉後所殘留的經USDA檢驗之斬碎生雞骨頭。蒸煮後，藉由傾倒使液體培養液部分與雞固體分離。在市售蒸發器中濃縮培養液，接著噴霧乾燥並包裝在經標記容器中。
實例3 不同培養液之蛋白質及胺基酸譜之比較
蛋白質為由執行生物系統中多種功能(包括，例如，作用為酵素，促進細胞通訊，及對細胞提供結構支持)之胺基酸之一或多條鏈組成之大分子。人類以及其他動物自作為其飲食的一部分而攝入之蛋白質獲得必需胺基酸，因為其缺少合成必需胺基酸所需要的酵素。該研究的目標係相較於自製產品確定雞培養液AAC1中蛋白質之濃度及尺寸範圍。
將根據本發明製備之一個樣品(AAC1)與根據自製型蒸煮方法製備(自製)之另一樣品進行比較。AAC1之固體百分比(w/v)為8%固體，而自製樣品之百分比(w/v)為1.7%固體。
在藉由布雷德福德(Bradford)法測定蛋白質含量之前，在蒸餾水中將各樣品稀釋至最終1% w/v溶液。使用牛血清白蛋白(0至3.5μg/μL)製作標準曲線。一式三份地分析所有樣品。使用板讀數器在595nm之波長下測定總蛋白質含量。結果顯示於表1中。
為校正AAC1(8%)及自製(1.7%)樣品之固體百分比差，AAC1及自製之基於1%溶液之蛋白質值乘以其各自的起始固體%。AAC1及自製之總蛋白質之最終調整含量顯示於表2中。
為測定各樣品之蛋白質譜，將等體積的AAC1及自製樣品(15.6μl)各與Laemmli氏樣品緩衝液及還原劑混合，在95℃下加熱5分鐘，且於4至12% Bis Tris凝膠上分離。藉由與市售蛋白質標準物(範圍自4.5kDa至300kDa)比較來確定蛋白質之相對尺寸範圍。對凝膠施加150V的恆定電壓30分鐘，允許各樣品中之蛋白質分離。使用SimplyBlueTM SafeStain在凝膠中視覺化蛋白質。
結果顯示於圖1中。泳道1顯示自製培養液之蛋白質譜，泳道2顯示AAC1培養液之蛋白質譜，及泳道3為分子量標準物。基於該等蛋白質譜，AAC1由比自製產品多約3倍的蛋白質組成。自製產品中之蛋白
質展現更寬廣範圍之分子量分佈，包含大(高達約300至500kD)及小蛋白質(約5至15kD)二者。相反，AAC1中之大多數(亦即，大於50%)蛋白質具有介於70kDa與15kDa之間之分子量。
亦分析個別胺基酸含量。下表3顯示根據所揭示的方法製得之培養液組成物與彼等利用自製型法製得者以及其他市售產品相比之個別胺基酸含量。
實例4 不同培養液中硫酸軟骨素(CS)水平之比較
硫酸軟骨素(CS)為在軟骨中發現的重要結構化合物及與關節健康相關。已證實CS可降低許多發炎介體諸如iNOS、PGE2、COX-2(Gwendolyn,Spine 2011)及NFkB(Vallières,Osteoarthritis Cartilage,2010)的水平。該研究的目標係確定各種雞培養液樣品中CS的含量。利用酵素消化及LC-UV檢測(Ji,Journal of AOAC International,2007)分析雞培養液之總CS。結果計算為相較於標準樣品之曲線上面積及定量的限值為8mg硫酸軟骨素/g乾物質(表4)。在所測試的所有雞培養液中，AAC1具有最大含量的CS(8.797% w/w)。
實例5 不同雞培養液中多元酚之濃度之比較
利用改良的福林-西奧卡特(Folin-Ciocalteau)法(Slinkard,American Journal of Enology and Viticulture,1977)測定不同雞培養液中多元酚之濃度。多元酚為一類已知具有抗氧化及抗發炎性質之化學化合物。雖然AAC1及自製培養液二者均含有多元酚，但AAC1含有4828.8μg/mL GAE多元酚，該多元酚之GAE相比由相同類型之雞部位製得之自製培養液(687.7μg/mL GAE)多約7倍。
實例6 培養液投餵對下胃腸道中腸微生物群之效應
將各種培養液組成物投餵給齧齒動物且在第0天(基礎)及第14天收集糞便樣品。採用變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradient gel electrophoresis；DGGE)以分析微生物譜之改變。所測試的培養液組成物包含：所揭示的培養液AAC1、水(作為陰性對照組)、自製型培養液及市售培養液產品。比較動物投餵不同培養液組成物後的第0天及第14天之腸微生物群之DGGE譜。
所有基礎樣品均顯示相對高的相似度。至多地，AAC1及水群組之基礎樣品之間存在9%差異。所有基礎樣品之間之平均差異為6.1%。各種雞培養液之引入以及兩週的時間期導致該等樣品之間額外的差異性。至多地，AAC1與市售培養液產品有15%差異。相反地，自製培養液產品與水及市售培養液之間有9%差異。所有樣品之間之平均差異為12%。
所有樣品於第0天(基礎)及第14天時間點之間在組成上會變化。例如，水對照組在第0天(基礎)及第14天之間之差異為7%。此7%改變證實在兩週時間期內相對穩定之腸微生物群及充作一極佳對照組。第14天時間點所有樣品與基礎樣品之間之平均變異數為13.5%。
將不同譜分組並基於DGGE中之顯帶相似性(亦即，存在/不存在DNA顯帶)歸類。接受AAC1雞培養液之動物與接受水或其他兩種培養液之動物相比時，其腸微生物群發生明顯移位。圖1中最明顯地證實該結果，因為階層式分群法顯示在投餵AAC1之動物中所觀察到的歧異對於該投與具獨特性。在第14天投餵AAC1之動物不與任何基礎或其他第14天群組集群。此點指明AAC1培養液引起齧齒動物腸微生物群中獨特的移位。圖1底部的標度指明集群之間之相似性百分比。
實例7 培養液投餵對盲腸中腸微生物群之效應
亦在第14天收集各投餵組之盲腸樣品並根據上述相同方案進行分析。雖然在糞便中發現的許多微生物亦在盲腸中被發現，但盲腸中
之內含物提供另一針對腸微生物群及任何相關的因器官之不同功能/條件而在動物中發生之改變之調查。盲腸分析的缺點在於必須殺死動物以用於收集，及因此未採集基礎樣品。盲腸材料之DGGE分析顯示投餵水、自製及市售培養液之動物之間之高相似度(所有三個樣品之間之差異平均在4.6%)。有趣的是，AAC1組與水、自製及市售培養液組之間之差異超過14%。
將不同譜分組並基於DGGE中之顯帶相似性(亦即，存在/不存在顯帶)歸類。圖2底部的標度指明集群之間之相似性百分比。
盲腸材料之分析結果映射糞便樣品之分析結果。雖然未取得關於盲腸微生物群之組成之基線資訊，但14天攝入AAC1培養液產生出獨特的盲腸組成物(圖2)。
為了試圖比較糞便及盲腸材料之間之移位，建立圖3之凝膠。該凝膠允許跨所有盲腸及所選糞便樣品直接比較。根據該結果，選擇十一個受關注區域，各區域對應於一個獨特的細菌物種。自顯帶直接定序DNA可識別由於AAC1攝入而改變之若干物種(表5)。由於腸微生物群之巨大多樣化的緣故，無法識別若干物種，因為其等在先前從未進行表徵。
受到特殊關注的序列為顯帶三，其經識別為鼠李糖乳桿菌。該物種僅在接受AAC1培養液之動物之盲腸內含物中發現。鼠李糖乳桿菌為受歡迎的市售益生菌，但亦為腸微生物群之天然駐留者。若干研究已指明許多效益與鼠李糖乳桿菌之某些菌株之攝入相關聯。例如，研究已證實小鼠攝入鼠李糖乳桿菌可導致焦慮及壓力激素水平減少。
實例8 利用下一代定序以識別糞便樣品中之益生菌
在健康成人中，經識別之糞便微生物群的80%可分為三個主要門類：擬桿菌、厚壁菌及放線菌。厚壁菌與擬桿菌比被認為是腸微生物群組成及平衡之良好指標物。參見Ley等人(2006)。測量投餵不同培養液產品之齧齒動物群組之厚壁菌與擬桿菌比。如圖4中所顯示，不同組之間厚壁菌與擬桿菌比並未顯著改變。
糞便腸微生物群之譜充作下胃腸道中微生物群相之良好指標物。圖5顯示投餵不同培養液組成物之動物之下胃腸道中變形菌之相對量。AAC1選擇動物下胃腸道中之變形菌。亦測定投餵不同培養液組成物之動物之下胃腸道中乳桿菌之相對量。如圖6中所顯示，AAC1選擇(或具體而言維持)動物之下胃腸道中之乳桿菌。此外，一個菌屬柔嫩梭菌僅在投餵AAC1達14天之群組中發現，而未在其他群組或基礎測量中發現。三個菌屬假薩特氏菌、摩根氏菌及顫螺菌以在AAC1之14天後比基礎水平顯著更高的水平存在。
實例9 利用下一代定序以識別盲腸樣品中之益生菌
測定投餵不同培養液產品之齧齒動物之群組中盲腸微生物群之譜。如圖7中所顯示，AAC1選擇(或具體而言維持)動物盲腸中之乳桿菌。此外，四個菌屬奧德瑞菌、甘斯曲菲利斯菌、柔嫩梭菌及阿拉菌僅在投餵AAC1達14天之群組中發現，而未在其他群組或基礎測量中發現。三個菌屬乳桿菌、糞球菌及顫桿菌以在AAC1之14天後比基礎水平顯著更高的水平存在。一個菌屬腸單孢菌屬(Intestimonas)以在AAC1之14天後比基礎水平顯著更低的水平存在。
實例10 所揭示的組成物增強腸中之生物多樣性
NGS資料分析中之另一重要考量為生物多樣性。參考文獻中一般同意更多樣化的腸微生物群係有益。NGS分析中兩種最常用的生物多樣性測量為Chao及Shannon-Weiner指數。各指數產生出代表腸微生物
群多樣化程度之值。圖8證實投餵AAC1之動物中14天後的多樣化程度遠比投餵自製、另一市售產品之組及水對照組中之多樣化高。
採用符合政府法規及規章之已核可的方案進行本文中所述的所有動物研究。可在上述方法及系統中於不脫離其範疇下進行改變。因此，應注意包含於以上說明中或顯示於附圖中之物質應解釋為例示性而非以限制意義。隨後之申請專利範圍意欲包涵本文中所述之一般及特定特徵以及因語言之故可說是落在其間之本發明方法及系統之範疇之陳述。
雖然已利用具有特定各自定向之各種組分來說明上文所述之各實施例，但應明瞭如本發明中所述之系統及方法可採用各種組分處在多種位置及相互定向之多種特定組態且仍在本發明之精神及範疇內。另外，可改用適宜的等效物替代各種組分或在各種組分之外，此等替代物或額外組分之功能及用途為熟習此項技術者所熟悉及因此被認為落在本發明之範疇內。因此，本發明實例應視為係例示性而非限制性，且本發明不受限於本文中所給出的詳細內容但可在隨附申請專利範圍之範疇內進行修改。
本發明中引述的所有參考文獻(包括專利、專利申請案、科學論文及其他出版物)以引用的方式併入本申請案中。
本說明書中所引述或下文所列之所有參考文獻係以如同完全再現於本文的方式併入本發明中。
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Claims (16)
- 一種自家禽製得之組成物之用途，其係用以製備用於增強個體中一或多種益生菌之藥物，其中該藥物包含可有效增強該一或多種益生菌之量之組成物，且其中該組成物包含來自家禽之至少20%(w/w，以固體計)可溶性膠原纖維。
- 如請求項1之用途，其中該組成物包含佔至少40%總固體重量之蛋白質。
- 如請求項1或2之用途，其中該組成物包含佔少於10%總固體重量之碳水化合物。
- 如請求項1或2之用途，其中該組成物係每天以該有效量投與該個體達至少14天。
- 如請求項1或2之用途，其中該增強益生菌之有效量為當該組成物於投與給該個體時可增加該個體胃腸系統中該一或多種益生菌之活菌計數的量。
- 如請求項1或2之用途，其中該組成物增加該個體胃腸系統中之微生物多樣性。
- 如請求項1或2之用途，其中該一或多種益生菌包括產生乳酸之細菌。
- 如請求項1或2之用途，其中該組成物係在與未接受該組成物的可比擬個體比較時增加該個體之胃腸系統中該一或多種益生菌之活菌計數，該一或多種益生菌包括至少一個選自由假薩特氏菌(Parasutterella)、摩根氏菌(Morganella)、顫螺菌(Oscillospira)、柔嫩梭菌(Faecalibacterium)及其組合組成之群之成員。
- 如請求項1或2之用途，其中該組成物增加該個體之腸之上段或 中段中一或多種益生菌之活菌計數，該至少一種益生菌包括至少一個選自由乳桿菌(Lactobacillus)、糞球菌(Coprococcus)、顫桿菌(Oscillibacter)、奧德瑞菌(Odoribacter)、甘斯曲菲利斯菌(Gastranaerophilales)、柔嫩梭菌、阿拉菌(Allabaculum)及其組合組成之群之成員。
- 如請求項1或2之用途，其中該組成物增加該個體之腸之上段及中段中一或多種益生菌之活菌計數，該至少一種益生菌包括至少一個選自由乳桿菌(Lactobacillus)、糞球菌(Coprococcus)、顫桿菌(Oscillibacter)、奧德瑞菌(Odoribacter)、甘斯曲菲利斯菌(Gastranaerophilales)、柔嫩梭菌、阿拉菌(Allabaculum)及其組合組成之群之成員。
- 如請求項1或2之用途，其中該一或多種益生菌包括乳桿菌。
- 如請求項1或2之用途，其中該一或多種益生菌包括鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)。
- 如請求項1或2之用途，其中該組成物包含佔該組成物之總胺基酸重量至少7%(w/w)之羥脯胺酸佔。
- 如請求項1或2之用途，其中該組成物包含胺基酸甘胺酸、脯胺酸及羥脯胺酸，其中甘胺酸佔該組成物中總胺基酸之至少12%(w/w)，脯胺酸佔至少8%(w/w)，及羥脯胺酸佔至少7%(w/w)。
- 如請求項1或2之用途，其中該組成物不含可檢測量之麩質。
- 如請求項1或2之用途，其中該組成物係藉由包括以下步驟之方法自家禽部位製得：(a)在介於70℃與150℃之間之溫度下，在水中蒸煮雞塊約8分鐘至約24小時，該等雞塊係自整隻雞或雞部位製得，及(b)移去步驟(a)之不溶物以獲得呈液體形式之該組成物。
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