TWI668221B

TWI668221B - 用作布魯頓酪氨酸激酶抑制劑的化合物及其製備方法和用途

Info

Publication number: TWI668221B
Application number: TW106144341A
Authority: TW
Inventors: 李英富; 黃浩喜; 劉冠鋒; 陳垌琿; 任俊峰; 蘇忠海
Original assignee: 大陸商成都倍特藥業有限公司; 大陸商成都海博銳藥業有限公司
Priority date: 2017-01-20
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2019-08-11
Also published as: EP3572414A1; TW201827434A; CN106831787A; CN106831787B; EP3572414A4; US10793576B2; US20190315758A1; JP2020505323A; WO2018133151A1; JP6884863B2

Abstract

本發明提供了具有式(I)所示結構的化合物，或其異構體、藥學上可接受的溶劑化物、鹽，用作布魯頓酪氨酸激酶抑制劑，其對於BTK具有較高的抑制活性，同時具有較小的不良反應。

Description

用作布魯頓酪氨酸激酶抑制劑的化合物及其製備方法和用途

本發明涉及藥物化學技術領域，尤其涉及一種用作布魯頓酪氨酸激酶抑制劑的化合物及其製備方法和應用。

自從2012年美國血液學會會議中報導了依魯替尼對多種B細胞淋巴瘤有良好的治療效果之後，人們就已經認識到BTK作為一種非受體蛋白酪氨酸激酶家族的成員，是除了T淋巴細胞和自然殺傷細胞之外的所有造血細胞類型中表達的關鍵信號酶。在B細胞信號傳導途徑中扮演至關重要的角色，與B淋巴細胞發育、分化、信號傳遞和存活密切相關。BTK在B細胞受體(BCR)信號通路的重要作用，使其成為B細胞惡性腫瘤治療的熱門靶點。

雖然依魯替尼在治療慢性淋巴細胞白血病(CLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)和Waldenström巨球蛋白血症方面已經改善了某些惡性腫瘤的生存期，並且避免了傳統化療導致的多種副作用。但是在臨床給藥過程中，依然存在易被代謝、生物利用度低(僅僅7~23%)、臨床給藥量大(560mg/天，4片/次)、持續療程長(一個療程28天，有時候需要幾個療程)、服用短時間內就會產生很強的耐藥性等問題。

另外依魯替尼最常見的副作用主要是出血、感染、血細胞減少、心房顫動、第二原發性惡性腫瘤、腫瘤溶解綜合徵、胚胎或胎兒毒性等。以上的出血事件(如硬膜下血腫，胃腸道出血，血尿和後程序出血)發生率達6%，出血機制還不清楚；發生3或3級以上的感染概率為14%~26%；出現3或4級的血細胞減少，包括中性粒細胞減少(19%~29%)，血小板減少(5%~17%)和貧血(0~9%)；出現心房顫動和心房撲動的機率為6%~9%，尤其是心臟病患者，急性感染患者，房顫病史的患者；出現其他惡性腫瘤機率為5%~14%，包括非皮膚癌(1%~3%)，最常見的是非黑色素瘤皮膚癌(4%~11%)；經依魯替尼治療的患者出現過腫瘤溶解綜合徵。

所以進一步開發既能增加病人順應性、又能維持高效性、高安全性、且將不良反應最小化的新BTK抑制劑是十分必要的。

有鑑於此，本發明要解決的技術問題在於提供一種用作布魯頓酪氨酸激酶抑制劑的化合物及其製備方法和應用，製備的化合物與目前已經上市的依魯替尼相比，本專利公佈的一些布魯頓酪氨酸激酶抑制劑化合物具有較好的活性、更高的心臟安全性，尤其是在藥代方面，在動物口服後，不管是血藥濃度、暴露量、半衰期、口服生物利用度等參數都具有明顯的優勢。因此本專利公佈的布魯頓酪氨酸激酶抑制劑化合物具有廣泛的臨床應用前景。

定義和一般術語

本發明所述的“取代”，表示所給結構中的一個或多個氫原子被取代基所取代。當所給出的結構式中不止一個位置能被取代基所取代時，所述取代基可以相同或不同。上述取代基可以任選的被一個或多個相同或不同的次級取代基所取代。其中所述的次級取代基可以是，但並不限於，氟，氯，溴，碘，氰基，硝基，烷基，鹵素烷基，雜烷基，鏈烯基，炔基，羥基，巰基，氨基，醯胺基，烷氨基醯基，芳基，雜芳基等。所述雜烷基可以是，但不限於，羥基烷基，烷氧基烷基，氨基烷基，烷氨基烷基，氰基烷基，烷氧基，烷硫基等。

本發明所述的“含N螺環基團”表示兩個環共用一個碳原子，其中兩個環獨立的為碳環或雜環，且至少有一個為含N雜環。所述碳環和雜環可以獨立的被取代，其中取代基可以是，但並不限於，氟，氯，溴，碘，氰基，硝基，烷基，鹵素烷基、雜烷基，鏈烯基，炔基，羥基，巰基，氨基，醯胺基，烷氨基醯基，芳基，雜芳基等。所述雜烷基可以是，但不限於，羥基烷基，烷氧基烷基，氨基烷基，烷氨基烷基，氰基烷基，烷氧基，烷硫基等。

本發明所述的“含N橋環基團”表示共用兩個或兩個以上碳原子的雙環或多環雜環化合物。所述雜環化合物可以被取代，其中取代基可以是，但並不限於，氟，氯，溴，碘，氰基，硝基，烷基，鹵素烷基、雜烷基，鏈烯基，炔基，羥基，巰基，氨基，醯胺基，烷氨基醯基，芳基，雜芳基等。所述雜烷基可以是，但不限於，羥基烷基，烷氧基烷基，氨基烷基，烷氨基烷基，氰基烷基，烷氧基，烷硫基等。

如本發明所描述的，取代基用化學鍵連接到環上形成的環體系(如下圖所示)，代表取代基在環上任何可取代的位置都可以取代。例如，式a表示R₁可取代螺環基團上任何可能被取代的位置，即1~7的任意位置，如式b所示。

橋原子用化學鍵連接到環上形成的環體系(如下圖所示)，代表橋原子可與環上任意可連接的C原子或雜原子連接。例如式c表示橋原子E可與六元環上任意的可連接橋原子的C原子或雜原子連接，即1~3的任意位置，當X或Q為N或C時，橋原子E也可以與X或Q連接，如式d所示。

化學鍵直接連接到環上，並用彎線打斷(如圖e所示)，表示該化學鍵連接有取代基，並且可以位於任意可被取代的位置。例如式e表示取代基可以位於1~3的任意位置，當X或Q為N或C時，取代基可以與X 或Q相連。

本發明所述的“異構體”指，本發明所描述的結構式包括其所有的同分異構形式(如鏡像異構，非鏡像異構，和幾何異構(或構象異構))：例如含有不對稱中心的R、S構型，雙鍵的(Z)、(E)異構體，和(Z)、(E)的構象異構體。因此，本發明的化合物的單個立體化學異構體或其鏡像異構體，非鏡像異構體，或幾何異構體(或構象異構體)的混合物都屬於本發明的範圍。

本發明所述的“藥學上可接受的鹽”是指本發明的化合物的有機酸鹽和無機酸鹽。所述藥學上可接受的能與之成鹽的酸包括但不限於鹽酸、硫酸、磷酸、氫溴酸、硝酸、苯磺酸、對甲基苯磺酸、檸檬酸、L-脯氨酸、丁酸、羥乙酸、乙酸、已酸、壬酸、丙酸、蘋果酸、天門冬氨酸、丙二酸、琥珀酸、酒石酸、乙二磺酸、甲磺酸、富馬酸、苯甲酸、乳酸、丁二磺酸、已二酸、α-酮戊二酸、乳糖酸、馬來酸、1,5-萘二磺酸、水楊酸、乙醯水楊酸、2-萘磺酸、苯乙酸、煙酸、1-羥基-2-萘甲酸、樟腦酸、2-羥基乙磺酸、扁桃酸、苦味酸、肉桂酸或草酸等。

本發明所述的“溶劑化物”是指一個或多個溶劑分子與本發明的化合物所形成的締合物。形成溶劑化物的溶劑包括，但並不限於，水，異丙醇，乙醇，甲醇，丙酮、乙腈、四氫呋喃、異丙醚、二氯甲烷、二甲亞碸，乙酸乙酯，乙酸，氨基乙醇。

化合物

本發明提供的化合物，及其藥物製劑，對布魯頓酪氨酸激酶，尤其是BTK受體調節的疾病或病症的治療具有潛在的用途。其具有式(I)所示結構或其異構體、藥學上可接受的溶劑化物或鹽：其中，Y選自取代或非取代的芳基或雜芳基；R選自取代或非取代的烯基或炔基；M選自取代或非取代的含N螺環基團或含N橋環基團，且N原子與羰基相連；或者M選自式(Ⅱ)所示基團，A為取代或非取代的螺環基團或橋環基團，且氨基與羰基相連；

其中，M優選為取代或非取代的C5~15的含N螺環基團或含N橋環基團，更優選為取代或非取代的C5~12的含N螺環基團或含N橋環基團，進一步優選為取代或非取代的C5~C8的含N螺環或含N橋環基團。

在本發明的某些具體實施例中，所述M選自以下任一基團：其中，n₁、n₂、m獨立的為0、1或2；n為1、2或3；X、Q獨立的選自CR₂R₃、N-R₄、O、S或S(O)₂； R₁、R₂、R₃、R₄獨立的選自H、取代或未取代C1~10烷基，取代或未取代C1~10雜烷基，C1~10羰基基團，取代或未取代C3~10環烷基，取代或未取代C3~10雜環烷基。

優選的，R₁、R₂、R₃、R₄獨立的選自H、取代或未取代C1~8烷基，取代或未取代C1~8雜烷基，C1~8羰基基團，取代或未取代C3~8環烷基，取代或未取代C3~8雜環烷基。

進一步的，R₁、R₂、R₃、R₄獨立的選自H、取代或未取代C1~3烷基，取代或未取代C1~3雜烷基，C1~3羰基基團，取代或未取代C3~6環烷基，取代或未取代C3~6雜環烷基。

更優選的，R₁、R₂、R₃、R₄獨立的選自H、氟、氯、溴、碘、羥基、巰基、氰基、氨基、甲基、乙基、三氟甲基、乙醯基、異丙基、三氟乙醯基、異丁基、環丙基、環氧丁基。

上述R₁、R₂、R₃、R₄還可以被次級取代基取代，所述次級取代基可以是，但並不限於，氟，氯，溴，碘，氰基，硝基，烷基，鹵代烷基、雜烷基，鏈烯基，炔基，羥基，巰基，氨基，醯胺基，烷氨基醯基，芳基，雜芳基等。所述雜烷基可以是，但不限於，羥基烷基，烷氧基烷基，氨基烷基，烷氨基烷基，氰基烷基，烷氧基，烷硫基等。

在本發明另外一些具體實施例中，所述M選自以下基團：其中，P選自CR₅R₆，N-R₇或O；R₇為取代或非取代C1~8烷基，取代或非取代C1~8雜烷基，取代或未取代C3~8環烷基，取代或未取代C3~8雜環烷基，或；優選的，R₇為取代或非取代C1~6烷基，取代或非取代C1~6雜烷基，取代或未取代C3~6環烷基，取代或未取代C3~6雜環烷基，或。

更優選的，R₇為H、氰基、甲基、乙基、異丙基、乙醯基、三氟乙醯基、環丙基或環氧丁基。

R₅、R₆、R₈獨立的選自取代或非取代C1~8烷基，或取代或非取代C1~8雜烷基，取代或未取代C3~8環烷基，取代或未取代C3~8雜環烷基；優選的，R₅、R₆、R₈獨立的選自取代或非取代C1~6烷基，或取代或非取代C1~6雜烷基，取代或未取代C3~6環烷基，取代或未取代C3~6雜環烷基。

更優選的，R₅、R₆、R₈獨立的選自H、氟、氯、溴、碘、羥基、巰基、氨基、甲基、乙基、三氟甲基、乙醯基、異丙基、三氟乙醯基、異丁基、環丙基或環氧丁基。

上述R₅、R₆、R₇、R₈還可以被次級取代基取代，所述次級取代基可以是，但並不限於，氟，氯，溴，碘，氰基，硝基，烷基，鹵代烷基、雜烷基，鏈烯基，炔基，羥基，巰基，氨基，醯胺基，烷氨基醯基，芳基，雜芳基等。所述雜烷基可以是，但不限於，羥基烷基，烷氧基烷基，氨基烷基，烷氨基烷基，氰基烷基，烷氧基，烷硫基等。

在本發明的另外一些具體實施中，所述M選自以下具體基團：

所述R為取代或非取代的烯基或炔基。優選為以下基團：其中，R’為H、取代或非取代的C1~8烷基、取代或非取代的C1~8雜烷基，取代或非取代的C1~8環烷基或取代或非取代的C1~8雜環烷基；優選的，R’為H、取代或非取代的C1~6烷基、取代或非取代的C1~6雜烷基，取代或非取代的C1~6環烷基或取代或非取代的C1~6雜環烷基；更優選的，R’為H、甲基、乙基、N,N-二甲氨基甲基、N-甲基-N-環丙基甲基、甲氧基甲基、乙氧基甲基、三氟甲氧基甲基、N,N-二環丙基甲基或N-甲基-N-乙基甲基。

R”為H、硝基、氟、氯、溴、碘或氰基。

所述Y為取代或非取代的芳基或雜芳基，優選為取代或非取代的C5~10的芳基或雜芳基，更優選為取代或非取代的C6~8的芳基或雜芳基。

當所述Y選自取代苯基時，所述苯基的取代基選自取代或非取代醯胺基團、取代或非取代烷基、取代或非取代醚基。

在本發明的某些具體實施例中，所述Y選自以下基團：所述取代基可以位於鄰位、間位或對位。

其中，R₉為三氟甲基或甲基；R₁₀，R₁₁和R₁₂獨立的選自取代或非取代的芳基或雜芳基。

優選的，R₁₀，R₁₁和R₁₂獨立的選自取代或非取代的C5~10的芳基或雜芳基，更優選的，R₁₀，R₁₁和R₁₂獨立的選自取代或非取代的C5~8的芳基或雜芳基.

在本發明的某些具體實施例中，所述R₁₀，R₁₁和R₁₂獨立的選自取代或非取代的苯基、吡啶基、呱啶基、呱嗪基或嘧啶基；上述基團的取代基選自硝基、羥基、巰基、氟、氯、溴、碘、氰基、取代或非取代C1~10烷基、取代或非取代C1~10雜烷基，取代或未取代C3~10環烷基，取代或未取代C3~10雜環烷基。

所述A為取代或非取代的螺環基團或橋環基團，優選為取代或非取代的C6~15的螺環基團或橋環基團。在本發明的某些具體實施例中，所述A為金剛烷基。

在本發明的某些具體實施例中，所述Y為取代或非取代的2-氨基吡啶基苯甲醯胺基團，M為C5-10的螺環或橋環基團，R為乙烯基或丙炔基。在本發明的某些具體實施例中，所述Y的吡啶基團上的H可以任選的被氟、氯、溴、碘、甲基或三氟甲基取代，所述取代可以為鄰位取代、間位取代或對位取代。

在本發明的另外一些具體實施例中，所述Y為二苯基乙醇基團，M為C5-10的螺環或橋環基團，R為乙烯基或丙炔基；在本發明的另外一些具體實施例中，所述Y為二苯醚基團，M為C5- 10的螺環或橋環基團，R為乙烯基或丙炔基；在本發明的另外一些具體實施例中，所述Y為2-氨基吡啶基苯甲醯胺基團，M為C5-10的橋環基團，R為乙烯基；在本發明的另外一些具體實施例中，所述Y為二苯基乙醇基團，M為C5-10的橋環基團，R為乙烯基；在本發明的另外一些具體實施例中，所述Y為二苯醚基團，M為C5-10的橋環基團，R為乙烯基；在本發明的另外一些具體實施例中，所述Y為三氟甲基取代的2-氨基吡啶基苯甲醯胺基團，M為C5-10的橋環基團，R為乙烯基。

在本發明的某些具體實施例中，所述化合物具有以下任一結構或其立體異構體或順反異構體：

本發明還提供了上述化合物的製備方法，包括以下步驟：1)以2-氯吡嗪為原料，在鹼性化合物作用下，反應生成3-氯-2-吡嗪甲醇；2)將3-氯-2-吡嗪甲醇透過蓋布瑞爾合成法生成(3-氯吡嗪-2-基)甲胺； 3)將(3-氯吡嗪-2-基)甲胺與式(Ⅲ)所示的螺環羧酸或橋環羧酸進行反應，製備得到醯胺類化合物；4)將醯胺類化合物在三氯氧磷的作用下進行閉環反應，然後經NBS溴代，得到式(Ⅳ)所示化合物；5)將上述式(Ⅳ)所示化合物在醇和氨水的作用下，發生氨基化反應；6)將上述氨基化反應後的產物與式(V-1)所示硼酸或式(V-2)所示硼酸酯透過Suzuki偶聯反應，得到式(Ⅵ)所示化合物；7)將上述式(Ⅵ)所示化合物與取代的或未取代的2-丁炔酸在縮合劑作用下發生縮合反應，得到式(I-1)所示化合物；或者將上述式(Ⅵ)所示化合物與3-氯丙醯氯或烯丙醯氯在堿的作用下透過直接縮合或者直接縮合後再消除氯化氫烯烴化的方式進行反應，得到式(I-2)所示化合物；或者將上述式(Ⅵ)所示化合物與式(Ⅶ)所示的烯酸類衍生物在縮合劑作用下進行反應，得到式(I-3)或式(I-4)所示化合物，R”分別為H或氟、氯、溴、碘；或者將上述式(Ⅵ)所示化合物與氰基乙酸或硝基乙酸在縮合劑的作用下得到醯胺化合物，然後再與式(Ⅷ)所示醛類化合物發生腦文格反應得到式(I-4)所示化合物；R”為硝基或氰基；M-COOH (Ⅲ)；上述Y、M、R’的範圍同上，在此不再贅述。

本發明還提供了一種藥物組合物，包括上述化合物或其鹽或上述製備方法製備的化合物或其鹽，以及藥學上可接受的載體，賦形劑，稀釋劑，輔劑，媒介物或它們的組合。

本發明還提供了上述化合物或上述製備方法製備的化合物或上述藥物組合物在製備用於治療或減輕BTK介導的疾病的藥物中的應用。

在本發明的某些具體實施例中，所述BTK介導的疾病選自免疫、自身免疫、炎症疾病、過敏症、感染性疾病、增生性病症和癌症疾病中的任意一種或多種。

在本發明的另外一些具體實施例中，所述BTK介導的疾病選自風濕性關節炎、感染性關節炎、致畸性關節炎、痛風性關節炎、脊椎炎、胰腺炎、慢性支氣管炎、急性支氣管炎、過敏性支氣管炎、毒性支氣管炎、兒科哮喘、變應性肺泡炎、過敏性或非過敏性鼻炎、慢性鼻竇炎、囊性纖維化或黏液黏稠病、咳嗽、肺氣腫、間質性肺病、肺泡炎、鼻息肉、肺水腫、各種原因的肺炎、紅斑狼瘡、全身性硬皮病、結節病、亞彌型漫性大B細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、慢性淋巴細胞淋巴瘤、結外邊緣帶B細胞淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞白血病(CLL)、B細胞幼淋巴細胞白血病、成熟B細胞的急性成淋巴細胞性白血病、17p缺失的慢性淋巴細胞白血病、Waldenström巨球蛋白血症、淋巴質漿細胞淋巴瘤、脾臟邊緣帶淋巴瘤、漿細胞性骨髓瘤、漿細胞瘤、結內邊緣帶B細胞淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤和原發性滲出性淋巴瘤中的一種或多種。

本發明上述化合物或組合物在應用於製備用於治療或減輕BTK介導的疾病的藥物時，可以單獨使用，或與其他藥物聯合使用。

與現有技術相比，本發明提供了具有式(I)所示結構的化合物，或其異構體、藥學上可接受的溶劑化物、或其鹽，用作布魯頓酪氨酸激酶抑制劑，其對於BTK具有較高的抑制活性，同時具有較小的不良反應。

為了進一步說明本發明，下面結合實施例對本發明提供的用作布魯頓酪氨酸激酶抑制劑的化合物及其製備方法和應用進行詳細描述。

下面的縮寫具有如下所示的意義：DMF表示N,N-二甲基甲醯胺；NBS表示N-溴代丁二醯亞胺；DCM表示二氯甲烷；TEA表示三乙胺；THF表示四氫呋喃；TFA表示三氟乙酸；EA表示乙酸乙酯；PE表示石油醚；MeOH表示甲醇；EtOH表示乙醇；Et2O表示乙醚；DIEA表示N,N-二異丙基乙胺；HBTU表示苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽；TLC表示薄層層析法；KOAc表示乙酸鉀；X-phos表示2-二環己基磷-2,4,6-三異丙基聯苯；Pd₂(dba)₃表示三(二亞苄基茚丙酮)二鈀；Pd(pph₃)₄表示三苯基磷鈀；n-BuLi表示叔丁基鋰；EDCI表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；DIPEA表示N,N-二異丙基乙胺；2-BuOH表示異丁醇； STAB表示三乙醯氧基硼氫化鈉；DMSO表示二甲基亞碸；FAM表示羧基螢光素；ATP表示腺嘌呤核苷三磷酸；MEM表示minimum essential medium；FBS表示胎牛血清；IMDM表示Iscove’s Modified Dulbecco’s Media；PS表示Penicillin-Streptomycin Solution；RPMI 1640 medium表示Roswell Park Memorial Institute 1640培養基；HEPES表示4-(2-羥乙基)-1-呱嗪乙磺酸；EGTA表示乙二醇二乙醚二胺四乙酸；Na-ATP表示腺嘌呤核苷三磷酸鈉。

實施例1：(S)-4-(8-氨基-3-(5-(2-丁炔醯基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

合成步驟如下所示：

步驟1：3-氯-2-吡嗪甲醇的製備

氮氣保護下，向裝有2,2,6,6-四甲基呱啶(72.8g，516.3mmol)的500mL乾燥的THF溶液中，在-78℃下慢慢滴加n-BuLi(346mL，553.7mmol，1.6mol/LTHF)，加畢，反應混合物自然升溫至0℃繼續攪拌反應20min，然後再把反應混合物降溫至-78℃，向反應混合物中逐滴滴加2-氯吡嗪(50g,436.3mmol)的THF(100mL)溶液，30min加完，反應混合物顏色由淺黃色變成深棕色，在-78℃下繼續攪拌反應10min。量取DMF(84ml，1092mmol)溶於THF(50mL)逐滴滴加到反應混合物中，控制反應體系溫度在-70℃~-78℃，10min加畢，再在-78℃下攪拌反應2h。然後向反應混合物中加入MeOH(800mL)，加畢，再向反應混合物中逐份加入NaBH₄(33g，868mmol)，加畢，待反應混合物自然升高到室溫並繼續攪拌2h，TLC顯示原料反應完全以後，反應液用飽和NH₄Cl淬滅，DCM(1L×3)萃取三次，有機相用水洗滌，無水Na₂SO₄充分乾燥，真空蒸發後透過矽膠柱(PE/EA=100/1~5/1)純化得到60g目標化合物，為黃色油狀物。

步驟2：2-((3-氯吡嗪-2-基)甲基)異吲哚啉-1,3-二酮的製備

在氮氣保護下，向裝有3-氯-2-吡嗪甲醇(60g，414.9mmol)，三苯基膦(130.4g，497.9mmol)和鄰苯二甲醯亞胺(73.2g，497.9mmol)的500mL THF溶液中，在-5℃下慢慢滴加DIAD(100.6g，497.9mmol)，加畢，該反應混合物在20℃下攪拌3h，TLC顯示反應完成後，水加入反應混合物中然後用EA萃取(1L×3)，有機相用無水Na₂SO₄充分乾燥，真空蒸發後透過快速色譜法(PE/EA=30/1)純化得到90.8g目標化合物，為白色固體。

步驟3：(3-氯吡嗪-2-基)甲胺的製備

在氮氣保護下，向裝有2-((3-氯吡嗪-2-基)甲基)異吲哚啉-1，3-二酮(90g，328.5mmol)的DCM/MeOH(800mL/400mL)混合溶液中加入水合肼(41.1g，821.5mmol)；該反應混合物在室溫下攪拌過夜，反應體系中有大量白色固體生成，抽濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌，濾液濃縮，再抽濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌，濾液用無水Na₂SO₄充分乾燥，真空蒸發後得到38.2g目標化合物，為黃色油狀物。

步驟4：(S)-6-(((3-氯吡嗪-2-基)甲基)氨甲醯基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯的製備

在氮氣保護下，向裝有(3-氯吡嗪-2-基)甲胺(2.86g，20mmol)、(S)-5-叔丁氧羰基-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-羧酸(4.82g，20mmol)、HOBt(3.51g,26mmol)和TEA(3.64g，36mmol)的30mL DMF溶液中(0℃)逐份加EDCI(4.97g，26mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完全以後，加水淬滅反應，EA萃取(50mL×3)，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄充分乾燥，真空蒸發後透過柱層析(PE/EA=5/1~3/1)純化得到6.4g目標化合物，為黃色固體。

步驟5：(S)-6-(8-氯咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯的製備

冰鹽浴下，向裝有(S)-6-(((3-氯吡嗪-2-基)甲基)氨甲醯基)-5-氮雜螺 [2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯(6.3g，17.18mmol)的DMF/EA(7.5mL/50mL)混合溶液中慢慢滴加POCl₃(12.6mL，103.08mmol)，加畢，該反應混合物在室溫下攪拌2h，TLC顯示原料反應完全以後，將反應液慢慢加入Na₂CO₃(6mol/L)的溶液中，保持pH大於8，分出有機相，水相用EA(20mL x 3)萃取，合併上述有機相用無水Na₂SO₄充分乾燥，真空蒸發後透過柱層析(PE/EA=3/1)純化得到5.52g目標化合物，為白色固體。

步驟6：(S)-6-(1-溴-8-氯咪唑並[1,5-a]吡嗪苯-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯的製備

冰鹽浴下，向裝有(S)-6-(8-氯咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯(5.5g，15.77mmol)的50mL DMF溶液中逐份加入NBS(2.95g，16.56mmol)，該反應混合物在冰鹽浴下攪拌1h，TLC顯示原料反應完成以後，將反應液慢慢加入到NaHCO₃(1mol/L)溶液中淬滅反應，用EA(20mL×3)萃取，有機相用飽和NaCl洗滌，無水Na₂SO₄充分乾燥，真空蒸發後透過柱層析(PE/EA=5/1)純化得到6.07g目標化合物，為紅棕色固體。

步驟7：(S)-6-(8-胺基-1-溴咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯的製備

室溫下，向裝有(S)-6-(1-溴-8-氯咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯(5.5g，12.86mmol)的高壓反應器中加入15mL 2-BuOH和30mL氨水，該反應混合物在90℃攪拌反應15h，TLC顯示原料反應完全以後，將反應液真空濃縮得到固體粗產品，用EA/PE(5/1)打漿得純品3.94g目標化合物，為淺黃色固體。

步驟8：(S)-6-(8-氨基-1-(4-(吡啶-2-基氨甲醯基)苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯的製備

氮氣保護下，向裝有2-氨基吡啶(5g，53.19mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環-2-基)苯甲酸(13.20g，53.19mmol)、DIPEA(13.72g，106.38mmol)的50mL DMF(0℃)溶液中，逐份加入HBTU(26.21g,，69.15mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完全以後，向反應溶液中加入水淬滅，用EA(30mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過柱層析(PE/EA=20/1)純化得到13.1g目標化合物，為類白色固體。

氮氣保護下，向裝有(S)-6-(8-氨基-1-溴咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯(3.5g，8.57mmol)、N-(吡啶-2-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環-2-基)苯甲醯胺(3.33g，10.28mmol)、Na₂CO₃(1.82g，17.14mmol)的dioxane/EtOH/water(36mL/12mL/12mL)混合溶液中，加入Pd(PPh₃)₄(496.89mg,，0.43mmol)，該反應混合物在90℃下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完全以後，向反應溶液中加入水淬滅，用EA(40mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過柱層析(DCM/MeOH=60/1)純化得到2.71g目標化合物，為淡黃色固體。

步驟9：(S)-4-(8-氨基-3-(5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

向裝有(S)-6-(8-氨基-1-(4-(吡啶-2-基氨甲醯基)苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯(2.71g，5.16mmol)的DCM(20mL)溶液中，加入TFA(3mL)，該反應混合物在室溫下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完全以後，反應體系濃縮，用Na₂CO₃(3mol/L)調pH至8，用DCM/MeOH(10/1)萃取，有機相無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過柱層析(DCM/MeOH=60/1~10/1)純化得到1.98g目標化合物，為白色固體。

步驟10：a(S)-4-(8-氨基-3-(5-(2-丁炔醯基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

氮氣保護下，向裝有(S)-4-(8-氨基-3-(5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺(90mg，0.212mmol)、2-丁炔酸(19.6mg,0.233mmol)、DIPEA(82mg，0.636mmol)的DMF(3mL)溶液中，加入HBTU(96.4mg，0.254mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應1h，TLC顯示原料反應完全以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(10 mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到55mg目標化合物，為黃色固體。

採用核磁共振以及質譜對產物結構進行鑑定，結果如下：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 0.58-0.77(4H,m),1.58(1H,s),1.99 (2H,s),2.24-2.33(2H,m),3.51(0.4H,d,J=16.4Hz),3.61(0.4H,d,J=11.6Hz),3.61(0.6H,d,J=10.8Hz),3.84(0.6H,d,J=10.8Hz),5.56-5.59(0.6H,m),5.79-5.82(0.4H,m),6.14-6.20(2H,m),7.11-7.20(2H,m),7.73-7.79(2.6H,m),7.84-7.89(1.4H,m),8.16(2H,dd,J=8.4Hz,2.8Hz),8.23(1H,d,J=8.4Hz),8.41(1H,dd,J=4.8Hz,1.2Hz),10.85(1H,s).

EM(計算值)：491.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：492.2。

可見本申請製備得到的化合物與上述反應式中的化合物結構一致。

實施例2：(S)-4-(3-(5-丙烯醯基-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)-8-氨基咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

氮氣保護下，向裝有(S)-4-(8-氨基-3-(5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺(120mg，0.28mmol)、TEA(113.12mg,1.12mmol)的DCM(10mL)溶液中，0℃下逐滴加入3-氯丙醯氯(35.6mg，0.28mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完全以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(10mL×3)萃取，有機相無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=15/1)純化得到40mg目標化合物，為黃色固體。

採用核磁共振以及質譜對產物結構進行鑑定，結果如下：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 0.56-0.76(4H,m),2.24-2.26(1.5H,m),3.61-3.66(1.5H,m),3.87(1H,d,J=10.4Hz),5.60-5.68(2H,m),6.05-6.20(3H,m),6.55(1H,dd,J=16.8Hz,10.4Hz),7.11-7.20(2H,m),7.66-7.74(2H,m),7.83-7.88(2H,m),8.15(2H,d,J=8.4Hz),8.22(1H,d,J=8.4Hz),8.41(1H,d,J=3.6Hz),10.84(1H,s).

EM(計算值)：479.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：480.2。

可見本申請製備得到的化合物與上述化合物結構一致。

實施例3~21

採用以下化合物為原料，以實施例1或實施例2的製備方法，製備得到以下化合物，所述化合物的結構以及核磁鑑定資料見表1，表1是本申請實施例3~21製備的化合物結構以及結構分析資料匯總。

根據文獻Tetrahedron Letters 57(2016)599-602合成製備；根據文獻Tetrahedron Letters 57(2016)599-602合成製備；根據文獻Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14(2004)6107-6111合成製備；根據專利WO2014/140081A1合成製備；參照專利WO2011/35332合成製備；參照文獻Journal of Organic Chemistry；vol.59；nb.2；(1994)；p.276-277合成製備；其他關鍵中間體片斷均透過直接採購或定制合成。

實施例22：4-(3-((1R,3S,4S)-2-丙烯醯基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-基)-8-氨基咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

合成步驟如下所示：

步驟1：(1R,3R,4S)-3-(((3-氯吡嗪-2-基)甲基)胺甲醯基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯的製備

在氮氣保護下，向裝有(3-氯吡嗪-2-基)甲胺(3.43g，24mmol)、(1R,3R,4S)-2-(叔丁氧羰基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-羧酸(5.80g，20mmol)、HOBt(4.21g,31.2mmol)和TEA(4.37g，43.2mmol)的30mL DMF溶液中(0℃)逐份加EDCI(5.97g，31.2mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完全以後，加水淬滅反應，EA萃取(50mL×3)，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄充分乾燥，真空蒸發後透過柱層析(PE/EA=5/1~3/1)純化得到8.0g目標化合物，為棕色固體。

步驟2：(1R,3S,4S)-3-(8-氯咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯的製備

冰鹽浴下，向裝有(1R,3R,4S)-3-(((3-氯吡嗪-2-基)甲基)胺甲醯基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(6.3g，17.18mmol)的DMF/EA(7.5mL/50mL)混合溶液中慢慢滴加POCl₃(12.6mL，103.08mmol)，加畢，該反應混合物在室溫下攪拌2h，TLC顯示原料反應完全以後，將反應液慢慢加入Na₂CO₃(6mol/L)的溶液中，保持pH大於8，分出有機相，水相用EA(20mL x 3)萃取，合併上述有機相用無水Na₂SO₄充分乾燥，真空蒸發後透過柱層析(PE/EA=3/1)純化得到5.6g目標化合物，為黃色固體。

步驟3：(1R,3S,4S)-3-(1-溴-8-氯咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯的製備

冰鹽浴下，向裝有(1R,3S,4S)-3-(8-氯咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(4.95g，14.19mmol)的50mL DMF溶液中逐份加入NBS(2.66g，14.9mmol)，該反應混合物在冰鹽浴下攪拌1h，TLC顯示原料反應完成以後，將反應液慢慢加入到NaHCO₃(1mol/L)溶液中淬滅反應，用EA(20mL×3)萃取，有機相用飽和NaCl洗滌，無水Na₂SO₄充分乾燥，真空蒸發後透過柱層析(PE/EA=5/1)純化得到5.2g目標化合物，為淡黃色固體。

步驟4：(1R,3S,4S)-3-(8-氨基-1-溴咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯的製備

室溫下，向裝有(1R,3S,4S)-3-(1-溴-8-氯咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(4.4g，10.29mmol)的高壓反應器中加入15mL 2-BuOH和30mL氨水，該反應混合物在90℃攪拌反應15h，TLC顯示原料反應完全以後，將反應液真空濃縮得到固體粗產品，用EA/PE(5/1)打漿得純品3.2g目標化合物，為淡黃色固體。

步驟5：(1R,3S,4S)-3-(8-氨基-1-(4-(吡啶-2-基氨甲醯基)苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯的製備

氮氣保護下，向裝有(1R,3S,4S)-3-(8-氨基-1-溴咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(3.5g，8.57mmol)、N-(吡啶-2-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環-2-基)苯甲醯胺(3.33g，10.28mmol)、Na₂CO₃(1.82g，17.14mmol)的dioxane/EtOH/water(36mL/12mL/12mL)混合溶液中，加入Pd(PPh₃)₄(496.89mg,，0.43mmol)，該反應混合物在90℃下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完全以後，向反應溶液中加入水淬滅，用EA(40mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過柱層析(DCM/MeOH=60/1)純化得到2.8g目標化合物，為淡黃色固體。

步驟6：4-(8-氨基-3-((1R,3S,4S)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

向裝有(1R,3S,4S)-3-(8-氨基-1-(4-(吡啶-2-基氨甲醯基)苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(2.98g，5.68mmol)的DCM(20mL)溶液中，加入TFA(3.5mL)，該反應混合物在室溫下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完全以後，反應體系濃縮，用Na₂CO₃(3mol/L)調pH至8，用DCM/MeOH(10/1)萃取，有機相用無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過柱層析(DCM/MeOH=60/1~10/1)純化得到2.0g目標化合物，為白色固體。

步驟7：4-(3-((1R,3S,4S)-2-丙烯醯基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-基)-8-氨基咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

氮氣保護下，向裝有4-(8-氨基-3-((1R,3S,4S)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺(180mg，0.42mmol)、TEA(170mg,1.68mmol)的DCM(10mL)溶液中，0℃下逐滴加入3-氯丙醯氯(53.4mg，0.42mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完全以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(10mL×3)萃取，有機相無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=15/1)純化得到48mg目標化合物，為黃色固體。

採用核磁共振以及質譜對產物結構進行鑑定，結果如下：¹H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 1.49-1.55(2H,m),1.74-1.80(3H,m),2.57-2.58(1H,m),2.67-2.73(1H,m),4.66(0.2H,s),4.74(0.8H,s),5.04(0.2H,s),5.25(0.8H,s),5.44-5.47(0.2H,m),5.65-5.68(0.8H,m),5.85(0.2H,dd,J=16.8Hz,10.4Hz),6.06-6.13(3H,m),6.76(0.8H,dd,J=16.8Hz,10.4Hz),7.13(1H,d,J=5.2Hz),7.16-7.20(1H,m),7.71(2H,dd,J=8.4Hz,4.0Hz),7.82-7.88(1H,m),7.92(1H,d,J=5.2Hz),8.15(2H,d,J=8.4Hz),8.22(1H,d,J=8.4Hz),8.40-8.41(1H,m),10.84-10.85(1H,m).

EM(計算值)：479.2；MS(ESI)m/e(M+1H)+：480.2

實施例23：4-(8-氨基-3-((1R,3S,4S)-2-(2-丁炔醯基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

氮氣保護下，向裝有4-(8-氨基-3-((1R,3S,4S)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺(180mg，0.424mmol)、2-丁炔酸(39.2mg,0.466mmol)、DIPEA(164mg，1.27mmol)的DMF(10mL)溶液中，加入HBTU(192.8mg，0.51mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應1h，TLC顯示原料反應完全以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(10mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到95mg目標化合物，為黃色固體。

採用核磁共振以及質譜對產物結構進行鑑定，結果如下：¹H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 1.46-1.50(2H,m),1.67-1.86(4H,m),2.03(2H,s),2.60-2.63(2H,m),4.56-4.63(1H,m),5.01-5.21(1H,m),6.15- 6.20(2H,m),7.12-7.20(2H,m),7.71-7.76(2H,m),7.84-7.88(2H,m),8.15-8.18(2H,m),8.22(1H,d,J=8.4Hz),8.40-8.42(1H,m),10.85-10.86(1H,m).

EM(計算值)：491.2；MS(ESI)m/e(M+1H)+：492.2。

實施例24~39

以實施例22或實施例23的製備方法，製備得到以下化合物，所述化合物的結構以及核磁鑑定資料見表2，表2是本申請實施例24~39製備的化合物結構以及結構分析資料匯總。

實施例40

(S)-4-(8-氨基-3-(5-(2-丁炔醯基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基1)-N-(4-(三氟甲基)呱啶-2-基)苯甲醯胺的製備

合成步驟如下所示：

步驟1：4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環-2-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

氮氣保護下，向裝有4-(三氟甲基)吡啶-2-胺(4g，24.69mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環-2-基)苯甲酸(6.13g，24.69mmol)、DIPEA(6.37g，49.38mmol)的30mL DMF(0℃)溶液中，逐份加入HBTU(11.23g,，29.63mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完全以後，向反應溶液中加入水淬滅，用EA(20mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過柱層析(PE/EA=20/1)純化得到7.75g目標化合物，為類白色固體。

步驟2：(S)-6-(8-氨基-1-(4-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨甲醯基)苯基) 咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯製備

氮氣保護下，向裝有(S)-6-(8-氨基-1-溴咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯(3.5g，8.57mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環-2-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲醯胺(4.03g，10.28mmol)、Na₂CO₃(1.82g，17.14mmol)的dioxane/EtOH/water(36mL/12mL/12mL)混合溶液中，加入Pd(PPh₃)₄(496.89mg,，0.43mmol)，該反應混合物在90℃下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完成以後，向反應溶液中加入水淬滅，用EA(40mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過柱層析(DCM/MeOH=60/1)純化得到3.2g目標化合物，為淡黃色固體。

步驟3：(S)-4-(8-氨基-3-(5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲醯胺製備

向裝有(S)-6-(8-氨基-1-(4-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨甲醯基)苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯(3.2g，5.39mmol)的DCM(20mL)溶液中，加入TFA(3mL)，該反應混合物在室溫下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完成以後，反應體系濃縮，用Na₂CO₃(3mol/L) 調pH至8，用DCM/MeOH(10/1)萃取，有機相用無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過柱層析(DCM/MeOH=60/1~10/1)純化得到2.53g目標化合物，為白色固體。

步驟4：(S)-4-(8-氨基-3-(5-(2-丁炔醯基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基l)-N-(4-(三氟甲基)呱啶-2-基)苯甲醯胺的製備

氮氣保護下，向裝有(S)-4-(8-氨基-3-(5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲醯胺(100mg，0.203mmol)、2-丁炔酸(20.5mg,0.244mmol)、DIPEA(78.56mg，0.609mmol)的DMF(5mL)溶液中，加入HBTU(92.5mg，0.244mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應1h，TLC顯示原料反應完成以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(15mL×3)萃取，有機用相飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到60mg目標化合物，為黃色固體。

採用核磁共振以及質譜對產物結構進行鑑定，結果如下：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 0.58-0.79(4H,m),1.58(1H,s),1.97(2H,s),2.24-2.33(2H,m),3.50-3.85(2H,m),5.57-5.59(0.65H,m),5.80-5.82(0.35H,m),6.14-6.22(2H,m),7.14(0.65H,d,J=4.8Hz),7.18(0.35H,d,J=4.8Hz),7.58(1H,d,J=4.8Hz),7.74-7.79(2H,m),7.89-8.04(1H,m),8.17-8.20(2H,m),8.62(1H,s),8.70(1H,d,J=5.2Hz),10.82(1H,s).

EM(計算值)：559.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：560.2

可見本申請製備得到的化合物與上述化合物結構一致。

實施例41

(S)-4-(3-(5-丙烯醯基l-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)-8-氨基咪唑並[1,5-a] 吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

氮氣保護下，向裝有(S)-4-(8-氨基-3-(5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲醯胺(100mg，0.203mmol)、TEA(103.1mg,1.02mmol)的DCM(10mL)溶液中，0℃下逐滴加入3-氯丙醯氯(25.8mg，0.203mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完成以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(10mL×3)萃取，有機相無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=15/1)純化得到32mg目標化合物，為黃色固體。

採用核磁共振以及質譜對產物結構進行鑑定，結果如下：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 0.56-0.76(4H,m),2.24-2.28(1.5H,m),3.61-3.66(1.5H,m),3.87(1H,d,J=10.4Hz),5.60-5.66(2H,m),6.05-6.19(3H,m),6.57(1H,dd,J=16.4Hz,10.4Hz),7.15(0.7H,d,J=5.2Hz),7.19(0.3H,d,J=5.2Hz),7.52-7.56(1H,m),7.76(2H,dd,J=8.0Hz,4.0Hz),7.83(0.7H,d,J=5.2Hz),7.97(0.3H,d,J=5.2Hz),8.17(2H,d,J=8.0Hz),8.57(1H,s),8.71(1H,d,J=5.2Hz),11.12(1H,s).

EM(計算值)：547.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：548.2

可見本申請製備得到的化合物與上述化合物結構一致。

實施例42~72

採用類似結構化合物為原料，以實施例40或實施例41的製備方法，製備得到以下化合物，所述化合物的結構以及核磁鑑定資料見表3，表3是本申請實施例42~72製備的化合物結構以及結構分析資料匯總。

表3實施例42~72製備的化合物結構以及結構分析資料匯總

實施例73

1-((6S)-6-(8-氨基-1-(4-(1羥基-1-苯乙基)苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-基)2-丁炔醯基-1-酮的製備

合成步驟如下所示：

步驟1：1-(4-溴苯基)-1-苯乙醇的製備

氮氣保護中，在-45℃下，向裝有4-溴苯乙酮(5g，25.13mmol)的30mL THF溶液中逐滴加入苯基溴化鎂(10.05mL,30.15mmol,3Min Et₂O)，該反應混合物在-45℃下繼續攪拌反應1h，TLC顯示原料反應完全，慢慢加入飽和NH₄Cl萃滅反應，繼續攪拌反應0.5h。水相用EA萃取(30mL x 3)，合併有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄充分乾燥，真空蒸發後透過柱層析(PE/EA=60/1~10/1)純化得到5.8g目標化合物。

步驟2：1-苯基-1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環-2-基)苯基)乙醇的製備

氮氣保護下，向裝有1-(4-溴苯基)-1-苯乙醇(5.2g，18.76mmol)、頻哪醇硼酸酯(6.19g，24.39mmol)、KOAc(3.68g，37.52mmol)和X-Phos(894.2mg，1.876mmol)的30mLdioxane溶液中，加入Pd₂(dba)₃(858.9mg,，0.938mmol)，該反應混合物在90℃下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完成以後，向反應溶液中加入水淬滅，用EA(20mLX3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過柱層析(PE/EA=60/1~10/1)純化得到4.8g目標化合物，為類白色固體。

步驟3：(6S)-6-(8-氨基-1-(4-(1-羥基-1-苯乙基)苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯的製備

氮氣保護下，向裝有(S)-6-(8-氨基-1-溴咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯(1g，2.45mmol)、1-苯基-1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環-2-基)苯基)乙醇(872.2mg，2.69mmol)、Na₂CO₃(519.4mg，4.9mmol)的dioxane/EtOH/water(12mL/4mL/4mL)混合溶液中，加入Pd(PPh₃)₄(141.56mg,，0.1225mmol)，該反應混合物在90℃下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完全以後，向反應溶液中加入水淬滅，用EA(10mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過柱層析(DCM/MeOH=60/1~30/1)純化得到837.1mg目標化合物，為淡黃色固體。

步驟4：1-(4-(8-氨基-3-((S)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)苯基)-1-苯基乙醇的製備

在室溫下，向裝有(6S)-6-(8-氨基-1-(4-(1-羥基-1-苯乙基)苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯(837mg，1.59mmol)的15mLDCM溶液中慢慢滴加TFA(1mL)，該反應混合物在室溫下攪拌3h，TLC顯示原料反應完成以後，反應體系濃縮，用Na₂CO₃(3mol/L)調pH至8，用DCM/MeOH(10/1)萃取，有機相用無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後得到642.8mg目標化合物，為白色固體。

步驟5：1-((6S)-6-(8-氨基-1-(4-(1羥基-1-苯乙基)苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-基)2-丁炔醯基-1-酮的製備

氮氣保護下，向裝1-(4-(8-氨基-3-((S)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)苯基)-1-苯基乙醇(80mg，0.188mmol)、2-丁炔酸(19mg,0.226mmol)、DIPEA(72.8mg，0.564mmol)的DMF(3mL)溶液中，加入HBTU(85.7mg，0.226mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應2h，TLC顯示原料反應完全以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(15mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=15/1)純化得到20mg目標化合物，為黃色固體。

採用核磁共振以及質譜對產物結構進行鑑定，結果如下：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 0.55-0.73(4H,m),1.58(1H,s),1.90(3H,s),2.01(2H,s),2.25-2.32(2H,m),3.52(0.3H,d,J=16.4Hz),3.62-3.65(0.3H,m),3.73(0.7H,d,J=10.8Hz),3.82(0.7H,d,J=10.8Hz),5.57-5.59(1H,m),5.71(1H,s),6.10-6.20(2H,m),7.08(1H,d,J=4.8Hz),7.12-7.18(1H,m),7.27-7.33(2H,m),7.44-7.55(6H,m),7.78(0.3H,d,J=4.8Hz),7.86(0.7H,d,J=4.8Hz).

EM(計算值)：491.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：492.2

可見本申請製備得到的化合物與上述化合物結構一致。

實施例74

1-((6S)-6-(8-氨基-1-(4-(1-羥基-1-苯乙基)苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-羥基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-基)-2-丙烯-1-酮的製備

氮氣保護下，向裝有1-(4-(8-氨基-3-((S)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)苯基)-1-苯基乙醇(80mg，0.188mmol)、TEA(94.9mg,0.94mmol)的DCM(10mL)溶液中，0℃下逐滴加入3-氯丙醯氯(23.9mg，0.188mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完全以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(10mL×3)萃取，有機相無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=15/1)純化得到15mg目標化合物，為黃色固體。

採用核磁共振以及質譜對產物結構進行鑑定，結果如下：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 0.58-0.73(4H,m),1.91(3H,s),2.22-2.32(2H,m),3.50-3.67(0.6H,m),3.75-3.80(1.4H,d,J=10.8Hz),5.57-5.60(1H,m),5.65-5.67(1H,m),5.71(1H,s),6.08-6.20(3H,m),6.76(1H,dd,J=16.8Hz,10.4Hz),7.06(1H,d,J=4.8Hz),7.10-7.18(1H,m),7.28-7.33(2H,m),7.46-7.55(6H,m),7.77(0.4H,d,J=4.8Hz),7.86(0.6H,d,J=4.8Hz).

EM(計算值)：479.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：480.2

可見本申請製備得到的化合物與上述化合物結構一致。

實施例75~91

採用類似結構化合物為原料，以實施例73或實施例74的製備方法，製備得到以下化合物，所述化合物的結構以及核磁鑑定資料見表4，表4是本申請實施例75~91製備的化合物結構以及結構分析資料匯總。

實施例92

(S)-1-(6-(8氨基-1-(4-苯氧基苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-基)-2-丁炔-1-酮的製備

合成步驟如下所示：

步驟1：(S)-6-(8-氨基-1-(4-苯氧基苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯的製備

氮氣保護下，向裝有(S)-6-(8-氨基-1-溴咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯(1g，2.45mmol)、4,4,5,5-四甲基-2-(4-苯氧基苯基)-1,3,2-二氧硼戊環(796.7mg，2.69mmol)、Na₂CO₃(519.4mg，4.9mmol)的dioxane/EtOH/water(12mL/4mL/4mL)混合溶液中，加入Pd(PPh₃)₄(141.56mg,，0.1225mmol)，該反應混合物在90℃下攪拌反應3h，TLC顯示原料反應完全以後，向反應溶液中加入水淬滅，用EA(10mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過柱層析(DCM/MeOH=60/1~30/1)純化得到865.6mg目標化合物，為淡黃色固體。

步驟2：(S)-1-(4-苯氧基苯基)-3-(5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-8-胺的製備

在室溫下，向裝有(S)-6-(8-氨基-1-(4-苯氧基苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸叔丁酯(865mg，1.74mmol)的15mL DCM溶液中慢慢滴加TFA(1mL)，該反應混合物在室溫下攪拌3h，TLC顯示原料反應完成以後，反應體系濃縮，用Na₂CO₃(3mol/L)調pH至8，用DCM/MeOH(10/1)萃取，有機相無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後得到690mg目標化合物，為白色固體。

步驟3：(S)-1-(6-(8氨基-1-(4-苯氧基苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-基)-2-丁炔-1-酮的製備

氮氣保護下，向裝(S)-1-(4-苯氧基苯基)-3-(5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-8-胺(80mg，0.20mmol)、2-丁炔酸(20.2mg,0.24mmol)、DIPEA(77.4mg，0.60mmol)的DMF(3mL)溶液中，加入HBTU(91mg，0.24mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應2h，TLC顯示原料反應完成以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(15mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=25/1)純化得到30mg目標化合物，為白色固體。

採用核磁共振以及質譜對產物結構進行鑑定，結果如下：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 0.55-0.76(4H,m),1.58(1H,s),2.00(2H,s),2.26-2.33(2H,m),3.51(0.4H,d,J=16.4Hz),3.63(0.4H,d,J=11.6Hz),3.70(0.6H,d,J=10.8Hz),3.84(0.6H,d,J=10.8Hz),5.57-5.59(0.6H,m),5.77-5.82(0.4H,m),6.14-6.21(2H,m),7.03-7.19(6H,m),7.41-7.44(2H,m),7.57-7.61(2H,m),7.82(0.6H,d,J=5.2Hz),7.97(0.4H,d,J=5.2Hz).

EM(計算值)：463.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：464.2

可見本申請製備得到的化合物與上述化合物結構一致。

實施例93

(S)-1-(6-(8-氨基-1-(4-苯氧基苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-基)-2-丙烯-1-酮的製備

氮氣保護下，向裝有(S)-1-(4-苯氧基苯基)-3-(5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-8-胺(80mg，0.20mmol)、TEA(101mg,1.0mmol)的DCM(10mL)溶液中，0℃下逐滴加入3-氯丙醯氯(25.4mg，0.20mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應過夜，TLC顯示原料反應完成以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(10mL×3)萃取，有機相無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=25/1)純化得到20mg目標化合物，為白色固體。

採用核磁共振以及質譜對產物結構進行鑑定，結果如下：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 1.25-1.54(5H,m),2.47-2.55(1H,m),2.68-2.70(1H,m),4.61(0.25H,s),4.73(0.75H,s),5.01(0.75H,s),5.19(0.25H,s),5.44(0.25H,d,J=10.4Hz),5.65(0.75H,dd,J=10.4Hz,2.4Hz),5.70(0.25H,dd,J=16.8Hz,10.4Hz),6.04-6.15(3H,m),6.74(0.75H,dd,J=16.8Hz,10.4Hz),7.03-7.19(6H,m),7.42-7.44(2H,m),7.55-7.61(2H,m),7.81(0.75H,d,J=5.2Hz),7.97(0.25H,d,J=5.2Hz).

EM(計算值)：451.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：452.2

可見本申請製備得到的化合物與上述化合物結構一致。

實施例94~111

採用類似結構化合物為原料，以實施例92或實施例93的製備方法，製備得到以下化合物，所述化合物的結構以及核磁鑑定資料見表5，表5是本申請實施例94~111製備的化合物結構以及結構分析資料匯總。

實施例112

(S,E)-4-(8-氨基-3-(5-(4-(二甲氨基)2-丁烯醯基)-5-氮雜螺[2.4庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

在氮氣保護下，向裝有(S)-4-(8-氨基-3-(5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺(100mg，0.235mmol)、(E)-4-(二甲氨基)-2-丁烯酸鹽酸鹽(46.7mg，0.282mmol)和DIPEA(121.26mg，0.94mmol)的DMF(3mL)溶液中，加入HBTU(106.9mg，0.282mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應3h，TLC顯示原料反應完成以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(15mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到20mg目標化合物，為淡黃色固體。

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 0.56-0.73(4H,m),1.82(2H,s),2.13(4H,s),2.22-2.26(1.5H,m),3.05(2H,d,J=4.4Hz),3.62-3.66(1.5H,m),3.87(1H,d,J=10.4Hz),5.59-5.66(1H,m),6.03-6.15(2H,m),6.37-6.54(2H,m),7.14-7.21(2H,m),7.71(2H,d,J=8.4Hz),7.86-7.92(2H,m),8.15(2H,d,J=8.4Hz),8.24(1H,d,J=8.4Hz),8.40(1H,dd,J=4.8Hz,1.8Hz),10.85(1H,s).

EM(計算值)：536.3；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：537.3。

實施例113

4-(8-氨基-3-((1S)-2-((E)-4-(二甲氨基)-2-丁烯醯基)八氫環戊烷[c]吡咯-1-基1)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

在氮氣保護下，向裝有4-(8-氨基-3-((1S)-八氫環戊烷[c]吡咯-1-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺(100mg，0.228mmol)、(E)-4-(二甲氨基)-2-丁烯酸鹽酸鹽(45.4mg，0.274mmol)和DIPEA(117.6mg，0.912mmol)的DMF(3mL)溶液中，加入HBTU(86.4mg，0.228mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應3h，TLC顯示原料反應完成以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(15mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到28mg目標化合物，為淡黃色固體。

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 1.45-1.60(3H,m),1.77-1.84(3H,m),1.85-2.03(2H,m),2.13(4H,s),2.68-2.71(1H,m),2.89-2.92(1H,m),3.05(2H,d,J=4.4Hz),3.63-3.67(1H,m),3.88-3.94(1H,m),5.43(1H,d,J=2.0Hz),6.03-6.18(2H,m),6.41-6.54(2H,m),7.15(1H,d,J=5.2Hz),7.18-7.20(1H,m),7.71(2H,d,J=8.4Hz),7.86-7.92(2H,m),8.13(2H,d,J=8.4Hz),8.23(1H,d,J=8.4Hz),8.42(1H,dd,J=4.8Hz,1.8Hz),10.84(1H,s).

EM(計算值)：550.3；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：551.3

實施例114

(S,E)-4-(8-氨基-3-(5-(4-(環丙基(甲基)氨基)-2-丁烯醯基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-yl基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(呱啶-2-基)苯甲醯胺的合成步驟如下所示：

步驟1：(E)-4-(環丙基氨基)-2-丁炔酸乙酯的製備

室溫下，向裝有環丙胺(2.2g，38.85mol)、K₂CO₃(3.6g，25.9mmol)的20mL THF溶液中加入溴代巴豆酸乙酯(90% purity，2.8g，12.95mmol)，室溫攪拌過夜，TLC檢測反應完成以後，向上述反應混合物加水淬滅反應，EA(15mLx3)萃取，合併有機相後用飽和NaCl洗滌，無水Na₂SO₄充分乾燥，真空蒸發後，得到1.1g目標化合物，不用進一步純化直接用於下一步反應。

步驟2：(E)-4-(環丙基(甲基)氨基)-2-丁炔酸乙酯的製備

在氮氣保護下，向裝有(E)-4-(環丙基氨基)-2-丁炔酸乙酯(1.1g，6.5mmol)的DCM溶液中加入甲醛水溶液(38wt%，2.6g，32.5mmol)，冰鹽浴下，逐份加入STAB(4.1g，19.5mmol)，此反應混合物自然升至室溫並攪拌3h，TLC檢測反應完全以後，再慢慢滴加水淬滅反應，DCM(10mLx4)萃取，合併有機相後用飽和NaCl洗滌，無水Na₂SO₄充分乾燥，真空蒸發後透過柱層析(PE/EA=20/1)純化得到860mg目標化合物，為黃色油狀物。

步驟3：(E)-4-(環丙基(甲基)氨基-2-丁烯酸的製備

室溫下，向裝有(E)-4-(環丙基(甲基)氨基)-2-丁炔酸乙酯(860mg，4.7mmol)、的THF/水(5mL/3mL)的混合溶液中，加入LiOH(451.2mg，18.8mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌5h，TLC檢測反應完成，DCM/MeOH(10/1，10mL x 3)萃取，有機相用無水Na₂SO₄充分乾燥，真空蒸發後得到750mg目標化合物，為白色固體。

步驟4：(S,E)-4-(8-氨基-3-(5-(4-(環丙基(甲基)氨基)-2-丁烯醯基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-yl基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(呱啶-2-基)苯甲醯胺的製備

在氮氣保護下，向裝有(S)-4-(8-氨基-3-(5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺(100mg，0.235mmol)、(E)-4-(環丙基(甲基)氨基-2-丁烯酸(48.2mg，0.282mmol)和DIPEA(121.26mg，0.94mmol)的DMF(3mL)溶液中，加入HBTU(106.9mg，0.282mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應3h，TLC顯示原料反應完成以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(15mLX3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到45mg目標化合物，為淡黃色固體。

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 0.24-0.39(4H,m),0.56-0.69(4H,m),1.44-1.46(1H,m),2.24-2.27(1.5H,m),3.23(3H,s),3.62-3.75(3.5H,m),3.85(1H,d,J=10.4Hz),5.65-5.68(1H,m),6.05-6.17(2H,m),6.37-6.50(2H,m), 7.11-7.22(2H,m),7.66-7.71(2H,m),7.83-7.87(2H,m),8.13(2H,,J=8.4Hz),8.20(1H,d,J=8.4Hz),8.41(1H,d,J=3.6Hz),10.86(1H,s).

EM(計算值)：562.3；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：563.3

實施例115

4-(8-氨基-3-((1S)-2-((E)-4-(環丙基(甲基)氨基)-2-丁烯醯基)八氫環戊烷[c]吡咯-1-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

在氮氣保護下，向裝有4-(8-氨基-3-((1S)-八氫環戊烷[c]吡咯-1-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺(100mg，0.228mmol)(E)-4-(環丙基(甲基)氨基-2-丁烯酸(46.9mg，0.274mmol)和DIPEA(117.6mg，0.912mmol)的DMF(3mL)溶液中，加入HBTU(86.4mg，0.228mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應3h，TLC顯示原料反應完成以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(15mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO4乾燥，真空蒸發後透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到55mg目標化合物，為淡黃色固體。

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 0.24-0.39(4H,m),1.48-1.59(3H,m),1.79-1.85(3H,m),1.91-2.03(2H,m),2.13(2H,s),2.67-2.71(1H,m),2.88-2.92(1H,m),3.04(2H,d,J=4.4Hz),3.63-3.66(1H,m),3.88-3.92(1H,m),5.45(1H,d,J=2.0Hz),6.03-6.15(2H,m),6.41-6.54(2H,m),7.14(1H,d,J=5.2Hz),7.17-7.20(1H,m),7.71(2H,d,J=8.4Hz),7.86-7.91(2H,m),8.13(2H,d,J=8.4Hz),8.25(1H,d,J=8.4Hz),8.42(1H,dd,J=4.8Hz,1.8Hz),10.86(1H,s).

EM(計算值)：576.3；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：577.3

實施例116

(S,Z)-4-(8-氨基-3-(5-(2-氰基-4-甲基-2-戊烯醯基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的合成步驟如下所示：

步驟1：(S)-4-(8-氨基-3-(5-(2-氰乙醯基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

在氮氣保護下，向裝有(S)-4-(8-氨基-3-(5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺(300mg，0.705mmol)、2-氰基乙酸(71.9mg，0.846mmol)和DIPEA(272.8mg，2.115mmol)的DMF(10mL)溶液中，加入HBTU(320.6mg，0.846mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應3h，TLC顯示原料反應完全以後，向反應體系中加水淬滅，用EA(15mL×3)萃取，有機相用飽和食鹽水反洗，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過柱層析(DCM/MeOH=60/1~20/1)純化得到150mg目標化合物，為黃色固體。

步驟2：(S,Z)-4-(8-氨基-3-(5-(2-氰基-4-甲基-2-戊烯醯基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

在氮氣保護下，向裝有(S)-4-(8-氨基-3-(5-(2-氰乙醯基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺(120mg，0.244mmol)、呱啶(24.3mg，0.293mmol)的MeOH(5mL)溶液中，加入異丁醛(26.4mg，0.366mmol)，該反應混合物在室溫下攪拌反應26h，TLC顯示原料反應完全以後，向反應體系中加水淬滅，用DCM(15mL×3)萃取，無水Na₂SO₄乾燥，真空蒸發後透過矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到30mg目標化合物，為黃色固體。

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 0.56-0.76(4H,m),1.04-1.09(6H,m),2.24-2.26(1.5H,m),2.78-2.81(1H,m),3.61-3.66(1.5H,m),3.87(1H,d,J=10.4Hz),5.60-5.68(1H,m),6.05-6.20(2H,m),6.74-6.77(1H,m),7.11-7.20(2H,m),7.66-7.74(2H,m),7.83-7.88(2H,m),8.15(2H,,J=8.4Hz),8.22(1H,d,J=8.4Hz),8.41(1H,d,J=3.6Hz),10.84(1H,s).

EM(計算值)：546.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：547.3

實施例117

4-(8-氨基-3-((1S)-2-((Z)-2-氰基-4-甲基-2-戊烯醯基l)八氫環戊烷[c]吡咯-1-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

合成方法同實施例116。透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到20mg目標化合物，為黃色固體。

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 1.04-1.10(6H,m),1.48-1.61(3H,m),1.76-1.79(1H,m),1.85-2.02(2H,m),2.65-2.69(1H,m),2.77-2.82(1H,m),2.90-2.93(1H,m),3.63-3.66(1H,m),3.91-4.00(1H,m),5.44-5.46(1H,m),6.08-6.17(2H,m),6.74-6.76(1H,m),7.13(1H,d,J=5.2Hz),7.20(1H,dd,J=6.8Hz,5.2Hz),7.70-7.73(2H,m),7.84-7.90(2H,m),8.13(2H,d,J=8.4Hz),8.22(1H,d,J=8.4Hz),8.40(1H,d,J=4.0Hz),10.85(1H,brs).

EM(計算值)：560.3；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：561.3

實施例118

4-(3-((1R,2S,4S)-7-丙烯醯基-7-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-基)-8-氨基咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

合成方法同實施例2.透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到15mg目標化合物，為類白色固體。

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 1.49-1.57(2H,m),1.74-1.85(3H,m),2.33-2.39(1H,m),4.56-4.74(2H,m),5.15-5.17(0.3H,m),5.28-5.32(0.7H,m),5.55-5.69(1H,m),6.06-6.18(3H,m),6.72(1H,dd,J=16.8Hz,10.4Hz),7.13(1H,d,J=5.2Hz),7.16-7.21(1H,m),7.71(2H,dd,J=8.4Hz,4.0Hz),7.83-7.87(1H,m),7.91(1H,d,J=5.2Hz),8.15(2H,d,J=8.4Hz),8.20(1H,d,J=8.4Hz),8.40-8.42(1H,m),10.84(1H,s).

EM(計算值)：479.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：479.2

實施例119

4-(8-氨基-3-((1R,2S,4S)-7-(2-丁炔醯基)-7-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-基) 咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

合成方法同實施例1。透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到12mg目標化合物，為類白色固體。

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 1.40-1.55(3H,m),1.73-1.82(3H,m),2.02(2H,s),2.33-2.40(1H,m),4.53-4.64(2H,m),5.13-5.17(0.4H,m),5.28-5.32(0.6H,m),6.11-6.23(2H,m),7.15(1H,d,J=5.2Hz),7.19-7.22(1H,m),7.71(2H,dd,J=8.4Hz,4.0Hz),7.85-7.87(1H,m),7.93(1H,d,J=5.2Hz),8.15(2H,d,J=8.4Hz),8.24(1H,d,J=8.4Hz),8.39-8.42(1H,m),10.83(1H,s).

EM(計算值)：491.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：492.2

實施例120

4-(3-(2-丙烯醯基-2-氮雜雙環[2.2.2]辛烷-1-基)-8-氨基咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

合成方法同實施例2。透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到10mg目標化合物，為淡黃色固體。

結構分析資料： ¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 1.22-1.55(3H,m),1.74-1.80(2H,m),2.07-2.23(3H,m),2.37-2.41(1H,m),3.25-3.28(1H,m),3.81-3.84(1H,m),5.65-5.69(1H,m),6.06-6.20(3H,m),6.75(1H,dd,J=16.8Hz,10.4Hz),7.13(1H,d,J=5.2Hz),7.16-7.21(1H,m),7.70(2H,dd,J=8.4Hz,4.0Hz),7.83-7.88(1H,m),7.90(1H,d,J=5.2Hz),8.15(2H,d,J=8.4Hz),8.21(1H,d,J=8.4Hz),8.39-8.41(1H,m),10.84-10.85(1H,m).

EM(計算值)：493.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：494.2

實施例121

4-(8-氨基-3-(2-(2-丁炔醯基)-2-氮雜雙環[2.2.2]辛烷-1-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

合成方法同實施例1。透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到13mg目標化合物，為淡黃色固體。

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 1.25-1.53(4H,m),1.70-1.76(2H,m),2.01(2H,s),2.07-2.24(3H,m),2.35-2.41(1H,m),3.25-3.26(1H,m),3.81-3.84(1H,m),6.06-6.20(2H,m),7.14(1H,d,J=5.2Hz),7.15-7.23(1H,m),7.68(2H,dd,J=8.4Hz,4.0Hz),7.81-7.85(1H,m),7.90(1H,d,J=5.2Hz),8.16(2H,d,J=8.4Hz),8.20(1H,d,J=8.4Hz),8.39-8.41(1H,m),10.86-10.88(1H,m).

EM(計算值)：505.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：506.2

實施例122

4-(3-(2-丙烯醯基-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-1-基)-8-氨基咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

合成方法同實施例2。透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到20mg目標化合物，為淡黃色固體。

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 1.25-1.51(3H,m),1.69-1.72(1H,m),1.90-1.93(1H,m),2.61-2.70(2H,m),3.03-3.07(1H,m),3.43-3.47(1H,m),5.61-5.68(1H,m),6.10-6.19(3H,m),6.73-6.75(1H,m),7.11-7.19(2H,m),7.73-7.86(4H,m),8.15(2H,dd,J=8.4Hz,2.8Hz),8.20(1H,d,J=8.4Hz),8.41(1H,dd,J=4.8Hz,1.2Hz),10.81(1H,s).

EM(計算值)：479.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：480.2

實施例123

4-(8-氨基-3-(2-(2-丁炔醯基)-2-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-1-基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

合成方法同實施例1。透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到15mg目標化合物，為淡黃色固體。

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 1.31-1.56(4H,m),1.66-1.72(1H,m),1.95-1.98(1H,m),2.02(2H,s),2.59-2.72(2H,m),3.07-3.09(1H,m),3.44-3.47(1H,m),6.10-6.19(2H,m),7.12-7.19(2H,m),7.71-7.76(2H,m),7.84-7.89(2H,m),8.15-8.17(2H,m),8.21(1H,d,J=8.4Hz),8.40-8.42(1H,m), 10.85-10.87(1H,m).

EM(計算值)：491.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：492.2

實施例124

(S)-3-(3-(5-丙烯醯基-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-8-氨基咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 0.58-0.72(4H,m),2.23-2.25(1.6H,m),3.63-3.66(1.4H,m),3.85(1H,d,J=10.4Hz),5.62-5.68(2H,m),6.05-6.17(3H,m),6.54(1H,dd,J=16.8Hz,10.4Hz),7.12-7.20(2H,m),7.78-7.83(3H,m),7.83-7.86(2H,m),8.21(1H,d,J=8.4Hz),8.41(1H,d,J=3.6Hz),8.68(1H,s),10.82(1H,s).

EM(計算值)：479.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：480.2

實施例125

(S)-2-(3-(5-丙烯醯基-5-氮雜螺環[2.4]庚烷-6-基)-8-氨基咪唑並[1,5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲醯胺的製備

合成方法同實施例2。透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到18mg目標化合物，為淡黃色固體。

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 0.55-0.76(4H,m),2.23-2.26(1.5H,m),3.61-3.65(1.5H,m),3.86(1H,d,J=10.4Hz),5.62-5.68(2H,m),6.07-6.19(3H,m),6.55(1H,dd,J=16.8Hz,10.4Hz),7.13-7.20(2H,m),7.58-7.62(2H,m),7.70-7.72(1H,m),7.83-7.88(2H,m),8.12-8.14(1H,m),8.21(1H,d,J=8.4Hz),8.40(1H,d,J=3.6Hz),10.84(1H,s).

EM(計算值)：479.2；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：480.2

實施例126

(1S,4S)-叔丁基-5-丙烯醯基-6-(8-氨基-1-(4-(吡啶-2-氨甲醯基)苯基)咪唑並[1,5-a]吡嗪-3-基)-2,5-二氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-甲酸酯的製備

合成方法同實施例2。透過製備矽膠板(DCM/MeOH=20/1)純化得到25mg目標化合物，為淡黃色固體。

結構分析資料：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ 1.47-1.52(9H,m),1.99-2.01(1H,m),2.82-2.84(1H,m),3.24-3.48(2H,m),4.38-4.52(1H,m),4.96-5.24(2H,m), 5.46-5.52(0.4H,m),5.65-5.76(1H,m),6.00-6.30(3H,m),6.86(0.6H,dd,J=16.8Hz,10.4Hz),7.17-7.25(2H,m),7.65-7.75(3H,m),7.84-7.88(1H,m),8.14-8.23(3H,m),8.40-8.42(1H,m),10.85(1H,s).

EM(計算值)：580.3；MS(ESI)m/e(M+1H)⁺：581.3

藥效試驗

試驗例1：體外BTK抑制激酶活性試驗

1：試驗原理：

微流體晶片技術的遷移率檢測技術(Mobility-Shift Assay)，該技術將毛細管電泳的基本理念應用到微流體環境中，用於實驗的受質是帶有螢光標記的多肽，在反應體系中酶的作用下，受質轉變為產物，其所帶的電荷也發生了相應的變化，Mobility-Shift Assay正是利用受質和產物所帶電荷的不同，將二者進行分離，並分別進行檢測，檢測結果由轉化率表達出來。

2：試驗方法：

(1)配置待測樣品：用100% DMSO稀釋至反應終濃度的50倍，即25umol/L；(2)稀釋：25umol/L為起始濃度，然後以4倍濃度稀釋，稀釋10個濃度梯度；(3)陽性對照和陰性對照孔中分別加入100% DMSO；(4)將配好的10個濃度的化合物分別用1倍激酶緩衝液稀釋10倍；其中激酶緩衝液中包含濃度為50mmol/L，pH為7.5的羥乙基呱嗪乙硫磺酸、0.01%的十二烷基聚乙二醇醚、10mmol/L的氯化鎂、2mmol/L的二硫蘇糖醇；(5)配製2.5倍酶溶液：將激酶加入1倍激酶緩衝液，形成2.5倍酶溶液；(6)配製2.5倍的受質溶液：將FAM標記的多肽和ATP加入1倍激酶緩衝液，形成2.5倍受質溶液；(7)向384孔板中加入酶溶液：384孔反應板中已有5μl的10% DMSO溶解的5倍化合物，然後再加入10μl的2.5倍酶溶液，室溫下孵育10分鐘；(8)向384孔板中加入受質溶液：在384孔反應板中加入10μl的 2.5倍受質溶液；(9)激酶反應和終止：28℃下孵育1h，然後加25μl終止液終止反應；其中終止液中包含濃度為100mmol/L，pH為7.5的羥乙基呱嗪乙硫磺酸、0.015%的十二烷基聚乙二醇醚、0.2%的3號表面試劑、20mmol/L的乙二胺四乙酸；(10)Caliper讀取數據：Caliper上讀取轉化率數據；

試驗例2：選用不同的細胞株對化合物進行體外細胞增殖抑制活性的測定

1：培養基配製見表6：

2：化合物配置：

待測化合物分別用DMSO稀釋配成終濃度為10mM母液備用。

3：IC₅₀測定

3.1.CCK-8方法檢測TMD8和OCI-ly10細胞

收集對數生長期細胞，計數，用完全培養基重新懸浮細胞，調整細胞濃度至合適濃度(依照細胞密度優化試驗結果確定)，接種96孔板，每孔加100μl細胞懸液。細胞在37℃，100%相對濕度，5% CO₂培養箱中孵育24小時。

用培養基將待測化合物稀釋至所設置的相應作用濃度，按25μl/孔加入細胞。細胞置於37℃，100%相對濕度，5% CO₂培養箱中孵育72小時。

吸棄培養基，加入含10%檢測試劑的完全培養基置於37℃培養箱中孵育1-4小時。輕輕震盪後在SpectraMax M5 Microplate Reader上測定450nm波長處的吸光度，以650nm處吸光度作為對照，計算抑制率。

3.2 CTG assay方法檢測DOHH2細胞

收集對數生長期細胞，計數，用完全培養基重新懸浮細胞，調整細胞濃度至合適濃度(依照細胞密度優化試驗結果確定)，接種96孔板，每孔加90μl細胞懸液。細胞在37℃，100%相對濕度，5% CO₂培養箱中孵育24小時。

用培養基將待測化合物稀釋至所設置的相應作用濃度，按10μl/孔加入細胞。細胞置於37℃，100%相對濕度，5% CO₂培養箱中孵育72小時。

吸棄培養基，加入30ul的檢測試劑，避光搖板10分鐘，裂解細胞。之後在室溫孵育2分鐘，在Envision上測定，計算抑制率。

4：資料處理

按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率：腫瘤細胞生長抑制率%=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%

As：樣品的OA(細胞+檢測試劑+待測化合物)

Ac：陰性對照的OA(細胞+檢測試劑+DMSO)

Ab：陽性對照的OA(培養基+檢測試劑+DMSO)

運用軟體Graphpad Prism 5或XLfit進行IC₅₀曲線擬合併計算出IC₅₀值。

化合物對BTK激酶抑制活性和體外細胞增殖抑制活性結果見表7：

試驗例3：hERG實驗考察潛在的心臟毒性

1：細胞培養

CHO hERG細胞生長於含上述培養液的培養皿中，並在37℃、含5% CO₂的培養箱中進行培養。電生理實驗之前24到48小時，CHOhERG細胞被轉移到放置於培養皿中的圓形玻璃片上，並在以上相同的培養液及培養條件下生長。每個圓形玻片上CHO hERG細胞的密度需要達到絕大多數細胞是獨立、單個的要求。

2：實驗溶液配製

細胞內液和外液的組成成分

3：電生理記錄系統

本實驗採用手動膜片鉗系統(HEKA EPC-10信號放大器及數位轉換系統，購自德國HEKA Electronics)作全細胞電流的記錄。表面生長有CHO hERG細胞的圓形玻片被放置於倒置顯微鏡下的電生理記錄槽中。記錄槽內以細胞外液作持續灌流(大約每分鐘1毫升)。實驗過程採用常規全細胞膜片鉗電流記錄技術。如無特殊說明，實驗都是在常規室溫下進行(~25℃)。細胞鉗制在-80mV的電壓下。細胞鉗制電壓去極化到+20mV以啟動hERG鉀通道，5秒後再鉗制到-50mV以消除失活並產生尾電流。尾電流峰值用作hERG電流大小的數值。上述步驟所記錄的hERG鉀電流在記錄槽內持續的細胞外液灌流下達到穩定後則可以疊加灌流待測試的藥物，直到藥物對hERG電流的抑制作用達到穩定狀態。一般以最近的連續3個電流記錄線重合作為判斷是否穩定狀態的標準。達到穩定態勢以後以細胞外液灌流沖洗直到hERG電流回復到加藥物之前的大小。一個細胞上可以測試一個或多個藥物，或者同一種藥物的多個濃度，但是在不同藥物之間需要以細胞外液沖洗。Cisapride(西塞菩，購自Sigma)被用於實驗中作為陽性對照以保證所使用的細胞質量正常。

4：化合物的處理與稀釋

為了取得化合物的IC₅₀，我們選擇了下列濃度(30,10,3,1,0.3和0.1μM)來作測試。在試驗之前，首先用DMSO以梯度稀釋的方式稀釋成10,3,1,0.3和0.1mM的貯備液，再用細胞外液稀釋成最終的μM測試濃度。除了30μM的化合物測試溶液中的DMSO濃度為0.3%以外，其它各濃度化合物溶液中DMSO的最終濃度都為0.1%。陽性對照Cisapride(西塞菩)的測試濃度為0.1μM。所有的化合物溶液都經過常規的5到10分鐘超聲波和振盪以保證化合物完全溶解。

5：資料處理

試驗資料由HEKA Patchmaster，Microsoft Excel以及Graphpad Prism提供的資料分析軟體進行分析。

部分化合物心臟hERG鉀電流檢測結果見表8：

試驗例4：本發明化合物的藥代動力學測試

SD大鼠，雄性(購於上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)。各受試化合物分別以口服(10mg/kg，每組3只)和靜脈(1mg/kg，每組3只)兩種給藥方式單次給予SD大鼠進行藥代動力學研究，受試化合物使用 DMSO/9%的氯化鈉注射液=5/95(V/V)溶解，並經渦旋1min，超聲波1min之後配製成給藥溶液。口服給藥前動物需禁食16-17小時，並於給藥4小時後恢復給食。SD大鼠經口服與靜脈給藥後，經頸靜脈或心臟穿刺採集藥代動力學樣本，採集時間點為：給藥前、給藥後5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h和24h，每個時間點採集3個全血樣本，採集量約0.2mL，並經肝素鈉抗凝。血液樣本採集後立即置於冰上，於30分鐘之內離心分離血漿(離心條件：8000轉/分鐘，6分鐘，2-8℃)。收集的血漿分析前存放於-70℃。取50μL血漿樣品至1.5mL離心管中，加入250μL內標溶液(空白不加內標補加相同體積的甲醇)，渦旋混勻，15000轉/分鐘離心5分鐘，取200μL上清液加入到96孔進樣板中，經LC-MS/MS進樣分析。

本發明部分化合物的藥代動力學測試結果如下表9所示：

從以上成藥性研究資料可以看出，本發明化合物對BTK活性具有明顯的抑制作用，與已上市藥物依魯替尼或臨床三期的ACP-196相比，心臟毒性極小，藥代方面也具有明顯的優勢，可用作BTK抑制劑，具有廣闊的抗惡性腫瘤疾病或炎症疾病的應用前景。

以上實施例的說明只是用於幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對於本技術領域具有通常知識者來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明申請專利範圍的保護範圍內。

本申請要求於2017年01月20日提交中國專利局、申請號為201710044771.4、發明名稱為“用作布魯頓酪氨酸激酶抑制劑的化合物及其製備方法和應用”的中國專利申請的優先權，其全部內容於此透過引用結合在本申請中。

Claims

一種用作布魯頓酪氨酸激酶抑制劑的化合物，其具有式(I)所示結構或其異構體、藥學上可接受的溶劑化物或鹽：其中，Y選自以下基團：R₉為三氟甲基或甲基；R₁₁為取代或非取代的吡啶基；R₁₀和R₁₂獨立的選自取代或非取代的苯基；所述R₁₀，R₁₁和R₁₂中的取代基獨立的選自硝基、羥基、巰基、氟、氯、溴、碘、氰基、取代或非取代C1~10烷基；所述烷基的取代基選自氟、氯、溴、碘、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、醯胺基；R選自以下基團：其中，R’為氫、取代或非取代的C1~6烷基、取代或非取代的C1~6雜烷基；所述取代基選自氟、氯、溴、碘、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、醯胺基、烷基、環烷基；R”為氫、硝基、鹵素或氰基；M選自以下基團：且N原子與羰基相連；其中，P選自CR₅R₆，N-R₇或O；R₇為氫、取代或非取代C1~8烷基或；所述取代基選自氟、氯、溴、碘、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、醯胺基；R₅、R₆、R₈獨立的選自取代或非取代C1~8烷基，或取代或非取代C1~8雜烷基；所述取代基選自氟、氯、溴、碘、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、醯胺基；或者M選自式(Ⅱ)所示基團，A為金剛烷基，且氨基與羰基相連；
如請求項1所述的化合物，其中所述M選自以下基團：
如請求項1所述的化合物，其具有以下任一結構或其立體異構體或順反異構體：
一種製備如請求項1~3任一項所述的化合物的方法，其包括以下步驟：1)以2-氯吡嗪為原料，在鹼性化合物作用下，反應生成3-氯-2-吡嗪甲醇；2)將3-氯-2-吡嗪甲醇透過蓋布瑞爾合成法生成(3-氯吡嗪-2-基)甲胺；3)將(3-氯吡嗪-2-基)甲胺與式(Ⅲ)所示的螺環羧酸或橋環羧酸進行反應，製備得到醯胺類化合物；4)將醯胺類化合物在三氯氧磷的作用下進行閉環反應，然後經NBS溴代，得到式(Ⅳ)所示化合物；5)將上述式(Ⅳ)所示化合物在醇和氨水的作用下，發生氨基化反應；6)將上述氨基化反應後的產物與式(V-1)所示硼酸或式(V-2)所示硼酸酯透過Suzuki偶聯反應，得到式(Ⅵ)所示化合物；7)將上述式(Ⅵ)所示化合物與取代的或未取代的2-丁炔酸在縮合劑作用下發生縮合反應，得到式(I-1)所示化合物；或者將上述式(Ⅵ)所示化合物與3-氯丙醯氯或烯丙醯氯在堿的作用下透過直接縮合或者直接縮合後再消除氯化氫烯烴化的方式進行反應，得到式(I-2)所示化合物；或者將上述式(Ⅵ)所示化合物與式(Ⅶ)所示的烯酸類衍生物在縮合劑作用下進行反應，得到式(I-3)或式(I-4)所示化合物，R”分別為氫或氟、氯、溴、碘；或者將上述式(Ⅵ)所示化合物與氰基乙酸或硝基乙酸在縮合劑的作用下得到醯胺化合物，然後再與式(Ⅷ)所示醛類化合物發生腦文格反應得到式(I-4)所示化合物；R”為硝基或氰基；M-COOH (Ⅲ)；其中，Y選自以下基團：R₉為三氟甲基或甲基；R₁₁為取代或非取代的吡啶基；R₁₀和R₁₂獨立的選自取代或非取代的苯基；所述R₁₀，R₁₁和R₁₂中的取代基獨立的選自硝基、羥基、巰基、氟、氯、溴、碘、氰基、取代或非取代C1~10烷基；所述烷基的取代基選自氟、氯、溴、碘、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、醯胺基；所述M選自以下基團：且N原子與羰基相連；其中，P選自CR₅R₆，N-R₇或O；R₇為氫、取代或非取代C1~8烷基或；所述取代基選自氟、氯、溴、碘、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、醯胺基；R₅、R₆、R₈獨立的選自取代或非取代C1~8烷基，或取代或非取代C1~8雜烷基；所述取代基選自氟、氯、溴、碘、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、醯胺基；R’為氫、取代或非取代的C1~6烷基、取代或非取代的C1~6雜烷基；所述取代基選自氟、氯、溴、碘、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、醯胺基、烷基、環烷基；R”為氫、硝基、鹵素或氰基；或者M為式(Ⅱ)所示基團，A為金剛烷基，且氨基與羰基相連；
一種藥物組合物，其包括如請求項1~3任一項所述的化合物或其鹽或如請求項4所述的製備方法所製備的化合物或其鹽，以及藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、輔劑、媒介物或它們的組合。
一種如請求項1~3任一項所述的化合物或如請求項4所述的製備方法所製備的化合物或如請求項5所述的藥物組合物之用途，其係製備用於治療或減輕BTK介導的疾病的藥物。
如請求項6所述的用途，其中所述BTK介導的疾病選自免疫、自身免疫、炎症疾病、過敏症、感染性疾病、增生性病症和癌症疾病中的任意一種或多種。
如請求項7所述的用途，其中所述BTK介導的疾病選自風濕性關節炎、感染性關節炎、致畸性關節炎、痛風性關節炎、脊椎炎、胰腺炎、慢性支氣管炎、急性支氣管炎、過敏性支氣管炎、毒性支氣管炎、兒科哮喘、變應性肺泡炎、過敏性或非過敏性鼻炎、慢性鼻竇炎、囊性纖維化或黏液黏稠病、咳嗽、肺氣腫、間質性肺病、肺泡炎、鼻息肉、肺水腫、各種原因的肺炎、紅斑狼瘡、全身性硬皮病、結節病、亞彌型漫性大B細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞淋巴瘤、結外邊緣帶B細胞淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞白血病、B細胞幼淋巴細胞白血病、成熟B細胞的急性成淋巴細胞性白血病、17p缺失的慢性淋巴細胞白血病、Waldenström巨球蛋白血症、淋巴質漿細胞淋巴瘤、脾臟邊緣帶淋巴瘤、漿細胞性骨髓瘤、漿細胞瘤、結內邊緣帶B細胞淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤和原發性滲出性淋巴瘤中的一種或多種。