TWI643869B - Molecular extension printing material and preparation method thereof, magnetic molecular extension printing material and preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
本發明分子拓印材及磁性分子拓印材的製備方法，透過使用選自於具有特性(i)至(ii)的胜肽做為模板化合物，製得具有辨識胰腺再生蛋白之能力的分子拓印材及磁性分子拓印材。其中胜肽的特性(i)至(ii)為：(i)該胺基酸序列含有的胺基酸的總數目範圍為8至25個，疏水性胺基酸的數目範圍為2至10個，親水性胺基酸的數目範圍為6至15個，具有苯環的胺基酸的數目範圍為1至6個，且親水性胺基酸的總數大於疏水性胺基酸的總數；以及(ii)該胺基酸序列的兩個末端分別為親水性胺基酸。
Description
本發明是有關於分子拓印材及其製備方式，特別是指一種用於辨識胰腺再生蛋白的分子拓印材及其製備方法。
胰腺再生蛋白1(Regenerating islet-derived protein 1，Reg1)是胰腺導管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)的體外尿液檢測的生物標誌物，檢測患者尿液中是否含有胰腺再生蛋白1即可知道其是否患有胰腺導管腺癌。
分子拓印材是在分子拓印聚合物基質上形成具有選擇辨識性的空穴以辨識目標分子。目標分子例如可為白蛋白，溶菌酶，血紅蛋白或肌紅蛋白等蛋白質。通常情況下，會使用完整的蛋白質做為模板化合物來製備分子拓印材，但以胰腺再生蛋白1來說，純化的胰腺再生蛋白1的售價非常高昂，1 mg約為新台幣150,000元，若直接使用胰腺再生蛋白1製備分子拓印材是非常不切實際及不符合成本效益的。
有鑑於此，如何以簡單且成本低的方式製備出能夠辨識待測檢體中是否含有胰腺再生蛋白的分子拓印材是亟欲解決的問題。
因此，本發明之第一目的，即在提供一種用於識別胰腺再生蛋白的分子拓印材的製備方法。
於是，本發明分子拓印材製備方法，包含以下步驟： 步驟(A) 將一分子拓印聚合物、一模板化合物以及一溶劑混合，使該分子拓印聚合物及該模板化合物溶解於該溶劑得到一混合液，其中，該模板化合物是選自於具有以下特性的胜肽： (i) 該胺基酸序列含有的胺基酸的總數目範圍為8至25個，其中，疏水性胺基酸的數目範圍為2至10個，親水性胺基酸的數目範圍為6至15個，具有苯環的胺基酸的數目範圍為1至6個，且親水性胺基酸的總數大於疏水性胺基酸的總數，以及 (ii)該胺基酸序列的兩個末端分別為親水性胺基酸； 步驟(B) 使該混合液中的該溶劑揮發，以形成一固化物；及 步驟(C) 移除該固化物中的該模板化合物，形成一用於識別胰腺再生蛋白的分子拓印材。
因此，本發明之第二目的，即在提供一種用於識別胰腺再生蛋白的分子拓印材。
於是，本發明分子拓印材，是由如上所述的分子拓印材製備方法所製得。
因此，本發明之第三目的，即在提供一種用於識別胰腺再生蛋白的磁性分子拓印材的製備方法。
於是，本發明磁性分子拓印材製備方法，包含以下步驟： 步驟(1) 將一分子拓印聚合物、一模板化合物及一溶劑混合，使該分子拓印聚合物及該模板化合物溶解於該溶劑得到一混合液，其中，該模板化合物是選自於具有以下特性的胜肽： (i) 該胺基酸序列含有的胺基酸的總數目範圍為8至25個，其中疏水性胺基酸的數目範圍為2至10個，親水性胺基酸的數目範圍為6至15個，具有苯環的胺基酸的數目範圍為1至6個，且親水性胺基酸的總數大於疏水性胺基酸的總數，以及 (ii)該胺基酸序列的兩個末端分別為親水性胺基酸； 步驟(2) 將該混合液與複數個磁性顆粒混合，得到一複合溶液； 步驟(3) 使該複合溶液經由相轉化形成複數個磁性分子拓印粗產物；及 步驟(4) 移除該等磁性分子拓印粗產物中的該模板化合物，形成一用於識別胰腺再生蛋白的磁性分子拓印材。
因此，本發明之第四目的，即在提供一種用於識別胰腺再生蛋白的磁性分子拓印材。
於是，本發明磁性分子拓印材，是由如上所述的磁性分子拓印材製備方法所製得。
本發明之功效在於：該分子拓印材及該磁性分子拓印材的製備方法透過使用具有特性(i)至(ii)的胜肽做為模板化合物，所製得的分子拓印材及磁性分子拓印材能夠辨識胰腺再生蛋白。
本發明的另一功效在於，相較於使用胰腺再生蛋白做為模板化合物，該分子拓印材及該磁性分子拓印材的製備方法中使用成本較低的胜肽做為模板化合物，因此能以成本低廉的方式製備分子拓印材及磁性分子拓印材，進而能夠透過簡單且成本較低的方式辨識待測檢體中是否含有胰腺再生蛋白。
以下就本發明內容進行詳細說明：
本發明中分子拓印材及磁性分子拓印材能辨識「胰腺再生蛋白家族(Regenerating protein family)」中任何一種「胰腺再生蛋白(Regenerating islet-derived protein )」，例如I型、II型、III型及IV型的胰腺再生蛋白。
〈分子拓印材及其製備方法〉
該分子拓印材製備方法的步驟是如上所述，故不再贅述。
該分子拓印材製備方法所製得的分子拓印材更具體地說，包括一個由該分子拓印聚合物所形成的分子拓印聚合物基體，以及複數個由該模板化合物被移除後所形成在該分子拓印聚合物基體的拓印空穴，且該等拓印空穴能夠吸附胰腺再生蛋白，進而使得分子拓印材對胰腺再生蛋白具有專一辨識性。
該分子拓印聚合物的種類沒有特別限制，可使用分子拓印領域中常用的分子拓印聚合物。較佳地，該分子拓印聚合物是選自於乙烯-乙烯醇共聚物、甲殼素、聚(羥甲基3,4-伸乙基二氧噻吩)[(Poly(hydroxymethyl 3,4-ethylene dioxythiophene)]、聚(苯胺-共-甲酸)[poly(aniline-co-metanilic acid)]、聚苯硫醚[poly(p-phenylene sulfide)]、聚噻吩[poly(thiophene)]或上述的任意組合。更佳地，該分子拓印聚合物是選自於乙烯-乙烯醇共聚物，且該乙烯-乙烯醇共聚物的乙烯莫耳含量範圍為27至44 mol%。
較佳地，以該混合液的總量為100wt%，該分子拓印聚合物的用量範圍為0.001至25wt%。
為了能夠於移除該模板化合物後，在該分子拓印聚合物基體形成能夠吸附胰腺再生蛋白的拓印空穴，該模板化合物選自於具有特性(i)至(ii)的胜肽。該模板化合物因具有特性(i)至(ii)，所以能夠與該分子拓印聚合物有很好的親和力，且有利於在該分子拓印聚合物基體形成能夠吸附胰腺再生蛋白的拓印空穴。其中，該具有特性(i)至(ii)的胜肽可以是胰腺再生蛋白的任何結構上的胺基酸序列，例如該具有特性(i)至(ii)的胜肽可以是胰腺再生蛋白的一級結構或二級結構上的胺基酸序列。
較佳地，該模板化合物是一具有一選自於由下列所構成的群組中的胺基酸序列的胜肽：序列辨識編號：1、序列辨識編號：2、序列辨識編號：3、序列辨識編號：4、序列辨識編號：5、序列辨識編號：6，以及序列辨識編號：7。
<TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 胰腺再生蛋白 </td><td> 胺基酸序列 </td><td> 對應於胰腺再生蛋白的胺基酸殘基位置 </td><td> 序列辨識編號 </td></tr><tr><td> Reg1A </td><td> SSTGFQKWKDVPCEDK </td><td> 142-157 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> KSWGIGAPSSVNPGYCVS </td><td> 122-139 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> KESGTDDFNVWIG </td><td> 89-101 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> NEDRETWVDADLY </td><td> 51-63 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Reg1B </td><td> SCSGFKKWKDESCEKK </td><td> 142-157 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KSWDTGSPSSANAGYCAS </td><td> 122-139 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> KESSTDDSNVWIG </td><td> 89-101 </td><td> 6 </td></tr></TBODY></TABLE>胺基酸序列中，親水性胺基酸為：N、Q、S、T、C、Y、G、K、D、E。疏水性胺基酸為：A、V、L、I、F、W、P、M。含苯環的胺基酸為：F、W、Y。
較佳地，以該混合液的總量為100wt%，該模板化合物的用量範圍為0.001至25wt%。
該溶劑的種類沒有特別限制，只要能夠溶解該模板化合物及該分子拓印聚合物即可。較佳地，該溶劑是選於二甲基亞碸、濃度範圍為0.01至5wt%的醋酸溶液，或上述的任意組合。
該分子拓印材製備方法的步驟(A)中的操作條件沒有特別限制，可根據具體使用的模板化合物、分子拓印聚合物及溶劑的種類適當調整操作時的溫度範圍以利於模板化合物及分子拓印聚合物溶解在溶劑中。
該分子拓印材製備方法的步驟(B)中的操作條件沒有特別限制，可根據具體使用的溶劑的種類適當調整操作時的加熱溫度範圍以使該混合液中的該溶劑揮發。
該分子拓印材製備方法的步驟(C)中的操作條件沒有特別限制，可依據具體使用的模板化合物及分子拓印聚合物的種類選擇適當的方式移除該固化物中的該模板化合物。較佳地，是使用一沖提劑清洗該固化物，以從該固化物中移除該模板化合物。更佳地，該沖提劑是選自於十二烷基硫酸鈉水溶液、去離子水、酒精、甲醇或上述的任意組合。其中，該十二烷基硫酸鈉水溶液的濃度範圍例如但不限於0.001至10wt%。
〈磁性分子拓印材及其製備方法〉
該磁性分子拓印材製備方法的步驟是如上所述，故不再贅述。
該磁性分子拓印材製備方法所製得的磁性分子拓印材更具體地說，是概呈顆粒狀且包括一個由該分子拓印聚合物所形成的分子拓印聚合物基體、多個被該分子拓印聚合物基體包覆的磁性顆粒，以及複數個由該模板化合物被移除後所形成在該分子拓印聚合物基體的拓印空穴，且該等拓印空穴能夠吸附胰腺再生蛋白，進而使得磁性分子拓印材對胰腺再生蛋白具有專一辨識性。
該磁性分子拓印材製備方法中使用的該分子拓印聚合物、模板化合物及溶劑是與該分子拓印材製備方法中所使用的相同，故於此不再贅述。
在該磁性分子拓印材製備方法中使用的該磁性顆粒，其種類及平均粒徑沒有特別限制，只要能夠使磁性分子拓印材具有磁性且不影響到辨識胰腺再生蛋白能力的磁性顆粒皆適用。該磁性顆粒的種類例如但不限於四氧化三鐵、鐵酸鈷、鐵酸錳、氧化鐵、氧化亞鐵或上述的任意組合。該磁性顆粒的平均粒徑範圍例如但不限於1nm至300nm。該磁性顆粒的製備方式沒有特別限制，可依據現有的磁性顆粒的製備方法。
該磁性分子拓印材製備方法的步驟(1)中的操作條件沒有特別限制，可根據具體使用的模板化合物、分子拓印聚合物及溶劑的種類適當調整操作時的溫度範圍以利於模板化合物及分子拓印聚合物溶解在溶劑中。
該磁性分子拓印材製備方法的步驟(2)中的操作條件沒有特別限制，可根據具體使用的磁性顆粒的種類適當調整操作時的條件以使該混合液能與磁性顆粒充分混合得到該複合溶液。
該磁性分子拓印材製備方法的步驟(3)中的操作條件沒有特別限制，可根據具體使用的該分子拓印聚合物、溶劑及磁性顆粒的種類選自適當的方式使該複合溶液進行相轉化(phase inversion)形成磁性分子拓印粗產物。該相轉化更具體地說是濕式(immersion precipitation)相轉化。
該磁性分子拓印材製備方法的步驟(4)中的操作條件沒有特別限制，可依據具體使用的模板化合物及分子拓印聚合物的種類選擇適當的方式移除該磁性分子拓印粗產物中的該模板化合物。較佳地，移除該磁性分子拓印粗產物中的該模板化合物的方式是使用一沖提劑清洗該固化物。更佳地，該沖提劑是選自於十二烷基硫酸鈉水溶液、去離子水、酒精、甲醇或上述的任意組合。其中，該十二烷基硫酸鈉水溶液的濃度範圍例如但不限於0.001至10wt%。
本發明將就以下實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施之限制。
[實施例A1]
將乙烯-乙烯醇共聚物(廠商為Sigma-Aldrich，乙烯的莫耳含量為27 mol%)以及模板化合物(為具有胺基酸序列辨識編號1的胜肽，購自於曜鴻生物科技有限公司，HPLC等級)與適量的二甲基亞碸混合，加熱到55至60℃並攪拌24小時使乙烯-乙烯醇共聚物及模板化合物溶於二甲基亞碸中，得到一混合液，其中以該混合液的總量為100wt%，該乙烯醇-乙烯共聚物的含量為0.1wt%，該模板化合物的含量為0.01mg/mL (=0.9wt%)。將2μL的混合液塗佈在一基板(為一絲網印刷金電極，廠商為DropSens，型號為DRP-250AT，直徑為4mm)。接著將塗佈有該混合液的基板置於50℃的烘箱中加熱6小時使該混合液中的二甲基亞碸蒸發，以在該基板的表面形成一固化薄膜。使用渦流震盪機先以10mL的0.1 wt%的十二烷基硫酸鈉水溶液清洗該固化薄膜10分鐘後，再以去離子水清洗該固化薄膜10分鐘，並交替地使用0.1 wt%的十二烷基硫酸鈉水溶液及去離子水進行上述的清洗流程共3次以去除該固化薄膜中的模板化合物，即在該基板上形成實施例1的用於識別胰腺再生蛋白的分子拓印材。
[實施例A2至A4]
使用與實施例A1相同的方法製備實施例A2至A4的用於識別胰腺再生蛋白的分子拓印材，差別在於如表1所示改變乙烯-乙烯醇共聚物中乙烯的莫耳含量。
[實施例B1至B4、C1至C4、D1至D4、E1至E4、F1至F4及G1至G4]
使用與實施例A1相同的方法製備實施例B1至B4、C1至C4、D1至D4、E1至E4、F1至F4及G1至G4的用於識別胰腺再生蛋白的分子拓印材，差別在於如表1所示改變模板化合物的種類及乙烯-乙烯醇共聚物中乙烯的莫耳含量。其中，實施例B1至B4中的模板化合物為具有胺基酸序列辨識編號2的胜肽(購自於曜鴻生物科技有限公司，HPLC等級)；實施例C1至C4中的模板化合物為具有胺基酸序列辨識編號3的胜肽(購自於曜鴻生物科技有限公司，HPLC等級)；實施例D1至D4中的模板化合物為具有胺基酸序列辨識編號4的胜肽(購自於曜鴻生物科技有限公司，HPLC等級)；實施例E1至E4中的模板化合物為具有胺基酸序列辨識編號5的胜肽(購自於曜鴻生物科技有限公司，HPLC等級)；實施例F1至F4中的模板化合物為具有胺基酸序列辨識編號6的胜肽(購自於曜鴻生物科技有限公司，HPLC等級)；實施例G1至G4中的模板化合物為具有胺基酸序列辨識編號7的胜肽(購自於曜鴻生物科技有限公司，HPLC等級)。
[實施例H]
先依據以下步驟製備四氧化三鐵磁性顆粒：將0.001至5M的FeSO
4．7H
2O水溶液及0.002至10M的FeCl
3．6H
2O水溶液混合形成鐵離子溶液，接著將該鐵離子溶液加入到裝有1至14N的氫氧化鈉水溶液的燒杯中並在60至80℃下快速攪拌，經由共沉澱法生成四氧化三鐵磁性顆粒粗產物。以強力磁鐵隔著燒杯底部吸附燒杯內的四氧化三鐵磁性顆粒粗產物，待四氧化三鐵磁性顆粒粗產物沉降後去除燒杯內的液體，再於燒杯中加入10mL離子水攪拌。再次以強力磁鐵隔著燒杯底部吸附燒杯內的四氧化三鐵磁性顆粒粗產物，待四氧化三鐵磁性顆粒粗產物沉降後再次去除燒杯內的液體，再於燒杯中加入由10mL的DMSO及2mL的油酸組成的溶液並在60至80°C水浴下攪拌2至6小時。再用強力磁鐵隔著燒杯底部吸附燒杯內的四氧化三鐵磁性顆粒粗產物，待四氧化三鐵磁性顆粒粗產物沉降後去除燒杯內的液體，再於燒杯中加入10mL至50mL去離子水攪拌後，待四氧化三鐵磁性顆粒粗產物自然沉降並移除上層液體後，將四氧化三鐵磁性顆粒粗產物冷凍乾燥，即得到四氧化三鐵磁性顆粒。
再依據以下步驟製備實施例H的磁性分子拓印材：將乙烯-乙烯醇共聚物(廠商為Sigma-Aldrich，乙烯的莫耳含量為32 mol%)以及模板化合物(為具有胺基酸序列辨識編號7的胜肽，購自於曜鴻生物科技有限公司，HPLC等級)與適量的二甲基亞碸混合，加熱到55至60℃並攪拌24小時使乙烯-乙烯醇共聚物及模板化合物溶於二甲基亞碸中，得到一混合液，其中以該混合液的總量為100wt%，該乙烯醇-乙烯共聚物的含量為0.1wt%，該模板化合物的含量為1mg/mL(=9wt%)。將10 mL的混合液與10 mg四氧化三鐵磁性顆粒混合並攪拌均勻，得到一複合溶液。再吸取100μL的複合溶液緩慢滴入10mL且恆溫5℃的由體積比例為6：4的去離子水與異丙醇所組成的溶液中，攪拌15分鐘進行相轉化得到顆粒狀的磁性分子拓印粗產物。以0.1 wt%的十二烷基硫酸鈉水溶液清洗該磁性分子拓印粗產物5至30分鐘後抽掉液體的部分，接著再以去離子水清洗該磁性分子拓印粗產物5至30分鐘後抽掉液體的部分，並交替地使用0.1 wt%的十二烷基硫酸鈉水溶液及去離子水進行上述的清洗流程共3次，以去除該磁性分子拓印粗產物中的模板化合物，即得到實施例H的用於識別胰腺再生蛋白的磁性分子拓印材。
實施例A1至A4、B1至B4、C1至C4、D1至D4、E1至E4、F1至F4及G1至G4的分子拓印材，分別包括：一個由乙烯-乙烯醇共聚物所形成的分子拓印聚合物基體，以及複數個由模板化合物被移除後所形成在該分子拓印聚合物基體的拓印空穴，且該等拓印空穴能夠吸附胰腺再生蛋白。
實施例H的磁性分子拓印材是概呈顆粒狀且包括：一個由乙烯-乙烯醇共聚物所形成的分子拓印聚合物基體、多個被該分子拓印聚合物基體包覆的四氧化三鐵磁性顆粒，以及複數個由模板化合物被移除後所形成在該分子拓印聚合物基體的拓印空穴，且該等拓印空穴能夠吸附胰腺再生蛋白。
[應用例H-1]
由於人類胰腺再生蛋白Reg1B可在大腸桿菌中複製，所以可將重組型人類胰腺再生蛋白Reg1B轉形(transformation)至大腸桿菌中，藉由培養該大腸桿菌就可以生成人類胰腺再生蛋白Reg1B。首先製備含有人類胰腺再生蛋白Reg1B的大腸桿菌代謝液，再使用實施例H的磁性分子拓印材對大腸桿菌代謝液進行萃取，即能夠從中得到人類胰腺再生蛋白Reg1B。其中，大腸桿菌代謝液的製備方式詳述如下：在500mL閃蒸瓶中，將1 mL的濃度為10
6cell/mL的大腸桿菌[購自於生物資源保存及研究中心(BCRC)，重組型人類胰腺再生蛋白Reg1B已轉形至大腸桿菌]加入到200 mL新鮮LB培養基中並培育過夜。將培育有大腸桿菌的LB培養基置於搖動培養箱中在30℃進一步培育10天。然後使用離心機(廠商：祥泰，型號：CN-1000)以轉速2000 rpm離心15分鐘，將大腸桿菌從LB培養基中分離出，剩下的培養基即為大腸桿菌代謝液培養基。
再使用實施例H的磁性分子拓印材從大腸桿菌代謝液培養基中萃取出人類胰腺再生蛋白Reg1B。萃取使用的儀器為核酸萃取儀(廠商：Thermo Fisher Scientific，型號：KingFisher
®mL)，並以該核酸萃取儀內建的自動化萃取程序進行，其中自動化萃取程序詳述如下： 取5根試管並分別設定為A、B、C、D及E，A試管中裝有0.5至2mL的去離子水以及1mg的實施例H的磁性分子拓印材，B試管中裝有該大腸桿菌代謝液培養基，C試管、D試管及E試管中分別裝有去離子水，用於將實施例H的磁性分子拓印材萃取到的人類胰腺再生蛋白Reg1B洗掉。 自動化萃取程序中設定的流程為： (步驟1).在A試管設定為將實施例H磁性分子拓印材與去離子水混合，然後，使用磁棒吸附實施例H磁性分子拓印材，取出該實施例H磁性分子拓印材再將實施例H磁性分子拓印材並釋放於B試管中； (步驟2).在B試管設定為使用實施例H磁性分子拓印材進行第一次萃取，以使人類胰腺再生蛋白Reg1B吸附於該實施例H磁性分子拓印材上而自大腸桿菌代謝液培養基中脫離，萃取結束後再以磁棒吸附該實施例H磁性分子拓印材，取出該實施例H磁性分子拓印材並釋放於C試管中； (步驟3).在C試管設定為將經過步驟2的實施例H磁性分子拓印材利用去離子水進行10分鐘的清洗，以使人類胰腺再生蛋白Reg1B自該實施例H磁性分子拓印材上脫離，然後，獲得清洗過的實施例H磁性分子拓印材，再以磁棒吸附清洗過的實施例H磁性分子拓印材，取出清洗過的實施例H磁性分子拓印材並釋放於B試管中； (步驟4). 在B試管中設定使用在步驟3(C試管)中得到的該清洗過的實施例H磁性分子拓印材對大腸桿菌代謝液培養基進行第二次萃取，萃取結束後再以磁棒吸附該實施例H磁性分子拓印材，取出該實施例H磁性分子拓印材並釋放於D試管中； (步驟5). 在D試管設定為將經過步驟4的實施例H磁性分子拓印材利用去離子水進行10分鐘的清洗，以使人類胰腺再生蛋白Reg1B自該實施例H磁性分子拓印材上脫離，然後，獲得清洗過的實施例H磁性分子拓印材，再以磁棒吸附清洗過的實施例H磁性分子拓印材，取出清洗過的實施例H磁性分子拓印材並釋放於B試管中； (步驟6). 在B試管中設定使用在步驟5(D試管)中得到的該清洗過的實施例H磁性分子拓印材對大腸桿菌代謝液培養基進行第三次萃取，萃取結束後再以磁棒吸附該實施例H磁性分子拓印材，取出該實施例H磁性分子拓印材並釋放於E試管中； (步驟7). 在E試管設定為將經過步驟6的實施例H磁性分子拓印材利用去離子水進行10分鐘的清洗，以使人類胰腺再生蛋白Reg1B自該實施例H磁性分子拓印材上脫離，然後，獲得清洗過的實施例H磁性分子拓印材，再以磁棒吸附清洗過的實施例H磁性分子拓印材，取出清洗過的實施例H磁性分子拓印材並釋放於B試管中。 上述步驟1至7算一次的萃取回合，重複進行萃取回合共四次，也就是總共的萃取次數為12次，並在每次萃取回合中個別收集C、D及E試管中的人類胰腺再生蛋白Reg1B以進行後續的檢測。
[性質評價]
1. 電流密度差(Δcurrent)
在上述每一實施例中使用的基板為絲網印刷金電極，因此將每一實施例的分子拓印材連同其基板做為分子拓印電極，並以循環伏安法對每一實施例的分子拓印材進行電化學分析，得到每一實施例的分子拓印材的電流密度差(current density differences，Δcurrent ，單位為μA/cm
2)。其中，循環伏安法中使用的參考電極為氯化銀，輔助電極為白金，工作電極為每一實施例的分子拓印電極，電解液是由500 mM的KCl、20 mM的K
4Fe(CN)
6及20 mM的K
3Fe(CN)
6所組成，掃描電壓為-600mV至600mV，掃描速度為0.1V/s。結果如表1所示。
2. 拓印效率(α)
依據以下的定義計算每一實施例分子拓印材的拓印效率(imprinting effectiveness，α)。 α＝ MIPs ∆current ÷ NIPs ∆current。 拓印效率的結果如表1所示，其中，「MIPs」表示製備過程中有使用模板化合物所得到的分子拓印材，即各個實施例的分子拓印材；「NIPs」表示製備過程中沒有使用模板化合物所得到的分子拓印材，且「MIPs」及「NIPs」中使用的分子拓印聚合物為相同。例如，實施例A1分子拓印材的拓印效率α＝MIPs Δcurrent ÷ NIPs ∆current，其中「MIPs」表示實施例A1分子拓印材，「NIPs」表示採用與實施例A1相同的製備流程，但沒有使用模板化合物，且使用的乙烯-乙烯醇共聚物種類與實施例A1使用的乙烯-乙烯醇共聚物種類相同所製得的分子拓印材。
3.檢量線
使用不同濃度的模板化合物依據實施例中的步驟流程製做成分子拓印材，並量測分子拓印材的電流密度差(∆current)後，以模板化合物的濃度做為橫軸，以及對應的分子拓印材的電流密度差做為縱軸繪製成檢量線。圖1的模板化合物為具有胺基酸序列辨識編號2的胜肽，分子拓印聚合物為乙烯的莫耳含量27mol%的乙烯-乙烯醇共聚物；圖2的模板化合物為具有胺基酸序列辨識編號4的胜肽，分子拓印聚合物為乙烯的莫耳含量32 mol%的乙烯-乙烯醇共聚物；圖3的模板化合物為具有胺基酸序列辨識編號6的胜肽，分子拓印聚合物為乙烯的莫耳含量27mol%的乙烯-乙烯醇共聚物；圖4的模板化合物為具有胺基酸序列辨識編號7的胜肽，分子拓印聚合物為乙烯的莫耳含量32mol%的乙烯-乙烯醇共聚物。其中，圖1至圖4中「MIPs」表示製備過程中使用模板化合物所得到的分子拓印材，「NIPs」表示製備過程中沒有使用模板化合物所得到的分子拓印材。
4. 粒徑分析
使用粒徑分析儀(廠商：Brookhaven Instruments Co., New York，型號：90 Plus Particle Size Analyzer)分析以下待測樣品的平均粒徑：[1].製備過程中沒有使用模板化合物所得到的磁性分子拓印材(以實施例H的流程製備，但沒有使用模板化合物。表2及圖5中以「NIPs」表示)；[2].實施例H中的四氧化三鐵磁性顆粒(表2及圖5中以「MNPs」表示)；[3].實施例H中的磁性分子拓印粗產物(表2及圖5中以「MIPs(Bw)」表示)；[4].實施例H中的磁性分子拓印材(表2及圖5中以「MIPs(Aw)」表示)；[5].應用例H-1中的已萃取到人類胰腺再生蛋白Reg1B的實施例H磁性分子拓印材(表2及圖5中以「MIPs(Rb)」表示)。分析結果如表2及圖5所示。
5. 表面形貌分析
以穿透式電子顯微鏡(廠商：Hitachi，型號：H-7500)分析應用例H-1中的已萃取到人類胰腺再生蛋白Reg1B的實施例H磁性分子拓印材。結果如圖6所示。
6. 應用例H-1中人類胰腺再生蛋白Reg1B的萃取量及萃取率
將在應用例H-1每次萃取回合中收集到C、D及E試管中的人類胰腺再生蛋白Reg1B以循環伏安法分別進行電化學檢測。循環伏安法的操作條件是與上述量測電流密度差的操作條件相同，故於此不再贅述，差別在於使用不同的工作電極。 其中，關於工作電極的製備方式說明如下：先使用與實施例G中相同的方式製做一分子拓印電極，其中，模板化合物為具有胺基酸序列辨識編號7的胜肽且濃度為1mg/mL，分子拓印聚合物為乙烯的莫耳含量32 mol%的乙烯-乙烯醇共聚物。將萃取得到的人類胰腺再生蛋白Reg1B取2 μL加入到998 μL的濃度為0.2M的赤血鹽水溶液中得到一待測液，將2μL待測液滴到該分子拓印電極上後做為工作電極。 將循環伏安法得到的結果配合檢量線 (參閱圖4)換算，可得知在應用例H-1中使用實施例H磁性分子拓印材所萃取到的人類胰腺再生蛋白Reg1B的萃取量。並使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(廠商：Sino Biological Inc.，貨號：SEK11638)量測萃取前以及總共萃取12次後的大腸桿菌代謝液培養基中的人類胰腺再生蛋白Reg1B的濃度，可算出使用實施例H磁性分子拓印材萃取人類胰腺再生蛋白Reg1B的總萃取率。結果如表3所示。
表1
<TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 模板化合物 </td><td> 分子拓印聚合物 </td><td> MIPs Δcurrent (μA/cm<sup>2</sup>) </td><td> NIPs Δcurrent (μA/cm<sup>2</sup>) </td><td> 拓印效率(α) </td></tr><tr><td> 胜肽的胺基酸序列辨識編號 </td><td> 含量(mg/mL) </td><td> EVAL中乙烯的莫耳含量(mol%) </td></tr><tr><td> 實施例 A </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 27 </td><td> 39.46±2.53 </td><td> 24.06±7.05 </td><td> 1.64 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32 </td><td> 74.12±6.37 </td><td> 27.08±4.29 </td><td> 2.74 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 38 </td><td> 55.43±2.35 </td><td> 25.34±5.49 </td><td> 2.19 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 44 </td><td> 46.60±0.74 </td><td> 24.76±6.68 </td><td> 1.88 </td></tr><tr><td> 實施例 B </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 27 </td><td> 75.88 ± 1.78 </td><td> 31.49±0.65 </td><td> 2.41 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32 </td><td> 59.74±3.40 </td><td> 25.95±6.58 </td><td> 2.30 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 38 </td><td> 49.37±1.47 </td><td> 24.85±7.01 </td><td> 1.99 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 44 </td><td> 45.49±0.92 </td><td> 25.46±7.85 </td><td> 1.79 </td></tr><tr><td> 實施例 C </td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 27 </td><td> 71.35±10.39 </td><td> 24.09±5.43 </td><td> 2.96 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32 </td><td> 52.41±2.82 </td><td> 23.81±7.36 </td><td> 2.20 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 38 </td><td> 43.52±2.03 </td><td> 25.46±7.24 </td><td> 1.71 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 44 </td><td> 37.40±0.93 </td><td> 23.56±5.14 </td><td> 1.59 </td></tr><tr><td> 實施例 D </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 1 </td><td> 27 </td><td> 52.53±3.67 </td><td> 25.08±6.25 </td><td> 2.09 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32 </td><td> 77.97 ± 3.25 </td><td> 30.45±2.07 </td><td> 2.56 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 38 </td><td> 42.99±3.28 </td><td> 24.63±8.87 </td><td> 1.75 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 44 </td><td> 32.83±4.04 </td><td> 24.11±6.60 </td><td> 1.36 </td></tr><tr><td> 實施例 E </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 27 </td><td> 60.05±3.83 </td><td> 26.85±8.30 </td><td> 2.24 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32 </td><td> 74.55±2.50 </td><td> 25.30±7.45 </td><td> 2.95 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 38 </td><td> 51.43±1.67 </td><td> 23.33±9.85 </td><td> 2.20 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 44 </td><td> 44.21±1.72 </td><td> 26.78±6.07 </td><td> 1.65 </td></tr><tr><td> 實施例 F </td><td> 1 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 27 </td><td> 78.66 ± 4.00 </td><td> 31.23±2.68 </td><td> 2.52 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32 </td><td> 56.47±2.63 </td><td> 26.40±8.46 </td><td> 2.14 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 38 </td><td> 48.72±1.53 </td><td> 28.88±7.58 </td><td> 1.69 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 44 </td><td> 37.44±2.67 </td><td> 24.0 3±7.93 </td><td> 1.56 </td></tr><tr><td> 實施例 G </td><td> 1 </td><td> 7 </td><td> 1 </td><td> 27 </td><td> 52.53±3.67 </td><td> 27.99±6.46 </td><td> 1.88 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32 </td><td> 75.08 ± 1.01 </td><td> 30.10±0.88 </td><td> 2.49 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 38 </td><td> 46.50±0.94 </td><td> 24.94±7.26 </td><td> 1.86 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 44 </td><td> 38.24±1.39 </td><td> 24.70±7.17 </td><td> 1.55 </td></tr></TBODY></TABLE>註：「EVAL」表示乙烯-乙烯醇共聚物
由表1的結果證明，實施例A1至A4、B1至B4、C1至C4、D1至D4、E1至E4、F1至F4及G1至G4的製備方法得到的分子拓印材具有由模板化合物移除後所形成的拓印空穴。
表2
<TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 平均粒徑(單位nm) </td></tr><tr><td> 沒有使用模板化合物所得到的 磁性分子拓印材 </td><td> NIPs </td><td> 84 </td></tr><tr><td> 實施例H的 四氧化三鐵磁性顆粒 </td><td> MNPs </td><td> 55 </td></tr><tr><td> 實施例H的 磁性分子拓印粗產物 </td><td> MIPs(Bw) </td><td> 165.4 </td></tr><tr><td> 實施例H的 磁性分子拓印材 </td><td> MIPs(Aw) </td><td> 87 </td></tr><tr><td> 應用例H-1的 已萃取到人類胰腺再生蛋白Reg1B的實施例H磁性分子拓印材 </td><td> MIPs(Rb) </td><td> 131.9 </td></tr></TBODY></TABLE>
由表2的結果可知，實施例H的磁性分子拓印粗產物[還未移除模板化合物，MIPs(Bw)]的平均粒徑大於沒有使用模板化合物所得到的磁性分子拓印材(NIPs)的平均粒徑，顯示在實施例H的磁性分子拓印粗產物中確實具有模板化合物。而磁性分子拓印粗產物的平均粒徑大於磁性分子拓印材[已移除模板化合物，MIPs(Aw)]的平均粒徑，顯示移除模板化合物後，實施例H的磁性分子拓印材具有模板化合物移除後所形成的拓印空穴。
表3
<TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 應用例H-1 </td><td> 萃取次數 </td><td> 萃取量(單位ng/mL) </td><td> 總萃取率(%) </td></tr><tr><td> 第1次 </td><td> 18.80±2.62 </td><td> 83.03±9.30% </td></tr><tr><td> 第2次 </td><td> 20.74±2.91 </td></tr><tr><td> 第3次 </td><td> 17.46±0.96 </td></tr><tr><td> 第4次 </td><td> 16.51±2.75 </td></tr><tr><td> 第5次 </td><td> 15.82±2.96 </td></tr><tr><td> 第6次 </td><td> 14.73±2.52 </td></tr><tr><td> 第7次 </td><td> 13.19±2.59 </td></tr><tr><td> 第8次 </td><td> 11.81±1.14 </td></tr><tr><td> 第9次 </td><td> 6.70±0.82 </td></tr><tr><td> 第10次 </td><td> 2.13±0.51 </td></tr><tr><td> 第11次 </td><td> 1.28±0.33 </td></tr><tr><td> 第12次 </td><td> 0.75±0.21 </td></tr></TBODY></TABLE>
由表3的萃取量及總萃取率顯示，在應用例H-1中，實施例H磁性分子拓印材能夠從大腸桿菌代謝液培養基中萃取出人類胰腺再生蛋白Reg1B，證明實施例H磁性分子拓印材具有辨識人類胰腺再生蛋白Reg1B的能力。並由第1次到第12次的萃取量也顯示實施例H磁性分子拓印材即使重複使用也能夠辨識人類胰腺再生蛋白Reg1B。
而從表3的結果也可推論實施例A1至A4、B1至B4、C1至C4、D1至D4、E1至E4、F1至F4及G1至G4的分子拓印材應該也具有辨識人類胰腺再生蛋白Reg1A、Reg1B的能力。
值得一提的是，胰腺再生蛋白1除了是胰腺導管腺癌的體外尿液檢測的生物標誌物，胰腺再生蛋白1還具有細胞增殖、調控保護細胞抗凋亡的功能，能夠做為治療組織傷口的藥物。但市售的人類胰腺再生蛋白1是在大腸桿菌中複製後，從大腸桿菌代謝產物中分離純化得到，因現有的分離純化流程操作不易，造成純化的人類胰腺再生蛋白1的市售價格高昂而不利於後續應用。而本發明分子拓印材及磁性分子拓印材的製備方法使用低成本的胜肽做為模板化合物，製成的分子拓印材及磁性分子拓印材對人類胰腺再生蛋白1具有專一辯識性，因此使用本發明的分子拓印材及磁性分子拓印材能夠從大腸桿菌代謝產物中萃取出人類胰腺再生蛋白1，再用簡單且無毒的清洗方式即能夠使人類胰腺再生蛋白1與分子拓印材及磁性分子拓印材分離，整套分離純化流程具有操作簡單、成本低廉的優勢。
惟以上所述者，僅為本發明之實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，凡是依本發明申請專利範圍及專利說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中： 圖1是以不同濃度的具有胺基酸序列辨識編號2的胜肽做為模板化合物所製得的分子拓印材的一檢量線數據圖； 圖2是以不同濃度的具有胺基酸序列辨識編號4的胜肽做為模板化合物所製得的分子拓印材的一檢量線數據圖； 圖3是以不同濃度的具有胺基酸序列辨識編號6的胜肽做為模板化合物所製得的分子拓印材的一檢量線數據圖； 圖4是以不同濃度的具有胺基酸序列辨識編號7的胜肽做為模板化合物所製得的分子拓印材的一檢量線數據圖； 圖5是本發明粒徑分析的結果的一數據圖；及 圖6是本發明應用例H-1中的已萃取到人類胰腺再生蛋白Reg1B的實施例H磁性分子拓印材的表面形貌的一照片。
<110> 國立高雄大學
<120> 分子拓印材及其製備方式、磁性分子拓印材及其製備方式
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於分子拓印的模板化合物
<400> 1
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於分子拓印的模板化合物
<400> 2
Ser Cys Ser Gly Phe Lys Lys Trp Lys Asp Glu Ser Cys Glu Lys Lys 1 5 10 15 ＜210＞ 3 ＜211＞ 18 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於分子拓印的模板化合物 ＜400＞ 3 Lys Ser Trp Gly Ile Gly Ala Pro Ser Ser Val Asn Pro Gly Tyr Cys 1 5 10 15 Val Ser ＜210＞ 4 ＜211＞ 18 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於分子拓印的模板化合物 ＜400＞ 4 Lys Ser Trp Asp Thr Gly Ser Pro Ser Ser Ala Asn Ala Gly Tyr Cys 1 5 10 15 Ala Ser ＜210＞ 5 ＜211＞ 13 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於分子拓印的模板化合物 ＜400＞ 5 Lys Glu Ser Gly Thr Asp Asp Phe Asn Val Trp Ile Gly 1 5 10 ＜210＞ 6 ＜211＞ 13 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於分子拓印的模板化合物 ＜400＞ 6 Lys Glu Ser Ser Thr Asp Asp Ser Asn Val Trp Ile Gly 1 5 10 ＜210＞ 7 ＜211＞ 13 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於分子拓印的模板化合物 ＜400＞ 7 Asn Glu Asp Arg Glu Thr Trp Val Asp Ala Asp Leu Tyr 1 5 10
Claims (6)
- 一種分子拓印材製備方法，包含以下步驟：步驟(A)將一分子拓印聚合物、一模板化合物以及一溶劑混合，使該分子拓印聚合物及該模板化合物溶解於該溶劑得到一混合液，其中，該模板化合物是一具有一選自於由下列所構成的群組中的胺基酸序列的胜肽：序列辨識編號：1、序列辨識編號：2、序列辨識編號：3、序列辨識編號：4、序列辨識編號：5、序列辨識編號：6，以及序列辨識編號：7；步驟(B)使該混合液中的該溶劑揮發，以形成一固化物；及步驟(C)移除該固化物中的該模板化合物，形成一用於識別胰腺再生蛋白的分子拓印材。
- 如請求項1所述的分子拓印材製備方法，其中，以該混合液的總量為100wt%，該模板化合物的用量範圍為0.001至25wt%。
- 如請求項1所述的分子拓印材製備方法，其中，該分子拓印聚合物是選自於乙烯-乙烯醇共聚物、甲殼素、聚(羥甲基3,4-伸乙基二氧噻吩)、聚(苯胺-共-甲酸)、聚苯硫醚、聚噻吩或上述的任意組合。
- 如請求項3所述的分子拓印材製備方法，其中，該分子拓印聚合物是選自於乙烯-乙烯醇共聚物，且該乙烯-乙烯醇共聚物的乙烯莫耳含量範圍為27至44mol%。
- 一種磁性分子拓印材製備方法，包含以下步驟： 步驟(1)將一分子拓印聚合物、一模板化合物以及一溶劑混合，使該分子拓印聚合物及該模板化合物溶解於該溶劑得到一混合液，其中，該模板化合物是一具有一選自於由下列所構成的群組中的胺基酸序列的胜肽：序列辨識編號：1、序列辨識編號：2、序列辨識編號：3、序列辨識編號：4、序列辨識編號：5、序列辨識編號：6，以及序列辨識編號：7；步驟(2)將該混合液與複數個磁性顆粒混合，得到一複合溶液；步驟(3)使該複合溶液經由相轉化形成複數個磁性分子拓印粗產物；及步驟(4)移除該等磁性分子拓印粗產物中的該模板化合物，形成用於識別胰腺再生蛋白的磁性分子拓印材。
- 如請求項5所述的磁性分子拓印材製備方法，其中，該分子拓印聚合物是選自於乙烯-乙烯醇共聚物、甲殼素、聚(羥甲基3,4-伸乙基二氧噻吩)、聚(苯胺-共-甲酸)、聚苯硫醚、聚噻吩或上述的任意組合。
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