JP2018031763A

JP2018031763A - 抗体および磁性ナノ粒子が結合された導電性高分子を含む血中のがん細胞の検出および回収用の磁性ナノ構造体

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Publication number: JP2018031763A
Application number: JP2017026925A
Authority: JP
Inventors: チョ、ヨンナム; Young Nam Cho; スクイ、ウン; Eun Sook Lee; ホン、ウヨン; Woo Young Hong
Original assignee: National Cancer Center Japan; National Cancer Center Korea
Current assignee: National Cancer Center Japan; National Cancer Center Korea
Priority date: 2016-08-24
Filing date: 2017-02-16
Publication date: 2018-03-01
Anticipated expiration: 2037-02-16
Also published as: KR20180022490A; US20180059114A1; KR101994370B1; JP6509926B2

Abstract

【課題】血中のがん細胞の検出及び回収用のナノ構造体の提供。【解決手段】抗体及び磁性ナノ粒子が結合された導電性高分子を含む血中のがん細胞の検出および回収用の磁性ナノ構造体に関する。少量の血液を用いて、初期がん患者の血中のがん細胞及び様々な種類の血中のがん細胞を効率的に検出することができ、比色検出を通して肉眼で血中のがん細胞のモニタリングが可能であり、多量の磁性ナノ粒子の搭載を通して発生される強い磁場で極微量で存在する血中のがん細胞を効率的に捕獲することができる。【選択図】図１ｂ

Description

本発明は抗体および磁性ナノ粒子が結合された導電性高分子のナノ構造体を通した血中のがん細胞の検出および回収に関するものである。

最近、全世界的にがん疾病の早期診断の重要性が大きく浮かび上がっており、したがって、がんの早期診断方法に関する研究の割合が増加している傾向である。
しかし、今までがんの診断方法は組織サンプルの採収および内視鏡の検査などの侵襲的な方法が主になっており、従来の侵襲的な診断および検査方法の代案としてリキッドバイオプシーが注目されている。リキッドバイオプシーは血液などの体液検査のみで身体部位別の血液内に存在するがん細胞由来のＤＮＡを解析してがんの発生および転移などに関する詳しい観察ができ、非侵襲的な（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ）方法を用いるため、遺伝体解析技術の急速な発展とコストの節減のメリットに基づいてがん診断技術へ応用しようとする努力が試みられている。

一方、血中循環腫瘍細胞（ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＴｕｍｏｒＣｅｌｌ、ＣＴＣ）は腫瘍細胞の一部が原発癌から離れ出て血管やリンパ管に流入され他の組織や臓器に移動するがんの過程で発見されて、どの段階で腫瘍が血流に血中循環腫瘍細胞を放出するのかは完全に解明されていないが、腫瘍の類型、サイズおよび／または攻撃性に応じて異なると推定されている。

これによって、がんの診断において、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は大きな相関関係を有していて、固形臓器で発生する様々な腫瘍の血中循環腫瘍細胞を検出、分離して特長を把握するための方法に関する研究が注目されている。したがって、血液を用いた非侵襲的、非手術的な方法で血中循環腫瘍細胞の検出を通してがんの診断およびがん患者の予後を観察することができるということが血中循環腫瘍細胞を用いる診断法の最も大きなメリットだといえる。

しかし、進行されたがんの場合、１ミリリットルの血液に１百万個以上の白血球が存在する一方、血中循環腫瘍細胞は１０−１００個程度で非常に低い濃度で存在して、血液内の白血球や血小板などに比べてＣＴＣ分布の程度が微々たるものであり、血中を循環する途中で、ほとんど死滅されるためＣＴＣを検出しにくいという限界がある（韓国公開特許ＫＲ１０−２０１４−００９８３３４）。
これで、従来の血中のがん細胞の検出技術の問題点を解決して検出効率を高めることができる技術の開発が求められているのが実情である。

本発明者は抗体および磁性ナノ粒子が結合された導電性高分子を含む血中のがん細胞の検出および回収用の磁性ナノ構造体を製造して、上記の構造体が少量の血液を用いて、初期のがん患者の血中循環腫瘍細胞および様々な種類の血中のがん細胞を効率的に検出することができ、比色検出を通して肉眼で血中のがん細胞のモニタリングができて、極少量存在する血中のがん細胞の検出、分離および回収において、はるかに向上された効果を有することを確認したので、これに基づいて本発明を完成するようになった。

これで、本発明の目的は抗体および磁性ナノ粒子が結合された導電性高分子を含む血中のがん細胞の検出および回収用の磁性ナノ構造体を提供することである。

また、本発明の他の目的は抗体および磁性ナノ粒子が結合された導電性高分子を含む血中のがん細胞の検出および回収用の磁性ナノ構造体を用いて血中のがん細胞の検出および／または回収方法を提供することである。

また、本発明の他の目的は抗体および磁性ナノ粒子が結合された導電性高分子を含む血中のがん細胞の検出および回収用の磁性ナノ構造体を含む診断キットを提供することである。

また、本発明の他の目的は抗体および磁性ナノ粒子が結合された導電性高分子を含む血中のがん細胞の検出および回収用の磁性ナノ構造体を用いてがんの発病および／または予後を診断するための情報提供方法を提供することである。

また、本発明の他の目的は抗体および磁性ナノ粒子が結合された導電性高分子を含む血中のがん細胞の検出および回収用の磁性ナノ構造体を用いてがんの診断方法を提供することである。

しかし、本発明が解決しようとする技術的な課題は以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は以下の記載から同業者に明確に理解されることができるだろう。

上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は導電性高分子を含む血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体を提供する。

また、上記の導電性高分子は抗体が結合され、磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子であることができる。

本発明の一実施例として、上記の抗体はａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ（ａｎｔｉ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ（ａｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ａｎｔｉ−Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ａｎｔｉ−ＴＲＯＰ２（ａｎｔｉ−ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ）およびａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎからなる群から選ばれるいずれかの一つ以上であることができる。

本発明の他の実施例として、上記の抗体はａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ（ａｎｔｉ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ（ａｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ａｎｔｉ−Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ａｎｔｉ−ＴＲＯＰ２（ａｎｔｉ−ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ）およびａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎを含む抗体混合物であることができる。

本発明の他の実施例として、上記の抗体混合物はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）をさらに含むことができる。

本発明の他の実施例として、上記の導電性高分子はポリアセチレン（ｐｏｌｙａｃｅｔｙｌｅｎｅ）、ポリピロール（ｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｅ）、ポリチオフェン（ｐｏｌｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、ＰＥＤＯＴ（ｐｏｌｙ（３，４−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ））、ポリアニリン（ｐｏｌｙａｎｉｌｉｎｅ）またはこれらの誘導体であることができる。

本発明の他の実施例として、上記のナノ構造体はナノワイヤ、ナノロッドまたはナノ粒子であることができる。

本発明の他の実施例として、上記のナノワイヤは用いられたＡｎｏｄｉｃａｌｕｍｉｎａｏｘｉｄｅ（ＡＡＯ）ｔｅｍｐｌａｔｅの孔のサイズにより１００ｎｍないし３００ｎｍの直径を有することができる。

本発明の他の実施例として、ナノワイヤは５μｍないし３０μｍの長さであることができ、平均１７μｍの長さを有することができる。

本発明の他の実施例として、上記の血中のがん細胞は血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌ；ＣＴＣ）または血中循環がん幹細胞（ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＴｕｍｏｒＳｔｅｍＣｅｌｌ；ＣＴＳＣ）であることができ、望ましくは血中循環腫瘍細胞であることができる。

また、本発明は（１）本発明のナノ構造体を対象試料に処理するステップ；および（２）磁石により生成された磁場を用いて上記のナノ構造体から上記の血中のがん細胞を検出するステップを含む血中のがん細胞の検出および回収方法を提供する。

本発明の一実施例として、上記の検出および回収方法において、化合物を用いて上記のナノ構造体から上記の血中のがん細胞を分離するステップをさらに含むことができ、上記の化合物はグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）であることができるし、上記の試料は血液であることができる。

また、本発明は（１）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）をさらに含む本発明のナノ構造体を対象試料に処理するステップ；および（２）上記のナノ構造体の色を肉眼で判断するステップを含む血中のがん細胞の比色検出方法を提供する。

本発明の一実施例として、上記の比色検出方法において、上記のナノ構造体の色変化を分光計または色度計で測定して、対象試料内の血中のがん細胞の濃度を定量するステップをさらに含むことができ、上記の試料は血液であることができる。

また、本発明は本発明の血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体を含むがん診断キットを提供する。

本発明の一実施例として、上記の診断キットはバイオセンサーであることができる。
また、本発明は本発明によるナノ構造体から検出した血中のがん細胞からＤＮＡを抽出または分離して解析するステップを含むがんの発病および／または予後を診断するための情報提供方法を提供する。

また、本発明は本発明によるナノ構造体を用いるがん診断方法を提供する。
また、本発明は本発明のナノ構造体を含む血中のがん細胞の検出および回収用の組成物を提供する。

本発明による抗体および磁性ナノ粒子が結合された導電性高分子のナノ構造体は少量の血液を用いて、初期のがん患者の血中のがん細胞および様々な種類の血中のがん細胞を効率的に検出することができ、比色検出を通して肉眼で血中のがん細胞のモニタリングが可能である。また、多量の磁性ナノ粒子の搭載を通して発生される強い磁場により極微量に存在する血中のがん細胞を効率的に捕獲することができる。これに加えて、極少量存在する血中のがん細胞の検出、分離および回収において、ナノワイヤの長い構造および様々な抗体の使用により、がん細胞との接触を増やすことができ、固い結合を形成するだけでなく、敏感度が向上されて、がん細胞と色々な相互作用を促進することで、従来の技術に比べて顕著に増加された検出および分離の効果をしめす。したがって、本発明による磁性ナノ構造体はがんの早期診断、治療だけでなく血中のがん細胞からＤＮＡを抽出して遺伝子変異診断サービスへの活用が期待される。

図１ａは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノ粒子（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＰｓ）の電子走査顕微鏡のイメージ結果である。図１ｂは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）を用いて血中のがん細胞を検出および分離する方法に関する概念的な模式図である。図１ｃは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）の電子走査顕微鏡のイメージ結果である。図１ｄは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）の平均長さの分布を示すものである。図１ｅは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）の電子透過顕微鏡のイメージ結果である。図１ｆは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）および磁性ナノ粒子（ＭＮＰｓ）の横緩和速度を示す結果である。図１ｇは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）および磁性ナノ粒子（ＭＮＰｓ）の磁気ヒステリシスループ（ｍａｇｎｅｔｉｃｈｙｓｔｅｒｅｓｉｓｌｏｏｐ）を示す結果である。図２ａは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）および単一抗体を用いたナノワイヤ（ＥｐＣＡＭ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）の細胞捕集効率を比較した結果である。図２ｂは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）の様々な細胞捕集効率を示す結果である。図２ｃは最適な細胞捕集のための本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）の濃度を確認した結果である。図２ｄは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）の細胞捕集を図式したものである。図２ｅは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノ粒子（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＰｓ）および磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）の細胞捕集効率を比較した結果である。図３ａは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）を用いて初期の乳がん患者の血液から血中のがん細胞を捕集した結果である。図３ｂは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）を用いて初期段階の乳がん患者の血液から血中のがん細胞を捕集して免疫蛍光解析を行った結果である。図３ｃは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）を用いて初期の乳がん患者の血液から血中のがん細胞を捕集して免疫組織化学解析を行った結果である。図３ｄは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）を用いて初期の乳がん患者の血液から血中のがん細胞を捕集して電子走査顕微鏡を通して解析した結果である。図４ａおよび図４ｂはグルタチオン化合物を用いて本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）に捕獲された血中のがん細胞を回収した結果である。図５ａは本発明のＨＲＰおよびａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ混合物（ＨＲＰ−ｌｏａｄｅｄ／ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ）が結合されたポリピロール磁性ナノ粒子（ＰｐｙＮＰ）を用いて現場肉眼検出ができる比色免疫反応を図式したものである。図５ｂおよび図５ｃは本発明のＨＲＰおよびａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ混合物（ＨＲＰ−ｌｏａｄｅｄ／ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ）が結合されたポリピロール磁性ナノ粒子（ＰｐｙＮＰ）を用いて初期のがん患者のサンプルで捕集された血中のがん細胞の比色肉眼検出を行って、ＵＶ分光光度計で解析した結果である。図６ａは本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）を用いて、患者のがん組織から検出されたＥＧＦＲＥｘｏｎ２１Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異をがん患者の血液から捕集されたＣＴＣｓでも同一に確認した結果である。図６ｂはがん患者の血液で捕集された血中のがん細胞（ＣＴＣｓ）のＥＧＦＲＥｘｏｎ２１Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異をデジタルＰＣＲ（ＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ）で確認した結果である。

本発明で用いられている用語、「血中のがん細胞」は腫瘍細胞の一部が原発癌から離れ出て血管やリンパ管に流入されて他の組織や臓器に移動するがんの過程で発見される細胞を意味する。

本発明で用いられている用語、「がん細胞」の種類には制限がなく、本発明の上記の血中のがん細胞は血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌ；ＣＴＣ）または血中循環がん幹細胞（ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＴｕｍｏｒＳｔｅｍＣｅｌｌ；ＣＴＳＣ）であることができるが、これに制限されるものではない。

また、本発明で用いられている用語「がん」の種類には制限がなく、肝がん、大腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、腎盂がん、膵臓がん、小腸がん、肝膵胆道がん、胃がん、脳腫瘍および乳がんなどを含む。

本発明の上記の「抗体」はその種類において制限がないが、ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ（ａｎｔｉ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ（ａｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ａｎｔｉ−Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ａｎｔｉ−ＴＲＯＰ２（ａｎｔｉ−ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅａｔｉｇｅｎ）またはａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎを含むことができる。

また、本発明の上記の抗体は抗体混合物であることができ、本発明の抗体混合物はａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ（ａｎｔｉ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ（ａｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ａｎｔｉ−Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ａｎｔｉ−ＴＲＯＰ２（ａｎｔｉ−ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ）およびａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎを含むことができる。

また、上記の抗体混合物はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）をさらに含むことができるが、これに制限されるものではない。

また、本発明で上記の導電性高分子はポリアセチレン（ｐｏｌｙａｃｅｔｙｌｅｎｅ）、ポリピロール（ｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｅ）、ポリチオフェン（ｐｏｌｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、ＰＥＤＯＴ（ｐｏｌｙ（３，４−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ））、ポリアニリン（ｐｏｌｙａｎｉｌｉｎｅ）またはこれらの誘導体であることできるが、これに制限されるものではない。

また、本発明の導電性高分子は多量の磁性ナノ粒子を搭載して、ビオチンが付着された抗体が結合された導電性高分子を含むナノ構造体であることができるが、これに制限されるものではない。

また、本発明でナノ構造体はナノワイヤ、ナノロッドまたはナノ粒子であることができ、望ましくはナノワイヤであることができるがこれに制限されるものではない。

また、本発明で上記のナノ構造体は多量の磁性ナノ粒子を搭載して、同じ鉄（Ｆｅ）の濃度でナノ粒子より多き横緩和速度（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅｒｅｌａｘａｔｉｏｎｒａｔｅ；Ｒ_２）を有し、より具体的に本発明の磁性ナノワイヤは２０ないし６０ｍＭＦｅＳ^−１の横緩和速度を有することができ、−９０ないし９０ｅｍｕ／ｇの飽和磁化値を有することができるが、これに制限されるものではない。

また、本発明で上記のナノワイヤは１００nmないし３００ｎｍの直径を有することができ、５μｍないし３０μｍの長さであることができ、平均１７μｍの長さを有することができるが、これに制限されるものではない。

本発明の他の様態として、本発明は血中のがん細胞の検出および分離方法を提供する。より具体的に（１）本発明のナノ構造体を対象試料に処理するステップ；および（２）磁石により生成された磁場を用いて上記のナノ構造体から上記の血中のがん細胞を検出するステップを含むことができ、化合物を用いて上記のナノ構造体から上記の血中のがん細胞を分離するステップをさらに含むことができるが、これに制限されるものではない。

本発明の血中のがん細胞の検出および分離方法で上記の化合物はグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）であることができるが、これに制限されず、ジスルフィド結合を切ることができる効果を有するならば、いかなる物質を用いてもよい。

本発明の他の様態として、本発明は血中のがん細胞の比色検出方法を提供する。より具体的に、（１）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）をさらに含む本発明のナノ構造体を対象試料に処理するステップ；および（２）上記のナノ構造体の色を肉眼で判断するステップを含むことができ、上記のナノ構造体の色変化を分光計または色度計で測定して、対象試料内の血中がん細胞の濃度を定量するステップをさらに含むことができる。

本発明で上記の試料は血液であることができるが、これに制限されるものではない。

本発明の他の様態として、本発明は血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体を含むがん診断キットを提供する。より具体的に、上記の診断キットはバイオセンサーであることができるが、これに制限されるものではない。

本発明の他の様態として、本発明はがんの発病および／または予後を診断するための情報提供方法を提供する。より具体的に、上記の方法は本発明の血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体から検出した血中のがん細胞からＤＮＡを抽出または分離して解析するステップを含むことができ、上記の解析は試料の中のＤＮＡの濃度、コピーの数または塩基配列を解析して遺伝子変異の可否を確認することができる。

本発明の他の様態として、本発明は血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体を含むがん診断方法を提供する。

より具体的に、上記の方法は本発明の血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体から検出した血中のがん細胞からＤＮＡを抽出または分離して解析するステップを含むことができ、上記の解析は試料の中のＤＮＡの濃度、コピー数または塩基配列を解析して遺伝子変異の可否を確認することができる。
以下、本発明の理解を助けるために望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されているものであり、下記の実施例により本発明の内容が限定されるものではない。

実施例１．抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノ構造体の製造
１−１．抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノ粒子（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＰｓ）の製造
ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）が結合されたポリピロール（Ｐｐｙ）ナノ粒子の合成のために、超純水（ｕｌｔｒａｐｕｒｅｗａｔｅｒ）３．１２５ｍｌにポリビニルピロリドン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ；ＰＶＰ、Ｍ．Ｗ：２９，０００）０．１２５ｇを溶解させた後、３０分の間、室温で強く攪拌した。その後、１６．２５ｍｌのピロール（ｐｙｒｒｏｌｅ）および１．５ｍｌの１０ｎｍの磁性ナノ粒子を柔らかく攪拌しながら添加した。１０分後、１２５μｌの塩化鉄（II）六水和物（ｉｒｏｎ（II）ｃｈｌｏｒｉｄｅｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ、０．７５ｇ／ｍｌ）および１００ｍｇのヒアルロン酸（４０Ｋ）を迅速に添加して、常温で３時間、重合させた。生成物は２日間透析により精製した後、精製した溶液を凍結乾燥して、使用するまでに真空状態で保管した。その後、約２ｍｇのヒアルロン酸が結合されたポリピロールナノ粒子（ＨＡ−ＰｐｙＮＰｓ）を１ｍｌの０．４ＭＥＤＣ（Ｎ−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ′−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）および０．１ＭＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）で４５分間、混合した後、１７，０００ｒｐｍで遠心分離を行った。最後に、１０μｌ／ｍｌの濃度で混合されたビオチンが付着された抗体（ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＴＲＯＰ−２およびｖｉｍｅｎｔｉｎ）と結合する１０μｌ／ｍｌのストレプトアビジン１ｍｌにヒアルロン酸が結合されたポリピロールナノ粒子（ＨＡ−ＰｐｙＮＰｓ）を再懸濁した。製造した溶液を再度１７，０００ｒｐｍで遠心分離して、使用するまでに超純水（ｕｌｔｒａｐｕｒｅｗａｔｅｒ）に保管した。

その結果、図１ａに示すように、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）のイメージを通して、抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノ粒子（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＰｓ）が製造されたことを確認した。

１−２．抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷ）の製造
多孔性アルミナ鋳型（ＡＡＯｔｅｍｐｌａｔｅ、Ｗｈａｔｍａｎ、ｐｏｒｅｄｉａｍｅｔｅｒ、２００ｎｍ）の片面に約１５０ｎｍの厚さの金（Ａｕ）層を加熱蒸発（ｔｈｅｒｍａｌｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）させ蒸着させた。すべての電気化学的な実験は金（Ａｕ）でコーティングされたＡＡＯ鋳型で白金ワイヤの相対電極とＡｇ／ＡｇＣｌ（３．０ＭＮａＣｌｔｙｐｅ）の比較電極を具備したｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ／ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔ（ＢｉｏＬｏｇｉｃＳＰ−１５０）を用いて測定した。図１ｂに図式するように、抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）の製造のために、常温で３０μｌの磁性ナノ粒子（−１０ｎｍｉｎａｄｉａｍｅｔｅｒ）を金（Ａｕ）でコーティングされたＡＡＯディスクの上に付着させ、ＡＡＯの細孔（ｐｏｒｅ）に導入した。磁性ナノ粒子が高い密度でドーピング（ｄｏｐｉｎｇ）された、五つの類型の抗体が結合されたポリピロール（Ｐｐｙ）ナノワイヤの製造のために、ＡＡＯ鋳型の細孔に０．０１Ｍポリ（４−スチレンスルホン酸）（ｐｏｌｙ（４−ｓｔｙｒｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ））および１ｍｇ／ｍｌＮＨＳ−ＳＳ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−２−（ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）−ｅｔｈｙｌ−１，３′−ｄｉｔｈｉｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）を含有する０．０１Ｍピロール溶液と一緒に１．０Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）で７分間クロノアンペロメトリー（ｃｈｒｏｎｏａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）を適用して電気化学的な蒸着を行った。その後、磁性ナノ粒子およびＳＳ−ｂｉｏｔｉｎ分子がドーピングされたフリースタンディングポリピロールナノワイヤ（ｆｒｅｅ―ｓｔａｎｄｉｎｇＰｐｙＮＷｓ）を得るためにＡＡＯ鋳型を超純水（ｕｌｔｒａｐｕｒｅｗａｔｅｒ）で数回洗浄して、２Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液に浸した。続いて、ポリピロールナノワイヤ（ＰｐｙＮＷｓ）のカルボン酸（−ＣＯＯＨ；ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ）基を活性化するためにポリピロールナノワイヤ（ＰｐｙＮＷｓ）に３０ｍＭのＥＤＣおよび６ｍＭのＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を添加した。生成されたポリピロールナノワイヤ（ＰｐｙＮＷｓ）をストレプトアビジン（１０μｇ／ｍｌ）と一緒に追加で４５分間培養した後、水で洗浄した。続いて、ビオチンが付着された抗体混合物（つまり、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄａｎｔｉ−ＥＧＦＲ、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄａｎｔｉ−Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄａｎｔｉ−ＴＲＯＰ−２およびｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎ、（１０μｇ／ｍｌｉｎＰＢＳ））をポリピロールナノワイヤ（ＰｐｙＮＷｓ）の末端にストレプトアビジンが導入されたポリピロールナノワイヤ（ＰｐｙＮＷｓ）と一緒に４℃で一晩反応させ、抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷ）を製造した。抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷ）の形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）は加速電圧１５ｋＶの走査電子顕微鏡（Ｇ２Ｆ３０、Ｔｅｃｎａｉ）および３００ｋＶの透過電子顕微鏡を用いて観察した。磁気力の測定はＳＱＵＩＤ−ＶＳＭｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｅｒ（ＭＰＭＳ−ＶＳＭ、Ｑｕａｎｔｕｍｄｅｓｉｇｎ）を用いて常温で行った。磁場は７０ないし７０ｋＯｅの強さで変化させ印加して、横緩和時間（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅｒｅｌａｘａｔｉｏｎｔｉｍｅ、Ｔ_２）は７テスラ（Ｔｅｓｌａ）ＭＲＩ（ＢｒｕｋｅｒＢｉｏＳｐｉｎＭＲＩＧｍｂＨ；ｅｃｈｏｔｉｍｅ［ＴＥ］＝６．５ｍｓおよびｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｔｉｍｅ［ＴＲ］＝１，６００ｍｓ）を用いて測定した。

その結果、図１ｃに示すように、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）のイメージ（スケールバー１０μｍ）を通して、約２００ｎｍの直径および約１６μｍの平均長さを有する比較的に長い長さのナノワイヤの合成を確認して、図１ｄに示すように、製造されたナノワイヤの平均長さの分布を確認した。

また、図１ｅに示すように、電子透過顕微鏡（ＴＥＭ）のイメージ（スケールバー５０ｎｍ）を通して抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷ）の中に磁性ナノ粒子（＜１０ｎｍの直径）が不規則に分布（ｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ）され、密度のあるように配列された状態で埋め立てられていることを確認した。

また、図１ｆに示すように、抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷ）および磁性ナノ粒子（ＭＮＰｓ）の磁気共鳴画像対比（ｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅｉｍａｇｉｎｇｃｏｎｔｒａｓｔ）を測定した結果、製造されたナノワイヤ（Ｒ_２＝５３ｍＭＦｅＳ^−１）はナノ粒子（Ｒ_２＝２１ｍＭＦｅＳ^−１）より大きい横緩和速度（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅｒｅｌａｘａｔｉｏｎｒａｔｅ；Ｒ_２）を有することを確認した。

また、図１ｇに示すように、抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷ）および磁性ナノ粒子（ＭＮＰｓ）の飽和磁化値を測定した結果、製造されたナノワイヤ（Ｍｓ＝８２ｅｍｕ／ｇ）はナノ粒子（Ｍｓ＝４５ｅｍｕ／ｇ）より相当に大きい飽和磁化値（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎｖａｌｕｅ）を有することをを確認して、実際に酸化鉄磁性ナノ粒子の組立（ａｓｓｅｍｂｌｙ）により、ナノワイヤの磁性（ｍａｇｎｅｔｉｓｍ）がさらに相乗（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ）して、ナノワイヤの空間的な制約（ｃｏｎｆｉｎｅｄｇｅｏｍｅｔｒｙ）はナノワイヤが磁場にもっと敏感になるようにして、それぞれのナノ粒子が磁気モーメントを配向することにより、最終的にがん細胞の分離において正確な制御および選択的な操作ができるようにすることを予測することができる。

実施例２．抗体混合物の使用による磁性ナノ構造体の細胞捕集効率の確認
２−１．単一抗体または抗体混合物が結合された磁性ナノワイヤの細胞捕集効率の比較
ＥｐＣＡＭ−陽性細胞（ＨＣＴ１１６大腸がん細胞、ＭＣＦ７乳がん細胞）およびＥｐＣＡＭ−陰性細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞、ＭＩＡＰａＣａ−２膵臓がん細胞）はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入して、ＤＭＥＭまたは１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）が添加されたＲＰＭＩ−１６４０に１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが補充された培地に、３７℃で５％ＣＯ_２で加湿された培養器で培養された。細胞培養試薬はＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＨｙｃｌｏｎｅａｎｄＧｉｂｃｏで購入した。抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）および単一抗体（ＥｐＣＡＭ抗体）が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（ＥｐＣＡＭ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）の細胞捕集効率を評価するために、上記の実施例１−２に記載された方法で抗体が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤを製造した。ＥｐＣＡＭ−陽性細胞（ＨＣＴ−１１６、ＭＣＦ７）およびＥｐＣＡＭ−陰性細胞（ＭＩＡＰａＣａ−２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を含む四つの相違な細胞を、０．１％ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ）／ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）または健康な供与者から得た全血に１００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で処理した後、３０分間常温で、細胞懸濁液に磁性ナノワイヤを添加して、標的細胞が捕集されるように柔らかく攪拌させた後、培養した。その後、磁石により生成された磁場を用いて捕集された細胞を効率的に分離するために、１．５ｍｌのマイクロ遠心分離チューブを用いて、捕集された細胞を分離した。磁石を用いた分離はサマリウムおよびコバルト磁石（ｓａｍａｒｉｕｍ／ｃｏｂａｌｔｍａｇｎｅｔ）を含むＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ（登録商標）ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＭａｇｎｅｔｉｃＳｅｐａｒａｔｉｏｎＳｔａｎｄｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）で行って、おおよそ１２８ないし２６４ｋＪ／ｍ^３に該当する１６ないし３３ｍｅｇａｇａｕｓｓ−ｏｅｒｓｔｅｄｓ（ＭＧＯｅ）エネルギ（ＢＨ_ｍａｘ）範囲で細胞の分離を行った。

上澄み液を除去した後、収集した細胞を１×ＰＢＳで洗浄して、ＲＰＭＩ−１６４０培地で再懸濁させた後、６−ｗｅｌｌｐｌａｔｅのカバーガラス（ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ）に移した。回収した細胞の評価のために、染料が導入されたＦＩＴＣ−ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ、Ｃｙ３−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ−ＣＤ４４およびＡｌｅｘａ６８０−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ−ＣＤ４５の抗体を用いて免疫染色を行った。染料が導入された抗体を製造するために、抗体およびＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）染料（抗体：ＮＨＳ染料＝１：２ないし１：８ｍｏｌａｒｒａｔｉｏ）は５０μｌの抗体に１×ＰＢＳを３００μｌになるように添加した。その後、暗い常温の条件で１時間柔らかく混合した。反応していないＮＨＳ染料を除去するために、ＰＤＭｉｎｉｔｒａｐＧ−２５（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０８５１−０１）を用いて溶液の塩分を除去した後、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒｓ−３０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ５０３０２４）を用いて濃縮した後、使用する前までに４℃で保管した。その後、カバーガラスの上に回収した細胞をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、蛍光染料が結合された抗体（ＦＩＴＣ−ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ、Ｃｙ３−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ−ＣＤ４４およびＡｌｅｘａ６８０−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ−ＣＤ４５）０．１μＭを細胞の配置に添加して、３７℃、５％ＣＯ_２条件の培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で培養した。固定された細胞は核を識別するためにＤＡＰＩで染色してＰＢＳで数回洗浄した。標識化された細胞はＺｅｉｓｓＬＳＭ７１０ＣｏｎｆｏＣｏｒ３蛍光顕微鏡で観察して、上記のポリピロール磁性ナノワイヤの細胞の捕集効率を確認した。

その結果、図２ａに示すように、抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）を用いる際に、腫瘍細胞のＥｐＣＡＭの状態に関係なく相当に高い捕集効率を達成することを確認した。一方、ＥｐＣＡＭ単一抗体が結合された磁性ナノワイヤ（ＥｐＣＡＭ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）の場合、ＭＣＦ７細胞において８３％の最大捕集効率を見せたが、非上皮性細胞株の分離において非常に制限された効率をみせた。

また、図２ｂに示すように、抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）は様々な種類の抗体がナノワイヤの間の作用および認識を形成して相違な表現型および様々な濃度のがん細胞と密着性を高めることができることを確認した。

２−２．最適の細胞捕集のための磁性ナノワイヤ濃度の確認
最適の細胞捕集効率をみせる磁性ナノワイヤの濃度を確認するために、上記の実施例１−２の方法で製造した抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）を用いて、ＨＣＴ１１６細胞を２０ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに処理した後、磁性ナノワイヤの濃度を異なるようにして細胞の捕集効率を確認した。

その結果、図２ｃに示すように、ＨＣＴ１１６細胞株（ＨＣＴ１１６ｃｅｌｌｌｉｎｅ）の捕集効率に影響を及ぶナノワイヤの効果的な濃度を決めた。標的がん細胞に対して、９６％の捕集効率で０．９ｍｇ／ｍｌの最大の収率を示してナノワイヤの凝集と絡みの結果で徐々に減少することを確認した。

２−３．磁性ナノ粒子および磁性ナノワイヤの細胞捕集効率の比較
磁性ナノ構造体および細胞の直接的な相互作用を通して、捕集性能を比較するために、上記の実施例２−１の方法で細胞を処理して、二つの異なる細胞株（Ｅｐ−ＣＡＭ−陽性ＨＣＴ１１６細胞およびＥｐＣＡＭ−陰性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）を用いて抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）および抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＰｓ）の捕集効率を比較した。

その結果、図２ｄおよび図２ｅに図式するように、ナノワイヤベースの接近法は球形ナノ粒子に比べて標的細胞の分離に大きな影響を与えることを確認した。ナノワイヤの延長された構造は十分な量の抗体を収容することができる空間（ｓｉｔｅ）を提供して、ＣＴＣの捕獲において敏感度を付与して容易に特定ながん細胞の様々な相互作用を促進することによって相当なメリットを提供することができることを確認した。また、ナノワイヤの比較的に長い長さにより、細胞の表面をラッピング（ｗｒａｐｐｉｎｇ）することで固い結合を形成して、ナノワイヤおよびがん細胞の間の結合活性を顕著に調節することができ、最終的に向上された捕集効率に導く。

実施例３．ナノワイヤ構造体を用いた乳がん患者の血液内に存在する細胞捕集効率の確認
３−１．捕集された細胞の免疫蛍光染色の確認
乳がん患者の抹消血液から稀な血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分離して、ポリピロールナノワイヤ構造体の性能を評価するために、総２９人のがん患者の血液を検査した。全血は国立がんセンター（ＮＣＣ）臨床試験審査委員会の承認手続きによりａｎｔｉ−ｃｏａｇｕｌａｎｔＥＤＴＡと一緒に真空採血器のチューブに収集した。臨床適用のために、１８人の健康な志願者および初期段階の乳がん患者２９人から血液サンプルを収集した。ほとんどの患者は局所的な初期の乳がん（段階ＩおよびＩＩ）であって、２９人の中に６人は手術の前に補助抗がん化学療法を受けた。別に処理されていない患者の血液２５０μｌ−１ｍｌのサンプルを用いてＣＴＣ分離および解析を行った。また、対照群で健康な寄贈者の抹消血液２５０μｌ−１ｍｌを用いてＣＴＣ検出を評価した。患者のサンプルで捕獲した細胞は周りの白血球と仕分けるために、ＤＡＰＩ、ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ、ａｎｔｉ−ＣＤ４４、ａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎおよびａｎｔｉ−ＣＤ４５の抗体を用いて免疫組織学的な解析を通して確認した。

上記の実施例２−１の方法で細胞の捕集を確認した後、捕集された細胞はカバースリッププレートに移した後、３．７％１５分間パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定させて、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１０分間透過した後、５％ＢＳＡ／ＰＢＳブロッキング溶液で３０分間培養した。続いて、ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ、ａｎｔｉ−ＣＤ４４、ａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎおよびａｎｔｉ−ＣＤ４５の抗体を９０分間カバースリップで培養した。その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；緑色、ＥｐＣＡＭ）またはＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；青色ＣＤ４４、ｖｉｍｅｎｔｉｎおよびＣＤ４５）が結合された二次抗体をカバースリップに追加した。４０分の後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；青色、核）で染色して、ＰＢＳで洗浄した。標識された細胞はＬＳＭ５０１ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて解析した。免疫蛍光イメージで細胞はＤＡＰＩ（核、青色）、ＣＤ４５（造血、赤色）、ＥｐＣＡＭ（上皮、緑色）、およびＣＤ４４またはｖｉｍｅｎｔｉｎ（間葉、赤色）で染色して、周りの白血球と仕分けて、すべての実験は５回繰り返し行った。

その結果、図３ａに示すように、すべてのがん患者の血液サンプルでＣＴＣｓを確認した。また、非−特異的に結合された白血球の数が低いこと（＜５ＷＢＣｓ／２５０μｌｏｆｂｌｏｏｄ）を発見して、抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）がＣＴＣｓの捕集に非常に選択的であり、白血球の除去に非常に効率的であることを確認した。抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）を用いて、非転移性の乳がん患者の血液２５０μｌからＣＴＣｓを成功的に分離した。一方、血液の量を２５０μｌから１ｍｌに増加してＣＴＣｓを分離したら、発見されるＣＴＣｓの数が徐々に増加したが、１８人の健康な供与者の中で１６人はＣＴＣｓが識別されていないのに対し、健康な供与者２人の１ｍｌの血液で１ないし２個のＣＴＣｓが検出された。

また、図３ｂに示すように、免疫蛍光イメージを確認した結果、基準（ｇｏｌｄｓｔａｎｄａｒｄ、ゴールドスタンダード）として、ＣＴＣｓは上皮起源のマーカー（ＤＡＰＩ＋／ＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４５−発現）の表現型の発現で分類されて、一方、白血球はＤＡＰＩ＋／ＥｐＣＡＭ−／ＣＤ４５＋の標識で定義した。数多くのＣＴＣｓはＣＴＣｓのほとんどが強い転移性と相関関係を示す上皮および間葉系マーカー（例えば、ＣＤ４４およびｖｉｍｅｎｔｉｎ）と一緒に発現された。

３−２．捕集された細胞の免疫組織化学の確認
上記の実施例２−１の方法で細胞を捕集した後、捕集された細胞の免疫組織化学の解析を行うために、免疫化学染色を実施した。捕集された細胞は上皮マーカーであるＥｐＣＡＭおよびジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＢ）で染色して、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）で対照染色した。また、ＳｕｐｅｒＰｉｃｔｕｒｅ３^ｒｄＧｅｎＩＨＣ検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造社のプロトコルに従い使用して、捕集された細胞はｇｌａｓｓｓｌｉｄｅで４００×の倍率の顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５２ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）およびＡｐｅｒｉｏＩｍａｇｅＳｃｏｐｅイメージ解析プログラムを用いて行った。

その結果、図３ｃに示すように、ＣＴＣｓはＤＡＢ−基質反応の結果、褐色で示されて、核（Ｎｕｃｌｅｉ）はヘマトキシリン対照染色の結果、青色で染色されて、免疫組織化学イメージ（スケールバー１０μｍ）を通して捕獲されたＣＴＣを確認した。

３−３．捕集された細胞の走査電子顕微鏡の確認
抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）により捕集されたＣＴＣｓの形態学的な解析を行うために、初期の乳がん患者から捕集したＣＴＣｓを走査電子顕微鏡で確認したし、５ｋＶ加速電圧のＳＥＭ（ＪＳＭ−６７０１Ｆ、ＪＥＯＬ）により形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を観察した。上記の捕集された細胞を２時間３．７％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定して、脱水のために１５分ごとにエタノールの濃度（５０％、７０％、９０％、１００％）を増加させながら露出した後、空気で完全に乾燥させた。サンプルをＳＥＭ顕微鏡で検査する前にｐｌａｔｉｎｕｍｇｏｌｄでスパッタコーティングした。

その結果、図３ｄに示すように、初期の乳がん患者の捕集されたＣＴＣｓを電子走査顕微鏡（ＳＥＭ）イメージ（スケールバー５μｍ）通して確認した。

実施例４．化合物を用いたポリピロール磁性ナノワイヤの細胞回収の確認
抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）に捕集された細胞を回収するために、抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）に捕集された細胞に５０ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）溶液で６０分間５００ｒｐｍで振盪処理した。細胞の成長と増殖をモニタリングするために放出された細胞を２４−ｗｅｌｌｐｌａｔｅで接種した。

その結果、図４ａに示すように、ナノワイヤの内部のドーパントとして配置されたＳＳ−ビオチン残基により、細胞の損傷なしに細胞を分離することができた。ＳＳ−ビオチンのジスルフィド結合を切ることで、抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）から捕獲された細胞を容易に回収して、ＧＳＨ化合物を用いた細胞の回収を確認した。また、図４ｂに示すように、ナノワイヤから細胞が放出された２４時間の後、細胞の成長と増殖を観察することで、ＧＳＨ化合物の処理は細胞の死滅に影響を及ばないことを確認した。

実施例５．比色免疫反応を通した血中のがん細胞の肉眼検出の評価
上記の実施例３の初期のがん患者のサンプルから捕集された血中のがん細胞（ＣＴＣｓ）のイメージ解析のために代表的な上皮マーカーを用いて固定した後、免疫染色を行ったが、この方法は複雑であり、時間が多く所要されて、多くの手続きを経なければならないので、現場肉眼検出戦略を導入して、迅速かつ信頼の高いがん細胞の存在を予測することができる簡単な比色免疫反応を図５ａに図式して提示した。

初期のがん患者のサンプルで捕集された血中のがん細胞の比色肉眼検出を行うために、ヒアルロン酸が結合されたポリピロール磁性ナノ粒子（ＨＡ−ＰＰＹＮＰ）、約２ｍｇを１ｍｌの０．４ＭＥＤＣおよび０．１ＭＮＨＳと４５分間混合した後、溶液を１７，０００ｒｐｍで過量の化学物質を除去するために遠心分離した。その後、１ｍｇのＨＲＰおよび２０μｇのｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ（重量比；ＨＲＰ：ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ＝５０：１）を一晩４℃で超音波振動の条件で混合した。反応せずに残った残余試薬はＰＤ１０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でゲル濾過（ｇｅｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）して除去した。この後、体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）比色検出のために、細胞に約０．１５ｍｇのＨＲＰおよびａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ混合物（ＨＲＰ−ｌｏａｄｅｄ／ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ）が付着されたポリピロール磁性ナノ粒子（ＰｐｙＮＰ）を添加して、０ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２０ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、５０ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１０^２ｃｅｌｌｓ／ｍｌおよび１０^３ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で９６−ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓに接種した後、プレートを１０分間３７℃、５％ＣＯ_２の加湿培養器で維持した。洗浄のためにＰＢＳ、１０ｍＭ３，３′，５，５′−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）基質溶液１０μｌ、０．１ＭＨ_２Ｏ_２１０μｌおよび０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液８０μｌ（ｐＨ５．０）を暗いところで３分間常温の条件で上記の分散液に添加した。捕獲された細胞の数と吸光度の間の関係を確認するためにＵＶ−検出法を用いて、６５２ｎｍの波長でＤＵ７３０ＵＶ−Ｖｉｓｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）分光光度計で測定した。臨床サンプルは健康な寄贈者または乳がん患者の血液サンプルから６−ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓで移して同一なＵＶ−ｖｉｓｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ分光法を用いて解析した。

その結果、図５ｂに示すように、ＴＭＢ基質溶液を細胞懸濁液に添加してすぐ反応を起こした結果、最終的に磁性ナノ粒子に捕獲されたがん細胞の数に比例する色相信号を検出することができた。ＣＴＣ検出および計算のためのコスト効率の高い事前評価ツールとして、明確な色相の変化は直接的に患者の血液でＣＴＣｓの存在もしくは不在を暗示するだけでなく、解析の後、生存細胞の回収において害のない方法である。また、図５ｃに示すように、６５２ｎｍの吸光度で捕獲されたがん細胞の数が増加することにより、明確な色の変化を伴っており、がん細胞の検出において十分に敏感であり、選択的であることを確認した。

実施例６．回収された血中のがん細胞の遺伝子変形の確認
抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）を用いて、がん患者の血液で捕集された血中のがん細胞（ＣＴＣｓ）のＥＧＦＲＥｘｏｎ２１Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異を解析するために、ＤＮＡを抽出した後ｄｉｇｉｔａｌＰＣＲを用いて、がん組織で検出されたＥＧＦＲＥｘｏｎ２１Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異と比較した。

その結果、図６ａに示すように、本発明の抗体混合物が結合されたポリピロール磁性ナノワイヤ（Ａｂｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍＰｐｙＮＷｓ）を用いて、患者のがん組織から検出されたＥＧＦＲＥｘｏｎ２１Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異をがん患者の血液で捕集されたＣＴＣｓでも同一に確認したし、図６ｂに示すように、３番の患者の血液で捕集された血中のがん細胞（ＣＴＣｓ）のＥＧＦＲＥｘｏｎ２１Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異をデジタルＰＣＲ（ＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ）で確認した。

前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有するものは本発明の技術的な思想や必須的な特徴を変更せずに他の具体的な形態で容易に変形ができることを理解するだろう。したがって、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。

Claims

導電性高分子を含む血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体として、上記の導電性高分子は、抗体が結合されて磁性ナノ粒子が搭載された導電性高分子であることを特徴とする、血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体。
上記の抗体は、ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ（ａｎｔｉ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ（ａｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ａｎｔｉ−Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ａｎｔｉ−ＴＲＯＰ２（ａｎｔｉ−ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ）およびａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎからなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体。
上記の抗体は、ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ（ａｎｔｉ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ（ａｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ａｎｔｉ−Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ａｎｔｉ−ＴＲＯＰ２（ａｎｔｉ−ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ）およびａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎを含む抗体混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体。
上記の抗体混合物は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）をさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体。
上記の導電性高分子は、ポリアセチレン（ｐｏｌｙａｃｅｔｙｌｅｎｅ）、ポリピロール（ｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｅ）、ポリチオフェン（ｐｏｌｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、ＰＥＤＯＴ（ｐｏｌｙ（３，４−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ））、ポリアニリン（ｐｏｌｙａｎｉｌｉｎｅ）またはこれらの誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載の血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体。
上記のナノ構造体は、ナノワイヤ、ナノロッド、またはナノ粒子であることを特徴とする、請求項１に記載の血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体。
上記の血中のがん細胞は、血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌ；ＣＴＣ）または血中循環がん幹細胞（ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＴｕｍｏｒＳｔｅｍＣｅｌｌ；ＣＴＳＣ）であることを特徴とする、請求項１に記載の血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体。
上記の血中のがん細胞は血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌ；ＣＴＣ）であることを特徴とする、請求項７に記載の血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体。
（１）請求項１のナノ構造体を対象試料に処理するステップ；および
（２）磁石により生成される磁場を用いて、上記のナノ構造体から上記の血中のがん細胞を検出するステップを含む、血中のがん細胞の検出および回収方法。
化合物を用いて上記のナノ構造体から上記の血中のがん細胞を分離するステップをさらに含む、請求項９に記載の血中のがん細胞の検出および回収方法。
上記の化合物はグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）であることを特徴とする、請求項１０に記載の血中のがん細胞の検出および回収方法。
上記の試料は血液であることを特徴とする、請求項９に記載の血中のがん細胞の検出および回収方法。
（１）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）をさらに含む請求項１に記載のナノ構造体を対象試料に処理するステップ；および
（２）上記のナノ構造体の色を肉眼で判断するステップを含む、血中のがん細胞の比色検出方法。
上記のナノ構造体の色変化を分光計または色度計で測定して、対象試料内の血中のがん細胞の濃度を定量するステップをさらに含む、請求項１３に記載の血中のがん細胞の比色検出方法。
上記の試料は血液であることを特徴とする、請求項１３に記載の血中のがん細胞の比色検出方法。
請求項１に記載の血中のがん細胞の検出および回収用のナノ構造体を含む、がん診断キット。
上記の診断キットはバイオセンサーであることを特徴とする、請求項１６に記載のがん診断キット。
請求項１に記載の血中のがん細胞の回収用のナノ構造体から検出した血中のがん細胞からＤＮＡを抽出または分離して解析するステップを含む、がんの発病または予後を診断するための情報提供方法。
上記の解析は、試料の中のＤＮＡの濃度、コピーの数または塩基配列を解析して遺伝子変異の可否を確認することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。