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TWI500631B - 藉由投予神經生長因子拮抗劑及含彼之組合物以治療骨關節炎疼痛之方法 - Google Patents

藉由投予神經生長因子拮抗劑及含彼之組合物以治療骨關節炎疼痛之方法 Download PDF

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TWI500631B
TWI500631B TW101125436A TW101125436A TWI500631B TW I500631 B TWI500631 B TW I500631B TW 101125436 A TW101125436 A TW 101125436A TW 101125436 A TW101125436 A TW 101125436A TW I500631 B TWI500631 B TW I500631B
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Description

藉由投予神經生長因子拮抗劑及含彼之組合物以治療骨關節炎疼痛之 方法
本發明係關於抗-NGF抗體(如抗-NGF拮抗劑抗體)。本發明進一步更關於使用拮抗劑，如抗體，來治療及/或預防疼痛，包括手術後疼痛、風濕性關節炎疼痛和骨關節炎疼痛。
神經生長因子(NGF)是第一個確認的神經營養素(neurotrophin)，並已經完全定出其在周圍和中樞神經之發育和存活上之角色的特徵。已經顯示NGF是在周圍交感神經和胚胎感覺神經元與基底前腦膽鹼能神經元發育上關鍵性的存活和維持因子。Smeyne等人，Nature 368：246-249(1994)和Crowley等人，Cell 76：1001-1011(1994)。NGF向上-調節神經肽在感覺神經元中的表現(Lindsay和Harmer,Nature 337：362-364(1989))，並經由兩個不同的膜-結合受體，TrkA酪胺酸激酶受體和p75共同神經營養素受體(有時分別稱為"高親和力"和"低親和力"NGF受體)調解其活性。p75受體在結構上與腫瘤壞死因子受體家族的其他成員有關(Chao等人，Science 232：518-521(1986))。關於NGF的回顧，參見Huang等人，Annu.Rev.Neurosci.24：677-736(2001)；Bibel等人，Genes Dev.14：2919-2937(2000)。已經定出NGF和與trkA受體形成複合物之NGF的結晶結構。參見Nature 254：411(1991)；Mature 401：184-188(1996)。
除了其在神經系統上的作用之外，NGF已經逐漸涉及神 經系統以外的加工過程。例如，已經顯示NGF促進了血管通透性(Otten等人，Eur J Pharmacol.106：199-201(1984))，提高T-和B-細胞免疫反應(Otten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10059-10063(1989))，誘導淋巴細胞分化和肥大細胞增殖，並引起從肥大細胞中釋放出可溶性生物信號(Matsuda等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6508-6512(1988)；Pearce等人，J.Physiol.372：379-393(1986)；Bischoff等人，Blood 79：2662-2669(1992)；Horigome等人，J.Biol.Chem.268：14881-14887(1993))。雖然已經顯示外源添加NGF，能夠擁有全部的這些作用，但重要的是注意到在活體內在任何的這些加工過程中，僅罕有地顯示內源的NGF是重要的(Torcia等人，Cell.85(3)：345-56(1996))。因此，即使有也不清楚是何者可能抑制了內源NGF的生物活性。
NGF由許多細胞類型產生，包括肥大細胞(Leon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3739-3743(1994))、B-淋巴細胞(Torcia等人，Cell 85：345-356(1996))、角化細胞(Di Marco等人，J.Biol.Chem.268：22838-22846))、平滑肌細胞(Ueyama等人，J.Hypertens.11：1061-1065(1993))、纖維母細胞(Lindholm等人，Eur.J.Neurosci.2：795-801(1990))、支氣管上皮細胞(Kassel等人，Clin.Exp.Allergy 31：1432-40(2001))、腎小球系膜細胞(Steiner等人，Am.J.Physiol.261：F792-798(1991))和骨骼肌肌管(Schwartz等人，J Photochem.Photobiol.B66：195-200(2002))。已經在神經系 統以外的各種細胞類型上找到NGF受體。例如，已經在人類單核細胞、T-和B-淋巴細胞及肥大細胞上找到TrkA。
已經在人類患者和數種動物模式中觀察到在增加NGF含量與炎症狀況之間的關聯。這些包括全身性紅斑性狼瘡(Bracci-Laudiero等人，Neuroreport 4：563-565(1993))、多發性硬化症(Bracci-Laudiero等人，Neurosci.Lett.147：9-12(1992))、牛皮癬(Raychaudhuri等人，Acta Derm.l'enereol.78：84-86(1998))、關節炎(Falcim等人，Ann.Rheum.Dis.55：745-748(1996))、間質性膀胱炎(Okragly等人，J.Urology 161：438-441(1999))和氣喘(Braun等人，Eur.JImmunol.28：3240-3251(1998))。
在周圍組織中升高NGF含量，一致地與痛覺過敏和炎症反應有關，並已經在許多形式的關節炎中觀察到。受風濕性關節炎侵襲之患者的滑膜，表現高量的NGF，而已經報告了在未發炎之滑膜中不可檢測到NGF(Aloe等人，Arch.Rheum.35：351-355(1992))。在以實驗方式誘發風濕性關節炎的大鼠中，亦看到類似的結果(Aloe等人，Clin.Exp.Rheumatol.10：203-204(1992))。已經在基因轉殖的關節炎老鼠中，報告了NGF的含量升高，連同肥大細胞的數目增加(Aloe等人，Int.J.Tissue Reactions-Exp.Clin.Aspects 15：139-143(1993))。PCT公開案第WO 02/096458號揭示使用具有某些特性的抗-NGF抗體，治療各種NGF相關病症，如炎症狀況(例如風濕性關節炎)。已經報告了將經過純化之抗-NGF抗體注射到帶有人類腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基 因之關節炎基因轉殖老鼠內，導致肥大細胞數目減少，並減少了在關節炎老鼠之滑膜中組織胺和物質P的含量(Aloe等人，Rheumatol.Int.14：249-252(1995))。已經顯示外源投與NGF抗體，降低了發生在關節炎老鼠中之提高的TNF-α含量(Manni等人，Rheumatol.Int.18：97-102(1998))。
再者，已經在人類骨關節炎軟骨細胞中觀察到NGF和高親和力NGF受體(TrkA)的增加表現(Iannone等人，Rheumatology 41：1413-1418(2002))。
已經報告了囓齒類抗-NGF拮抗劑抗體。參見，例如Hongo等人，Hybridoma(2000)19(3)：215-227；Ruberti等人(1993)Cell.Molec.Neurobiol.13(5)：559-568。然而，當為了治療而將囓齒類抗體使用在人類上時，在大量接受治療之個體中發展出人類抗-老鼠抗體反應。此外，已經發現老鼠抗體的效應物功能，在人類關係中是較低效力的。因此，真正需要抗-NGF拮抗劑抗體，包括人類化的抗-NGF拮抗劑抗體。
在本文中揭示的所有參考文獻、公開案和專利申請案，全部以引用的方式併入本文中。
在本文中揭示的本發明係關於對抗神經生長因子的抗體。
另一方面，本發明是人類化和親和力成熟的抗體E3，其專一地結合人類和囓齒類神經生長因子("NGF")。分別在圖1A(SEQ ID NO：1)和1B(SEQ ID NO：2)中出示E3之重鏈和 輕鏈可變區的胺基酸序列。在圖1A和1B中以圖示敘述抗體E3的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDRs)。在下文中亦出示E3重和輕鏈之胺基酸序列，以及個別的衍生CDRs(參見下文的"抗體序列)。
另一方面，本發明是包括抗體E3之片段或區域的抗體(在本文中可交替稱為"E3")。在一具體實施例中，該片段是在圖1B中出示的抗體E3之輕鏈。在另一具體實施例中，該片段是在圖1A中出示的抗體E3之重鏈。在另一具體實施例中，該片段含有一或多個得自抗體E3之輕鏈及/或重鏈的可變區。在另一具體實施例中，該片段含有一或多個得自在圖1A和1B中出示之抗體E3之輕鏈及/或重鏈的互補性決定區(CDRs)。
另一方面，本發明是包括輕鏈的抗體，該輕鏈係由具有ATCC第PTA-4893號或ATCC第PTA-4894號之存放編號的宿主細胞產生之多核苷酸編碼的。另一方面，本發明是包括重鏈的抗體，該重鏈係由具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的宿主細胞產生之多核苷酸編碼的。另一方面，本發明是包括(a)輕鏈，該輕鏈係由具有ATCC第PTA-4894號或ATCC第PTA-4893號之存放編號的宿主細胞產生之多核苷酸編碼的，和(b)重鏈的抗體，該重鏈係由具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的宿主細胞產生之多核苷酸編碼的(在本文中為了方便，將由已存放之宿主細胞產生的多核苷酸(們)稱為具有ATCC第PTA-4894號、PTA-4893和PTA-4895號的存放編號)。另一方面，本發明是包括輕鏈之輕 鏈可變區的抗體，該輕鏈係由具有ATCC第PTA-4894號或ATCC第PTA-4893號之存放編號的宿主細胞產生之多核苷酸編碼的。另一方面，本發明是包括重鏈之重鏈可變區的抗體，該重鏈係由具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的宿主細胞產生之多核苷酸編碼的。另一方面，本發明是包括(a)輕鏈的輕鏈可變區，該輕鏈係由具有ATCC第PTA-4894號或ATCC第PTA-4893號之存放編號的宿主細胞產生之多核苷酸編碼的，以及(b)重鏈之重鏈可變區的抗體，該重鏈係由具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的宿主細胞產生之多核苷酸編碼的。另一方面，本發明是包括一或多個CDR(s)的抗體，該CDR(s)係由(a)由具有ATCC第PTA-4894號之存放編號的宿主細胞產生之多核苷酸；及/或(b)由具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的宿主細胞產生之多核苷酸編碼的編碼的。
在某些具體實施例中，該抗體包括人類重鏈IgG2a恆定區。在某些具體實施例中，該抗體包括人類輕鏈恆定區。在某些具體實施例中，該抗體包括經過修改的恆定區，如在免疫學上為惰性的恆定區，例如不誘發補體調解之溶解，或不刺激抗體-依賴性細胞調解之細胞毒性(ADCC)。在其他具體實施例中，按照在Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT公開案第PCT/GB99/01441號；及/或大不列顛聯合王國專利申請案第9809951.8號中的描述來修改該恆定區。在另外的具體實施例中，該抗體包括人類重鏈IgG2a恆定區，包括下列的突變：A330P331至 S330S331(胺基酸編號係參考野外型IgG2a序列)。Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624。
另一方面，本發明提供包括下列任一或多個的多肽(其可以或可以不是抗體)：a)在圖1A和1B中出示之抗體E3的一或多個CDR(s)；b)得自在圖1A中出示之抗體E3之重鏈的CDR H3；c)得自在圖1B中出示之抗體E3之輕鏈的CDR L3；d)得自在圖1B中出示之抗體E3之重鏈的三個CDRs；e)得自在圖1A中出示之抗體E3之重鏈的三個CDRs；以及f)得自在圖1A和1B中出示之抗體E3之輕鏈的三個CDRs和得自其重鏈的三個CDRs。本發明更提供包括下列任一或多個的多肽(其可以或可以不是抗體)：a)衍生自在圖1A和1B中出示之抗體E3的一或多(一、二、三、四、五或六)個CDR(s)；b)衍生自得自在圖1A中出示之抗體E3的重鏈之CDR H3的CDR；及/或c)衍生自得自在圖1B中出示之抗體E3的輕鏈之CDR L3的CDR。在某些具體實施例中，CDRs可能是Kabat CDRs、Chothia CDRs，或Kabat和Chothia CDRs的組合(在本文中稱為"衍生"或"混合"的CDRs)。在某些具體實施例中，多肽(如抗體)與NGF(如人類NGF)結合。在某些具體實施例中，該多肽包括在本文中描述的任何CDR組態(包括組合、變體等等)。
本發明一方面提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO：9組成的重鏈可變區，其中I34是S、L、V、A或I；且以N、T或S取代N35。在本文中為了方便，在關於或提及胺基酸時，"取代"或"是"意指特定位置可選擇的胺基酸 (們)。取代或選擇，顯然可以是在SEQ ID或圖中敘述的胺基酸。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO：10組成的重鏈可變區，其中M50是M、I、G、Q、S或L；A62是A或S；且L63是L或V。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO：11所組成的重鏈可變區，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；且其中Y110是Y、K、S、R或T。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO：11所組成的重鏈可變區，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何胺基酸。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO：11所組成的重鏈可變區，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中 Y110是任何胺基酸。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO：12組成的輕鏈可變區，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO：13組成的輕鏈可變區，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO：14組成的輕鏈可變區，其中S91是S或E；K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO：14組成的輕鏈可變區，其中S91是S或E；K92是任何胺基酸；且其中Y96是Y或R。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO：9中出示的胺基酸序列，其中I34是S、L、V、A或I；且N35是N、T或S。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO：10中出示的胺基酸序列，其中M50是M、I、G、Q、S或L；A62是A或S；且L63是L或V。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO：11中出示的胺基酸序列，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G； 且其中Y110是Y、K、S、R或T。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO：11中出示的胺基酸序列，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何胺基酸。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO：11中出示的胺基酸序列，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何胺基酸。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO：12中出示的胺基酸序列，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO：13中出示的胺基酸序列，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO：14中出示的胺基酸序列，其中S91是S或E；K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO：14中出示的胺基酸序列，其中S91是S或E；K92是任何胺基酸；T93是任何胺基酸；且其中Y96是Y或R。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體，包括人類化抗體)，其包括由SEQ ID NO：9之CDR1區，其中I34為S、L、V、A或I；且N35是N、T或S；SEQ ID NO：10之CDR2區，其中M50是M、I、G、Q、S或L；A62是A或S，且L63是L或V；以及SEQ ID NO：11之CDR3區，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；其中Y110是Y、K、S、R或T，所組成的重鏈可變區。在一些具體實施例中，該重鏈可變區包括SEQ ID NO：11的CDR3區，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；其中Y110是任何胺基酸。在另外的具體實施例中，該重鏈可變區包括SEQ ID NO：11的CDR3區，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G； 且其中Y110是任何胺基酸。在一些具體實施例中，該多肽(如抗體)更包括抗體輕鏈可變區。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括由SEQ ID NO：12之CDR1區，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q；SEQ ID NO：13之CDR2區，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T；以及SEQ ID NO：14之CDR3區，其中S91是S或E；K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R，所組成的輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該輕鏈可變區包括SEQ ID NO：14的CDR3區，其中S91是S或E；K92是任何胺基酸；T93是任何胺基酸；且其中Y96是Y或R。在一些具體實施例中，該多肽(如抗體)更包括抗體重鏈。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括(a)由SEQ ID NO：9之CDR1區，其中I34是S、L、V、A或I；且N35是N、T或S；SEQ ID NO：10之CDR2區，其中M50是M、I、G、Q、S或L；A62是A或S，且L63是L或V；以及SEQ ID NO：11之CDR3區，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；其中Y110是Y、K、S、R或T，所組成的重鏈可變區；以及(b)由SEQ ID NO：12之CDR1區，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q；SEQ ID NO：13之CDR2區，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T；以及SEQ ID NO：14之 CDR3區，其中S91是S或E；K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R，所組成的輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該輕鏈可變區包括SEQ ID NO：14之CDR3區，其中S91是S或E；K92是任何胺基酸；T93是任何胺基酸；且其中Y96是Y或R。在一些具體實施例中，該重鏈可變區包括SEQ ID NO：11之CDR3區，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；其中Y110是任何胺基酸。在其他的具體實施例中，該重鏈可變區包括SEQ ID NO：11之CDR3區，G98是G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何胺基酸。在一些具體實施例中，該多肽更包括抗體輕鏈。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體，包括人類化抗體)，其包括在SEQ ID NO：9中出示之胺基酸序列，其中I34是S、L、V、A或I；且N35是N、T或S；在SEQ ID NO：10中出示之胺基酸序列，其中M50是M、I、G、Q、S或L；A62是A或S，且L63是L或V；以及在SEQ ID NO：11中出示之胺基酸序列，其中Y100是Y、L或R；其中Y101 是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；其中Y110是Y、K、S、R或T。在一些具體實施例中，該多肽包括在SEQ ID NO：11中出示之胺基酸序列，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何胺基酸。在其他的具體實施例中，該多肽包括在SEQ ID NO：11中出示之胺基酸序列，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何胺基酸。在一些具體實施例中，該多肽(如抗體)更包括抗體輕鏈可變區。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括在SEQ ID NO：12中出示之胺基酸序列，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q；在SEQ ID NO：13中出示之胺基酸序列，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T；以及在SEQ ID NO：14中出示之胺基酸序列，其中S91是S或E；K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R。在一些具體 實施例中，該多肽包括在SEQ ID NO：14中出示之胺基酸序列，其中S91是S或E；K92是任何胺基酸；T93是任何胺基酸；且其中Y96是Y或R。在一些具體實施例中，該多肽(如抗體)更包括抗體重鏈可變區。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括(a)在SEQ ID NO：9中出示之胺基酸序列，其中I34是S、L、V、A或I；且N35是N、T或S；在SEQ ID NO：10中出示之胺基酸序列，其中M50是M、I、G、Q、S或L；A62是A或S，且L63是L或V；以及在SEQ ID NO：11中出示之胺基酸序列，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；且其中Y110是Y、K、S、R或T；以及(b)在SEQ ID NO：12中出示之胺基酸序列，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q；在SEQ ID NO：13中出示之胺基酸序列，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T；以及在SEQ ID NO：14中出示之胺基酸序列，其中S91是S或E；K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R。在一些具體實施例中，該多肽包括在SEQ ID NO：14中出示之胺基酸序列，其中S91是S或E；K92是任何胺基酸；T93是任何胺基酸；且其中Y96是Y或R。在一些具體實施例中，該多肽包括在SEQ ID NO：11中出示之胺基酸序列，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或 T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何胺基酸。在其他的具體實施例中，該多肽包括在SEQ ID NO：11中出示之胺基酸序列，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何胺基酸。在一些具體實施例中，該多肽更包括抗體輕鏈可變區。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括由下列所組成的重鏈可變區：(a)SEQ ID NO：9之CDR1區，其中I34是S、L、V、A或I；且N35以N、T或S取代；(b)SEQ ID NO：10之CDR2區，其中M50是I、G、Q、S或L；A62是A或S，且L63是L或V；以及(c)SEQ ID NO：11之CDR3區，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；其中Y110是Y、K、S、R或T；其中該抗體與NGF結合。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括由下列所組成的輕鏈可變區：(a)SEQ ID NO：12之CDR1區，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q； (b)SEQ ID NO：13之CDR2區，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T；以及(c)SEQ ID NO：14之CDR3區，其中K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R；其中該抗體與NGF結合。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其包括(a)重鏈可變區，包括：(i)SEQ ID NO：9之CDR1區，其中I34以S、L、V、A或I取代；且N35以N、T或S取代；(ii)SEQ ID NO：10之CDR2區，其中M50是I、G、Q、S或L；A62是A或S，且L63是L或V；和(iii)SEQ ID NO：11之CDR3區，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；其中Y110是Y、K、S、R或T；以及(b)輕鏈可變區，包括：(i)SEQ ID NO：12之CDR1區，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q；(ii)SEQ ID NO：13之CDR2區，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T；和(iii)SEQ ID NO：14之CDR3區，其中S91是S或E；K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R；其中該抗體與NGF結合。
除非另行提到，在一位置的胺基酸選擇(例如取代)是與在任何其他位置的胺基酸選擇無關。
在一些具體實施例中，多核苷酸(如抗體)與NGF(如人類NGF)結合。在一些具體實施例中，該多肽包括包括在本文中描述的任何CDR組態(包括組合、變體等等)。
從本文中的說明，顯然在本文中可變區的編號係使用連續編號。熟諳此藝者迅速地了解一些現存的抗體編號系統(如Kabat和Chothia編號)，以及如何將連續編號轉換成其他的編號系統，如Kabat編號或Chothia編號。
另一方面，本發明提供包括選自SEQ ID NO：46或50之胺基酸序列(如CDR3序列)的多肽(如抗體)。在另外的具體實施例中，該多肽更包括一或多個在SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8中出示的胺基酸序列。在另外的具體實施例中，該多肽更包括一或多個在SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14和15中出示的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供包括選自下列之胺基酸序列(如CDR區，如CDR H1及/或CDR H2區)的多肽(如抗體)：(a)SEQ ID NO：28及/或29；(b)SEQ ID NO：30及/或31；(c)SEQ ID NO：32及/或33；(d)SEQ ID NO：34及/或35；(e)SEQ ID NO：36及/或37；(f)SEQ ID NO：38及/或39；以及(g)SEQ ID NO：40和41。在一些具體實施例中，該多肽包括選自SEQ ID NO：28、30、32、34、36、38和40的胺基酸序列(如CDR H1區)。在一些具體實施例中，該多肽包括選自SEQ ID NO：29、31、33、35、37、39和41的胺基酸序列(如CDR H2區)。在另外的具體實施例中，該多肽更包括一或多個在SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8中出示的胺基酸序列。在另外的具體實施例中，該多肽更包括一或多個在SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14和15中出示的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供包括選自下列之胺基酸序列(如CDR區，如CDR L1及/或CDR L2區)的多肽(如抗體)：(a)SEQ ID NO：18及/或19；(b)SEQ ID NO：20及/或21；和(c)SEQ ID NO：22及/或23。在一些具體實施例中，該多肽包括選自SEQ ID NO：18、20和22的胺基酸序列(如CDR L1區)。在一些具體實施例中，該多肽包括選自SEQ ID NO：19、21和23的胺基酸序列(如CDR L2區)。在另外的具體實施例中，該多肽更包括一或多個在SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8中出示的胺基酸序列。在另外的具體實施例中，該多肽更包括一或多個在SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14和15中出示的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供包括選自下列之胺基酸序列(如CDR區，如CDR L3及/或CDR H3區)的多肽(如抗體)：(a)SEQ ID NO：51及/或52；(b)SEQ ID NO：55及/或56；(c)SEQ ID NO：57及/或58；(d)SEQ ID NO：59及/或60；(e)SEQ ID NO：61及/或62；(f)SEQ ID NO：63及/或64。在一些具體實施例中，該多肽包括選自SEQ ID NO：51、55、57、59、61和63的胺基酸序列(如CDR L3區)。在一些具體實施例中，該多肽包括選自SEQ ID NO：52、56、58、60、62和64的胺基酸序列(如CDR H3區)。在另外的具體實施例中，該多肽更包括一或多個在SEQ ID NO：18、19、30和31中出示的胺基酸序列。在另外的具體實施例中，該多肽更包括一或多個在SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8中出示的胺基酸序列。在另外的具體實施例中，該多肽更包括一或多 個在SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14和15中出示的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供包括一或多個在SEQ ID NO：61、63、18、19、30和31中出示之胺基酸序列(如CDR區)的多肽(如抗體)。
本發明一方面提供抗-NGF抗體(如拮抗劑抗體)，其以高親和力與NGF(如人類NGF)結合。在一些具體實施例中，高親和力是(a)以低於大約2 nM(如大約1 nM、800 pM、600 pM、400 pM、200 pM、100 pM、90 pM、80 pM、70 pM、60 pM、50 pM或更低)之KD ，及/或比大約6x10-5 s-1 更慢的koff 與NGF結合；並/或(b)以大約200 pM、150 pM、100 pM、80 pM、60 pM、40 pM、20 pM、10 pM或更低的IC50 (在大約15 pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經元的人類NGF-依賴性存活；並/或(c)以大約50 pM、40 pM、30 pM、20 pM、10 pM、5 pM、2 pM、1 pM或更低的IC50 (在大約1.5 pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經元的人類NGF-依賴性存活；並/或(d)以大約150 pM、125 pM、100 pM、80 pM、60 pM、40 pM、30 pM、20 pM、10 pM、5 pM或更低的IC50 (在大約15 pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經元的大鼠NGF-依賴性存活；並/或(e)以大約30 pM、25 pM、20 pM、15 pM、10 pM、5 pM、4 pM、3 pM、2 pM、1 pM或更低的IC50 (在大約1.5 pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉 神經元的老鼠NGF-依賴性存活；並/或(f)並以比trkA受體更高的親和力與NGF結合。
另一方面，本發明提供多肽(如抗體)，其中該多肽(a)以低於大約2 nM(如大約1 nM、800 pM、600 pM、400 pM、200 pM、100 pM、90 pM、80 pM、70 pM、60 pM、50 pM或更低)之KD ，及/或比大約6x10-5 s-1 更慢的koff 與NGF(如人類NGF)結合；並/或(b)以大約200 pM、150 pM、100 pM、80 pM、60 pM、40 pM、20 pM、10 pM或更低的IC50 (在大約15 pM NGF的存在下)，抑制老鼠E13.5三叉神經元的人類NGF-依賴性存活；並/或(c)以大約50 pM、40 pM、30 pM、20 pM、10 pM、5 pM、2 pM、1 pM或更低的IC50 (在大約1.5 pM NGF的存在下)，抑制老鼠E13.5三叉神經元的人類NGF-依賴性存活；並/或以比trkA受體更高的親和力與NGF結合。在一些具體實施例中，該多肽(a)以比大約2 nM更低的KD 與NGF結合；並/或(b)以大約100 pM或更低之IC50 抑制老鼠E13.5三叉神經元的人類NGF-依賴性存活，其中係在大約15 pM NGF的存在下測量該IC50 ；並/或(c)以大約10 pM或更低之IC50 抑制老鼠E13.5三叉神經元的人類NGF-依賴性存活，其中係在大約1.5 pM NGF的存在下測量該IC50 。在一些具體實施例中，該多肽(a)以比大約100 pM更低的KD 與NGF結合；並/或(b)以大約20 pM或更低之IC50 抑制老鼠E13.5三叉神經元的人類NGF-依賴性存活，其中係在大約15 pM NGF的存在下測量該IC50 ；並/或(c)以大約2 pM或更低之IC50 抑制老鼠E13.5三 叉神經元的人類NGF-依賴性存活，其中係在大約1.5 pM NGF的存在下測量該IC50 。
從本文中的說明，顯然明確地排除在本發明之外的是由與老鼠單株抗體911之胺基酸序列相同的胺基酸序列所組成的多肽具體實施例。在圖1A和1B，以及在SEQ ID NO：9-14中，出示Mab 911的衍生CDR序列。
在一些具體實施例中，本發明提供任何上述的多肽或抗體，其中該多肽(如抗體)更是經過分離的。在一些具體實施例中，該多肽(抗體)實質上是經過純化的。在另外的具體實施例中，該多肽(如抗體)是親和力成熟的。在其他的具體實施例中，該抗體是拮抗劑抗體。在一些具體實施例中，該多肽(抗體)包括人類架構序列。在另外的具體實施例中，該多肽(抗體)包括一或多個非-人類架構殘基。在一些具體實施例中，該多肽(抗體)以2 nM或更低之KD 與NGF(如人類NGF)結合。在一些具體實施例中，相對於非-人類胺基酸序列(如可變區序列，如CDR序列，如架構序列)，該多肽包括一或多個(如2、3、4、5、6、7、8或更多個)人類胺基酸取代。在一些具體實施例中，相對於親代多肽胺基酸序列(如抗體911胺基酸序列，如任一或多個的SEQ ID NO：9-14)，該多肽包括至少1、至少2或更多，如至少3、4、5、6或更多個胺基酸取代。在一些具體實施例中，相對於親代抗體(如Mab 911)親和力，已經改變了(在某些具體實施例中，增加了)該抗體的結合親和力。在其他的具體實施例中，該抗體的結合親和力比trkA受體對 NGF(如人類NGF)的結合親和力更低。在一些具體實施例中，該多肽可以是抗體。在一些具體實施例中，該抗體是人類抗體。在其他的具體實施例中，該抗體是人類化抗體。在另外的具體實施例中，該抗體是單株抗體。在一些具體實施例中，該抗體是親和力成熟的抗體。
本發明提供多核苷酸(包括經過分離的多核苷酸)，包括編碼任何上述之具體實施例的多核苷酸。
另一方面，本發明提供經過分離的多核苷酸，包括編碼抗體E3(在本發明中可交替稱為"E3")之片段或區域的多核苷酸。在一具體實施例中，該片段是如同在圖1B中出示的抗體E3之輕鏈。在另一具體實施例中，該片段是如同在圖1A中出示的抗體E3之重鏈。在另一具體實施例中，該片段含有一或多個得自抗體E3之輕鏈及/或重鏈的可變區。在另一具體實施例中，該片段含有一或多個得自如同在圖1A和1B中出示的抗體E3之輕鏈及/或重鏈的互補性決定區(CDRs)。
另一方面，本發明是經過分離之多核苷酸，包括編碼抗體E3之多核苷酸。在一些具體實施例中，該多核苷酸包括在圖2和3中出示的任一多核苷酸或兩者。
另一方面，本發明是經過分離的多核苷酸，其編碼具有ATCC第PTA-4893號或ATCC第PTA-4894號之存放編號的E3輕鏈。另一方面，本發明是經過分離之多核苷酸，其編碼具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的E3重鏈。另一方面，本發明是經過分離的多核苷酸，包括(a)在具有ATCC 第PTA-4893號或PTA-4894號之存放編號的多核苷酸中編碼的可變區，以及(b)在具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的多核苷酸中編碼的可變區。另一方面，本發明是經過分離的多核苷酸，包括(a)一或多個在具有ATCC第PTA-4893號或PTA-4894號之存放編號的多核苷酸中編碼的CDR；及/或(b)一或多個在具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的多核苷酸中編碼的CDR。
另一方面，本發明提供編碼任何在本文中描述之抗體(包括抗體片段)或多肽的多核苷酸。
另一方面，本發明提供包括任何在本文中揭示之多核苷酸的載體(包括表現和選殖載體)和宿主細胞。
從在本文中的說明，顯然明確地排除在本發明之外的是由與老鼠單株抗體911之多核苷酸序列相同的多核苷酸序列所組成的多核苷酸具體實施例。在圖1A和1B，以及在SEQ ID NO：9-14中，出示Mab 911的衍生CDR序列。
另一方面，本發明是包括編碼E3輕鏈之多核苷酸和編碼E3重鏈之多核苷酸的宿主細胞，其中該多核苷酸(們)編碼具有ATCC第PTA-4893號及/或PTA-4894號之存放編號的E3輕鏈，且該多核苷酸編碼具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的E3重鏈。在一些具體實施例中，該宿主細胞包括多核苷酸，其包括(a)在具有ATCC第PTA-4893號或PTA-4894號之存放編號之多核苷酸中編碼的可變區，及/或(b)在具有ATCC第PTA-4895號之存放編號之多核苷酸中編碼的可變區。在一些具體實施例中，該宿主細胞包括編碼(a)一或 多個在具有ATCC第PTA-4893號或PTA-4894號之存放編號的多核苷酸中編碼之CDR；及/或(b)一或多個在具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的多核苷酸中編碼之CDR的多核苷酸。在一些具體實施例中，該宿主細胞是哺乳動物細胞。
另一方面，本發明是與抗體E3結合之NGF的複合物。另一方面，該複合物是經過分離的。另一方面，該複合物實質上是經過純化的。
另一方面，本發明是與在本文中描述之抗體或多肽結合的NGF的複合物。另一方面，該複合物是經過分離的。另一方面，該複合物實質上是經過純化的。
另一方面，本發明是包括在本文中描述之多肽(包括抗體，如抗體E3)或多核苷酸的醫藥組合物，如包括抗體E3或包括抗體E3之片段的抗體之醫藥組合物，以及在藥學上可接受的賦形劑。
另一方面，本發明是產製抗體E3的方法，包括製備包括編碼抗體E3之表現載體的宿主細胞，在容許抗體E3產生的條件下培養該宿主細胞或其後代；並純化抗體E3。在一些具體實施例中，該表現載體包括在圖2和3中出示的多核苷酸序列之一或兩者。
另一方面，本發明是產製抗體E3的方法，包括使編碼E3輕鏈之多核苷酸和編碼E3重鏈之多核苷酸在適當的細胞中表現，其中編碼E3輕鏈的多核苷酸具有ATCC第PTA-4893號及/或ATCC第PTA-4894號之存放編號，且編碼E3重鏈的 多核苷酸具有ATCC第PTA-4895號之存放編號；通常接著回收及/或分離該抗體。
另一方面，本發明提供產製任何在本文中描述之多肽(如抗體)的方法，藉著使一或多個編碼該抗體(其可以單一輕或重鏈分別表現，或可從一載體中表現輕和重鏈兩者)之多核苷酸在適當的細胞中表現，通常接著回收並/或分離感興趣的抗體或多肽。
另一方面，本發明是使用在本文中揭示之任何多肽(包括抗體，如抗體E3)，拮抗NGF(如人類NGF)生物活性的方法。在一具體實施例中，該方法包括使人類神經生長因子與在本文中描述的任何多肽(包括抗體E3)接觸，藉此拮抗、降低、阻斷或壓抑NGF活性(如人類神經生長因子活性)。
另一方面，本發明是使用在本文中描述之任何多肽(包括抗體，如抗體E3)，檢測NGF的方法。藉著檢測在NGF和在本文中描述的任何多肽(如抗體E3)之間的複合物，來檢測NGF的存在。當在本文中使用"檢測"一詞時，包括有或無參考對照組的定性及/或定量檢測(測量含量)。
另一方面，本發明是藉著投與有效含量之包括抗體E3或在本文中描述之任何多肽(包括抗體)或多核苷酸具體實施例的組合物，來治療疼痛的方法。在一些具體實施例中，該疼痛是手術後的疼痛。
另一方面，本發明是藉著對個體投與有效含量之抗-NGF拮抗劑抗體，在該個體中預防或治療風濕性關節炎疼 痛的方法。根據本發明，已經顯示抗-NGF拮抗劑抗體能夠抑制或阻斷與風濕性關節炎有關的疼痛。在一些具體實施例中，在投與抗-NGF拮抗劑抗體之後大約24小時內減輕了該疼痛。在一些具體實施例中，在投與抗-NGF拮抗劑抗體之後大約4天內減輕了該疼痛。在一些具體實施例中，在個體中觀察到改善炎症狀況的跡象之前，或在沒有改善的跡象時，減輕該疼痛。
另一方面，本發明提供在個體中減少風濕性關節炎疼痛的發生、改善風濕性關節炎疼痛、抑制風濕性關節炎疼痛、減輕風濕性關節炎疼痛及/或延遲風濕性關節炎疼痛之發作、發展或進行的方法，該方法包括對該個體投與有效含量的抗-NGF拮抗劑抗體。
另一方面，本發明提供在個體中治療與風濕性關節炎有關之炎症惡病質(體重減輕)的方法，包括投與有效含量的抗-NGF拮抗劑抗體。
另一方面，本發明是藉著對個體投與有效含量之神經生長因子的拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)，在個體中預防或治療骨關節炎疼痛的方法。
另一方面，本發明提供在個體中減少骨關節炎疼痛的發生、改善骨關節炎疼痛、抑制骨關節炎疼痛、減輕骨關節炎疼痛及/或延遲骨關節炎疼痛之發作、發展或進行的方法，該方法包括對該個體投與有效含量的NGF抑制劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。
另一方面，本發明提供在患有骨關節炎之個體中改善身 體功能的方法，該方法包括對該個體投與有效含量的NGF抑制劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。
另一方面，本發明提供在患有骨關節炎之個體中改善僵硬的方法，該方法包括對該個體投與有效含量的NGF抑制劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。
在一些具體實施例中，該個體為人類。在一些具體實施例中，為了治療骨關節炎疼痛，抗-NGF拮抗劑抗體的給藥頻率是在每天一次和每10週一次之間，或是更低的頻率。
另一方面，本發明提供包括任一或多個在本文中描述之組合物的套組和組合物。這些套組，通常是在適當的包裝中並提供適當的說明書，適用在本文中描述的任何方法。
本發明亦提供任何適合在本文中描述之任何用途的組合物和套組，無論是在醫藥品的用途，及/或用來製造醫藥品的前後文中。
在本文中揭示之本發明，提供抗-NGF拮抗劑抗體，其以高親和力與NGF(如人類NGF)結合。本發明更提供衍生自與NGF結合之E3的抗體和多肽，以及製造和使用這些抗體的方法。在一些具體實施例中，本發明提供人類化抗體E3，其與神經生長因子("NGF")結合，以及製造和使用該抗體的方法。本發明亦提供與NGF結合的E3多肽(包括抗體)，以及編碼E3抗體及/或多肽的多核苷酸。
在本文中揭示之本發明，亦藉著投與在治療上有效之含 量的抗-NGF拮抗劑抗體，提供在個體中預防及/或治療風濕性關節炎疼痛的方法。
在本文中揭示之本發明，亦藉著投與在治療上有效之含量的NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)，提供在個體中預防及/或治療骨關節炎疼痛的方法。
本發明亦提供調整抗體之親和力的方法，以及定出CDR區之特徵的方法。
共同技術
除非另行指定，本發明之實施將使用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生化和免疫學的傳統技術，這些均為熟諳此藝者所擅長的。在文獻中充分說明了這類技術，如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，編輯，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編輯，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編輯，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和D.G.Newell，編輯，1993-1998)J.Wiley和Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell編輯)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M. Miller和M.P.Calos編輯，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人，編輯，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人，編輯，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人，編輯，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty編輯，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd和C.Dean編輯，Oxford University Press,2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra編輯，Harwood Academic Publishers,1995)；以及Cancer：Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人，編輯，J.B.Lippincott Company,1993)。
定義
"抗體"是能夠經由至少一個位在免疫球蛋白分子之可變區的抗原認知位置，與標靶(如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等等)專一結合的免疫球蛋白分子。當在本文中使用時，該名詞不僅包括完整的多株或單株抗體，還包括其片段(如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變種、包括抗體部分的融合蛋白，以及包括抗原認知位置之免疫球蛋白分子的任何其他修改組態。抗體包括任何種類的抗體，如IgG、IgA或IgM(或其亞類)，且抗體不一定是 任何特殊的種類。依據抗體重鏈之恆定功能部位的胺基酸序列，可將免疫球蛋白分成不同的種類。有五大類的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，而這些有可能進一步細分成亞類(同型物)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。分別將與不同種類免疫球蛋白相符合的重鏈恆定功能部位稱為α、δ、ε、γ和μ。已完全明瞭不同種類之免疫球蛋白的次單元結構和三維組態。
"Fv"是含有完整抗原-認知和-結合位置的抗體片段。在雙鏈Fv物種中，該區域係由以緊密、非-共價結合的一重和一輕鏈可變功能部位之二聚體組成。在單鏈Fv物種中，可藉著有彈性的肽交聯劑，共價連接一重和一輕鏈可變功能部位，使得該輕和重鏈可以類似在雙鏈Fv物種中的二聚體結構來結合。在該組態中，每個可變功能部位的三個CDRs交互作用，將抗原-結合專一性限定在VH-VL二聚體的表面上。然而，甚至單一的可變功能部位(或半個Fv，僅包括對抗原專一的3個CDRs)亦具有認出抗原並與其結合的能力，雖然通常是以比完整結合位置更低的親和力。
Fab片段亦含有輕鏈的恆定功能部位和重鏈的第一個恆定功能部位(CH1)。Fab'片段與Fab片段之差異在於在重鏈CH1功能部位的羧基終端加上數個殘基，包括一或多個得自抗體絞鏈區的半胱胺酸。
"單株抗體"意指均一的抗體族群，其中該單株抗體是由涉及抗原之選擇結合的胺基酸(天然存在或非-天然存在的)所組成。單株抗體之族群針對單一的抗原性位置是高度專 一的。"株抗體"一詞不僅包括完整的單株抗體和全長的單株抗體，還包括其片段(如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變種、包括抗體部分的融合蛋白，以及包括與抗原結合之專一性和能力所需的抗原認知位置之免疫球蛋白分子的任何其他修改組態。並非企圖限制關於抗體的來源或其製造方式(例如藉著融合瘤、噬菌體選擇、重組表現、基因轉殖動物等等)。
當在本文中使用時，"人類抗體"意指抗體具有與由人類產生，及/或已經使用此項技藝中已知或在本文中揭示之製造人類抗體的任何技術製造之抗體一致的胺基酸序列。人類抗體的定義，包括由至少一個人類重鏈多肽或至少一個人類輕鏈多肽所組成的抗體。這類實例之一，是包括老鼠輕鏈和人類重鏈多肽的抗體。可使用此項技藝中已知的各種技術產生人類抗體。在一具體實施例中，人類抗體係選自表現人類抗體的噬菌體庫(Vaughan等人，1996,Nature Biotechnology,14：309-314；Sheets等人，1998,PNAS,(USA)95：6157-6162；Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.,227：381；Marks等人，1991,J.Mol.Biol.,222：581)。亦可藉著將人類免疫球蛋白位點導入基因轉殖的動物，例如其中已經使內源之免疫球蛋白基因部分或全部失活的老鼠中，來製造人類抗體。在美國專利第5,545,807號；5,545,806號；5,569,825號；5,625,126號；5,633,425號和5,661,016號中揭示了該方法。或者，可藉著永存不死之人類B淋巴細胞來製備人類抗體，其產生針對標靶抗原的抗 體(可從個體中回收這類B淋巴細胞，或可以是已經在活體外免疫的)。參見，例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boemer等人，1991,J.Immunol.,147(1)：86-95；以及美國專利第5,750,373號。
"嵌合型抗體"意指其中每個重和輕鏈之胺基酸序列的一部分均是與在衍生自特殊物種之抗體中的相對應序列同種的，或屬於特殊種類，而鏈的剩餘斷片是與在其他物種中之相對應序列同種的那些抗體。在這些嵌合型抗體中，輕和重鏈兩者的可變區通常模仿衍生自一哺乳動物物種之抗體的可變區，而恆定部分則是與抗體中衍生自另一物種之序列同種的。這類嵌合形式的一個顯著優點是，例如可使用迅速可用的融合瘤或得自非人類宿主生物的B細胞，從目前已知之來源便利地衍生可變區，並與衍生自例如人類細胞製備物的恆定區混合。雖然可變區具有容易製備的優點，但專一性並不受其來源影響，恆定區則是人類，比得自非-人類來源之恆定區，更不可能在注射該抗體時從人類個體中誘發免疫反應。然而，定義並未受限於該特殊實例。
"有功能的Fc區"具有固有序列Fc區的至少一種效應物功能。代表性的"效應物功能"包括C1q結合；補體-依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體-依賴性細胞-調解之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)的向下-調節等等。這類效應物功能通常需要將 與結合功能部位(例如抗體可變功能部位)結合的Fc區，並可使用此項技藝中已知用來評估這類抗體效應物功能的各種測定來評估之。
"固有序列Fc區"包括與自然發現之Fc區的胺基酸序列相同的胺基酸序列。"變種Fc區"包括與固有序列Fc區之差異為至少一個胺基酸修改，但仍保留固有序列Fc區之至少一個效應物功能的胺基酸序列。變種Fc區與固有序列Fc區或與親代多肽之Fc區相比較，最好具有至少一個胺基酸取代，例如從大約1到大約10個胺基酸取代，且最好是在固有序列Fc區或在親代多肽之Fc區中，具有從大約1到大約5個胺基酸取代。在本文中，變種Fc區最好與固有序列Fc區及/或親代多肽之Fc區，將具有至少大約80%序列同一性，且與其最好有至少大約90%序列同一性，更佳的是與其有至少大約95%序列同一性。
當在本文中使用時，"抗體-依賴性細胞-調解之細胞毒性"和"ADCC"意指細胞-調解之反應，其中非專一性的細胞毒性細胞，表現Fc受體(FcRs)(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球和巨噬細胞)認得在標靶細胞上已結合的抗體，隨後引起標靶細胞的溶解。可使用活體外的ADCC測定，如在美國專利第5,500,362號或5,821,337號中描述的，評估感興趣分子的ADCC活性。適用於這類測定的效應物細胞包括周圍血液單核細胞(PBMC)和NK細胞。或者，或另外亦可在活體內評估感興趣分子的ADCC活性，例如在動物模式中，如在Clynes等人，1998,PNAS(USA),95：652-656 中揭示的。
當在本文中使用時，"Fc受體"和"FcR"描述與抗體之Fc區結合的受體。較佳的FcR是固有序列人類FcR。此外，較佳的FcR是與IgG抗體結合的FcR(γ受體)，並包括Fc？R I、Fc？R Ⅱ和Fc？R Ⅲ亞類的受體，包括對偶基因變體，以及這些受體的另類接合形式。Fc？R Ⅱ受體包括Fc？R Ⅱ A("激活受體")和Fc？R Ⅱ B("抑制受體")，其具有類似的胺基酸序列，主要的差異為其細胞質功能部位。在Ravetch和Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9：457-92；Capel等人，1994,Immunomethods,4：25-34；以及de Haas等人，1995,J.Lab.Clin.Med.,126：330-41中回顧了FcRs。"FcR"亦包括新生兒受體FcRn，其負責將成熟IgGs運送至胎兒(Guyer等人，1976,J.Immunol.,117：587；以及Kim等人，1994,J.Immunol.,24：249)。
"補體依賴性細胞毒性"和"CDC"意指在補體存在下的標靶溶解。藉著補體系統的第一個補體(C1q)與已與關聯抗原複合的分子(例如抗體)結合，發動補體激活路徑。欲評估補體激活作用，可進行CDC測定，例如像是在Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods,202：163(1996)中的描述。
當在本文中使用時，可交替使用名詞"E3"、"3E"和"抗體E3"，意指包括分別在圖1A(SEQ ID NO：1)和1B(SEQ ID NO：2)中出示的重鏈和輕鏈可變區之胺基酸序列的抗體。在圖1A和1B中，以圖解描述抗體E3之CDR部分(包括 Chothia和Kabat CDRs)。圖2和3分別顯示編碼重和輕鏈的多核苷酸，包括分別在圖1A和1B中出示的重和輕鏈可變區。在實例中說明E3的產製及特徵。與E3有關的不同生物功能，包括但不限於與NGF結合並抑制NGF生物活性及/或由NGF發送信號來調解之下游路徑(們)的能力；以及抑制老鼠E13.5三叉神經元之NGF-依賴性存活的能力。如同在本文中討論的，本發明之抗體可具有這些特徵之一或多項。在一些具體實施例中，"E3"一詞意指由(a)編碼具有ATCC第PTA-4893號或ATCC第PTA-4894號之存放編號的E3輕鏈之多核苷酸，以及(b)編碼具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的E3重鏈之多核苷酸編碼的免疫球蛋白。
當在本文中使用時，抗體的"免疫專一之"結合意指抗原專一的結合交互作用發生在抗體之抗原結合位置與由該抗體認出之特定抗原之間(即該抗體在ELISA或其他免疫測定中與該蛋白質反應，但與無關蛋白質沒有可檢測到的反應)。
一抗原決定位與抗體或多肽"專一地結合"或"優先結合"(在本文中可交替使用)，是此項技藝中已熟知的字眼，且判定這類專一或優先結合的方法亦是此項技藝中已熟知的。若一分子以比它與另類細胞或物質更頻繁、更迅速，並以更長的期間及/或更高的親和力與一特定細胞或物質反應或結合，便說該分子表現出"專一地結合"或"優先結合"。若一抗體以比它與其他物質更高的親和力、抗體親抗原性，更迅速及/或以更長的期間結合，便說該抗體與標靶"專 一地結合"或"優先結合"。例如，與NGF抗原決定位專一地或優先結合的抗體，是以比它與其他NGF抗原決定位或非-NGF抗原決定位更高之親和力、抗體親抗原性，更迅速及/或以更長的期間與該抗原決定位結合的抗體。藉著閱讀該定義亦明瞭，例如與第一個標靶專一地或優先結合的抗體(或部分或抗原決定位)，可能或可能不是專一地或優先與第二個標靶結合。"專一地結合"或"優先結合"不一定需要(雖然它可能包括)獨占的結合。通常，但不一定在提到結合時意指優先結合。
名詞"多肽"、"低聚肽"、"肽"和"蛋白質"在本文中可交替使用，意指任何長度之胺基酸的聚合物。聚合物可以是直線或分支的，其可包括經過修改的胺基酸，且其可被非-胺基酸中斷。該名詞亦包括已經以天然方式或藉著干涉修改的胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化作用、脂化作用、乙醯化作用、磷酸化作用或任何其他的操作或修改，如與標示組份共軛。在該定義中，亦包括例如含有一或多個胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸)的多肽，以及在此項技藝中已知的其他修改。因為本發明之多肽是以抗體為基礎，該多肽當然可以單鏈或結合鏈之行是存在。
"多核苷酸"或"核酸"在本文中可交替使用，意指任何長度之核苷酸的聚合物，並包括DNA和RNA。核苷酸可以是去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修改之核苷酸或鹼基，及/或其類似物，或任何能夠由DNA或RNA聚合酶併入聚 合物內的物質。多核苷酸可包括經修改的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其類似物。若出現修改，可能在聚合物組裝之前或之後，給予對該核苷酸結構的修改。可藉著非-核苷酸組份中斷核苷酸之序列。可在聚合作用之後進一步修改多核苷酸，如藉著與標示組份共軛。其他類型的修改包括，例如"加帽"、以類似物取代一或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間的取代，像是例如具有不帶電鍵合(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷醯胺酸、胺基甲酸酯等等)和帶電荷鍵合(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等等)的那些，含有垂懸部分的那些，像是例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、ply-L-離胺酸等等)，具有嵌入劑的那些(例如吖啶、補骨脂素等等)，含有螯合劑的那些(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等等)，含有烷化劑的那些，帶有修改鍵合的那些(例如α異頭核酸等等)，以及多核苷酸(們)的未修改形式。此外，任何經常出現在糖中的羥基基團，亦可藉著例如膦酸鹽基團、磷酸鹽基團置換，以標準保護基保護，或激活，來製備與其他核苷酸的額外鍵合，或可與固體支撐物共軛。可將5'和3'終端OH磷酸化，或以胺或1至20個碳原子之有機加帽基團部分取代。亦可將其他的羥基衍生成標準保護基。多核苷酸亦可含有核糖或去氧核糖糖的類似形式，通常是此項技藝中已知的，包括例如2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮-核糖、碳環糖類似物、α-異頭糖類、表異構糖類，如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非 環化類似物和非鹼基核苷類似物，如甲基核糖苷。可藉著另類連接基來取代一或多個磷酸二酯鍵合。這些另類連接基包括，但不限於其中以P(O)S("硫代酯")、P(S)S("二硫代酯")、(O)NR2 ("醯胺化物")、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2 ("甲縮醛(formacetal)")置換磷酸鹽的具體實施例，其中每個R或R'分別為H或經取代或未經取代的烷基(1-20C)，其可視需要含有(-O-)鍵合、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。在多核苷酸中並非全部的鍵合都要是相同的。先前的說明適用於所有在本文中提及的多核苷酸，包括RNA和DNA。
抗體之"可變區"意指單獨或混合的抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區。重和輕鏈的可變區分別由四個架構區(FR)所組成，藉著三個亦稱為高變區的互補性決定區(CDRs)連接。在每個鏈中的CDRs都由緊鄰的FRs維持在一起，並與來自其他鏈之CDRs形成抗體的抗原結合位置。至少有兩種判定CDRs的技術：(1)以交叉-物種序列變異性為基礎的方法(即Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；以及(2)以抗原-抗體複合物之結晶學研究為基礎的方法(Chothia等人(1989)Nature 342：877；Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273：927-948))。當在本文中使用時，CDR可以意指以任一方法或兩種方法之組合定義的CDRs。
抗體的"恆定區"意指單獨或混合的抗體輕鏈之恆定區或 抗體重鏈之恆定區。
當在本文中使用時，"神經生長因子"和"NGF"意指神經生長因子及其保留至少一部分NGF之生物活性的變體。當在本文中使用時，NGF包括所有哺乳動物物種的固有序列NGF，包括人類、狗、貓、馬或牛。
"NGF受體"意指與NGF結合或被NGF激活的多肽。NGF受體包括任何哺乳動物物種的TrkA受體和p75受體，包括但不限於人類、狗、貓、馬、靈長類或牛。
當在本文中使用時，"抗-NGF拮抗劑抗體"(可交替稱為"抗-NGF抗體")意指能夠與NGF結合，並抑制NGF之生物活性及/或藉由NGF發送信號調解之下游路徑(們)的抗體。抗-NGF拮抗劑抗體包括阻斷、拮抗、壓抑或降低(包括明顯地)NGF生物活性的抗體，包括藉由NGF發送信號調解的下游路徑，如受體結合及/或誘發對NGF的細胞反應。為了本發明，將明確地明瞭名詞"抗-NGF拮抗劑抗體"包括所有先前確認的名詞、標題，以及功能狀態和特徵，藉此以任何有意義的程度，使NGF本身、NGF生物活性(包括但不限於其調解任何方面的手術後疼痛的能力)或生物活性之結果無效、減少或中和。在一些具體實施例中，抗-NGF拮抗劑抗體與NGF結合並預防NGF二聚作用及/或與NGF受體(如p75及/或trkA)結合。在其他的具體實施例中，抗-NGF抗體與NGF結合，並預防trkA受體二聚作用及/或trkA自我磷酸化作用。在本文中提供抗-NGF拮抗劑抗體的實例。
NGF的"生物活性"通常意指與NGF受體結合及/或激活NGF受體發送信號路徑的能力。生物活性包括，但不限於下列之一或多項：與NGF受體(如p75及/或trkA)結合的能力；提高trkA受體二聚作用及/或自我磷酸化作用的能力；激活NGF受體發送信號路徑的能力；在細胞生理學上促進細胞分化、增殖、存活、生長及其他變化的能力，包括(在神經元的案例中，包括周圍和中樞神經元)神經元形態學上的變化、突觸生成(synaptogenesis)、突觸功能、在創傷之後的神經遞質及/或神經肽釋放和再生；促進老鼠E13.5三叉神經元存活的能力；以及調解疼痛，包括手術後疼痛的能力。
當在本文中使用時，"實質上純的"意指一物質是至少50%純的(即不含污染物)，更佳的是至少90%純的，再更佳的是至少95%純的，再更佳的是至少98%純的，再更佳的是至少99%純的。
"宿主細胞"包括個別的細胞或細胞培養物，其可以是或已經是併入多核苷酸插入物之載體的接受者。宿主細胞包括單一宿主細胞的子代，且該子代可能因為天然、偶然或故意的突變作用，與原始的親代細胞不一定是完全相同的(在形態學或在基因組DNA補體上)。宿主細胞包括在活體外以本發明之多核苷酸(們)轉移感染的細胞。
當在本文中使用時，"治療"是獲得有利或想要之臨床結果的方法。為了本發明，有利或想要的臨床結果包括，但不限於下列之一或多項：改善或減輕任何方面的疼痛，包 括急性、慢性、炎症性、神經病變、手術後的疼痛、風濕性關節炎疼痛或骨關節炎疼痛。為了本發明，有利或想要的臨床結果包括，但不限於下列之一或多項：減輕嚴重性，緩和一或多個與疼痛有關的症狀，包括任何方面的疼痛(如縮短疼痛期間、降低疼痛的嚴重性或感覺)。
藥物、化合物或醫藥組合物的"有效含量"是足以達成有利或想要之結果，包括臨床結果，如減輕或降低疼痛感覺的量。可以一或多次投藥，來投與有效含量。為了本發明，有效含量之藥物、化合物或醫藥組合物是足以治療、改善、降低強度並/或預防疼痛的量，包括手術後疼痛、風濕性關節炎疼痛及/或骨關節炎疼痛。在一些具體實施例中，"有效含量"可降低疼痛至靜止(靜止疼痛)或以機械方式-誘導之疼痛(包括在移動之後的疼痛)，或兩者，並可在切入、割傷、撕裂或受傷之前、期間或之後，及/或在疼痛刺激之前、期間或之後投與。就像在臨床狀況中所了解的，藥物、化合物或醫藥組合物的有效含量，可併用其他的藥物、化合物或醫藥組合物一起達到。因此，可從投與一或多種治療劑的情況來考量"有效含量"，若與一或多個其他製劑併用，可能或達到想要的結果，便可認為以有效含量給予該單一製劑。
疼痛的"降低發生率"意指任何的降低嚴重性(其可包括減少對於該狀況經常使用之其他藥物及/或療法的需要，及/或減少(例如接觸)用量，包括例如鴉片製劑)、期間，及/或頻率(包括，例如，在個體中延遲或增加到出現手術後 疼痛的時間)。熟諳此藝者了解個體可能隨著對治療之反應而有所不同，因此，例如"在個體中降低風濕性關節炎疼痛或骨關節炎疼痛之發生率的方法"，表示以合理的期待為基礎投與抗-NGF拮抗劑抗體，使得這類投藥可能得以在特殊個體中引起這類的發生率降低。
"改善"疼痛或一或多個疼痛的症狀(如風濕性關節炎疼痛或骨關節炎疼痛)，意指與未投與抗-NGF拮抗劑抗體相比較，減少或改善一或多個疼痛的症狀。"改善"亦包括縮短或減少症狀的期間。
"減輕"疼痛或一或多個疼痛的症狀(如風濕性關節炎疼痛或骨關節炎疼痛)，意指在以根據本發明之抗-NGF拮抗劑抗體治療之個體或個體族群中，減少一或多個手術後疼痛的不受歡迎之臨床徵候的程度。
當在本文中使用時，"延遲"疼痛的發展意指延緩、阻止、減慢、妨礙、使穩定及/或延後疼痛的進行，如手術後疼痛、風濕性關節炎疼痛或骨關節炎疼痛。該延遲可以是不同長度的時間，視待治療之疾病及/或個體的病史而定。對熟諳此藝者而言，顯然充分或重大的延遲，事實上可包含預防，在這一點上該個體不發展出疼痛。"延遲"症狀發展的方法就是在與不使用該方法相比較時，在特定的時間架構中降低發展出症狀的可能性，及/或在特定的時間架構中降低症狀之程度的方法。這類比較通常是以臨床研究為基礎，使用有統計學意義之數目的實驗者。
當在本文中使用時，"疼痛"意指任何病因學的疼痛，包 括急性和慢性疼痛，以及任何有炎症組份的疼痛。疼痛的實例包括手術後疼痛、操作後疼痛(包括牙齒痛)、偏頭痛、頭痛和三叉神經痛、與燒傷、創傷或腎結石有關的疼痛、與外傷(包括頭部外傷)有關的疼痛、神經病變的疼痛、與肌肉-骨骼病症有關的疼痛，如風濕性關節炎、骨關節炎、脊椎僵直性脊椎炎、血清-陰性(非-風濕性)關節病、非-關節性風濕病和關節周圍病症，以及與癌症有關的疼痛(包括"突破疼痛"和與癌症末期有關的疼痛)、周圍神經病變和帶狀疱疹後神經痛。有炎症組份之疼痛的實例(除了上述的那些)，包括風濕性疼痛、與黏膜炎有關的疼痛和經痛。
"手術後疼痛"(可交替稱為"切入後"或"受傷後疼痛")意指起因於外傷的疼痛，如個體組織的割傷、穿刺傷、切入、撕裂或受傷(包括起因於所有手術程序的那些，無論是侵入性或非侵入性的)。當在本文中使用時，手術後疼痛不包括沒有外在物理創傷而發生(出現或發作)的疼痛。在一些具體實施例中，手術後疼痛是內在或外在(包括周圍)的疼痛，並可能偶爾(有外傷)或故意(有手術切開)發生受傷、割傷、外傷、撕裂或切口。當在本文中使用時，"疼痛"包括感受傷害和感覺疼痛，可使用疼痛計分和此項技藝中已知的方法，主觀和客觀地評估疼痛。手術後疼痛，當在本文中使用時，包括異常性疼痛(即增加對正常無害刺激的反應)和痛覺過敏(即增加對正常有害或討厭刺激的反應)，其實際上可依次為熱或機械(觸覺)的。在一些 具體實施例中，藉著熱敏感性、機械敏感性及/或靜止疼痛定出疼痛的特徵。在一些具體實施例中，手術後疼痛包括以機械方式引起的疼痛或靜止疼痛。在其他的具體實施例中，手術後疼痛包括靜止疼痛。該疼痛為主要或次要疼痛，如同此項技藝中已熟知的。
"生物試樣"包括各種獲自個體的試樣類型，並可用在診斷或監視測定中。該定義包括血液及其他生物來源的液體試樣，固體組織試樣，如生檢樣本或從其衍生而來的組織培養物或細胞，及其子代。該定義亦包括已經在其採樣之後以任何方式處理過的試樣，如利用試劑處理、促溶、增強某些組份，如蛋白質或多核苷酸，或為了切片而埋入半-固體或固體基質內。"生物試樣"一詞包括臨床試樣，亦包括培養中的細胞、細胞上清液、細胞溶胞產物、血清、血漿、生物液體和組織試樣。
"個體"是脊椎動物，最好是哺乳動物，更佳的是人類。哺乳動物包括，但不限於農場動物(如牛)、競賽動物、寵物(如貓、狗和馬)、靈長類、老鼠和大鼠。
當在本文中使用時，"載體"意指構築體，其能夠遞送，且最好能在宿主細胞中表現一或多個感興趣的基因(們)或序列(們)。載體的實例包括但不限於病毒載體、裸露的DNA或RNA表現載體、質體、粘接質體或噬菌體載體、與陽離子凝聚劑結合的DNA或RNA表現載體、包膠於脂質體中的DNA或RNA表現載體，以及某些真核生物細胞，如生產者細胞。
當在本文中使用時，"表現控制序列"意指指揮核酸轉錄的核酸序列。表現控制序列可以是啟動基因，如組成或可誘導的啟動基因，或促進子。表現控制序列以可操作之方式與待轉錄之核酸序列連接。
當在本文中使用時，"在藥學上可接受的載劑"包括任何物質，當將其與活性成分混合時，容許該成分保留生物活性，且不與該個體之免疫系統起反應。實例包括，但不限於任何標準藥學載劑，如磷酸緩衝鹽水溶液、水、乳劑，如油/水乳劑，以及各種形式的濕潤劑。適合氣溶膠或非經腸投藥的較佳稀釋劑是磷酸緩衝鹽水或生理(0.9%)鹽水。藉著已熟知的傳統方法，來調配包括這類載劑的組合物(參見，例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro編輯，Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；以及Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing,2000)。
當在本文中使用時，"Koff "企圖意指抗體從抗體/抗原複合物中解離的關閉速率常數。
當在本文中使用時，"Kd "企圖意指抗體-抗原交互作用的解離常數。
抗體E3,E3-衍生抗體、組合物和使用方法
E3組合物、E3衍生之組合物，以及製造組合物的方法
本發明包括組合物，含有由E3抗體或多肽組成的醫藥組合物；以及由編碼E3抗體或多肽之序列組成的多核苷酸。當在本文中使用時，組合物包括一或多個與NGF結合的抗 體或多肽(可以是或可以不是抗體)，及/或一或多個多核苷酸，包括編碼一或多個與NGF結合之抗體或多肽的序列。這些組合物可更包括適當的賦形劑，如在藥學上可接受的賦形劑，包括緩衝溶液，其為此項技藝中已熟知的。
本發明亦包括經過分離的抗體、多肽和多核苷酸具體實施例。本發明亦包括實質上純的抗體、多肽和多核苷酸具體實施例。
本發明之抗體和多肽可具有任何(一或多項)下列的特徵：(a)與NGF結合的能力；(b)降低及/或抑制NGF生物活性及/或由NGF發送信號調解之下游路徑(們)的能力；(c)降低及/或抑制老鼠E13.5三叉神經元之NGF-依賴性存活的能力；(d)缺少任何對NT3、NT4/5及/或BDNF明顯的交叉反應性；(e)治療及/或預防疼痛(包括手術後疼痛)的能力；(f)增加NGF之清除的能力；(g)降低或抑制trkA受體之激活作用的能力，可使用例如激酶受體激活作用測定(KIRA)來檢測之(參見美國專利第6,027,927號)。
在下文中概述抗體E3的結合特性，與親代老鼠抗-NGF單株抗體911相比較，其以高親和力和慢解離動力學與人類NGF結合。E3以比親代老鼠抗體911更高大約50-倍的結合親和力與人類NGF結合。
E3抗體和相關抗體亦顯示出強有力的拮抗人類NGF之能力，可經由在活體外的測定來評估(參見實例2和3)。例 如，抗體E3在15 pM人類NGF的存在下以大約21 pM之IC50 ，並在1.5 pM人類NGF的存在下以大約1.2 pM之IC50 拮抗老鼠E13三叉神經元之NGF-依賴性存活。
因此，另一方面，更進一步確認本發明之抗體和多肽具有下列特徵：(h)以高親和力和低解離動力學與人類NGF結合(在一些具體實施例中，具有低於大約2 nM之KD ，及/或比大約6 x10-5 s-1 更慢的koff )，及/或(i)在大約15 pM NGF(在一些具體實施例中，人類NGF)下，以大約100 pM或更低之IC50 ，並/或在大約1.5 pM NGF下以大約20 pM或更低之IC50 ，抑制(阻斷)老鼠E13.5三叉神經元之NGF依賴性存活的能力。
在一些具體實施例中，該抗體與人類NGF結合，但不與得自其他脊椎動物物種(在一些具體實施例中為哺乳動物)之NGF明顯地結合。在一些具體實施例中，該抗體與人類NGF，以及一或多個得自其他哺乳動物物種(在一些具體實施例中為哺乳動物)之NGF結合。在另外的具體實施例中，該抗體與NGF結合，但不與其他神經營養素(如相關的神經營養素，NT3、NT4/5及/或BDNF)產生明顯的交叉反應。在一些具體實施例中，該抗體結合NGF，以及至少一個其他的神經營養素。在一些具體實施例中，該抗體與哺乳動物物種的NGF結合，如馬或狗，但不與得自其他哺乳動物物種的NGF明顯地結合。
在一些具體實施例中，本發明是包括由多核苷酸編碼之輕鏈的抗體，該多核苷酸是由具有ATCC第PTA-4893號或 ATCC第PTA-4894號之存放編號的宿主細胞產生的。另一方面，本發明是包括由多核苷酸編碼之重鏈的抗體，該多核苷酸是由具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的宿主細胞產生的。本發明亦包括E3的各種調配物及相等的抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、Fc等等)、單鏈(ScFv)、其突變種、包括抗體部分的融合蛋白，以及E3之任何其他經過修改的組態，其包括所需之專一性的抗原(NGF)認知位置。E3的相等抗體，包括E3的抗體和多肽片段(其可以是或可以不是抗體)，以及藉著上述的任何(一或多項)基準確認並定出特徵的包括E3之多肽片段的多肽。
因此，本發明提供任何下列的，或包括任何下列的組合物(包含醫藥組合物)：(a)抗體E3；(b)抗體E3之片段或區域；(c)如圖1B所示的抗體E3之輕鏈；(c)如圖1A所示的抗體E3之重鏈；(d)得自抗體E3之輕鏈及/或重鏈的一或多個可變區(們)；(e)在圖1A和1B中出示之抗體E3的一或多個CDR(s)(一、二、三、四、五或六個CDRs)；(f)得自在圖1A中出示之抗體E3之重鏈的CDR H3；(g)得自在圖1B中出示之抗體E3之輕鏈的CDR L3；(h)得自在圖1B中出示之抗體E3之輕鏈的三個CDRs；(i)得自在圖1A中出示之抗體E3之重鏈的三個CDRs；(j)得自在圖1A和1B中出示之抗體E3之輕鏈的三個CDRs和重鏈的三個CDRs；以及(k)包括(b)到(j)中任一個的抗體。從在本文的說明中，顯然明確地排除由與老鼠單株抗體911之胺基酸序列相同的胺基酸序列所組成的多肽具體實施例。在圖1A和1B中，並在SEQ ID NO：9-14中出示了Mab 911的衍生CDR序列。
在圖1A和1B中以圖解說明抗體E3的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDRs)，並由下列的胺基酸序列組成：(a)重鏈CDR 1("CDR H1")GFSLIGYDLN(SEQ ID NO：3)；(b)重鏈CDR 2("CDR H2")IIWGDGTTDYNSAVKS(SEQ ID NO：4)；(c)重鏈CDR 3("CDR H3")GGYWYATSYYFDY(SEQ ID NO：5)；(d)輕鏈CDR 1("CDR L1")RASQSISNNLN(SEQ ID NO：6)；(e)輕鏈CDR 2("CDR L2")YTSRFHS(SEQ ID NO：7)；和(f)輕鏈CDR 3("CDR L3")QQEHTLPYT(SEQ ID NO：8)。CDR區域的判定為熟諳此藝者已熟知的。在一些具體實施例中，CDRs當然可以是Kabat和Chothia CDR的組合(亦稱為"組合的CDRs"或"衍生的CDRs")。在一些具體實施例中，CDRs包括Kabat CDR。在另外的具體實施例中，CDRs為Chothia CDRs。
在一些具體實施例中，本發明提供包括至少一個CDR的抗體，該CDR實質上是與E3的至少一個CDR、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個CDRs是同種的(或在一些具體實施例中，與E3的所有6個CDRs是同種的，或衍生自E3)。其他的具體實施例包括具有至少2、3、4、5或6個CDR(s)的抗體，該CDRs實質上是與E3的至少2、3、4、5或6個CDRs是同種的，或衍生自E3。當然為了本發明，通常保留了結合專一性及/或全部的活性(可從治療及/或預防疼痛或抑制E13.5老鼠三叉神經元之NGF-依賴性存活的方面來看)，雖然與E3比較活性的程度可能有變化(可能更大 或更小)。
本發明亦提供包括E3之胺基酸序列(在圖1A和1B中所示)的多肽(可以是或可以不是抗體)，其具有下列任一項：E3序列的至少5個連續的胺基酸、至少8個連續的胺基酸、至少大約10個連續的胺基酸、至少大約15個連續的胺基酸、至少大約20個連續的胺基酸、至少大約25個連續的胺基酸、至少大約30個連續的胺基酸，其中至少3個胺基酸是得自E3的可變區，並了解明確地排除由與老鼠單株抗體911之胺基酸序列相同的胺基酸序列所組成的具體實施例。在圖1A和1B中，並在SEQ ID NO：9-14中出示了Mab 911的衍生CDR序列。在一具體實施例中，該可變區係得自E3之輕鏈。在另一具體實施例中，該可變區係得自E3之重鏈。在其他的具體實施例中，5個(或更多個)連續的胺基酸是得自在圖1A和1B中出示之E3的互補性決定區(CDR)。
在另一具體實施例中，本發明提供包括E3之胺基酸序列的多肽，其具有下列任一項：E3序列的至少5個連續的胺基酸、至少8個連續的胺基酸、至少大約10個連續的胺基酸、至少大約15個連續的胺基酸、至少大約20個連續的胺基酸、至少大約25個連續的胺基酸、至少大約30個連續的胺基酸，其中該E3序列包括下列任一或多項：CDRH1之胺基酸殘基L29、CDRH2之I50、CDRH3之W101，及/或CDRH3之A103；及/或CDRL1之胺基酸殘基S28、CDRL1之N32、CDRL2之T51、CDRL3之91E，及/或CDRL3之H92，並了解明確地排除由與老鼠單株抗體911之胺基酸序列相 同的胺基酸序列所組成的具體實施例。
顯然在本揭示內容中，使用連續的胺基酸編號體系來稱呼可變區中的胺基酸殘基(即在每個可變區中的胺基酸殘基均按順序編號)。如同此項技藝中已熟知的，當比較兩個抗體或多肽時，如E3抗體和E3變體(或懷疑其為E3變體之多肽)，可使用Kabat及/或Chothia編號系統。在此項技藝中，例如，若需要在E3和其他多肽之間進行比較時，當然知道如何將連續編號轉變為Chothia及/或Kabat編號。圖23敘述使用連續的Chothia和Kabat編號，將E3可變區編號。此外，為了便於比較，架構殘基通常，但並非總是具有約略相同的殘基數目。然而，CDRs的大小可能有變化(即可能插入及/或刪除一或多個胺基酸殘基)。當比較E3抗體和候選的E3變體(例如，在得自候選序列之CDR區比在與其排成一直線的抗體E3中之序列更長的案例中)，可能遵循下列的步驟(雖然在此項技藝中已知其他的方法)。將候選抗體序列與E3抗體重鏈和輕鏈可變區排成一直線。可用手或藉著電腦，使用普遍接受的電腦程式來進行排列。可藉著使用對大多數Fab序列而言常見的一些胺基酸殘基，使得排列更為容易。例如，輕和重鏈通常都有兩個半胱胺酸，通常是在保留位置發現它們。當然候選變體抗體的胺基酸序列可能是更長(即有插入的胺基酸殘基)或更短的(有刪除的胺基酸殘基)。可將殘基編號加上字尾，代表插入額外的殘基，例如殘基34abc。至於候選序列，例如將其與E3序列排成一直線，例如殘基33和35，但在它們之 間沒有殘基與殘基35排在一起，簡單地不指派該殘基35為一殘基。在其他的方法中，在比較不同長度的CDRs時，通常已知可在結構相等的(例如在抗原-抗體複合物中的相同位置)胺基酸之間進行比較。例如Chothia編號(Al-Lazikani等人，在前)，通常(但並非在所有情況下)在結構正確的位置安排插入和刪除。亦可使用X-射線結晶學或雙突變環分析(參見Pons等人(1999)Prot.Sci.8：958-968)來推論或證實結構同等。
抗-NGF抗體對NGF(如hNGF)之結合親和力，可能是大約0.10至大約0.80 nM、大約0.15至大約0.75 nM，以及大約0.18至大約0.72 nM。在一些具體實施例中，結合親和力是大約2 pM、大約5 pM、大約10 pM、大約15 pM、大約20 pM、大約40 pM或比大約40 pM更高。在一具體實施例中，結合親和力是在大約2 pM到22 pM之間。在其他的具體實施例中，結合親和力是低於大約10 nM、大約5 nM、大約4 nM、大約3.5 nM、大約3 nM、大約2.5 nM、大約2 nM、大約1.5 nM、大約1 nM、大約900 pM、大約800 pM、大約700 pM、大約600 pM、大約500 pM、大約400 pM、大約300 pM、大約200 pM、大約150 pM、大約100 pM、大約90 pM、大約80 pM、大約70 pM、大約60 pM、大約50 pM、大約40 pM、大約30 pM、大約10 pM。在一些具體實施例中，結合親和力是大約10 nM。在其他的具體實施例中，結合親和力是低於大約10 nM。在其他的具體實施例中，結合親和力是大約0.1 nM或大約0.07 nM。 在其他的具體實施例中，結合親和力是低於大約0.1 nM或低於大約0.07 nM。在其他的具體實施例中，結合親和力是大約10 nM、大約5 nM、大約4 nM、大約3.5 nM、大約3 nM、大約2.5 nM、大約2 nM、大約1.5 nM、大約1 nM、大約900 pM、大約800 pM、大約700 pM、大約600 pM、大約500 pM、大約400 pM、大約300 pM、大約200 pM、大約150 pM、大約100 pM、大約90 pM、大約80 pM、大約70 pM、大約60 pM、大約50 pM、大約40 pM、大約30 pM、大約10 pM之任一者至大約2 pM、大約5 pM、大約10 pM、大約15 pM、大約20 pM或大約40 pM之任一者。在一些具體實施例中，結合親和力是大約10 nM、大約5 nM、大約4 nM、大約3.5 nM、大約3 nM、大約2.5 nM、大約2 nM、大約1.5 nM、大約1 nM、大約900 pM、大約800 pM、大約700 pM、大約600 pM、大約500 pM、大約400 pM、大約300 pM、大約200 pM、大約150 pM、大約100 pM、大約90 pM、大約80 pM、大約70 pM、大約60 pM、大約50 pM、大約40 pM、大約30 pM、大約10 pM之任一者。在另外的具體實施例中，結合親和力是大約2 pM、大約5 pM、大約10 pM、大約15 pM、大約20 pM、大約40 pM或比大約40 pM更高。
可使用此項技藝中已熟知的方法，判定抗體對NGF的結合親和力。一種判定抗體對NGF之結合親和力的方法是藉著測量抗體之單功能Fab片段的親和力，如同在實例中的描述。欲獲得單功能Fab片段，可利用木瓜酵素切開抗體 (例如IgG)，或以重組方式表現。可藉著表面等離子體激光共振(BIAcore3000TM 表面等離子體激光共振(SPR)系統，BIAcore,INC,Piscataway NJ)，按照在實例中的描述，判定抗體之抗-NGF Fab片段的親和力。該草案適用於判定抗體對任何物種之NGF的結合親和力，包括人類NGF、其他脊椎動物的NGF(在一些具體實施例中為哺乳動物)(如老鼠NGF、大鼠NGF、靈長類NGF)，並適用於其他的神經營養素，如相關的神經營養素NT3、NT4/5，及/或BDNF。
在一些具體實施例中，本發明之抗體或肽可(在大約15 pM之NGF的存在下)以大約200 pM、150 pM、100 pM、80 pM、60 pM、40 pM、20 pM、10 pM或更低之IC50 ，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經元的人類NGF-依賴性存活。在一些具體實施例中，本發明之抗體或肽可(在大約1.5 pM之NGF的存在下)以大約50 pM、40 pM、30 pM、10 pM、20 pM、10 pM、5 pM、2 pM、1 pM或更低之IC50 ，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經元的人類NGF-依賴性存活。在一些具體實施例中，本發明之抗體或肽可(在大約15 pM之NGF的存在下)以大約150 pM、125 pM、100 pM、80 pM、60 pM、40 pM、30 pM、20 pM、10 pM、5 pM或更低之IC50 ，抑制(降低及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經元的大鼠NGF-依賴性存活。在一些具體實施例中，本發明之抗體或肽可(在大約1.5 pM之NGF的存在下)以大約30 pM、25 pM、20 pM、15 pM、10 pM、5 pM、4 pM、3 pM、2 pM、1 pM或更低之IC50 ，抑制(降低 及/或阻斷)老鼠E13.5三叉神經元的大鼠NGF-依賴性存活。測量老鼠三叉神經元之NGF-依賴性存活的方法是此項技藝中已知的，並在實例2中說明。
本發明亦提供製造任何這些抗體或多肽的方法。可藉著此項技藝中已知的程序，在實例中解釋其中一些，來製造本發明之抗體。可藉著蛋白水解或抗體的其他作用，藉著上述的重組方法(即單一或融合多肽)，或藉著化學合成來產生多肽。藉著化學合成便利地製造抗體之多肽，尤其是較短的，最多大約50個胺基酸的多肽。化學合成的方法是此項技藝中已知的，並為市售的。例如，可藉著使用固相法的自動多肽合成器，產生E3抗體。亦參見美國專利第5,807,715號、4,816,567號和6,331,415號。亦可在活體外使用合成蛋白質化學的已知方法，包括涉及交聯劑的那些，來製備嵌合型或雜種抗體。例如，可使用二硫交換反應，或藉著形成硫酯鍵結，來建構免疫毒素。適合該目的之試劑的實例包括亞胺硫醇鹽和甲基-4-巰基丁醯亞醯胺鹽。
在另一種選擇中，可以重組方式製造抗體，使用此項技藝中已熟知的程序。在一具體實施例中，將包括編碼抗體E3(在圖1A和1B中出示)之可變和輕鏈區的序列的多核苷酸選殖到載體內，以便在宿主細胞(例如CHO細胞)中表現或繁殖。在另一具體實施例中，將在圖2和3中出示的多核苷酸序列選殖到一或多個載體內，以便表現或繁殖。可將編碼感興趣之抗體的序列保存在在宿主細胞中之載體內，然 後可為了未來使用將宿主細胞擴大並冷凍。在本文中進一步描述了載體(包括表現載體)和宿主細胞。已經揭示了在植物或乳汁中以重組方式表現抗體的方法。參見，例如Peeters等人(2001)Vaccine 19：2756；Lonberg,N.和D.Huszar(1995)Int.Rev.Immunol 13：65；以及Pollock等人(1999)J Immunol Methods 231：147。製造抗體衍生物的方法，例如人類化、單鏈等等，為此項技藝中已知的。
本發明亦包括本發明之抗體，如E3的單鏈可變區片段("scFv")。藉著使用短交聯肽連接輕及/或重鏈可變區，製造單鏈可變區片段。Bird等人(1988)Science 242：423-426。交聯肽的實例為(GGGGS)3(SEQ ID NO：15)，其在一可變區的羧基終端和另一可變區的胺基終端之間架起約3.5毫微米的橋。已經設計並使用其他序列的交聯劑(Bird等人(1988))。為了額外的功能，如附接藥物或附接固體支撐物，可轉而修改交聯劑。可以重組或合成方式產生單鏈變體。關於scFv的合成產生，可使用自動合成器。至於scFv的重組產生，可將含有編碼scFv之多核苷酸的適當質體導入適當的宿主細胞內，宿主細胞可以是真核生物的，如酵母菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞，或原核生物的，如大腸桿菌。可藉著例行的操作，如多核苷酸的連接，製造編碼感興趣之scFv的多核苷酸。可使用此項技藝中已知的標準蛋白質純化技術，分離所得的scFv。
亦包括其他形式的單鏈抗體，如微型雙功能抗體(diabodies)。微型雙功能抗體是二價的，雙重專一性的抗 體，其中在單一的多肽鏈上表現VH和VL功能部位，但所使用的交聯劑太短，以致於不容許在同一鏈上兩個功能部位之間配對，藉此迫使功能部位與在另一鏈上的互補功能部位配對，並創造兩個抗原結合位置(參見，例如Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2：1121-1123)。
抗體可以是雙重專一性的抗體，對至少兩個不同抗原具有結合專一性的單株抗體。可使用在本文中揭示之抗體製備雙重專一性的抗體。製造雙重專一性抗體的方法，為此項技藝中已知的(參見，例如Suresh等人，1986,Meyhods in Enzymology 121：210)。在傳統上，雙重專一性抗體的重組產生，是以兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共同表現為基礎，而這兩個重鏈具有不同的專一性(Millstein和Cuello,1983,Nature 305,537-539)。
根據一製造雙重專一性抗體的方法，將具有想要結合專一性(抗體-抗原結合位置)之抗體可變功能部位與免疫球蛋白恆定功能部位序列融合。該融合最好是利用免疫球蛋白重鏈恆定功能部位，包括至少一部分絞鏈、CH2和CH3區。最好是有第一個重鏈恆定區(CH1)，含有輕鏈結合所需之位置，出現在至少一個融合中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合，若需要還有免疫球蛋白輕鏈的DNAs，插入分開的表現載體中，並共同轉移感染到適當的宿主生物內。這在使用不等比例的三個多肽鏈來建構，以便提供最佳產量的具體實施例中，在調整三個多肽片段之突變比例上提供 了相當大的彈性。然而，也有可能在一表現載體中插入二或全部三個多肽鏈的密碼序列，此時以等比例表現至少兩個多肽鏈，結果產生高產量，或此時該比例並不是特別重要的。
在一方法中，雙重專一性抗體由雜種的免疫球蛋白重鏈組成，在一臂上有第一個結合專一性，而在另一臂上有雜種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二個結合專一性)。該不對稱的結構，僅在雙重專一性分子的一半具有免疫球蛋白輕鏈，使想要的雙重專一性化合物更容易與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。在1994年3月3日發表的PCT公開案第WO 94/04690號中描述了該方法。
包括兩個共價連接之抗體的異種共軛抗體，亦在本發明之範圍內。已經使用這類抗體使免疫系統細胞瞄準不想要的細胞(美國專利第4,676,980號)，並用來治療HIV感染(PCT申請案公開案第WO 91/00360號和WO 92/200373號；歐洲專利第03089號)。可使用任何便利的交聯法，製造異種共軛抗體。適當之交聯劑和技術是此項技藝中已熟知的，並描述在美國專利第4,676,980號中。
該抗體可以是人類化抗體，例如如同在此項技藝中已知的，並在本文中描述之。
可按照在1999年11月18日發表之PCT公開案第WO 99/58572中描述的，來修改抗體。除了針對標靶分子的結合功能部位之外，這些抗體包括具有實質上與人類免疫球蛋白重鏈之全部或部分恆定功能部位同種的胺基酸序列的 效應物功能部位。這些抗體能夠與標靶分子結合，不誘發明顯的補體依賴性溶解，或細胞-調解的標靶破壞。效應物功能部位最好能夠專一地結合FcRn及/或Fc？R Ⅱ b。這些通常是以衍生自二或多個人類免疫球蛋白重鏈CH2功能部位之嵌合型功能部位為基礎。最好是在慢性抗體療法中使用以此方式修改的抗體，以避免炎症和其他對傳統抗體療法不利的反應。
本發明包括對抗體E3的修改，包括不顯著影響其特性之功能相等的抗體，以及具有提高或降低活性的變體。在此項技藝中，例行地實行多肽的修改，並在實例中進一步舉例說明之。修改多肽的實例包括具有胺基酸殘基之取代(包括保留性置換)，一或多個不會明顯有害地改變功能活性之胺基酸刪除或添加的多肽，或使用化學類似物。
當在本文中使用時，多肽"變體"是與固有蛋白質之差異在於一或多個取代、刪除、添加及/或插入的多肽，使得實質上並未減少該多肽之免疫反應性。換句話說，相對於固有蛋白質，可提高或不改變變體專一地與抗原結合的能力，或相對於固有蛋白質，可減少至低於50%，較佳的是低於20%。多肽變體最好對已經確認之多肽，顯示出至少大約80%，更佳的是至少大約90%，且最佳的是至少大約95%的同一性(根據在本文中的描述來判定)。
可藉著將適當的核苷酸改變導入抗體DNA內，或藉著肽合成，來製備抗體的胺基酸序列變體。這類變體包括，例如從在本文中描述之SEQ ID NO：1或2的胺基酸序列中刪除 及/或插入及/或取代殘基。可進行刪除、插入和取代的任何組合以獲得最終的構築體，其限制條件為最終的構築體具有想要的特徵。胺基酸變化亦可改變抗體的轉譯後加工，如改變糖基化作用的數目和位置。
一種確認抗體的某些殘基或區域是進行突變生成或修改之較佳場所的有用方法，叫做"丙胺酸掃描突變生成作用"，並由Cunningham和Wells,1989,Science,244：1081-1085描述了。確認一殘基或一群標靶殘基(例如帶電荷之殘基，如arg、asp、his、lys和glu)，並以中性或帶負電的胺基酸(最好是丙胺酸或聚丙胺酸)取代，影響胺基酸與抗原的交互作用。然後藉著在取代位置導入更多或其他變體，改進那些證實對取代有功能敏感性的胺基酸位置。因此，雖然預先判定導入胺基酸序列變化的位置，仍不必預先判定突變本身的性質。例如，欲分析突變在特定位置的效能，在標靶密碼子或區域進行ala掃描或隨機突變生成作用，並就想要的活性篩選所表現之抗體變體。亦可使用在本文中描述的庫掃描突變生成作用，確認在抗體中適合突變或修改的位置。
胺基酸序列插入包括範圍從一個殘基到含有一百或更多殘基之多肽的胺基-及/或羧基-終端融合，以及單一或多個胺基酸殘基的序列內插入。終端插入的實例包括帶有N-終端甲硫胺醯基殘基的抗體，或與抗原決定位標籤融合的抗體。抗體分子的其他插入變體包括酵素或增加抗體之血清半衰期的多肽與抗體之N-或C-終端融合。
取代變體在抗體分子中移除至少一個胺基酸殘基，並在其位置插入另一個殘基。取代突變生成作用最感興趣的位置包括高變區，但亦期待FR改變。在表1中，在"保留性置換"項目之下出示保留性置換。若這類取代結果改變了生物活性，然後可導入更多實質上的改變，在表1中稱為"典型的取代"，或按照下文在提及胺基酸種類時更多的描述，並篩選產物。
表1：胺基酸取代
藉著選擇某種取代，該取代與其對維持(a)在取代區中之多肽主鏈的結構，例如片狀或螺旋構形，(b)在標靶位置之分子的電荷或忌水性，或(c)龐大側鏈的影響明顯不同，來 完成抗體之生物特性的實質修改。以共同的側鏈特性為基礎，將天然存在的殘基分類：(1)忌水性的：去甲亮胺酸，Met,Ala,Val,Leu,Ile；(2)中性親水性的：Cys,Ser,Thr；(3)酸性的：Asp,Glu；(4)鹼性的：Asn,Gln,His,Lys,Arg；(5)影響鏈方位的殘基：Gly,Pro；和(6)芳香族的：Trp,Tyr,Phe。
藉著將這些種類之一的成員與另一種類的交換，進行非-保留性置換。
亦可取代，通常是以絲胺酸取代任何不涉及維持抗體之適當構形的半胱胺酸，以便改善該分子的氧化穩定性，並防止反常的交聯。相反地，可在抗體中加入半胱胺酸鍵結(們)，以改善其穩定性，特別是在該抗體為抗體片段，如Fv片段之處。
胺基酸修改的範圍可從改變或修改一或多個胺基酸到整個區域的重新設計，如可變區。在可變區中的改變可改變結合親和力及/或專一性。在一些具體實施例中，在CDR功能部位中進行不超過1至5個保留性胺基酸置換。在其他的具體實施例中，在CDR3功能部位中進行不超過1至3個保留性胺基酸置換。在另外的具體實施例中，CDR功能部位是CDRH3及/或CDRL3。
修改亦包括糖基化和未糖基化的多肽，以及有其他轉譯後修改的多肽，像是例如有不同糖類的糖基化，醯基化作 用和磷酸化作用。抗體在其恆定區中的保留位置被糖基化(Jefferis和Lund,1997,Chem.Immunol.65：111-128；Wright和Morrison,1997,TibTECH 15：26-32)。免疫球蛋白的寡糖側鏈影響蛋白質功能(Boyd等人，1996,Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe和Howard,1990,Biochem.29：4175-4180)，以及在部分糖蛋白之間的分子間交互作用，其可影響糖蛋白之構形和現存的三維表面(Hefferis和Lund，在前；Wyss和Wagner,1996,Current Opin.Biotech.7：409-416)。寡糖亦可作為特定糖蛋白對某些分子的標靶，係以特定的認知結構為基礎。亦已經報告了抗體的糖基化作用影響抗體-依賴性細胞之細胞毒性(ADCC)。特定而言，報告了帶有四環素-調節之β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶Ⅲ(GnT Ⅲ)表現，葡糖基轉移酶催化之二等份GlcNAc形成的CHO細胞，具有改善的ADCC活性(Umana等人，1999,Mature Biotech.17：176-180)。
抗體的糖基化作用通常是N-連接或O-連接的。N-連接意指碳水化合物部分附接在天冬醯胺殘基的側鏈上。三肽序列，天冬醯胺-X-絲胺酸和天冬醯胺-X-蘇胺酸，其中X是脯胺酸以外的任何胺基酸，是碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈之酵素附接的認知序列。因此，這些三肽序列的任一者出現在多肽中，產生可能的糖基化作用位置。O-連接的糖基化作用意指糖類N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附接在羥胺基酸上，最常見的是絲胺酸或蘇胺酸，雖然亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
藉著改變胺基酸序列，使其含有一或多個上述的三肽序列(對於N-連接的糖基化作用位置)，便利地完成在抗體中添加糖基化作用位置。亦可藉著添加或以一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代原始抗體的序列(對於O-連接的糖基化作用位置)，來進行改變。
亦可改變抗體的糖基化作用模式，但不改變潛在的核苷酸序列。糖基化作用相當依賴用來表現抗體的宿主細胞。因為用來表現可能成為治療劑之重組糖蛋白，例如抗體的細胞類型，很少是天然的細胞，預期在抗體之糖基化作用模式上有所改變(參見，例如Hse等人，1997,J.Biol.Chem.272：9062-9070)。
除了宿主細胞的選擇之外，在抗體之重組產製期間影響糖基化作用的因素還包括生長模式、培養基調配、培養密度、氧合作用、pH值、純化計畫及其類似物。已經提出各種方法來改變在特殊宿主生物中獲得的糖基化作用模式，包括導入或過度表現某些涉及寡糖產生的酵素(美國專利第5,047,335號；5,510,261號和5,278,299號)。可以酵素方式從糖蛋白中移除糖基化作用，或某些類型的糖基化作用，例如使用內切糖苷酶(endoglycosidase)H(endo H)。此外，亦可以遺傳方式設計重組宿主細胞，使其在處理某些類型的多糖方面是有缺陷的。這些及類似的技術均為此項技藝中已熟知的。
其他的修改方法包括使用此項技藝中已知的偶聯技術，包括但不限於酵素工具、氧化取代和螯合。修改可使用， 例如附接免疫測定用的標記。使用在此項技藝中已確立的程序來製造經過修改的E3多肽，並可使用此項技藝中已知的標準測定篩選之，其中一些將在下文和實例中描述。
其他的抗體修改包括已經按照在1999年11月18日發表之PCT公開案第WO 99/58572號中之描述加以修改的抗體。這些抗體，除了針對標靶分子的結合功能部位之外，還包括效應物功能部位，具有實質上與人類免疫球蛋白重鏈之全部或部分恆定功能部位同種的胺基酸序列。這些抗體能夠與標靶分子結合，不誘發明顯的補體依賴性溶解，或細胞-調解的標靶破壞。在一些具體實施例中，該效應物功能部位能夠專一地結合FcRn及/或Fc？R Ⅱ b。這些通常是以衍生自二或多個人類免疫球蛋白重鏈CH2功能部位之嵌合型功能部位為基礎。以此方式修改的抗體，特別適合用在慢性抗體療法中，以避免炎症和其他對傳統抗體療法不利的反應。
本發明亦包括由一或多個得自本發明之抗體(如E3)或多肽的片段或區域所組成的融合蛋白。在一具體實施例中，提供包括在圖1B中所示之可變輕鏈區的至少10個連續胺基酸，及/或在圖1A中所示之可變重鏈區的至少10個胺基酸的融合多肽。在其他的具體實施例中，該融合多肽包括E3的輕鏈可變區及/或重鏈可變區，如在圖1A和1B中所示。在其他的具體實施例中，該融合多肽包括一或多個E3的CDR(s)。在另外的具體實施例中，該融合多肽包括抗體E3的CDR H3及/或CDR L3。在另一具體實施例中，該融合多 肽包括下列的任一或多項：CDRH1的胺基酸殘基L29，CDRH2之I50，CDRH3之W101，及/或CDRH3之A103；及/或CDRL1的胺基酸殘基S28，CDRL1之N32，CDRL2之T51，CDRL3之91E及/或CDRL3之H92。為了本發明，E3融合蛋白含有一或多個E3抗體，以及在天然分子中未附接的其他胺基酸序列，例如異種序列或得自其他區域的同種序列。代表性的異種序列包括，但不限於"標籤"，如FLAG標籤或6His標籤。標籤為此項技藝中已熟知的。
可藉著此項技藝中已知的方法來創造E3融合多肽，例如以合成或重組方式。通常，藉著使用在本文中描述的重組方法，製備並表現編碼其之多核苷酸，來製造本發明之E3融合蛋白，雖然亦可藉著此項技藝中已知的其他方法來製備，包括例如化學合成。
本發明亦提供組合物，其包括與有助於偶聯固體支撐物(如生物素或抗生物素蛋白)之製劑共軛(例如連接)的E3抗體或多肽。為了簡化，通常將提到E3或抗體，但應了解這些方法適用於任何在本文中描述之NGF結合的具體實施例。共軛通常意指連接在本文中描述的這些組份。可利用任何方式完成連接(通常是將這些組份緊密地結合固定，至少是為了投藥)。例如，當製劑和抗體均具有能夠彼此反應的取代基時，在它們之間可能有直接反應。例如，親核基團，如胺基或硫氫基，其能夠與在另一個上的含有羰基之基團，如酐或醯基鹵，或含有良好釋離基(例如鹵化物)之烷基基團反應。
可將本發明之抗體或多肽與標示用製劑(或稱為"標記")連接，如螢光分子、放射性分子或任何此項技藝中已知的標記。此項技藝中已知的標記通常提供(直接或間接)信號。因此，本發明提供經標示之抗體及多肽。
可使用此項技藝中已知的方法，其中一些在實例中描述，測試本發明之抗體和多肽的能力，如與NGF結合；降低或抑制NGF之生物活性；降低及/或阻斷NGF-誘導之E13.5老鼠三叉神經元的存活。
本發明亦提供包括抗體E3，如同該揭示內容明確指出的，和任何或所有在本文中描述之抗體及/或多肽的組合物(包括醫藥組合物)和套組。
多核苷酸、載體和宿主細胞
本發明亦提供經過分離之多核苷酸，其編碼本發明之抗體和多肽(包括由在圖1A和1B中出示之輕鏈和重鏈可變區之多肽序列所組成的抗體)，以及包括該多核苷酸之載體和宿主細胞。
因此，本發明提供多核苷酸(或組合物，包括醫藥組合物)，包括編碼下列任一項之多核苷酸：(a)抗體E3；(b)抗體E3之片段或區域；(c)如在圖1B中出示的抗體E3之輕鏈；(d)如在圖1A中出示的抗體E3之重鏈；(e)一或多個得自抗體E3之輕鏈及/或重鏈的可變區(們)；(f)在圖1A和1B中出示之抗體E3的一或多個CDR(s)(1、2、3、4、5或6個CDRs)；(g)得自在圖1A中出示之抗體E3之重鏈的CDR H3；(h)得自在圖1B中出示之抗體E3之輕鏈的CDR L3；(i) 得自在圖1B中出示之抗體E3之輕鏈的三個CDRs；(j)得自在圖1A中出示之抗體E3之重鏈的三個CDRs；(k)得自在圖1A和1B中出示之抗體E3之輕鏈的三個CDRs和得自重鏈的三個CDRs；或(l)由(b)至(k)中任一個所組成的抗體。在一些具體實施例中，多核苷酸包括在圖2和3中出示的任一多核苷酸(們)或兩者。
另一方面，本發明是經過分離的多核苷酸，其編碼具有ATCC第PTA-4893號或ATCC第PTA-4894號之存放編號的E3輕鏈。另一方面，本發明是經過分離的多核苷酸，其編碼具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的E3重鏈。另一方面，本發明是經過分離的多核苷酸，其包括(a)在具有ATCC第PTA-4894號之存放編號的多核苷酸中編碼的可變區，和(b)在具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的多核苷酸中編碼的可變區。另一方面，本發明是經過分離的多核苷酸，其包括(a)一或多個在具有ATCC第PTA-4894號之存放編號的多核苷酸中編碼的CDR；及/或(b)一或多個在具有ATCC第PTA-4895號之存放編號的多核苷酸中編碼的CDR。
另一方面，本發明提供編碼在本文中描述之任何抗體(包括抗體片段)和多肽的多核苷酸。可藉著此項技藝中已知的程序製造多核苷酸。
另一方面，本發明提供包括本發明之任何多核苷酸的組合物(如醫藥組合物)。在一些具體實施例中，該組合物包括由編碼在本文中描述之E3抗體的多核苷酸所組成的表現 載體。在其他的具體實施例中，該組合物包括由編碼任何在本文中描述之抗體或多肽的多核苷酸所組成的表現載體。在另外的具體實施例中，該組合物包括在圖2和3中出示的任一多核苷酸或兩者。在本文中進一步描述表現載體，以及多核苷酸組合物的投藥。
另一方面，本發明提供製造任何在本文中描述之多核苷酸的方法。
本發明亦包括與任何這類序列互補的多核苷酸。多核苷酸可以是單股的(密碼或反義)或雙股的，並可以是DNA(基因組的、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其含有插入序列，並以一對一之方式與DNA分子相對應，以及不含插入序列的mRNA。在本發明之多核苷酸中，可以但不必出現額外的密碼或非-密碼序列，且多核苷酸可以但不必與其他的分子及/或支撐物質連接。
多核苷酸可包括天然的序列(即編碼抗體或其一部分的內源序列)，或可包括這類序列的變體。多核苷酸變體含有一或多個取代、添加、刪除及/或插入，使得相對於天然的免疫反應性分子，不會減少編碼多肽之免疫反應性。變體最好是對編碼天然抗體或其一部分之多核苷酸序列顯示出至少大約70%同一性，較佳的是至少大約80%同一性，且最佳的是至少大約90%同一性。
按照下述為了最大一致性而將其排列時，若在兩個多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或胺基酸序列是相同的，這兩 個序列就是所謂"相同的"。通常藉著在確認並比較序列類似性之局部區域的比較窗上比較序列，來進行兩個序列之間的比較。當在本文中使用時，"比較窗"意指一段至少大約20個連續的位置，通常是30到大約75，40到大約50個，其中在將兩個序列最適切地排列之後，將序列與具有相同數目之連續位置的參考序列做比較。
可使用在生物資訊軟體之Lasergene組件中的Megalign程式(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)，使用預設參數，進行最適合比較的序列排列。該程式收錄在下列參考文獻中描述的數個排列計畫：Dayhoff,M.O.(1978)蛋白質之進化改變模式-檢測遠距關係的矩陣(A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships)。在Dayhoff,M.O.(編輯)蛋白質序列和結構的圖譜(Atlas of Protein Sequence and Structure),National Biomedical Research Foundation,Washington DC，第5冊，附錄3，第345-358頁；Hein J.,1990，排列的一致方法和系統發生學(Unified Approach to Alignment and Phylogenes)第626-645頁Methods in Enzymology第183冊，Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5：151-153；Myers,E.W.和Muller W.,1988,CABIOS 4：11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11：105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.,1973，數字分類學原理和數字分類學的實行(Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy),Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
最好藉著在至少20個位置之比較窗上，比較兩個最佳排列的序列，判定"序列同一性百分比"，其中為了兩個序列的最佳排列，該多核苷酸或多肽序列在比較窗中的部分，與參考序列(其不包括添加或刪除)相比較，可包括20%或更少，通常是5至15%，或10至12%的添加或刪除(即間隙)。藉著判定在兩個序列中出現相同核酸鹼基或胺基酸殘基之位置的數目，產生相配位置的數目，將相配位置的數目除以在參考序列中之位置的總數(即窗尺寸)，並將結果乘以100，產生序列同一性的百分比，來計算該百分比。
變體亦可以是，或者是與天然基因或其一部分或補體實質上同種的。這類多核苷酸變體能夠在中等嚴格的條件下與編碼天然抗體之天然存在的DNA序列(或互補序列)雜交。
適當的"中等嚴格的條件"包括以5X SSC,0.5%SDS,1.0 mM EDTA(pH8.0)的溶液預先沖洗；在50℃-65℃,5X SSC下雜交過夜；接著在65℃下20分鐘，以含有0.1%SDS之2X、0.5X和0.2X SSC各沖洗兩次。
當在本文中使用時，"高度嚴格的條件"或"高嚴格度條件"是下列那些：(1)使用低離子強度和高溫沖洗，例如在50℃下0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫 酸鈉；(2)在雜交期間使用變性劑，如甲醯胺，例如在42℃下，帶有0.1%牛血清白蛋白之50%(體積/體積)甲醯胺/0.1%水溶性聚蔗糖(Ficoll)/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50 mM pH6.5之磷酸鈉緩衝溶液，帶有750 mM氯化鈉，75 mM檸檬酸鈉；或(3)在42℃下使用50%甲醯胺，5xSSC(0.75 M NaCl,0.075 M檸檬酸鈉)，50 mM磷酸鈉(pH6.8),0.1%焦磷酸鈉，5x登哈特氏液，音波震盪的鮭精DNA(50微克/毫升)，0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖，在42℃下以0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)沖洗，在55℃下以50%甲醯胺沖洗，接著是在55℃下以含有EDTA之0.1xSSC組成的高嚴格度沖洗。熟諳此藝者將知曉如何調整適應因子，如探針長度及其類似物所需的溫度、離子強度等等。
熟諳此藝者將了解因為遺傳密碼簡併的結果，有許多編碼在本文中描述之多肽的核苷酸序列。這些多核苷酸中有些對任何天然基因的核苷酸序列有少許同種性。然而，本發明特別期待因為在密碼子使用上之差異而有所不同的多核苷酸。此外，包括在本文中提供之多核苷酸序列的基因之對偶基因，亦在本發明的範圍內。對偶基因是內源的基因，係由於一或多個核苷酸的突變，如刪除、添加及/或取代而改變。所得的mRNA和蛋白質可能，但不必具有改變的結構或功能。可使用標準技術(如雜交、擴大及/或資料庫序列比較)來確認對偶基因。
可使用化學合成、重組方法或PCR來獲得本發明之多核苷酸。化學多核苷酸合成的方法是此項技藝中已熟知的， 不必在下文中詳細說明。熟諳此藝者可使用在本文中提供的序列和市售的DNA合成器，產生想要的DNA序列。
為了使用重組方法製備多核苷酸，可將包括想要序列的多核苷酸插入適當的載體內，並可轉而將載體導入適當的宿主細胞內，按照在本文中進一步的討論，進行複製和擴大。可藉著此項技藝中已知的任何方法，將多核苷酸插入宿主細胞內。藉著直接攝取、胞飲作用、轉移感染、F-接合或電穿透作用，藉著導入外源多核苷酸來轉化細胞。一旦導入，可將外源的多核苷酸維持在細胞內，成為未被整合的載體(如質體)或整合到宿主細胞之基因組內。可藉著在此項技藝中已熟知的方法，從宿主細胞中分離如此擴大的多核苷酸。參見，例如Sambrook等人(1989)。
或者，PCR容許產生DNA序列。PCR技術為此項技藝中已熟知的，並在美國專利第4,683,195號，4,800,159號，4,754,065號和4,683,202號，以及PCR：The Polymerase Chain Reaction,Mullis等人編輯，Birkauswer Press,Boston(1994)中描述。
可藉著在適當載體中的經過分離之DNA，並將其插入適當的宿主細胞內，獲得RNA。此時細胞複製並將DNA轉錄成RNA，然後可使用熟諳此藝者已熟知的方法分離RNA，例如項是在Sambrook等人(1989)中的陳述。
可根據標準技術建構，或可從此項技藝中可利用的大量選殖載體中選擇適當的選殖載體。雖然可根據企圖使用之宿主細胞，改變所選擇的選殖載體，但有用的選殖載體通 常將具有自我-複製的能力，可能具有特殊核酸內切限制酶的單一標靶，並/或可能帶有用來選擇含有該載體之純種系的標記基因。適當的實例包括質體和細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBK SK+)及其衍生.物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNAs和往返載體，如pSA3和pAT28。這些和許多其他的選殖載體可獲自商業賣主，如BioRad、Strategene和Invitrogen。
表現載體通常是可複製的多核苷酸構築體，其含有根據本發明之多核苷酸。暗示表現載體在宿主細胞中必須是可複製的，如附加體或染色體DNA的嵌入部分。適當的表現載體包括但不限於質體、病毒載體，包括腺病毒、腺病毒伴隨病毒、逆轉錄病毒、粘接質體和在PCT公開案第WO 87/04462號中揭示的表現載體(們)。載體組份通常可包括，但不限於下列的一或多項：信號序列；複製起點；一或多個標記基因；適當的轉錄控制元件(如啟動基因、促進子和終止序列)。為了表現(即轉譯)，通常亦需要一或多個轉譯控制元件，如核糖體結合位置、轉譯開始位置和終止密碼子。
可藉著任何適當的方法，包括電穿透作用、轉移感染、使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質；微粒撞擊；脂染作用；以及感染(例如在載體為傳染原之處，如痘苗病毒)，將含有感興趣之多核苷酸的載體導入宿主細胞內。導入載體或多核苷酸的選擇，通常將視 宿主細胞的特性而定。
本發明亦提供包括任何在本文中描述之多核苷酸的宿主細胞。為了分離編碼感興趣之抗體、多肽或蛋白質的基因，可使用任何能夠過度-表現異種DNAs的宿主細胞。哺乳動物宿主細胞的非-限制性實例包括，但不限於COS、HeLa和CHO細胞。亦參見PCT公開案第WO 87/04462號。適當的非-哺乳動物宿主細胞包括原核生物(如大腸桿菌或枯草桿菌)和酵母菌(如酒酵母菌、裂殖酵母(S.pombe)；或乳酸克魯維酵母(K.lactis)。較佳的是，該宿主細胞以比相對應之感興趣的內源抗體或蛋白質(若出現在宿主細胞中)更高大約5倍，更佳的是10倍，再更佳的是20倍的程度表現cDNAs。藉著免疫測定或FACS，完成針對與NGF之專一結合來篩選宿主細胞。可確認過度表現感興趣之抗體或蛋白質的細胞。
使用E3和E3衍生之抗體的方法
可使用與NGF結合的抗體E3，確認或檢測NGF的存在或缺乏。為了簡化，通常提到E3或抗體，了解這些方法適用於任何在本文中描述的NGF結合具體實施例(如多肽)。檢測通常涉及使生物試樣與在本文中描述之抗體接觸，其與NGF結合並在NGF與專一地結合NGF的抗體(例如E3)之間形成複合物。這類複合物的形成可以是在活體外或在活體內的。當在本文中使用時，"檢測"一詞包括定性及/或定量檢測(測量含量)，有或無參考對照組。
可使用各種已知方法中的任一種來進行檢測，包括但不 限於免疫測定，使用多肽結合的抗體，例如藉著酵素-連接的免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)及其類似者；以及針對編碼多肽的功能測定，例如結合活性或酵素測定。在一些具體實施例中，以可檢測之方式標示抗體。
E3和衍生物的診斷用途
本發明之抗體和多肽可應用在與改變或異常NGF表現(在一些具體實施例中，(相對於正常試樣)增加或降低NGF表現，及/或不適當之表現，如在正常不表現NGF的組織(們)及/或細胞(們)中出現表現，或在正常有NGF表現之組織(們)及/或細胞(們)中沒有NGF表現)有關之疾病、狀況或病症的檢測、診斷和監視上。本發明之抗體和多肽更可進一步用來檢測NGF表現，例如在與對NGF有改變或異常之敏感性或反應性有關的疾病中。在一些具體實施例中，在得自懷疑或患有疾病、病症之個體的試樣中，檢測NGF表現，該疾病或病症之特徵為對NGF表現有改變或異常之敏感性或反應性，或與其有關(例如其中NGF促進生長及/或轉移的癌症)。
因此，在一些具體實施例中，本發明提供的方法包括使懷疑有改變或異常NGF表現之個體的樣本(試樣)與本發明之抗體或多肽接觸，並判定NGF的含量是否與對照組或比較樣本有差異。在一些具體實施例中，該個體患有心律不整、阿茲海默氏症及/或自主神經功能障礙。
在其他的具體實施例中，本發明提供之方法包括使個體 的樣本(試樣)接觸，並判定NGF表現的程度。在一些具體實施例中，懷疑該個體患有特徵為對NGF表現有改變或異常之敏感性或反應性，或與其有關的疾病或病症。在一些具體實施例中，該個體患有小細胞肺癌、乳癌、胰臟癌、前列腺癌、卵巢癌、肝細胞癌或黑色素瘤。
為了診斷應用，通常以可檢測部分來標示抗體，包括但不限於放射性同位素、螢光標記和各種酵素-受質標記。使標記與抗體共軛的方法是此項技藝中已知的。在本發明其他的具體實施例中，不必標示本發明之抗體，可使用與本發明之抗體結合並經過標示的抗體來檢測它的存在。
亦可在任何已知的測定方法中使用本發明之抗體，如競爭性結合測定、直接或間接三明治測定，以及免疫沉澱測定。Zola，單株抗體：技術手冊(Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques)，第147-158頁(CRC Press,Inc.1987)。
亦可在活體內的診斷測定中使用抗體，如在活體內的顯影。通常以放射性核素(如111 In、99 Tc、14 C、131 I、125 I或3 H)來標示抗體，而得以使用免疫閃爍照相法來定位感興趣的細胞或組織。
亦可在病理學中將抗體當作染色試劑來使用，依據在此項技藝中已熟知的技術。
使用E3及衍生物治療的方法
抗體E3可用來降低及/或阻斷NGF之生物活性。咸相信該拮抗活性可用來治療與內源之NGF產生有關的病理學狀 況，如疼痛。通常，在這些具體實施例中，對個體投與有效的含量。因此，本發明一方面提供使用任何在本文中揭示的多肽(包括抗體，如抗體E3)，拮抗人類NGF生物活性的方法。在一具體實施例中，該方法包括使人類神經生長因子與任何在本文中揭示之多肽(包括抗體E3)接觸，藉此拮抗、降低、阻斷或抑制人類神經生長因子活性。在另外的具體實施例中，給予患有疼痛(如手術後疼痛或風濕性關節炎疼痛)的個體E3來治療。
為了簡化，通常提到E3或抗體，了解這些方法適用於任何在本文中描述的E3變體抗體和多肽。
可使用各種E3或E3片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、Fc等等)的調配物來進行投藥，如單鏈(ScFv)、其突變種、包括抗體部分的融合蛋白，以及任何其他經過修改的E3組態，其包括專一性所需的抗原NGF認知位置。在一些具體實施例中，可投與純的E3抗體或E3的各種調配物。在其他的具體實施例中，投與E3或E3的各種調配物(包括在本文中描述的任何組合物實施例)，以及在藥學上可接受的賦形劑，且其可以是各種調配物。在藥學上可接受的賦形劑是此項技藝中已知的，並是相對上較惰性的物質，其有助於在藥學上有效之物質的投藥。例如，該賦形劑可提供形狀或密度，或作為稀釋劑。適當的賦形劑包括但不限於穩定劑、濕潤劑和乳化劑、改變滲透壓的鹽類、包膠製劑、緩衝劑和皮膚穿透促進劑。在Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Publishing(2000)中陳述了非經 腸和經腸藥物遞送的賦形劑和調配物。
在一些具體實施例中，將這些製劑調配成藉著注射投藥(例如腹腔內、靜脈內、皮下、肌肉內等等)的，雖然亦可使用其他的投藥形式(例如口服、黏膜、經吸入、舌下等等)。因此，最好將E3抗體及其相等物與在藥學上可接受之媒劑混合，如生理鹽水、林格氏液、右旋糖溶液及其類似物。特殊的劑量攝生法，即劑量、給藥時間和重複次數，將視特殊的個體和個體的醫學病史而定。通常可使用任何下列的劑量：投與至少大約50毫克/公斤體重；至少大約10毫克/公斤體重；至少大約3毫克/公斤體重；至少大約1毫克/公斤體重；至少大約750微克/公斤體重；至少大約500微克/公斤體重；至少大約250微克/公斤體重；至少大約100微克/公斤體重；至少大約50微克/公斤體重；至少大約10微克/公斤體重；至少大約1微克/公斤體重；或更低之劑量。為了在數天或更長的期間內重複給藥，視狀況而定，持續治療直到出現期望的疾病症狀之抑制為止。代表性的劑量攝生法包括投與大約2毫克/公斤的最初劑量，接著是大約1毫克/公斤抗-NFD抗體的每週維持劑量，或接著每隔一週投與大約1毫克/公斤的維持劑量。然而，其他的劑量攝生法可能也是有用的，視醫師希望達到的藥物動力學衰退模式而定。憑經驗的考量，如半衰期，通常將用以判定劑量。藉著傳統的技術和測定，輕易地監視該療法的進行。
在某些個體中，可能需要一次以上的給藥。可在療程中 判定並調整投藥的頻率。例如，可以欲治療之疼痛的類型和嚴重性、為了預防或治療目的而投與製劑、先前的療法、患者的臨床病史和對該製劑之反應，以及臨床醫師的判斷為基礎，來判定並調整投藥的頻率。通常，臨床醫師將投與抗-NGF拮抗劑抗體(如E3)，直到達到獲得想要結果的劑量為止。在某些情況下，持續連續釋放的E3抗體調配物可能是適合的。達到持續釋放的各種調配物和裝置為此項技藝中已知的。
在一具體實施例中，可在已經給予一或多次投藥的個體中，憑經驗判定E3抗體(或多肽)的劑量。給予個體增加劑量的E3。欲評估E3或其他相等抗體的效力，可監視疾病症狀(如疼痛)的標記。
根據本發明之方法投與抗體(如E3)或多肽，可以是連續或間歇的，視例如接受者的生理學狀況、投藥目的是否為治療性或預防性，以及熟練之醫師已知的其他因素而定。抗體的投藥基本上可能是在預先選擇的時間內連續的，或可以是一連串分開的劑量，例如在發展出疼痛之前、期間或之後，發展出疼痛之前、期間、之前和之後、期間和之後，或之前、期間和之後。投藥可以在受傷、切開、創傷、手術和任何其他類似引起手術後疼痛的事件之前、期間及/或之後。
其他調配物包括此項技藝中已知的適當遞送形式，包括但不限於載劑，如脂質體。參見，例如Mahato等人(1997)Pharm.Res.14：853-859。脂質體製備物包括，但不限於細 胞轉染劑、多層囊泡和單層囊泡。
在一些具體實施例中，可能出現一種以上的抗體或多肽。該抗體可以是單株或多株的。這類組合物可含有至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種不同的抗體。在此項技藝中經常以抗體的混合物來表示，其在治療較廣泛的個體族群時是特別有用的。
編碼任何本發明之抗體或多肽(如抗體E3)的多核苷酸，亦可用來在想要的細胞中，遞送及表現任何本發明之抗體或多肽(如抗體E3)。顯然可使用表現載體來指揮E3抗體或多肽的表現。可藉著此項技藝中已知的任何方法，投與表現載體，如腹腔內、靜脈內、肌肉內、皮下、鞘內、心室內、口服、經腸、非經腸、鼻內、經皮、舌下或藉著吸入。例如，表現載體的投藥包括局部或系統的投藥，包括注射、口服投藥、顆粒槍或插入導管投藥，以及局部投藥。熟諳此藝者通曉表現載體的投藥，獲得外源蛋白質在活體內的表現。參見，例如美國專利第6,436,908號；6,413,942號和6,376,471號。
亦可使用包括編碼任何本發明之抗體或多肽(如抗體E3)的多核苷酸之治療組合物的瞄準遞送。在例如Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11：202；Chiou等人，基因療法：直接基因轉移的方法和應用(Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer)(J.A.Wolff編輯)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988)263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem.(1991)266：338中描述了受體-調解之DNA遞送技術。在基因療法草案中，為了局部投藥，以大約100毫微克到大約200毫克DNA的範圍，投與含有多核苷酸的治療組合物。在基因療法草案期間，亦可使用大約500毫微克到大約50毫克、大約1微克到大約2毫克、大約5微克到大約500微克，以及大約20微克到大約100微克DNA的濃度範圍。可使用基因遞送媒介，遞送本發明之治療用多核苷酸和多肽。基因遞送媒介可以是病毒或非-病毒來源的(通常參見Jolly,Cancer Gene Therapy(1994)1：51；Kimura,Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly,Human Gene Therapy(1995)1：185；以及Kaplitt,Nature Genetics(1994)6：148)。可使用內源的哺乳動物或異種啟動基因，誘導這類密碼序列的表現。密碼序列的表現可以是組成上的或經調節的。
用來遞送想要的多核苷酸，並在想要之細胞中表現的以病毒為基礎之載體，為此項技藝中已熟知的。代表性的以病毒為基礎之媒介包括，但不限於重組的逆轉錄病毒(參見，例如PCT公開案第WO 90/07936號；WO 94/03622號；WO 93/25696號；WO 93/25234號；WO 93/11230號；WO 91/02805號；WO 91/02805號；美國專利第5,219,740號；4,777,127號；英國專利第2,200,651號；和歐洲專利第0 345 242號)、以α病毒為基礎的載體(例如辛得比斯病毒(Sindbis virus)載體、勝利森林病毒(Semiliki forest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、羅斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532))，腺病毒伴隨病毒(AAV)載體(參見，例如PCT公開案第WO 94/12649號；WO 93/03769號；WO 93/19191號；WO 94/28938號；WO 95/11984號和WO 95/00655號)。亦可使用在Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3：147中描述的與已殺死之腺病毒連接的DNA來投藥。
亦可使用非-病毒遞送媒介和方法，包括但不限於聚陽離子凝聚的DNA，與殺死的腺病毒連接或單獨不與其連接(參見，例如Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3：147)；配體-連接之DNA(參見，例如Wu,J.Biol.Chem.(1989)264：16985)；真核生物細胞遞送媒介細胞(參見，例如美國專利第5,814,482號；PCT公開案第WO 95/07994號；WO 96/17072號；WO 95/30763號和WO 97/42338號)，以及核電荷中和作用或與細胞膜融合。亦可使用裸露的DNA。在PCT公開案第WO 90/11092號和美國專利第5,580,859號中描述了代表性的裸露DNA導入法。在美國專利第5,422,120號；PCT公開案第WO 95/13796號；WO 94/23697號；WO 91/14445號和歐洲專利第0 524 968號中描述了可作為基因遞送媒介的脂質體。在Philip,Mol.Cell Biol.(1994)14：2411和Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581中描述了額外的方法。
關於在本文中描述的所有方法，參考抗-NGF拮抗劑抗體，亦包括由一或多個這些製劑所組成的組合物。這些組合物可進一步包括適當的賦形劑，如在藥學上可接受的賦形劑，包括緩衝劑，其為此項技藝中已熟知的。本發明可單獨使用，或與其他傳統治療方法併用。
使用抗-NGF拮抗劑抗體治療或預防風濕性關節炎疼痛的方法
在某些方面，本發明提供在個體，包括哺乳動物，人類和非人類兩者中，治療及/或預防風濕性關節炎疼痛的方法。因此，本發明一方面提供在個體中治療風濕性關節炎疼痛的方法，包括投與有效含量的抗-NGF拮抗劑抗體。抗-NGF拮抗劑抗體是此項技藝中已知的，並在本文中描述。
另一方面，本發明提供在個體中降低發生率、改善、壓抑、減輕及/或延遲風濕性關節炎疼痛之發生、發展或進行的方法。因此，在一些具體實施例中，在發展出疼痛或疼痛事件之前，在患有風濕性關節炎之個體中投與抗-NGF拮抗劑抗體。
另一方面，本發明提供在個體中治療與風濕性關節炎有關之炎症性惡病質(體重喪失)的方法，包括投與有效含量之抗-NGF拮抗劑抗體(Roubenoff等人，Arthritis Rheum.40(3)：534-9(1997)；Roubenoff等人，J.Clin.Invest.93(6)：2379-86(1994))。
在此項技藝中，已確立了風濕性關節炎疼痛的診斷或評 估。可以在此項技藝中已知的測量為基礎進行評估，如使用各種疼痛計分，定出患者疼痛的特徵。參見，例如Katz等人，Surg Clin North Am.(1999)79(2)：231-52；Caraceni等人J Pain Symptom Manage(2002)23(3)：239-55。也有常用來測量疾病狀態的計分表，如美國風濕病學會(American College of Rheumatology)(ACR)(Felson等人，Arthritis and Rheumatism(1993)36(6)：729-740)，健康評估問卷(Health Assessment Questionnaire)(HAQ)(Fries等人，(1982)J.Rheumatol.9：789-793)、保羅士(Paulus)計分表(Paulus等人，Arthritis and Rheumatism(1990)33：477-484)，以及關節炎衝擊量表(Arthritis Impact Measure Scale)(AIMS)(Meenam等人，Arthritis and Rheumatology(1982)25：1048-1053)。可經由任何適當的路徑投與抗-NGF拮抗劑抗體。在本文中描述不同投藥路徑的實例。
可藉著解除的時間經過，定出疼痛解除的特徵。因此，在一些具體實施例中，在投與抗-NGF拮抗劑抗體之後大約24小時內觀察到疼痛解除。在其他的具體實施例中，在投與抗-NGF拮抗劑抗體之後大約36、48、60、72小時或4天內觀察到疼痛解除。在另外的具體實施例中，在觀察到改善與風濕性關節炎有關之炎症狀況的指標之前，就觀察到疼痛解除。在一些具體實施例中，減少疼痛的頻率及/或強度，並/或增加那些受該疾病所苦者的生活品質。
在以下的章節中("NGF拮抗劑"；"抗-NGF拮抗劑抗體"；"其他的NGF拮抗劑"；"確認NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑 抗體)"；"用於本發明之方法中的組合物"；"投與NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)")，描述製造和使用NGF拮抗劑(包括抗-NGF抗體)的那些方法。
使用抗-NGF拮抗劑抗體來治療或預防骨關節炎疼痛的方法
在某些方面，本發明提供在個體，包括哺乳動物，人類和非人類兩者中，治療及/或預防骨關節炎疼痛的方法。因此，本發明一方面提供在個體中治療骨關節炎疼痛的方法，包括投與有效含量的NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。NGF拮抗劑，包括抗-NGF拮抗劑抗體是此項技藝中已知的，並在本文中描述。
另一方面，本發明提供在個體中降低發生率、改善、壓抑、減輕及/或延遲骨關節炎疼痛之發生、發展或進行的方法，包括投與有效含量的NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。因此，在一些具體實施例中，在發展出疼痛或疼痛事件之前，在患有骨關節炎之個體中投與NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。
在此項技藝中，已確立了骨關節炎疼痛的診斷或評估。可以在此項技藝中已知的測量為基礎進行評估，如使用各種疼痛計分，定出患者疼痛的特徵。參見，例如Katz等人，Surg Clin North Am.(1999)79(2)：231-52；Caraceni等人J Pain Symptom Manage(2002)23(3)：239-55。例如，可使用WOMAC移動疼痛計分(Ambulation Pain Scale)(包括疼痛、僵硬和身體功能)，以及100毫米視覺類比量表 (Visual Analogue Scale)(VAS)來評估疼痛，並評估對治療之反應。
可經由任何適當的路徑對個體投與NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。在本文中描述了不同投藥路徑的實例。
在一些具體實施例中，每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次、每十五週一次、每二十週一次、每二十五週一次或每二十六週一次，投與NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。在一些具體實施例中，每個月一次、每兩個月一次、每三個月一次、每四個月一次、每五個月一次或每六個月一次，投與NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。
可藉著解除的時間經過，定出疼痛解除的特徵。因此，在一些具體實施例中，在投與NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)之後大約24小時內觀察到疼痛解除。在其他的具體實施例中，在投與NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)之後大約36、48、60、72小時或4天內觀察到疼痛解除。在一些具體實施例中，減少疼痛的頻率及/或強度，並/或增加那些受該疾病所苦者的生活品質。
在以下的章節中("NGF拮抗劑"；"抗-NGF拮抗劑抗體"；"其他的NGF拮抗劑"；"確認NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)"；"用於本發明之方法中的組合物"；"投與NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)")，描述製造和使用NGF拮抗劑 (包括抗-NGF抗體)的那些方法。
NGF拮抗劑
本發明之方法(關於風濕性關節炎疼痛和骨關節炎疼痛)使用NGF拮抗劑，其意指任何阻斷、壓抑或降低(包括明顯地)NGF生物活性，包括由NGF發送信號來調解之下游路徑，如與NGF結合之受體及/或誘發對NGF之細胞反應的分子。"拮抗劑"一詞意指非專一的生物作用機制，並認為明確地包含並包括所有可能的與NGF之藥理學、生理學和生化交互作用，及其可藉著各種不同的，在化學上歧異的組合物達到的結果。代表性的NGF拮抗劑包括，但不限於抗-NGF抗體、針對NGF之反義分子(包括針對編碼NGF之核酸的反義分子)、針對NGF受體(如TrkA受體及/或p75受體)的反義分子(包括針對編碼TrkA及/或p75之核酸的反義分子)、NGF抑制化合物、NGF結構類似物、與NGF結合之TrkA受體的負面優勢突變、TrkA免疫黏附素、抗-TrkA抗體、與NGF之p75的負面優勢突變、抗-p75抗體和激酶抑制劑。為了本發明，明確地了解"拮抗劑"一詞包括所有先前確認的名詞、標題和功能狀態，並藉此定出NGF本身、NGF生物活性的特徵(包括但不限於其調解任何方面之疼痛的能力)，或該生物活性的結果，實質上以任何有意義的程度使其無效、減少、或中和。在一些具體實施例中，NGF拮抗劑(例如抗體)與NGF結合(與NGF產生物理交互作用)，與NGF受體(如TrkA受體及/或p75受體)結合，及/或降低(妨礙及/或阻斷)下游的NGF受體發送信號。因此，在 一些具體實施例中，NGF拮抗劑與NGF結合(與NGF產生物理交互作用)。在一些具體實施例中，NGF拮抗劑嗜與NGF結合之多肽。在一些具體實施例中，NGF拮抗劑是在PCT WO 2004/026329中描述的肽或經過修改的肽(如與Fc功能部位融合的NGF結合肽)。在另一具體實施例中，NGF拮抗劑與NGF受體(如TrkA受體或p75)結合。在其他的具體實施例中，NGF拮抗劑降低(妨礙及/或阻斷)下游的NGF受體發送信號(例如激酶發送信號的抑制劑)。在其他的具體實施例中，NGF拮抗劑抑制(降低)了NGF合成及/或釋放。在另外的具體實施例中，NGF拮抗劑是不屬於TrkA免疫黏附素的NGF拮抗劑(即為TrkA免疫黏附素以外的)。在另一具體實施例中，NGF拮抗劑是抗-NGF抗體以外的。在其他的具體實施例中，NGF拮抗劑是TrkA免疫黏附素和抗-NGF抗體以外的。在一些具體實施例中，NGF拮抗劑與NGF(如hNGF)結合，但不明顯地與相關的神經營養素，如NT-3、NT4/5及/或BDNF結合。在一些具體實施例中，NGF拮抗劑與有害的免疫反應無關。在其他的具體實施例中，NGF拮抗劑是抗-NGF抗體。在另外的具體實施例中，抗-NGF抗體是人類化的(如在本文中描述的抗體E3)。在一些具體實施例中，抗-NGF抗體是抗體E3(如同在本文中描述的)。在其他的具體實施例中，抗-NGF抗體包括一或多個抗體E3的CDR(s)(如1、2、3、4、5個，或在一些具體實施例中，得自E3的全部6個CDRs)。在其他的具體實施例中，該抗體是人類。在另外的具體實施例中，抗-NGF抗體包 括在圖1A中出示之重鏈可變區的胺基酸序列(SEQ ID NO：1)和在圖1B中出示之輕鏈可變區的胺基酸序列(SEQ ID NO：2)。在另外的具體實施例中，抗體包括經過修改的恆定區，如在免疫學上惰性的恆定區，例如不誘發補體調解之溶解，或不刺激抗體-依賴性細胞調解之細胞毒性(ADCC)。在其他的具體實施例中，按照在Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT申請案第PCT/英國99/01441號；及/或大不列顛聯合王國專利申請案第9809951.8號中的描述來修改恆定區。
抗-NGF拮抗劑抗體
本發明之方法(關於風濕性關節炎疼痛和骨關節炎疼痛)使用抗-NGF拮抗劑抗體，其意指任何阻斷、壓抑或降低(包括明顯地)NGF生物活性，包括由NGF發送信號調解之下游路徑，如受體結合及/或誘發對NGF之細胞反應的抗體分子。
抗-NGF拮抗劑抗體應顯示出下列特徵之任一或多項：(a)與NGF結合並抑制NGF生物活性，或由NGF發送信號功能調解之下游路徑；(b)預防、改善或治療任何方面的風濕性關節炎疼痛或骨關節炎疼痛；(c)阻斷或減少NGF受體激活作用(包括TrkA受體二聚作用及/或自動磷酸化作用)；(d)增加NGF的清除；(e)抑制(降低)NGF合成、產生或釋放。抗-NGF拮抗劑抗體為此項技藝中已知的，參見，例如PCT公開案第WO 01/78698號、WO 01/64247號、美國專利第5,844,092號、5,877,016號和6,153,189號；Hongo等 人，Hybridoma,19：215-227(2000)；Cell Molec.Biol.13：559-568(1993)；GenBank登錄編號U39608、U39609、L17078或L17077。亦在PCT WO 2005/019266中描述了抗-NGF拮抗劑抗體和多肽。
為了本發明，該抗體以抑制NGF及/或由NGF發送信號功能調解之下游路徑的方式與NGF反應。在一些具體實施例中，抗-NGF拮抗劑抗體認識人類NGF。在另外的具體實施例中，抗-NGF拮抗劑抗體專一地與人類NGF結合。在一些具體實施例中，抗-NGF拮抗劑抗體不明顯地與相關之神經營養素，如NT-3、NT4/5及/或BDNF結合。在另外的具體實施例中，抗-NGF抗體能夠與NGF結合，並有效地抑制NGF與其TrkA及/或p75受體在活體外的結合，並/或有效地抑制NGF激活其TrkA及/或p75受體。在另外的具體實施例中，抗-NGF拮抗劑抗體是單株抗體。在其他的具體實施例中，抗-NGF抗體是人類化的(如在本文中描述的抗體E3)。在一些具體實施例中，抗-NGF抗體是人類。參見，例如WO 2005/019266。在一具體實施例中，該抗體是人類抗體，其認得在人類NGF上的一或多個抗原決定位。在另一具體實施例中，該抗體是老鼠或大鼠抗體，其認得在人類NGF上的一或多個抗原決定位。在另一具體實施例中，該抗體認得在選自靈長類、狗、貓、馬和牛所組成之群的NGF上的一或多個抗原決定位。在其他的具體實施例中，抗-NGF拮抗劑抗體基本上與與選自下列之任一或多項之抗體相同的NGF抗原決定位6結合：MAb 911、MAb 912和 MAb 938(參見Hongo等人，Hybridoma 19：215-227(2000))。在其他的具體實施例中，該抗體與與MAb 911相同的抗原決定位結合。在另一具體實施例中，該抗體包括在免疫學上為惰性的恆定區(例如不誘發補體調解之溶解或抗體依賴性細胞調解之細胞毒性(ADCC))。可使用在美國專利第5,500,362號中揭示之方法評估ADCC活性。在一些具體實施例中，按照在Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT申請案第PCT/英國99/01441號；及/或大不列顛聯合王國專利申請案第9809951.8號中的描述來修改恆定區。
在一些具體實施例中，抗-NGF拮抗劑抗體是人類化的老鼠抗-NGF單株抗體，叫做抗體"E3"，任何在本文中描述的E3相關抗體，或其任何片段，均是NGF拮抗劑。
在本發明中有用的抗體可包括單株抗體、多株抗體、抗體片段(如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、Fc等等)、嵌合型抗體、雙重專一性抗體、異種共軛物抗體、單鏈(ScFv)、其突變種、包括抗體部分的融合蛋白、人類化抗體，以及免疫球蛋白分子之任何其他經過修改的組態，其包括所需專一性的抗原認知位置，包括抗體的糖基化作用變體、抗體的胺基酸序列變體，以及共價修改的抗體。該抗體可以是老鼠、大鼠、人類或任何其他來源的(包括嵌合型或人類化的抗體)。
抗-NGF拮抗劑抗體對NGF(如hNGF)的結合親和力，可以是大約0.10到大約0.80 nM，大約0.15到大約0.75 nM和 大約0.18到大0.72 nM。在一具體實施例中，結合親和力是在大約2 pM到22 pM之間。在一具體實施例中，結合親和力是在大約23 pM到大約100 pM之間。在一些具體實施例中，結合親和力是大約10 nM。在其他的具體實施例中，結合親和力是低於大約10 nM。在其他的具體實施例中，結合親和力是大約0.1 nM或大約0.07 nM。在另外的具體實施例中，結合親和力低於大約0.1 nM或低於大約0.07 nM。在另外的具體實施例中，結合親和力是大約100 nM、大約50 nM、大約10 nM、大約1 nM、大約500 pM、大約100 pM、大約50 pM中的任一個到大約2 pM、大約5 pM、大約10 pM、大約15 pM、大約20 pM或大約40 pM中的任一個。在一些具體實施例中，結合親和力是大約100 nM、大約50 nM、大約10 nM、大約1 nM、大約500 pM、大約100 pM或大約50 pM中的任一個，或低於大約50 pM。在一些具體實施例中，結合親和力低於大約100 nM、大約50 nM、大約10 nM、大約1 nM、大約500 pM、大約100 pM或大約50 pM。在另外的具體實施例中，結合親和力是大約2 pM、大約5 pM、大約10 pM、大約15 pM、大約20 pM、大約40 pM或超過大約40 pM。
一種判定抗體對NGF之結合親和力的方法，是藉著測量抗體之單功能Fab片段的結合親和力。欲獲得單功能Fab片段，可利用木瓜蛋白酶切開抗體(例如IgG)，或以重組方式表現。可藉著表面等離子體激光共振(BIAcore3000TM 表面等離子體激光共振(SPR)系統，BIAcore,INC,Piscaway NJ)，判定抗體之抗-NGF Fab片段的親和力。可根據供應者的說明書，利用N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)-碳化二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，激活CM5晶片。可以10 mM乙酸鈉pH 4.0稀釋人類NGF(或任何其他的NGF)，並以0.005毫克/毫升之濃度注射到已經激活的晶片上。使用可變的流動時間，跨越個別的晶片通道，可達到兩種抗原密度範圍：100-200反應單位(RU)，進行詳細的動力學研究，以及500-600RU，進行篩選測定。以乙醇胺阻斷晶片。再生研究已經顯示Pierce洗脫緩衝溶液(產品編號21004，Pierce Biotechnology,Rockford IL)和4 M NaCl(2：1)的混合物，有效地移除已經結合的Fab，同時在200次注射中仍保持在晶片上之hNGF的活性。使用HBS-EP緩衝溶液(0.01 M HEPES,pH 7.4,0.15 NaCl,3 mM EDTA,0.005%界面活性劑P29)作為BIAcore測定的執行緩衝溶液。以100微升/分鐘，注射連續稀釋的(0.1-10x已確立之KD )經過純化之Fab試樣1分鐘，並容許高達2小時的解離時間。藉著ELISA及/或SDS-PAGE電泳判定Fab蛋白質的濃度，使用具有已知濃度(藉著胺基酸分析判定)的Fab作為標準物。藉著使用BIA評估程式，使數據符合1：1之Langmuir結合模式(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994)Methods Enzymology 6.99-110)，同時獲得動力學結合率(kon )和解離率(koff )。按koff /kon 計算平均解離常數(KD )值。該草案適合用來判定抗體對任何NGF，包括人類NGF、其他脊椎動物(在一些具體實施例中，為 哺乳動物)之NGF(如老鼠NGF、大鼠NGF、靈長類NGF)的結合親和力，並可用於其他的神經營養素，如相關的神經營養素NT3、NT4/5及/或BDNF。
在一些具體實施例中，與人類NGF結合的抗體並不會顯著地與得自其他脊椎動物物種(在一些具體實施例中，為哺乳動物)之NGF結合。在一些具體實施例中，該抗體與人類NGF和一或多個得自其他脊椎動物(在一些具體實施例中，為哺乳動物)之NGF結合。在另外的具體實施例中，與NGF結合的抗體並不顯著地與其他神經營養素(如相關的神經營養素，NT3、NT4/5及/或BDNF)產生交叉反應。在一些具體實施例中，該抗體與NGF和至少一個其他的神經營養素結合。在一些具體實施例中，該抗體與哺乳動物物種之NGF結合，如馬或狗，但不顯著地與得自其他哺乳動物物種之NGF結合。
抗原決定位(們)可以是連續或間斷的。在一具體實施例中，該抗體基本上與與選自在Hongo等人，Hybridoma,19：215-227(2000)中描述的MAb 911、MAb 912和MAb 938所組成之群的抗體相同的hNGF抗原決定位結合。在另一具體實施例中，該抗體基本上與與MAb 911相同的hNGF抗原決定位結合。在另一具體實施例中，該抗體基本上與與MAb 909相同的抗原決定位結合。Hongo等人，在前。例如，抗原決定位可包括下列的一或多項：在hNGF之可變區1(胺基酸23-35)中的殘基K32、K34和E35；在hNGF之可變區4(胺基酸81-88)中的殘基F79和T81；在可變區4中的殘 基H84和K88；在hNGF之可變區5(胺基酸94-98)與hNGF之C-終端(胺基酸111-118)之間的殘基R103；在hNGF之前-可變區1(胺基酸10-23)中的殘基E11；在hNGF之可變區2(胺基酸40-49)與hNGF5之可變區3(胺基酸59-66)之間的殘基Y52；在hNGF之C-終端中的殘基L112和S113；在hNGF之可變區3中的殘基R59和R69；或在hNGF之前-可變區1中的殘基V18、V20和G23。此外，抗原決定位亦可包括一或多個hNGF的可變區1、可變區3、可變區4、可變區5、N-終端區及/或C-終端。在另一具體實施例中，該抗體明顯地降低hNGF之殘基R103的溶劑可及性。應了解雖然上述的抗原決定位是相對於人類NGF，但熟諳此藝者可將人類NGF與其他物種NGF的結構排成一直線，並確認這些抗原決定位可能的配對物。
一方面可藉著使用表現全長NGF或其部分序列的免疫原，製造能抑制NGF的抗體(例如人類、人類化、老鼠、嵌合型)。另一方面，亦可使用包括過度表現NGF之細胞的免疫原。可使用之免疫原的其他實例是NGF蛋白質，其含有全長NGF或一部分的NGF蛋白質。
可藉著此項技藝中已知的任何方法製造抗-NGF拮抗劑抗體。免疫宿主動物的路徑和計畫，通常被保管在已確立和傳統的抗體刺激與產製技術中，如同在本文中進一步描述的。產生人類和老鼠抗體之普通技術為此項技藝中已知的，並在本文中描述。
期待操縱任何哺乳動物個體，包括人類或從其中產生抗 體的細胞，作為產生哺乳動物，包括人類之融合瘤細胞株的基礎。通常以在本文中描述之免疫原的用量，以腹腔內、肌肉內、口服、皮下、蹠內(intraplantar)及/或皮內接種宿主動物。
可從淋巴細胞和永存不朽的骨髓瘤細胞來製備融合瘤，使用Kohler,B.和Milstein,C.(1975)Nature 256：495-497的一般體細胞雜交技術，或按照Buck,D.W.等人，In Vitro,18：377-381(1982)的修改。在雜交作用中可使用可獲得的骨髓瘤細胞株，包括但不限於X63-Ag8.653，以及得自Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA的那些。通常，該技術涉及使用融合劑(fusogen)，如聚乙二醇，或藉著熟諳此藝者已熟知的電方法，將骨髓瘤細胞與淋巴樣細胞融合。在融合之後，從融合培養基中分離細胞，並使其生長在選擇培養基中，如次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸腺核苷(HAT)培養基，排除未雜交的親代細胞。可使用有或無補充血清之在本文中描述的任何培養基來培養分泌單株抗體的融合瘤。另一種細胞融合技術，可使用EBV永存不朽的B細胞，產生本發明的抗-NGF單株抗體。擴大並繼代選殖融合瘤，若希望可藉著傳統的免疫測定程序(例如放射性免疫測定、酵素免疫測定或螢光免疫測定)，測定上清液的抗-免疫原活性。
可用來作為抗體來源的融合瘤，包括所有的衍生物、產生對NGF專一之單株抗體的親代融合瘤之子代，或其一部分。
可使用已知的程序，使產生這類抗體的融合瘤在活體外或在活體內生長。若希望可藉著傳統的免疫球蛋白純化程序，如硫酸銨沉澱、凝膠電泳、透析、層析法和超過濾作用，從培養基或體液中分離單株抗體。若出現不想要的活性，可藉著例如在使免疫原附接在固相上製成的吸附劑上執行製備，並從免疫原中洗脫或釋放出想要的抗體來移除之。使用雙重功能或衍生製劑，例如順丁烯二醯亞胺苯甲醯基磺基琥珀醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基共軛)、N-羥基琥珀醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2 或R1N=C=NR，其中R和R1是不同的烷基，將對欲免疫之物種為免疫原性的蛋白質與人類NGF或含有標靶胺基酸序列的片段共軛，用以免疫宿主動物，產生抗體族群(例如單株抗體)。
若想要，可將感興趣的抗-NGF拮抗劑抗體(單株或多株的)定序，然後可將多核苷酸序列選殖到載體內進行表現或繁殖。可將編碼感興趣之抗體的序列維持在宿主細胞中的載體內，然後可擴大宿主細胞並冷凍以供未來使用。或者，亦可使用多核苷酸序列進行基因操縱，"人類化"抗體，或改善親和力或抗體的其他特徵。例如，可設計恆定區使其更像人類恆定區，若將該抗體用於臨床試驗並用來治療人類，便可避免免疫反應。可能想要以遺傳方式操縱抗體序列，以便對NGF獲得更高的親和力，或在抑制NGF上獲得更大的效力。熟諳此藝者將知曉可對抗-NGF拮抗劑抗體進行一或多個多核苷酸改變，但仍維持其對NGF的 結合能力。
有四個人類化單株抗體的一般步驟。其為(1)判定起始抗體輕和重可變功能部位之核苷酸和預測的胺基酸序列，(2)設計人類化抗體，即決定在人類化加工期間使用哪一個抗體架構區，(3)實際的人類化方法/技術，和(4)人類化抗體的轉移感染與表現。參見，例如美國專利第4,816,567號；5,807,715號；5,866,692號；6,331,415號；5,530,101號；5,693,761號；5,693,762號；5,585,089號和6,180,370號。
已經描述了許多包括衍生自非-人類免疫球蛋白之抗原-結合位置的"人類化"抗體分子，包括嵌合型抗體，具有與人類恆定功能部位融合之囓齒類或經過修改之囓齒類V區和其結合的互補性決定區(CDRs)。參見，例如Winter等人Nature 349：293-299(1991),Lobuglio等人Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：4220-4224(1989),Shaw等人J.Immunol.138：4534-4538(1987)和Brown等人Cancer Res.47：3577-3583(1987)。其他參考文獻描述囓齒類CDRs移植到人類的支撐架構區(FR)內，之後再與適當的人類抗體恆定功能部位融合。參見，例如Riechmann等人Nature 332：323-327(1988)，Verhoeyen等人Science 239：1534-1536(1988)，和Jones等人Nature 321：522-525(1986)。其他的參考文獻描述藉著以重組方式在外側鑲嵌囓齒類架構區，支撐囓齒類CDRs。參見，例如歐洲專利公開案第0519596號。設計這些"人類化"分子，使對囓齒類抗-人類抗體分子之不想要的免疫反應減至最少，其限制了這些部分在人類接受者中 之治療應用的期間和效力。例如，可設計抗體恆定區，使其成為免疫學惰性的(例如不誘發補體溶解)。參見，例如PCT公開案第PCT/英國99/01441號；大不列顛聯合王國專利申請案第9809951.8號。亦可利用由Daugherty等人，Nucl.Acids Res.19：2471-2476(1991)，以及在美國專利第6,180,377號；6,054,297號；5,997,867號；5,866,692號；6,210,671號和6,350,861號；以及在PCT公開案第WO 01/27160號中揭示的人類化抗體的其他方法。
另外，可藉著使用已經設計成表現特定人類免疫球蛋白蛋白質的市售老鼠，獲得全部的人類抗體。亦可使用經過設計產生更想要(例如全部的人類抗體)或更強免疫反應的基因轉殖動物，產生人類化或人類抗體。這類技術的實例為得自Abgenix,Inc.(Fremont,CA)的XenomouseTM 和得自Medarex,Inc.(Princeton,NJ)的HuMAb-Mouse® 和TC MouseTM 。
另外，亦可以重組方式製造抗體，並使用此項技藝中已知的任何方法表現。或者，可藉著噬菌體展示技術以重組方式製造抗體。參見，例如美國專利第5,565,332號；5,580,717號；5,733,743號和6,265,150號；以及Winter等人，Annu.Rev.Immunol.12：433-455(1994)。或者，可使用噬菌體展示技術(McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990))在活體外從得自未免疫捐贈者的免疫球蛋白可變(V)功能部位基因節目中產生人類抗體和抗體片段。根據該技術，將抗體V功能部位基因以框架選殖到絲狀噬菌 體，如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因內，並以功能抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面上。因為絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單股DNA副本，故以抗體之功能特性為基礎的選擇亦導致選出編碼表現那些特性之抗體的基因。因此，噬菌體模仿B細胞的某些特性。可以各種格式進行噬菌體展示；關於回顧，參見例如Johnso,Kevin S.和Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。可使用數個來源的V-基因斷片進行噬菌體展示。Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)從衍生自免疫老鼠脾臟之V基因的小型隨機綜合庫中分離出抗-唑酮抗體的多種陣列。可建構得自未免疫人類捐贈者之V基因的節目，並基本上依據由Mark等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等人，EMBO J.12：725-734(1993)描述的技術，分離對抗多種抗原陣列(包括自身-抗原)的抗體。在天然的免疫反應中，抗體基因以高速累積突變(體細胞的突變過高)。某些改變的導入，將賦予較高的親和力，並在後續的抗原攻毒期間，展現出高-親和力表面免疫球蛋白的B細胞優先複製和分化。可藉著使用稱為"鏈洗牌"的技術模仿該自然過程。Marks等人，Bio/Technol.10：779-783(1992)。在該方法中，可藉著隨後以獲自未免疫捐贈者之V功能部位基因的天然存在變體之節目(節目們)置換重和輕鏈V區基因，改良經由噬菌體展示而獲得的"原始"人類抗體之親和力。該技術容許產生親和力在pM-nM範圍內的抗體和抗體片段。已經由 Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993)描述了製造極大噬菌體抗體節目(亦稱為"庫之母")的策略。亦可使用基因洗牌，從囓齒類抗體中衍生人類抗體，其中人類抗體具有與起始囓齒類抗體類似的親和力和專一性。根據該方法，亦稱為"抗原決定位銘記"，以人類V功能部位基因的節目置換藉著噬菌體展示技術獲得的囓齒類抗體之重或輕鏈V功能部位基因，創造出囓齒類-人類嵌合體。抗原選擇導致分離出能夠恢復有功能之抗原-結合位置的人類可變區，即抗原決定位支配(銘記)了夥伴的選擇。當重複該過程以便置換剩下的囓齒類V功能部位時，獲得人類抗體(參見1993年4月1日發表的PCT公開案第WO 93/06213號)。不像囓齒類抗體藉著CDR移植的傳統人類化作用，該技術提供了完整的人類抗體，沒有囓齒類來源的架構或CDR殘基。
雖然上文的討論顯然是關於人類化抗體，但所討論的一般原則亦適用於在例如狗、貓、靈長類、馬和牛中定做的抗體。顯然可混合在本文中描述之一或多種人類化抗體的方法，例如CDR移植、架構突變和CDR突變。
可藉著先從宿主動物中分離抗體和產生抗體的細胞，獲得基因序列，並使用該基因序列以重組方式在宿主細胞(例如CHO細胞)中表現抗體，以重組方式製造抗體。可使用其他方法在植物(例如菸草)或基因轉殖之乳汁中表現抗體序列。已經揭示了在植物或乳汁中以重組方式表現抗體的方法。參見，例如Peeters等人，Vaccine 19：2756(2001)； Lonberg,N.和D.Huszar Int.Rev.Immunol 13：65(1995)；和Pollock等人，J.Immunol Methods 231：147(1999)。製造抗體衍生物，例如人類化、單鏈等等的方法，為此項技藝中已知的。
亦可使用免疫測定和流動細胞計數分類技術，如螢光激活細胞分類(FACS)分離對NGF專一的抗體。
抗體可與許多不同的載劑結合。載劑可以是有活性或惰性的。已熟知之載劑的實例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、澱粉酶、玻璃、天然和經過修改的纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖和磁鐵礦。為了本發明之目的，載劑的性質可以是可溶或不可溶的。熟諳此藝者將知道其他適合與抗體結合的載劑，或將能夠使用例行的實驗探知這類載劑。在一些具體實施例中，載劑包括瞄準心肌的部分。
使用傳統程序(例如藉著使用能夠專一地與編碼單株抗體之重和輕鏈的基因結合的寡核苷酸探針)，迅速地分離編碼單株抗體的DNA，並定序之。融合瘤細胞是這類DNA的最佳來源。一旦分離，便可將DNA放在表現載體(如在PCT公開案第WO 87/04462號中揭示的表現載體)內，然後將其轉移感染到宿主細胞，如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不另行產生免疫球蛋白蛋白質的骨髓瘤細胞內，在重組的宿主細胞中獲得單株抗體的合成。參見，例如PCT公開案第WO 87/04462號。亦可修改DNA，例如藉著以人類重和輕鏈恆定功能部位的密碼序列取代同種的老鼠序列，Morrison等人，Proc.Nat. Acad.Sci.81：6851(1984)，或藉著共價連接免疫球蛋白密碼序列與全部或部分的非-免疫球蛋白多肽之密碼序列。以此方式，製備具有本文之抗-NGF單株抗體之結合專一性的"嵌合型"或"雜種"抗體。
可使用此項技藝中已熟知的方法定出抗-NGF拮抗劑抗體的特徵。例如，一種方法是確認與其結合之抗原決定位，或"抗原決定位作圖"。在此項技藝中已知許多作圖並定出在蛋白質上抗原決定位之位置特徵的方法，包括解釋抗體-抗原複合物的結晶結構、競爭性測定、基因片段表現測定和以合成肽為基礎的測定，如同在例如Harlow and Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999第11章中的描述。在另外的實例中，可使用抗原決定位作圖判定抗-NGF拮抗劑抗體與之結合的序列。抗原決定位作圖可購自各種來源，例如Pepscan系統(Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad,The Netherlands)。抗原決定位可以是直線的抗原決定位，即包含在單片胺基酸中的，或藉著胺基酸之三維交互作用形成的組態抗原決定位，其可能不一定包含在單片中。可分離或合成(例如以重組方式)不同長度的肽(例如至少4-6個胺基酸長)，並用在與抗-NGF拮抗劑抗體的結合測定中。在其他的實例中，可在藉著使用衍生自NGF序列之部分重疊肽的系統篩選中，判定與抗-NGF拮抗劑抗體結合的抗原決定位，並藉著抗-NGF拮抗劑抗體判定結合作用。根據基因片段表現測定，隨機或藉著 特定遺傳建構打破編碼NGF的開放編閱架構，並判定所表現之NGF片段與欲測試之抗體的反應性。可藉著例如PCR產生基因片段，然後在放射性胺基酸的存在下，在活體外轉錄並轉譯成蛋白質。然後藉著免疫沉澱法和凝膠電泳，判定抗體與放射性標示之NGF片段的結合。亦可藉著使用在噬菌體顆粒表面上展示的大型隨機肽序列庫(噬菌體庫)，確認某些抗原決定位。或者，可在簡單的結合測定中，針對與受試抗體的結合，測試部分重疊肽片段的限定庫。在另外的實例中，亦可進行抗原結合功能部位之突變生成作用、功能部位交換實驗和丙胺酸掃描突變生成作用，確認抗原結合所需、有資格及/或必要的殘基。例如，可使用其中已經利用得自密切相關，但在抗原性上不同之蛋白質(如神經營養素蛋白質家族的其他成員)的序列置換(交換)各種NGF多肽片段的突變NGF，進行功能部位交換實驗。藉著評估抗體與突變NGF的結合作用，可評估特殊NGF片段對於抗體結合的重要性。
另一種可用來定出抗-NGF拮抗劑抗體之特徵的方法，是使用利用已知與相同抗原，即在NGF上的各種片段結合之其他抗體的競爭性測定，判定抗-NGF拮抗劑抗體是否與與其他抗體相同的抗原決定位結合。競爭性測定為熟諳此藝者已熟知的。可用在本發明之競爭性測定中之抗體的實例包括MAb 911、912、938，如同在Hongo等人，Hybridoma 19：215-227(2000)中描述的。
可使用表現載體直接表現抗-NGF拮抗劑抗體。熟諳此 藝者熟知表現載體的投藥，以便獲得外源蛋白質在活體內的表現。參見，例如美國專利第6,436,908號；6,413,942號和6,376,471號。表現載體的投藥包括局部或全身性投藥，包括注射、口服、顆粒槍或導管投藥，以及局部投藥。在其他的具體實施例中，直接對交感神經幹或神經節投與表現載體，或投與冠狀動脈、心房、心室或心包囊。
亦可使用含有表現載體或次基因組多核苷酸之治療組合物的瞄準遞送。在例如Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff編輯)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988)263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem.(1991)266：338中描述了受體-調解之DNA遞送技術。在基因療法草案中，關於局部投藥，以大約100毫微克到大約200毫克DNA的範圍投與含有多核苷酸的治療組合物。在基因療法草案期間，亦可使用大約500毫微克到大約50毫克，大約1微克到大約2毫克，大約5微克到大約500微克，以及大約20微克到大約100微克DNA的濃度範圍。可使用基因遞送媒介遞送治療性多核苷酸和多肽。基因遞送媒介可以是病毒或非-病毒來源的(通常參見Jolly,Cancer Gene Therapy(1994)1：51；Kimura,Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly,Human Gene Therapy(1995)1：185；以及Kaplitt,Nature Genetics(1994)6：148)。可使用 內源的哺乳動物或異種的啟動基因，誘導這類密碼序列的表現。密碼序列的表現可以是組成上或經調節的。
遞送想要的多核苷酸，並在想要的細胞中表現之以病毒為基礎的載體，為此項技藝中已熟知的。以病毒為基礎之媒介的實例包括，但不限於重組的逆轉錄病毒(參見，例如PCT公開案第WO 90/07936號；WO 94/03622號；WO 93/25698號；WO 93/25234號；WO 93/11230號；WO 93/10218號；WO 91/02805號；美國專利第5,219,740號和4,777,127號；英國專利第2,200,651號和歐洲專利第0 345 242號)、以α病毒為基礎的載體(例如辛得比斯病毒(Sindbis virus)載體、勝利森林病毒(Semiliki forest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、羅斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532))，以及腺病毒伴隨病毒(AAV)載體(參見，例如PCT公開案第WO 94/12649號；WO 93/03769號；WO 93/19191號；WO 94/28938號；WO 95/11984號和WO 95/00655號)。亦可使用在Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3：147中描述的與已殺死之腺病毒連接的DNA來投藥。
亦可使用非-病毒遞送媒介和方法，包括但不限於聚陽離子凝聚的DNA，與殺死的腺病毒連接或單獨不與其連接(參見，例如Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3：147)；配體-連接之DNA(參見，例如Wu,J.Biol.Chem.(1989) 264：16985)；真核生物細胞遞送媒介細胞(參見，例如美國專利第5,814,482號；PCT公開案第WO 95/07994號；WO 96/17072號；WO 95/30763號和WO 97/42338號)，以及核電荷中和作用或與細胞膜融合。亦可使用裸露的DNA。在PCT公開案第WO 90/11092號和美國專利第5,580,859號中描述了代表性的裸露DNA導入法。在美國專利第5,422,120號；PCT公開案第WO 95/13796號；WO 94/23697號；WO 91/14445號和歐洲專利第0 524 968號中描述了可作為基因遞送媒介的脂質體。在Philip,Mol.Cell Biol.(1994)14：2411和Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581中描述了額外的方法。
其他的NGF拮抗劑
可使用抗-NGF抗體以外的NGF拮抗劑(關於風濕性關節炎疼痛和骨關節炎疼痛)。在本發明的一些具體實施例中，NGF拮抗劑包括至少一個能夠阻斷或減少有功能之NGF表現的反義分子。NGF之核苷酸序列是已知的，並可迅速地獲自公開取得的資料庫。參見，例如Borsani等人，Nuc.Acids Res.1990,18,4020；登錄編號NM 002506；Ullrich等人，Nature 303：821-825(1983)。例行地製備反義寡核苷酸分子，其將專一地與NGF mRNA結合，但與其他多核苷酸沒有交叉反應。代表性的瞄準位置包括，但不限於起始密碼子、5'調節區、密碼序列和3'未轉譯區。在一些具體實施例中，該寡核苷酸是大約10至100個核苷酸長、大約15至50個核苷酸長、大約18至25個核苷酸長或更 長。該寡核苷酸可包括主鏈修改，像是例如此項技藝中已熟知的硫代磷酸鹽鍵合和2'-O糖修改。代表性的反義分子包括在美國公開案第20010046959號中描述的NGF反義分子，亦參見http：//www.rna-tec.com/repair.htm 。
在其他的具體實施例中，NGF拮抗劑包括至少一個能夠阻斷或減少有功能之NGF受體(如TrkA及/或p75)表現的反義分子。Woolf等人，J.Neurosci.(2001)21(3)：1047-55；Taglialetela等人，J.Neurochem(1996)66(5)：1826-35。TrkA和p75的核苷酸序列是已知的，並可迅速地獲自可公開取得的資料庫。
或者，可使用此項技藝中已熟知的基因剔除、嗎啉并寡核苷酸、RNAi或核糖酵素法，減少NGF表現及/或釋放及/或NGF受體表現。參見http：//www.macalester.edu/~montgomery/RNAi.html；http：//pub32.ezboard.com/fmorpholinosfrm19.showMessage？topicID=6.topic；http：//www.highveld.com/ribozyme.html。
在其他的具體實施例中，NGF拮抗劑包括至少一個NGF抑制化合物。當在本文中使用時，"NGF抑制化合物"意指抗-NGF抗體以外，直接或間接降低、抑制、中和或廢除NGF生物活性的化合物。NGF抑制化合物應顯示出任一或多項下列的特徵：(a)與NGF結合並抑制NGF生物活性及/或由NGF發送信號功能調解的下游路徑；(b)預防、改善或治療任何方面的疼痛(如骨關節炎疼痛)；(c)阻斷或減少NGF受體激活作用(包括TrkA受體二聚作用及/或自動磷酸化作用)；(d)增加NGF之清除；(e)抑制(降低)NGF合成、 產生或釋放。代表性的NGF抑制化合物包括在美國公開案第20010046959號中描述的小分子NGF抑制劑；抑制NGF與p75結合的化合物，如在PCT公開案第WO 00/69829號中的描述，以及由Colquhoun等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.310(2)：505-11(2004)描述的PD90780[7-(苯甲醯胺基)-4,9-二氫-4-甲基-9-氧基-吡唑并[5,1-b]喹唑啉-2-羧酸]；抑制NGF與TrkA及/或p75結合的化合物，如在PCT公開案第WO 98/17278號中描述的。NGF抑制化合物的其他實例包括在PCT公開案第WO 02/17914號和WO 02/20479號中；以及在美國專利第5,342,942號；6,127,401號和6,359,130號中描述的化合物。更多代表性的NGF抑制化合物是屬於NGF競爭性抑制劑的化合物。參見美國專利第6,291,247號。此外，熟諳此藝者可製備其他小分子的NGF抑制化合物。
在一些具體實施例中，NGF抑制化合物與NGF結合。代表性的標靶(結合)位置包括，但不限於NGF與TrkA受體及/或p75受體結合的部分，以及NGF緊鄰受體-結合區，並一部分負責該受體-結合區之正確三維形狀的那些部分。在另外的具體實施例中，NGF抑制化合物與NGF受體(如TrkA及/或p75)結合，並抑制NGF生物活性。代表性的標靶位置包括TrkA及/或p75與NGF結合的那些部分。
在包括小分子的具體實施例中，該小分子可具有大約100至20,000道爾吞、500至15,000道爾吞或1000至10,000道爾吞的分子量。小分子庫是市售的。可使用此項技藝中已知的任何方法投與小分子，包括吸入、腹腔內、靜脈 內、肌肉內、皮下、鞘內、心室內、口服、經腸、非經腸、鼻內或經皮。通常，當根據本發明之NGF-拮抗劑是小分子時，以0.1至300毫克/公斤患者體重之比例，分成1至3或更多個劑量投與。對於正常體重的成年患者，可投與範圍從每個劑量1毫克到5克的劑量。
在其他的具體實施例中，NGF拮抗劑包括至少一個NGF結構類似物。在本發明中，"NGF結構類似物"意指具有類似NGF一部分之3-維結構，且其在活體外或在活體內在生理學條件下與NGF受體結合的化合物，其中該結合至少部分地抑制了NGF生物活性。在一具體實施例中，NGF結構類似物與TrkA及/或p75受體結合。代表性的NGF結構類似物，包括但不限於在PCT公開案第WO 97/15593號中描述的雙環肽；在美國專利第6,291,247號中描述的雙環肽；在美國專利第6,017,878號中描述的環狀化合物；以及在PCT公開案第WO 89/09225號中描述的NGF-衍生肽。亦可設計適當的NGF結構類似物，並經由NGF-受體結合的分子塑型來合成，例如藉著在PCT公開案第WO 98/06048號中描述的方法。該NGF結構類似物可以是單體或二聚體/低聚物，按任何想要之相同或不同結構的組合，以便獲得改善的親和力和生物效力。
在其他的具體實施例中，本發明提供包括至少一個TrkA受體及/或p75受體的顯性抑制突變種的NGF拮抗劑。熟諳此藝者可製備例如TrkA受體的顯性抑制突變種，使得該受體將與NGF結合，並因此作為捕捉NGFs的"溝槽"。然而， 當與NGF結合時，該顯性抑制突變種將沒有TrkA受體的正常生物活性。代表性的顯性抑制突變種包括，但不限於在下列參考文獻中描述的突變種：Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998,95,10884；Eide等人，J.Neurosci.1996,16,3123；Liu等人，J.Neurosci 1997,17,8749；Klein等人，Cell 1990,61,647；Valenzuela等人，Neuron 1993,10,963；Tsoulfas等人，Neuron 1993,10,975；和Lamballe等人，EMBO J.1993,12,3083，分別以引用的方式全部併入本文中。可以蛋白質形式或以表現載體之形式，投與顯性抑制突變種，而得以在活體內表現該顯性抑制突變種，例如突變的TrkA受體。可使用任何此項技藝中已知的方法，如腹腔內、靜脈內、肌肉內、皮下、鞘內、心室內、口服、經腸、非經腸、鼻內、經皮或藉著吸入，投與該蛋白質或表現載體。例如，表現載體的投藥包括局部投藥或全身性的投藥，包括注射、口服、顆粒槍或導管投藥和局部投藥。熟諳此藝者熟悉表現載體的投藥，以便獲得外源蛋白質在活體內的表現。參見，例如美國專利第6,436,938號；6,413,942號和6,376,471號。
亦可使用含有反義多核苷酸、表現載體或次基因組多核苷酸之治療組合物的瞄準遞送。在例如Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff編輯)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988)263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.(1994) 269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem.(1991)266：338中描述了受體-調解之DNA遞送技術。在基因療法草案中，關於局部投藥，以大約100毫微克到大約200毫克DNA的範圍投與含有多核苷酸的治療組合物。在一些具體實施例中，在基因療法草案期間，亦可使用大約500毫微克到大約50毫克，大約1微克到大約2毫克，大約5微克到大約500微克，以及大約20微克到大約100微克DNA或更多的濃度範圍。可使用基因遞送媒介遞送本發明之治療性多核苷酸和多肽。基因遞送媒介可以是病毒或非-病毒來源的(通常參見Jolly,Cancer Gene Therapy(1994)1：51；Kimura,Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly,Human Gene Therapy(1995)1：185；以及Kaplitt,Nature Genetics(1994)6：148)。可使用內源的哺乳動物或異種的啟動基因及/或促進子，誘導這類密碼序列的表現。密碼序列的表現可以是組成上或經調節的。
遞送想要的多核苷酸，並在想要的細胞中表現之以病毒為基礎的載體，為此項技藝中已熟知的。以病毒為基礎之媒介的實例包括，但不限於重組的逆轉錄病毒(參見，例如PCT公開案第WO 90/07936號；WO 94/03622號；WO 93/25698號；WO 93/25234號；WO 93/11230號；WO 93/10218號；WO 91/02805號；美國專利第5,219,740號和4,777,127號；英國專利第2,200,651號和歐洲專利第0 345 242號)、以α病毒為基礎的載體(例如辛得比斯病毒(Sindbis virus)載體、勝利森林病毒(Semiliki forest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、羅斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532))，以及腺病毒伴隨病毒(AAV)載體(參見，例如PCT公開案第WO 94/12649號；WO 93/03769號；WO 93/19191號；WO 94/28938號；WO 95/11984號和WO 95/00655號)。亦可使用在Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3：147中描述的與已殺死之腺病毒連接的DNA來投藥。
亦可使用非-病毒遞送媒介和方法，包括但不限於聚陽離子凝聚的DNA，與殺死的腺病毒連接或單獨不與其連接(參見，例如Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3：147)；配體-連接之DNA(參見，例如Wu,J.Biol.Chem.(1989)264：16985)；真核生物細胞遞送媒介細胞(參見，例如美國專利第5,814,482號；PCT公開案第WO 95/07994號；WO 96/17072號；WO 95/30763號和WO 97/42338號)，以及核電荷中和作用或與細胞膜融合。亦可使用裸露的DNA。在PCT公開案第WO 90/11092號和美國專利第5,580,859號中描述了代表性的裸露DNA導入法。在美國專利第5,422,120號；PCT公開案第WO 95/13796號；WO 94/23697號；WO 91/14445號和歐洲專利第0 524 968號中描述了可作為基因遞送媒介的脂質體。在Philip,Mol.Cell Biol.(1994)14：2411和Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581 中描述了額外的方法。
亦明瞭可使用表現載體，直接表現任何在本文中描述之以蛋白質為基礎的NGF拮抗劑(例如抗-NGF抗體、TrkA免疫黏附素等等)。例如，其他能夠阻斷(部分到全部阻斷)NGF及/或NGF生物活性的TrkA受體片段為此項技藝已知的。
在其他的具體實施例中，NGF拮抗劑包括至少一個TrkA免疫黏附素。在本文中使用的TrkA免疫黏附素意指可溶性嵌合型分子，包括TrkA受體之細胞外功能部位和免疫球蛋白序列，其仍保留了TrkA受體的結合專一性(實質上保留了trkA受體的結合專一性)，並能夠與NGF結合。
TrkA免疫黏附素為此項技藝中已知的，並已經發現其阻斷NGF與TrkA受體的結合。參見，例如美國專利第6,153,189號。Brennan等人報告了在手術後疼痛之大鼠模式中投與TrkA免疫黏附素。參見Society for Neuroscience Abstracts 24(1-2)880(1998)。在一具體實施例中，TrkA免疫黏附素包括得自能夠與NGF結合之TrkA細胞外功能部位的TrkA受體胺基酸序列(或其一部分)(在一些具體實施例中，該胺基酸序列實質上保留了trkA受體的結合專一性)與免疫球蛋白序列的融合。在一些具體實施例中，該TrkA受體是人類TrkA受體序列，並與免疫球蛋白恆定功能部位序列融合。在其他的具體實施例中，免疫球蛋白恆定功能部位序列是免疫球蛋白重鏈恆定功能部位序列。在另外的具體實施例中，兩個TrkA受體-免疫球蛋白重鏈融合的結合 (例如經由二硫鍵(們)的共價鍵合)，導致同種二聚的類免疫球蛋白結構。免疫球蛋白輕鏈可進一步與在二硫-鍵結之二聚體中一或兩個TrkA受體-免疫球蛋白嵌合體結合，產生同種三聚或同種四聚的結構。適當之TrkA免疫黏附素的實例包括在美國專利第6,153,189號中描述的那些。
在其他的具體實施例中，NGF拮抗劑包括至少一個能夠阻斷、壓抑、改變及/或降低NGF與TrkA受體之物理交互作用，及/或下游發送信號的抗-TrkA抗體，藉此降低及/或阻斷NGF生物活性。抗-TrkA抗體是此項技藝中已知的。代表性的抗-TrkA抗體包括在PCT公開案第WO 97/21732號、WO 00/73344號、WO 02/15924號和美國公開案第20010046959號中描述的那些。
在其他的具體實施例中，NGF拮抗劑包括至少一個能夠阻斷、壓抑及/或降低NGF與p75受體之物理交互作用，及/或下游發送信號的抗-p75抗體，藉此降低及/或阻斷NGF生物活性。
在另外的具體實施例中，NGF拮抗劑包括至少一個能夠抑制下游激酶發送與TrkA及/或p75受體活性有關之信號的激酶抑制劑。代表性的激酶抑制劑是K252a或K252b，其為此項技藝中已知的，並在Knusel等人，J.Neurochem.59：715-722(1992)；Knusel等人，J.Neurochemistry 57：955-962(1991)；Koizumi等人，J.Neuroscience 8：715-721(1988)；Hirata等人，Chemical Abstracts 111：728,XP00204135，參見摘要和第12版Collective Chemical Substance Index，第 3423頁，c.3(48-50,52-53)；以及美國專利第6,306,849號中描述。
若臨床醫師找到，亦期待確認許多其他種類的NGF拮抗劑。
確認NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)
可使用此項技藝中已知的方法，確認並定出NGF拮抗劑，包括抗-NGF拮抗劑抗體的特徵，藉此檢測及/或測量NGF生物活性的降低、改善或中和。可使用在PCT WO 04/065560中描述的方法。可使用其他方法，例如在美國專利第5,766,863號和5,891,650號中描述的激酶受體激活(KIRA)測定，來確認抗-NGF製劑。該ELISA-型的測定適合定性或定量測量激酶活性，藉著測量受體蛋白質酪胺酸激酶(在後文中稱為"rPTK")，如TrkA受體之激酶功能部位的自我磷酸化作用，並確認和定出所選之rPTK，例如TrkA可能拮抗劑的特徵。測定的第一階段涉及激酶受體，例如TrkA受體之激酶功能部位的磷酸化作用，其中該受體出現在真核生物細胞之細胞膜中。該受體可以是內源的受體或編碼受體的核酸，或可轉化至細胞內的受體構築體。通常，以實質上均質的這類細胞族群(通常是哺乳動物細胞株)塗覆第一個固相(例如第一個測定盤的壁)，使細胞黏著在固相上。通常，細胞是有黏性的，並藉此自然地黏在第一個固相上。若使用"受體構築體"，其通常包括激酶受體和flag多肽的融合。flag多肽被在測定之ELISA部分中的捕捉劑，通常是捕捉抗體認出。然後在含有黏附細胞的孔 中，與NGF一起加入分析物，如候選的NGF拮抗劑(包括抗-NGF拮抗劑抗體)，使酪胺酸激酶受體(例如TrkA受體)暴露在NGF和分析物下(或與其接觸)。該測定能夠確認抑制由其配體NGF激活TrkA之作用的拮抗劑(包括抗體)。在與NGF和分析物接觸之後，使用溶解緩衝溶液(其具有促溶的去垢劑)使黏附的細胞溶解，並溫和地攪拌，藉此釋放出細胞之溶胞產物，可使其直接接受測定的ELISA部分，不需濃縮或使細胞溶胞產物澄清。
然後準備使如此製備之細胞溶胞產物接受測定的ELISA階段。在ELISA階段的第一個步驟中，以捕捉劑(通常是捕捉抗體)塗覆第二個固相(通常是ELISA微量滴定盤的壁)，該捕捉劑專一地與酪胺酸激酶受體結合，或在受體構築體的案例中與flag多肽結合。完成第二個固相的塗覆，使得捕捉劑黏在第二個固相上。捕捉劑通常是單株抗體，但如同在本文實例中的描述，亦可使用多株抗體。然後使所獲得的細胞溶胞產物暴露或與已黏著的捕捉劑接觸，使得該受體或受體構築體黏在(或被捕捉到)第二個固相上。然後進行沖洗步驟，以便移除未結合的細胞溶胞產物，留下被捕捉到的受體或受體構築體。然後使黏住或被捕捉到的受體或受體構築體暴露或與抗-磷酸酪胺酸抗體接觸，其確認在酪胺酸激酶受體中磷酸化了的酪胺酸殘基。在一具體實施例中，抗-磷酸酪胺酸抗體(直接或間接)與催化非-放射性顏色試劑之顏色變化的酵素共軛。因此，可藉著後續試劑的顏色變化來測量受體的磷酸化作用。酵素可與抗- 磷酸酪胺酸抗體直接結合，或與與抗-磷酸酪胺酸抗體共軛的共軛分子(例如生物素)結合，且該酵素後續可經由共軛分子與抗-磷酸酪胺酸抗體結合。最後，藉著例如顏色試劑的顏色變化，來測量與捕捉受體或受體構築體結合的抗-磷酸酪胺酸抗體。
亦可藉著將候選製劑與NGF一起培養，並監視任一或多項的下列特徵，來確認NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)：(a)與NGF結合並抑制NGF生物活性或由NGF發送信號功能調解的下游路徑；(b)抑制、阻斷或減少NGF受體激活作用(包括TrkA二聚作用及/或自我磷酸化作用)；(c)增加NGF的清除；(d)治療或預防任何方面的風濕性關節炎疼痛或骨關節炎疼痛；(e)抑制(降低)NGF合成、產生或釋放。在一些具體實施例中，可藉著將候選製劑與NGF一起培養，並監視結合及/或附帶的NGF生物活性之降低或中和作用，來確認NGF拮抗劑(例如抗-NGF拮抗劑抗體)。可利用經過純化的NGF多肽(們)，或利用天然表現或經過轉移感染而得以表現NGF多肽(們)的細胞，來進行結合測定。在一具體實施例中，該結合測定是競爭性結合測定，其中評估候選製劑(如抗體)與已知的抗-NGF拮抗劑抗體競爭與NGF結合的能力。可以各種格式進行測定，包括ELISA格式。在其他的具體實施例中，藉著將候選製劑與NGF一起培養，並監視結合及附帶的trkA受體二聚作用及/或自我磷酸化作用的抑制作用，來確認NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。
在初步確認之後，可進一步藉著已知測試瞄準之生物活性的生物測定，證實並改進候選抗-NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)的活性。或者，可使用生物測定直接篩選候選者。例如，NGF在反應性細胞中促進了許多在形態學上可認知的改變。這些包括，但不限於促進了PC12細胞的分化，並增加來自這些細胞之軸突的生長(Greene等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.73(7)：2424-8,1976)，促進軸突從反應性感覺和交感神經節的移植物中長出(Levi-Montalcini,R.和Angeletti,P.Nerve growth factor.Physiol.Rev.48：534-569,1968)，並促進NGF依賴性神經元，如胚胎背根神經節、三叉神經節或交感神經節神經元的存活(例如Chun & Patterson,Dev.Biol.75：705-711,(1977)；Buchman & Davies,Devrlopment 118：989-1001(1993))。因此，抑制NGF生物活性的測定需要將NGF反應性細胞與NGF加分析物，如候選的NGF拮抗劑(包括抗-NGF拮抗劑抗體)一起培養。在適當的時間之後，將測量細胞反應(細胞分化、軸突長出或細胞存活)。
亦可根據Hongo等人，Hybridoma 19：215-227(2000)中的描述，藉著在胚胎大鼠背根神經節存活生物測定中，監視候選製劑抑制NGF調解之存活的能力，來評估候選的NGF拮抗劑(包括抗-NGF拮抗劑抗體)阻斷或中和NGF之生物活性的能力。
在本發明之方法中使用的組合物
在本發明方法中使用的組合物(適合風濕性關節炎疼痛 和骨關節炎疼痛)，包括有效用量的NGF拮抗劑(如抗-NGF抗體)，且在某些具體實施例中，更包括在藥學上可接受之賦形劑。在一些具體實施例中，該組合物適用於在本文中描述的任何方法中。這類組合物的實例，以及如何調配，亦描述在較早的章節和後文中。在一具體實施例中，該組合物包括NGF拮抗劑。在另一具體實施例中，該組合物包括一或多個NGF拮抗劑。在其他的具體實施例中，該組合物包括一或多個選自下列任一或多項之NGF拮抗劑：與NGF結合(在物理上產生交互作用)的拮抗劑(例如抗體)、與NGF受體(如TrkA及/或p75受體)結合的拮抗劑，以及降低(妨礙及/或阻斷)下游NGF受體發送信號的拮抗劑。在另外的具體實施例中，該組合物包括任何不是TrkA免疫黏附素的NGF拮抗劑(即TrkA免疫黏附素以外的)。在其他的具體實施例中，該組合物包括任何抗-NGF抗體以外的NGF拮抗劑。在另外的具體實施例中，該組合物包括任何TrkA免疫黏附素和抗-NGF抗體以外的NGF拮抗劑。在其他的具體實施例中，NGF拮抗劑抑制(降低)NGF合成、產生或釋放。在一些具體實施例中，NGF拮抗劑與NGF結合，且不明顯地與相關神經營養素(如NT3、NT4/5及/或BDNF)產生交叉-反應。在一些具體實施例中，NGF拮抗劑不與有害的免疫反應結合。在一些具體實施例中，NGF拮抗劑選自抗-NGF抗體、針對NGF的反義分子(包括針對編碼NGF之核酸的反義分子)、針對NGF受體(如TrkA及/或p75)的反義分子、NGF抑制化合物、NGF結構類似物、與 NGF結合之TrkA受體的顯性抑制突變、TrkA免疫黏附素、抗-TrkA抗體、抗-p73抗體和激酶抑制劑所組成之群。在其他的具體實施例中，NGF拮抗劑是抗-NGF抗體。在其他的具體實施例中，抗-NGF抗體認得人類NGF。在一些具體實施例中，抗-NGF抗體是人類。在另外的具體實施例中，抗-NGF抗體是人類化的(如在本文中描述的抗體E3)。在另一具體實施例中，抗-NGF抗體包括恆定區，其不誘發不想要或不希望的免疫反應，如抗體-調解之溶解或ADCC。在其他的具體實施例中，抗-NGF抗體包括抗體E3的一或多個CDR(s)(如1、2、3、4、5，或在一些具體實施例中，得自E3的全部6個CDRs)。
組合物當然可包括一個以上的NGF拮抗劑。例如，組合物可包括一種NGF拮抗劑中一個以上的成員(例如抗-NGF抗體的混合物，其認得NGF不同的抗原決定位)，以及不同種類NGF拮抗劑的成員們(例如抗-NGF抗體和NGF抑制化合物)。其他代表性的組合物包括一種以上的抗-NGF抗體，其認得相同的抗原決定位(們)，不同物種的抗-NGF抗體，其與NGF不同的抗原決定位結合，或不同的NGF抑制化合物。
在本發明中使用的化合物更可包括在藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington：The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkins，編輯K.E.Hoover)，以冷凍乾燥調配物或水溶液的形式。在本文中進一步說明在藥學上可接受的賦形劑。
NGF拮抗劑及其組合物亦可與其他製劑併用，係用以提高及/或補充該製劑的效力。對於骨關節炎疼痛，NGF拮抗劑可連同一或多個其他的止痛劑、NSAIDS或類固醇一起投與。止痛劑包括，但不限於對乙醯胺基酚(acetaminophen)、曲馬朵(tramadol)、辣椒素(capsaicin)(局部的)。NSAIDS的實例是乙醯水楊酸鹽類，包括阿斯匹靈；非乙醯水楊酸鹽類，包括雙水楊酸酯(salsalate)、雙氟尼酸(diflunisal)；乙酸類，包括依托度酸(etodolac)、雙氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、酮咯酸(ketorolac)、萘丁美酮(nabumetone)；丙酸類，包括苯氧苯丙酸(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘普生(naproxen)、萘普生鈉、丙嗪(oxaprozin)；芬那酸鹽類(fenamates)，包括甲氯芬那酸鹽(meclofenamate)、甲芬那酸(mefenamic acid)；保泰松(phenylbutazone)、吡羅昔康(piroxicam)；COX-2抑制劑，包括希樂葆(celecoxib)、萬克適(etoricoxib)、伐地考昔(valdecoxib)、偉克適(rofecoxib)、魯米雷昔(lumiracoxib)。類固醇的實例是關節內的皮質類固醇(IACs)。
為了治療風濕性關節炎疼痛，NGF拮抗劑可與一或多個其他的止痛劑、NSAIDS、皮質類固醇(例如脫氫可的松)或其他的疾病修改抗-風濕藥物一起投與。疾病修改抗-風濕藥物的實例為胺甲碟呤、羥氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、TNF抑制劑、可溶性介白素-1受體、金-共軛物、細胞毒性製劑 (硫唑嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺、環孢靈A)。
NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)的投藥
可經由任何適當的路徑，將NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)投與個體(風濕性關節炎和骨關節炎)。熟諳此藝者應知曉在本文中描述的實例並非企圖限制，僅為了解釋可利用的技術。因此，在一些具體實施例中，根據已知的方法將NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體投與個體，如靜脈內投藥，例如以積儲注射或藉著在一段時間內連續輸液，藉著肌肉內、腹腔內、腦脊髓內、皮下、關節內、舌下、滑液囊內、經由吹入、鞘內、口服、吸入或局部路徑。投藥可以是全身的，例如靜脈內投藥或局部的。市售的霧化器適合液體調配物，包括噴射霧化器和超音波霧化器均可用以投藥。可將液體調配物直接霧化，並可在重組之後將冷凍乾燥的粉末霧化。或者，可使用氟碳調配物和定量劑量吸入器將NGF拮抗劑(抗-NGF拮抗劑抗體)氣溶膠化，或以冷凍乾燥和磨細的粉末形式吸入。
在一具體實施例中，經由位置-專一的或瞄準局部的遞送技術，投與NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。位置-專一的或瞄準局部之遞送技術的實例，包括各種可植入的NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)的積儲來源或局部遞送導管，如輸液套管、留置套管或針頭套管、合成的移植物、外膜包覆物、吻合器或支架，或其他可植入之裝置、位置專一的載劑、直接注射或直接塗抹。參見，例如PCT公開案第WO 00/53211號和美國專利第5,981,568號。
可使用NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)的各種調配物來進行投藥。在一些具體實施例中，可單純投與NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)。在一些具體實施例中，NGF拮抗劑(如抗-NGF拮抗劑抗體)和在藥學上可接受之賦形劑可以在各種調配物中。在藥學上可接受的賦形劑為此項技藝中已知的，並為相對上惰性的物質，其有助於投與在藥理學上有效之物質。例如，賦形劑可提供形狀或濃度，或作為稀釋劑。適當的賦形劑包括，但不限於穩定劑、濕潤劑和乳化劑、改變滲透壓的鹽類、包膠製劑、緩衝劑和皮膚穿透促進劑。在Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Publishing(2000)中陳述了非經腸和經腸藥物遞送的賦形劑和調配物。
在一些具體實施例中，將這些製劑調配成藉著注射投藥(例如腹腔內、靜脈內、皮下、肌肉內等等)的。因此，可將這些製劑與在藥學上可接受之媒劑混合，如生理鹽水、林格氏液、右旋糖溶液及其類似物。特殊的劑量攝生法，即劑量、給藥時間和重複次數，將視特殊的個體和個體的醫學病史而定。
可使用任何適當的方法，投與抗-NGF拮抗體，包括藉著注射(例如腹腔內、靜脈內、皮下、肌肉內等等)。亦可經由吸入投與抗-NGF抗體，如同在本文中描述的。通常，為了投與抗-NGF抗體，一開始的候選劑量可以是大約2毫克/公斤。為了本發明，典型的每日劑量範圍可從大約0.1微克/公斤到1微克/公斤，到3微克/公斤，到30微克/ 公斤到300微克/公斤到3毫克/公斤，到30毫克/公斤，到100毫克/公斤或更多，視上文提及之因素而定。例如，可以大約1微克/公斤、大約10微克/公斤、大約20微克/公斤、大約50微克/公斤、大約100微克/公斤、大約200微克/公斤、大約500微克/公斤、大約1毫克/公斤或大約2毫克/公斤投與抗-NGF抗體。至於在數天或更長的時間內重複給藥，視情況而定，持續治療直到出現想要的症狀抑制，或直到達到充分的治療程度以便降低疼痛。代表性的給藥攝生法包括投與大約2毫克/公斤的起始劑量，接著是大約1毫克/公斤之抗-NGF抗體的每週維持劑量，或接著是大約1毫克/公斤每隔一週的維持劑量。然而，亦可使用其他的給藥攝生法，視醫師希望達到的藥物動力學衰退模式而定。例如，在一些具體實施例中，期待每週給藥四次。亦可使用更低頻率的給藥。在一些具體實施例中，每2週、每3週、每4週、每5週、每6週、每7週、每8週、每9週、每10週、每15週、每20週、每25週或更久投與抗-NGF抗體。在一些具體實施例中，每1個月、每2個月、每3個月、每4個月、每5個月、每6個月或更久一次投與抗-NGF抗體。藉著傳統的技術和測定輕易地監視該療法的進行。可在一段時間內改變給藥攝生法(包括所使用的NGF抑制劑(們))。
在患有來自膝蓋骨關節炎之中等到嚴重疼痛的患者中進行研究(在實例9中概述)，證實範圍在3至300微克/公斤之劑量提供了不同期間的疼痛減輕。所有受試的劑量(3、 10、30、100和300微克/公斤)產生疼痛降低至少7天；較高的劑量導致延長的疼痛減輕至少28天(圖24)。100微克/公斤的劑量產生至少80天的疼痛減輕(圖25)。
通常，當NGF拮抗劑不是抗體時，(在一些具體實施例中)可以大約0.1到300毫克/公斤患者體重的比例，分成1至3個劑量，或按照在本文中揭示的投與。在一些具體實施例中，對於正常體重的成年患者，可投與從大約0.3到5.00毫克/公斤之劑量。特殊的給藥攝生法，即劑量、給藥時間和重複次數，將視特殊個體和個體之醫學病史，以及個別製劑之特性(如製劑之半衰期和此項技藝中已熟知的其他考量)而定。
為了本發明，NGF拮抗劑(包括抗-NGF拮抗劑抗體)的適當劑量，將視所使用之NGF拮抗劑(或其組合物)、待治療之疼痛的類型和嚴重性、該製劑是否為了預防或治療目的而投與、先前的療法、患者的臨床病史和對該製劑之反應，以及臨床醫師的判斷而定。通常，臨床醫師將投與NGF拮抗劑(例如抗-NGF拮抗劑抗體)，直到達到獲得想要之結果的劑量為止。可在治療期間內改變劑量及/或頻率。
經驗上的考量，如半衰期，通常將助成劑量的判定。例如，可使用可與人類免疫系統相容的抗體，如人類化抗體或完整的人類抗體，延長抗體的半衰期，並防止抗體被宿主的免疫系統攻擊。可在療程中判定並調整投藥頻率，且通常但不一定以治療及/或壓抑及/或改善及/或延遲疼痛為 基礎。或者，NGF拮抗劑(例如抗-NGF拮抗劑抗體)的持續連續釋放調配物可能是適合的。各種達到持續釋放的調配物和裝置均為此項技藝中已知的。
在一具體實施例中，可憑經驗在已經給予一或多種NGF拮抗劑投藥的個體中判定NGF拮抗劑(例如抗-NGF拮抗劑抗體)的劑量。給予個體增加的NGF拮抗劑(例如抗-NGF拮抗劑抗體)劑量。欲評估NGF拮抗劑(例如抗-NGF拮抗劑抗體)之效力，可追蹤疼痛之指標。
可連續或間斷地根據本發明之方法投與NGF拮抗劑(例如抗-NGF拮抗劑抗體)，例如視接受者之生理學狀況、投藥目的是否為治療或預防性，以及熟練之醫師已知的其他因素而定。NGF拮抗劑(例如抗-NGF拮抗劑抗體)的投藥基本上可能是在預先選擇的時間內連續的，或可以是一連串分開的劑量，例如在發展出疼痛之前、期間或之後，發展出疼痛之前、期間、之前和之後、期間和之後，或之前、期間和之後。
在一些具體實施例中，可出現一個以上的NGF拮抗劑，如抗-NGF拮抗劑抗體。可出現至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個不同的，或更多個NGF拮抗劑(例如抗-NGF拮抗劑抗體)。通常那些NGF拮抗劑(例如抗-NGF拮抗劑抗體)具有互補的活性，彼此沒有不利的影響。NGF拮抗劑亦可與其他製劑併用，用來促進該製劑之效力及/或與其互補。
以冷凍乾燥調配物或水溶液之形式，藉著將具有想要純 度的NGF拮抗劑(例如抗體)與任意的在藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing(2000))混合，來製備根據本發明來使用，並可儲存的NGF拮抗劑(例如抗-NGF拮抗劑抗體)之治療調配物。可接受的載劑、賦形劑或穩定劑是在所使用之劑量和濃度下對接受者無毒性的，並可褒括緩衝溶液，如磷酸、檸檬酸及其他有機酸類；鹽類，如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯苄烷銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；酚、丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯，如對羥苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間-甲酚)；低分子量(低於大約10個殘基)的多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣類、雙醣類和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成鹽的抗衡離子，如鈉；金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及/或非-離子界面活性劑，如吐溫TM 、普羅尼克(PLURONICS)TM 或聚乙二醇(PEG)。
可藉著此項技藝中已知的方法製備含有NGF拮抗劑(例如抗-NGF拮抗劑抗體)的脂質體，如在Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；和美國專利第4,485,045號和4,544,545號中描述的。在美國專利第5,013,556號中揭示了具有增加循環時間的脂質體。可藉著逆向蒸發法，利用由磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG-衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)組成的脂質組合物，來產製特別有用的脂質體。通過具有限定孔隙尺寸的濾紙擠出脂質體，產生具有想要直徑的脂質體。
亦可使活性成分陷入微膠囊中，例如藉著凝聚技術或藉著界面聚合作用來製備，例如羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚-(異丁烯酸甲酯)微膠囊，分別在膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白中心體、微滴乳狀液、奈米-顆粒和奈米膠囊)或粗滴乳狀液中。在Remington：The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing(2000)中揭示了這類技術。
可製備持續-釋放的製備物。持續-釋放製備物的適當實例包括半通透基質的固體忌水性聚合物，其中含有拮抗劑(如抗體)，該基質為有形狀之物件，如薄膜或微膠囊。持續-釋放之基質的實例包括聚酯類、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L-穀胺酸和7-乙基-L-穀胺酸的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙里德(leuprolide acetate)所組成的注射用中心體)、蔗糖醋酸異丁酸酯和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
可用於活體內投藥的調配物必須是無菌的。這可藉著例如通過無菌過濾膜過濾而輕易地完成。通常將治療用的NGF拮抗劑(例如抗-NGF拮抗劑抗體)組合物放在具有無菌接近孔的容器，例如靜脈內溶液袋，或具有可被皮下注射針頭貫穿之塞子的小瓶中。
根據本發明之組合物可以是單位劑量形式，如錠劑、藥丸、膠囊、粉末、顆粒、溶液或懸浮液，或栓劑，以供口服、非經腸或直腸投藥，或藉著吸入或吹入投藥。
為了製備固體組合物，如錠劑，將主要的活性成分與藥學載劑，例如傳統壓製錠劑的成分，如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠，以及其他的藥學稀釋劑，如水混合，形成固體配方前(preformulation)組合物，其含有本發明化合物或其無毒性在藥學上可接受之鹽的均質混合物。當說這些配方前組合物是均質的時，意指活性成分均勻地分布在整個組合物中，而得以迅速地將該組合物細分成同樣有效的單位劑量形式，如錠劑、藥丸和膠囊。然後將該固體配方前組合物細分成上述類型的單位劑量形式，含有從0.1到大約500毫克的本發明之活性成分。可塗覆或另行調配該新穎組合物的錠劑或藥丸，提供足以給予延長作用之優點的劑量形式。例如，錠劑或藥丸可包括內層劑量和外層劑量組份，後者為覆蓋前者的封套形式。可藉著腸衣層分開兩種組份，其用以抵抗胃中的分解，並容許內層組份完整地通過進入十二指腸或延遲釋放。這類腸衣層或塗料可使用各種 材料，包括各種聚合酸，以及聚合酸與紫膠片、鯨蠟醇和醋酸纖維素之類材料的混合物。
適當的界面活性劑特別包括，非-離子製劑，如聚氧乙烯脫水山梨糖醇(例如吐溫TM 20、40、60、80或85)和其他脫水山梨糖醇(例如斯盤(Span)TM 20、40、60、80或85)。帶有界面活性劑的組合物，將便利地包括0.05到5%之間的界面活性劑，並可在0.1到2.5%之間。將知曉若需要可加入其他的成分，例如甘露糖醇或其他在藥學上可接受之媒劑。
可使用市售的脂肪乳劑，如英脫利匹特(Intralipid)TM 、利波賽(Liposyn)TM 、英肪紐醇(Infonutrol)TM 、力保脂寧(Lipofundin)TM 和力匹非森(Lipiphysan)TM 製備適當的乳劑。可將活性成分溶解於預先混合的乳劑組合物中，或者可將其溶解在油(例如大豆油、紅花油、棉子油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，並將所形成的乳劑與磷脂(例如蛋磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合。將知曉可加入其他成分，例如甘油或葡萄糖，調整乳劑的張力。適當的乳劑通常將含有高達20%的油，例如在5到20%之間。脂肪乳劑可包括0.1到1.0微米之間的脂肪小滴，特別是在0.1到0.5微米之間，並具有範圍在5.5到8.0的pH值。
乳劑組合物可以是藉著混合NGF拮抗劑(如神經生長因子抗體)與英脫利匹TM 或其組份(大豆油、蛋磷脂、甘油和水)製備的那些。
吸入或吹入的組合物包括在藥學上可接受之含水或有機 溶劑或其混合物中的溶液和懸浮液，以及粉末。液體或固體組合物可含有適當的在藥學上可接受之賦形劑，如同上文陳述的。在一些具體實施例中，為了局部或全身性作用，藉著口或鼻呼吸路徑投與該組合物。可藉著使用氣體，將在適當無菌的、在藥學上可接受之溶劑中的組合物霧化。可直接從霧化裝置中呼吸霧化了的溶液，或可將霧化裝置附接面罩、帳篷或間歇性正壓的呼吸機器。最好是經口或鼻，從以適當方式遞送調配物的裝置中投與溶液、懸浮液或粉末組合物。
可藉著此項技藝中已熟知的方法評估治療效力。
包括本發明之抗體或多核苷酸的套組
本發明亦提供包括抗體或多肽的套組，用來檢測及/或治療。因此，在一些具體實施例中，該套組包括抗體E3。在一些具體實施例中，該套組包括在本文中描述的任何抗體或多肽。
另一方面，可使用套組進行在本文中描述的任何方法，包括例如治療有疼痛(包括手術後疼痛、風濕性關節炎疼痛和骨關節炎疼痛)的個體。可適當地包裝本發明之套組，並可視需要提供額外的組份，如緩衝溶液和在本文中描述之任何方法中使用抗體的說明書。在一些具體實施例中，套組包括治療疼痛的說明書。在一些具體實施例中，套組包括在本文中描述的抗-NGF拮抗劑抗體，以及在個體中治療及/或預防風濕性關節炎疼痛的說明書。在其他的具體實施例中，套組包括在本文中描述的NGF拮抗劑 (如抗-NGF拮抗劑抗體)，以及在個體中治療及/或預防骨關節炎疼痛的說明書。在一些具體實施例中，該抗-NGF拮抗劑抗體是抗體E3。
另一方面，本發明提供包括編碼如在本文中描述之E3多肽的多核苷酸的套組。在一些具體實施例中，該套組更包括在本文中描述之任何方法中使用該多核苷酸的說明書。
調整抗體之親和力的方法，以及定出CDR特徵的方法
我們已經發展出定出抗體之CDR的特徵，及/或改變(例如改善)多肽，如抗體之結合親和力的新穎方法，稱為"庫掃描突變生成作用"。通常，如下進行庫掃描突變生成作用。使用此項技藝認可的方法，以二或多個(如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸置換在CDR中的一或多個胺基酸位置。這產生小型純種系庫(在一些具體實施例中，每個胺基酸位置分析一次)，各有二或多個成員的複雜性(若在每個位置有二或多個胺基酸被取代)。通常，該庫亦包括由本來的(未經取代之)胺基酸所組成的純種系。針對與標靶多肽的結合親和力，從每個庫中篩選出少數的純種系，例如大約20-80個純種系(視庫的複雜性而定)，並確認具有增加、相同、降低或無結合的候選者。判定結合親和力的方法是此項技藝中已熟知的。在一些具體實施例中，使用BIAcore表面等離子體激光共振分析，判定結合親和力，其檢測在大約2-倍或更高之結合親和力上的差異。當起始的抗體業已以相對較高之親和力，例如大約10 nM或更低之KD 結合 時，BIAcore是特別有用的。在本文的實例中描述了使用BIAcore表面等離子體激光共振的篩選。
在其他的具體實施例中，使用Kinexa Biocensor閃爍接近測定、ELISA、ORIGEN免疫測定(IGEN)、螢光猝滅、螢光轉移及/或酵母菌展示，判定結合親和力。在其他的具體實施例中，使用適當的生物測定篩選結合親和力。
在一些具體實施例中，使用此項技藝認可的突變生成方法(在本文中描述其中一些)，以全部20個天然胺基酸置換在CDR中的每個胺基酸位置(在一些具體實施例中，一次一個)。這產生小型純種系庫(在一些具體實施例中，每個胺基酸位置分析一次)，各有20個成員的複雜性(若在每個位置均取代全部20個胺基酸)。
在一些具體實施例中，欲篩選的庫包括在二或多個位置處取代，其可以是在相同的CDR或在二或多個CDRs中。因此，在一些具體實施例中，該庫包括在一CDR中之二或多個位置處的取代。在其他的具體實施例中，該庫包括在二或多個CDRs中之二或多個位置處的取代。在另外的具體實施例中，該庫包括在二、三、四、五或六個CDRs中找到的3、4、5或更多位置處的取代。在一些具體實施例中，使用低重複性的密碼子來準備取代。參見，例如Balint等人，(1993)Gene 137(1)：109-18的表2。
在一些具體實施例中，該CDR為CDRH3及/或CDRL3。在其他的具體實施例中，該CDR為一或多個CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及/或CDRH3。在一些 具體實施例中，該CDR為Kabat CDR、Chothia CDR或衍生的CDR。
可定序具有改善結合的候選者，藉此確認結果改善了親和力的CDR取代突變種(亦稱為"改善的"取代)。例如，如同在實例1中證實的，使用該方法容許確認改善結合的單一取代，即使是在相同胺基酸位置處已確立的18個其他取代未導致結合(即喪失抗體功能)。亦可定序結合的候選者，以便確認仍保持結合的CDR取代。
在一些具體實施例中，進行多次的篩選。例如，具有改善結合的候選者(分別包括一或多個CDR之一或多個位置的胺基酸取代)亦可用來設計第二個庫，在每個改善之CDR位置(即CDR中的胺基酸位置，在那裡取代突變種顯示出改善的結合)含有至少一個原始和經取代胺基酸。在下文進一步討論該庫的製備和篩選或選擇。
庫篩選突變生成作用亦提供定出CDR特徵的方法，只要有改善結合、相同結合、減少結合或無結合之純種系的頻率，亦提供關於每個胺基酸位置對抗體-抗原複合物之穩定性的重要性之資訊即可。例如，若CDR位置在變成全部20個胺基酸時仍保持結合，便確認該位置不可能是抗原結合所必需的。相反的，若CDR位置僅在一小部分取代時保持結合，則確認該位置是對CDR功能是很重要的位置。因此，庫掃描突變生成法產生了與在CDRs中可變成許多不同胺基酸(包括全部20個胺基酸)之位置，以及在CDRs中不能改變，或僅能變成少數胺基酸之位置有關的資訊。在實 例1中討論該觀點並舉例說明。
在一些具體實施例中，在第二個庫中混合具有改善親和力的候選者，其在位置上包括改良的胺基酸、原始的胺基酸，且可在位置上進一步包括額外的取代，視想要的庫複雜性或准許使用的想要篩選或選擇方法而定。此外，若需要可將鄰近胺基酸位置隨機化成至少二或多個胺基酸。鄰近胺基酸的隨機化，可容許在突變CDR中有額外組態上的彈性，其可轉而容許或有助於導入較大數量的改善突變。在一些具體實施例中，該庫亦包括在第一輪篩選時未顯示出改善親和力之位置處的取代。
使用此項技藝中已知的任何方法，包括使用BIAcore表面等離子體激光共振分析，就帶有改善及/或改變結合親和力的庫成員，篩選或選擇第二個庫，並使用此項技藝中已知的任何選擇方法來選擇，包括噬菌體展示、酵母菌展示和核糖體展示。
調整抗體之親和力並定出CDR特徵之方法的優點
該方法可用來預先篩選CDR胺基酸位置，以便確認改善結合或保持結合的胺基酸取代。預先確認重要的殘基，改善結合的取代及/或保留抗體功能的取代，容許有效地設計，並篩選親和力成熟庫。
本方法亦可用來定出CDR的特徵，並提供關於在CDR中對於抗原結合很重要的每個胺基酸位置的廣泛資訊。本方法亦可用來確認改善結合的取代。
使用小型庫，其中可將每個位置隨機化(在一些具體實 施例中，一次一個)，容許使用敏感的方法，如提供詳細動力學資訊的BIAcore，篩選取代突變種。當篩選較大的庫時，篩選方法通常是不實用的。確實，諸如噬菌體展示、酵母菌展示和核糖體展示之類的選擇方法，經常用來確認保持結合的純種系。噬菌體展示和ELISA測定可能極度依賴從純種系製備之蛋白質試樣的濃度，並因此有極度偏向有增加表現、增加穩定性或降低毒性之純種系的傾向，而非確認有增加結合親和力的純種系。此外，純種系在表現程度上的差異，掩蓋了在結合親和力上的少許改善。這些缺點在使用具高結合親和力之抗體作為起始材料時是特別劇烈的，因為為了足夠嚴格的篩選，必須使用極低量的抗原。
相對之下，本發明之方法，如在每個位置的隨機化(在一些具體實施例中，一次一個位置)，容許導入並定出例如，在特定位置之全部20個胺基酸取代的影響。該分析提供了在特定位置可容忍多少取代(及保持抗體結合)的資訊，其轉而提供關於每個胺基酸對於抗體功能之重要性的資訊。此外，可確認結果改善了結合的取代，甚至是在其中在特定位置的許多或大多數取代產生無功能(不-結合)抗體的情況下。相對而言，丙胺酸-掃描突變生成作用，經常用來確認重要的CDR位置，提供了關於丙胺酸的取代是否容許或阻止結合的資訊。通常，從親和力成熟庫中移除在丙胺酸取代阻止了結合的位置。然而，在許多情況下，丙胺酸在CDR位置可能是不良的取代基。
本方法亦容許確認並定出單一CDR突變之影響的特徵。相對而言，諸如噬菌體展示之類的方法，同時導入並選擇許多突變，並因此可能增加肯定突變將被出現在特殊純種系中之有害突變掩蓋的風險。
亦可使用本方法改善親和力，同時仍保留原始(起始)抗體的結合專一性，只要本方法容許確認改善結合親和力的少量突變(例如在單一CDR中有1、2、3、4或5個突變)。相對之下，諸如噬菌體展示之類的方法，通常使用一次多個突變，改善了結合親和力，結果可能導致抗體專一性的轉變，及/或增加了不想要的交叉-反應性。
實例 實例1：老鼠拮抗劑抗-NGF抗體911之人類化作用和親和力成熟
A.共同方法
在本實例中使用下列的共同方法
庫的產製
藉著PCR卡匣突變生成作用，利用在Kay等人(1996)，肽和蛋白質之噬菌體展示：實驗室手冊(Phage display of peptides and proteins：a laboratory manual), San Diego,Academic Press(參見第277-291頁)中描述的簡併寡核苷酸，產生庫。使用填補密碼子NNK，將一個胺基酸位置隨機化，包括20個可能的胺基酸。欲隨機化一個胺基酸位置，使其僅包括一具有特定特性的胺基酸亞組，使用在Balint等人(1993)Gene 137(1)：109-18中描述的填補密碼 子。使用在Innis等人，(1990)PCR草案：方法和應用的指引(PCR Protocols：A guide to methods and applications)(參見第177-183頁)中描述的重組PCR，進行指定位置之突變生成作用。
小規模的Fab製備
在96孔培養盤中的小規模表現，最適合用來篩選Fab庫。從以Fab庫轉化的大腸桿菌開始，挑選菌落接種在主培養盤(瓊脂LB+氨苄青黴素(50微克/毫升)+2%葡萄糖)和工作培養盤(2毫升/孔，96孔/培養盤，含有1.5毫升LB+氨苄青黴素(50微克/毫升)+2%葡萄糖)兩者上。使兩種培養盤生長在30℃下8-12小時。將主培養盤儲存在4℃下，並以5000 rpm使得自工作培養盤的細胞形成小球，再懸浮於1毫升LB+氨苄青黴素(50微克/毫升)+1 mM IPTG中，誘導Fabs表現。在30℃下5小時表現時間之後，藉著離心收集細胞，然後再懸浮於500微升緩衝溶液HBS-EP(100 mM HEPES緩衝溶液pH 7.4,150 mM NaCl,0.005%P20,3 mM EDTA)中。藉著一次冷凍(-80℃)然後在37℃下融解的循環，使再懸浮於HBS-EP中的細胞溶解。以5000 rpm離心細胞溶胞產物30分鐘，從含有Fabs的上清液中分離細胞碎屑。然後將上清液注入BIAcore等離子體激光共振裝置內，獲得每個Fab的親和力資訊。從主培養盤中救出表現Fabs的純種系，定序DNA並進行大規模Fab產生，然後按照下述定出詳細的特徵。
大規模的Fab製備
欲獲得詳細的動力學參數，表現Fabs並從大量培養物中純化。以5毫升得自選出表現Fab之大腸桿菌純種系的過夜培養物接種含有200毫升LB+氨苄青黴素(50微克/毫升)+2%葡萄糖的錐形燒瓶。在30℃下培養純種系，直到達到1.0之OD550毫微米 ，然後藉著以200毫升LB+氨苄青黴素(50微克/毫升)+1mM IPTG置換培養基誘導之。在30℃下5小時表現時間之後，藉著離心使細胞形成小球，然後再懸浮於10毫升PBS(pH8)中。藉著兩次冷凍/融解(分別為-80℃和37℃)的循環，獲得細胞的溶解。將細胞溶胞產物的上清液裝入以PBS,pH8平衡過的Ni-NTA超流瓊脂糖(Qiagen,Valencia CA)管柱中，然後以5倍管柱體積的PHS,pH8沖洗。以PBS(pH8)+300 mM咪唑，將個別的Fabs洗脫至不同的溶離份中。集合含有Fabs的溶離份，並在PBS中透析，然後在定出親和力特徵之前，藉著ELISA定量。
完整抗體的製備
為了表現完整的抗體，在2個哺乳動物表現載體(Eb.911.E3或Eb.pur.911.3E適合輕鏈，而Db.911.3E適合重鏈；在本文中描述)中選殖重和輕鏈可變區，並使用脂染胺轉移感染到HEK293細胞內，進行暫時的表現。使用標準方法，使用蛋白質A純化抗體。
Biacore測定
使用BIAcore3000TM 表面等離子體激光共振(SPR)系統(BIAcore,INC,Piscaway NJ)判定抗-NGF Fabs和單株抗體的親和力。根據供應商的說明，利用N-乙基-N'-(3-二甲胺 基丙基)-碳化二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，激活CM5晶片。以10 mM乙酸鈉pH4.0稀釋人類NGF，並以0.005毫克/毫升之濃度注射到已經激活的晶片上。使用可變的流動時間，跨越個別的晶片通道，達到兩種抗原密度範圍：100-200反應單位(RU)，進行詳細的動力學研究，以及500-600 RU，進行篩選測定。以乙醇胺阻斷晶片。再生研究已經顯示Pierce洗脫緩衝溶液(產品編號21004，Pierce Biotechnology,Rockford IL)和4 M NaCl(2：1)的混合物，有效地移除已經結合的Fab，同時在200次注射中仍保持在晶片上之hNGF的活性。使用HBS-EP緩衝溶液(0.01 M HEPES,pH 7.4,0.15 NaCl,3 mM EDTA,0.005%界面活性劑P29)作為所有BIAcore測定的執行緩衝溶液。
篩選測定
篩選BIAcore測定最適合判定來自庫之Fab純種系的親和力。以50微升/分鐘注射少量培養物溶胞產物的上清液2分鐘。使用10至15分鐘之解離時間，使用BIA評估軟體，判定單一指數解離率(koff )。為了證實，注射顯示與用來創造庫之模板(純種系8L2-6D5,koff 1x10-3 s-1 )相同範圍之koff 的試樣，而高達45分鐘的解離時間容許獲得較佳的koff 值。大規模表現顯示出改善(較慢)koff 值的純種系，並對經過純化之蛋白質判定全部的動力學參數kon 和koff 。該測定能夠檢測出大約2-倍或更大的親和力差異。
親和力判定測定
以100微升/分鐘，注射連續稀釋的(0.1-10x已確立之KD ) 經過純化之Fab試樣1分鐘，並容許高達2小時的解離時間。藉著ELISA及/或SDS-PAGE電泳判定Fab蛋白質的濃度，使用具有已知濃度(藉著胺基酸分析判定)的Fab作為標準物。藉著使用BIA評估程式，使數據符合1：1之Langmuir結合模式(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994)Methods Enzymology 6：99-110)，同時獲得動力學結合率(kon )和解離率(koff )。按koff /kon 計算平均解離常數(KD )值。
B.老鼠拮抗劑抗-NGF抗體911的人類化和親和力成熟
選擇老鼠拮抗劑抗-NGF抗體911(參見Hongo等人，(2000)Hybridoma 19(3)：215-227)進行人類化和親和力成熟。Mab 911以高親和力與人類和大鼠NGF結合，並顯示與神經營養素NT3、NT4/5或BDNF沒有明顯的交叉-反應性。參見Hongo，同上。按照上述使用BIAcore分析，判定使用木瓜蛋白酶-切開之老鼠Mab 911的Fab片段的親和力。木瓜蛋白酶-切開之老鼠Mab 911的Fab片段，以大約10 nM之KD 與人類NGF結合。
如下以數個步驟進行人類化和親和力成熟：
(1)製備CDR-移植模板 。將抗體911的輕鏈衍生之CDRs(即包括Kabat和Chothia CDR區兩者)移植到帶有JK2之人類生殖種系接受者序列O8內，並將抗體911的重鏈衍生之CDRs移植到帶有JH4之人類生殖種系接受者序列VH4-59內。在圖1A和1B中出示人類生殖種系接受者序列的胺基酸序列。胺基酸編號是連續的。使用上文提及的蛋白質架 構，替編碼帶有老鼠CDRs之人類架構的合成基因，設計DNA序列。將這些人類化的重和輕可變功能部位分別稱為hVH和hVL。密碼子最適合大腸桿菌和倉鼠使用。使用數個部份重疊的寡核苷酸(長度69-90個鹼基)，其利用每個鏈的兩個短的側面引子延伸全長的hVL和hVH，藉著基本上按照在Prodromou等人，(1992)Protein Eng 5(8)：827-9中描述的循環PCR，分別合成兩個基因。以凝膠純化具有正確長度的所得DNA片段，然後選殖到大腸桿菌二順反子表現質體(氨苄青黴素抗藥性的)內。抗體的表現是在IPTG可誘導之lacZ啟動基因的控制之下，類似在Barbas(2001)噬菌體展示：實驗室手冊(Phage display：a laboratory manual),Cold Spring Harbor,NY,Cold Spring Harbor Laborayory Press(參見Vector pComb3X，在第2.10頁)中的描述，然而，修改包括下列額外之功能部位的加入和表現：人類輕鏈恆定功能部位(參見GenBank登錄編號CAA09181)和IgG2a人類免疫球蛋白的CHI恆定功能部位(GenBank登錄編號P01859)。
亦在圖1A和1B中出示CDR-移植抗體之可變區的胺基酸序列(亦稱為"模板")，稱為8L2-4D5。使用上述的BIAcore分析判定8L2-4D5的親和力。8L2-4D5以大約38 nM之KD 與人類NGF結合。
(2)將點突變導入架構序列內 。使用如同在Innis等人，(1995)PCR策略(PCR strategies), San Diego,Academic Press中描述的重組PCR指定位置之突變生成作用，將 V71K取代導入CDR-移植重鏈內。該取代以相對應的老鼠架構殘基置換人類的架構殘基。將所得的抗體稱為8L2-6D5，並在圖1A中出示8L2-6D5重鏈可變區的胺基酸序列。使用上述的BIAcore分析判定8L2-6D5的親和力。8L2-6D5之Fab片段以大約15 nM之KD 與人類NGF結合。選擇8L2-6D5作為親和力成熟的模板。
(3)CDRs L1、L2、H1和H2的人類化和親和力成熟 。使CDRs L1、L2、H1和H2接受人類化和親和力成熟作用。以Chothia正統結構為基礎(參見Al-Lazikani等人(1997)J.Mol.Biol.273(4)：927-48)，確認在CDRs L1、L2、H1和H2中對於CDRs之結構並非必要的胺基酸位置；並如下接受隨機化作用。使用PCR卡匣突變生成作用，利用在Kay等人(1996)，肽和蛋白質的噬菌體展示：實驗室手冊(Phage display of peptides and proteins：a laboratory manual) ,San Diego,Academic Press中描述的簡併寡核苷酸，使用在Balint等人，(1993)Gene 137(1)：109-18中描述的填補密碼子，製備兩個分別含有如表2之輕鏈突變或重鏈突變，以及移植之(老鼠)CDR L3或CDR H3的庫。通常，以抗體911輕鏈和重鏈胺基酸序列與人類生殖種系抗體序列的排列為基礎，將胺基酸殘基變成較常出現在人類抗體中的殘基。在庫中亦陳述了野外型(未經取代的)胺基酸殘基，除了CDR H2殘基50，甲硫胺酸以外，在庫中並未神述野外型甲硫胺酸。使甲硫胺酸殘基接受氧化作用；因此，預期該殘基的置換改善了所得抗體的穩定性。如同上述，將 Fabs的庫選殖到載體pComb3X加人類CH1和C？區內。
表2：
1.重鏈H1/H2庫：
CDR-H1
將I34變成F、L、V、S、P、T、A或I將N35變成N、T、S或Y
CDR-H2
將M50變成全部20個天然的胺基酸將A62變成A或S將L63變成L或V
2.輕鏈L1/L2庫
CDR-L1
將S26變成S、A、V或F將D28變成D、A、S或Y將H32變成H、N、K、D、E、Q或Y
CDR-L2
將Y50變成Y、D、A或S將I51變成I、T、A或V將F54變成F或L將S56變成S和T
關於親和力篩選實驗，更進一步將每個庫與相對應的CDR-移植之輕或重鏈配對(例如H1/H2庫與CDR-移植之輕鏈配對)，表現該抗體，並根據製造者的說明並按照上述，使用BIACORE表面等離子體激光共振(SPR)系統 (BIAcore,Inc.Piscataway,NJ)，篩選個別純種系對人類NGF的親和力，判定koff 、kon 和KD 。以koff 率為基礎，排列抗體純種系，因為通常在koff 率上看到最大的親和力變化，並更進一步因為koff 率與抗體濃度無關。
判定已結合之純種系的序列，並在表3中出示已結合之純種系的序列。
表3： L1和L2胺基酸序列，H1和H2胺基酸序列，以及在H1/H2或L1/L2庫純種系的親和力篩選之後，已結合之純種系的動力學數據
按照上文指示將粗體的胺基酸隨機化*使用kon 4e4M-1 s-1 來計算KD **為了方便，在本文中使用"e"來表示"x10"。因此4e4可交替意指4x104 。
含有下列取代的CDRs仍保持結合：
CDR-H1
I34：S、L、V、I和A結合N35：N、T和S結合
CDR-H2
M50：M、I、G、Q、S、L結合A62：A和S結合L63：L和V結合
CDR-L1
S26：S和F結合D28：D、S、A、Y結合H32：H、N、Q結合
CDR-L2
Y50：Y結合I51：I、T、V、A結合F54：F結合 S56：S和T結合
通常，以結合親和力為基礎選出含有下列取代的CDRs，並組合成單一的純種系，稱為H19-L129：CDR-H1 ：I34L；N35N(無改變)CDR-H2 ：M50I；A62A(無改變)；L63VCDR-L1 ：S26S(無改變)；D28S；H32NCDR-L2 ：Y50Y(無改變)；I51T；F54F(無改變)；S56S(無改變)
組合這些突變(藉著以PCR擴大H和L鏈，以限制酵素切開PCR產物和載體(pRN8)，並進行3個片段的連接)成為單一的純種系，稱為H19-L129，其亦包括移植的H3和L3 CDRs。在圖1A和1B中出示H19-L129之重鏈和輕鏈可變區的序列，而表4顯示CDRs L1、L2、H1和H2的胺基酸序列。H19-L129以大約1 nM之KD 與NGF結合，使用上述的BIAcore分析判定。
表4： CDRS H1、H2、L1和L2的胺基酸序列，以及組合純種系H19-L129的動力學數據
(4)H3和L3 CDRs的親和力成熟 。以兩個步驟進行H3和 L3 CDRs的親和力成熟。首先，在叫做"庫掃描突變生成"的過程中，分別預先篩選在H3和L3中的每個胺基酸殘基，以便確認突變導致對人類NGF之結合親和力增加的胺基酸位置。以庫掃描突變生成作用(亦稱為"小型庫隨機化分析")的結果為基礎，選擇在H3和L3中胺基酸位置的亞組，來製備親和力成熟庫，並使用上述的BIAcore分析，針對對人類NGF之親和力來篩選該親和力成熟庫。了解通常可應用這些技術。
(a)庫掃描突變生成作用
分別就結果增加了對人類NGF之結合親和力的取代，先篩選在H3和L3 CDRs中每個胺基酸位置。在每個特定位置，胺基酸取代的頻率結果導致改善的結合、相同的結合、較差的結合或不結合，提供了有關於在CDRs中可變成許多不同的胺基酸(包括全部的20個胺基酸)之位置，在CDRs中不能改變之位置，或僅可變成少數胺基酸之位置的資訊。亦確認結果增加了結合親和力的胺基酸取代。以該篩選之結果為基礎，選出在CDRs H3和L3中胺基酸位置的亞組，來製備親和力成熟庫。
製備個別的Fab庫，其中L3和H3 CDRs的每個胺基酸均被隨機化成全部20個胺基酸，一次一個，結果產生數個(5個輕鏈的庫和13個重鏈的庫)小型庫，均在每個胺基酸位置處可能有20個胺基酸的複雜性。在所有的情況下，在庫中陳述本來的(即未改變的)胺基酸。藉著PCR卡匣突變生成作用，利用在Kay等人，(1996)，肽和蛋白質之噬菌體 展示：實驗室手冊(Phage display of peptides and proteins：a laboratory manual),San Diego,Academic Press中描述的簡併寡核苷酸製備庫，使用填補密碼子NNK，將一個胺基酸位置隨機化，包括20個可能的胺基酸。8L2-6D5(CDR移植抗體，具有架構突變V71K)作為庫建構的模板，因為CDR移植抗體的低親和力容許在篩選期間，較容易檢測出在H3和L3突變種中的親和力差異。因此，每個庫成員均含有具有1個胺基酸取代的CDR3(H3或L3)，和5個移植CDRs。
使用上述的BIAcore分析，從每個小型庫中篩選出20-80個純種系。在BIAcore晶片的一個通道上針對與NGF的結合親和力，並在感應晶片的另一個通道上針對Fab的存在，藉著與五-his標籤抗體結合，檢測在重鏈之C終端處的his標籤，藉著BIAcore同時分析試樣。按照具有相同之親和力、較差的親和力、較佳的親和力或不結合，將表現蛋白質之純種系分類，使用koff 來分類：在表5中出示該分析之結果。
表5： 按照具有相同之親和力、較差的親和力、較佳的親和力或不結合，以koff 為基礎將表現蛋白質之純種系分類。
判定所有具有改善親和力之純種系的序列，揭露導致增加親和力之胺基酸取代的頻率和身分。此外，從每個庫中選出少數保持類似8L2-6D5純種系之親和力的純種系，以便探查容許在特定位置進行的胺基酸序列取代，即使雖然該取代不一定增加結合親和力。在表6中概述該分析的結果。
表6
數個突變導致增加的結合親和力。與8L2-6D5模板相比較，至少下列的突變導致明顯增加的結合親和力：H_Y101W(CDR序列GGYWYGTSYYFDY(SEQ ID NO：46))；H_S105A(CDR序列GGYYYGTAYYFDY(SEQ ID NO：47))；H_S105T(CDR序列GGYYYGTTYYFDY(SEQ ID NO：48))；H_G103A(CDR序列GGYYYATSYYFDY(SEQ ID NO：49))和L_S91E(CDR序列QQEKTLPYT(SEQ ID NO：50))。
使用本實驗之結果，指引胺基酸位置的選擇，產生親和力成熟庫。
本實驗亦提供關於如在表5中所示，結果產生改善結合、相同結合、較差結合或不結合的在任何特定位置之胺基酸取代頻率的資訊。該資訊容許確認在CDRs中可變成許多不同胺基酸(包括全部20種胺基酸)的胺基酸位置，以及在CDRs中可變成少數胺基酸或極少數胺基酸(在一些具體實施例中，沒有胺基酸)的位置。這些結果亦證實增加結合親和力的胺基酸取代。
(b)親和力成熟
接下來，使用小型庫隨機化分析的結果(上文)，選擇產生用以進行H3和L3 CDRs之親和力成熟的H3和L3庫之殘 基。選擇CDR H3的殘基Y101和G103，以及CDR L3的殘基S91和K92，產生H3和L3庫，進行H3和L3的親和力成熟。
該庫混合同時在CDR-移植純種系8L2-6D5中，以及分別在H19-L129主鏈中的H3和L3之突變，並有80個各式各樣的不同純種系。表7顯示為了取代所選出的胺基酸殘基，以及在每個位置被取代的胺基酸。
表7. 在H3和L3中為了取代所選出的胺基酸殘基，以及在每個位置被取代的胺基酸
CDR-H3：
Y101變成Y和W,C(注意包含C，因為使用在一簡併寡核苷酸中的密碼子TRS，亦產生密碼子C)。
G103變成A,P,S
CDR-L3：
S91變成E K92變成所有20種胺基酸。A,R,K和H結合。
以Fab表現每個多肽，並根據製造者的說明和上述，使用BIACORE分析，對每個庫篩選96個個別純種系對人類NGF的親和力。在表8中出示該分析的結果。
表8.
以結合親和力為基礎，選出最佳的純種系E3(可交替地稱為"3E")和3C進行下一步定出特徵。E3包括下列的CDR取代：CDR-H3 ：Y101W，G103A；以及CDR-L3 ：S91E，K92H，將其組合成單一的純種系，其亦包括下列的L1、L2、H1和H2突變：CDR-H1 ：I34L；CDR-H2 ：M50I；L63V；CDR-L1 ：D28S；H32N；CDR-L2 ：I51T。
在圖1A和1B中出示E3之重鏈和輕鏈可變區的序列。3C 包括下列的CDR取代：CDR-L3 ：S91E，K92R；CDR-H3 ：Y101W，G103A；將其組合成單一的純種系，其亦包括對純種系E3描述的L1、L2、H1和H2突變。
將3E和3C純種系選殖到哺乳動物表現載體內，產生Fab和完整抗體，並在HEK293細胞中表現，並使用Ni-NTA或蛋白質A層析法純化。藉著胺基酸分析精確地定量純的蛋白質。
根據製造者的說明和上文的描述，除了在晶片上使用100RU NGF以保護再結合效力，使用BIAcore分析測量Fabs E3和3C對人類NGF的結合親和力。簡言之，將數個濃度的抗體(Fabs)注射到CM5晶片上2分鐘，在該晶片上帶有100 RU固定了的人類NGF，並容許解離1800秒。分析老鼠抗體911(Fab)作為對照組。使用BIA評估軟體，依據製造者的說明分析數據。在圖9和10中出示抗體E3和911的分析結果。E3以大約0.07 nM之KD 與人類NGF結合(並具有大約6.0e5M-1 s-1 之kon ，和大約4.2e-5 s-1 之koff )。3C以大約0.35 nM之KD 與人類NGF結合(具有大約1.4E-5之koff )。相對而言，老鼠抗體911以3.7 nM，8.4x10-5 s-1 之koff 和2.2x104 Ms-1 之kon 與NGF結合。
以高結合親和力為基礎，選出抗體E3(可交替地稱為3E)進行進一步的分析。欲測試E3阻止NGF與NGF受體trkA和p75之交互作用的能力，將2.5 nM人類NGF與0至50 nM的抗體E3(Fab)預先混合並培養1小時。在培養之後，以10微升/分鐘將試樣注射在含有260 RU之p75(通道2)和600 RU之 trkA(通道3)的BIAcore CM5晶片上，並判定結合百分比。在圖11中出示該分析的結果。藉著減少信號發送所示(以RU來測量)，增加濃度的Fab E3阻斷了NGF與p75和trkA兩者的交互作用，表示Fab E3阻斷了人類NGF與trkA和p75兩者的交互作用。當抗體E3(Fab)濃度等於NGF濃度時(大約2.5 nM NGF濃度)，沒有觀察到NGF結合(由信號0表示)。當NGF的濃度等於抗體3E之濃度時，出現0%的NGF-受體結合，暗示2.5 nM比E3對NGF之KD 更高至少10倍，並達到平衡。
實例2：使用老鼠E13.5三叉神經元存活測定，評估抗-NGF抗體的NGF-阻斷能力
藉著測量抗體在活體外抑制老鼠E13.5三叉神經元之NGF-依賴性存活的能力，來評估Fab E3或完整抗體E3阻斷NGF活性的能力。三叉神經節包括支配顏面區神經的皮膚感覺神經元。老鼠E13.5三叉神經元的存活是評估抗-NGF拮抗劑抗體阻斷NGF活性的敏感測定，因為NGF為支持這些神經元存活所必需的。例如，在NGF的飽和濃度下，在培養物中存活48小時接近100%。相反地，在缺少NGF時48小時，低於5%的神經元存活。
如下進行存活測定：藉著CO2 吸入將按時交配並懷孕的Swiss Webster雌鼠安樂死。移出子宮角，並取出在胚胎階段E13.5的胚胎將之斷頭。使用電解磨尖的鎢針頭切開三叉神經節。然後以胰蛋白酶消化神經節，以機械方式解離，並以每孔200-300個細胞的密度平舖在限定的、不含 血清的培養基中，在以聚-L-鳥胺酸和昆布胺酸塗覆的96孔培養盤中。
藉著在三叉神經元中加入各種劑量的抗-NGF抗體Mab 911(Fab)、8L2-6D5；H19-L129；E3和3C；以及下列濃度的人類或大鼠NGF：0.4毫微克/毫升(約15 pM；該濃度代表存活的NGF之飽和濃度)和0.04毫微克/毫升(約1.5 pM；該濃度接近IC50 )，評估抗-NGF Fabs或抗體的阻斷活性。在培養48小時之後，使細胞在Biomek FX液體操作工作站(Beckman Coulter)上接受如下的自動免疫細胞化學草案：使用4%甲醛，5%蔗糖和PBS固定；使用在PBS中之0.3%三通X-100使其可通透；使用5%正常山羊血清，在PBS中之0.11%BSA阻斷非專一的結合位置；並接著與初級和二級抗體一起培養，以便檢測神經元。初級抗體是對抗蛋白質基因產物89.5(PGP9.5,Chemicon)，一種已確立之神經元表現型標記的兔多株抗體。二級抗體是Alexa Fluor 488山羊抗-兔(Molecular Probes)，連同核染料Hoechst 33342(Molecular Probes)，標示所有出現在培養物中之細胞的核。在Discovery-I/Gen Ⅱ顯影器(Universal Imaging Corporation)上進行影像獲得和影像分析。在適合Alexa Fluor 488和Hoechst 33342的兩個波長處自動獲得影像，並使用核染色作為顯影器之以影像為基礎的自動對焦系統的參考點，因為核染色出現在所有的孔中。選擇適當的目標和每孔顯影位置的數目，涵蓋每個孔的整個表面。設定自動影像分析，以其與抗-PGP9.5抗體的專一性染色為基 礎，計算在培養48小時之後，出現在每孔中之神經元的數目。小心地取捨影像的閾值，並應用形態學和以選擇性濾紙為基礎的螢光強度，產生每孔神經元的精確計數。
本實驗的結果證實Fab E3以高親和力阻斷了NGF活性。在圖4-6和表9中出示結果。
圖4為顯示在各種濃度之人類和大鼠NGF的存在下，E13.5神經元之NGF依賴性存活的圖表。
圖5為在0.04毫微克/毫升人類NGF(約1.5 pM；出示在下圖中)或0.4毫微克/毫升人類NGF(約15 pM；出示在上圖中)的存在下，比較各種Fabs之NGF阻斷效力的圖表。1.5 pM之NGF約為促進存活之NGF的EC50 ，而15 pM則代表NGF的飽和濃度。按照上述評估在各種濃度的Fab E3；老鼠911 Fab和Fab H19-L129與Fab 8L2-6D5之下，E13.5老鼠三叉神經元的存活。在每個NGF濃度下，計算每個Fab的IC50 (按pM計)，並在表9中出示。Fab E3在15 pM人類NGF的存在下，以大約21 pM之IC50 ，並在1.5 pM人類NGF的存在下，以大約1.2 pM之IC50 ，強有力地阻斷了人類NGF-依賴性之三叉神經元存活。Fabs 3C和H19-L129亦強有力地阻斷了人類NGF-依賴性之三叉神經元存活。
圖6為在0.04毫微克/毫升大鼠NGF(約1.5 pM；出示在下圖中)或0.4毫微克/毫升大鼠NGF(約15 pM；出示在上圖中)的存在下，比較各種Fabs之NGF阻斷效力的圖表。1.5 pM之NGF約為EC50 ，而15 pM則代表NGF的飽和濃度。按照上述評估在各種濃度的Fab E3；老鼠Fab 911和Fab H19- L129與Fab 8L2-6D5之下，E13.5老鼠三叉神經元的存活。在每個NGF濃度下，計算每個Fab的EC50 (按pM計)，並在表9中出示。Fab E3在15 pM大鼠NGF的存在下，以大約31.6 pM之IC50 ，並在1.5 pM大鼠NGF的存在下，以大約1.3 pM之IC50 ，強有力地阻斷了大鼠NGF-依賴性之三叉神經元存活。Fabs 3C和H19-L129亦強有力地阻斷了大鼠NGF-依賴性之三叉神經元存活。
表9：
在不同的實驗中，我們比較完整抗體E3與Fab 3E，在0.4毫微克/毫升(飽和濃度)之人類NGF的存在下，抑制E13.5神經元之NGF-依賴性存活的能力。在圖12中出示分析的結果。當將完整抗體和Fab的濃度對NGF結合位置的數目標準化(Fab具有一個結合位置而完整抗體具有兩個結合位置)時，完整抗體E3和Fab E3顯示出類似程度的抑制NGF-依賴性存活。這些結果證實沒有抗體親抗原性的影 響，因為完整抗體與NGF二聚體結合。
在其他的實驗中，我們在0.4毫微克/毫升(飽和濃度)的存在下，比較各種濃度(20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128和0.0 nM)的抗體E3、抗體911和trkA受體免疫黏附素(由NGF受體trkA之細胞外功能部位與免疫球蛋白Fc功能部位CH2-CH3融合所組成)，抑制E13.5神經元之NGF-依賴性存活的能力。在圖13中出示這些結果。這些結果證實抗體E3阻斷了NGF，比抗體911或trkA免疫黏附素更好。
實例3：使用老鼠三叉神經元和結節神經元存活測定，評估抗-NGF抗體E3的專一性
藉著在飽和濃度的NGF、NGF相關之神經營養素NT3，或與NGF無關之神經營養因子、巨噬細胞刺激蛋白質(MSP)的存在下，測量抗體在活體外抑制老鼠E17/18三叉神經元存活的能力，評估抗體E3專一地阻斷NGF活性的能力。老鼠E17/18三叉神經元的存活是評估抗-NGF拮抗劑抗體之NGF-阻斷活性的敏感性測定，因為支持這些神經元存活需要比支持E13.5 TG神經元存活所需之NGF含量更高濃度的NGF。NT3或MSP亦支持這些神經元的存活，因此，這些神經元的存活也是評估抗-NGF拮抗劑抗體是否亦阻斷NT3或MSP的敏感性測定。
亦藉著在飽和濃度之BDNF或NT4/5的存在下，測量抗體抑制老鼠結節E17神經元存活的能力，評估抗體E3專一地阻斷NGF活性的能力。BDNF或NT4/5亦支持結節神經元的 存活，因此，這些神經元的存活也是評估抗-NGF拮抗劑抗體之阻斷BDNF或NT4/5能力的敏感性測定。
如下進行存活測定：藉著CO2 吸入將按時交配並懷孕的Swiss Webster雌鼠安樂死。移出子宮角，並取出胚胎(在胚胎第17或18天)將之斷頭。切下三叉神經和結節神經節並清潔之。然後以胰蛋白酶消化神經節，以機械方式解離，並以每孔100-300個細胞的密度平舖在限定的、不含血清的培養基中，在以聚-L-鳥胺酸和昆布胺酸塗覆的4孔培養盤(Greiner)中。
使E17/18三叉神經元在不添加神經營養因子(陰性對照組)，或在飽和濃度之人類NGF(400 pM和15 pM)(陽性對照組)；NT3(400 pM)或MSP(600 pM)的存在下生長。設定一式兩份的培養物，其包括各種濃度的E3和911 Fabs，以及完整抗體。每個結合位置指出Fab和完整抗體的濃度(例如完整抗體含有兩個結合位置，而Fab含有一個結合位置)。
使E17結節神經元在缺少添加神經營養因子(陰性對照組)，或帶有飽和濃度之BDNF(400 pM)(陽性對照組)，或NT4/5(400 pM)或與NGF無關之生長因子ILF(介白素抑制因子)之下生長。使用高濃度的神經營養素，因為本實驗的目標是測試抗體的專一性。設定一式兩份的培養物，其包括各種變化，有或無添加抗體E3和911。在培養48小時之後，藉著手工計數，使用逆相顯微鏡，探查在每個條件下，在每孔中之存活神經元的總數。
這些實驗的結果證實E3和911抗體完全阻斷了NGF對E18 三叉神經元的存活促進效力。相反的，E3和911抗體不影響由NT3或MSP促進之三叉神經元的存活，或由BDNF或NT4/5或LIF促進之結節神經元的存活。這些結果證實抗體E3對NGF具有選擇性專一性，在比阻斷NGF之有效濃度更高1000-倍至10,000倍的濃度下，在這些抗體與其他NGF相關神經營養素(NT3、NT4/5、BDNF)之間並沒有檢測到交互作用。此外，這些結果亦證實添加抗體或Fab E3時，在NGF-支持之NGF-依賴性神經元的培養物中看到神經元死亡，係歸因於在這些抗體與NGF之間專一的交互作用，而不是因為一般化的毒性作用。亦測試老鼠抗-NGF拮抗劑抗體911，並觀察到類似的結果。注意到因為使用高農度的神經營養素，抗體E3和911兩者均非常接近其滴定條件，並預期以類似的程度與NGF結合，因為在這些抗體與NGF之結合親和力上的差異，在這些條件下將較不明顯。
在圖14、15、16和17中出示了這些實驗的結果。數據顯示在培養48小時之後，相對於在每個實驗之陽性對照組中看到存活(例如在飽和NGF濃度的存在下生長之三叉神經元為100%存活，且在飽和BDNF濃度的存在下生長之結節神經元亦為100%存活)的平均存活百分比(±平均值之標準差，每個數據點的n=3)。圖14-15為顯示抗-NGF拮抗劑抗體E3或Fab E3不抑制由NT3和MSP促進之存活的圖表，即使是在高達200 nM的抗體濃度下。相反的，20 nM的抗體E3或Fab E3和Fab 911完全阻斷了NGF-誘發的存活。亦測試老鼠抗-NGF拮抗劑抗體911，並觀察到類似的結果。明 確地說，圖14是顯示在不添加神經營養素(稱為"對照組")、400 pM NGF(稱為"NGF-400 pM")、10 nM NT3(稱為"NT3-10 nM")或600 pM MSP(稱為"MSP-600 pM")的存在下，比較各種濃度(20 nM、2 nM或0.2 nM)之E3 Fab(在圖中稱為"3E")和老鼠抗體911 Fab對E18三叉神經元存活之影響的圖表。圖15是描述在不添加神經營養素(稱為"無因子")、400 pM NGF(稱為"NGF-400 pM")、10 nM NT3(稱為"NT3-10 nM")或600 pM MSP(稱為"MSP-600 pM")的存在下，比較各種濃度(200 nM和80 nM)之E3 Fab和完整抗體，以及老鼠抗體911之完整抗體和Fab對E17三叉神經元存活之影響的圖表。
圖16-17是顯示抗-NGF拮抗劑抗體E3或Fab E3不抑制由BDNF、NT4/5或LIF促進之E17結節神經元存活的圖表。亦測試老鼠抗-NGF拮抗劑抗體911，並觀察到類似的結果。明確地說，圖16是顯示在不添加神經營養素(稱為"無因子")、400 pM BDNF(稱為"BDNF-400 pM")、400 pM NT4/5(稱為"NT4/5-400 pM")或2.5 nM LIF(稱為"LIF-2.5 nM")的存在下，比較各種濃度(200 nM或80 nM)之完整抗體E3(在圖中稱為"3E")、Fab E3、完整抗體911或Fab 911對E17結節神經元存活之影響的圖表。圖17是顯示在不添加神經營養素(稱為"對照組")、400 pM BDNF(稱為"BDNF-400 pM")、400 pM NT4/5(稱為"NT4/5-400 pM")或2.5 nM LIF(稱為"LIF-2.5 nM")的存在下，比較各種濃度(200 nM、20 nM或2 nM)之Fab E3(在圖中稱為"3E")或Fab 911對E17結節神經 元存活之影響的圖表。
實例4：製備哺乳動物表現載體，並在哺乳動物細胞中表現抗體E3
設計並建構三個哺乳動物表現載體，以便用來在哺乳動物細胞中表現抗體E3。
載體Db.911.3E是包括E3抗體之重鏈可變區和人類IgG2a恆定區的表現載體，並適用於重鏈的暫時性或穩定表現。Db.911.3E由符合下列區域的核苷酸序列組成：老鼠細胞巨大病毒啟動基因區(核苷酸1-612)；合成的插入序列(核苷酸619-1507)；DHFR密碼區(核苷酸707-1267)；人類生長激素信號肽(核苷酸1525-1602)；抗體E3重鏈可變區(核苷酸1603-1965)；含有下列突變的人類重鏈IgG2a恆定區：A330P331至S330S331(胺基酸編號係參考野外型IgG2a序列；參見Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624)；SV40晚期聚腺苷酸化作用信號(核苷酸2974-3217)；SV40促進子區域(核苷酸3218-3463)；噬菌體f1區(核苷酸3551-4006)和β內醯胺酶(AmpR)密碼區(核苷酸4443-5300)。Db.911.3E於2003年1月8日存放在ATCC，並分配到ATCC登錄編號PTA-4895。
載體Eb.911.3E是包括E3抗體之輕鏈可變區和人類鏈恆定區的表現載體，並適用於輕鏈的暫時性表現。Eb.911.3E由符合下列區域的核苷酸序列組成：老鼠細胞巨大病毒啟動基因區(核苷酸1-612)；人類EF-1插入序列(核苷酸619-1142)；人類生長激素信號肽(核苷酸1173-1150)；抗體E3 輕鏈可變區(核苷酸1251-1571)；人類鏈恆定區(核苷酸1572-1892)；SV40晚期聚腺苷酸化作用信號(核苷酸1910-2153)；SV40促進子區域(核苷酸2154-2399)；噬菌體f1區(核苷酸2487-2942)和β內醯胺酶(AmpR)密碼區(核苷酸3379-4236)。Eb.911.3E於2003年1月8日存放在ATCC，並分配到ATCC登錄編號PTA-4893。
載體Eb.pur.911.3E是包括E3抗體之輕鏈可變區和人類恆定區的表現載體，並適用於輕鏈的穩定表現。Eb.pur.911.3E由符合下列區域的核苷酸序列組成：老鼠細胞巨大病毒啟動基因區(核苷酸1-612)；人類EF-1插入序列(核苷酸619-1758)；pac基因(嘌羅黴素R)密碼區(核苷酸739-1235)；人類hsp70 5'UTR區(核苷酸1771-1973)；人類生長激素信號肽(核苷酸1985-2062)；抗體E3輕鏈可變區(核苷酸2063-2383)；人類鏈恆定區(核苷酸2384-2704)；SV40晚期聚腺苷酸化作用信號(核苷酸2722-2965)；SV40促進子區域(核苷酸2966-3211)；噬菌體f1區(核苷酸3299-3654)和β內醯胺酶(AmpR)密碼區(核苷酸4191-5048)。Eb.pur.911.E3於2003年1月8日存放在ATCC，並分配到ATCC登錄編號PTA-4894。
如下進行暫時的細胞表現：以每種質體各25微克(即一種含有重鏈的質體和一種含有輕鏈的質體)暫時地共同轉移感染在150毫米培養皿中的CHO和HEK293T細胞。根據製造者的說明，將DNA與100微升脂染胺2000(Invitrogen)混合。容許該DNA-脂質混合物與細胞在不含血清或抗生 素的DMEM/F12培養基中接觸5小時。在該培養之後，為了表現將培養基換成沒有任何添加物的Opti-MEM(Invitrogen)2天。利用後續的培養基更換，連續收穫含有抗體的細胞上清液4次。藉著親和力層析法純化上清液，使用MapSelect蛋白質A樹脂(Amersham biosciences 17：5199-02)。抗體在0.3 M甘胺酸、0.6 M NaCl緩衝溶液，pH 8中與蛋白質A樹脂結合，然後以0.1 M檸檬酸緩衝溶液，pH 3洗脫。立刻以1 M Tris緩衝溶液，pH 8.0中和含有抗體的溶離份，然後在PBS中透析抗體溶離份並濃縮之。
實例5：抗-NGF抗體E3在治療手術後疼痛上是有效的
我們使用模仿手術後疼痛的疼痛模式來評估以抗體E3治療的效力。抗體E3包括含有下列突變的人類重鏈IgG2a恆定區：A330P331至S330S331(胺基酸編號係參考野外型IgG2a序列；參見Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624)；人類輕鏈恆定區；以及在表1A和1B中出示之重和輕鏈可變區。
動物。從Harlan(Wisconsin)購買重量在220-240克之間的雄性Sprague Dawley大鼠，並在手術前先使其適應動物設施的環境1週。
手術。手術是以由Brennan等人Pain 64：493-501(1996)描述的程序為基礎。以在空氣中2%異氟烷的混合物麻醉動物，並在手術期間經由鼻圓錐筒維持麻醉。以聚維酮-碘墊準備右後腳掌的蹠表面，並通過皮膚和筋膜，從離腳後跟邊緣0.5公分開始向著腳趾延伸，做1公分的中央縱 切。使用彎鉗舉起蹠肌，並縱向切開。在起點和插入之間，通過肌肉的全深切開它。在手術期間，藉著經由紗布墊施壓控制出血。以兩個褥式縫法(5-0 ethilon黑色單一纖維)關閉傷口。將這些縫線打結5-6次，鬆鬆地綁住第一個結。將傷口位置塗上桿菌肽溶液。在再度測試行為之前，容許動物在乾淨的籠子裡恢復並休息2小時或更久。
評估靜止疼痛。使用累積疼痛計分來評估與支撐體重有關的疼痛。將動物放在乾淨塑膠籠子中的塑膠網(格子：8平方毫米)上，可在平台上將其升高(高度：18吋)，容許檢查牠們腳掌的底面。在20分鐘的適應期間之後，按0至2的刻度評估體重支撐。若腳掌變白或再度踩在網子上，表示完全支撐體重，則給0分。若偏好使用的腳掌皮膚僅輕觸網子，沒有變白或皮膚凹入，便給1分。若完全不使腳掌碰到網子，便給2分。若大鼠仍在休息，認為縮起腳掌即是2。每隻動物每5分鐘觀察1分鐘，持續30分鐘。使用在½小時期間獲得的6次計分之總合(0-12)，評估切傷腳掌的疼痛。亦計算2分的頻率，並用來評估嚴重疼痛的發生率或動物對腳掌的整體保護。在手術前24小時(基準線)，以及手術後2小時、24小時、48小時和72小時測試每隻動物。在圖1中出示本實驗的結果，其描述在以35毫克/公斤抗-NGF老鼠抗體911治療之動物中觀察到的累積靜止疼痛分數。這些結果證實以抗-NGF抗體治療，顯著地降低了手術後靜止疼痛。體重支撐與動物將如何使用肢體有良好關係，並因此是疼痛減輕的有效測量。
在切開前15小時，以各種濃度的抗體(每公斤動物體重0.004、0.01、0.02、0.1、0.6和1毫克)腹腔內(i.p.)注射E3抗體。陰性對照組沒有接受抗體，但以生理鹽水溶液腹腔內注射。在進行24小時手術後測試之前30分鐘，腹腔內注射0.01毫克/公斤之芬太尼作為陽性對照組。對於每種條件，每個實驗涉及8隻動物(每組n=8)，且對照組有56隻動物。按照上述進行手術並測量累積疼痛分數。在手術後24小時評估靜止疼痛。
如在圖7中所示，當投與0.02毫克/公斤至1毫克/公斤劑量時，人類化抗-NGF抗體E3明顯地在手術後降低了靜止疼痛(p<0.05)。"*"代表明顯與對照組有顯著差異(p<0.05)。以0.02毫克/公斤治療改善疼痛行為，至少像0.01毫克/公斤芬太尼一樣有效。該劑量之芬太尼是該有效類鴉片之正常人類劑量的10倍。
在其他實驗中，測試在手術後投與時，E3抗體降低手術後疼痛的效力。在手術後2小時靜脈內(i.v.)注射抗體E3(0.5毫克/公斤)。對照組沒有接受抗體，但靜脈內注射生理鹽水溶液。進行手術並以在手術後24小時評估的累積疼痛分數表示靜止疼痛。如在圖8中所示，當在切開後2小時投與抗體時，在切開後24小時以抗-NGF抗體治療明顯地(p<0.05)降低了靜止疼痛。這些結果證實當在手術後投與時，E3抗體有效地改善了手術後疼痛。
實例6：在風濕性關節炎之大鼠模式中，評估抗-NGF拮抗劑抗體911之止痛效果
使用發聲測試，調查在以完全福瑞德(Freund's)佐劑(CFA)-誘導之慢性關節炎的大鼠中，抗-NGF抗體911(參見Hongo等人，Hybridoma 19(3)：215-227(2000))的止痛效果，與用來作為參考物的吲哚美辛相比較。
在本研究中包括50隻在實驗初期重150克至220克的雄性Lewis大鼠(LEWIS LEW/Crl Ico)(Charles River Belgium)。在實驗之前飼養所有的動物至少5天，並關在溫度(19.5-24.5℃)、相對溼度(45-65%)和12-小時亮/暗週期-控制的屋子裡，在實驗期間可任意接近經過過濾的自來水和標準小顆粒實驗室食物(U.A.R.,France)。在尾巴上分別標示每隻動物的身分。
在第0天(D0)，藉著皮內注射0.05毫升在礦物油中之丁酸分枝桿菌(Mycobacterium butyricum)(Difco,USA)懸浮液(10毫克/毫升)至尾巴內，在大鼠中誘導關節炎。在第14天(D14)，根據在溫和地彎曲後腳掌時牠們發聲的能力，並藉著使用炎症反應分數評估每個後和前腳掌而得的關節炎指數(參見Kuzuna等人，Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)23：1184-1191(1975)；Pearson等人，Arthritis Rheum.2：440-459(1959))，將關節炎的大鼠納入本研究中。以下列的判斷標準為基礎對動物計分：0分：正常外觀；1分：紅斑；2分：紅斑和輕微的水腫；3分：嚴重的炎症反應但沒有關節僵硬；4分：關節僵硬。本研究只包含在溫和彎曲時發出聲音並得到2或3分的動物。
在本研究中包含四組各10隻動物。第1組(媒劑)，在選 出之後第14天(D14)，以媒劑(生理鹽水)靜脈內投與大鼠。在第18天(D18)，藉著溫和地彎曲後腳掌評估感受傷害的強度，並紀錄每隻動物發聲程度的強度。第2組(4天)，在選出之後第14天，以911(10毫克/公斤)靜脈內投與大鼠。在第18天(D18)，藉著溫和地彎曲後腳掌評估感受傷害的強度，並紀錄每隻動物發聲程度的強度。第3組(24小時)，在注射CFA之後第17天，以911(10毫克/公斤)靜脈內投與大鼠。在24小時之後，藉著溫和地彎曲後腳掌評估感受傷害的強度，並紀錄每隻動物發聲程度的強度。第4組(吲哚美辛)，在第18天(D18)，在口服投與吲哚美辛(10毫克/公斤)之後1小時，藉著溫和地彎曲後腳掌評估感受傷害的強度。亦紀錄每隻動物發聲程度的強度。藉著靜脈內之路徑，在5毫升/公斤的體積下，以盲目和隨機的方式投與受試物質，而在10毫升/公斤的體積下口服投與吲哚美辛。
在表10中出示抗-NGF抗體911的止痛效果。以按mV(平均值±SEM)計對每隻動物紀錄之發聲程度的強度來評估的感受傷害強度，表示每組的結果，並從媒劑-處理組之平均值來計算感受傷害強度的變化百分比。在變異數之單尾分析之後使用剩餘變異數，以Dunnett's檢定判定在治療組和媒劑組之間的統計顯著性(P<0.05)。
表10.在大鼠的完全福瑞德佐劑-誘導之慢性關節炎中，911的止痛效果
以平均值±SEM表示結果每組n=10隻老鼠第0天(D0)：藉著投與CFA誘導慢性關節炎媒劑：生理鹽水
在D14或D17靜脈內投與911(10毫克/公斤)，並在D18進行疼痛測量。僅在D18口服給予吲哚美辛(10毫克/公斤)，並在給藥後1小時進行疼痛測量。Dunnett's檢定：*表示與媒劑-處理組比較有顯著差異P<0.05
如在表10中所示，在風濕性關節炎的大鼠模式中，在單次投與抗體之後24小時或4天，抗-NGF抗體911明顯地降低了疼痛。
實例7：在風濕性關節炎的大鼠模式中，抗-NGF拮抗劑抗體E3和911的藥理學作用
調查在大鼠中以完全福瑞德佐劑(CFA)-誘導之慢性關節炎的模式中，抗-NGF拮抗劑抗體E3和911的藥理學作用(消炎和止痛效果)，與作為內部陽性對照物質之吲哚美辛相比較。藉著測量感受傷害的反應來評估E3和911的止痛效果。藉著腳掌體積、關節炎指數(炎症反應分數)、體重和後腳掌重來評估消炎效果。在實驗結束時，進行腳掌細胞激動素含量(IL-6、IL-1β、TNF-α和TGF-β1)、血清中的循環TGF-β1、E3和911血漿濃度、生物學參數和X-光攝影。
實驗草案
1.研究設計
在本研究中，包括80隻5-週齡的雄性Lewis大鼠(LEWIS Lew/Ico)(Charles River Laboratories-Belgium)。將牠們飼養在溫度(19.5-24.5℃)和相對溼度(45-65%)，12-小時亮/暗週期-控制的屋子裡，在實驗期間可任意接近經過過濾的自來水和標準小顆粒實驗室食物(SAFE,France)。當動物設施收到動物時，以每個籠子5隻飼養，並在任何測試之前先觀察10-天的適應期。在尾巴上分別標示每隻動物的身分。
在本研究中包含五組各10隻動物(5-週齡的雄性Lewis大鼠-LEWIS Lew/Ico，得自Charles River Laboratories-Belgium)：第1組：無關節炎大鼠/生理鹽水(媒劑)，靜脈內積儲注射，n=10；第2組：關節炎大鼠/生理鹽水(媒劑)，靜脈內積儲注射，n=10；第3組：關節炎大鼠/吲哚美辛3毫克/公斤，10天內每天口服，n=10；第4組：關節炎大鼠/E3，1毫克/公斤，靜脈內積儲注射，n=10；第5組：關節炎大鼠/911，10毫克/公斤，靜脈內積儲注射，n=10。以自由物質的觀點來表示劑量(毫克/公斤)。臨時以生理鹽水從母液製備E3和911至想要的濃度。E3 1毫克/公斤：3.41毫升母液(0.88毫克/毫升)適量15毫升生理鹽水。911 10毫克/公斤：12毫升母液(2.5毫克/毫升)適量15毫升生理鹽水。使用0.20微米之滅菌濾紙單元將所有稀釋溶液(在靜脈內注射之前)滅菌。在每次靜脈內注射之前測量稀釋溶液的pH值和滲透壓。在第一次靜脈內注射之前，生理鹽 水、E3和911的滲透壓(毫滲透壓/公升)分別為278、269和308；生理鹽水、E3和911的pH值分別為5.93、6.76、6.71。在第二次靜脈內注射之前，生理鹽水、E3和911的滲透壓(毫滲透壓/公升)分別為280、270和309；生理鹽水、E3和911的pH值分別為5.86、6.72和6.59。
在關節炎誘導之後，第14和第19天藉著靜脈內積儲注射，以編碼和隨機的順序，投與體積5毫升/公斤的E3或911或生理鹽水。在第14和第19天，藉著靜脈內積儲注射給予無關節炎組體積5毫升/公斤的生理鹽水。臨時以1%甲基纖維素製備吲哚美辛。在關節炎誘導之後，在第14至23天，以編碼和隨機的順序，在10天內每天一次口服投與體積10毫升/公斤的吲哚美辛，
2.關節炎的誘導
在第0天(D0)，在70隻大鼠中藉著皮內注射0.05毫升丁酸分枝桿菌懸浮液至尾巴內，誘導關節炎。A組10隻大鼠不接受任何皮內注射(無關節炎大鼠)。在第14天(D14)，根據下列的判斷標準將關節炎的大鼠納入本研究中：與在無關節炎組中的平均腳掌體積(左和右腳掌體積的平均值)相比較，所有被納入的大鼠均展現出增加平均腳掌體積(左和右腳掌體積的平均值)至少0.30毫升(腳掌體積的測量如下述)：當溫和地彎曲時所有被納入的大鼠均發出聲音(感受傷害的反應測量如下述)；且所有被納入的大鼠每隻後腳掌均得到2-3分的關節炎指數(關節炎指數測量如下述)(放棄得0、1或4分的動物)。
3.體重
從第0天到第24天，每天將動物秤重一次(除了在治療前的週末期間：D1、D2、D8、D9、D10)。在早上9：00到12：00之間進行所有的測量，除了在第14天(早上7：30-9：00)和第24天(早上7：30-8：00)之外。
3.腳掌體積測量
使用體積測量器測量每隻大鼠(關節炎和無關節炎大鼠)右和左後腳掌的體積。在下列時間(誘導關節炎之後)進行測量：第14天(在靜脈內積儲注射或口服之前)；和第24天(在最後一次靜脈內積儲注射之後5天，或在最後一次口服投藥之後24小時)。在早上9：00到12：00之間進行所有的測量。由WinDas軟體收集和儲存所有的數據。
4.關節炎指數
使用每隻後和前腳(關節炎大鼠)的炎症計分，評估關節炎指數：0分：正常外觀；1分：紅斑；2分：紅斑和輕微的水腫；3分：嚴重的炎症反應但沒有關節僵硬；4分：關節僵硬。在下列時間(在誘導關節炎之後)進行該評估：第14天(在靜脈內積儲注射或口服投藥之後)；和第24天(在最後一次靜脈內積儲注射之後5天，或在最後一次口服投藥之後24小時)。在下午2：00到3：00之間(D14)和早上8：00到9：00之間(D24)進行所有的測量。由WinDas軟體收集和儲存所有的數據。
5.測量感受傷害的反應(發聲測試)
藉著以4至5秒之間隔，用操作者的手指重複兩次溫和地 彎曲右和左後腳掌，評估感受傷害的反應(關節炎大鼠)。對每隻動物紀錄每隻後腳掌的發聲程度之強度(2次：在右後腳掌：s1和s3；2次：在左後腳掌：s2和s4)。在下列時間(在誘導關節炎之後)進行該評估：第14天(在靜脈內積儲注射或口服投藥之前)；第18天(在第二次靜脈內積儲注射之前，或在口服投藥之後1小時)；以及第24天(在最後一次靜脈內積儲注射之後5天，或在最後一次口服投藥之後24小時)。在早上9：00到12：00之間進行所有的測量，除了D14(早上7：30-9：00)和D24(早上7：30-9：00)。
6.收集血液用來測量E3或911濃度，以及循環中之TGF-β1和血液學參數
在第24天(在測量腳掌體積和關節炎指數，以及測試發聲之後)，在使用異氟烷(以氧氣和一氧化二氮的混合物)之普通麻醉下，藉著毛細管作用以微量吸移管從眼眶後竇中收集血液試樣(大約800-1000微升)。
測量E3或911濃度(第2、4和5組)：將一部分血液試樣收集在含有Li-肝素之試管(保持在冰上)中，並以2500-3000 g離心10分鐘。獲得血漿試樣(至少100微升)，在液態氮中冷凍，儲存在-80℃下。一份試樣稍微有溶血(媒劑-處理的關節炎大鼠#36)。
測量循環中的TGF-β1(第1-2-3-4-5組)：將一部分血液試樣收集在微量試管中，在室溫下製備血清。在試樣收集之後，混合血液並容許在離心之前凝固30分鐘。以大約6000 g離心試管3分鐘。等分每個血液試樣(至少100微升，除了 大鼠#52和#53)，並儲存在-20℃下，直到為了TGF-β1分析而激活試樣為止。從實驗結束開始，這些等份(50個小瓶)可保存6個月。有些試樣稍有溶血(媒劑-處理無關節炎大鼠：#2、#5、#9、#10；媒劑處理的關節炎大鼠：#53、#63；E3-處理的關節炎大鼠：#31、#51；911-處理的關節炎大鼠：#52、#62、#64)。使用人類TGF-β1 ELISA套組(ref.DB100,Batch 212258和213610,R&D Systems-France)測量TGF-β1含量。
為了血液學參數收集血液(第1-2-3-4-5組；50個小瓶)：將一部分血液試樣收集在含有K3-EDTA的試管中(至少100微升)。在收集當天進行參數的判定，不需儲存試樣。以血液學細胞計數器，測量血液學參數，包括紅血球、白血球、血小板、血紅素、血球容積(D24)。沒有測量到一些血液學參數，因為試樣凝固了(媒劑-處理無關節炎大鼠：#10；E3-處理的關節炎大鼠：#59、#67；911-處理的關節炎大鼠：#16)。
7.腳掌細胞激動素含量
在第24天(在最後一次靜脈內積儲注射之後5天，或在最後一次口服投藥之後24小時)(在X-光攝影之後)，將每隻動物的後腳掌(關節炎和無關節炎大鼠)秤重，並收集在已標示的聚乙烯小瓶中。在液態氮中冷凍組織試樣，並儲存在-80℃下。
製備關節勻漿：使用生物-研磨機將冷凍的後腳掌磨碎。然後將粉末狀的後腳掌放在含有3毫升PBS，補充有50 微升抗-蛋白酶雞尾酒的50毫升圓錐形離心管中，並使用Ultra-Turrax均質機在冰上均質化(最大速度的50%)。然後在4℃下以2000xg離心勻漿15分鐘，並通過0.2微米Sartorius濾紙過濾上清液，等分並儲存在-80℃下，直到使用為止。
細胞激動素含量測量：根據製造者的說明，以一式兩份判定TNF-α(大鼠TNF-α ELISA套組，ref.RTA00,Batch 213718,R&D Systems,France)、IL-1β(大鼠IL-1β ELISA套組，ref.RLB00,Batch 212435,R&D Systems,France)、IL-6(大鼠IL-6 ELISA套組，ref.R6000,Batch 211773,214008和214362,R&D Systems,France)和TGF-β1(人類TGF-β1 ELISA套組，ref.DB100,Batch 212258和213610,R&D Systems,France)的細胞激動素含量。將後腳掌勻漿的等份儲存在-80℃下。
8. X-光分析
在第24天，在收集血液之後犧牲動物，並獲得X-光照片(後腳掌)，評估關節病變。X-光分析集中在兩隻後腳掌上的關節糜爛、關節腔、骨膜異常。藉著檢查七個不同的項目來分析所有的放射線照片：軟組織傷害、變形、去礦物質化、關節腔、糜爛、成骨作用和骨膜反應。對每隻動物，分析前六個項目，與檢查較差的後腳無關。藉著檢查尾巴分析骨膜反應。對每個項目，得分是從0(正常)到4(最大傷害)。因此，總分是從0到28。由不知道關於動物(處理或未處理組)任何事情的相同審查員進行放射線照片解讀。
9.觀察
在吲哚美辛投藥之後D23(在D23投藥之前)，一隻動物(#65)因未知的原因死亡。
10.結果的分析和表示
在每個時間點，以每組中10隻大鼠的平均值±S.E.M.來報告所有的結果。以從右和左腳掌體積之平均值計算出的毫升來表示腳掌體積。從4隻腳掌分別獲得之分數的總和來計算關節炎指數。藉著對每隻動物紀錄之發聲程度的強度，按mV計，來評估感受傷害的反應(4個值的平均值：2次/腳掌)。從媒劑-處理關節炎組的平均值計算感受傷害反應的抑制百分比[(媒劑-處理關節炎組之平均值-處理之關節炎組的平均值/媒劑-處理關節炎組之平均值)*100]。以克表示體重。以克表示後腳掌(左和右)的重量。以微微克/毫升表示美之後腳掌的細胞激動素含量(IL-6、IL-1β、TNF-α和TGF-β1)。以微微克/毫升表示TGF-β1的循環含量。從每個參數所獲得之分數的總和，來計算每個參數的放射學指數(去礦物質化、糜爛、骨膜反應、軟組織傷害、關節腔、成骨作用、變形)和總放射學指數(總分)。當等變異數或常態檢定失敗時，藉著Student t檢定或Mann-Whitney Rank Sum檢定，評估在媒劑-處理組(關節炎大鼠)和媒劑-處理組(無關節炎大鼠)之值之間的組內偏差顯著性。藉著變異數ANOVA的1-尾分析，接著是不成對Dunnett t檢定，評估在媒劑-處理組(關節炎大鼠)和E3-和911-和吲哚美辛-處理組之值之間的組內偏差顯著性。認為 P≦0.05的或然率是顯著的。藉著SigmastatTM 體進行所有的統計分析。
結果
1.感受傷害反應(發聲測試)
如同在表11和圖18中所示，在D14，在媒劑-、吲哚美辛-、E3-和911-治療之關節炎組中，感受傷害的反應分別為4147±331、4386±235、4644±367和4468±143。與媒劑-處理之關節炎組相比較(D18：1511±398對5279±326 mV；D24：1552±508對5905±345mV)，吲哚美辛在3毫克/公斤/天口服(持續10天)之後，在D18和D24分別以大約-3768 mV(抑制%：71%)和-4353 mV(抑制%：74%)，強有力且明顯地降低了感受傷害反應。與媒劑-處理之關節炎組相比較(D18：1112±401對5279±326 mV；D24：0±0對5905±345 mV)，E3(在D14和D19，1毫克/公斤靜脈內注射)在D18和D24分別以大約-4167mV(抑制%：79%)和-5905 mV(抑制%：100%)，強有力且明顯地降低了感受傷害反應。與媒劑-處理之關節炎組相比較(D18：1347±492對5279±326 mV；D24：547±307對5905±345 mV)，911(10毫克/公斤靜脈內注射，在D14和D19兩天)在D18和D24分別以大約-3932 mV(抑制%：74%)和-5358 mV(抑制%：91%)，強有力且明顯地降低了感受傷害反應。
表11. 在靜脈內注射(2天：D14-D19)之後，E3和911在風濕性關節炎的大鼠中對感受傷害反應的影響
按照平均值±S.E.M.以mV表示數值每組n=10隻動物，除了吲哚美辛D24(n=9)Dunnett t檢定：*P=0.05對媒劑-處理之關節炎大鼠
2.體重
如表12和圖19中所示，從D0到D14，與關節炎大鼠相比較，在關節炎大鼠中觀察到明顯減少增重，係因為關節炎的建立。在D14(選擇日)，與無關節炎大鼠相比較，關節炎大鼠展現出體重的明顯減少(289±2對217±4克)(Student t檢定P<0.05)。然而，在所有關節炎組中沒有檢測到任何明顯的體重差異(D14)(Dunnett t檢定P>0.05)。與媒劑-治療隻關節炎大鼠相比較，在吲哚美辛-治療組(3毫克/公斤/天，持續10天)中，從D17至D24體重中等並顯著地增加(261±5對218±3克)，在D24有大約43克的最大值。與媒劑-治療之關節炎大鼠相比較，在E3治療(1毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)之後，從D17至D24體重中等並顯著地增加(264±5克對218±3克)，在D24有大約46克的最大值。與 媒劑-治療之關節炎大鼠相比較，在911治療(10毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)之後，從D18至D24體重中等並顯著地增加(265±7克對218±3克)，在D24有大約47克的最大值。
表12.在靜脈內注射(2天：D14-D19)之後，E3和911在風濕性關節炎的大鼠中對體重的影響
按照平均值±S.E.M.表示數值，每組n=10隻動物，除了吲哚美辛的D23和D24(n=9) Dunnett t檢定：*P=0.05對媒劑-處理之關節炎大鼠
3.腳掌體積
在D14，進行隨機化以便從腳掌體積的觀點來看，獲得均一的組別。如同在表13中所示，在D14，在關節炎組中後腳掌體積(右和左腳掌體積)明顯比在無關節炎組中的更大(2.10±0.05對1.44±0.02毫升(Student t檢定P<0.05))。與媒劑-處理之關節炎組相比較，吲哚美辛(3毫克/公斤/天口服持續10天)明顯地降低腳掌體積大約-0.75毫升(D24)(1.59±0.03毫升對2.34±0.08毫升)。與媒劑-處理之關節炎組相比較，E3(1毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)稍微並明顯地增加腳掌體積大約0.37毫升(2.71±0.09毫升對2.34±0.08毫升)。與媒劑-處理之關節炎組相比較，911(10毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)稍微並明顯地增加腳掌體積大約0.36毫升(2.70±0.11毫升對2.34±0.08毫升)。
表13.在靜脈內注射(2天：D14-D19)之後，E3和911在風濕性關節炎的大鼠中對腳掌體積的影響
按照平均值±S.E.M.以毫升表示數值每組n=10隻動物，除了吲哚美辛D24(n=9)Dunnett t檢定：*P=0.05對媒劑-處理之關節炎大鼠
4.關節炎指數
如在表14中所示，在D14，在媒劑-、吲哚美辛-、E3-和911-處理的關節炎組中，關節炎指數分別為10.1±0.8、8.7±0.6、10.2±0.4和9.7±0.7。與媒劑-處理之關節炎組相比較，吲哚美辛在3毫克/公斤/天口服(持續10天)之後，強有力且明顯地降低了關節炎指數(2.7±0.7對10.7±0.6)，最大值大約-8.0。與媒劑-處理之關節炎組相比較，E3(1毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)不影響關節炎指數(11.4±0.4對10.7±0.6)。與媒劑-處理之關節炎組相比較，911(10毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)不影響關節炎指數(10.9±0.7對10.7±0.6)。
表14.在靜脈內注射(2天：D14-D19)之後，E3和911在風濕性關節炎的大鼠中對關節炎指數的影響
按照平均值±S.E.M.表示數值(分數) 每組n=10隻動物，除了吲哚美辛(n=9)Dunnett t檢定：*P=0.05對媒劑-處理之關節炎大鼠
5.腳掌細胞激動素含量
如在表15中所示，在D24，與無關節炎之媒劑-處理組相比較，在關節炎媒劑-處理組中，增加了左和右腳掌的細胞激動素含量，最大值約3.5(IL-1β)、4(TNF-α)和1.8(TGF-β1)倍。至於IL-6含量，在右和左腳掌中，在兩組之間則沒有觀察到明顯的差異。在左和右腳掌中，關節炎組的細胞激動素含量是類似的：IL-6、IL-1β、TNF-α和TGF-β1分別為259.7±38.5對219.2±32.4、4802.8±365.5對4007.1±380.4、17.8±1.6對18.6±1.9和9735.0±1219.8對9161.4±846.1微微克/毫升。與媒劑-處理之關節炎組相比較，吲哚美辛在3毫克/公斤/天口服(持續10天)之後，稍微但明顯地降低了右腳掌中TGF-β1的含量大約1.3倍(7057.4±335.6對9161.4±846.1)，而它並未修改IL-6、TNF-α或IL-1β含量。在左腳掌中亦觀察到類似但不明顯的影響。與媒劑-處理之關節炎組相比較，E3(1毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)不影響在兩隻腳掌中的IL-6、IL-1β、TNF-α或TGF-β1含量。與媒劑-處理之關節炎組相比較，911(10毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)增加了在右腳掌中的IL-1β含量(6215.3±666.7對4007.1±380.4)。它對在兩隻腳掌中其他的細胞激動素含量並無影響。
表15. 在靜脈內注射(2天：D14-D19)之後，E3和911在風濕性關節炎的大鼠中對細胞激動素含量的影響
按照平均值±S.E.M.以微微克/毫升表示數值每組n=10隻動物，除了無關節炎/媒劑(右腳掌)，關節炎/媒劑(左腳掌)和吲哚美辛(n=9)Dunnett t檢定：*P=0.05對媒劑-處理之關節炎大鼠
6.循環TGF-β1的測量
如在表16中所示，在D24，與無關節炎之媒劑-處理組相比較，在關節炎媒劑-處理組中增加了血清TGF-β1含量(81715.7±1984.1對60269.9±2142.8)。與媒劑-處理之關節炎組相比較，吲哚美辛在3毫克/公斤/天口服(持續10天)之後，明顯地減少了血清TGF-β1的含量大約1.5倍(57222.2±3194.1對81715.7±1984.1)。E3(1毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)和911(10毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)明顯地減少了血清TGF-β1含量，使得在E3-和911-處理組中的細胞激動素含量可與在媒劑-處理之無關節炎組 中觀察到的相比擬(分別為69408.8±3926.7和67214.5±3649.4對60269.9±2142.8)。
表16.在靜脈內注射(2天：D14-D19)之後，E3和911在風濕性關節炎的大鼠中對血清TGF-β1含量的影響
按照平均值±S.E.M.以微微克/毫升表示數值每組n=10隻動物，除了無關節炎/媒劑(右腳掌)，關節炎/媒劑(左腳掌)和吲哚美辛(n=9)Dunnett t檢定：*P=0.05對媒劑-處理之關節炎大鼠
7.血液學參數
如在表17中所示，與媒劑-處理之無關節炎大鼠相比較，在媒劑-處理之關節炎大鼠中血液學參數，如白血球和血小板是較高的(Student t檢定P>0.05)，而紅血球、血紅素和血球容積則未改變(Student t檢定P>0.05)。與媒劑-處理之關節炎組相比較，吲哚美辛在3毫克/公斤/天口服(持續10天)之後，不影響血液學參數。與媒劑-處理之關節炎組相比較，E3(1毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)不影響血液學參數。與媒劑-處理之關節炎組相比較，911(10毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)不影響血液學參數。
表17. 在靜脈內注射(2天：D14-D19)之後，E3和911在風濕性關節炎的大鼠中對血液參數的影響(在D24測量)
按照平均值±S.E.M.表示數值Anova：P>0.05對媒劑-處理之關節炎大鼠
7.後腳掌重量
如在表18中所示，在媒劑-處理之關節炎大鼠中的左和右後腳掌重量比在媒劑-處理之無關節炎大鼠中的更高(分別為3.43±0.11對1.98±0.01和3.32±0.12對1.99±0.02克)(Student t檢定或Mann-Withney P<0.05)。與媒劑-處理之關節炎組相比較，吲哚美辛在3毫克/公斤/天口服(持續10天)之後，明顯地減少了後腳掌重量(左後腳掌：2.23±0.04對3.43±0.11克；右後腳掌：2.20±0.05對3.32±0.12克)。與媒劑-處理之關節炎組相比較，E3(1毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)僅明顯增加了左後腳掌重量(左後腳掌：3.86±0.14對3.43±0.11克；右後腳掌3.72±0.13對3.32±0.12克)。與媒劑-處理之關節炎組相比較，911(10毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)僅明顯增加了右後腳掌重量 (左後腳掌：3.73±0.12對3.43±0.11克；右後腳掌：3.83±0.15對3.32±0.12克)。
表18.在靜脈內注射(2天：D14-D19)之後，E3和911在風濕性關節炎的大鼠中對後腳掌重量的影響(在D24測量)
按照平均值±S.E.M.以克表示數值每組n=10隻動物，除了吲哚美辛(n=9)Dunnett t檢定：*P=0.05對媒劑-處理之關節炎大鼠
8. X-光分析
如在表19中所示，在媒劑-處理之無關節炎大鼠中觀察到0.0±0.0的總分。媒劑-處理之關節炎大鼠有15.1±1.3之總分，並有高分的去礦物質化(2.4±0.3)、糜爛(2.7±0.3)、軟組織傷害(3.1±0.2)和關節腔(3.3±0.2)，中間分數的骨膜反應(1.0±0.3)、成骨作用(0.8±0.2)和變形(1.8±0.2)。與媒劑-處理之關節炎大鼠相比較，吲哚美辛(3毫克/公斤/天口服，持續10天)強有力且明顯地減少總分大約10.7(4.4±0.9對15.1±1.3)。與媒劑-處理之關節炎組相比較，E3(1毫克/ 公斤靜脈內，在D14和D19)不影響總分(14.2±1.3對15.1±1.3)。與媒劑-處理之關節炎組相比較，911(10毫克/公斤靜脈內，在D14和D19)不影響總分(15.4±1.0對15.1±1.3)。
表19.在靜脈內注射(2天：D14-D19)之後，E3和911在風濕性關節炎的大鼠中對X-光參數的影響
按照平均值±S.E.M.表示數值(分數)每組n=10隻動物，除了吲哚美辛(n=9)Dunnett t檢定：*P=0.05對媒劑-處理之關節炎大鼠
結論
在上述的實驗條件下，E3(1毫克/公斤靜脈內，2天：D14-D19)和911(10毫克/公斤靜脈內，2天：D14-D19)顯示出強的止痛效果，但在本關節炎模式中未顯示出明顯的消炎效果。
實例8：不同劑量之抗-NGF抗體E3在風濕性關節炎之大鼠模式中的效力
藉著檢查在E3投藥與疼痛降低之間的劑量反應關係，進一步調查E3在關節炎大鼠中產生疼痛降低的能力。按照上述以佐劑處理大鼠，誘導關節炎。使用10隻未注射佐劑的大鼠作為無關節炎對照組。在佐劑注射的14天之後，以上述的判斷標準為基礎，選出適任本研究的動物，隨機分成8組每組10隻大鼠，並測試其發聲反應的強度。然後在14天按照上述給藥，使用生理鹽水，或0.003毫克/公斤、0.01毫克/公斤、0.03毫克/公斤、0.1毫克/公斤、0.3毫克/公斤、1毫克/公斤或5毫克/公斤的E3抗體。在第16、18、20和24天測試動物的發聲反應。在發聲測試之後第18天，再度對動物投與生理鹽水或相同劑量的E3。在第14天開始，每天亦將動物秤重。因此在第14和18天，以特定劑量之抗體或生理鹽水對動物投藥兩次，並在第14、16、18、20和24天評估疼痛5次。在表20-22和圖20-22中出示數據。
表20.不同劑量之E3在風濕性關節炎的大鼠中對感受傷害反應的影響，按平均值±s.e.m.以mV表示發聲強度
藉著使用二-尾ANOVA，與在以媒劑處理之關節炎動物與以特定劑量抗體E3處理的那些之間逐對獲得的結果相比較，以統計方式分析以各種劑量之抗-NGF抗體E3處理動物，對疼痛誘導之發聲(在表20中出示數據)的影響。在所有受試含量的E3處均有極為顯著的影響(p<0.0001)。即使是最低的受試劑量(0.003毫克/公斤之E3)，在發聲上的差異亦是明顯的(p<0.0001)。
如在表20和圖20中所示，與上文的實驗一致，以1毫克/公斤之抗體E3處理，顯示快速和強烈的疼痛減輕。在2天內(最早的測試時間點)，發聲強度降低90%。以較低濃度之E3處理，亦提供強烈的疼痛減輕，雖然較低的劑量顯示疼痛減輕花費稍長的時間。在第24天效力可能都明顯地降低，除了最高的受試劑量，因為血漿E3含量的實際含量降低次於主題大鼠的免疫反應。似乎像0.003毫克/公斤這樣低的劑量，在本模式中亦提供了至少部分的疼痛減輕。
表21.不同劑量之E3在風濕性關節炎的大鼠中對體重的影響(在第14天測量)
表22.不同劑量之E3在風濕性關節炎的大鼠中對體重的影響(在第0天測量)
藉著使用二-尾ANOVA，與在以媒劑處理之關節炎動物與以特定劑量抗體E3處理的那些之間逐對獲得的結果相比較，以統計方式分析以各種劑量之抗-NGF抗體E3處理動物對體重的影響。使用在第14天對體重標準化的數據(表21)，0.03毫克/公斤E3之劑量結果明顯地改變了體重(p<0.005)。在所有較高劑量之E3處，在處理和未處理關節炎動物之間的差異均是顯著的(p=或<0.0001)。使用在第0天對體重標準化的數據(表22)，0.03毫克/公斤E3之劑量結果明顯地改變了體重(p<0.002)。在所有較高劑量之E3處，在處理和未處理關節炎動物之間的差異均是顯著的(p<0.0001)。
再度與稍早的研究一致，以E3處理的大鼠顯示出比生理鹽水處理之關節炎大鼠更不明顯的體重喪失(表22和圖22)。事實上，以高劑量抗體E3處理的大鼠，體重喪失的恢復比其無關節炎之隊友更早，且實際增重更快(表21和圖21)。
實例9. 抗-NGF抗體E3在因膝蓋骨關節炎而有中等至嚴重疼痛之患者中的止痛效果
在本隨機、安慰劑-對照、雙盲、劑量-逐漸升高的研究中，在因膝蓋骨關節炎而有中等至嚴重疼痛的患者中，比較抗-NGF抗體E3之單次靜脈內給藥(3微克/公斤、10微克/公斤、30微克/公斤、100微克/公斤或300微克/公斤)與安慰劑的止痛效果。使體驗到因膝蓋骨關節炎而有中等-至- 嚴重疼痛，但在其他方面整體健康良好的成年男女(年齡在35至65之間)加入本研究中。在篩選期間內，患者必須在投與抗-NGF抗體E3之前，先中斷關節炎藥物，如NSAIDs、環氧化酶第2型(COX-2)抑制劑和鴉片製劑至少14天。容許患者使用對乙醯胺基酚或布洛芬的解救藥物，以實驗室發現或過去的醫療病史為基礎而有一些限制。有些患者在研究期間採用解救藥物，但在投與抗-NGF抗體E3之前和之後2天不能吃解救藥物。
34位患者參加本研究，並在研究第-1、1和2天經評估成為住院病人。在第1天早晨發生抗-NGF抗體E3的投藥。使用電子日誌紀錄膝蓋疼痛指數，以及在門診和家裏使用的解救藥物。以安慰劑治療10位患者。以抗-NGF抗體E3治療24位患者：3微克/公斤(第1隊)、10微克/公斤(第2隊)和30微克/公斤(第3隊)每種劑量各4位患者；100微克/公斤(第4隊)和300微克/公斤(第5隊)每種劑量各6位患者。所使用的安慰劑是無菌的0.9%氯化鈉注射，USP(生理鹽水)。抗-NGF抗體E3是冷凍液體調配物，由在10 mM組胺酸、275 mM蔗糖、0.01%聚山梨糖醇20,pH 6.0中的10毫克/毫升抗體所組成。在靜脈內投藥之前1小時，將冷凍的抗體融解，並以氯化鈉注射液，USP稀釋。以個體第-1天之體重為基礎來計算每位患者的體積，並指定劑量含量，第1隊的範圍是從3-6 cc，第2隊是10-20 cc，第3隊是30-60 cc，而第4和第5隊是100 cc。關於第1和第2隊，在3至5分鐘內藉著緩慢靜脈內積儲投與抗體E3，接著以5 cc氯化鈉注射 液，USP靜脈內沖洗。至於第3-5隊，經由輸液幫浦以100 cc/小時投與抗體E3，接著以5 cc氯化鈉注射液，USP靜脈內沖洗，並中止IV。在每隊中，藉著與抗體E3相同的方式緩慢積儲注射或連續輸液投與安慰劑(氯化鈉注射液，USP)。
在住院2天之後，讓患者出院回家。依據各隊的劑量含量，持續評估他們的疼痛程度，持續至抗體E3投藥之後28天(第1、第2和第3隊)，或高達抗體E3投藥之後181天(第4和第5隊)。在所有患者中進行定期安全性評估，持續181天。
在給藥前和投與抗體E3之後多次評估止痛效果。對於目前的膝蓋疼痛指數，使用範圍從0-100的核准電子VAS，具有101點分辨率。每天提示患者四次並教導患者指出那時關節炎疼痛在膝蓋指數中的等級。在步行期間對於膝蓋指數亦使用範圍從0-100的核准電子VAS，具有101點分辨率。每天與第四次目前膝蓋疼痛指數VAS同時完成在步行期間對膝蓋疼痛指數的VAS。
在第-8和第-7天配給收集資料的電子日誌，從第-8到第-2天進行電子日誌服從的篩選評估，判定特定個體使用電子日誌是否順利。教導個體每天四次完成日誌。使用在篩選期間紀錄的平均VAS作為評估效果的基準線。
亦使用WOMAC(Western Ontario and McMaster Universities Arthritis Scale)3.1骨關節炎指數VA.1版© 來評估關節炎疼痛。WOMAC 3.1TM 包括分成三個領域的24個問題：疼痛(5 個問題)、僵硬(2個問題)和身體功能(17個問題)。Bellamy等人，J.Rheumatol 15：1833-40(1988)；以及Bellamy等人，Semin.Arthritis Rheum.18：14-7(1989)。身體功能領域提供執行每天生活之活動能力的資訊。在設計的出診訪問期間，患者直接在電子日誌上進行測試，使用範圍從0-100之核准的電子VAS，具有101個點分辨率。藉著判定組成問題之VAS分數的平均值，對每個領域計分。藉著判定分別來自三個領域之分數的平均值，計算總WOMAC 3.1TM 的分數。患者亦須經由電子日誌報告解救藥物的使用。
按照與基準線(在篩選期間的疼痛程度)的改變評估成果，以疼痛強度差異(PID)或不同劑量含量的總和疼痛強度差異(SPID)來表示。使用共變數分析(ANCOVA)模式，分析在活動測量上與基準線的變化，以處理方式作為主要因子，並以基準線作為共變量。關於平均值和平均變化，使用Dunnett's檢定進行抗體E3與安慰劑的比較。使用Tukey-Ciminera-Heyse趨勢檢定，來評估劑量-反應關係。
如在圖24中所示，在每個受試劑量中觀察到在單次投與抗-NGF抗體E3之後，平均每日疼痛強度的降低。通常，在較高劑量(30微克/公斤、100微克/公斤和300微克/公斤)處理組中，降低疼痛強度的效果比較低劑量(3微克/公斤和10微克/公斤)處理組更持久。如在圖25中所示，在投與100微克/公斤的E3之後，疼痛強度的降低至少持續80天。
下表23顯示與基準線相比較，每種E3劑量之2-8天、2-14天、2-21天和2-28天的總和疼痛強度差異(SPID)。使用 ANCOVA進行統計分析。表23指出在單次投與抗-NGF抗體E3之後，疼痛降低在統計學上是顯著的(p<0.05)。
表23.與基準線相比較，各種時間間隔之總和疼痛強度差異
進行統計分析，不調整或為了多重比較而調整。在每個時間點，在括弧中的第一排p值是不調整的；在括弧中的第二排p值是以Dunnett's調整的。
如圖26所示，藉著單次投與抗-NGF抗體E3，對每種受試之E3劑量，在SPID上最大降低的百分比從第2至第14天達到大約45%至大約65%，並對於10微克/公斤、30微克/公斤、100微克/公斤和300微克/公斤之E3劑量，從第2至第28天達到大約45%至大約60%。
如在圖27中所示，抗-NGF抗體E3的投藥亦從第1至第28天降低了WOMAC分數。在100微克/公斤劑量之E3下，明 顯降低了疼痛、身體功能和僵硬分數。這些數據暗示抗-NGF抗體的單次投藥，在患有骨關節炎的患者中不僅降低了疼痛，亦改善了身體功能和僵硬。
生物材料的存放
下列材料已經存放於美國典型培養物收集中心(American Type Culture Collection),10801 University Boulevard,Manassas,Virginia,USA(ATCC)：
載體Eb.911.3E是編碼E3輕鏈可變區的多核苷酸；載體Eb.pur.911.3E是編碼E3輕鏈可變區的多核苷酸，且載體Db.911.3E是編碼E3重鏈可變區的多核苷酸。
在國際承認用於專利之微生物保存布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder)(布達佩斯條約)之下進行該存放。這確保從存放日起，維持存放物可存活的培養物30年。在布達佩斯條約的期限和在Rinat Neuroscience Corp.和ATCC同意的題目之下，將由ATCC利用存放物，其在發布適合的美國專利，或主張對大眾開放任何美國或外國專利申請案時，對大眾確保永久和不受限地利用存放培養物之子代，無論誰先到，並對由美國專利 和商標管理員(U.S.Commissioner of Patents and Trademarks)判定，根據35 USC第122節和依據其之管理員規則(包括37 CFR第1.14節，並特別參考886 OG 638)賦予資格者確保子代的利用性。
本申請案的受託人已經同意，若在存放處的材料培養物當在適當的條件下培養時死亡或喪失或遭到破壞，將通告以其他的相同物迅速地置換該材料。不可將存放材料的利用性解釋為實施本發明的執照，違反在根據其專利法律之任何政府權力之下賜與的權力。
抗體序列
重鏈 可變區 (Kabat CDRs加下標線 )；Chothia CDRs為粗斜體)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLI G YDLN WIRQPPGKGLEWIG IIWGDGTTD YNSAVKS RVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GGYWYATSYYFDY WGQGTLVTVS(SEQ ID NO：1)
輕鏈 可變區 (Kabat CDRs加下標線 )；Chothia CDRs為粗斜體)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISNNLN WYQQKPGKAPKLLIY YTSRFHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QQEHTLPYT FGQGTKLEIKRT(SEQ ID NO：2)E3重鏈衍生的CDRs CDRH1：GFSLIGYDLN(SEQ ID NO：3)CDRH2：IIWGDGTTDYNSAVKS(SEQ ID NO：4)CDRH3：GGYWYATSYYFDY(SEQ ID NO：5)E3輕鏈衍生的CDRs CDRL1：RASQSISNNLN(SEQ ID NO：6)CDRL2：YTSRFHS(SEQ ID NO：7)CDRL3：QQEHTLPYT(SEQ ID NO：8) 老鼠單株抗體911衍生的CDRs 911重鏈衍生的CDRs CDRH1：GFSLIGYDIN(SEQ ID NO：9)CDRH2：MIWGDGTTDYNSALKS(SEQ ID NO：10)CDRH3：GGYYYGTSYYFDY(SEQ ID NO：11)911輕鏈衍生的CDRs；CDRL1：RASQDISNHLN(SEQ ID NO：12)CDRL2：YISRFHS(SEQ ID NO：13)CDRL3：QQSKTLPYT(SEQ ID NO：14)
E3重鏈胺基酸序列(完整)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：16)
3E輕鏈胺基酸序列(完整抗體)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHXVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：17)
3E重鏈核苷酸序列(完整抗體) CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACTGGATCCGACAGCCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGGTGATGGAACCACAGACTATAATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGGTACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCACCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAA(SEQ ID NO：65)
3E重鏈可變功能部位核苷酸序列CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACTGGATCC GACAGCCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGGTGATGGAACCACAGACTATAATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGGTACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：66)
3E輕鏈核苷酸序列(完整抗體)GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGTCACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACTCAGGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTTCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACMAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA(SEQ ID NO：67)
3E輕鏈可變功能部位核苷酸序列GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGTCACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACTCAGGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGC(SEQ ID NO：68)
在本文中描述之實例和具體實施例當然僅為了解釋之目的，並將對熟諳此藝者提出各種來自前者的修改或變化，且亦將其納入本申請案的精神和範圍內。
圖1A顯示E3抗體之重鏈可變區的胺基酸序列(標示為"6"和"5+親和力成熟H3")。分別藉著加下標線的原文和粗斜體的原文來描述Chothia CDRs和Kabat CDRs。圖1A亦顯示下列重鏈可變區胺基酸序列的直線排列：(1)老鼠911抗體之CDRs H1(SEQ ID NO：9)，H2(SEQ ID NO：10)及H3(SEQ ID NO：11)；(2)VH4-59人類生殖種系接受者序列(標示為"VH4-59"或"2")(SEQ ID NO：69)；(3)以老鼠抗體911之衍生CDRs移植的接受者序列(標示為"CDR移植"或"3")(SEQ ID NO：70)；(4)CDR移植之接受者序列，包括V71K取代(標示為"3+一架構突變"或"4")(SEQ ID NO：71)；(5)含有親和力成熟CDRs H1和H2的純種系(標示為"5"或"4+親和力成熟H1,H2")(SEQ ID NO：72)；以及抗體E3(如上述)(SEQ ID NO：1)。
圖1B顯示E3抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列(標示為"5"或"4+親和力成熟L3")。分別藉著加下標線的原文和粗斜體的原文來描述Chothia CDRs和Kabat CDRs。圖1B亦顯示下列輕鏈可變區胺基酸序列的直線排列：(1)老鼠911抗體之CDRs L1(SEQ ID NO：12)，L2(SEQ ID NO：13)及L3(SEQ ID NO：14)；(2)O8人類生殖種系接受者序列(標示為"O8"或"2")(SEQ ID NO：73)；(3)以老鼠抗體911之衍生CDRs移植的接受者序列(標示為"CDR移植"或"3")(SEQ ID NO：74)；(4)CDR移植之接受者序列(標示為"3+親和力成熟L1,L2"或 "4")(SEQ ID NO：75)；(5)含有親和力成熟CDRs L1和L2的純種系(標示為"5"或"4+親和力成熟L3")；以及抗體E3(如上述)(SEQ ID NO：2)。
圖2顯示包括編碼抗體E3之重鏈可變區之多核苷酸序列的多核苷酸序列(SEQ ID NO：76)。
圖3顯示包括編碼抗體E3之輕鏈可變區之多核苷酸序列的多核苷酸序列(SEQ ID NO：77)。
圖4是在各種濃度之人類和大鼠NGF的存在下，敘述E13.5神經元之NGF-依賴性存活的圖表。X軸代表NGF濃度(毫微克/毫升)且Y軸代表計算出的神經元。
圖5為在0.04毫微克/毫升人類NGF(約1.5 pM；在下圖中出示)或0.4毫微克/毫升人類NGF(約15 pM；在上圖中出示)的存在下，比較各種Fabs之NGF阻斷效力的圖表。在各種濃度的Fab E3；老鼠911 Fab；和Fab H19-L129與Fab 8L2-6D5中，評估E13.5老鼠三叉神經元的存活。在每個NGF濃度下，計算每個Fab的IC50 (以pM計)，並在表9中出示。Fab E3在15 pM人類NGF的存在下以大約21 pM之IC50 ，並在1.5 pM人類NGF的存在下以大約1.2 pM之IC50 ，強有力地阻斷了人類NGF-依賴性的三叉神經元存活。Fab 3C和H19-L129亦強有力地阻斷了人類NGF-依賴性的三叉神經元存活。在兩圖中，X軸代表抗體濃度(nM)且Y軸代表計算出的神經元。1.5 pM之NGF約為IC50 ，而15 pM則代表NGF之飽和濃度。
圖6為在0.04毫微克/毫升大鼠NGF(約1.5 pM；在下圖中出示)或0.4毫微克/毫升大鼠NGF(約15 pM；在上圖中出示) 的存在下，比較各種Fabs之NGF阻斷效力的圖表。在各種濃度的Fab E3；老鼠Fab 911；和Fab H19-L129與Fab 8L2-6D5中，按照上述評估E13.5老鼠三叉神經元的存活。在每個NGF濃度下，計算每個Fab的IC50 (以pM計)，並在表9中出示。Fab E3在15 pM大鼠NGF的存在下以大約31.6 pM之IC50 ，並在1.5 pM大鼠NGF的存在下以大約1.3 pM之IC50 ，強有力地阻斷了人類NGF-依賴性的三叉神經元存活。Fab 3C和H19-L129亦強有力地阻斷了大鼠NGF-依賴性的三叉神經元存活。1.5 pM之NGF約為IC50 ，而15 pM則代表NGF之飽和濃度。在兩圖中，X軸代表抗體濃度(nM)且Y軸代表計算出的神經元。
圖7是敘述在手術後24小時評估靜止疼痛，並顯示以0.02毫克/公斤、0.1毫克/公斤、0.6毫克/公斤或1毫克/公斤之抗-NGF抗體E3治療降低了疼痛的圖表。"*"表示與陰性對照組有統計學上的顯著差異(p<0.5)。
圖8是敘述在手術後24小時評估靜止疼痛，並顯示以0.5毫克/公斤之抗-NGF抗體E3治療，當在手術後2小時注射，顯著(p<0.05)地降低了靜止疼痛的圖表。
圖9是顯示人類NGF與老鼠抗體911(Fab)之結合親和力的BIAcore分析之結果的圖表。老鼠抗體911以3.7nM之KD ，8.4x10-5 s-1 之koff 和2.2x104 Ms-1 之kon 與人類NGF結合。
圖10是顯示人類NGF與抗體E3(Fab)(稱為"3E Fab")之結合親和力的BIAcore分析之結果的圖表。E3抗體以0.07 nM之KD (並以大約6.0x105 M-1 s-1 之kon 和大約4.2x10-5 s-1 之koff ) 與人類NGF結合。
圖11是敘述抗體E3阻斷NGF與其受體trkA和p75之交互作用的圖表，係藉著在NGF和trkA(以黑色圓形表示)以及NGF和p75(以空心正方形表示)之間檢測到的結合百分比來評估。X軸代表抗體3E(Fab)之濃度，而Y軸代表NGF結合(最大值RU的百分比)。增加Fab 3E之濃度，阻斷了NGF與p75和trkA兩者的交互作用，可藉著減少的信號來表示(以RU來測量)。當抗體E3(Fab)濃度等於NGF濃度時，沒有觀察到任何NGF結合(以信號為0來表示)。
圖12是敘述完整抗體E3和Fab E3之人類NGF阻斷能力的圖表。在人類NGF和各種濃度之Fab E3及抗體E3的存在下，評估E13.5老鼠三叉神經元的存活。X軸代表NGF結合位置(nM)，而Y軸代表三叉神經(TG)元的標準化計數。當將完整抗體和Fab之濃度對NGF結合位置之數目標準化(Fab有一個結合位置，而完整抗體有兩個結合位置)時，完整抗體E3和Fab 3E，對三叉神經元之NGF-依賴性存活顯示出類似的抑制程度。
圖13是敘述在0.4毫微克/毫升人類NGF(飽和條件)的存在下，各種濃度(20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128和0.0 nM)的抗體E3(實心三角形；稱為"3E")、抗體911(實心圓形)和trkA受體免疫黏附素(immunoadhesin)(陰暗的正方形；稱為"trkA-Fc")，抑制E13.5三叉神經元之NGF-依賴性存活的能力的圖表。X軸代表抗體濃度(nM)且Y軸代表計算出的神經元。這些結果證實抗體E3阻斷了NGF，明顯比 老鼠單株抗-NGF抗體911或trkA免疫黏附素更好。
圖14是敘述抗-NGF拮抗劑抗體E3(在圖中稱為"3E")或Fab 911不能抑制由NT3、NT4/5和MSP促進之神經元存活的圖表，甚至是高達200 nM的抗體濃度。數據代表在培養48小時之後，相對於在每個實驗之陽性對照組中觀察到存活(在飽和NGF濃度的存在下生長的三叉神經元100%存活)的平均存活百分比(±平均值之標準差，每個數據點n=3)。在不加神經營養素(稱為"對照組")、400 pM NGF(稱為"NGF-400 pM")、10 nM NT3(稱為"NT3-10 nM)或600 pM MSP(稱為"MSP-600 pM")的存在下，使用各種濃度(20 nM、2 nM或0.2 nM)的E3 Fab(在圖中稱為"3E")和老鼠抗體911 Fab。
圖15是敘述抗-NGF拮抗劑抗體E3(Fab或完整抗體)(在圖中稱為"3E")或老鼠抗體911(Fab或完整抗體)不能抑制由NT3、NT4/5和MSP促進之神經元存活的圖表，甚至是高達200 nM的抗體濃度。在不加神經營養素(稱為"無因子")、400 pM NGF(稱為"NGF-400 pM")、10 nM NT3(稱為"NT3-10 nM)或600 pM MSP(稱為"MSP-600 pM")的存在下，使用各種濃度(200 nM和80 nM)的E3 Fab和完整抗體，以及老鼠抗體911完整抗體和Fab。
圖16是敘述抗-NGF拮抗劑抗體E3或Fab E3不能抑制由BDNF、NT4/5或LIF促進之E17結節神經元存活的圖表。亦測試老鼠抗-NGF拮抗劑抗體911，並觀察到類似的結果。在不加神經營養素(稱為"無因子")、400 pM BDNF(稱為 "BDNF-400 pM")、400 pM NT4/5(稱為"NT4/5-400 pM")或2.5 nM LIF(稱為"LIF-2.5 nM")的存在下，測試各種濃度(200 nM或80 nM)的完整抗體E3(在圖中稱為"3E")、Fab E3、完整抗體911或Fab 911。
圖17是敘述抗-NGF拮抗劑抗體E3或Fab E3不能抑制由BDNF、NT4/5或LIF促進之E17結節神經元存活的圖表。在不加神經營養素(稱為"對照組")、400 pM BDNF(稱為"BDNF-400 pM")、400 pM NT4/5(稱為"NT4/5-400 pM")或2.5 nM LIF(稱為"LIP-2.5 nM")的存在下，測試各種濃度(200 nM、20 nM、2 nM)的Fab E3(在圖中稱為"E3")或Fab 911。
圖18是在第14和19天投與抗-NGF抗體(E3和911)之後，證實在關節炎大鼠(風濕性關節炎模式)中之感受傷害反應的圖表。將E3(1毫克/公斤，靜脈內，第14和19天)、911(10毫克/公斤，靜脈內，第14和19天)或吲哚(吲哚美辛(indomethacin)3毫克/公斤，10天內每天口服)投與關節炎老鼠。以平均值±sem，按mV計來表現發聲強度值。
圖19是在第14和19天投與抗-NGF抗體之後，證實抗-NGF抗體在關節炎大鼠(風濕性關節炎模式)中對體重之影響的圖表。將E3(1毫克/公斤，靜脈內，第14和19天)、911(10毫克/公斤，靜脈內，第14和19天)或吲哚(吲哚美辛3毫克/公斤，10天內每天口服)投與關節炎老鼠。以平均值±sem，按公克計來表現體重值。
圖20是在第14和18天投與不同劑量之抗-NGF抗體 E3(0.003毫克/公斤、0.03毫克/公斤、0.3毫克/公斤和5毫克/公斤)之後，證實在關節炎大鼠(風濕性關節炎模式)中之感受傷害反應的圖表。以平均值±sem，按mV計來表現發聲強度值。
圖21是在第14和18天投與不同劑量之抗-NGF抗體E3(0.03毫克/公斤、0.3毫克/公斤和5毫克/公斤)之後，證實在關節炎大鼠(風濕性關節炎模式)中抗-NGF抗體E3對第14天的體重百分比(對第14天標準化)之影響的圖表。
圖22是在第14和18天投與不同劑量之抗-NGF抗體E3(0.03毫克/公斤、0.3毫克/公斤和5毫克/公斤)之後，證實在關節炎大鼠(風濕性關節炎模式)中抗-NGF抗體E3對體重喪失之影響的圖表。將體重值對第0天標準化。
圖23敘述E3重鏈可變區胺基酸序列(圖23A)和輕鏈可變區胺基酸序列(圖23B)，使用連續編號Kabat編號和Chothia編號來編號。
圖24敘述在投與抗-NGF抗體E3之後，與在第0天之基準線相比較，在平均每日疼痛強度上的改變。Y軸代表與在第0天之平均每日疼痛強度相比較，在平均每日疼痛強度(VAS分數)上的降低。X軸代表在投與抗-NGF抗體E3之後的天數。
圖25敘述在投與抗-NGF抗體E3之後的平均VAS分數。"SE"意指標準差。
圖26敘述在投與抗-NGF抗體E3之後從第2到第14天，和從第2到第28天，在總計疼痛強度差異(SPID)上的最大降 低百分比。
圖27敘述在投與不同劑量(3微克/公斤、10微克/公斤、30微克/公斤、100微克/公斤和300微克/公斤)的抗-NGF抗體E3之後從第1到第28天，對WOMAC之最小二乘方平均值(LSM)反應、疼痛次量表(subscale)、身體功能次量表和僵硬次量表。"SE"意指標準差。X軸代表所投與之抗-NGF抗體E3的劑量。"*"表示在Dunnett's檢定之下，與基準線相比較P<0.05。
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Claims (15)

  1. 一種NGF拮抗劑之用途，其係用於製備在患有骨關節炎的個體中改善身體功能之藥物，其中該NGF拮抗劑是抗-NGF拮抗劑抗體或其抗原結合片段。
  2. 如請求項1之用途，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是單株抗體。
  3. 如請求項1或2之用途，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是人類化抗體。
  4. 如請求項1或2之用途，其中該抗-NGF拮抗劑抗體或其抗原結合片段與人類NGF結合。
  5. 如請求項4之用途，其中該抗-NGF拮抗劑抗體或其抗原結合片段與囓齒類NGF結合。
  6. 如請求項1或2之用途，其中該抗-NGF拮抗劑抗體或其抗原結合片段：(a)以低於大約2nM之KD與NGF結合；(b)以大約100pM或更低之IC50，抑制老鼠E13.5三叉神經元之人類NGF-依賴性存活，其中該IC50是在大約15pM人類NGF的存在下測量到的；以及(c)以大約10pM或更低之IC50，抑制老鼠E13.5三叉神經元之人類NGF-依賴性存活，其中該IC50是在大約1.5pM之NGF的存在下測量到的。
  7. 如請求項1或2之用途，其中該抗-NGF拮抗劑抗體或其抗原結合片段包含(a)來自SEQ ID NO：1之重鏈可變區之3個CDR；及(b)來自SEQ ID NO：2之輕鏈可變區之3個CDR。
  8. 如請求項1或2之用途，其中該抗-NGF拮抗劑抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區，其包括：(a)顯示在SEQ ID NO：3中的CDR1區；(b)顯示在SEQ ID NO：4中的CDR2區；以及(c)顯示在SEQ ID NO：5中的CDR3區；以及輕鏈可變區，其包括：(a)顯示在SEQ ID NO：6中的CDR1區；(b)顯示在SEQ ID NO：7中的CDR2區；以及(c)顯示在SEQ ID NO：8中的CDR3區。
  9. 如請求項8之用途，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是包括顯示在SEQ ID NO：1和2中之胺基酸序列的抗體。
  10. 如請求項9之用途，其中該抗-NGF拮抗劑抗體是包括顯示在SEQ ID NO：16和17中之胺基酸序列的抗體。
  11. 如請求項1或2之用途，其中該抗-NGF拮抗劑抗體或其抗原結合片段與請求項8、9或10中所定義之抗體或其抗原結合片段競爭結合人類NGF；及/或與請求項8、9或10中所定義之抗體或其抗原結合片段結合相同人類NGF抗原決定位。
  12. 如請求項1或2之用途，其中該個體是人類。
  13. 如請求項1或2之用途，其中該抗-NGF拮抗劑抗體或其抗原結合片段係以範圍從大約3微克/公斤至大約1毫克/公斤之劑量使用。
  14. 如請求項13之用途，其中該抗-NGF拮抗劑抗體係以大約100微克/公斤之劑量使用。
  15. 如請求項13之用途，其中該抗-NGF拮抗劑抗體係以大約300微克/公斤之劑量使用。
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