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TWI583791B - 對β-澱粉樣肽之原纖維體形式具專一性之人類化抗體 - Google Patents

對β-澱粉樣肽之原纖維體形式具專一性之人類化抗體 Download PDF

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TWI583791B
TWI583791B TW105112498A TW105112498A TWI583791B TW I583791 B TWI583791 B TW I583791B TW 105112498 A TW105112498 A TW 105112498A TW 105112498 A TW105112498 A TW 105112498A TW I583791 B TWI583791 B TW I583791B
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Description

對β-澱粉樣肽之原纖維體形式具專一性之人類化抗體
本發明係關於一種對β-澱粉樣肽之原纖維體形式具專一性之人類化抗體。本發明亦關於該等抗體的治療、診斷及/或預防用途，特定言之，係與神經退化性疾病之誘發及發展相關之用途，及/或與有關澱粉樣斑塊沉積之疾病(且特別是阿茲海默氏病(Alzheimer's disease))相關之用途。
阿茲海默氏病為影響極大比例年老人群的進行性神經退化性疾病。該疾病之臨床特徵為記憶喪失及認知功能減退，且神經病理學特徵為在腦中出現細胞內之神經纖維體沉積，及細胞外之可形成澱粉樣斑塊之β-澱粉樣肽(A-β)沉積。(Yanker等人Nature Med.第2卷，第8號(1996))。除了該等症狀之外，亦存在許多其他異常變化，包括免疫及發炎系統退化、及粒線體功能退化，其導致氧化壓力增加、細胞凋亡機制活化，且最終導致細胞死亡。
澱粉樣斑塊主要係由含40或42個殘基之A-β肽組成，其係在β-澱粉樣肽前體(APP)蛋白質之蛋白裂解過程中產生。細胞外之A-β肽沉積代表所有AD形式(包括家族形式(FAD))之不變之早期特徵。FAD出現得相當早(介於40至60歲之間)，且其病因為基因突變：在5%之FAD病例(>20個家庭)中為APP基因突變(六個單或雙錯義突變)；在50至70% 之FAD病例(>200個家庭)中為早老蛋白1基因(PS 1)突變(迄今為止已鑑定出80種以上之不同突變)；且在較少FAD病例中為早老蛋白2基因(PS 2)突變(在8個家庭中已闡述2種錯義突變)。已顯示該等三個基因之突變會誘發APP之蛋白裂解變化，其導致過度產生A-β，並導致較早出現類似於AD偶發形式之病理及症狀。
澱粉樣斑塊之神經毒性可能係由於呈纖維體形式之可溶性A-β肽凝集所形成之高分子量纖維體造成，其最初可溶(亦稱為原纖維體形式)，且隨後轉變成不可溶形式合併成澱粉樣斑塊。事實上，於活體外已顯示，可溶性A-β肽逐步凝集成纖維體形式(亦即其可標記諸如可識別肽/蛋白質之β-折叠片三級結構的剛果紅(Congo Red)或硫代黃素S之試劑)，其具有高分子量(>200kDa)，但仍為可溶。由於該形式可溶，亦常稱為原纖維體形式，當其進一步凝集產生纖維體，則導致溶解性喪失。通常認為原纖維體過渡形式係澱粉樣纖維之前體，且可能造成阿茲海默氏病及其他與蛋白質凝集相關之疾病中的細胞功能失調及神經元喪失。
已顯示老化澱粉樣斑塊(亦即已凝集者，亦稱為成熟斑塊)係與阿茲海默氏病患者之認知狀態相關，反之，在未受影響之患者中亦廣泛存在A-β肽之散亂沉積物(Duyckaerts等人，Neurobiol.Aging 1997；18：33-42及Jellinger等人，1998；54：77-95)。因此藉由特定靶向該等老化澱粉樣斑塊，可能會更專一且有效地治療阿茲海默氏病。
許多治療法已試圖防止A-β肽形成，例如針對APP蛋白質裂解過程之抑制劑。
已測試諸如投與抗-A-β抗體(以減少澱粉樣沉積)或接種A-β肽抗原(以促進體液反應)之免疫治療方法，以減少斑塊之大小及密度。
例如，已闡述一種治療阿茲海默氏病的方法(US 7 179 463)，其包括投與一種針對原纖維體之抗體組成，該原纖維體在編碼A-β肽之 區域中出現北極突變(Arctic mutation)。
沒有抗體實例曾被確實闡述。此外，沒有人以此等肽之分子量為函數來比較抗體對肽之親和力。其他專利案(US 6 761 888及US 6 750 324)曾提及識別沿著肽A-β42之胺基酸序列的多種抗原決定基的抗體。已申請一項國際專利申請案(WO2007/108756)，其係關於對原纖維體具專一性之抗體，但該等所述抗體同時識別高分子量A-β肽及中分子量之寡聚體。此外，未曾相對於抗體對散亂斑塊之親和力闡述抗體對成熟斑塊之親和力。
儘管當前正發展關於阿茲海默氏病的知識，但是仍需要治療及/或預防該病變之組合物及方法，以最大程度限制二次效應。諸如闡述於本申請案中之對A-β肽之原纖維體形式具專一性之人類化抗體意欲解決該問題。根據本發明之抗體可以識別老化澱粉樣斑塊而並非散亂斑塊，故較之可識別A-β之所有形式的抗體(其大部份將與散亂沉積物結合或與可溶形式之單體或低分子重量A-β肽結合)，根據本發明之抗體可更有效識別病變性斑塊。
此外，僅識別A-β肽之原纖維體形式而不識別與阿茲海默氏病無關之其他蛋白質之原纖維體形式避免了無用之結合(其會降低可有效針對病變性病灶之抗體的濃度)，且避免由於與該等其他蛋白質結合而可能導致之副作用。
已人類化之鼠類抗體在本申請案中通篇稱為抗體13C3。
表3中出示可編碼或構建根據本發明之人類化抗體的序列。
本發明係關於一種人類化抗體，其可與A-β肽之原纖維體形式(亦即高分子量肽)專一性結合。
在一項更有利之實施例中，抗體係與分子重量200、300、400或500kDa以上之A-β肽之凝集形式結合。
根據一項實施例，根據本發明之抗體係與凝集成老化斑塊之A-β肽結合，而不與A-β肽之散亂沉積物結合。
在一項有利實施例中，根據本發明之抗體係與A-β肽之原纖維體形式專一性結合，但不與具澱粉樣結構之其他蛋白質(例如IAPP、胰島澱粉樣多肽)結合。
本發明亦關於一種效應子功能降低的人類化抗體，因此可能限制諸如發展出微出血症及血管性腦水腫之副作用。
在一項有利之實施例中，根據本發明抗體不再具有效應子功能。
在一項更有利之實施例中，抗體為免疫球蛋白G4，其Fc結構域已發生突變，使得半分子之產生減少。
在一項更有利之實施例中，抗體為免疫球蛋白G4，其Fc結構域已發生突變，使得效應子活性降低。
本發明亦關於一種人類化抗體，其可預防形成澱粉樣斑塊，且可減少腦中之該等斑塊。根據本發明之抗體事實上刺激針對已凝集於小神經膠質起源性細胞中的A-β1-42肽顆粒之胞噬作用，已知該抗體在活體內導致腦中澱粉樣斑塊減少(Bard等人，2000「Peripherally administered antibodies to amyloid beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease.」Nat Med.2000 Aug；6(8)：916-9。)。
本發明因此係關於一種以人類化抗體LP09027於治療阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)上之用途，其係基於其預防澱粉樣斑塊形成並減少腦中之該等斑塊之作用。
本發明係關於一種人類化抗體，其包括至少一個由與序列SEQ ID NO：9、11、13、15、17及19中之其中一個相同之核苷酸序列，或由與該等序列各有1、2、3、4或5個核苷酸不同之序列編碼之 CDR。
本發明亦關於一種人類化抗體，其包括至少一個具有與序列SEQ ID NO：10、12、14、16、18及20中之一個相同序列的CDR。
在另一項實施例中，根據本發明之抗體包括至少一個CDR，其序列相對於序列SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20及32中之一個有一至兩個胺基酸不同，但該抗體仍保持其結合專一性。
在一項有利實施例中，抗體包括由核苷酸序列SEQ ID NO：9、11、13、15、17及19，或由與該等序列各有1、2、3、4或5個核苷酸不同之序列編碼的多個CDR。
在另一項有利實施例中，抗體包括序列為SEQ ID NO：10、12、14、16、18及20之多個CDR。
根據本發明之抗體亦可包括由核苷酸序列SEQ ID NO：9、11、13、31、17及19，或由與該等序列各有1、2、3、4或5個核苷酸不同之序列編碼的多個CDR。
在一項有利實施例中，根據本發明之抗體包括序列為SEQ ID NO：10、12、14、32、18及20之多個CDR。
本發明之一個標的為人類化抗體，其包括由核苷酸序列SEQ ID NO：9、11、29、31、17及19，或由與該等序列各有1、2、3、4或5個核苷酸不同之序列編碼之多個CDR。
本發明亦關於一種人類化抗體，其包括序列為SEQ ID NO：10、12、30、32、18及20之多個CDR。
在一項有利實施例中，根據本發明之抗體包括一重鏈可變部份(VH)，其係由與序列SEQ ID NO：5或序列SEQ ID NO 27至少有80%、85%、90%、95%或99%相同之序列編碼。
在一項有利實施例中，根據本發明之抗體包括一重鏈可變部份(VH)，其包括與序列SEQ ID NO：6或序列SEQ ID NO 28至少有 80%、85%、90%、95%或99%相同之序列。
在一項有利實施例中，根據本發明之抗體包括一輕鏈可變部份(VL)，其係由與序列SEQ ID NO：7或序列SEQ ID NO 23至少有80%、85%、90%、95%或99%相同之序列編碼。
在一項有利實施例中，根據本發明之抗體包括一輕鏈可變部份(VL)，其包括與序列SEQ ID NO：8或序列SEQ ID NO 24至少有80%、85%、90%、95%或99%相同之序列。
在一項更有利實施例中，抗體包括一重鏈，其包括由核苷酸序列SEQ ID NO 5及SEQ ID NO 27中之一編碼之可變部份(VH)。
在一項更有利實施例中，抗體包括一重鏈，其包括多肽序列為SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 28之可變部份(VH)。
在另一項實施例中，抗體包括一輕鏈，其包括由核苷酸序列SEQ ID NO 7及SEQ ID NO 23中之一編碼之可變部份(VL)。
在另一項實施例中，抗體包括一輕鏈，其包括多肽序列為SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 24之可變部份(VL)。
在一項有利實施例中，抗體包括由核苷酸序列SEQ ID NO：5及7編碼之序列。
在一項有利實施例中，抗體包括多肽序列SEQ ID NO：6及8。
在另一項實施例中，抗體包括由核苷酸序列SEQ ID NO：5及23編碼之序列。
在另一項實施例中，抗體包括多肽序列SEQ ID NO：6及24。
在另一項實施例中，抗體包括由核苷酸序列SEQ ID NO：27及23編碼之序列。
在另一項實施例中，抗體包括多肽序列SEQ ID NO：28及24。
本發明亦關於一種抗體，其包括一重鏈，其係由與核苷酸序列SEQ ID NO 1及SEQ ID NO 25中之一至少有80%、85%、90%、95%或 99%相同之序列編碼。
本發明亦關於一種抗體，其包括一重鏈，其與多肽序列SEQ ID NO 2或與多肽序列SEQ ID NO 26至少有80%、85%、90%、95%或99%相同。
在一項有利實施例中，抗體包括一輕鏈，其係由與核苷酸序列SEQ ID NO 3及SEQ ID NO 21中之一至少有80%、85%、90%、95%或99%相同之序列編碼。
在另一項實施例中，抗體包括一輕鏈，其包括與多肽序列SEQ ID NO 4及SEQ ID NO 22中之一至少有80%、85%、90%、95%或99%相同之序列。
本發明之一項標的為一種抗體，其包括由核苷酸序列SEQ ID NO：1及3編碼之序列。
本發明之另一項標的為一種抗體，其序列包括多肽序列SEQ ID NO：2及4。
本發明之一項標的為一種抗體，其包括由核苷酸序列SEQ ID NO：1及21編碼之序列。
本發明之另一項標的為一種抗體，其序列包括多肽序列SEQ ID NO：2及22。
本發明之一項標的為一種抗體，其包括由核苷酸序列SEQ ID NO：25及21編碼之序列。
本發明之另一項標的為一種抗體，其序列包括多肽序列SEQ ID NO：26及22。
本發明之另一項標的為一種人類化抗-A-β肽抗體，其對A-β肽之原纖維體形式的親和力比對該肽之其他形式的親和力高出至少100倍。
本發明之另一項標的為一種抗體，其特徵為其在活體內誘發澱 粉樣斑塊減少。
本發明之另一項標的為一種以人類化抗-A-β肽抗體於治療與神經退化性病症相關之疾病上，且特定言之於治療阿茲海默氏病上之用途。
本發明之另一項標的為一種醫藥組合物，其包括人類化抗-A-β肽抗體及賦形劑。
本發明之另一項標的為一種治療阿茲海默氏病之方法，包括向患者投與人類化抗-A-β-肽抗體。
本發明之另一項標的為一種或多種可產生人類化抗-A-β-肽抗體之細胞，及產生該種抗體之方法，包括培養該等細胞。該等細胞較佳衍生自一個細胞株。
本發明之一項標的為一種包括人類化抗-A-β-肽抗體之醫藥產品。
本發明之一項標的為一種聚核苷酸，其編碼與序列SEQ ID NO：2、4、6、8、22、24、26或28中之一至少有80%、85%、90%、95%或99%相同的多肽。
本發明之另一項標的為一種聚核苷酸，其序列與序列SEQ ID NO：1、3、5、7、21、23、25、或27中之一至少有80%、85%、90%、95%或99%相同。
本發明之另一項標的為一種重組載體，其包括序列為序列SEQ ID NO 1、3、5、7、21、23、25、或27中之一之核酸，且本發明之另一項標的為包括該種載體之寄主細胞。
圖1A：允許表現抗A-β抗體13C3-VH1VL1之輕鏈LC1的質體pXL4973之圖譜。
圖1B：允許表現抗A-β抗體13C3-VH1VL1之重鏈HC1的質體 pXL4979之圖譜。
圖2A及2B：藉由Superdex 75凝膠過濾，分離出原纖維體及低分子量寡聚體(分別在t=0及在t=16h時)。
圖3：確定原纖維體之分子量。
圖4A、4B及4C：確定人類化抗體(分別為抗體LP09027(4A)、LP09026(4B)及LP09028(4C))對原纖維體之親和力(獲自三個實驗之平均值±sem)。
圖5：人類化抗體LP09027對A-β纖維體之專一性。
圖6A及6B：人類化抗體(LP09027)分別對小鼠額葉皮層(6A)及對海馬(6B)中之老化斑塊的專一性。該等箭頭指示老化斑塊。
圖7：人類化抗體(LP09027)分別對人類腦部額葉皮層(7A)及對海馬(7B)中之成熟老化斑塊的專一性。與對照抗體比較(7C及7D)。
單箭頭指示成熟斑塊，雙箭頭指示散亂沉積物。
圖8：比較抗體LP09027與對照抗體DM4激發針對凝集於BV2小神經膠質細胞中之螢光A-β1-42肽顆粒的胞噬作用。
定義
專一性結合應理解為結合至一種受體之強度與結合至另一種受體之強度之間存在至少約10、20、30、40、50、或100倍之差異，本文係指結合至A-β肽之原纖維體形式之強度與結合至該肽之其他形式之強度之間。
「抗原決定基」意指與抗體結合之抗原位點。若該抗原為諸如蛋白質或多醣之聚合物，則該抗原決定基可由連續或不連續之殘基形成。本文中之抗原決定基具構象性，亦即與該原纖維體A-β肽之三維結構有關。
「原纖維體形式」意指A-β肽之寡聚體形式，其在活體外可溶， 且可呈分子量200kDa、300kDa、400kDa或500kDa以上之整體分離出，且其可固定諸如硫代黃素-S或剛果紅之試劑。
「老化斑塊」意指由周圍被發育不良之軸突包圍之澱粉樣核心(固定硫代黃素S或剛果紅)及神經膠質細胞之反應所組成之斑塊。老化斑塊尤其存在於阿茲海默氏病患者中，其與更大量但與該疾病無關之散亂的澱粉樣沉積物(其不會固定硫代黃素S或剛果紅)不同。
抗體(亦稱為免疫球蛋白)係由經二硫橋連接之兩條相同之重鏈(「CH」)及兩條相同之輕鏈(「CL」)組成。各鏈均含有一恒定區及一可變區。各可變區包括三個稱為「互補決定區」(「CDR」)或「高可變區」之片段，其主要作用為與抗原之抗原決定基結合。
術語「VH」係指抗體免疫球蛋白重鏈之可變區，包括片段Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab'或F(ab)'之重鏈。
術語「VL」係指抗體免疫球蛋白輕鏈之可變區，包括片段Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab'或F(ab)'之輕鏈。
「抗體」亦意指抗體之任一功能性片段：Fab(結合抗原之片段)、Fv、scFv(單鏈Fv)、Fc(可結晶片段)。該等功能性片段較佳為如下類型之片段：Fv、scFv、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc、雙功能抗體、多特異性抗體(尤其為雙特異性)、含有一或多個CDR序列之合成多肽(其結合親和力通常與衍生其之人類化抗體相同)。根據本發明，可藉由諸如酶(諸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化及/或藉由由化學還原法裂解雙硫橋，自人類化抗體獲得本發明之抗體片段。
奈米抗體亦屬於該定義。
「一或多個CDR」係指如Kabat等人(Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH,1991，及隨後之版本)所定義之免疫球蛋白重鏈及輕鏈之高可變區。存在三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR。文中所 用之術語一或多個CDR係指(當可行時)一或多個或甚至所有之含有負責該抗體與其所識別之抗原或抗原決定基親和結合的大部份胺基酸殘基之結構域。可變區中之最保守區稱為FR區或序列(表示「框架區」)。
本發明係關於一種人類化抗體。
「人類化抗體」意指一種主要含有人類免疫球蛋白序列之抗體。該術語一般係指經併入人類序列或存在於人類序列中之殘基而改質之非人類免疫球蛋白。
人類化抗體通常包括一個或通常兩個可變結構域，其中所有或部份CDR區對應於衍生自非人類母本序列之部份，且其中所有或部份之FR區衍生自人類免疫球蛋白序列。人類化抗體則可包括免疫球蛋白(特定言之所選之對照人類免疫球蛋白)之恒定區(Fc)之至少一部份。
吾人因此意欲獲得一種對人類具最小免疫原性之抗體。因此，可使一或多個CDR中之一或兩個胺基酸經過對人類主體具較小免疫原性之胺基酸改質，而大體上不降低抗體對高分子量之A-β肽的結合專一性。此外，框架區之殘基並非一定具人類性，且其可能不經改質，因為其不形成抗體之免疫原性潛力。
熟習此項技術者已知若干種人類化方法，其係將非人類母本抗體改質成對人類免疫原性較小之抗體。並無必要使該等序列與人類抗體完全相同。事實上，序列完全相同並不一定成為免疫原性減小之預示性指標，且有限數量之殘基改質即可產生在人體中表現出非常減弱之免疫原性潛力的人類化抗體(Molecular Immunology(2007)44,1986-1998)。
一些方法為例如包含入CDR(接枝)(EPO 0 239 400；WO 91/09967；及美國專利案第5,530,101及5,585,089號)、表面重塑(EPO 0 592 106；EPO 0 519 596；Padlan,1991,Molec Imm 28(4/5)：489-498；Studnicka等人，1994,Prot Eng7(6)：805-814；及Roguska等人，1994,PNAS 91：969-973)或鏈混合(美國專利案第5,565,332號)。
本發明係特定關於人類化抗體，其可變部份係根據國際專利申請案WO 2009/032661中所述之技術經改質。
該技術尤其使用基於抗體三維模型之動態分子模擬(dynamic molecular simulation)，該等模型係根據同源性構建。
本發明亦關於效應子功能減小之抗體之任一形式，諸如具有減小其對免疫系統中受體的親和力的Fc結構域突變的免疫球蛋白，或諸如奈米抗體。
「效應子功能」意指抗體之Fc結構域與可誘發免疫反應之受體或蛋白質之間的任何結合。減少該等效應子功能可能減少諸如誘發微出血症之副作用(Racke等人J Neurosci 2005,25：629)。
可藉由熟習此項技術者所知之任一技術測量親和力。宜藉由基於由Ratkovsk DA及Reedy TJ所述之演算法發展出之Biostat Speed技術測量(Biometrics,1986,42,575-82)。
為了能夠表現根據本發明抗體之重鏈及/或輕鏈，將編碼該等鏈之聚核苷酸插入至表現載體中。該等表現載體可為質體、YAC、黏接質體、反轉錄病毒、獲自EBV之游離基因，及熟習此項技術者可能認為適於表現該等鏈之所有載體。
該等載體可用於使細胞轉形，該細胞較佳地係衍生自一個細胞株。該細胞株更佳係衍生自哺乳動物。較佳為CHO細胞株或衍生自該細胞株之細胞株、或HEK293細胞株或衍生自該細胞株之細胞株。
可藉由熟習此項技術者已知之任一種方法使該等細胞轉形，以便將聚核苷酸導入寄主細胞。該等方法可為：利用葡聚糖轉形、利用磷酸鈣沉澱、利用聚凝胺(polybrene)轉染、原生質體融合、電穿孔、 將聚核苷酸囊封入脂質體、基因槍注射、及將DNA直接微注射至細胞核。
根據本發明抗體可包含於醫藥組合物中，以便經外用、經口、非經腸、經鼻內、經靜脈內、經肌內、經皮下、經眼內或經其他途徑投與。當為可注射調配物時，該醫藥組合物較佳含有醫藥上可接受載劑。這些醫藥組合物具體言之是無菌的、等滲生理食鹽水溶液(磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等、或該等鹽之混合物)或為乾組合物(尤其經凍乾)，該乾組合物可藉由添加無菌水或(若適宜)生理血清，復水成可注射之溶質合物。
例如，一種醫藥組合物包含(1)Dulbecco磷酸緩衝液(pH~7.4)，其視需要含有1mg/ml至25mg/ml之人類血清白蛋白，(2)0.9w/v%氯化鈉(NaCl)、及(3)5w/v%右旋葡萄糖。其亦可包括諸如色胺之抗氧化劑及諸如Tween 20之安定劑。
所述病變為與澱粉樣斑塊沉積相關之任一疾病。特定言之，所述疾病為阿茲海默氏病。
劑量取決於所需效應、治療時間及所採用之投與方式；對於成年人，其通常為每週、或每月5mg至1000mg抗體。醫生通常會根據疾病階段、患者年齡及體重、或任一其他必須考慮與患者有關之因素來決定適宜劑量。
本發明闡述以下所示實例，但不受其限制。
實例： 實例1：獲得人類化抗體
使鼠類抗體13C3人源化。
本實例闡述人類化抗-A-β肽抗體VH1VL1(LP09027)之序列及其製造方法，該製造方法為藉由在稱為FreeStyle 293-F之哺乳動物細胞株HEK293中瞬時表現。
使編碼人類化可變鏈VL1及VH1之cDNA分別與編碼人類恒定區Cκ及IgG4之cDNA融合。恒定區IgG4之序列為具有依Kabat命名法之S241P及L248E取代之突變體序列，以顯著減少半分子之產生(Angla等人，1993,Mol.Immunol.,30：105-108)及降低效應子功能(WO 97/09351)。
於表現載體中獨立選殖編碼CH1(SEQ ID NO 1)及CL1(SEQ ID NO 3)之核酸序列，以分別產生質體pXL4973(圖1A)及pXL4979(圖1B)。
產生一批抗體之方法為：根據Invitrogen所述之方法(目錄參考編號K9000-01)，在共轉染質體pXL4973及pXL4979之後，在細胞株FreeStyle 293-F(Invitrogen)中瞬時表現。隨後根據供應商之建議，藉由MabSelect凝膠(Amersham)管柱親和層析術純化該批抗體(LP09027)，隨後於PBS緩衝液(參考編號Dulbecco 14190-094)中調配，並經無菌過濾(0.2μm)。以1L培養物為起始物，於變性條件下進行SDS-PAGE，及進行空間排阻層析術，獲得純度為97%之33mg之抗體。藉由變性條件下之SDS-PAGE及藉由LC/MS所獲得之質量與一級胺基酸序列、及在Fc結構域中存在N-聚糖之情形相符，亦即LC1之23969Da之質量及HC1之49650Da之質量已考慮呈G0F形式之N-聚糖。藉由非變性條件下之SDS-PAGE及藉由尺寸排阻層析術所獲得之質量與150kDa之雜四聚體結構之抗體相符(圖4A)。
根據相同方法，分別以核苷酸序列SEQ ID NO 25及SEQ ID NO 21(用於產生LP09026)(圖4B)、及SEQ ID NO 1及SEQ ID NO 21(用於產生LP09028)(圖4C)為起始物，產生一批人類化抗體LP09026及LP09028。
實例2：自A-β肽(1-42)製備原纖維體
根據Johansson等人所述之方法(FEBS,2006,2618-2630)，由合成 性A-β肽(1-42)製得原纖維體。將凍乾之肽(Anaspec參考編號24224)溶解於10mM NaOH，濃度為100μM，隨後攪拌1min並於冰上培養10min。隨後將肽溶液於含100mM磷酸鈉、200mM NaCl之緩衝液(pH=7.4)中稀釋至濃度50μM，隨後攪拌1min。於37℃下培養該製備物過夜，以形成原纖維體，且隨後依17900g，在16℃下離心15min，以移除不可溶性凝集物。為了分離原纖維體與低分子量之A-β之寡聚體形式，將上清液添加至已於50mM乙酸銨緩衝液(pH=8.5)中平衡之Superdex 75凝膠過濾管柱上。收集對應於原纖維體及低分子量寡聚體之溶離份，並貯存於4℃下。圖2顯示分離原纖維體之典型曲線。利用Biorad校準套組(參考編號150-1901)作為分子量標記，藉由Superdex200凝膠過濾確定原纖維體之分子量。圖3顯示原纖維體之分子量大於200kDa。
實例3：人類化抗體對原纖維體之專一性及親和力
將50μl含1μg/ml原纖維體及低分子量寡聚體的PBS(Gibco，參考編號70011)溶液添加至ELISA分析板(Nunc，參考編號442404)之各孔中，並於4℃下培養過夜。在移除過剩抗原之後，向各孔添加200μl PBS緩衝液+5%奶粉(重量/體積)，以移除非特異性吸附，並於室溫下培養2h。隨後利用300μl PBS Tween 0.02%緩衝液洗滌各孔4次。向各孔添加50μl之第一抗體溶液(於PBS Tween中稀釋三倍之稀釋液，進行三重覆，且寡聚體之起始濃度為100μg/ml，原纖維體之起始濃度為25μg/ml)，並於室溫下培養1h。利用300μl之PBS Tween緩衝液洗滌各孔4次。向各孔添加於PBS Tween緩衝液中稀釋至1/10000的與過氧化物酶偶聯之第二抗-Fc人類抗體(與過氧化物酶偶聯之山羊抗人類IgG(Fc)，Pierce，參考編號31413)，並於室溫下培養1h。利用300μl之PBS Tween洗滌四次後，向各孔添加100μl之TMB(Interchim，參考編號UP664782)，並培養約10min，隨後利用1 M HCl溶液(Interchim，參考編號UPS29590)終止反應，並在波長為450nm下測定分析板之OD。藉由BioStat Speed測定EC50數值。所得結果出示於表1及圖4中，且相對於對低分子量寡聚體，該抗體對原纖維體顯示極高專一性(184倍)。
根據供應商之建議溶解經凍乾之A-β1-42肽(Anaspec參考編號24224)：添加40μl之1% NH4OH至500μg A-β1-42。完全溶解之後，添加460μl PBS，使得濃度為1mg/ml。製備分成一份10μl，並貯藏於-80℃下。
向ELISA分析板之各孔添加pH 9.7之50μl含1μg/ml A-β1-42肽之碳酸鹽緩衝液(0.025M NaHCO3(Acros Organics，參考編號217120010)、0.025M Na2CO3(Acros Organics，參考編號207810010)溶液，並於室溫下培養過夜。如前所述，利用PBS Tween緩衝液洗滌各孔，並與PBS緩衝液+5%奶粉(重量/體積)一起培養，並以PBS Tween緩衝液洗滌。在室溫下，由濃度為0.02μg/ml之人類化抗體與在一段濃度範圍內(開始於1μg/ml)之如下物質一起培養1h：A-β1-28肽(Bachem，參考編號H7865)、A-β1-16(Anaspec，參考編號24225)、A-β25-35(Anaspec，參考編號24227)、如前述製得之低分子量寡聚體或原纖維體。隨後向各孔添加抗體/抗原混合物，並於室溫下培養該微滴定分析板1h。根據與前述相同之ELISA方法，測定游離、未複合之抗體。該等競爭性實驗顯示：唯有具有比低分子量寡聚體高得多之親 和力之原纖維體能夠藉由防止人類化抗體與A-β1-42肽相互作用而中和人類化抗體；沒有肽能夠中和抗體。
實例4：人類化抗體LP09027對A-β1-42纖維體之專一性
將A-β1-42肽(Anaspec，20276)溶解於200μl之10mM NaOH中，濃度為5mg/ml。將肽IAPP(Anaspec，60804)稀釋於200μl之50% DMSO中，濃度為5mg/ml。將100μl各製備物於400μl之1.25X PBS中稀釋。在500μl中，肽的最終濃度為1mg/ml。於37℃下培養樣本72h。在培養之後，於4℃下，以17900g離心樣本30分鐘。移除上清液，並利用1X PBS洗滌離心塊3次。在最後一次洗滌之後，將纖維體離心塊溶解於150μl之PBS中。為確定是否存在澱粉樣類型之纖維體，進行硫代黃素T螢光測試(Anaspec,88306)測試。將20μl硫代黃素T(最終為20μM)、10μl樣本及70μl 1X PBS(最終體積為100μl)於黑色分析板(Corning，3792)之孔中混合。於450nm下激發硫代黃素T，且在澱粉樣類型結構物存在下，發射出482nm之螢光。將50μl之1μg/ml之A-β1-42纖維體及0.5μg/ml之IAPP分別添加至微滴定分析板之各孔中。利用開始於10μg/ml之人類化抗體之系列稀釋物進行ELISA方法。圖5顯示，人類化抗體LP09027專一性識別A-β1-42纖維體但不識別IAPP纖維體。
實例5：人類化抗體LP09027對成熟老化斑塊具專一性，但對小鼠之散亂斑塊無專一性
將與毛地黃毒苷(digoxigenin)(毛地黃毒苷-3-O-甲基羰基-ε-胺基己酸-N-羥基琥珀醯亞胺酯：Roche 11333054001；11418165001)偶聯之人類化抗體(LP09027)用於對獲自小鼠APP PS1(闡述於Schmitz C.等人，Am.J.Pathol,2004,164,1495-1502之阿茲海默氏病模型)之腦切片、及對獲自阿茲海默氏病患者之人類腦切片(大腦皮質)之免疫組織化學分析(Ventana Robot)。事先已將樣本固定於甲醛，並包埋在石蠟 中。
獲自小鼠之結果(圖6A及6B)清晰說明，人類化抗體專一性識別A-β肽之緻密、成熟之老化斑塊，但不識別其散亂沉積物。
該等數據與該種抗體之性質具相關性，亦即其對原纖維體A-β形式具專一性，且因此不識別該肽之可溶之單體或寡聚體形式。
實例6：人類化抗體LP09027對緻密之成熟老化斑塊具專一性，但對人類腦部之A-β澱粉樣肽散亂沉積物無專一性
將與毛地黃毒苷(毛地黃毒苷-3-O-甲基羰基-ε-胺基己酸-N-羥基琥珀醯亞胺酯：Roche 11333054001；11418165001)偶聯之人類化抗體(LP09027)用於對獲自阿茲海默氏病患者之人類腦切片(海馬後部、額葉皮層)之免疫組織化學分析(Ventana Robot)。事先已將樣本固定於甲醛，並包埋入石蠟中。
所獲結果(圖7A、7B及7C)清晰說明，抗體LP09027大體上識別緻密之成熟老化斑塊，但不識別肽A-β之散亂沉積物，該結果亦由對照抗體3D6測得(圖7D)。
該等數據與該抗體之性質具相關性，亦即其對原纖維體A-β形式具專一性，且因此不識別該肽之可溶之單體或寡聚體形式。
實例7：測定人類化抗體LP09027與多種Fcγ人類受體之相互作用之親和力
利用Biocore 3000(GE healthcare，第CH321號)測定人類化抗體對多種Fcγ人類受體(R&D系統)之親和力。在相同條件下進行分析，比較人類化抗體的親和力與具有人類IgG1類型之恒定結構域Fc之抗體(3D6-huIgG1)的親和力。利用用於使胺與EDC(N-乙基-N'-[二甲基-胺基丙基]碳化二亞胺)/NHS(N-羥基琥珀醯亞胺)(GE healthcare BR-1000-50)偶合，並使固定化程度為500RU之標準方法，使人類化抗體固定於CM5類型之感測器晶片(GE healthcare BR-1000-12)之基質上， 其在乙酸鈉緩衝液(pH=5.0)中之濃度為5μg/ml。所有相互作用實驗均在25℃下，流速為10μl/min，於介於12.8μM與0.2nM之間(取決於抗體對受體之親和力)之受體進行。採集約14min(結合時間4min，解離時間10min)時期內之結果。用於稀釋受體之緩衝液係與流動相之緩衝液相同：HBS-EP緩衝液(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005%界面活性劑p20-GE healthcare BR 1001-88)。以流速為20μl/min注入10μl 50mM NaOH/1M NaCl緩衝液，使感測器晶片再生(不影響已固定之人類化抗體之活性)。
減去獲自無抗體之基質的非專一性信號，並減去在注入對當於用於稀釋受體之緩衝液的空白液之後所獲之信號，隨後利用軟體Biaevaluation(V4.1)進行分析。親和力常數之確定方法為：針對解離極快速之弱親和力，以濃度為函數繪製平衡時之反應圖，而分析平衡時之親和力；或針對解離緩慢之強親和力，藉由與適宜模型(Langmuir 1：1或雙態反應)整體擬合。
示於表2之結果說明，對比於具有人類IgG1類型之恒定Fc結構域的抗體(3D6-huIgG1)，該人類化抗體(具有人類IgG4類型之恒定Fc結構域)對受體FcγRIIIa不具有明顯之親和力，且針對受體FcγRI之親和力為3D6-huIgG1之約350倍。
實例8：藉由LP09027激發針對凝集之A-β肽的胞噬作用
將螢光A-β1-42肽(ANASPEC，FAM目錄號23526-01)再懸浮於蒸餾水(100μM)中，並於37℃下培養三天，以在使用前促進凝集。
製備凝集之螢光A-β1-42與抗體之混合物：在37℃下，與不同濃度之抗體一起培養凝集之螢光A-β1-42溶液(0.5μM)1h，隨後向細胞添加該混合物。
於含5% DMEM-F12之滅活胎牛血清介質中培養BV2細胞。依每個孔10 000個細胞，將細胞置於分析板(96-孔分析板)中。次日，以不含血清之DMEM/F12置換介質，並於37℃下培養細胞3h。添加螢光A-β1-42/抗體混合物，並於37℃下培養細胞4h。將細胞固定於4%多聚甲醛中。採用製造商之軟體及說明，利用Incell 1000分析儀(General Electric)定量吞噬於細胞中之螢光顆粒的數量及面積大小。
自10nM開始，人類化抗體LP09027係依依賴濃度之方式刺激針對凝集於小神經膠質細胞源BV2中之螢光A-β1-42肽顆粒物的胞噬作用/內含作用(圖8)。反之，用作對照免疫球蛋白之不識別肽A-β之抗體(DM4)對A-β之胞噬作用無影響。
<110> 法商賽諾菲-安萬特公司
<120> 對β-澱粉樣肽之原纖維體形式具專一性之人類化抗體
<130> FR2009-054
<140> 待指定
<141> 2010-05-11
<150> 0953133
<151> 2009-05-12
<160> 32
<170> Patent In version 3.3
<210> 1
<211> 1326
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<213> 人工
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<223> 人類化序列
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<212> PRT
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<223> 合成構築體
<400> 2
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<213> 人工
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<213> 人工
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<223> 人類化序列
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<211> 115
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<213> 人工
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<223> 人類化序列
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<212> DNA
<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(27)
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<212> PRT
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<213> 人工
<220>
<223> 人類化序列
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<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 22
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<212> DNA
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<220>
<223> 人類化序列
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
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<212> DNA
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<223> 人類化序列
<220>
<221> CDS
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<220>
<223> 合成構築體
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人類化序列
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<220>
<223> 合成構築體
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<213> Mus sp.
<220>
<221> CDS
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<212> DNA
<213> Mus sp.
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<221> CDS
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<400> 31
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 32

Claims (4)

  1. 一種聚核苷酸，其編碼與序列SEQ ID NO：2、4、6、8、22、24、26或28其中之一至少有99%相同之多肽。
  2. 一種聚核苷酸，其特徵為與序列SEQ ID NO：1、3、5、7、21、23、25或27其中之一至少有99%相同。
  3. 一種重組載體，其包含如請求項1或2之聚核苷酸。
  4. 一種宿主細胞，其包含如請求項3之載體。
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