CN116808027B

CN116808027B - 化合物或其盐在制备抑制wnt7a基因活性的制剂中的应用

Info

Publication number: CN116808027B
Application number: CN202310622675.9A
Authority: CN
Inventors: 任国胜; 李洪忠; 王品; 孙嘉政
Original assignee: First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University
Priority date: 2023-05-30
Filing date: 2023-05-30
Publication date: 2025-08-29
Anticipated expiration: 2043-05-30
Also published as: CN116808027A

Abstract

本发明属于癌症药物技术领域，具体涉及一种化合物或其盐在制备抑制WNT7A基因活性的制剂中的应用。该化合物可以有效抑制WNT7A基因活性和肿瘤的生长和扩散；并且该化合物在体内和体外均表现出较好的药物安全性，对于正常细胞的毒性较低，且在细胞和体内水平上都没有引起明显的副作用。

Description

化合物或其盐在制备抑制WNT7A基因活性的制剂中的应用

技术领域

本发明属于癌症药物技术领域，具体涉及一种化合物或其盐在制备抑制WNT7A基因活性的制剂中的应用。

背景技术

WNT7A是WNT家族中一种重要的蛋白质，其在人类发育、组织稳态和多种生理病理过程中扮演着重要角色。大量的研究表明WNT7A与多种恶性肿瘤的发生、发展以及预后不良密切相关。例如，有研究发现，WNT7A的高表达可以促进乳腺癌的发生和发展，而WNT7A的低表达则与患者更好的预后相关；在结直肠癌中，WNT7A高表达可以促进EpCAM阳性细胞的增殖和转移，并影响肿瘤细胞的耐药性，从而导致患者的预后不良；在卵巢癌中，WNT7a以β-catenin/Tcf-MMP7依赖的方式促进卵巢癌细胞的生长和侵袭，WNT7a诱导与卵巢癌转移相关的成纤维细胞样细胞的产生，导致WNT7A的高表达与预后不良密切相关；另外，Wu等发现低氧诱导的WNT7A高表达可能通过促进PDAC上皮细胞向间充质细胞的转化来促进细胞迁移，从而促进肿瘤转移，导致预后不良。

WNT7A对预后不良的影响可能涉及多个生物学过程机制和分子机制，包括促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，调节干细胞特性和上皮-间充质转化，并影响肿瘤微环境和致癌途径等方面。在上述机制中，WNT7A通常会与其他信号通路和蛋白质相互作用，形成复杂的信号网络。现有研究显示，WNT7A是WNT通路家族成员之一，这个通路在人类发育和多种生理病理过程中都扮演着重要角色，被广泛认为是人体内细胞信号传导和基因表达的重要调节机制。其中作为WNT通路的重要通路之一的WNT/β-catenin通路是WNT7A参与生物活动的主要通路。WNT/β-catenin通路是一种广泛参与细胞生长、分化和凋亡等多种生物学过程的重要信号传导通路。该通路通过构成复合物的WNT受体和Frizzled(FZD)受体相互作用来启动，并通过调节β-catenin的稳定性和核内转位来实现其生物学效应。并且，WNT/β-catenin通路的过度激活，会促进癌细胞增殖和转移。总之，WNT/β-catenin通路可以通过调节多个细胞周期和凋亡相关基因的表达，影响肿瘤细胞的增殖和生存，例如，MYC和CCND1等基因是WNT/β-catenin通路下游目标基因之一，它们的高表达与恶性肿瘤的发生和发展密切相关。除此之外，WNT/β-catenin通路也可以影响肿瘤干细胞的特性，肿瘤干细胞具有促进肿瘤增殖、转移和耐药等能力，该通路通过调节IL-6、Notch、Hedgehog等细胞因子的表达，促进了肿瘤干细胞的自我更新和增殖。

综上所述，WNT7A是一种已经被确定为具有癌症预后不良作用的基因。高表达的WNT7A在多种癌症中能够刺激细胞增殖、转移和侵袭，从而对肿瘤发展起到促进作用。然而，目前还没有针对WNT7A的临床转化研究，这使得医疗人员难以使用更加直接、精准的方法治疗相关癌症。为达到抑制WNT7A基因活性的目的，目前可以选择siRNA和shRNA等RNA干扰技术，特异性地抑制WNT7A的表达水平，从而有效地抑制细胞增殖和侵袭等生物学过程。但上述方法具有局限性，例如专一性低、剂量效应有限以及不适宜制作成药物等。另外，还可以选择WNT7A特异性单克隆抗体，其通过靶向WNT7A蛋白质或其相互作用蛋白，这些抗体药物可以有效地抑制WNT信号通路的激活，进而达到抑制肿瘤生长和转移的目的；然而，由于抗体药物的生产成本较高，并且需要注射剂量较大，WNT7A特异性单克隆抗体的使用受到了一定限制。

除上述两种RNA干扰技术以外，随着现代计算机技术的发展，研究人员还可以通过计算化学、分子对接等多种方法，筛选可以靶向特异性抑制目标基因的小分子化合物。而且，小分子化合物具有疗效稳定，使用便捷，成本低廉的优势。因此，开发或者挖掘一种可以靶向抑制WNT7A基因的小分子化合物是有必要的。

发明内容

针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种可以靶向抑制WNT7A基因的小分子化合物1365-0109(下述式I所示化合物)，其可以应用于制备抑制WNT7A基因活性的制剂中。该小分子化合物是先通过计算化学和分子对接的方式进行第一轮筛选，然后通过体外体内试验进一步筛选得到。

为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：

本发明一方面提供一种化合物或其盐在制备抑制WNT7A基因活性的制剂中的应用，化合物结构式如式I所示，

本发明另一方面提供一种化合物或其盐在制备用于治疗癌症的药物中的应用，化合物结构式如式I所示，

本发明有益效果至少包括：

(1)式I所示化合物可以有效抑制WNT7A基因活性。

(2)式I所示化合物可以有效抑制肿瘤的生长和扩散，较对照组，肿瘤生长更加缓慢、肿瘤更小，同时重量更轻、生存周期明显延长。

(3)式I所示化合物在体内和体外均表现出较好的药物安全性，对于正常细胞的毒性较低，且在细胞和体内水平上都没有引起明显的副作用。

附图说明

图1为高WNT7A表达水平的人乳腺癌组织样本图；

图2为低WNT7A表达水平的人乳腺癌组织样本图；

图3为癌组织样本中不同WNT7A表达水平的乳腺癌患者总体生存率(overallsurvivial,OS)比较图；

图4为使用shWNT7A-EO771皮下原位成瘤后肿瘤生长情况实物图；

图5为使用shWNT7A-EO771皮下原位成瘤后肿瘤生长时间-体积曲线图；

图6为shWNT7A-EO771组肿瘤体积情况图；

图7为shWNT7A-EO771组小鼠肿瘤重量情况图；

图8为WNT7A蛋白的活性口袋示意图；

图9为5286670小分子化合物作用2D图；

图10为5683035小分子化合物作用2D图；

图11为5180332小分子化合物作用2D图；

图12为5673999小分子化合物作用2D图；

图13为5283766小分子化合物作用2D图；

图14为7954-4074小分子化合物作用2D图；

图15为F067-1148小分子化合物作用2D图；

图16为C200-3685小分子化合物作用2D图；

图17为1365-0109小分子化合物作用2D图；

图18为3253-0183小分子化合物作用2D图；

图19为不同小分子抑制剂在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中抑制WNT7A与FZD5情况图；

图20为不同小分子抑制剂在三阴性乳腺癌细胞系EO771中抑制WNT7A与FZD5情况图；

图21为不同浓度1365-0109小分子对MDA-MB-231细胞系不同作用时间的作用情况图；

图22为不同浓度1365-0109小分子对EO771细胞系不同作用时间的作用情况图；

图23为不同浓度1365-0109小分子干预后肿瘤生长实物情况图；

图24为不同浓度1365-0109小分子干预后肿瘤生长时间-体积图；

图25为不同浓度1365-0109小分子干预后肿瘤体积情况图；

图26为不同浓度1365-0109小分子干预后肿瘤重量情况图；

图27为不同浓度1365-0109小分子对小鼠血常规及ASL、ALT的影响情况图；其中，图中的横坐标从左到右出依次为shNC组、5mg/kg组、10mg/kg组和15mg/kg组。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。

本发明实施例提供一种化合物或其盐在制备抑制WNT7A基因活性的制剂中的应用，化合物结构式如式I所示，

具体地，WNT7A基因全称为Wnt family member 7A，ID:7476。另外，本发明使用chembrige库和chemdiv库小分子化合物进行筛选，通过确定WNT7A活性口袋的方式确定分子活性位点，将最终的筛选得到的小分子进行对接，其结果以docking score值进行排序，选取打分高者形成合成，通过COIP等实验验证小分子抑制剂阻断WNT7A与FZD5的有效性，并通过体能体外实验验证药物的有效性及安全性。

另外，如上所述，WNT7A是一个重要的分子标志物，在多种类型的肿瘤中都与预后不良相关联。上述的化合物或其盐可以有效抑制WNT7A的活性，从而影响与WNT7A基因活性相关的行为，比如肿瘤的发生、发展和预后不良。

另外，上述式I所示化合物下也称1365-0109。

需要说明的是，上述化合物的盐的形式为本领域中已知的盐，一般为盐酸盐。

在一些具体实施例中，上述制剂的剂型可以包括片剂、粉剂、液体剂、悬浮剂或凝胶剂。

需要说明的是，可以将上述的化合物或其盐根据不同的需求添加辅料制备成不同的剂型，比如片剂、粉剂、液体剂、悬浮剂或凝胶剂。辅料均为本领域所已知的，比如制备片剂主要会使用到稀释剂(如淀粉、糊精、蔗糖或甘糖等)、吸收剂(硫酸钙、磷酸氢钙或轻质氧化镁等)、粘合剂(聚维酮、糖浆或羟丙甲纤维素等)、润湿剂(水等)或崩解剂(干淀粉、羟甲基淀粉钠或交联聚维酮等)等；比如制备液体剂主要会使用到增容剂、助悬剂、乳化剂或着色剂等。

另外，上述的制剂不特指药物，除了药物之外，也可以是以其他形式达到抑制WNT7A基因活性的目的。

本发明另一实施例提供一种上述的化合物或其盐在制备用于治疗癌症的药物中的应用。需要说明的是，将上述的化合物应用在肿瘤的抑制中，可以使得癌细胞增殖和侵袭能力显著下降，同时不会对细胞及小鼠内脏及血常规、肝功能造成显著伤害。

在一些具体实施例中，上述在制备用于治疗癌症的药物中的应用包括：上述化合物或其盐在制备用于抑制WNT7A基因活性的药物中的应用。

在一些具体实施例中，上述在制备用于抑制WNT7A基因活性的药物的应用以及用于抑制WNT7A基因活性的药物中的应用包括：上述化合物或其盐在制备用于抑制WNT/β-catenin信号通路的药物中的应用。

具体地，上述的化合物或其盐可以通过抑制WNT7A基因活性，从而抑制WNT7A与FZD5的结合，减少WNT/β-catenin信号通路的激活作用，从而达到抑制肿瘤发生发展的目的。并且该化合物对于正常细胞的毒性较低，且在细胞和体内水平上都没有引起明显的副作用。

需要说明的是，WNT7A是一种关键的信号分子，它通过结合特定的受体来触发细胞内部的一系列生物学响应。经过查阅文献和相关数据库(http://genemania.org/)得知WNT7A的主要受体是FZD5。FZD5是一种膜相关的细胞表面受体蛋白，它属于Frizzled家族成员之一，并能够与WNT7A等WNT家族蛋白结合。FZD5分子由大约300个氨基酸残基组成，其N-末端以及C-末端均位于细胞膜内外；在膜内侧，FZD5结构域包括一个七次跨膜的α螺旋和一个胞浆端的C末端序列。WNT7A分子通过与FZD5受体分子结合，可以激活WNT/β-catenin信号通路，并在基因表达调控等生物学过程中发挥着重要作用。

在一些具体实施例中，上述癌症可以为乳腺癌、结直肠癌和卵巢癌中的一种或多种。具体的，上述癌症可以是任何由WNT引起的癌症，比如乳腺癌、结直肠癌和卵巢癌。

在一些具体实施例中，上述药物的剂型可以包括注射剂或口服剂。具体地，上述的药物剂型可以根据临床需要制备成注射剂或者口服剂，制备注射剂或口服剂的方法为本领域所已知的。

为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。

一、WNT7A作为判断乳腺癌患者预后情况的肿瘤学标记物验证

本发明实施例中，验证了WNT7A可以作为判断乳腺癌患者预后情况的肿瘤学标记，具体如下：

(一)取样并制作石蜡切片

收集重庆医科大学附属第一医院内分泌外科乳腺癌患者癌组织(该研究已经重庆医科大学附属第一医院伦理委员会审核通过，伦理号为：2022-K121)，常规制作组织石蜡包块及切片。

(二)免疫组化检测癌组织WNT7A表达

(1)石蜡切片脱蜡至水；(2)3％H₂O₂室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；(3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，重复浸泡2次；(4)柠檬酸抗原修复；(5)10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟；(6)滴加WNT7A一抗工作液(Abcam，100792)，37℃孵育1.5小时，4℃过夜；(7)PBS冲洗5分钟，重复冲洗3次；(8)滴加适量生物素标记二抗工作液(迈新科技公司，KIT-9730)，37℃孵育25分钟；(9)PBS冲洗5分钟，重复冲洗3次；(10)滴加适量的辣根酶(也可用碱性磷酸酶标记的链霉卵白素替代)工作液，37℃孵育25分钟；(11)PBS冲洗5分钟，重复冲洗3次；(12)DAB显色剂显色10分钟；(13)自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片；(14)光学显微镜镜下观察WNT7A表达，计数WNT7A阳性细胞数。

(三)结果

通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(0分、1分、2分和3分分别对应阴性着色、淡黄色、浅褐色和深褐色)和阳性范围(1分、2份、3分和4分分别对应0-25％、26％-50％、51％-75％、76％-100％)进行评分，最终得到总分(染色程度×阳性范围，0-12分)进行评价。根据免疫组化评分结果，①WNT7A的免疫组化评分小于6分，判定为WNT7A低表达；②

WNT7A的免疫组化评分大于等于6分，判定为WNT7A高表达。

WNT7A低表达水平的人乳腺癌组织样本如图1所示，WNT7A低表达水平的人乳腺癌组织样本如图2所示。

另外，上述组织样本中不同WNT7A表达水平的乳腺癌患者总体生存率(overallsurvivial,OS)如图3所示，结果显示，WNT7A高表达水平的乳腺癌患者总体生存率显著低于WNT7A低表达水平的乳腺癌患者。

以上说明，WNT7A表达水平与乳腺癌患者预后存在关联，WNT7A可以作为判断乳腺癌患者预后情况的肿瘤学标记物。

二、阻断WNT7A活性可以有效抑制肿瘤生长验证

本发明实施例中，对阻断WNT7A活性可以有效抑制肿瘤生长进行验证，具体如下：

(一)小鼠原位成瘤自发肺转移模型的构建

(1)取小鼠三阴性乳腺癌细胞EO771(购买于American Type Culture Collection公司)，使用shRNA技术敲除WNT7A基因，设置敲除WNT7A基因细胞作为shWNT7-EO771细胞(也称shWNT7)；设置不敲除的WNT7A基因细胞作为shNC-EO771细胞(也称shNC组)；分别培养对数生长期，常规消化，离心，去上清，PBS洗2次。

(2)PBS重悬，计数，将细胞密度调整至1×10⁷/ml。

(3)接种前3天，将6-8周龄的雌性C57BC/L小鼠打耳标(购买于恩斯维尔生物科技有限公司)；将制备好的细胞悬液吹匀后，于单侧臀部皮下接种shNC-EO771细胞和shWNT7A-EO771细胞，分别命名为shNC组和shWNT7A组。，50μl/侧，即40×10⁴细胞/只，每组接种5只小鼠。

(4)接种后于SPF级环境中饲养小鼠，自第5天起隔天测量肿瘤长宽径。

(5)第15天时，将小鼠处死，将原位肿瘤完整取出并称重，使用graphpad软件制作小鼠生长曲线图及肿瘤体积(肿瘤体积(mm³)＝长径×宽径2×0.5)和肿瘤重量图。

(二)结果

各组小鼠的肿瘤实物如图4所示(其中，上面一排是shNC组，下面一排是shWNT7组)，结果显示，shWNT7组的EO771皮下原位成瘤后肿瘤体积明显小于shNC组。

各组小鼠的肿瘤从第5天至15天的体积变化情况如图5所示，结果显示，shWNT7组的EO771皮下原位成瘤后肿瘤生长较对照组明显减缓。

各组小鼠的15天后肿瘤体积如表1和图6所示，结果显示，shWNT7组的EO771皮下原位成瘤后肿瘤体积显著低于对照组。

表1ShNC和ShWNT7A小鼠肿瘤体积

各组小鼠的15天后肿瘤重量如表2和图7所示，结果显示shNC组的EO771皮下原位成瘤后肿瘤重量显著小于对照组。

表2ShNC和ShWNT7A小鼠肿瘤重量

三、通过虚拟分子筛选的方式寻找到小分子抑制剂

(一)蛋白结构的选择与准备

在进行对接分析过程中，使用软件包中的Prep Wiz模块对蛋白进行加氢和去水等预处理操作，准备试验蛋白。

(二)小分子数据库的准备

chembrige库和chemdiv库被用于本发明的虚拟筛选中，所有的化合物都经过DS4.0中的Lipinski’s rule offive and Veber rule模块对其进行类药性的初步筛选，剔除类药性差的分子；剩余的分子用软件包中的LigPrep模块进行准备，力场使用OPLS_2005力场，分子的质子化在pH7.4的条件下使用Epik模块进行操作。

(三)寻找活性位点

采用软件包中的SiteMap模块找到WNT7A蛋白的活性位点，WNT7A活性位点如下图8所示，将该活性位点定义为对接的口袋。

(四)具有PAINS性质化合物滤过

为了鉴定筛选出的化合物是否是PAINS结构，本发明实施例采用了Canvas 1.1的程序进行了滤过。需要说明的是，泛筛选干扰化合物(pan-assay interferencecompounds，PAINS)是指在新药筛选过程中，有些化合物展现出来的“活性”并不是基于化合物分子与蛋白质之间特异性的作用，这是一种假阳性结果。

(五)ADME性质预测和聚类分析

为了预测本发明实施例筛选出的化合物的药代动力学性质，本发明实施例使用了软件包中的QikProp 3.2程序进行了相应性质的计算。需要说明的是，QikProp3.2程序主要计算的是化合物是否违反Lipinski五规则和Jorgensen三规则，这两个性质能够初步的评价化合物的ADME特性。筛选化合物必须至少符合Lipinski五规则中的四个条件，才可能具备良好的口服生物利用度。期间，合并了经过不同药效团筛选和对接所得到的分子，剔除相同的分子，并对剩下的小分子使用FCFP_6指纹进行结构聚类分析。

(六)分子对接

选择最优对接条件Glide力场，以WNT7A蛋白文件(为受体进行对接研究，在对接之前，WNT7A蛋白受体需要准备并定义一个大小为的口袋，所有分子和受体蛋白准备好后，用Glide算法在SP对接精度下进行对接，其他参数保持默认。

(七)对接结果分析

通过chembrige库和chemdiv库进行筛选，将最终的筛选得到的小分子进行对接，其结果以docking score值进行排序，选取打分高，合成了每个数据库中得分最高的五种药物(如表3和表4)。

表3通过蛋白筛选chembrige库得到的小分子作用2D图

表4通过蛋白筛选chemdiv库得到的小分子作用2D图

No.	ID	Dockingscore	Structure
				1	7954-4074	-7.513	图14
2	F067-1148	-7.461	图15
				3	C200-3685	-7.451	图16
4	1365-0109	-7.390	图17
				5	3253-0183	-7.383	图18

四、小分子抑制剂1365-0109筛选与效果验证

(一)最佳阻止WNT7A与FZD5结合药物筛选

本发明实施例中，使用免疫共沉淀(COIP)实验方法试验上述十种小分子化合物(陶术生物公司进行合成)，并确定最佳阻止WNT7A与FZD5结合药物的方法如下：

(1)将细胞种植于10cm细胞培养皿内，待细胞密度大约90％时弃去培养基，预冷PBS+PMSF(1ml+10ul)，洗涤细胞3次，分别加入1mlPSB+PMSF将细胞用细胞刮刮下转移到1.5mlEP管中，3000rpm离心1分钟。

(2)上清，在每个EP管中加入IPbuffer1ml，4℃，摩天轮旋转仪裂解30min。

(3)16000g，4℃离心15min，取30ul上清作为Input，剩余上清分别取400ul至新的1.5mlEP管中，作为IP样本及IgG样本。

(4)IP样和IgG样分别加入30ulproteinA/G磁珠，4℃，摩天轮转30分钟，以去除非特异性蛋白。

(5)10000rpm，30s，收集上清，IP组上清中加入4ugWNT7A抗体及小分子化合物或者DMSO或者None，IgG样本中加入2ulnormalIgG抗体，4℃，摩天轮旋转仪过夜。

(6)加入proteinA/G磁珠30ul，4℃，2小时，摩天轮旋转仪。

(7)4℃，1000rpm离心30s，置于磁力架上5ml，除去上清。

(8)用1mlIPbuffer洗涤3次，每次4℃摩天轮旋转仪转5min，4℃，4000rpm离心1min，除去上清。

(9)IP样本和IgG样本加入20ul5×loadingbuffer，Input样本加入30ul5×loadingbuffer，100℃，煮5分钟。

(10)按照westernblot步骤进行上样(将样本使用SDS-PAGE进行电泳分离；将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺(PVDF)或硝酸纤维素膜上；闭塞和洗涤膜，一抗标记，洗涤，二抗标记，洗涤，信号检测，具体参照《Wu,Y.,et al.,FGFR blockade boosts T cellinfiltration into triple-negative breast cancer by regulating cancer-associated fibroblasts.Theranostics,2022.12(10):p.4564-4580》)。

按照上述方法试验表3和表4中所示的10种化合物分别在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和EO771中抑制WNT7A与FZD5结合的情况，结果如图19和图20所示，结果显示，不论是在细胞系MDA-MB-231，中还是细胞系EO771中，小分子化合物1365-0109抑制WNT7A与FZD5结合效果最显著，优于其他小分子化合物。

(二)小分子化合物1365-0109细胞活性实验

本发明实施例中，试验小分子化合物1365-0109的细胞毒性的方法如下：

(1)将细胞接种于96孔板中，3000个细胞/孔，100ul/孔，每组设3复孔，设置为空白对照组。

(2)第2日，加入不同浓度梯度(0、1μM、3μM、10μM、30μM和100μM)的小分子化合物1365-0109，置于37℃，5％CO₂的孵育箱中孵育24h；向96孔板每孔加入10ulCCK8试剂，避光，避免气泡。

(3)96孔板放回孵箱继续孵育2h，通过全波长酶标仪检测(TECAN)检测λ＝450nm处的吸光值。

(4)细胞存活率(％)＝[(试验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100％，其中，实验孔：含有细胞的培养基及待测化合物；对照孔：含有细胞的培养基，无待测化合物；空白孔：不含细胞和待测化合物的培养基。

(5)使用graphpad软件制作柱状。

按照上述方法分别试验小分子化合物1365-0109对MDA-MB-231细胞系和EO771细胞系的细胞活性影响情况，结果如图21和22所示，结果显示，不同浓度法人1365-0109分别作用MDA-MB-231细胞系和EO771细胞系，其细胞活性均没有明显变化。

五、小分子抑制剂1365-0109抑制肿瘤生长与毒副作用试验

(一)小鼠原位成瘤自发肺转移模型的构建

(1)取对数生长期的小鼠三阴性乳腺癌细胞EO771，常规消化，离心，去上清，PBS洗2次。(2)PBS重悬，计数，将细胞密度调整至1×10⁷/ml。

(3)接种前3天，6-8周龄的雌性C57BC/L小鼠打耳标；将制备好的细胞悬液吹匀后，于单侧臀部皮下接种细胞，50μl/侧，即40×10⁴/只，共接种20只。

(4)接种后于SPF级环境中饲养小鼠，自第3天起隔天测量肿瘤长宽径；(5)第5天开始随机将小鼠分成4组，第一组仅给予生理盐水干预，设置为对照组，第二组按照5mg/kg剂量干预，第三组按照10mg/kg剂量干预，第四组按照15mg/kg计量干预；每三天给一次药。

(5)第15天时，将小鼠处死。

(6)将小鼠血液取出，分成两份，一份完成血常规检查，一份完成AST和ALT检测(工作试剂的配制：单试剂法直接用；双试剂法将R1，R2分别应用；在全自动生化酶标仪上设置好相应参数；上样，全自动生化仪自动测定；实验结果用全自动生化仪检测后导出结果，并使用graphpad做图)；并将原位肿瘤完整取出并称重，使用graphpad软件制作小鼠生长曲线图及肿瘤体积(肿瘤体积(mm³)＝长径×宽径2×0.5)和肿瘤重量图。

(二)结果

各组小鼠的肿瘤实物如图23所示，结果显示，1365-0109组的EO771皮下原位成瘤后肿瘤体积明显小于对照组，并且随着1365-0109的浓度不断增大，肿瘤体积不断变小。

各组小鼠的肿瘤体积从第5天至15天的变化情况如图24所示，结果显示，1365-0109组的EO771皮下原位成瘤后肿瘤生长较对照组明显减缓；并且随着1365-0109的浓度不断增大，肿瘤生长速度逐渐变小。

各组小鼠的15天后肿瘤体积如表5和图25所示，结果显示，1365-0109组的EO771皮下原位成瘤后肿瘤体积显著低于对照组，并且随着1365-0109的浓度不断增大，肿瘤体积逐渐变小。

表5不同组别小鼠肿瘤体积

各组小鼠的15天后肿瘤重量如表6和图26所示，结果显示，1365-0109组的EO771皮下原位成瘤后肿瘤重量显著低于对照组，并且随着1365-0109的浓度不断增大，肿瘤重量逐渐变小。

表6不同组别小鼠肿瘤重量

各组小鼠的血常规指数以(RBC、WBC、HCG和PLT)及AST和ALT指数的检测情况如图27所示，结果显示，不同给药浓度下，小鼠血常规和肝功能均没有明显异常，即不同浓度小分子化合物1365-0109均对小鼠血常规及ASL、ALT没有明显毒副作用。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

Claims

1.化合物或其盐在制备用于治疗乳腺癌的药物中的应用，化合物结构式如式I所示，

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，应用包括：化合物或其盐在制备用于抑制WNT7A基因活性的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，应用包括：化合物或其盐在制备用于抑制WNT/β-catenin信号通路的药物中的应用。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，药物的剂型包括注射剂或口服剂。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，药物的剂型包括注射剂或口服剂。