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TWI582238B - 建構於處理樣品中微生物的多樣性指數及生存力指數之方法 - Google Patents

建構於處理樣品中微生物的多樣性指數及生存力指數之方法 Download PDF

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TWI582238B
TWI582238B TW102125194A TW102125194A TWI582238B TW I582238 B TWI582238 B TW I582238B TW 102125194 A TW102125194 A TW 102125194A TW 102125194 A TW102125194 A TW 102125194A TW I582238 B TWI582238 B TW I582238B
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Description

建構於處理樣品中微生物的多樣性指數及生存力指數之方法 相關申請案之交叉引用
本申請案為2012年1月24日申請之美國專利申請案13/360,238之部分接續申請案。
有關聯邦贊助之研究或開發之聲明
不適用。
發明背景
本發明大體上係關於適用於偵測、鑑別及處理(addressing)存在於市售處理系統中之微生物的組成物、裝置及方法。
市售處理系統中某些微生物之存在及生長為持續存在之挑戰。市售處理系統之各個階段中有許多含有具有不同量之水、營養素、熱、庇護物、錨定基質、化學條件及/或不存在捕食者的各種條件，該等捕食者通常充當適用於一切種類微生物定殖之環境生態席位。此微生物之群體生長通常引起許多問題，包括使處理功能退化及使最終產品積垢。
一個該問題為微生物誘發之殼沈積物形成。殼為包含所沈積有機及/或無機物質之剛性固體組成物在存在於市售處理系統中之物品表面上之聚積。殼可為分泌物及/或微生物本身之菌落。特定言之，殼可包括一或多種硬殼及/或幾丁質(chitin)生物及/或珊瑚生物之聚積或由其組成。殼可對系統具有許多消極影響，諸如降低之操作效率、過早設備故障、生產 力損失、產品品質損失及增加之健康相關風險。最糟的為，殼通常必須藉由刮削或其他物理手段物理地移除，且此需要昂貴地關停或拆卸處理系統之一部分或全部。
微生物引起之另一問題為形成生物膜。生物膜為包含微生物或由微生物分泌之胞外聚合物的有機物層，其有助於形成微生物群落。生物膜可在處理設備之表面上以及在流體池中生長。此等生物膜為複雜生態系統，其建立用於濃縮營養素之手段且為生長提供保護。生物膜可加速成殼、腐蝕及其他積垢過程。生物膜不僅造成系統效率降低，而且其為其他包括病原生物之微生物的微生物增殖提供極佳環境。因此重要的為，儘可能最大程度減少生物膜及其他積垢過程，以使處理效率最大化且使來自該等病原體之健康相關風險最小化。
若干因素造成生物污染程度且控制適當反應。水溫；水pH值；有機及無機營養素；生長條件，諸如好氧或厭氧條件；及在一些情況下存在或不存在日光等可起重要作用。此等因素亦有助於判定何種類型之微生物可存在於水系統中及如何最佳控制彼等微生物。正確鑑別微生物對適當作出反應亦為關鍵的。關於微生物為植物、動物抑或真菌或其為浮游抑或固著生物之差異決定如何有效進行各種生物控制。因為不同微生物誘發不同問題，所以正確鑑別對適當糾正不期望微生物效應為關鍵的。最後，因為化學促成之問題不能以殺生物劑糾正，所以亦需要鑑別何等問題具有基於非生物學來源。
典型地用以監測處理系統之標準技術包括標準平板計數技術。此等技術需要漫長培育期，且未提供關於前瞻性控制及預防與微生物生長相關之問題的充足資訊。最近，腺苷三磷酸(ATP)量測已用作前瞻性控制之手段。然而，試劑成本較高且自較大水系統取樣體積較小。雖然有可能藉助於ATP分析定量樣品中之微生物活性，但反應不能區別由一種類 型之微生物與另一者相比產生之ATP，且其不偵測活的但受抑制之生物。另一缺點為，此方法不能用以測定微生物對薄板缺陷之影響，因為大多數生物在曝露於乾燥器區段之熱之後不為活的。資料收集亦很少發生，導致資料存在顯著差異。因此，此方法提供的關於相關系統中之微生物狀態之資訊有限。另外，此等方法典型地用以監測浮游細菌。但在一些情況下，表面可經擦拭及分析以便定量生物膜細菌。此等方法極為冗長及費時。
溶氧(DO)探針已用以量測流體中之微生物活性，此由於已熟知微生物活性及需氧代謝導致溶氧濃度降低。美國專利5,190,728及5,282,537揭示一種利用DO量測來監測市售水中之污垢的方法及裝置。然而，該方法需要使用營養素添加物以將生物與非生物污垢區分，且不提及在探針表面已積垢之後如何恢復探針用於進一步量測。另外，所揭示之方法需要連續供應氧之手段。
標準克拉克(Clark)型電化學DO探針具有許多限制，諸如：化學干擾(H2S、pH值、CO2、NH3、SO4、Cl-、Cl2、ClO2、MeOH、EtOH及各種離子物質)、頻繁校準及薄膜更換、緩慢反應及浮動讀數、熱衝擊及薄膜上之高流量需求。近來許多公司(例如HACH,Loveland,CO)已市售之新型溶氧探針克服幾乎所有此等限制，以便可線上量測處理水中之DO。此新DO探針(LDO)基於螢光壽命衰變，其中氧之存在使受激螢光團之螢光壽命縮短。螢光團固定於感測器表面處之膜中且激勵係以藍色LED提供。美國專利5,698,412及5,856,119揭示一種監測及控制流體中之生物活性之方法，其中與pH值及/或ORP(氧化還原電位)組合量測DO以量測尤其與營養素/基質耗乏相關的代謝特性之轉變。
習知塗佈技術及氧化劑殘餘物可指示足夠的殺生物劑劑量及微生物生長控制，而沈積、缺陷及破碎仍為普遍的。明顯需要提供關於工業系統中之微生物生長及生物膜形成的更準確之資訊。定量PCR技術允 許快速分析薄板缺陷、氈(felt)、處理水樣品等以測定微生物對品質問題之影響。此新方法已證實可更前瞻性地診斷問題，從而改良機器效率及產品品質。
因此，顯然新穎方法及組成物就正確鑑別市售處理系統中存在之微生物而言有明顯效用。除非如此明確指定，否則此部分中所述之技術不意欲承認本文中所提及之任何專利、公開案或其他資訊為本發明之「先前技術」。另外，此部分不應視為意謂已作出搜尋或不存在如37 CFR§1.56(a)中限定之其他有關資訊。
本發明之至少一個具體實例係關於一種處理工業處理系統中之微生物感染的方法。該方法包含以下步驟：1)獲得至少一個第一量測結果，其鑑別存在於工業處理系統之至少一部分中的兩種或兩種以上生物之相對濃度，該鑑別至少部分限定基線多樣性指數，2)獲得至少一個第二量測結果，其鑑別存在於工業處理系統之至少一部分中的兩種或兩種以上生物之相對濃度，該鑑別至少部分限定後續多樣性指數，該至少一個第二量測結果比該(該等)第一量測結果更遲地獲得，3)注意兩種生物之濃度的任何相對變化，4)若第二量測結果與量測結果相差之量高於預定臨限量，則判定變化是否與對工業處理系統之不良影響相關，及5)實施補救辦法以補救不良影響。
第一及第二量測結果可藉由選自由以下組成之清單的至少一項進行：DNA分析、PCR分析、qPCR分析及其任何組合。臨限量可為每毫升獲自系統之流體100個細胞，或每公克工業處理最終產品或獲自處理之其他固體樣品(包括(但不限於)氈)100個細胞。該方法可進一步包含以下步驟：鑑別生物中之一者是否為先驅生物及一者是否為接附生物，若一者為先驅生物且其濃度在後續指數中之增量超過臨限值，則補救包括應 用靶向先驅生物之殺生物劑方案，若未偵測到生物膜形成劑，則補救包括鑑別及消除促進微生物沈降之非生物載體。
不論至少一種生物之身分，若其相對濃度相對於先前量測結果之增量超過臨限值，則即使整個生物群體保持相同，仍可添加殺生物處理劑至系統中。
該方法可進一步包含以下步驟：使多樣性指數變化與工業系統中發生之另一事件相關，另一事件選自由以下組成之清單：改變至少一種饋料之來源、改變至少一種饋料之種類、改變系統之至少一部分的操作速率及其任何組合，及使該事件逆轉。樣品中細胞之整體濃度的第一與第二量測結果之間可保持不變。量測結果可在系統中之已形成有沈積物且沈積物不含有任何顯著生物組分的部分中獲得。量測結果可於整個系統之多個位置上獲得，且指數比較整個系統群體。
可在第二量測結果之後及在補救之後獲得至少一個第三多樣性指數量測結果，且藉由至少兩種生物之相對濃度的變化來評估補救功效，如第三多樣性指數量測結果所量度。樣品中細胞之整體濃度的第一與第二量測結果之間可保持不變，對處理設備或最終產品造成任何不良影響的第一及第二生物之身分未知，且當偵測到臨限變化時，可添加有效殺生物劑至系統中以殺死第一及第二生物。生物中之一者能夠形成對殺生物劑具有抗性之孢子，且當相對量之該生物生長超過臨限值時，可使處理劑靶向至具有營養細胞之處理區域以防止孢子形成。
【發明之詳述】
提供以下定義以確定本申請案中如何使用術語，及尤其如何解釋申請專利範圍。定義之組織僅為了方便起見且不意欲將任一定義限於任何特定類別。
「接附生物(Adaptor)」意謂對生物控制程式展現一定耐受性水準之生物。當接附生物之微生物競爭因殺生物劑而減小時，此接附生物能夠茂盛繁殖且可形成生物膜。
「生物(Biological)」意謂組成物的至少10%(以體積或質量計)包含來自生物之細胞之組成物。
「缺陷(Defect)」意謂與工業處理相關之項目之不良屬性。其包括(但不限於)氈上之一或多個堵塞；及紙板屬性，諸如孔、褪色、條紋、斑點、半透明斑點及其任何組合。
「氈(Felt)」意謂由交織羊毛或用於造紙處理中之任何其他纖維製成之帶，其充當材料輸送器，其中交織纖維限定水或其他流體可通過之多個腔。氈亦可在壓輥之間提供緩衝且亦可為用以自造紙材料移除水之介質。氈包括(但不限於)底氈、底板氈、滾筒薄紙濕氈、乾燥器氈、無縫氈、拾取氈、吸入式拾取氈、Harper頂氈及頂氈。
「機會主義生物(Opportunist)」意謂藉由安定於預先建立之生物膜、殼、沈積物或其他生物群落中而茁壯成長且傾向於代替、置換先驅生物及/或先前機會主義生物或與其一起共存的生物。
「紙產品(Paper Product)或紙板(Paper Sheet)」意謂造紙處理之任何形成之纖維結構最終產品，傳統上但未必包含纖維素纖維。該等最終產品之實例包括(但不限於)擦面紙、浴室用紙、餐巾、複印紙、打印紙、書寫紙、筆記本紙、報紙、紙板、廣告紙、黏合紙、卡紙板及其類似物。
「造紙處理(Papermaking Process)」意謂一或多種用於將原料轉化為紙產品之處理，且其包括(但不限於)諸如以下之步驟中之一或多者：製漿、消化、精煉、乾燥、砑光、壓製、起縐、脫水及漂白。
「PCR分析(PCR Analysis)」意謂聚合酶鏈反應分析。
「先驅生物(Pioneer)或原代生物(Primary)」意謂附著於清潔表面或區域、由此在該表面處引發生物膜、殼或沈積物形成之生物。
「堵塞(Plug)」意謂定位於氈腔內之材料的固體、半固體、黏性及/或其他沈積物。堵塞可抑制材料流過腔，及/或可削弱氈之任何其他功能。
「引子(Primer)」意謂組成物，典型地為短股核苷酸，已知其與DNA之特定部分互補且充當起點用於合成與鄰接於DNA之特定部分之DNA互補的核苷酸鏈。
「探針(Probe)」意謂經建構及排列以與目標DNA部分結合且當如此結合時可容易偵測且由此用以指示目標DNA部分之存在或不存在的組成物。
「qPCR分析」意謂聚合酶鏈反應定量分析。
「微生物(Microorganism)」意謂小到足以使自身潛入用於工業處理(包括造紙)之設備內、鄰接於設備、在設備之上或附著於設備之任何生物，其包括(但不限於)如此小以致不藉助於顯微鏡便無法看到的彼等生物，；肉眼可看到、但包含許多太小以致肉眼看不到之個別生物的 小生物集合或群落，以及一或多種肉眼可看到之生物，其包括(但不限於)其存在以一些方式削弱工業處理(諸如在氈內形成堵塞及/或在紙板內產生缺陷)之任何生物。
若本申請案中其他處所述之以上定義或描述與常用、辭典中或以引用方式併入本申請案中之原始資料中陳述的含義(明確或含蓄的)不一致，則本申請案及申請專利範圍術語尤其應視為根據本申請案中之定義或描述來解釋，且不應根據常見定義、辭典定義或以引用方式併入之定義來解釋。鑒於上文，若術語僅可在其由辭典解釋時理解的情況下，若術語由Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，第5版(2005)(由Wiley,John & Sons公司出版)定義，則此定義應控制術語如何在申請專利範圍中定義。
本發明之至少一個具體實例係關於一種藉由將系統之至少一部分的當前多樣性指數與基線指數比較來鑑別微生物感染之方法。幾乎無市售處理系統為100%不含微生物。處理系統設施通常涵蓋巨大體積，具有許多輸入，生物可經由其進入且含有眾多不同生態席位用於其定殖，如此其始終具有一些生物群體。然而，自商業立場出發，與繁殖有有害生物(諸如削弱處理、損壞產品或給人帶來危險之生物)相比，系統繁殖有良性生物更佳。因此，使用多樣性指數為適用診斷方法，其使群體變化與良性效應至有害效應之變化相關。正確鑑別存在何等生物且其在何處之方法可有助於選擇適當補救辦法且將其部署於最佳位置。
多樣性指數為存在於市售處理系統中之生物的生物多樣性之快照。多樣性指數可為全系統的或可限於處理系統之某些部分。舉例而言，因為造紙處理之流漿箱為許多富流體輸入之匯合點，所以其通常高度繁殖有微生物且可預期具有隨時間廣泛變化之多樣性指數。相比而言，用於造紙處理中之經處理淡水幾乎不含生物，因此其中多樣性及豐度自若干 生物至一系列細菌之變化將指示問題。因此，有時注意特定部分之多樣性指數可深入瞭解全系統多樣性指數未提供之內容。注意多樣性變化之種類及其定位於何處影響殺生物劑之饋入點應定位於何處及群體應如何處理。
在至少一個具體實例中，多樣性指數用以在有害微生物效應出現之前搶先避免有害微生物效應。因為存在如此多不同種類之生物，其對應於市售處理系統中特定之特定問題，所以有時集中於特定目標生物之存在或不存在或相對比率為有效的。舉例而言，一些生物為先驅生物且一些生物為接附生物膜形成劑。先驅生物產生生物膜或殼沈積物，其中先前無一者，而接附生物膜形成劑對處理程式展現抗性。若對多樣性指數之檢查首先顯示膜或殼主要包含一種生物、隨後其組成變為不同生物，則其可指示先驅生物轉變為機會主義接附生物且殺生物劑方案可經改進以適當解決此情況。類似地，若原代生物膜形成劑傾向於根據一種機制且接附生物根據另一機制進入系統，則適當鑑別存在何種生物有助於鑑別微生物污染之載體來源。
在至少一個具體實例中，多樣性分析可用於集中對最終產品之品質控制檢查。舉例而言，一些生物(諸如一些真菌)自身並不導致顯著削弱處理，但其形成傾向於變得嵌入最終產品或機器組件中之塊體且由此導致不良缺陷、氈脫水減少及機械效率降低。多樣性指數中真菌之濃度升高表示對於最終產品之缺陷的特別緊密審核為適當的。
在至少一個具體實例中，指數變化之性質不如多樣性變化之速率顯著。舉例而言，若既定多樣性指數隨時間傾向於顯示相對靜態群體多樣性，但其突然變化，則此指示系統中之一些重要東西已改變。此可意謂材料輸入可具有刺激群體變化之缺陷，或一台設備可損壞或出故障，其為不同生物開拓新生態席位。因此，多樣性指數分析可用於偵測處理系統中之非生物問題。
在至少一個具體實例中，多樣性指數變化可用於在潛在問題實際上顯示之前偵測其。如先前提及，多樣性指數變化可指示缺陷材料或損壞或出故障之設備。有時，多樣性變化可在其他不良影響出現(諸如操作效率損失或缺陷之最終產品)之前偵測，且鑑別多樣性變化之原因可在潛在問題之效應以顯著或昂貴方式顯示之前討論其。類似地，多樣性變化可指示殼沈積物或生物膜或另一生物誘發之問題將出現，但指數允許問題微生物在其產生其相關問題之前經移除。有時，急劇變化指示先前阻斷有害生物之定殖努力的良性物質不再有效且有害生物現自由定殖於該生態席位。
在至少一個具體實例中，分析多樣性指數係在所分析區域內之總細胞計數保持不變、但微生物之組成變化之情況下進行。在至少一個具體實例中，多樣性變化對應於總細胞計數增加或減少之情況。
在至少一個具體實例中，對處理系統之一或多個部分定期取樣用於其多樣性指數。樣品指數可隨時間變化，且可與設施處之其他事件(諸如某些設備之啟動、停用、操作狀態、生產率及/或溫度、及/或不同材料、添加劑或化學品之使用)相關。此允許使用生物多樣性作為設施處之品質控制的另一手段。對應於一些其他事件之顯著多樣性變化指示其他事件可對處理具有一些出乎意料之積極或消極影響。
在至少一個具體實例中，已知一些微生物誘發之效應在自污染時刻起特定量之時間過去之後出現。因此，多樣性指數變化可用於測定生物花費多久而導致其相關問題。此方法可用作診斷(以查明生物如何起作用)以及成本最佳化工具。成本最佳化可藉由根據多樣性變化接收將在既定時段內出現之問題的預警、在其具有更低成本或更高可用性(與作為對意外緊急事件之突然反應而獲得時相比)時使用預警獲得或使用補救辦法來實現。
在至少一個具體實例中，多樣性指數可用於偵測形成孢子之生物。當此等生物呈孢子形式時，其幾乎不具有或不具有代謝活性且對殺生物劑具有高度抗性。一旦生物呈孢子狀態，則需要大量殺生物劑以控制生物，且孢子使其進入最終產品之可能性變得極高。Dairyman之液體包裝標準可能不滿足存在孢子之情形。相比而言，當此等生物呈營養狀態時，其對殺生物劑敏感且更容易控制。藉由多樣性指數方法偵測形成孢子之生物使生物控制程式之焦點轉移為防止孢子形成。
在至少一個具體實例中，多樣性指數分析之結果用以藉由測定多少、何種及每隔多久一或多種殺生物劑組成物添加至市售處理系統內之一或多個位置來加強生物控制程式。在至少一個具體實例中，任何及所有以上及以下具體實例應用於市售系統，諸如工業系統，包括(但不限於)處理水系統、造紙處理、製漿處理、食品加工處理、化學精煉處理、木材加工處理、水過濾處理、水純化處理、化學合成處理、塗佈處理、使用有機化學之處理及其任何組合。在至少一個具體實例中，多樣性指數用以評估發現於機器沈積物、薄板缺陷、最終產品、氈等中之問題微生物。該方法基於樣品提取物中之核酸分析。
在至少一個具體實例中，多樣性指數之成分鑑別係經由基於DNA之分析實現，其涉及使用PCR引子偵測微生物之存在、不存在及量。美國專利5,928,875描述使用PCR引子偵測形成孢子之細菌的存在或不存在。在至少一個具體實例中，引子靶向DNA股中之在生物群中高度保守的一部分。因此，偵測DNA之該特定部分之存在為特定生物存在之明確證據。PCR分析由於正確鑑別其污染微生物之難度而尤其適用於分析氈及紙板，因為其不具有用於傳統塗佈法或ATP量測之活生物。
在至少一個具體實例中，PCR分析涉及利用Randall Saiki等人之論文Primer Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase,Science，第239卷，第487-491頁(1988)中所述之一或多種方法。在至少一個具體實例中，PCR分析涉及利用Kary Mullis等人之the Article Specific Synthesis of DNA in Vitro via a Polymerase-Catalyzed Chain Reaction,Methods In Enzymology，第155卷，第335-350頁(1987)中所述之一或多種方法。
在至少一個具體實例中，PCR分析為如Jo Vandesompele作序之Trade Brochure qPCR guide(如2012年1月19日自網站http：//www.eurogentec.com/file-browser.html下載)中所述之qPCR分析。在至少一個具體實例中，該方法為定量qPCR分析。在至少一個具體實例中，該方法為定性qPCR分析。
在至少一個具體實例中，聚合酶鏈反應(PCR)為靶向核酸(DNA或RNA)之序列且增加目標序列之複本數以獲得適用量之核酸用於下游分析的方法。此方法可應用於偵測多種樣品(包括(但不限於)氈機、薄板缺陷、機器沈積物等)中之微生物。
在至少一個具體實例中，一旦使用可商購之任何DNA提取套組自樣品提取DNA，則其可使用PCR方法(諸如定量PCR方法)即時分析。定量PCR利用與PCR相同之方法，但其包括即時定量組分。在此技術中，引子用以基於生物之身分或特定基因之功能靶向相關DNA序列。一些偵測形式(諸如螢光)可用於偵測所得DNA或『DNA擴增子』。螢光變化與目標DNA之量成正比。將達成預定螢光臨限值所需之循環數與對應於特定DNA目標之標準相比。標準物典型地為純目標基因，且在範圍為幾個對數之濃度下的量已知。存在於樣品中之目標DNA之複本數係使用標準曲線計算。每個樣品之複本數隨後用以測定每個樣品中之細胞數。
在至少一個具體實例中，使用保守方法、利用靶向細菌DNA序列的引子組來定量總細菌。在至少一個具體實例中，使用靶向原代生物 膜形成細菌(包括(但不限於)亞棲熱菌(Meiothermus)、假黃單胞菌(Pseudoxanthomonas)及異常球菌(Deinococcus))之引子組。在至少一個具體實例中，使用靶向屬於鞘脂單胞菌(Sphingomonadacea)細菌科之接附生物膜形成劑的引子組。在至少一個具體實例中，接附生物膜形成劑對基於氧化劑之生物控制程式展現的耐受性高於其他生物膜及浮游微生物。在至少一個具體實例中，使用引子區分真菌與細菌感染。
在至少一個具體實例中，該方法涉及在生物結構域層面區分DNA。在至少一個具體實例中，該方法涉及區分細菌、古菌(Archaea)及真核生物(Eukaryota)之DNA。此等生物具有非常不同之DNA，且集中於在結構域層面鑑別生物之DNA的方案比更特定測定方案簡單得多。因為在氈之情況下，來自不同域之生物通常經不同方式最佳處理，所以該種簡單鑑別形式可用於準確鑑別最佳靶向特定污染物之特定方案。在至少一個具體實例中，所用測試應使得其不會在相同域之生物之間或不同種類之細菌之間或不同種類之古菌之間或不同種類之真核生物之間作出區分。
在至少一個具體實例中，使用一種以上引子鑑別具有一種以上可獨特識別之核苷酸序列的生物。在至少一個具體實例中，使用PCR分析偵測與特定生物獨有或接近獨有之酶相關的基因組序列。
在至少一個具體實例中，該方法涉及偵測缺陷及隨後利用PCR分析正確分析缺陷之多樣性指數。在至少一個具體實例中，該方法確定缺陷是否完全基於生物學、完全基於非生物化學或由基於非生物化學、機械及生物學之來源組合產生。在至少一個具體實例中，缺陷為氈上之一或多個堵塞。在至少一個具體實例中，缺陷為具有以下至少一者或多者之紙板：孔、在其至少一部分周圍具有褪色暈輪之孔、褪色之條紋、斑點、半透明斑點及其任何組合。
在至少一個具體實例中，臨限水準為用以減少假陽性之方 法。有時，PCR分析偵測雖然存在但不為特定缺陷之原因的痕量生物。在至少一個具體實例中，該方法涉及減少任何生物之存在，對此生物所偵測到之濃度低於一或多種特定生物之已知預定含量。在至少一個具體實例中，該方法涉及使偵測含量低於104個細胞/公克(缺陷)之任何生物之存在減少。在至少一個具體實例中，該方法涉及使偵測含量低於104個細胞/毫升之任何生物之存在減少。
在至少一個具體實例中，該方法能夠偵測先前技術方法無法以其他方式偵測之微生物。舉例而言，在污垢物由厭氧或硫酸鹽還原生物感染產生之情況下，諸如ATP偵測之方法不會正確鑑別生物形式之污垢物來源，此由於微生物在厭氧條件下產生之ATP量顯著少於在好氧條件下。因此，將不正確地鑑別污垢物來源，且使用化學而非抗生物方法試圖解決該問題。在另一實例中，使用傳統方法(諸如塗佈、ATP偵測等)區分氈中微生物與化學污染幾乎不可能，此因為此等樣品在輸送期間均變乾且所有活生物均死亡。利用DNA方法將始終正確指示生物感染，此因為所有生命均含有DNA。
多樣性指數可使用PCR(諸如(但不限於)qPCR)偵測總生物，諸如細菌；鞘脂單胞菌(Sphingomonas)種；赤桿菌(Erythrobacter)種；假單胞菌(Pseudomonas)種；伯克霍爾德菌(Burkholderia)種；束縛桿菌(Haliscomenobacter)種；腐敗螺旋菌(Saprospira)種；施萊格爾菌(Schlegelella)種；纖毛菌(Leptothrix)種；浮游球衣細菌(Sphaerotilus natans)；桿菌(Bacillus)種；厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus)種；噬細胞菌-黃桿菌-擬桿菌(Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides)門之成員；未經處理無硫細菌，包括滑柱菌(Herpetosiphon)；異常球菌-棲熱菌(Deinococcus-Thermus)門之成員，包括亞棲熱菌種；產生過氧化氫酶之細菌；產生澱粉酶之細菌；產生尿素酶之細菌；硝化細菌；真菌等。此等技術利用允許基於保守序列 偵測及定量目標生物之引子及標準物對。引子靶向在微生物基因組中經由演化而具高度保守性之區域，而特定門或屬之引子靶向基因組之更多可變區。
能夠準確定量存在於樣品中之相關生物使得可能以樣品中之總細菌負荷的百分比形式表示該生物。多樣性指數亦可以若干目標生物之相對豐度形式定量表示。任何處理部分之多樣性指數均可在機器或處理較佳操作時量測，因此產生基線。隨後可將不良機器或處理效能時量測之多樣性指數與基線相比較以尋找微生物群體之波動及測定何等細菌群造成處理中之問題。亦可定量多樣性指數以便使用向農多樣性指數(Shannon diversity index)計算進行比較以在樣品位置中比較監測資料或相對於基線進行比較。因此可隨後改變處理策略及饋入點以解決該問題。
基於DNA定量之多樣性指數量測處理中生物之存在及多樣性，不論其生存力。核糖核酸(RNA)、尤其信使RNA(mRNA)為僅由活生物產生之分子，且具有視目標而定為細菌之特定門或屬獨有的性質。藉由擴增上列生物獨有之mRNA序列，可測定何等細菌以其活形式存在。活生物之準確偵測可隨後用作評估處理水之處理策略之功效的工具。此可藉由將多樣性指數與生存力指數比較來實現。
此方法將定量存在於處理樣品中之活細菌的量及類型。定量(即時)聚合酶鏈反應方法可應用於偵測信使核糖核酸(mRNA)。mRNA為轉錄DNA，其送至核糖體充當稱為轉譯之處理中之蛋白質合成的藍圖。mRNA僅由活細胞產生。來自活細胞之RNA可藉助於市售套組分離。偵測mRNA在定量聚合酶鏈反應中需要額外步驟。添加逆轉錄酶至反應混合物以將mRNA轉錄為其互補DNA(cDNA)。此實驗需要兩組引子。第一組靶向特定mRNA，而第二組用以擴增由逆轉錄酶反應產生之所得cDNA。
下文中具體參考圖式來描述本發明之實施方式，其中：圖1含有三幅圖，其說明應用本發明快速偵測經塗佈之自由薄板研磨機處收集之流漿箱沈積物中的總細菌(A)、原代(B)及接附(C)生物膜形成細菌。
圖2說明本發明所應用之經塗佈之自由薄板研磨機(1-5)、薄紙研磨機(6)及未經塗佈之自由薄板研磨機(7)的薄板缺陷之總細菌負荷之圖。
圖3為本發明所應用之薄板缺陷樣品的總細菌負荷之圖。
圖4說明圓餅圖，其表示自三個不同造紙廠之氈機收集的DNA樣品中之微生物多樣性。
可參考以下實施例更好地理解上文，該等實施例係出於說明之目的呈現且不欲限制本發明之範疇。
實施例#1
經塗佈之自由薄板研磨機在機器流漿箱中之一者中經歷持續沈積，其咸信為最終產品中之缺陷之原因。流漿箱自身受化學沈積物聚積及纖維生長影響。顯微及化學分析顯示聚積物內存在極少至無細菌。假定微生物為問題之潛在原因。然而，用以分析處理樣品之傳統監測技術(例如標準平板計數及ATP水準)並不指示微生物活性之水準升高。特定言之，結果指示不超過100 CFU/ml且不超過100 RLU(ATP)。
使用qPCR技術分析數月期間之來自流漿箱之沈積物樣品以形成多樣性指數。分析流漿箱沈積物之初始qPCR結果展現高水準之微生物負荷以及升高密度之先驅及接附生物膜形成劑(圖1)。藉由添加殺生物劑至製漿機及碎紙倉中加強處理策略。基於氧化劑之生物控制程式的饋入速率亦增加。一個月後收集之沈積物的分析偵測到流漿箱沈積物之總細菌負荷發生極小變化(圖1A)。先驅生物膜形成劑之數目減少一個對數，而接附生物膜形成劑之密度減少四個對數(圖1B及1C)。流漿箱沈積物之量及薄板缺陷之頻率繼續保持不變。紙料及處理水系統之傳統塗佈及ATP分析指示極小生物活性。將ATP及平板計數值平均化，分別為小於100 RLU及100個菌落形成單位/公克(CFU/g)。
經由添加不穩定氯及殺生物劑至碎紙倉及製漿機中來進一步使處理策略最佳化。在最後一組變化實施之後，收集及分析其他樣品。沈積物之總細菌負荷顯示幾乎一個對數之減少(圖1A)。最後一組沈積物樣品顯示原代生物膜形成劑之密度降低幾乎兩個對數(圖1B)。接附生物膜形成劑保持在幾乎背景水準下(圖1C)。再者，儘管微生物群體之控制改良，但缺陷頻率、缺陷性質及流漿箱沈積保持不變。
使用基於qPCR之相同方法分析來自此研磨機之薄板缺陷。使用傳統塗佈及ATP方法不可能測定缺陷中之細菌含量，此因為可能已存在於缺陷中之許多細菌由乾燥器區段之高溫殺死。化學分析不提供有關存在於薄板中之細菌的明確答覆，此由於其依靠茚三酮(ninhydrin)染色。此方法為非特定的且有假陽性及假陰性結果傾向。來自此研磨機之孔及薄板缺陷之DNA分析偵測到極低細菌密度(圖2，樣品1-5)。在分析來自此研磨機之薄板缺陷中偵測不到原代及接附生物膜形成劑。因此，細菌黏液不可能造成此研磨機處之缺陷及品質問題。相比而言，受顯著生物沈積影響之研磨機具有含有高得多的微生物負荷之缺陷(圖2，樣品6)。此外，鑑別出在沈積物及缺陷中存在類似細菌種。此等缺陷之茚三酮染色導致陽性反應，指示微生物存在。在另一情況下，偵測到薄板缺陷中的細菌含量恰好高於視為生物缺陷所需之最小密度。然而，茚三酮反應為陰性，指示缺陷並不含有微生物(圖2，樣品7)。流漿箱沈積物之定量qPCR檢驗顯示在對處理策略進行各改進之後原代及接附生物膜形成劑均減少。此等目標生物存在劇烈減少且沈積量或缺陷頻率不減少之事實指示細菌可能不造成此機器系統中之缺陷問題。原代生物膜形成劑定殖於機器表面且產生有利於其他生物類型之附著及增殖的環境。在此等生物不存在下，細菌可在可充當良好生長培養基之化學碎屑沈積之後附著於機器表面。化學添加劑及纖維很可能沈積於流漿箱內，產生適用於微生物定殖之微環境。因為薄板缺陷之分析展現疏忽微生物存在，所以排除微生物為流漿箱中之主要沈積來源及對產品品質之不良影響。改良機器效能之努力不集中於對系統之生物控制且集中於更佳機械控制，從而改良操作條件及產品品質。
實施例#2
數年來，經塗佈之自由薄板研磨機係利用基於氧化劑之競爭性生物控制程式。微生物生長之控制視為充足；然而，有機會進一步減少 薄板破碎以達成改良之處理效率。實施程式且在數個階段中使其最佳化。處理各處之細菌密度保持較低且證明薄板破碎之減少。每天破碎之平均數目自每天1.2個破碎之平均值減少至每天0.42個破碎。
在實施最佳化程式大約兩年之後，觀測到處理條件已變得更可變且維持相同控制水準需要增加生物控制產品濃度。使用傳統監測工具(諸如平板計數及ATP量測結果)之系統測量指示處理水系統中之細菌密度保持較低且在流漿箱及碎片系統中觀測不到或觀測到極小增加。然而，研磨機遭受孔及缺陷之嚴重爆發。雖然傳統監測技術指示生物控制程式之效能無變化，但線上活性監測器偵測到增加之微生物活性(圖3)。
利用機器沈積物及薄板缺陷之qPCR分析的多樣性指數分析均證實先驅及接附生物膜形成劑之存在。缺陷中總細菌之密度為大約1.8×107個細胞/公克(圖3)。此證據指示微生物在缺陷及品質問題中之作用。機器進行苛性沸煮，其後線上活性監測器顯示微生物活性減小及更穩定ORP值，指示改良之程式效能及恢復力。薄板缺陷中微生物之量在沸煮之後自107減少至105個細胞/公克(圖3)。此證實qPCR可偵測微生物對薄板缺陷之作用，其不能使用傳統技術偵測。另外，qPCR可用以評估生物控制程式對最終產品之功效。
實施例#3
使用qPCR分析來自兩家造紙廠、經歷效能問題之氈樣品，該等效能問題本身顯示為機器上沈積物及薄板缺陷。測試各樣品中微生物之存在。一旦確定各樣品含有大量細菌，則分析樣品中接附及原代生物膜形成劑之存在，其包括已知造成機器效率及產品品質問題的鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae fm.)、亞棲熱菌、地熱菌(Geothermus)及假黃單胞菌。兩個研磨機均含有正常含量之接附生物膜形成劑，然而研磨機1具有之原代生物膜形成劑為研磨機2的兩倍多(圖4)。接附生物膜形成劑之含量經 測定為正常的，此由於其含量在指示不可能造成問題之範圍中。多樣性指數顯示研磨機2處之先驅生物膜形成劑之含量接近背景含量。研磨機2處之高先驅生物膜形成劑含量表明氈中形成生物膜，導致氈堵塞及自薄板移除之水減少。氈上存在生物膜可導致其他物質沈積增加，其隨後可再沈積至薄板上。研磨機1處之先驅生物膜形成劑含量升高表明需要另外分析其他處理部分(諸如噴淋水、添加劑、儲存箱等)來測定此等生物起源於何處。
此等實施例之結果顯示，習知塗佈技術及氧化劑殘餘物可指示足夠的殺生物劑劑量及微生物生長控制，而沈積、缺陷及破碎仍為普遍的。利用包含PCR及qPCR方法之多樣性指數提供關於工業水系統中之微生物生長及生物膜形成的更準確資訊。此等策略允許快速分析微生物對沈積物形成之作用，且可用於快速測定含有微生物之沈積物是否造成缺陷。
基於qPCR之多樣性指數允許快速分析薄板缺陷以測定微生物對品質問題之作用。此新方法已經證實允許更前瞻性診斷問題，從而改良機器效率及產品品質。
雖然本發明可以多種不同形式體現，但本文中詳細地描述本發明之特定較佳具體實例。本發明為本發明原理之例證，且不欲將本發明限於所說明之特定具體實例。本文中所提及之所有專利、專利申請案、科學文件及任何其他參考資料均以全文引用的方式併入。此外，本發明涵蓋本文中描述及/或併入本文中之各種具體實例中的一些或全部之任何可能組合。另外，本發明涵蓋亦尤其排除本文中描述及/或併入本文中之各種具體實例中的任一者或一些之任何可能組合。
以上揭示內容意欲為說明性的而非窮舉的。此描述將使此項技術之一般技術者想起多種變化形式及替代方案。所有此等替代方案及變化形式欲包括於申請專利範圍之範疇內，其中術語「包含」意謂「包括(但 不限於)」。熟習此項技術者可認識到本文中所描述之特定具體實例的其他等效形式，亦希望申請專利範圍涵蓋該等其他等效形式。
本文中所揭示之所有範圍及參數應理解為涵蓋包含於其中之任何及所有子範圍以及端點之間的每個數字。舉例而言，「1至10」之既定範圍應視為包括介於最小值1與最大值10之間(且包括端點)的任何及所有子範圍；亦即始於最小值1或大於1(例如1至6.1)且終於最大值10或小於10(例如2.3至9.4、3至8、4至7)且最終至此範圍內所含各數1、2、3、4、5、6、7、8、9及10的所有子範圍。
由此完成對本發明之較佳及替代具體實例之描述。熟習此項技術者可認識到本文中所描述之特定具體實例的其他等效形式，希望隨附申請專利範圍涵蓋該等其他等效形式。

Claims (11)

  1. 一種處理(addressing)工業處理系統中之微生物感染的方法，該方法包含以下步驟：進行至少一個第一量測，其鑑別存在於該工業處理系統之至少一部分中的兩種或兩種以上生物之相對濃度，進行至少一個第二量測，其鑑別存在於該工業處理系統之該至少一部分中的兩種或兩種以上生物之相對濃度，該鑑別至少部分地界定後續多樣性指數，該至少一個第二量測比該(該等)第一量測更晚進行，注意該兩種生物之濃度的任何相對變化，若該等經量測生物中之一者的相對濃度超過預定臨限量，則測定該變化是否與對該工業處理系統之不良影響相關，及實施補救辦法以補救該不良影響，其中該方法進一步包含以下步驟：鑑別該等生物中之一者是否為先驅生物(pioneer)及其中之一者是否為接附生物(adaptor)或機會主義生物(opportunist)，若其中之一者為先驅生物且其濃度之增加在該後續指數中超過該臨限值，則該補救包括應用靶向該先驅生物之殺生物劑方案，且若未偵測到先驅生物，則該補救包括鑑別及消除促進該等微生物沈降之非生物載體。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一及第二量測藉由選自由以下者組成之清單的至少一項進行：DNA分析、PCR分析、qPCR分析及其任何組合。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該臨限量為每毫升獲自該系統之流體104個細胞或每公克該工業處理之最終產品或來自該工業處理之固體樣品104個細胞。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中不論該兩種或兩種以上生物之 身分，若其相對濃度相對於先前的量測之增量超過該臨限值，則即使整體生物群體保持相同，仍對該系統施以殺生物劑處理。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含以下步驟：使該多樣性指數變化與該工業系統中發生之另一事件相關，該另一事件選自由以下者組成之清單：改變至少一種饋料之來源、改變至少一種饋料之種類、改變該系統之至少一部分的操作速率及其任何組合，及使該事件逆轉。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中樣品中細胞之整體濃度在該第一與第二量測之間保持不變。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等量測在已有沈積物形成於其上之系統中之一部分中進行且該沈積物不含有任何顯著生物組分。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等量測於整個系統中之多個位置上進行，且該等指數比較整體系統群體。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該第二量測之後及在該補救之後進行至少一個第三多樣性指數量測，且藉由根據該第三多樣性指數量測所測量之該至少兩種生物之相對濃度變化來評估該補救功效。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中樣品中細胞之整體濃度在該第一與第二量測之間保持不變，第一及第二生物之身分未知會對處理設備或最終產品造成任何不良影響，以及當偵測到臨限變化時，添加有效殺生物劑至該系統中以殺死該第一及第二生物。
  11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等生物中之一者能夠形成對殺生物劑具有抗性之孢子，以及當該生物之相對量成長超過該臨限值時，將處理靶向具有營養細胞之處理區域以防止孢子形成。
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