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TWI549687B - 胃抑胜肽受體活化之胰高血糖素化合物 - Google Patents

胃抑胜肽受體活化之胰高血糖素化合物 Download PDF

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TWI549687B
TWI549687B TW099119633A TW99119633A TWI549687B TW I549687 B TWI549687 B TW I549687B TW 099119633 A TW099119633 A TW 099119633A TW 99119633 A TW99119633 A TW 99119633A TW I549687 B TWI549687 B TW I549687B
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約瑟 家貝爾
強納生 戴
詹姆士 帕特森
布萊恩Ｃ 沃德
陶馬
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印地安那大學研究及技術公司
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Description

胃抑胜肽受體活化之胰高血糖素化合物
本發明係提供一種胰高血糖素胜肽類似物，其係於胃抑胜肽受體(GIP)顯現促效劑(agonist)活性。同時於本文提出使用此等類似物之方法。
胰高血糖素前原(pre-proglucagon)係一種於不同組織中經處理而形成之許多不同胰高血糖素原(proglucagon)衍生肽之158個胺基酸前體多肽，包括：胰高血糖素(glucagon)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)及調酸素(OXM；oxyntomodulin)，其係參與多樣生理功能，包括葡萄糖體內平衡、胰島素分泌、胃排空、及腸道生長、以及食物攝取量調節。胰高血糖素(Glucagon)係對應於胰高血糖素前原由胺基酸33至61含29個胺基酸之胜肽，而胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)係經產生為對應於胰高血糖素前原由胺基酸72至108含37個胺基酸之胜肽。胰高血糖素樣肽-1(7-36)醯胺或胰高血糖素樣肽-1(7-37)酸係胰高血糖素樣肽-1之生物有效形式，其係對主要對胰高血糖素樣肽-1受體展現相等之活性。
當血糖值降得太低時而不能提供足夠能量供身體活動時，會發生低血糖症。在成人或超過10歲大的孩童中，低血糖症除了作為糖尿病治療之副作用出現外，並不常見，但其會由其他的藥物治療或疾病、激素或酵素缺乏、或腫瘤所引起。當血糖開始下降時，胰高血糖素(一種由胰臟所產生的激素)會對肝臟發出分解肝醣(glycogen)及釋放葡萄糖的信號，導致血糖值朝向正常值上升。因此，胰高血糖素於葡萄糖調節中所扮演的一般角色係為抗衡胰島素的作用及維持血糖值。然而，對於糖尿病患，此胰高血糖素對低血糖症的反應可能受損，而使得葡萄糖值更難回到正常範圍。
低血糖症係一種需要立即醫療而威脅生命的事件。施予胰高血糖素係為一種用於治療急性低血糖症已確定的藥物療法，且其係可於給藥的數分鐘內恢復正常葡萄糖值。當將胰高血糖素用於低血糖症的急性醫療時，將結晶形態的胰高血糖素用稀酸緩衝液溶解，且以肌內注射該溶液。雖然此治療有效，但此方法對於意識不清的人士而言麻煩且危險。因此，需要有一種胰高血糖素類似物，其係可維持或超越母分子之生物效能但在相關之生理條件下充分可溶解且穩定，且可預先調配為溶液，而可立即注射。
此外，糖尿病患者被鼓勵要維持接近正常的血糖值，以延緩或預防微血管併發症。此目標之達成通常需要密集的胰島素治療。於努力達成此目標時，醫師已遭遇其糖尿病患中之低血糖症頻率及嚴重度的大量增加。因此，需要比目前的胰島素療法更不易誘導低血糖症，用於治療糖尿病的改良藥物及方法。
胰高血糖素樣肽-1具有與胰高血糖素不同之生物活性。其作用包括：刺激胰島素合成及分泌、抑制胰高血糖素分泌，以及抑制食物攝取量。胰高血糖素樣肽-1已證實可降低糖尿病患中之高血糖症(升高之葡萄糖值)。促胰島素分泌素-4(exendin-4)，一種與GLP-1共有約50%胺基酸相似度來自蜥蜴毒液(lizard venom)之胜肽，其係活化GLP-1受體且同樣已證實可降低糖尿病患中之高血糖症。
其亦證實胰高血糖素樣肽-1及促胰島素分泌素-4可降低食物攝取量及促進減重，其係一種不僅對糖尿病患，且亦對罹患肥胖症之病患有益之效果。肥胖症之病患有較高的糖尿病、高血壓、高脂血症、心血管疾病、及肌肉骨骼疾病之風險。
因此，有需要用於治療糖尿病及肥胖症之替代且較佳經改良之方法。
如本文所述，本發明係提供一種胰高血糖素胜肽類似物，其係於胃抑胜肽受體(GIP)顯現促效劑(agonist)活性。同時於本文提出使用此等類似物之方法。
天然胰高血糖素(SEQ ID NO:1)不會活化胃抑胜肽受體，且天然胰高血糖原本於胃抑胜肽受體顯現0%(例如：小於0.001%、0.0001%)之天然胃抑胜肽活性。天然胰高血糖素亦於胰高血糖素樣肽-1受體，具有約1%天然胰高血糖素樣肽-1活性。如本文所述對該天然胰高血糖素序列(SEQ ID NO:1)之修飾產生胰高血糖素胜肽類似物，其係可顯現與天然胰高血糖素(SEQ ID NO:1)活性相等或更佳之有效胰高血糖素活性，與天然胃抑胜肽(SEQ ID NO:675)活性相等或更佳之有效胃抑胜肽活性，及/或與天然胰高血糖素樣肽-1、胰高血糖素樣肽-1(7-36)醯胺(SEQ ID NO: 52)或胰高血糖素樣肽-1(7-37)酸(SEQ ID NO: 50)之活性〈係胰高血糖素樣肽-1之生物有效形式，證實基本上對胰高血糖素樣肽-1受體相等之活性〉相等或更佳之有效胰高血糖素樣肽-1活性。如本文所述之數據證實具有胃抑胜肽活性及胰高血糖素樣肽-1活性之胰高血糖素類似物對於導致體重降低或預防體重增加，以及治療高血糖症，包括糖尿病，特別有效。有鑑於先前技術之教示，即拮抗胃抑胜肽為降低日常食物攝取量及體重，並增加胰島素敏感性及能量消耗，該活性並未特別地被預期。(Irwin et al.,Diabetologia 50:1532-1540(2007);and Althage et al.,J Biol Chem,e-publication on April 17,2008).。
因此，於某些實施例中，該胰高血糖素類似物於100 nM或更少，或約：75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1 nM或更少時，顯現對胃抑胜肽受體活化活性之EC50值。於某些實施例中，本文所述之類似物於約0.001 nM、0.01 nM或0.1 nM之胃抑胜肽受體顯現一EC50值。於某些實施例中，本文所述之類似物於不超過1 nM、2 nM、3 nM、4 nM、5 nM、6 nM、8 nM、10 nM、15 nM、20 nM、25 nM、30 nM、40 nM、50 nM、75 nM、或100 nM之胃抑胜肽受體顯現一EC50值。於某些實施例中，該類似物於100 nM或更少，75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1 nM或更少時，顯現對胰高血糖素受體活化之EC50值。於某些實施例中，本文所述之類似物於約0.001 nM、0.01 nM或0.1 nM之胰高血糖素受體顯現一EC50值。於某些實施例中，該於胰高血糖素受體之EC50值係不超過1 nM、2 nM、3 nM、4 nM、5 nM、6 nM、8 nM、10 nM、15 nM、20 nM、25 nM、30 nM、40 nM、50 nM、75 nM、或100 nM。於某些實施例中，該類似物顯現約100 nM或更少，或約：75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1 nM或更少之對胰高血糖素樣肽-1受體活化之EC50值。於某些實施例中，本文所述之類似物於約0.001 nM、0.01 nM或0.1 nM之胰高血糖素樣肽-1受體顯現一EC50。於某些實施例中，該於胰高血糖素樣肽-1之EC50值係不超過1 nM、2 nM、3 nM、4 nM、5 nM、6 nM、8 nM、10 nM、15 nM、20 nM、25 nM、30 nM、40 nM、50 nM、75 nM、或100 nM。受體活化係藉體外(in vitro)測定法而測得，其係於HEK293細胞過度表現該受體以測試cAMP之誘導，例如：測定之HEK293細胞與DNA編號之受體共同轉染，且具連接至如例子14所述之cAMP反應單元(responsive element)之一螢光酶基因(luciferase gene)。
於某些實施例中，該類似物於胃抑胜肽受體相對於天然胃抑胜肽(胃抑胜肽效能)顯現至少約0.005%、0.0075%、0.01%、0.025%、0.05%、0.075%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175%或200%或更高之活性。於某些實施例中，本文所述之類似物於胃抑胜肽受體相對於天然胃抑胜肽顯現不超過約100%、1000%、10,000%、100,000%，或1,000,000%之活性。於某些實施例中，該類似物於胰高血糖素受體相對於天然胰高血糖素(胰高血糖素效能)顯現至少約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%或更高之活性。於某些實施例中，本文所述之類似物於胰高血糖素受體相對於天然胰高血糖素顯現不超過約100%、1000%、10,000%、100,000%，或1,000,000%之活性。於某些實施例中，該類似物於胰高血糖素樣肽-1受體相對於天然胰高血糖素樣肽-1(胰高血糖素樣肽-1效能)顯現至少約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175%或200%或更高之活性。於某些實施例中，本文所述之類似物於胰高血糖素樣肽-1受體相對於天然胰高血糖素樣肽-1顯現不超過約100%、1000%、10,000%、100,000%，或1,000,000%之活性。
於特定實施例中，如本文所述之類似物及胰高血糖素胜肽，當缺少親水性基團時，例如：聚乙二醇(PEG)，顯現標示%之活性，然而，當包含親水性基團時，例如：聚乙二醇(PEG)，顯現一降低%之活性(例如：約10倍降低之活性)。因此，於某些實施例中，該類似物於缺少親水性基團時顯現前述%活性程度，並於包含親水性基團時，顯現一約10倍降低之活性。一類似物於一受體相對於該受體之一天然配體之活性，其係以該類似物對天然配體兩者之EC50取倒數計算。
因此，本發明之一方面提供係可於胰高血糖素受體及胃抑胜肽受體顯現活性之類似物(胰高血糖素/胃抑胜肽共同促效劑(co-agonist))。此類類似物缺少天然胰高血糖素之選擇性(其係胰高血糖素受體相對於胃抑胜肽受體之選擇性)。於某些實施例中，該類似物於胃抑胜肽受體之EC50，與其於胰高血糖素受體之EC50不同，係少於約50倍、40倍、30倍或20倍(較高或較低)。於某些實施例中，該類似物之胃抑胜肽效能，與其於胰高血糖素效能不同，係少於約500倍、450倍、400倍、350倍、300倍、250倍、200倍、150倍、100倍、75倍、50倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍(較高或較低)。於某些實施例中，該類似物於胃抑胜肽受體之EC50除以該類似物於胰高血糖素受體之EC50之比值，約少於100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。於某些實施例中，於胃抑胜肽受體之EC50除以胰高血糖素受體之EC50之比值，約為1或少於1(例如：約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。於某些實施例中，該類似物胃抑胜肽效能相較於該類似物胰高血糖素效能之比值，約少於500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。於某些實施例中，於胃抑胜肽受體之效能除以於胰高血糖素受體之效能之比值，約為1或少於1(例如：約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。於某些實施例中，胰高血糖素樣肽-1活性係可顯著地降低或破壞，例如：藉由第7號位置之胺基酸修飾，如：取代異白胺酸(Ile)，羧基端至第27號或第28號位置之刪除，產生27-或28-胺基酸胜肽，或其組合。
本發明之另一方面提供於胰高血糖素、胃抑胜肽及胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1 receptor)(胰高血糖素/胃抑胜肽/胰高血糖素樣肽-1三重促效劑(tri-agonist)顯現活性之類似物。此類類似物係會損失天然胰高血糖素之選擇性(其係胰高血糖素受體相對於胰高血糖素樣肽-1及胃抑胜肽受體之選擇性)。於某些實施例中，該類似物於胃抑胜肽受體之EC50，分別與其於胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體之EC50不同，係約少於5000倍、2500倍、1000倍、750倍、500倍、250倍、100倍、50倍、40倍、30倍或20倍(較高或較低)。於某些實施例中，該類似物之胃抑胜肽效能，與其於胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1效能不同，係少於約1000倍、750倍、500倍、450倍、400倍、350倍、300倍、250倍、200倍、150倍、100倍、75倍、50倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍(較高或較低)。於某些實施例中，三重促效劑於胃抑胜肽受體之EC50除以三重促效劑於胰高血糖素樣肽-1受體之EC50之比值，約少於10,000、7500、5000、2500、1000、750、500、250、100、75、60、50、40、30、20、15、10、5或1。於某些實施例中，於胰高血糖素樣肽-1受體之EC50除以於胃抑胜肽受體之EC50之比值，約為5、4、3、2或1，或少於1(例如：少於約0.00001、0.0001、0.001、0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。於某些實施例中，於胰高血糖素樣肽-1受體之EC50大於約0.1(例如：大於約0.25、0.75、1)。於某些實施例中，三重促效劑於胃抑胜肽受體之效能除以三重促效劑於胰高血糖素樣肽-1受體之效能之比值，約1000、750、500、250、100、75、60、50、40、30、20、15、10、5或1。於某些實施例中，於胃抑胜肽受體之效能除以於胰高血糖素樣肽-1受體之效能之比值，約為約為5、4、3、2或1，或少於1(例如：少於約0.0001、0.001、0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。於相關實施例中，三重促效劑於胃抑胜肽受體之EC50除以三重促效劑於胰高血糖素受體之EC50之比值，約少於100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。於某些實施例中，於胃抑胜肽受體之EC50除以胰高血糖素受體之EC50之比值，約為1或少於1(例如：約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。於某些實施例中，該三重促效劑之胃抑胜肽效能相較於該三重促效劑之胰高血糖素效能之比值，約少於500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。於某些實施例中，於胃抑胜肽受體之效能除以於胰高血糖素受體之效能之比值，約為1或少於1(例如：約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。於某些實施例中，三重促效劑於胰高血糖素樣肽-1之EC50除以三重促效劑於胰高血糖素受體之EC50之比值，約少於100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。於某些實施例中，於胰高血糖素樣肽-1之EC50除以胰高血糖素受體之EC50之比值，約為1或少於1(例如：約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。於某些實施例中，三重促效劑之胰高血糖素樣肽-1效能除以三重促效劑之胰高血糖素效能之比值，約少於100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。於某些實施例中，於胰高血糖素樣肽-1受體之效能除以於胰高血糖素受體之效能之比值，約為1或少於1(例如：約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。
本發明之又另一方面提供於胰高血糖素樣肽-1受體及胃抑胜肽受體顯現活性，但其中胰高血糖素活性係顯著地降低或破壞(胃抑胜肽/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑)之類似物，例如：第3號位置胺基酸修飾。舉例來說：此位置取代為酸性、鹼性或疏水性胺基酸(麩胺酸、鳥胺酸、正白胺酸)而降低胰高血糖素之活性。於某些實施例中，該類似物於胃抑胜肽受體之EC50，與其於胰高血糖素樣肽-1受體之EC50不同，係約少於1000倍、750倍、500倍、250倍、100倍、50倍、40倍、30倍或20倍(較高或較低)。於某些實施例中，該類似物之胃抑胜肽效能，與其胰高血糖素樣肽-1效能不同，係少於約1000倍、750倍、500倍、250倍、100倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍(較高或較低)。於某些實施例中，此類類似物於胰高血糖素受體具有約10%或更少之天然胰高血糖素活性，例如：約1至10%，或約0.1至10%，或大於約0.1%但小於約10%。於某些實施例中，該類似物於胃抑胜肽受體之EC50除以該類似物於胰高血糖素樣肽-1受體之EC50之比值，約少於100、75、60、50、40、30、20、15、10或5，且不少於1。於某些實施例中，該類似物之胃抑胜肽效能相較於該類似物之胰高血糖素樣肽-1之比值，約少於100、75、60、50、40、30、20、15、10或5，且不少於1。於某些實施例中，於胰高血糖素樣肽-1受體之EC50除以於胃抑胜肽受體之EC50之比值，約為5、4、3、2或1，或少於1(例如：少於約0.00001、0.0001、0.001、0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。於某些實施例中，共同促效劑之胃抑胜肽效能除以共同促效劑之胰高血糖素樣肽-1效能，約1000、750、500、250、100、75、60、50、40、30、20、15、10、5或1。於某些實施例中，於胃抑胜肽受體之效能除以於胰高血糖素樣肽-1受體之效能之比值，約為約為5、4、3、2或1，或少於1(例如：少於約0.0001、0.001、0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。
本發明之另一方面提供於胃抑胜肽受體顯現活性，其胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1活性顯著地降低或破壞(「胃抑胜肽促效劑胰高血糖素胜肽」)之類似物，例如第3及7號位置之胺基酸取代。於某些實施例中，此類類似物於胰高血糖素受體具有約10%或更少之天然胰高血糖素活性，例如：約1至10%，或約0.1至10%，或大於約0.1%、0.5%或1%，但小於約1%、5%或10%。於某些實施例中，此類類似物於胰高血糖素樣肽-1受體具有約10%或更少之天然胰高血糖素樣肽-1活性，例如：約1至10%，或約0.1至10%，或大於約0.1%、0.5%或1%，但小於約1%、5%或10%。
於本發明之某些方面，於胃抑胜肽受體顯現促效劑活性之類似物包含有SEQ ID NO: 1，係具有至少一個胺基酸修飾以及一種延伸，其係由1至21個胺基酸(例如：5至18、7至15、9至12個胺基酸)之羧基端至類似物第29號位置之胺基酸。
於特定實施例中，該類似物包含至少一個胺基酸修飾並高達15個(例如：不超過15個，不超過10個胺基酸修飾)。舉例來說，該類似物包含有SEQ ID NO: 1，具1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸修飾。於特定實施例中，該類似物包含至少一個胺基酸修飾，高達10個胺基酸修飾以及額外之保留性胺基酸修飾。於又一方面，該至少一個之胺基酸修飾係賦予穩定類似物羧基端部分中一穩定化之α螺旋結構。達成穩定化之α螺旋結構之修飾係如本文所述。請參見，例如，於「α螺旋結構之穩定/分子內架橋」章節中之教學。
包含有一醯基化或烷基化羧基端延伸或一包括1至6個帶正電胺基酸羧基端延伸之類似物，意外地於胃抑胜肽受體顯現增加之促效劑活性。因此，於特定實施例中，該延伸之胺基酸至少一個，係位於第37至43號位置中任何位置(根據SEQ ID NO: 1之編號)包含有：醯基或烷基，其中該醯基或烷基對自然發生之胺基酸來說是非自然的，即該延伸醯基化或烷基化。於某些實施例中，該醯基或烷基係直接連接至胺基酸，例如：透過胺基酸側鏈。於其他實施例中，該醯基或烷基係可藉由間隔物(例如：單一胺基酸、雙肽、三肽、親水性雙功能間隔物、疏水性雙功能間隔物)連接至醯基或烷基。適合包含醯基或烷基之胺基酸，也適合如本文所述之醯基及烷基。請參見，例如標題為「醯基化及烷基化」章節中之教學。
於其他實施例中，延伸之1至6個胺基酸(例如：1至2個、1至3個、1至4個、1至5個胺基酸)為帶正電胺基酸，例如：化學式IV之胺基酸，如：離胺酸。如本文所使用之術語：「帶正電胺基酸(positive-charged amino acid)」係指包含於生理pH下(例如：pH 6.8至8.0，pH 7.0至7.7)之任何自然生成或非自然生成，於其側鏈原子上帶正電之胺基酸。於特定方面，該帶正電胺基酸係位於第37、38、39、40、41、42及43號位置中任何位置。於特定實施例中，該帶正電胺基酸係位於第40號位置。
於其他例子中，該延伸中係如本文所述經醯基化或烷基化，並包含如本文所述之1至6個帶正電胺基酸。
於又一實施例中，該胃抑胜肽受體顯現促效劑活性之類似物包含：(i)SEQ ID NO: 1，其係具有至少一個胺基酸修飾，(ii)一種延伸，為1至21個胺基酸(例如：5至18、7至15、9至12個胺基酸)，其係羧基端至類似物第29號位置之胺基酸，以及(iii)包含醯基或烷基之胺基酸，該醯基或烷基係指對自然生成之胺基酸來說是非自然之胺基酸，該胺基酸係位於羧基端延伸外(例如：第1至29號位置中任何位置)。於某些實施例中，該類似物包含於第10號位置經醯基化或烷基化之胺基酸。於特定方面，該醯基或烷基係為C4至C30脂肪醯基或C4至C30烷基。於某些實施例中，該醯基或烷基係可藉由間隔物(例如：一胺基酸、雙肽、三肽、親水性雙功能間隔物、疏水性雙功能間隔物)連接至醯基或烷基。於特定方面，該類似物包含穩定α螺旋之胺基酸修飾，(例如：其係介於第16號位置之麩胺酸及第20號位置之離胺酸間之鹽橋，或位於第16、20、21、及24號位置中任意一、二、三或多個位置之α，α雙取代胺基酸)。於特定方面，該類似物額外地包含有胺基酸修飾，其係賦予對第四型雙胜肽蛋白水解酶切割之抗性。包含另外胺基酸修飾之類似物需於此處考慮。
於特定實施例中，該具胃抑胜肽受體活性之類似物於胃抑胜肽受體顯現至少約0.1%(例如：至少0.5%、1%、2%、5%、10%、15%或20%)之天然胃抑胜肽活性。於某些實施例中，該類似物於胃抑胜肽受體顯現超過20%(例如：超過50%、75%、100%、200%、300%、500%)之天然胃抑胜肽活性。於某些實施例中，該胃抑胜肽受體於胰高血糖素樣肽-1受體及胰高血糖素受體中之一或前述兩者顯現可觀之促效劑活性。於某些方面，對此類受體(其係指胃抑胜肽受體及胰高血糖素樣肽-1受體及/或胰高血糖素受體)之選擇性為100倍以內。舉例來說，該具有胃抑胜肽受體活性之類似物，其對胰高血糖素樣肽-1受體之選擇性係少於100倍(於50倍內、於25倍內、於15倍內、於10倍內)，該選擇性係於胃抑胜肽受體及/或胰高血糖素受體。
如本文所述，提供高效能之胰高血糖素促效劑類似物，其係亦於胰高血糖素受體顯現增加之活性，於另外實施例中，顯現增強之生物物理穩定度及/或水溶液溶解度。此外，依據本發明之另一方面，提供缺少天然胰高血糖素之選擇性(其係胰高血糖素受體相對於胰高血糖素樣肽-1受體之選擇性)之類似物，且因此代表此兩類受體之共同促效劑。胰高血糖素類似物內之經選擇胺基酸修飾係可控制該類似物之相對活性，其係於胰高血糖素樣肽-1受體對胰高血糖素受體之相對活性。因此，本發明之又另一方面提供：胰高血糖素共同促效劑類似物，其係於胰高血糖素受體對胰高血糖素樣肽-1受體具較高活性，胰高血糖素共同促效劑類似物係於此兩受體均約有相等活性，且胰高血糖素共同促效劑類似物於胰高血糖素樣肽-1受體對胰高血糖素受體具較高活性。共同促效劑之後續分類係可設計於胰高血糖素受體顯現少量或無活性，而仍保留其活化胰高血糖素樣肽-1受體之能力，其係與天然胰高血糖素樣肽-1有相同或更強之效能。 此類共同促效劑之任一種亦包含有修飾，其係賦予增強之生物物理穩定度及/或水溶液溶解度。
對胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體展現共同促效作用的胰高血糖素類似物有利於數個應用。首先，使用胰高血糖素於治療低血糖症會過度補償低血糖值，而導致過高的血糖值。若施予胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1受體共同促效劑，則額外的胰高血糖素樣肽-1刺激可緩衝胰高血糖素促效劑之效果，而防止由治療低血糖症所導致之過高的葡萄糖血值。
此外，如本文所述，當單獨使用，或與其他抗糖尿病或抗肥胖藥劑合併用藥時，本發明之胰高血糖素共同促效劑類似物可用於控制高血糖症，或導致體重降低或防止體重增加。另一種導致體重降低的化合物為調酸素，其係一種存在於小腸中之天然產生的消化激素(參見Diabetes2005；54：2390-2395)。調酸素係為包含胰高血糖素之29個胺基酸序列(即SEQIDNO：1)其後接SEQIDNO：27之8個胺基酸羧基端延伸(KRNRNNIA)之一37個胺基酸胜肽。雖然本發明考慮將文中所述之胰高血糖素類似物可視情況結合至此8個胺基酸羧基端延伸(SEQIDNO：27)，但本發明之某些實施例中亦特別地考慮缺乏SEQIDNO：27之8個相連羧基胺基酸的類似物及該類似物的使用。
化合物可經由胺基酸修飾而客置化以調節胜肽之胰高血糖素樣肽-1活性，且因此可調整本發明的胰高血糖素類似物以治療特定症狀或疾病。更具體地說，本文提供胰高血糖素類似物，其中每一類似物對各別的胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體展現特有的活性相對值。舉例來說，可對每一胜肽進行修飾，以產生胰高血糖素胜肽，該胰高血糖素胜肽具有對GLP-1受體相對於天然GLP-1為至少約1%(包括至少約1.5%、2%、5%、7%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175%)至約200%間之任何值或更高活性，以及對胰高血糖素受體相對於天然胰高血糖素為至少約1%(包括至少約1.5%、2%、5%、7%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%)至約500%間之任何值或更高活性。於某些實施例中，本文所述之胰高血糖素胜肽，於胰高血糖素受體顯現高達約100%、1000%、10，000%、100，000%或1，000，000%之天然胰高血糖素活性。某些實施例中，本文所述之胰高血糖素胜肽，於胰高血糖素樣肽-1受體顯現高達約100%、1000%、10，000%、100，000%，或1，000，000%之天然胰高血糖素樣肽-1活性。該天然胰高血糖素之胺基酸序列為SEQIDNO：1，該胰高血糖素樣肽-1(7-36)醯胺之胺基酸序列為SEQIDNO：52，該胰高血糖素樣肽-1(7-37)之胺基酸序列為SEQIDNO：50。於例示實施例中，一胰高血糖素胜肽係可於胰高血糖素受體顯現至少10%之天然胰高血糖素活性，並於胰高血糖素樣肽-1受體顯現至少50%之天然胰高血糖素樣肽-1活性，或於胰高血糖素受體顯現至少40%之天然胰高血糖素活性，且於胰高血糖素樣肽-1受體顯現至少40%之天然胰高血糖素樣肽-1活性，或於胰高血糖素受體顯現至少60%之天然胰高血糖素活性，並於胰高血糖素樣肽-1受體顯現至少60%之天然胰高血糖素樣肽-1活性。
一胰高血糖素胜肽之選擇性(其係胰高血糖素受體相對於胰高血糖素樣肽-1受體之選擇性)，係以胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1活性之相對比率描述(其係於胰高血糖素受體對於天然胰高血糖素之胜肽活性，除以於胰高血糖素樣肽-1受體對於天然胰高血糖素樣肽-1之胜肽活性)。舉例來說，一胰高血糖素胜肽有1：1之胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1活性比率，其係於胰高血糖素受體顯現60%之天然胰高血糖素活性，且於胰高血糖素樣肽-1受體顯現60%之天然胰高血糖素樣肽-1活性。胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1活性之例示比率包含約1：1、1.5：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1或10：1，或約1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2或1：1.5。如一例子，10：1之胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1活性比率係指10倍之選擇性(其係胰高血糖素受體相對於胰高血糖素樣肽-1受體之選擇性)。同樣地，10：1之胰高血糖素樣肽-1/胰高血糖素之活性比率係指10倍之選擇性(其係胰高血糖素樣肽-1受體相對於胰高血糖素受體之選擇性)。
根據一實施例，提供具有增強之效能，及視情況經改良之溶解度及穩定度的胰高血糖素類似物。於一實施例中，增強之胰高血糖素效能，係藉由位於天然胰高血糖素(SEQIDNO：1)中第16號位置之胺基酸修飾而提供。經由非限定例子之方法，此等增強之效能係藉由第16號位置之自然發生之絲胺酸取代為麩胺酸，或另一具有4個原子長度側鏈之帶負電胺基酸，或替代為麩醯胺酸、同麩胺酸(ho mog1utamicacid)或同胱胺酸(ho m ocysteic acid)、或帶電荷胺基酸，其係具有包含至少一異質原子(例如：N，0，S，P)之側鏈以及4個(或3至5)原子長度側鏈。於一實施例中，增強效能的胰高血糖素促效劑包含：SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7之一胜肽或一SEQIDNO：5之胰高血糖素促效劑類似物。依據一實施例，係提供一種胰高血糖素類似物蛋白質，其係對胰高血糖素受體相對於野生型胰高血糖素具有增強之效能，其中該胜肽包含：SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9或SEQIDNO：10之序列，其中該胰高血糖素肽維持其於胰高血糖素受體相對於胰高血糖素樣肽-1受體的選擇性。
胰高血糖素受體活性，係可藉由於第3號位置之胺基酸修飾而減少、維持或增強，例如取代第3號位置自然發生之麩醯胺酸。於一實施例中，第3號位置之胺基酸取代為酸性、鹼性、或疏水性胺基酸(麩胺酸、鳥胺酸、正白胺酸)，其係證實可大量地降低或破壞胰高血糖素受體活性。取代該類似物為例如：麩胺酸、鳥胺酸或正白胺酸者，於胰高血糖素受體具有約10%或更少之天然胰高血糖素活性，例如：約1-10%，或約0.1-10%，或大於約0.1%但小於約10%，而於胰高血糖素樣肽-1受體顯現約至少20%之胰高血糖素樣肽-1活性。舉例來說，如本文所述之例示類似物，具有約0.5%、1%或約7%之天然胰高血糖素活性，而於胰高血糖素樣肽-1受體顯現約至少20%之胰高血糖素樣肽-1活性。
於另一實施例中，該胰高血糖素胜肽第3號位置自然發生之麩醯胺酸，係可取代為不會於胰高血糖素受體大量降低活性之麩醯胺酸類似物，且於某些情況下，增強如本文所述胰高血糖素受體之活性。舉例來說，該在第3號位置包含有一麩醯胺酸類似物之一胰高血糖素胜肽，係可於胰高血糖素受體顯現約5%、10%、20%、50%或約85%，或更高之天然胰高血糖素(例如：SEQIDNO：1)活性。舉例來說，該在第3號位置包含有麩醯胺酸類似物之一胰高血糖素胜肽，係可於胰高血糖素受體顯現約5%、10%、20%、50%或約85%，或更高之天然胰高血糖素(例如：SEQIDNO：1)活性，其係一對應之胰高血糖素胜肽之活性，具有除了在第3號位置經修飾胺基酸外(例如：SEQID NO：601或SEQID NO：602)，與包含有麩醯胺酸類似物之胜肽相同的胺基酸序列。於某些實施例中，該在第3號位置包含有麩醯胺酸類似物之一胰高血糖素胜肽，係可於胰高血糖素受體顯現增強之活性，但增強之活性不超過1000%、10，000%、100，000%、或1，000，000%之天然胰高血糖素活性或一對應之胰高血糖素胜肽之活性，其係具有除了在第3號位置經修飾胺基酸外，與包含有麩醯胺酸類似物之胜肽相同的胺基酸序列。
於某些實施例中，該麩醯胺酸類似物係為自然生成或非自然生成之胺基酸，其係包含有：結構I、II，或III之側鏈：
其中R1為C0-3烷基或C0-3異烷基；R2為NHR4或C1-3烷基；R3為C1-3烷基；R4為H或C1-3烷基；X為NH、O、或S；及Y為NHR4、SR3、或OR3。於某些實施例中，X為NH或Y為NHR4。於某些實施例中，R1為C0-2烷基或C1異烷基。於某些實施例中，R2為NHR4或C1烷基。於某些實施例中，R4為H或C1烷基。於結構I之例示實施例中，R1為CH2-S，X為NH，以及R2為CH3(乙醯胺甲基-半胱胺酸，acetamidomethy1-cysteine，C(Acm))；R1為 C H2，X 為NH，以及R2為C H3(乙醯二胺基丁酸，acety1diaminobutanoic acid，Dab(Ac))；R1為C0烷基，X為NH，R2為NHR4，以及R4為H(胺甲醯二胺基丙酸，carbamoy1diaminopropanoic acid，Dap(urea))；或R1為CH2-CH2，X為NH，以及R2為CH3(乙醯鳥胺酸，acety1ornithine，Orn(A c))。於結構II之例示實施例中，R1為CH2，Y為NHR4，以及R4為CH3(甲基麩醯胺酸，methy1g1utamine，Q(M e))；於結構III之例示實施例中，R1為C H2以及R4為H(甲硫胺酸-亞碸，methionine-su1foxide，M(O))；於特定實施例中，該於第3號位置之胺基酸取代為乙醯二胺基丁酸(Dab(Ac))。舉例來說，胰高血糖素促效劑係可包含：SEQIDNO：595、SEQIDNO：601、SEQIDNO：603、SEQIDNO：604、SEQIDNO：605及SEQIDNO：606之胺基酸序列。
於另一實施例中，提供胰高血糖素類似物，其係於胰高血糖素受體相對於天然胰高血糖素胜肽具有增強或維持之效能，但對胰高血糖素樣肽-1受體亦具有大量增強之活性。胰高血糖素正常於胰高血糖素樣肽-1受體，具有約1%之天然胰高血糖素樣肽-1活性，而胰高血糖素樣肽-1正常於胰高血糖素受體，具有少於約0.01%之天然胰高血糖素活性。於胰高血糖素樣肽-1受體增強活性，係藉由羧基端胺基酸之羧酸替代為一電中性基團，諸如：醯胺或酯而提供。於一實施例中，此類胰高血糖素類似物包含：SEQIDNO：20之序列，其中該羧基端胺基酸具有醯胺基以取代存在於天然胺基酸之羧酸基。此類胰高血糖素類似物，係可於胰高血糖素受體及胰高血糖素樣肽-1受體均具有很強活性，因此能於前述兩受體作為共同促效劑。依據一實施例，提供一胰高血糖素受體及胰高血糖素樣肽-1受體之共同促效劑，其中該胜肽包含：SEQIDNO：20，其中第28號位置之胺基酸取代為天冬醯胺酸或離胺酸，且第29號位置胺基酸為蘇胺酸-醯胺(Thr-amide)o
於胰高血糖素樣肽-1受體增強之活性，亦可經由分子內架橋藉由三個插入胺基酸(interveningamino acids)分隔之兩個胺基酸側鏈之間而形成，使胰高血糖素羧基端部分(例如約胺基酸12-29)中α螺旋結構穩定而提供。即：一胺基酸位於第i號位置，且一股基酸位於第i+4號位置，其中i為任何介於12及25間之整數)，或藉由兩個插入胺基酸而形成，即：一胺基酸位於第j號位置，且一胺基酸位於第j+3號位置，其中j為任何介於12及27間之整數，或藉由六個插入胺基酸而形成，即：一胺基酸位於第k號位置，且一胺基酸位於第k+7號位置，其中k為任何介於12及22間之整數。於例示實施例中，該架橋(bridge)或連接物(1inker)約8個原子(或約7至9個原子)，並形成於胺基酸之側鏈間，其係第12及16，第16及20，第20及24，第24及28號位置間。此類兩股基酸側鏈，係藉由非共價鍵而相互連接，例如：氫鍵或離子交互作用連接，如：鹽橋之形成，或藉由共價鍵而相互連接。
依據一實施例，提供一胰高血糖素促效劑，包含SEQIDNO：20之胰高血糖素胜肽，其中一內醯胺環，係形成於位於第12、20或28號位置一離胺酸殘基之側鏈，以及位於第16或24號位置一麩胺酸殘基之側鏈間，其中其側鏈參與形成內醯胺環之胰高血糖素胜肽的兩個胺基酸經三個插入胺基酸彼此隔開。根據一實施例，帶有內醯胺之胰高血糖素類似物包含：選自由SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17及SEQIDNO：18所組成之群的一胺基酸序列。於一實施例中，帶有內醯胺胜肽之羧基端胺基酸，具有一醯胺基或一酯基，以取代該末端羧酸。於一實施例中，SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、及SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17及SEQIDNO：18之一胰高血糖素胜肽進一步包含一額外胺基酸，其係共價鍵結至SEQID NO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17或SEQIDNO：18之羧基端。於一另外實施例中，提供一胰高血糖素胜肽，包含選自由SEQIDNO：66、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68及SEQIDNO：69所組成之群的序列，其係進一步包含共價鍵結至SEQIDNO：66、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68及SEQIDNO：69之羧基端的額外胺基酸。於一實施例中，第28號位置之胺基酸為天冬醯胺酸或離胺酸，且第29號位置之胺基酸為蘇胺酸。
於某些特定實施例中，胰高血糖素促效劑胜肽羧基端部分α螺旋之穩定係藉由形成一共價性分子內架橋達成，而非內醯胺架橋。舉例來說，適合形成共價鍵方法(即：形成一共價性分子內架橋之方法)包括：任一或多種烯烴複分解反應(o1efin m etathesis)、羊毛硫胺酸為主之環化反應(1anthionine-based cyc1ization)、雙硫架橋，或經修飾含硫架橋之形成、α，ω-二胺烷類繫鏈(α，ω-dia minoa1kanetethers)之使用、金屬架橋之形成，以及其他用於穩定α螺旋之胜肽環化作用方法。
於胰高血糖素樣肽-1受體增強活性，係可藉由穩定胰高血糖素胜肽羧基端部分(約胺基酸12至29)的α螺旋而達成，其係透過於該位置導入一或多個α，α-雙取代胺基酸(α，α-disubstituted a mino acid)以保留期望活性。於某些方面，α螺旋之穩定以此方法達成，而不需目的性導入分子內架橋(例如：鹽橋或共價鍵。) 此處列入考慮之胜肽係缺少分子內架橋之胜肽。於特定方面，穩定α螺旋係透過導入一或多個α，α-雙取代胺基酸達成，不需導入共價性分子內架橋(例如：內醯胺架橋、雙硫架橋)。此處列入考慮之胜肽係缺少共價性分子內架橋之胜肽。於某些實施例中，胰高血糖素胜肽之第16、17、18、19、20、21、24或29號位置中一、二、三、四或多個位置取代為α，α-雙取代胺基酸。舉例來說，胰高血糖素胜肽之第16號位置取代為胺基異丁酸(AIB)，以於沒有鹽橋或內醯胺存在時，增強胰高血糖素樣肽-1活性。於某些實施例中，第16、20、21或24號位置之一、二、三或更多位置取代為胺基異丁酸。
於胰高血糖素樣肽-1受體及胰高血糖素受體，增強對缺少分子內架橋(例如：共價性分子內架橋)的胰高血糖素類似物胜肽的活性，係可藉由添加醯基或烷基至該胜肽第10號位置胺基酸之側鏈而達成。於某些方面，該醯基或烷基並非自然生成於胺基酸上。於特定方面，該醯基或烷基對任何自然生成之胺基酸而言為非自然者。某些實施例中，該醯基為脂肪醯基，如：C4至C30脂肪醯基。舉例來說，於本文所提供係一缺少共價性分子內架橋之胰高血糖素類似物胜肽，於第16號位置包含有胺基異丁酸(AIB)，且一C14、C16或C18脂肪醯基係共價連接至第10號位置之離胺酸側鏈。亦提供一缺少分子內架橋(如：共價性分子內架橋)之胰高血糖素類似物胜肽，於第2及16號位置包含有胺基異丁酸(AIB)，且一C14、C16或C18脂肪醯基係共價連接至第10號位置之離胺酸側鏈。此等經醯基化的缺少分子內架橋(如：共價性分子內架橋)之胰高血糖素類似物胜肽，係可聚乙二醇化，進一步詳述如下。
進一步增強對缺少分子內架橋(例如：分子內架橋)的胰高血糖素類似物胜肽於胰高血糖素樣肽-1及胰高血糖素之活性，係可藉由納入一間隔物於醯基或烷基與第10號位置胺基酸之側鏈間而達成。依據某些實施例，該間隔物(如：一胺基酸、雙肽、三肽、親水性雙功能間隔物、或疏水性雙功能間隔物)有3至10個原子長度(如：6至10個原子)。依據特定具體實施例，該間隔物及醯基或烷基之總長度係14至28個原子，例如：17至28、19至26、19至21個原子。對缺少分子內架橋(例如：共價性分子內架橋)的經醯基化或烷基化胰高血糖素類似物胜肽，增強胰高血糖素樣肽-1活性及胰高血糖素活性之適合間隔物，進一步詳述如下。
舉例來說，提供一非自然胰高血糖素胜肽，係與SEQIDNO：1有不超過10個胺基酸修飾之不同，包含有醯基和烷基，其中該醯基和烷基係連接至一間隔物，且該間隔物係連接至胰高血糖素胜肽第10號位置胺基酸之側鏈，其中當該胰高血糖素胜肽缺少一親水性基團，例如：聚乙二醇(PEG)時，係可於胰高血糖素樣肽-1受體顯現至少20%(例如：至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、約100%、約150%、約200%、約400%、約500%或更多)之天然胰高血糖素樣肽-1活性。於某些實施例中，當該胰高血糖素胜肽缺少一親水性基團，例如：聚乙二醇(PEG)時，該胰高血糖素胜肽於胰高血糖素受體顯現至少0.5%(例如：至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少10%、至少20%)之天然胰高血糖素活性。於某些實施例中，上述之胰高血糖素胜肽係可於胰高血糖素受體顯現任何上述標示活性，並不超過1000%、10，000%、100，000%，或1，000，000%之天然胰高血糖素活性。於某些實施例中，上述之胰高血糖素胜肽係可於胰高血糖素樣肽-1受體顯現任何上述標示活性，並不超過1000%、10，000%、100，000%，或1，000，000%之天然胰高血糖素樣肽-1活性。
於胰高血糖素樣肽-1受體增強之活性，係可藉由於第20號位置之胺基酸修飾而提供。於一實施例中，第20號位置之麩醯胺酸取代為另一具有帶電或具有氫鍵能力，且長度為至少約5(或約4-6)個原子長度側鏈的親水性胺基酸，例如，離胺酸、瓜胺酸、精胺酸、或鳥胺酸。
胰高血糖素樣肽-1活性係可降低藉由包含：(i)一羧酸端α羧酸基，(ii)於第7號位置之蘇胺酸取代為缺少羥基之胺基酸，例如：丁胺酸(Abu)、異白胺酸，(iii)刪除羧基端至第27號位置之胺基酸(例如，刪除位於第28號位置之胺基酸，刪除位於第28及29號位置之胺基酸)，產生一胜肽於長度上具27或28個胺基酸，或(iv)其組合。
任何增加或降低胰高血糖素受體活性，並增加胰高血糖素樣肽-1受體活性之上述修飾，可獨自使用或以組合方式使用。增加胰高血糖素樣肽-1受體活性之修飾以組合方式使用，相較於任一修飾單獨使用，提供更高之胰高血糖素樣肽-1活性。舉例來說，本發明提供：一種胰高血糖素類似物，其係包含於第16號位置、第20號位置以及於羧基端羧酸基之修飾，視情況於第16及20號位置間具共價鍵；一種胰高血糖素類似物，係可包含於第16號位置以及於羧基端羧酸基之修飾；一種胰高血糖素類似物，係可包含於第16及20號位置之修飾，視情況於第16及20號位置間具共價鍵；以及一種胰高血糖素類似物，係可包含胰高血糖素胜肽包含於第20號位置以及於羧基端羧酸基之修飾，視情況附加條件為第12號位置之胺基酸非精胺酸，或視情況附加條件為第9號位置之胺基酸非麩胺酸。
其他如本文所述，於第1或2號位置處之修飾，係可提高對第四型雙胜肽蛋白水解酶(DPPIV)切割之抗性。舉例來說，第2號位置之胺基酸取代為D-絲胺酸、D-丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸、N-甲基丙胺酸，或胺基異丁酸。替代地或添加地，第1號位置之胺基酸係可取代為：D-組胺酸、脫胺基組胺酸、羥基組胺酸、乙醯基組胺酸、同組胺酸、N-甲基組胺酸、α-甲基組胺酸、咪乙酸(imidazo1eaceticacid)或α，α-雙甲基咪乙酸(D MIA)。
經觀察到在第2號位置之修飾(例如，第2號位置之胺基異丁酸)，及在一些情況中，第1號位置之修飾會降低胰高血糖素活性，有時係顯著地降低；令人驚奇地，此胰高血糖素活性之降低，係可藉由穩定胰高血糖素羧基端部分中α螺旋結構而恢復。可藉由在第12及16、16及20、或20及24號位置處之胺基酸間的共價鍵(例如，在第16號位置之麩胺酸與第20號位置之離胺酸間的內醯胺架橋)而回復。例如，透過一介於第i及ｉ＋4之胺基酸間之共價鍵，例如：介於第12及16、16及20、20及24號位置之間。於某些實施例中：該共價鍵係內醯胺架橋，其係介於在第16號位置之麩胺酸及第20號位置之離胺酸。於某些實施例中，該共價鍵係分子內架橋，而非內醯胺架橋。舉例來說，適合共價鍵結之方法包括：任一或多種烯烴複分解反應、羊毛硫胺酸為主之環化反應、雙硫架橋或經修飾含硫架橋之形成、α，ω-二胺烷類繫鏈之使用、金屬架橋之形成，以及其他胜肽環化作用之方法。
具有胰高血糖素樣肽-1活性之胰高血糖素胜肽，其係包含有第1號位置之組胺酸非保留性取代為大的芳香族胺基酸(例如：酪胺酸)者，透過如本文所述任一種分子內架橋穩定α螺旋，則可保留胰高血糖素樣肽-1活性。例如，透過一共價鍵，其係介於第i及i+4之胺基酸間。例如：介於第12及16、16及20、或20及24號位置之間。於某些實施例中：該共價鍵係內醯胺架橋，其係介於在第16號位置之麩胺酸及第20號位置之離胺酸。於某些實施例中，該共價鍵係分子內架橋，而非內醯胺架橋。舉例來說，適合共價鍵結之方法包括：任一或多種烯烴複分解反應、羊毛硫胺酸為主之環化反應、雙硫架橋或經修飾含硫架橋之形成、α，ω-二胺烷類繫鏈之使用、金屬架橋之形成，以及其他胜肽環化作用之方法。
於又一例示實施例中，前述化合物之任一種係可進一步修飾以改善穩定度，其係藉由修飾SEQIDNO：1之第15號位置處胺基酸，以隨時間流逝減少胜肽降解，特別是於酸性或鹼性緩衝液中。
於另一實施例中，本文所述之胰高血糖素胜肽，其溶解度係可藉由連接親水性基團至胜肽而增強。於一實施例中，該親水性基團為聚乙二醇(PEG)鏈，視情況共價性鍵結於該胜肽第16、17、20、21、24、29、40，羧基端延伸內，或羧基端胺基酸。於某些實施例中，於此位置之天然胺基酸，取代為一具有適合與親水性基團交聯之側鏈，以利親水性基團連接至該胜肽。於其他實施例中，該經修飾之胺基酸包含一添加至胜肽羧基端之親水性基團。於一實施例中，該胜肽共同促效劑包含一序列，係選自於：SEQID NO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18及SEQIDNO：19所組成之群，其中該胰高血糖素胜肽之第16、17、21及24號位置進一步包含一聚乙二醇鏈，具有係選自約500至40，000道耳吞(Da1tons)之分子量。於一實施例中，聚乙二醇鏈具有一分子量係選自約500至5，000道耳吞之範圍。於另一實施例中，聚乙二醇鏈具有一分子量約10，000至20，000道耳吞。於又另一實施例中，聚乙二醇鏈具有一分子量約20，000至40，000道耳吞之範圍。
於另一實施例中，任何前述胰高血糖素類似物之溶進度係可藉由胺基酸取代，及/或將帶電胺基酸導入至胜肽之羧基端部分而添加，較佳地於SEQIDNO：1羧基端至第27號位置而改進。視情況可將一、二或三個帶電胺基酸導入羧基端部分內，較佳為羧基端至第27號位置。依據一實施例，位於第28號位置及/或第29號處之天然胺基酸取代為帶電胺基酸，及/或於另外實施例中，將一至三個帶電胺基酸加至胜肽之羧基端。於例示實施例中，一、二或全部之帶電胺基酸均帶負電。可對胰高血糖素肽進行額外修飾，例如，保留性取代(conservativesubstitution)，使其仍可維持胰高血糖素活性。於一實施例中，提供SEQIDNO：20之胜肽的類似物，其中該類似物與SEQIDNO：20之差異在於第17至26號位置處之1至2個胺基酸取代，且在一實施例中，該類似物與SEQIDNO：20之胜肽的差異在於第20號位置處之胺基酸取代。
依據某些實施例，如本文所述之胰高血糖素胜肽係藉由羧基端截斷一或二個胺基酸殘基而修飾。此等經修飾之胰高血糖素胜肽，如本文證實，保留於胰高血糖素受體及胰高血糖素樣肽-1受體之相似活性及效能。就此點而言，該胰高血糖素胜肽係可包含：天然胰高血糖素(SEQIDNO：1)胜肽之1至27或1至28胺基酸，視情況具有如本文所述之任何額外修飾。
依據一實施例，如本文所述之該胰高血糖素胜肽係藉由添加第二胜肽至胰高血糖素胜肽之羧基端(例如：SEQIDNO：26、SEQIDNO：27或SEQIDNO：28)而修飾。於一實施例中，一胰高血糖素胜肽其係具有一胜肽序列，選自於由：SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：66、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68及SEQIDNO：69所組成之群，該序列係透過一胜肽鍵共價鍵結至一第二胜肽，其中，該第二胜肽係選自包含：SEQIDNO：26、SEQIDNO：27及SEQIDNO：28號所組成之群。於另外實施例中，胰高血糖素胜肽包含羧基端延伸，其中於天然胰高血糖素胜肽第29號位置之蘇胺酸取代為甘胺酸。一種胰高血糖素相關胜肽，第29號位置之蘇胺酸取代為甘胺酸，且包含SEQIDNO：26之羧基端延伸，其於胰高血糖素樣肽-1之效能係為經修飾含有SEQIDNO：26羧基端延伸之天然胰高血糖素的四倍。胰高血糖素樣肽-1效能藉由取代原本位於第18號位置之精胺酸為丙胺酸係可進一步增加。
任何如本文所述之胰高血糖素胜肽經修飾而包含一醯基或烷基，例如，C4至C30醯基或烷基。於某些方面，該醯基或烷基對任何自然發生之胺基酸來說是非自然的。醯基化或烷基化係可於循環時增加胰高血糖素胜肽之半生期。醯基化或烷基化係可有利地延遲起效作用及/或延長於胰高血糖素及/或胰高血糖素樣肽-1受體之作用期間及/或改善對蛋白酶(如：第四型雙胜肽蛋白水解酶)之抗性。如本文所示，胰高血糖素胜肽於胰高血糖素受體及胰高血糖素樣肽-1受體之活性維持，如醯基化後未大幅增加。再者，如未大幅增加的話，醯基化類似物之效能與未醯基化版胰高血糖素胜肽相比效能相當。胰高血糖素胜肽可以於有親水性基團連結之相同、或不同胺基酸位置醯基化或烷基化。於某些實施例中，本發明提供一種胰高血糖素胜肽，其係經修飾而包含共價性鍵結於該胰高血糖素胜肽第10號位置之一醯基或烷基。該胰高血糖素胜肽係進一步於胰高血糖素胜肽之第10號位置胺基酸及醯基或烷基間包含有間隔物。於某些實施例中，該醯基係可為脂肪酸、膽汁酸(bi1eacid)，或其鹽類，例如：C4至C30脂肪酸、C8至C24脂肪酸、膽酸(cho1ic acid)、C4至C30烷基、C8至C24烷基，或包含有膽汁酸(bi1eacid)中類固醇基團之烷基。該間隔物係為具有適合連接至醯基或烷基之反應基團的任何基團。於例示實施例中，該間隔物包含一胺基酸、一雙肽、一三肽、一親水性雙功能間隔物、或疏水性雙功能間隔物。於某些實施例中， 該間隔物係選自包含：色胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸及包含NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH之一間隔物，其中m係為在1至6之間任意整數，且n係為在2至12之間任意整數所組成之群。此等醯基化或烷基化之胰高血糖素胜肽亦進一步包括一親水性基團，視情況為聚乙二醇。任何前述胰高血糖素胜肽係可包括兩個醯基或兩個烷基，或其組合。
因此，如本文所揭示，提供高效能胰高血糖素類似物或胰高血糖素共同促效劑類似物，其亦顯現改善溶解度及/或穩定度。一例示之高效能胰高血糖素類似物於胰高血糖素受體顯現至少200%之天然胰高血糖素活性，並且視情況溶於至少1mg/mL濃度介於pH值6到8之間，或介於6到9之間，或介於7到9之間(例如：pH值7)，並且視情況於24小後25。C條件下，保留至少95%原始胜肽(例如：5%或更少之原始胜肽降解或切割)。如另一例子，例示之胰高血糖素共同促效劑類似物於胰高血糖素受體及胰高血糖素樣肽-1受體均顯現大於40%或60%之活性(其比例約介於1：3及3：1，或1：：2及2：1之間)，並且視情況於pH值6到8之間溶於至少1mg/mL濃度，或介於6到9之間，或介於7到9之間(例如：pH值7)，並且視情況於24小後25。C條件下，保留至少95%原始胜肽。又另一例示之胰高血糖素共同促效劑類似物於胰高血糖素受體顯現約10%或更少之天然胰高血糖素活性，並於胰高血糖素樣肽-1受體顯現至少約20%之天然胰高血糖素樣肽-1活性，視情況溶於至少1mg/mL濃度於pH值6到8之間，或介於6到9之間，或介於7到9之間(例如：pH值7)，並且視情況於24小後25。C條件下，保留至少95%原始胜肽。又另一例示之胰高血糖素共同促效劑類似物於胰高血糖素受體顯現約10%或少於10%但大於0.1%、0.5%或1%之天然胰高血糖素活性，並於胰高血糖素樣肽-1受體顯現至少約50%、60%、70%、80%、90%或100%以上之天然胰高血糖素樣肽-1活性，視情況溶於至少1mg/mL濃度於pH值6到8之間，或介於6到9之間，或介於7到9之間(例如：pH值7)，並且視情況於24小後25。C條件下，保留至少95%原始胜肽。於某些實施例中，該胰高血糖素胜肽於胰高血糖素樣肽-1受體顯現不超過約1000%、10，000%、100，000%或1，000，000%之天然胰高血糖素樣肽-1活性。於某些實施例中，此等胰高血糖素胜肽保留天然胰高血糖素中對應位於自然生成胺基酸之第22、23、24、25、26、27或28號位置。(例如：具有1至7、1至5、或1至3個相對於自然生成胰高血糖素之修飾)。
將下列胜肽中之任一者排除在本發明之化合物外，儘管本發明中可包括展現期望胰高血糖素樣肽-1或共同促效劑活性的一或多個進一步修飾，使用此等化合物之醫藥組合物、套組及治療方法：具有[精胺酸12]取代及具有羧基端醯胺之SEQIDNO：1胜肽；具有[精胺酸12，離胺酸20]取代且具有羧基端醯胺之SEQIDNO：1胜肽；具有[精胺酸12，離胺酸24]取代且具有羧基端醯胺之SEQIDNO：1胜肽；具有[精胺酸12，離胺酸29]取代且具有羧基端醯胺之SEQIDNO：1胜肽；具有[麩胺酸9]取代之SEQIDNO：1胜肽；失去組胺酸1、具有[麩胺酸9，麩胺酸16，離胺酸29]取代及羧基端醯胺之SEQIDNO：1胜肽；具有[麩胺酸9，麩胺酸16，離胺酸29]取代且具有羧基端醯胺之SEQIDNO：1胜肽；具有經由內醯胺架橋鍵結之[離胺酸13，麩胺酸17]取代且具有羧基端醯胺之SEQIDNO：1胜肽；具有經由內醯胺架橋鍵結之[離胺酸17，麩胺酸21]取代且具有羧基端醯胺之SEQIDNO：1胜肽；失去組胺酸1、具有經由內醯胺架橋鍵結取代之[麩胺酸20，離胺酸24]SEQIDNO：1胜肽。
依據一實施例，提供一種藥學組合物，包括任何如本文所述之新穎胰高血糖素胜肽，較佳地為無菌且純度至少為90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，及一醫藥可接受稀釋劑、載體或輔藥。此等組合物係可包括濃度至少為A之如本文所述之一胰高血糖素胜肽，其中A為0.001 mg/m1、0.01 mg/m1、0.1 mg/m1、0.5mg/m1、1mg/m1、2mg/m1、3mg/m1、4mg/m1、5mg/m1、6mg/m1、7mg/m1、8mg/m1、9mg/m1、10 mg/m1、11 mg/m1、12mg/m1、13mg/m1、14mg/m1、15mg/m1、16mg/m1、17mg/m1、18mg/m1、19mg/m1、20 mg/m1、21mg/m1、22mg/m1、23mg/m1、24mg/m1、25mg/m1或更高。於其他實施例中，此等組合物係包括最高濃度為B之一胰高血糖素胜肽，其中B之濃度為30 mg/m1、25mg/m1、24mg/m1、23、mg/m1、22mg/m1、21ng/m1、20 mg/m1、19mg/m1、18mg/m1、17mg/m1、16mg/m1、15mg/m1、14mg/m1、13mg/m1、12mg/m1、11mg/m110 mg/m1、9mg/m1、8mg/m1、7mg/m1、6mg/m1、5mg/m1、4mg/m1、3mg/m1、2mg/m1、1mg/m1、或0.1mg/m1。於某些實施例中，該包含一胰高血糖素胜肽之組合物係，係於一A至B之濃度範圍，例如，0.001至30.0 mg/m1。於一實施例中，該藥學組合物包括無菌之水溶液，並視情況存放於不同容器中。本發明之化合物係可依據某些實施例使用，先配製成一預配製溶液以供注射使用。於某些實施例中，該藥學組合物包括經凍乾之粉末。該藥學組合物係可進一步包裝成包括有用於施予患者之一可拋式裝置中一套組的一部份。該容器或套組可標示儲存於常溫或低溫下。
根據一實施例，提供一種使用本發明之胰高血糖素胜肽之預調配水性組合物以快速提高葡萄糖值或治療低血糖症之方法。該方法包括施予有效量水溶液之步驟，該水溶液包含有本發明揭示之一新穎經修飾胰高血糖素胜肽之一水溶液。於一實施例中，該胰高血糖素胜肽於該胰高血糖素胜肽第21或24號位置處經聚乙二醇化，且該聚乙二醇鏈具有約500至約5，000道耳吞之分子量。於一實施例中，將經修飾的胰高血糖素溶液預包裝在用於將組合物施予罹患低血糖症之病患的裝置中。
根據一實施例，提供一種調節胰島素依賴型病患中之血糖值的改良方法。該方法包括以用於控制糖尿病之治療有效量施予胰島素，且以用於預防低血糖症之治療有效量施予本發明揭示之新穎經修飾胰高血糖素胜肽的步驟，其中該施予步驟係在間隔十二小時內進行。於一實施例中，該胰高血糖素胜肽及胰島素係作為單一組合物共同施予，其中該胰高血糖素胜肽係經具有選自約5，000至約40，000道耳吞範圍分子量之一聚乙二醇鏈而聚乙二醇化。
在另一實施例中，提供一種用於誘發腸道暫時麻痺之方法。該方法包括將一或多種如本文所述之胰高血糖素胜肽施予病患之步驟。
代謝症候群，亦稱代謝症候群X、胰島素抗阻症候群、雷文氏症候群(Reaven'ssyndrome)，係一影響超過五千萬美國人之疾病。代謝症候群，傳統上具有下列危險因子中至少三項或多項聚集之特點：(1)不正常肥胖(於腹部或其周圍有過度脂肪組織)；(2)血脂肪不正常(血脂肪疾病包括：三酸甘油酯、高密度脂蛋白膽固醇含量低、低密度脂蛋白膽固醇含量高所導致增加動脈壁粥狀硬塊累積)；(3)血壓升高，或正在治療高血壓)；(4)胰島素抗阻或血糖不耐；(5)易血栓狀態(如：血液中有高纖維蛋白原、纖維蛋白溶酶原活化抑制劑第一型(p1asminogen activatorinhibitor-1))以及(6)易發炎狀態(如：血中C-反應蛋白升高)。其他危險因子包括：老化、賀爾蒙失調及基因先決(geneticpredisposition)。
代謝症候群與增加冠心病風險及其他與動脈粥狀硬塊累積相關疾病有關，例如：中風或周邊血管疾病，稱之為動脈粥狀性心血管疾病(簡稱為ASCVD)。代謝症候群之患者係於疾病早期經歷由胰島素抗阻期進入成熟之第二型糖尿病，係增加罹患ASCVD之風險。無任何理論規範下，胰島素抗阻、代謝症候群及心血管疾病之關係係可納入一個或多個同時發生之病理機制，係包含：胰島素刺激血管舒張之減損、因增加氧化壓力導致NO利用性之胰島素抗阻相關還原、以及脂肪細胞衍生荷爾蒙之異常，例如：脂締素(LteifandM ather，Can.J.Cardio1.20(supp1.B)：66B-76B(2004))。
依據2001國家膽固醇教育計畫之成人治療準則(ATPIII)，個人具有下列任何三準則，則符合代謝症候群準則：(a)不正常肥胖(腰圍：男性超過102cm，且女性腰圍超過88cm)；(b)血清三酸甘油酯150mg/d1或更高；(c)高密度脂蛋白膽固醇：男性為40 mg/d1或更少，且女性為50 mg/d1或更少；(c)血壓為130/85或更高；(d)空腹血糖為110 mg/d1或超過。依據世界衛生組織(WHO)，個人具有下列至少兩準則之高胰島素濃度(快速升高之血糖或僅餐後升高之血糖)則符合代謝症候群準則：(a)不正常肥胖(腰臀比(waistto hipratio)大於0.9，身體質量指數(body massindex)至少30kg/m2，或腰圍超過37吋)；(b)膽固醇準則顯示三酸甘油酯至少150 mg/d1或高密度脂蛋白膽固醇低於35mg/d1；(c)血壓為140/90或更高，或正在治療高血壓)。(M athur，Ruchi，‘‘Metabo1ic Syndrome，” ed. Shie1， Jr.， Wi11iam C.，MedicineNet.com，M ay11，2009).
為達此目標，若個人符合2001國家膽固醇教育計畫之成人治療準則，或世界衛生組織所提出之準則之一或兩者，則該個人視為罹患代謝症候群。
不需任何理論下，如本文所述之胰高血糖素胜肽對治療代謝症候群有效。因此，本發明提供一種預防或治療代謝症候群之方法，或降低其一、二、三個以上危險因子，其係施予如本文所述之胰高血糖素胜肽至一有效量以預防或治療代謝症候群或其危險因子。
非酒精性脂肪肝病變(N ona1coho1ic fatty 1iver disease，NAFLD)，係指肝臟疾病之廣泛系列，其範圍係從單純脂肪肝(steatosis)、非酒精性脂肪肝炎(nona1coho1icsteatohepatitis，N A S H)至肝硬化(不可逆之肝臟進一步瘢痕，cirrhosis)。所有非酒精性脂肪肝病變之階段通常係於肝臟細胞(hepatocytes)堆積脂肪(又稱脂肪浸潤(fattyinfi1tratio n))。單純脂肪肝係一種特定脂肪(三酸甘油酯)之異常堆積，於肝臟細胞無發炎或瘢痕。於非酒精性脂肪肝炎(N A S H)中，脂肪堆積與肝臟發炎(即：肝炎(hepatitis))及瘢痕(即：纖維化(fibrosis))之各種程度有關。該發炎細胞係可破壞肝細胞。(肝細胞壞死， (hepatoce11u1arnecrosis))。於術語「脂肪肝炎(steatohepatitis)」及「脂肪壞死(steatonecrosis)」中，steatO係指脂肪浸潤(fattyinfi1tratio n)，hepatitis係指肝臟發炎，而壞死係指遭破壞之肝臟細胞。非酒精性脂肪肝炎(NASH)最終可導致肝臟瘢痕(即：纖維化(fibrosis))，其後為不可逆的進一步瘢痕(即：肝硬化(cirrhosis))。由非酒精性脂肪肝炎(N ASH)所導致之肝硬化(cirrhosis)，係為非酒精性脂肪肝病變(N AFLD)系列中最終且最嚴重之階段。(Mend1er，Miche1，‘‘Fatty Liver： Nona1coho1ic Fatty Liver Disease(NAFLD)and Nona1coho1ic Steatohepatitis(N ASH)，”ed.Schoenfie1d，Les1ieJ.，M edicineNet.com，August29，2005).
酒精性肝病變(A1coho1ic Liver Disease)或酒精誘導性肝病變(A1coho1-Induced Liver Disease)包含三個與過量酒精攝取有關或導致的生理上相異之肝臟疾病：脂肪肝(steatosis)、慢性或急性肝炎，以及肝硬化(cirrhosis)。酒精性肝炎其範圍由異常實驗室測試中僅一個疾病徵兆之溫和性肝炎，至具有併發症之嚴重肝功能異常，例如：黃疸(因膽紅素滯留所導致之黃皮膚)、肝性腦病變(hepaticencepha1opathy，係因肝臟失能(1iver fai1ure)所導致之神經功能異常)、腹水症(ascites，液體堆積於腹部)、出血性食道靜脈曲張(b1eeding esophagea1varices，於食道靜脈曲張)、異常血液凝固及昏迷。組織學上，酒精性肝炎之表徵為：肝臟細胞氣球樣退化(ba11ooning degeneration)、具嗜中性球之發炎，以及有時有麥洛利氏小體(M a11ory bodies)(細胞中間絲蛋白之異常聚集)。肝硬化解剖學上之特徵在於：遍佈於肝臟之小結(nodu1es)兼具有纖維化。(W orman，Howard J.，‘‘A1coho1ic Liver Disease”，Co1umbia UniversityM edica1Center website).
不需任何特定理論，如本文所述之胰高血糖素胜肽對於治療酒精性肝病變、非酒精性脂肪肝病變(NAFLD)、或其任何階段有效，包含例如：單純性脂肪肝(steatosis)、脂肪肝炎、肝炎、肝性發炎反應(hepaticinflam mation)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝硬化或其併發症。因此，本發明提供一種預防或治療酒精性肝病變、非酒精性脂肪肝病變(NAFLD)或其任何階段之方法，其係於一受試者包含：施予該受試者如本文所述之胰高血糖素胜肽至一有效量以預防或治療酒精性肝病變、非酒精性脂肪肝病變(NAFLD)或其階段。此等治療方法包含：降低下列之一、二、三或以上：肝脂肪含量、肝硬化之發生或進程、肝癌(hepatoce11u1arcarcinoma)之發生、發炎指標，例如：異常肝臟酵素濃度(如：天冬胺酸轉胺酶(AST)及/或丙胺酸轉胺酶(ALT)，或乳酸去氫酶(LDH))、升高的血清鐵蛋白、升高的膽紅素、及/或纖維化指標，例如：升高的轉化生長因子-β(Transforming GrowthFactor-Beta，T GF-beta)。於較佳實施例中，該類胰高血糖素胜肽用於治療在單純性脂肪肝(steatosis)進程中並顯現發炎或肝炎指標之患者。此等方法係可造成，如，天冬胺酸轉胺酶(AST)及/或丙胺酸轉胺酶(ALT)濃度之降低。
在又另一實施例中，提供一種治療高血糖症之方法，或一種減少體重增加或導致體重降低之方法，其包括施予有效量之水溶液，該水溶液包含有本發明之胰高血糖素胜肽。於一實施例中，任一方法包括施予有效量之一含有胰高血糖素促效劑之組合物，係選自由SEQID NO：11、SEQID NO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18及SEQIDNO：19所組成之群。於另一實施例中，該方法包括施予有效量之一含有胰高血糖素促效劑之組合物，其中該胰高血糖素促效劑包含有一胰高血糖素胜肽，選自由SEQID NO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：66、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68、及SEQIDNO：69所組成之群，其中該胰高血糖素胜肽之胺基酸29係透過一胜肽鍵而鍵結至一第二胜肽，且該第二胜肽包含SEQIDNO：26、SEQIDNO：27或SEQIDNO：28之序列。於其他實施例中，提供包括共同施予習知劑量或降低劑量之胰島素及本發明之胰高血糖素胜肽治療糖尿病之方法。亦提供利用本發明之胰高血糖素胜肽，不共同施予胰島素而治療糖尿病之方法。
於又另一方面，本發明提供用於治療高血糖症之新穎方法及用於減低食慾或促進體重減低之新穎方法，其包括：施予活化胰高血糖素受體及胰高血糖素樣肽-1受體兩者之胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑分子(包括其藥學可接受鹽類)。促效作用，即活化胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體兩者，與單獨用胰高血糖素樣肽-1促效作用治療高血糖症相比，提供意想不到的改良。因此，增加胰高血糖素促效作用提供意想不到的加成(additive)或協同(synergistic)效果，或其他意想不到的臨床益處。根據此等方法，施予習知劑量之胰島素、降低劑量之胰島素、或不施予胰島素均考慮。與單獨用胰高血糖素樣肽-1促效作用於促進減重或預防增重相比，胰高血糖素受體之促效作用亦具有意想不到的有利效果。
例示的胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑分子包括：本發明之胰高血糖素胜肽、活化胰高血糖素樣肽-1及胰高血糖素受體兩者之胰高血糖素樣肽-1類似物、胰高血糖素與胰高血糖素樣肽-1之融合物、或胰高血糖素類似物與胰高血糖素樣肽-1類似物之融合物、或其之化學修飾衍生物。或者，可將活化胰高血糖素受體之化合物與活化胰高血糖素樣肽-1受體之化合物(諸如胰高血糖素樣肽-1類似物、促胰島素分泌素-4類似物、或其衍生物)共同施予。本發明亦考慮共同施予胰高血糖素促效劑類似物與胰高血糖素樣肽-1促效劑類似物。
此等用於治療高血糖症及/或用於減低食慾或促進體重減輕之方法包括：施予具有一胰高血糖素類似物，其具有第12號位置處之修飾(例如，精胺酸12)，視情況並結合在第16及/或20號位置處之修飾。本發明之方法亦包括施予包含在由三個插入股基酸所分隔之胺基酸12與29之區域內之兩個胺基酸(例如，第12與16、13與17(例如，離胺酸13麩胺酸17或麩胺酸13離胺酸17)、16與20、17與21(例如，離胺酸17麩胺酸21或麩胺酸17離胺酸21)、20與24、或24與28號位置之側鏈間分子內架橋之胰高血糖素類似物，視情況之附加條件為在第9號位置處之胺基酸不為麩胺酸，且視情況包括羧基端醯胺或酯。
依據一實施例，此等胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1胰高血糖素樣肽-1分子不包括任何習知技術中已知有用於此一方法知胰高血糖素類似物或胰高血糖素樣肽-1類似物。於另一實施例中，亦排除以美國專利第6，864，069號中所述之用於治療糖尿病作為胰高血糖素樣肽-1及胰高血糖素拮抗劑兩者的胜肽作為胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1分子。於另一實施例中，排除使用胰高血糖素拮抗劑治療糖尿病，例如於Unsoneta1.，J.Bio1.Chem.，264：789-794(1989)，Ahneta1.，J.Med.Chem.，44：3109-3116(2001)，and Sapse et a1.，Mo1.Med.，8(5)：251-262(2002)所述之拮抗劑。於再一實施例中，亦排除使用調酸素或包含調酸素(SEQIDNO：27)之8個羧基端胺基酸之胰高血糖素類似物作為胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑分子。
此用於治療高血糖症之方法預期對治療各種不同類型之高血糖症有效，包括：糖尿病、第一型、第二型或妊娠性糖尿病(gestationa1 diabetes)，或是胰島素依賴性、非胰島素依賴性糖尿病，並降低糖尿病併發症，包括：腎疾病、視網膜病變及血管疾病。此等用以減少食慾及促進減重之方法亦預期可用於減輕體重，避免體重增加，或是治療各種原因之肥胖，包括：藥物弓起之肥胖，並減少因肥胖弓起之併發症，包括：血管疾病(冠狀動脈疾病、心臟病、週邊血管疾病、缺血再灌流(ischemiareperfusion)等)、高血壓、第二型糖尿病之發生、高血脂及肌肉骨骼疾病。
如本文所述之所有治療方法、醫藥組合物、套組及其他類似實施例將術語胰高血糖素類似物之使用，包括所有藥學可接受鹽類或其酯列入考慮。
定義
於本發明之說明及請求項中，將使用依照下列定義之術。
如本文所使用之術語：「藥學可接受載體」包括任何標準的藥學載體，例如：磷酸鹽緩衝液、水、乳化劑諸如油/水、水/油及各種濕潤劑。該術語亦包含任何經由美國聯邦政府管理機構所准許或美國藥典中列出用於動物，包括人類之試劑。
如本文所使用之術語：「藥學可接受鹽類」係指包括各種保留有原化合物生物活性之化合物鹽類，且非為生物上或其他方面所排斥。如本文所述之許多化合物係可藉由胺基、羧基或其他相似之官能基而形成酸性或鹼性鹽類。
藥學可接受鹼性添加鹽類可經由無機或有機鹼製成。由無機鹼衍生之鹽類，包括(僅作為實例)：鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽及鎂鹽。由有機鹼衍生之鹽類，包括但不限於一級、二級及三級胺之鹽。
藥學可接受酸性添加鹽類係可經由無機或有機酸製成。由無機酸衍生之鹽類，包括：氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等。由有機酸衍生之鹽類，包括：醋酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、桂皮酸、杏仁酸、甲基磺酸、乙基磺酸、p-甲苯磺酸、水楊酸等等。
如本文所使用之術語：「治療」，係包括預防特定疾病或症狀，或減輕特定之疾病或症狀及/或防止或消除該病症。舉例來說，如本文所使用之術語「治療糖尿病」一般將係指朝正常值之方向改變葡萄糖血中濃度，並可視給定情況而包括提高或降低血糖濃度。
如本文所述胰高血糖素肽之「有效」量或「藥理有效」量，係指無毒性且具有但可提供期望效果之足夠量胜肽。例如：舉例來說，一期望的效果將係預防或治療低血糖症，如藉由血糖值的升高測量。本發明揭示之共同促效劑類似物之另一期望效果包括治療高血糖症，例如，由較接近正常的血糖值變化所測量，或誘導減重/預防增重，例如，由體重之降低所量測，或預防或降低體重增加，或使體脂肪分佈正常化。所謂「有效」量視情況而不同，取決於年齡及個體之一般情況，施予之模式等等。因此，並非一定可以定義一精確之「有效量」。然而，用在任何個體之適當「有效」量可經由在該領域具有通常知識者藉經驗之累積所決定。
術語：「非經腸道」係指不通過供給營養的管道，而係經由一些其他途徑諸如：皮下、肌肉內、脊椎內、或靜脈內。
如本文所使用之術語「經純化(purified)」及類似術語係指以實質上不含一般與分子或化合物於原生或自然環境中相關之污染物的形式分離出分子或化合物。
如本文所使用之術語 「經純化」不需要絕對純度；而是指相對定義。術語「經純化的多肽」在此係用於描述經自包括(但不限於)核酸分子、脂質及碳水化合物之其他化合物分離的多肽。
術語「經分離」需要將所提及的物質自其原始環境(例如，若其為自然生成時的自然環境)移除。舉例來說，存在於活動物體內之自然產生的多核苷酸係未經分離，但自於自然系統中之一些或所有共同存在物質中分離出的相同多核苷酸係為經分離。
如本文所使用之術語：「胜肽」，涵蓋3個或更多之胺基酸且典型上少於50個胺基酸之序列，其中該等胺基酸係自然生成或非自然生成之胺基酸。非自然生成之胺基酸係指不會於體外自然生成之胺基酸，然而可納入如本文所述之胜肽結構。
如本文所使用之術語「多肽」及「蛋白質」係交替用於指示胺基酸之聚合物的術語，而與聚合物長度無關。一般來說，多肽及蛋白質具有大於「胜肽」之聚合物長度。
如本文所使用之「胰高血糖素胜肽」包括任何包含SEQIDNO：1之胺基酸序列、或任何SEQIDNO：1之胺基酸序列之類似物胜肽，包括胜肽之胺基酸取代、加成、刪除或轉譯後修飾(posttrans1ationa1 m odification)(例如，甲基化、醯基化、泛素化作用(ubiquitination)、分子內共價鍵結諸如：內醯胺架橋之形成、聚乙二醇化等等)，其中該類似物刺激胰高血糖素或胰高血糖素樣肽-1受體活性，例如，如使用例子14中所述之測定方法由cAMP產生所測定。
術語「胰高血糖素促效劑」係指包含刺激胰高血糖素受體活性(例如，如使用例子14中所述之測定方法由cAMP產生所測量)之胰高血糖素胜肽的複合物。
如本文所使用之「胰高血糖素促效劑類似物」係一胰高血糖素胜肽包含有一序列，係選自由：SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14及SEQIDNO：15所組成之群，或經修飾而包括一或多個處之保留性胺基酸取代，其係於第2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29號位置之保留性胺基酸取代。
如本文所使用之胺基酸之「修飾(m odification)」係指胺基酸之取代、添加或刪除，並包含任何人體內常見之20種胺基酸、特殊或非自然界產生之胺基酸之取代或添加。於整篇申請案中，所有以數字(例如，第28號位置)所提及之特定胺基酸位置係指在天然胰高血糖素(SEQIDNO：1)中之該位置，或於其任何類似物中之對應胺基酸位置處者。例如，關於第28號位置係指對應於一胰高血糖素類似物(其SEQIDNO：1序列之第一個胺基酸被刪除)之第27號位置。同樣地，關於第28號位置係指對應於一胰高血糖素類似物(其SEQIDNO：1之胺基端前添加一個胺基酸)之第29號位置。特殊胺基酸之購買來源包括Sigma-A1drich(Mi1waukee，WI)、ChemPep Inc.(Miami，FL)，以及GenzymePharmaceutica1s(Cambridge，M A)公司。特殊胺基酸可經由供應商所購得、再合成、化學修飾或由其他胺基酸衍生。
如本文所使用之「胰高血糖素共同促效劑」係於胰高血糖素受體顯現相對於天然胰高血糖素為至少約10%至約500%或更高之活性，且亦於胰高血糖素樣肽-1受體顯現相對於天然胰高血糖素樣肽-1為至少約10%至約200%或更高之活性的胰高血糖素胜肽。
如本文所使用之「胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑分子」係為一分子，其係於胰高血糖素受體顯現相對於天然胰高血糖素為至少約10%之活性，且亦對胰高血糖素樣肽-1受體顯現相對於天然胰高血糖素樣肽-1為至少約10%之活性。
如本文所使用之術語「天然胰高血糖素」係指由SEQIDNO：1之序列所組成的胜肽，及術語「天然胰高血糖素樣肽-1」係為一通稱，指胰高血糖素樣肽-1(7-36)醯胺(由SEQIDNO：52之序列所組成)、胰高血糖素樣肽-1(7-37)酸(由SEQIDNO：50之序列所組成)、或該兩化合物之混合。如本文所述，於無進一步指定下，提及「胰高血糖素」或「胰高血糖素樣肽-1」分別係意指天然胰高血糖素或天然胰高血糖素樣肽-1。
如本文所使用之胺基酸「取代(substitution)」係指以不同之胺基酸殘基取代一股基酸殘基。
如本文所使用之術語：「保留性胺基酸取代(conservative a mino acidsubstitution)」，於此係定義為下列五種群組內之一的交換：I.小的、脂肪族、非極性或輕度極性殘基：丙胺酸(亦可簡寫為A1a)、絲胺酸(亦可簡寫為Ser)、蘇胺酸(亦可簡寫為Thr)、脯胺酸(亦可簡寫為Pro)、甘胺酸(G1y)；II.極性、帶負電殘基及其醯胺和酯：天冬胺酸(亦可簡寫為Asp)、天冬醯胺(亦可簡寫為Asn)、麩胺酸(亦可簡寫為G1u)、麩醯胺酸(亦可簡寫為G1n)、氧化半胱胺酸(cysteic acid)及同胱胺酸(ho m ocysteicacid)；III.極性、帶正電殘基：組胺酸(亦可簡寫為His)、精胺酸(亦可簡寫為Arg)、離胺酸(亦可簡寫為Lys)；鳥胺酸(Ornithine，亦可簡寫為Orn)；IV.大的、脂肪族、非極性殘基：甲硫胺酸(亦可簡寫為Met)、白胺酸(亦可簡寫為Leu)、異白胺酸(亦可簡寫為I1e)、纈胺酸(亦可簡寫為Va1)、半胱胺酸(亦可簡寫為Cys)、正白胺酸(Nor1eucine，亦可簡寫為N1e)、同半胱胺酸(homocysteine)；V.大的、芳香族殘基：苯丙胺酸(亦可簡寫為Phe)、酪胺酸(亦可簡寫為Tyr)、色胺酸(亦可簡寫為Trp)、乙醯基苯丙胺酸(acety1pheny1a1anine)o
如本文所使用之一般術語「聚乙二醇鏈(po1yethy1eneg1yco1chain)」或「PEG鏈(PEG chain)」係指由通式H(OCH2CH2)kOH所表示之環氧乙烷與水之呈分支鏈或直鏈之縮合聚合物之混合物，其中k為至少9。若不存在任何進一步之特徵，則此術語係意指包括平均總分子量選自500至40，000道耳吞(Da1tons)之範圍之乙二醇之聚合物。「聚乙二醇鏈」或「PEG鏈」係與數字字尾結合使用，以指示其近似平均分子量。舉例來說，PEG-5，000(5kPEG)係指具有總分子量平均值約5，000道耳吞之聚乙二醇鏈。
如本文所使用之術語「聚乙二醇化(pegy1ated)」及類似術語係指藉由聚乙二醇鏈鍵結至化合物而由天然狀態經修飾之化合物。「聚乙二醇化之胰高血糖素胜肽」係指一胰高血糖素胜肽，具有共價鍵結至該胰高血糖素胜肽之PEG鏈。
如本文所使用之廣義「胜肽」係指包含經修飾胺基及羧基端之胜肽。舉例來說，包含醯胺基替代末端羧酸之胺基酸鏈係意指涵蓋於指示標準胺基酸的胺基酸序列內。
如本文所使用之「連接物(1inker)」係使兩個個別實體彼此結合之鍵、分子或分子基團。連接物可提供兩實體之最適間隔，或可進一步提供使兩實體可彼此隔開之不穩定鍵結。不穩定鍵結包括光分裂官能基、酸不穩定基團、鹼不穩定基團及酵素可分裂基團。
如本文所使用之「二聚體(dimer)」係包含兩個子單元透過連接物而彼此共價性鍵結之複合物。術語二聚體當在沒有任何修飾語言下使用時，係涵蓋同二聚體(homodimers)及異二聚體(heterodimers)兩者。同二聚體包含兩個相同之子單元，而異二聚體包含兩個不同之子單元，儘管兩個子單元實質上彼此相似。
如本文所使用之術語：「帶電胺基酸(charged aminoacid)」係指一胺基酸，其係包含在生理pH水溶液中帶負電(即去質子化)或帶正電(即質子化)側鏈。舉例來說，帶負電之胺基酸包括：天冬胺酸、麩胺酸、半胱胺酸、同胱胺酸(homocysteic acid)、及同麩胺酸，而帶正電之胺基酸包括：精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶電胺基酸包括20種常見於人類蛋白質中的胺基酸，以及非典型或非自然產生之胺基酸中之帶電胺基酸。
如本文所使用之術語：「酸性胺基酸」係指包含第二酸性基團，包括例如：羧酸基或磺酸基。
如本文所使用之術語「烷基」係指直鏈或分支之碳氫化合物，其係包含碳原子之標示號碼。例示之烷基包括甲基、乙基、及直鏈丙基。
如本文所使用之術語「異烷基(heteroa1ky1)」係指直鏈或分支之碳氫化合物，其係包含碳原子之標示號碼，並於結構主鏈包含至少一個異質原子。適用於此之異質原子包含但不限於：氮、硫及氧。
本發明提供對胰高血糖素受體、或胰高血糖素樣肽-1受體、或兩受體具有增加或降低活性之胰高血糖素胜肽。本發明亦提供於胰高血糖素受體相對於胰高血糖素樣肽-1受體具有經改變之選擇性的胰高血糖素胜肽。
於胰高血糖素受體增加活性係藉由於天然胰高血糖素(SEQIDNO：1)第16號位置處之胺基酸修飾所提供。於胰高血糖素受體維持或增加活性亦藉由於天然胰高血糖素之第3號位置具有麩醯胺酸類似物(例如，(Dab(Ac))之胺基酸修飾所提供。
對胰高血糖素受體之降低活性，例如，經由如本文所述第3號位置處之胺基酸取代為酸性、鹼性、或疏水性胺基酸而提供。
對胰高血糖素樣肽-1受體增加之活性經由羧基端胺基酸替代為電中性基團，諸如醯胺或酯而提供。
於胰高血糖素樣肽-1受體增加之活性藉由使胰高血糖素之羧基端部分(例如，約殘基12-29)中之α螺旋穩定之修飾而提供。於某些實施例中，於胰高血糖素樣肽-1受體增強之活性，亦可經由分子內架橋藉由三個插入胺基酸(intervening aminoacids)分隔之兩個胺基酸側鏈之間而形成，例如，如本文所述之第12及16、或16及20、或20及24號位置間。於其他實施例中，此等修飾包括於第16、20、21或24號位置中之一或多處導入一或多個α，α-雙取代胺基酸(如：胺基異丁酸(AIB))之插入或取代而修飾。
增加對缺少分子內架橋(例如：分子內架橋)之胜肽於胰高血糖素樣肽-1及胰高血糖素之活性，係可藉由共價性連接一醯基或烷基至該胜肽第10號位置胺基酸之側鏈而達成，其中該醯基或烷基對於第10號位置胺基酸係非自然的。此等缺少分子內架橋(例如，共價性分子內架橋)之胜肽對胰高血糖素樣肽-1及胰高血糖素受體之進一步增加的活性可藉由在醯基或烷基與第10號位置胺基酸之側鏈之間加入一間隔物而達成。適當之間隔物如本文所述，且包括但不限於具3至10個原子長度之間隔物。
如本文所述，於胰高血糖素樣肽-1受體增加活性，係藉由位於第20號位置之胺基酸修飾而提供。
對胰高血糖素樣肽-1受體之增加活性係於包含SEQIDNO：26之羧基端延伸之胰高血糖素類似物中提供。於此等包含SEQIDNO：26之類似物中胰高血糖素樣肽1活性進一步增加係藉由如本文所述修飾位於第18、28或29號位置、或位於第18及29號位置之胺基酸而提供。
已於第1及2號位置處修飾胺基酸降低之胰高血糖素活性之恢復係藉由如本文所述於由三個插入胺基酸所分隔之兩個胺基酸(例如，第12與16、或16與20、或20與24號位置)側鏈間之共價鍵來提供。
胰高血糖素樣肽-1效能進一步適度增加，係藉由修飾位於第10號位置之胺基酸為色胺酸而提供。
任何上述使胰高血糖素受體活性提高或降低且使胰高血糖素樣肽-1受體活性提高之修飾，可被獨自使用或以組合方式使用。任何上述修飾係可結合其他可賦予其他所需特性之修飾，例如增加溶解度及/或穩定度及/或作用期間。或者，任何上述修飾係可結合不會大幅影響溶解度或穩定度或活性之其他修飾。例示修飾包含但不限於：
(A)改善溶解度，舉例來說，藉由將一、二、三或多個帶電胺基酸導入天然胰高血糖素之羧基端部分內而達成，較佳地，係羧基端至第27號位置。此胺基酸係可藉由將天然胺基酸取代為帶電胺基酸，例如：位於第28或第29號位置處，或者添加一個帶電胺基酸，例如第27、28或29號位置後。於例示實施例中，一、二、三或全部之帶電胺基酸均帶負電。於其他實施例中，一、二、三或全部之帶電胺基酸均帶正電。此等修飾係可增加溶解度，例如於pH值5.5到8之間，如於pH值7，超過24小時，25。C條件下，提供相較天然胰高血糖素至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或更高之溶解度。
(B)增加溶解度及作用期間或於循環時半生期係藉由添加親水性基團例如聚乙二醇鏈而達成，如本文所述，係添加於胜肽之第16、17、20、21、24、29號位置，或羧基端胺基酸。
(C)增加穩定度係藉由第15號位置之天冬胺酸之修飾而達成，例如：刪除或取代為麩胺酸、同麩胺酸、氧化半胱胺酸(cysteicacid)或同胱胺酸(ho m ocysteicacid)。此等修飾係可減少於pH值5.5到8範圍間之降解或切割，例如於24小時後，25℃條件下，保留至少原胜肽之75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
(D)增加溶解度係藉由第27號位置之甲硫胺酸之修飾而達成，例如：取代為白胺酸或正白胺酸。此等修飾係可減少氧化性降解。穩定度係可藉由修飾第20或24號位置之麩醯胺酸而增加，例如取代為絲胺酸、蘇胺酸、丙胺酸或胺基異丁酸。此等修飾係可減少透過麩醯胺酸之脫醯胺作用而發生之降解。穩定度係可藉由修飾第21號位置之天冬胺酸而增加，例如取代為麩胺酸。此等修飾係可減少透過天冬胺酸之脫水作用而發生之降解，該天冬胺酸之脫水作用係形成環化琥珀醯亞胺，其後藉異構化反應產生異天冬胺酸(iso-aspartate)o
(E)提高對第四型雙胜肽蛋白水解酶切割之抗性係藉由如本文所述修飾於第1或2號位置之胺基酸而達成。
(F)保留性或非保留性取代、添加或刪除係不會影響活性，舉例來說，於第2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29號位置中一或多個保留性取代；第27、28或29號位置之一或多個胺基酸刪除；或第29號位置之胺基酸刪除，並視情況結合將羧基端醯胺或酯取代為羧基端羧酸基；
(G)添加如本文所述之羧基端延伸；
(H)增加於循環時半生期及/或延長作用期間及/或延遲起效作用，舉例來說，透過如本文所述胰高血糖素胜肽醯基化或烷基化而達成；
(I)如本文所述之同二聚體化或異二聚體化。
於例示實施例中，胰高血糖素胜肽可相對於天然胰高血糖素序列包含總計1個、高達2個、高達3個、高達4個、高達5個、高達6個、高達7個、高達8個、高達9個、或高達10個胺基酸修飾。
其他修飾包含：第1號位置之組胺酸取代為大的芳香族胺基酸(例如：酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸或胺基苯丙胺酸)；第2號位置之絲胺酸取代為丙胺酸；第10號位置之酪胺酸取代為纈胺酸或苯丙胺酸；於第12號位置之離胺酸取代為精胺酸；於第15號位置之天冬胺酸取代為麩胺酸；於第16號位置之絲胺酸取代為蘇胺酸或胺基異丁酸(AIB)。
如本文所揭示之一實施例係關於一種胰高血糖素促效劑，其係已修飾相對於His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-A1a-G1n-Asp-Phe-Va1-G1n-Trp-Leu- Met-Asn-Thr(SEQ ID N O：1)之野生型胜肽，以增進胜肽對胰高血糖素受體之效能。令人驚奇地，申請人已發現在天然胰高血糖素(SEQIDNO：1)之第16號位置處正常發生之絲胺酸可取代為經選定的酸性胺基酸，以在一有效體外模型測定方法(見例子14)之刺激cAMP合成能力之方面，增強胰高血糖素效能。更具體地說，該取代增強類似物於胰高血糖素受體之效能至少為大於2倍、4倍、5倍，以及高達10倍。該取代增加類似物於胰高血糖素樣肽-1受體之活性，至少為相對於天然胰高血糖素之5倍、10倍或15倍，但選擇性仍維持對胰高血糖素受體超過對胰高血糖素樣肽-1受體。
依據一實施例，於天然胰高血糖素第16號位置之絲胺酸殘基取代為一胺基酸，其係選自包含麩胺酸、麩醯胺酸、同麩胺酸(homog1utamicacid)、同胱胺酸(ho mocysteicacid)、蘇胺酸及甘胺酸所組成之群。依據一實施例，於天然胰高血糖素第16號位置之絲胺酸殘基取代為一胺基酸，其係選自包含麩胺酸、麩醯胺酸、同麩胺酸(homog1utamicacid)、同胱胺酸(ho m ocysteicacid)所組成之群，且於一實施例中，絲胺酸殘基取代為麩胺酸。於一實施例中，該胰高血糖素胜肽於胰高血糖素受體增強選擇性，其係包含SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10之胜肽，或其胰高血糖素促效劑類似物，其中該羧基端胺基酸保留其天然之羧酸基。根據一實施例，提供一種包含N H2-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-G1u-Arg-Arg-A1a-G1n-Asp-Phe-Va1-G1n-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-CO O H(SEQIDNO：10)之序列的胰高血糖素促效劑，其中如利用例子14之體外cAMP測定方法所測量，該胜肽於胰高血糖素受體顯現相對於天然胰高血糖素大約五倍之增強效能。
親水性基團
本發明之胰高血糖素胜肽係可進一步修飾以增加於生理pH值水溶液中溶解度及穩定度，而可保留相對於天然胰高血糖素之高生物活性。諸如聚乙二醇基之親水性基團可用於使蛋白質與活化聚合物分子反應之任何適當條件下連接至胰高血糖素胜肽。可使用任何已為本領域之人所熟知之方法，包含：透過醯基化、還原性烷基化、麥可加成(Michae1addition)、硫醇烷基化或其他化學選擇性結合/連接方法，其係透過於聚乙二醇基團上之反應基(例如：醛基、胺基、酯基、硫醇基、α-鹵素乙醯基(α-ha1oacety1)、馬來醯亞胺基(ma1eimido)、或胼基(hydrazino group))而連接至目標化合物之反應基(例如：醛基、胺基、酯基、硫醇基、α-鹵素乙醯基、馬來醯亞胺基、或胼基)。活化基團可用於連接水溶性聚合物至一或多個蛋白質，包括但不限於碸(su1fone)、馬來醯亞胺(ma1eimide)、硫氫基(su1fh ydry1)、硫醇基、三氟甲基磺酸酯、三氟乙基磺酸酯(tresy1ate)、氮丙啶、環氧乙烷、5-比啶基及α-鹵化醯基 (a1pha-ha1ogenated acy1group)，例如：α-碘乙酸(a1pha-iodoaceticacid)、α-溴乙酸(a1pha-bro m oaceticacid)、α-氯乙酸(a1pha-ch1oroacetic acid)。若藉由還原性烷基化連接，該聚合物應具有單一反應醛基，而可控制聚合反應之程度。請參閱，例如：Kinst1ereta1.，Adv.Drug.De1ivery Rev.54：477-485(2002)；Robertseta1.，Adv.DrugDe1ivery Rev.54：459-476(2002)；and Za1ipskyeta1.，Adv.DrugDe1ivery Rev.16：157-182(1995).
於本發明之一特定方面中，於具有硫醇之胰高血糖素胜肽上的胺基酸殘基係經如聚乙二醇之親水性基團修飾。於某些實施例中，該硫醇係於麥可加成反應下以馬來醯亞胺-活化聚乙二醇修飾，產生聚乙二醇化胜肽包含如下所示之硫醚(thioether)鍵結：
於某些實施例中，該硫醇係於親核劑取代反應下以鹵素乙醯基-活化聚乙二醇修飾，產生聚乙二醇化胜肽包含如下所示之硫醚(thioether)鍵結：
合適之親水性基團包含聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇(po1yoxyethy1ated po1yo1s)(例如：P O G)、聚氧乙基化山梨醇(po1yoxyethy1ated sorbito1)、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化丙三醇(po1yoxyethy1ated g1ycero1，P OG)、聚氧化烯(po1yoxya1ky1enes)、聚乙二醇丙醛(po1yethy1eneg1yco1propiona1dehyde)、乙二醇/丙二醇之共聚物、單甲氧基聚乙二醇(monomethoxy-po1yethy1eneg1yco1)、單-(C1-C10烷氧基或芳氧基聚乙二醇(mono-(C1-C10)a1koxy-orary1oxy-po1yethy1ene g1yco1) 、羧甲基纖維素(carboxy m ethy1ce11u1ose)、聚縮醛(po1yaceta1s)、聚乙烯醇(po1yviny1a1coho1，P V A)，聚乙烯氫比咯酮(po1yviny1pyrro1idone)、聚1，3-二氧環戊烷(po1y-1，3-dioxo1ane)、聚1，3，6-三氧環戊烷(po1y-1，3，6-trioxane)、乙二醇/順丁烯二酸酐之共聚物(ethy1ene/ma1eic anhydride copo1y mer)、聚(β-胺基酸)(可為同元聚合物或任意共聚物)、聚N-乙烯氫吡咯酮聚乙二醇(po1y(n-viny1 pyrro1idone)po1yethy1eneg1yco1)、丙二醇(propropy1ene g1yco1，PPG)同元聚合物及其他聚環氧烷化合物(po1ya1ky1ene oxides)、聚環氧丙烷/環氧乙烷之共聚物(po1ypropy1ene oxide/ethy1ene oxidecopo1y mers)、結腸酸(co1onicacids)或其他多醣聚合物、聚蔗糖(Fico11)或聚葡萄糖(dextran)及其混合物。聚葡萄糖為主要藉由α1-6鍵(α1-61inkages)鍵結之葡萄糖次單元之多醣聚合物。聚葡萄糖多種有效的分子量範圍，例如約1kD 至100kD，或從約5、10、15或20kD至20、30、40、50、60、70、80或90kD。直鏈或分支聚合物在考慮範圍內。結合物之合成製備主要可為單分散或多分散，並具有每胜肽約0.5、0.7、1、1.2、1.5或2聚合物基團。
依據一實施例，於SEQID NO：9或SEQID NO：10之胜肽中，導入親水性基團至第17、21及24號位置，預期可改善高效能胰高血糖素類似物於生理pH值溶液之溶解度及穩定度。導入此類基團亦可增加作用期間，例如測量於循環時半生期。合適之親水性基團包含任何已為人所熟知的可溶性聚合物，包含：聚乙二醇、聚乙二醇同元聚合物或共聚物、一聚乙二醇之單甲基取代聚合物(m ono methy1-substitutedpo1ymerofPE G，mPEG)或聚氧乙烯甘油(po1yoxyethy1eneg1ycero1(PO G))。依據一實施例，該親水性基可包含聚乙二醇(EG)鏈。更具體地說，於一實施例中該胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：6或SEQIDNO：7之序列，其中聚乙二醇鏈共價性連接於該胰高血糖素胜肽之第21及24號位置胺基酸之側鏈，或其具有羧酸基之羧基端胺基酸。
結合物
本發明揭示內容亦涵蓋其他結合物，其中本發明之胰高血糖素相關胜肽視情況透過共價性鍵結，並視情況透過連接物鍵結至結合物基團。鍵結可藉由共價性化學鍵、物理力諸如靜電、氫、離子、凡得瓦力(vander Waa1s)、或疏水性或親水性交互作用而達成。可使用各種非共價偶合系統，包括生物素-抗生物素蛋白質(biotin-avidin)、配體/受體、酵素/基質、核酸/核酸結合蛋白質、脂質/脂質結合蛋白質、細胞黏附分子伴體(ce11u1aradhesion m o1ecu1e partners)；或其對於彼此具有親和力之任何結合伴體或片段。
該胰高血糖素相關胜肽可結合於結合物基團，其係透過標的胜肽胺基酸殘基與一有機衍生化試劑而直接共價性鍵結，該有機衍生化試劑能與選定之側鏈或是該標的胺基酸之胺基端、羧基端胺基酸進行反應。該胜肽或結合物基團之反應官能基包括如：醛基、胺基、酯基、硫醇基、α-鹵素乙醯基(α-ha1oacety1)、馬來醯亞胺基(m a1eimido)、胼基(hydrazino)。衍生化試劑包括：如馬來醯亞胺苯甲醯硫化琥珀醯亞胺酯(ma1eimidobenzoy1su1fo succinimideester)(透過半胱胺酸殘基結合)，N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide)(透過離胺酸殘基結合)，戊二醛(g1utara1dehyde)，琥珀酸酐，或其他已於該領域所熟知藥劑。或者，結合物基團係可間接地透過一中間載體結合於該胜肽，例如多醣或多肽載體。多醣載體之例子包括胺葡聚糖(aminodextran)。適合的多肽載體之例子包括：聚離胺酸、聚麩胺酸、聚天冬胺酸、及其共聚物、以及前述胺基酸或其他胺基酸之混合聚合物，例如絲胺酸，以賦予其載體期望的溶解度性質。
半胱胺酸殘基最常與α-鹵乙酸酯(及相關胺類)進行反應，例如：氯乙酸或氯乙醯胺，以產生羧甲基或醯胺甲基(carboxyamidomethy1)之衍生物。半胱胺酸殘基亦會衍生自與溴三氟丙酮(bromotrifluoroacetone)、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸(alpha-bromo-β-(5-imidozoyl)propionic acid)、氯乙醯磷酸酯(chloroacetyl phosphate)、N-烷基馬來醯亞胺(N-alkylmaleimides)、二硫化3-硝基-2-吡啶(3-nitro-2-pyridyl disulfide)、二硫化甲基2-吡啶(methyl 2-pyridyl disulfide)、對氯汞苯甲酸鹽(p-chloromercuribenzoate)、2-氯汞4-硝基苯酚(2-chloromercuri-4-nitrophenol)、或氯-7-硝基苯-2-氧雜-1,3-二氮唑(chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole)之反應中。
組胺酸殘基會衍生自與焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)在pH值為5.5-7.0之反應下，因為此化合物對於組胺酸側鏈相對專一。對溴苯醯甲基溴(Para-bromophenacyl bromide)同樣具有作用；此反應之較佳條件係在pH 6.0的0.1M之二甲砷酸鈉(sodium cacodylate)。
離胺酸及胺基端殘基會與琥珀酸及其他羧酸酐進行反應。與這些成分之衍生反應可反轉改變離胺醯基所帶電荷。其他適於衍生具有α胺基殘基者包括有：亞胺酯(imidoesters)，例如：甲基吡啶亞胺甲酯(methyl picolinimidate)、吡哆醛磷酸(pyridoxal phosphate)、吡哆醛(pyridoxal)、氫氯硼化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid)、O-甲基異脲硫酸鹽(O-methylisourea)、2,4-戊二酮(2,4-pentanedione)以及與乙醛酸(g1yoxy1ate)之轉胺酶催化反應(transa minase-cata1yzed reaction)。
精胺酸殘基可藉由與一或數個傳統反應劑發生反應進行修飾，包括：苯甲醯甲醛(pheny1g1yoxa1)、2，3-丁二酮(2，3-butanedione)、1，2-環己二酮(1，2-cyc1ohexanedione)及茚三酮(ninhydrin)。由於胍(guanidine)官能基之高p Ka，精胺酸殘基之衍生反應需要在鹼性環境下。更甚者，此等成分除可與精胺酸的基團發生反應外，亦可與精胺酸之ε胺基反應。
酪胺酸殘基之特定修飾可特別重要地在於酪胺酸殘基導入光譜標記完成，係經由芳香族重氮(aro m aticdiazonium)化合物或四硝基甲烷(tetranitro m ethane)之反應形成。最常見地，係將N-乙醯咪(N-acety1imidizo1e)及四硝基甲烷(tetranitro m ethane)用以分別形成O-乙醯酪胺醯類(O-acety1tyrosy1species)及3-氮衍生物。
羧酸側基團(天冬胺基或糓胺基)係選擇性地藉由與碳化二亞胺(carbodiimides)(R-N=C= N-R')反應修飾，其中R及R'係為不同烷基，例如1-環己基-3-(2-嗎琳基-4-乙基)-碳化二 亞 胺 ( 1-cyc1ohexy1-3-(2-m orpho1iny1-4-ethy1)carbodiimide)或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4，4-雙甲基戊基)-碳亻二亞胺 ( 1-ethy1-3-(4-azonia-4，4-dim ethy1penty1)carbodiimide)。更甚者，天冬胺基或糓胺基藉由與銨離子反應而轉變為天冬醯胺基或麩醯胺基。
其他修飾作用包括脯胺酸及離胺酸之氫氧化，絲胺酸及蘇胺酸之磷酸化，離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈α胺基之甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and M o1ecu1arProperties，W.H.Freeman＆Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))、天冬醯胺酸或麩醯胺酸之去醯胺化、胺基端胺基之乙醯化，及/或羧基端羧酸基之醯胺化或酯化。
另一共價修飾包括化學性或酵素性偶合醣苷(g1ycosides)結合於該胜肽。醣類係可結合於(a)精胺酸及組胺酸、(b)游離羧酸基、(c)游離硫氫基(例如半胱胺酸)、(d)絲胺酸、蘇胺酸及氫氧化脯胺酸之自由羥基、(e)酪胺酸或色胺酸之芳香殘基、或(f)麩醯胺酸之醯胺基。這些方法描述於在1987年9月11日公開之第WO87/05330號前案，以及Ap1in and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981).
例示之結合物係可連接至任何如本文所述之胰高血糖素相關胜肽，包括但不限於：異源性胜肽(hetero1ogous)或多肽(包括，例如：血漿蛋白)、標靶藥劑、免疫球蛋白或其部位(例如可變區、CDR或Fc部位)、診斷標記(例如：同位素、螢光或酵素標記)、一聚合物係包括有水溶性聚合物、或其他治療性或診斷性藥劑。於一實施例中，提供一種結合物，其包括一胰高血糖素胜肽及一血漿蛋白，其中該血漿蛋白係選自於包含：白蛋白、運鐵蛋白、纖維蛋白原及球蛋白所組成之群。於一實施例中，該結合物之血漿蛋白基團係為白蛋白或運鐵蛋白。
於某些實施例中，連接物包括約1至60、1至30個原子或更長之鏈，2至5、2至10、5至10、10至20個原子長。於某些實施例中，該鏈之原子全為碳原子。於某些實施例中，組成連接物主鏈之鏈原子係選自於包含：碳、氧、氮及硫所組成之群。鏈原子及連接物係選自依據其期望之溶解度(親水性)，以提供一更易溶解之結合物。於某些實施例中，連接物提供一種官能基，該官能基易受到酵素或其他催化劑，或於標的組織或器官或細胞中發現水解情形而切割。於某些實施例中，連接物之長度足以減少立體障礙之效能。若連接物係為共價鍵或肽鍵，且結合物係為多肽，則整體結合物係可為融合蛋白。此類胜肽連接物係可為任何長度。例示之連接物係為約1至50個胺基酸長度，5至50、3至5、5至10、5至15或10至30個胺基酸長度。另一種方式為此等融合蛋白係可以藉由該領域具有通常知識者所熟知之基因重組工程方法所生成。
如前所述，於某些實施例中，該胰高血糖素胜肽係結合有，例如：融合於至免疫球蛋白或其部位(例如：可變區、CDR或Fc部位)。已知之免疫球蛋白(Ig)種類包括：IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc部位係為免疫球蛋白重鏈之羧基端部位，用以鍵結至Fc受體以表現活性，例如：再利用(以延長其半生期)、抗體依賴毒殺細胞反應(antibody dependentce11-mediated cytotoxicity，以下簡稱A D C C)、及補體依賴毒殺細胞反應(co m p1ementdependentcytotoxicity，以下簡稱CDC)。
舉例來說，依據某些定義而言，人類免疫球蛋白IgG之重鏈Fc部位由半胱胺酸226(半胱胺酸226)延伸至重鏈之羧基端。「樞紐部位(hinge region)」一般是由人類免疫球蛋白IgG1之麩胺酸216(G1u216)延伸至脯胺酸230(PrO230)(其他構造同型(isotypes)IgG之樞紐部位可對齊於IgG1系列，其係藉由對齊於包含於半胱胺酸鍵結之半胱胺酸)。人類免疫球蛋白IgG 之 Fc部位包括兩不變區域(constantdomains)：CH2及CH3。人類免疫球蛋白IgG 中Fc部位之CH2區係由第231號位置胺基酸延伸至341號位置胺基酸。人類免疫球蛋白IgG中Fc部位之CH2區係由第342號位置胺基酸延伸至447號位置胺基酸。免疫球蛋白、其片段或區域之胺基酸編號係依據Kabateta1.1991，SequencesofProteinsofIm muno1ogica1Interest，U.S.Department of Pub1ic Hea1th，Bethesda，M d. 於一相關實施例中，Fc部位係可包括一或多個天然或經修飾之免疫球蛋白重鏈不變區域，除CH1外，例如，免疫球蛋白IgG及IgA之CH2與CH3區域，或免疫球蛋白IgE之CH3及CH4區域。
適合之結合物基團包括含有FcRn結合部免疫球蛋白序列之部位。FcRn是一種補救性受體(sa1vagereceptor)，負責免疫球蛋白之再利用且將其送回血液中循環。FcRn部位中鍵結IgG至FcRn受體之區域已利用X光結晶法顯示(Burmeistereta1.1994，Nature372：379)。FcRn 及 Fc主要接觸之區域係接近於CH2和CH3區域之連接位置。FcRn及Fc均於單一IgG之重鏈內。主要接觸之位置包括：CH2區域中第248、250至257、272、285、288、290至291、308至311、及314號位置之胺基酸殘基，以及CH3區域中第385至387、428、及433至436號位置之胺基酸殘基。
某些結合物基團係可以包括或不包括FcγR結合部。FcγR結合部係用以負責ADCC及CDC進行。Fc區域與FcγR直接接觸之位置於第234至239號胺基酸(低樞紐區域)、第265至269號胺基酸(B/C1oop)、第297至299號胺基酸(C'/E1oop)、及第327至332號胺基酸(F/G 1oop)(Sondermanneta1，Nature406：267-273，2000)。IgE之低樞紐區域亦包括於FcRI結合中(Henry，et a1，Biochemistry36，15568-15578，1997)。IgA受體結合之胺基酸殘基已發表於Lewiseta1.，(JIm muno1.175：6694-701，2005)。IgE受體結合之胺基酸殘基已發表於Sayerseta1.(J Bio1Chem.279(34)：35320-5，2004)。
免疫球蛋白之Fc區域亦可形成胺基酸修飾。此等可變之Fc區域至少包括一胺基酸修飾於Fc區域之CH3區域(第342至447號位置)，及/或至少一胺基酸修飾於Fc區域之CH2區域(第231至341號位置)。某些突變據信可增加對FcRn之親和力，包括T256A、T307A、E380A，及N434A(Shie1ds et a1.2001，J.Bio1.Chem.276：6591)o其他突變於不明顯減少FcRn之親和力情形下，係可減少Fc區域對FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB，及/或 FcγRIIIA之親和力。例如，將Fc區域中第297號位置之天冬醯胺酸取代為丙胺酸或其他胺基酸，可除去高度保留之N-醣化部，並伴隨著Fc區域半生期之延長而導致免疫力降低，亦減少結合於FcγRs(Rout1edge et a1.1995，Transp1antation60：847；Friend et a1.1999，Transp1antation68：1632；Shie1dseta1.1995，J.Bio1.Chem.276：6591)。於Ig G1之第233至236號位置之胺基酸修飾可減少結合於FcγRs(W ard and Ghetie1995，TherapeuticIm muno1ogy2：77及Armoureta1.1999，Eur.J.Im muno1.29：2613)。某些例示之胺基酸取代揭示於美國專利第7，355，008及7，381，408號，前述每一申請案揭示內容全體皆弓用作為本說明書之參考資料。
融合蛋白及末端延伸
本發明亦涵蓋胰高血糖素融合胜肽或蛋白質，其中一第二胜肽或多肽已融合至胰高血糖素胜肽之末端(例如，羧基端)。更具體地說，該融合胰高血糖素胜肽係可包含SEQIDNO：55、SEQID NO：9或SEQID NO：10之胰高血糖素促效劑，其進一步包含一連接至胰高血糖素胜肽中第29號位置胺基酸之SEQ ID NO：26(GPSSGAPPPS)、 SEQ IDNO：27(KRNRNNIA)或SEQIDNO：28(KRNR)胺基酸序列。於一實施例中，SEQID NO：26(GPSSGAPPPS)、SEQIDNO：27(KRNRNNIA)或SEQID NO：28(KRNR)之胺基酸序列，係透過胜肽鍵連接至胰高血糖素胜肽中第29號胺基酸。申請人發現，該第三類胰高血糖素相關胜肽之融合胜肽包含促胰島素分泌素-4(例如，SEQID NO：26或SEQID NO：29)之羧基端延伸，第29號位置之天然蘇胺酸殘基取代為甘胺酸將大幅增加胰高血糖素樣肽-1受體活性。此胺基酸取代係可與其他如本文所述之修飾一起使用，以增進胰高血糖素類似物於胰高血糖素樣肽-1受體之親和力。舉例來說，此蘇胺酸29甘胺酸(T29G)取代可結合絲胺酸16麩胺酸(S16E)及天冬醯胺酸20離胺酸(N20K)胺基酸取代，視情況於第16及20號位置之胺基酸間具有內醯胺架橋，以及視情況添加如本文所述之聚乙二醇鏈。於一實施例中，提供一胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑包含SEQIDNO：64之序列。於某些實施例中，該胰高血糖素融合胜肽之胰高血糖素胜肽部分係選自於包含SEQIDNO：55、SEQID NO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、及SEQIDNO：5所組成之群，其中具有一聚乙二醇鏈，該聚乙二醇鏈存在於第17、21、24號位置、或羧基端胺基酸、或第21及24號位置均存在，該聚乙二醇鏈之範圍選自於約500至40，000道耳吞(Da1tons)。更具體地說，於某些實施例中，該胰高血糖素胜肽片段，係選自於包含SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、及SEQIDNO：63所組成之群，其中該聚乙二醇鏈之範圍選自於約500至5，000道耳吞(Da1tons)。於一實施例中，該胰高血糖素胜肽係為一融合胜肽，包含SEQIDNO：65之序列，其中SEQIDNO：65之胜肽連接至SEQIDNO：55之羧基端。
電中性羧基端
依據一實施例，SEQIDNO：10之胰高血糖素胜肽中額外的化學修飾賦予增加胰高血糖素樣肽-1受體效能，其係增加至於胰高血糖素受體及胰高血糖素樣肽-1受體之相對活性幾乎相等之程度。因此，於一實施例中，提供一種胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1受體共同促效劑其中本發明之胰高血糖素胜肽的末端胺基酸具有一醯胺基以取代天然胺基酸之羧酸基。於個別胰高血糖素受體及胰高血糖素樣肽-1受體之胰高血糖素類似物相對活性，係可藉對該胰高血糖素胜肽進一步修飾而調整，生產之類似物證實於胰高血糖素受體具約40%至500%或更高之天然胰高血糖素活性，以及於胰高血糖素樣肽-1受體具約20%至200%或更高之天然胰高血糖素樣肽-1活性，例如：相對於胰高血糖素樣肽-1受體之胰高血糖素正常活性增加50倍、100倍或更高。於某些實施例中，本文所述之胰高血糖素胜肽於胰高血糖素受體顯現高達約100%、1000%、10，000%、100，000%，或1，000，000%之天然胰高血糖素活性。於某些實施例中，本文所述之胰高血糖素胜肽於胰高血糖素樣肽-1受體顯現高達約100%、1000%、10，000%、100，000%，或1，000，000%之天然胰高血糖素樣肽-1活性。
α螺旋/分子內架橋之穩定化
於一再一實施例中，提供顯現增強之胰高血糖素樣肽-1受體促效劑活性的胰高血糖素類似物，其中於兩個胺基酸側鏈之間形成分子內架橋，以使胜肽之羧基端的三維結構穩定。該兩胺基酸側鏈可經由非共價鍵(例如，氫鍵結)、離子交互作用(諸如形成鹽橋)、或藉由共價鍵相互連接。當兩個胺基酸側鏈係透過一或多個共價鍵相互連接時，該胜肽於此可被視為包含共價性分子內架橋。當兩個胺基酸側鏈係透過非共價鍵(例如，氫鍵、離子交互作用)相互連接時，該胜肽於此可被視為包含非共價性分子內架橋。
於某些實施例中，分子內架橋形成於間隔3個胺基酸之兩股基酸間，例如：第i及i+4號位置之胺基酸，其中i為任何介於12及25間之整數(例如第12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、及25號位置)。更具體地說，於12及16、16及20、20及24、24及28號之胺基酸對(胺基酸對中i=12、16、20、或24)互相連接，因此穩定胰高血糖素之α螺旋。或者，i可為17。
於某些特定實施例中，其中第i及i+4號位置胺基酸係藉由分子內架橋連接，該連接物約8個原子，或約7至9個原子。
於其他實施例中，分子內架橋形成於間隔2個胺基酸之兩胺基酸間，例如：第j及j+3號位置之胺基酸，其中j為任何介於12及26間之整數(例如第12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25及26號位置)。於某些定實施例中，j為17。
於某些特定實施例中，其中第j及j+3號位置胺基酸係藉由分子內架橋連接，該連接物約6個原子，或約5至7個原子。
於又一實施例中，分子內架橋形成於間隔6個胺基酸之兩胺基酸間，例如：第k及k+7號位置之胺基酸，其中k為任何介於12及22間之整數(例如第12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、及22號位置)。於某些特定實施例中，k係為12、13、或17。於例示實施例中，k係為17。
可共價性鍵結形成6個原子連接架橋之胺基酸對例子包括：鳥胺酸與天冬胺酸、麩胺酸與包括化學式I之胺基酸，其中n為2、及同麩胺酸與包括化學式I之胺基酸，其中n為1，其中化學式I係為：
其中n=1至4
[化學式I]
可共價性鍵結形成7個原子連接架橋之胺基酸對例子包括：鳥胺酸-麩胺酸(內醯胺環)；離胺酸-天冬胺酸(內醯胺)；或同絲胺酸-同麩胺酸(內酯)。可形成8個原子之連接物胺基酸對例子包括：離胺酸-麩胺酸(內醯胺)；同離胺酸-天冬胺酸(內醯胺)；鳥胺酸-同麩胺酸(內醯胺)；4-胺基苯丙胺酸-天冬胺酸(內醯胺)；或酪胺酸-天冬胺酸(內酯)。可形成9個原子連接物之胺基酸對例子包括：同離胺酸-麩胺酸(內醯胺)；離胺酸-同麩胺酸(內醯胺)；4-胺基苯丙胺酸-麩胺酸(內醯胺)；或酪胺酸-麩胺酸(內酯)。此類胺基酸上之任何側鏈係可額外地取代為添加之化學基團，只要α螺旋體之三維結構不會被破壞即可。該領域具有通常知識者係可預想包括化學修飾衍生物之取代配對或取代胺基酸類似物，將產生類似大小及期望效果之穩定化結構。舉例來說，同半胱胺酸-同半胱胺酸雙硫架橋之長度為6個原子，且可進一步修飾以提供期望效果。即使沒有共價鍵結，上述之胺基酸對或該領域具有通常知識者可預想之類似配對亦可透過非共價鍵(例如，透過形成鹽橋或氫鍵之交互作用)而對α螺旋提供增加之穩定度。
進一步例示實施例包括下列胺基酸對，視情況具有內醯胺架橋：第12號位置麩胺酸與第16號位置離胺酸；第12號位置天然離胺酸與第16號位置麩胺酸；第16號位置麩胺酸與第20號位置離胺酸；第16號位置離胺酸與第20號位置麩胺酸；第20號位置麩胺酸與第24號位置離胺酸；第20號位置離胺酸與第24號位置麩胺酸；第24號位置麩胺酸與第28號位置離胺酸；第24號位置離胺酸與第28號位置麩胺酸。
根據一實施例，提供一種顯現胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1受體共同促效劑活性之胰高血糖素類似物，其中該類似物包含一胺基酸序列，其選自由SEQIDNO：11、47、48及49所組成之群。於一實施例中，該側鏈係共價性互相鍵結，且於一實施例中，兩股基酸係互相鍵結以形成內醯胺環。內醯胺環之大小係可隨其胺基酸側鏈長度而變，於一實施例中，內醯胺係藉由離胺酸側鏈連接至麩胺酸側鏈而形成。
內醯胺環之醯胺鍵順序可相反(例如：內醯胺環可形成於第12號位置離胺酸與第16號位置麩胺酸間，或者第12號位置麩胺酸與第16號位置離胺酸間)。依據一實施例，提供一種SEQIDNO：45之胰高血糖素類似物，其中至少一個內醯胺環形成於胺基酸對之側鏈間，該胺基酸對係選自包含：第12與16，第16與20、第20與24、及第24與28號位置組成之群組。於一實施例中，提供一胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑包含SEQIDNO：20之一胰高血糖素胜肽類似物，其中該胜肽包含一分子內內醯胺架橋，其係形成於第12及16號、或第16及20號胺基酸位置間。於一實施例中，提供一胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑包含SEQIDNO：20之序列，其中一分子內內醯胺架橋形成於第12及16號、或第16及20號、或第20及24號胺基酸位置間，且第29號位置為甘胺酸，其中SEQID NO：29係連接至SEQIDNO：20之羧基端胺基酸。於另外實施例中，第28號位置為天冬胺酸。
可用除內醯胺架橋外之分子內架橋來穩定胰高血糖素類似物胜肽之α螺旋。於一實施例中，該分子內架橋係為一疏水性架橋。於此例子中，分子內架橋係較佳地位於兩胺基酸側鏈間，其係胰高血糖素類似物胜肽α螺旋之疏水性面的一部份。舉例來說，加入疏水性架橋之一胺基酸可以是第10、14、及18號位置之胺基酸。
於一特定方面，烯烴複分解反應(O1efin m etathesis)係利用一全碳水化合物交叉連結系統，而用於交聯胰高血糖素胜肽之α螺旋之一或二個彎折。於此例中，胰高血糖素胜肽可包括α-甲基化胺基酸，其具有可變長度之烯烴側鏈，且於i及i+4或i+7位置結合R或S立體化學組態。舉例來說，烯烴側鏈可包括(CH2)n，其中n為1~6之間任一整數。於一實施例中，交聯長度為8個原子時，n為3。適於形成此類分子內架橋之方法如先前技術所述，例如可參閱Schafmeister eta1.，J.A m.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)及W a1enskyeta1.，Science305：1466-1470(2004).或者，該胰高血糖素胜肽可包括氧-烯基絲胺酸(O-a11y1Ser)殘基，其係鄰近於螺旋彎折，透過釕催化環親近複分解反應(rutheniu m-cata1yzedring c1osing m etathesis)而架橋在一起。於此所述交聯方式可參閱例如B1ack We11 et a1.，Angew，Chem.，Int.Ed.37：3281-3284(1998)。
於另一特定方面，利用非自然硫代二丙胺酸胺基酸(thio-dia1anine)、羊毛硫胺酸(1anthionine)，其可廣泛地應用作為半胱胺酸之擬肽(peptido mim etic)，被用於交聯α螺旋之彎折。適於羊毛硫氨酸基礎之環化方法係為該領域具有通常知識者所熟知，可參閱例如M atteucci et a1.，Tetrahedron Letters45：1399-1401(2004)；M ayer et a1.，J.Peptide Res.51：432-436(1998)；Po1insky et a1.，J.Med.Chem.35：4185-4194(1992)；Osapayeta1.，J.Med.Chem.40：2241-2251(1997)；Fukaseeta1.， Bu11.Chem.Soc.Jpn.65：2227-2240(1992)；Harpp eta1.，J.Org.Chem.36：73-80(1971)；GoodmanandShao，Pure App1.Chem.68：1303-1308(1996)；and Osapay and Goodman，J.Chem.Soc.Chem.Commun.1599-1600(1993)o
於某些實施例中，α，ω-二胺烷類繫鏈(α，ω-diaminoa1kane tethers)(例如1，4-二胺丙烷及1，5-二胺戊烷)在兩麩胺酸殘基(i及i+7位置)，可用以穩定胰高血糖素胜肽之α螺旋。此種繫鏈(tethers)導致形成一具有9個或更多原子長度之架橋，視二胺烷類繫鏈之長度而定。適於以繫鏈形成交聯胜肽之方法可參閱，例如Phe1aneta1.，J.A m.Chem.Soc.119：455-460(1997)。
於又一實施例中，可利用雙硫架橋交聯胰高血糖素胜肽之α螺旋之一或二彎折。或者，經修飾之雙硫架橋其中一或兩硫原子以亞甲基(methy1enegroup)取代，導致異構巨環作用(isosteric m acrocyc1ization)，可用以穩定胰高血糖素胜肽之α螺旋。適於以雙硫架橋或硫基環化作用修飾胜肽之方法可參閱如Jackson et a1.，J.A m.Chem.Soc.113：9391-9392(1991)及RLdinger and Jost，Experientia20：570-571(1964)o
於又一實施例中，胰高血糖素相關胜肽之α螺旋可經由下列方式予以穩定：透過在兩個組胺酸殘基或一組胺酸與半胱胺酸對之i及i+4位置結合金屬原子。該金屬原子係可為，如：Ru(III)、Cu(II)、Zn(II)、或Cd(II)。適於以結合金屬原子為基礎以穩定α螺旋之方法係為該領域具有通常知識者所熟知，可參閱例如Andrews and Tabor，Tetrahedron55：11711-11743(1999)；Ghadirieta1.，J.A m.Chem.Soc.112：1630-1632(1990)；and Ghadirieta1.，J.A m.Chem.Soc.119：9063-9064(1997)o
其他穩定胰高血糖素相關胜肽之α螺旋之方法可以透過胜肽環化，可參閱D avies，J.Peptide.Sci.9：471-501(2003)。α螺旋可經由形成醯胺架橋、硫酯架橋、尿素架橋、胺甲酸酯(carbamate)架橋、硫醯胺(su1fonamide)架橋及其相似物而穩定。舉例來說，硫酯架橋可形成於羧基端及半胱胺酸殘基之側鏈間。或者，硫酯可形成於其側鏈具有硫醇(半胱胺酸)及羧酸(例如；天冬胺酸、麩胺酸)的胺基酸。於另一方法中，交聯劑例如：二元羧酸(例如：軟木酸(octanedioicacid))等，係可導入一連結於胺基酸側鏈之兩官能基，例如胺基、烴基、硫醇基，或其組合。
依據一實施例，胰高血糖素相關胜肽之α螺旋可經由在i及i+4位置添加疏水性胺基酸使其穩定。例如，i可以為酪胺酸且i+4可以為纈胺酸或白胺酸；i可以為苯丙胺酸且i+4可以為半胱胺酸或甲硫胺酸：i可以為半胱胺酸且i＋4可以為甲硫胺酸；或i可以為苯丙胺酸且i+4可以為異白胺酸。應了解的是為達此目的，前述之胺基酸對順序係可反轉，指定之胺基酸於i位置，亦可於i+4位置，此時原來i+4胺基酸係可於i位置。
根據本發明之又另一實施例，具有增強胰高血糖素樣肽-1活性之胰高血糖素胜肽包含：(a)一或多個在胺基酸第12至29號位置內取代為經α，α-雙取代胺基酸，及視情況(b)羧基端醯胺。於某些方面中，應明瞭此等胰高血糖素胜肽明確地缺少一分子內架橋(例如，共價性分子內架橋)，該分子內架橋係使胰高血糖素之羧基端部分(大約第12至29號位置)中的α螺旋結構穩定。於某些實施例中，胰高血糖素之第16、17、18、19、20、21、24或29號位置中一、二、三、四或多個位置取代為α，α-雙取代胺基酸，例如：胺基異丁酸，係一種胺基酸，雙取代為相同或相異基團，該基團係選自於包含：甲基、乙基、丙基及正-丁基組成之群組、或環辛烷、或環庚烷(例如：1-胺基環辛烷-1-羧酸)。舉例來說，於不存在分子內架橋，例如，非共價性分子內架橋(例如：鹽橋)或共價性分子內架橋(例如：內醯胺)下，第16號位置取代為胺基異丁酸增強胰高血糖素樣肽-1活性。於某些實施例中，第16、20、21及24號位置之一、二、三或更多位置取代為胺基異丁酸。此一胰高血糖素胜肽可進一步包含一或多個如本文所述之其他修飾，包括但不限於：醯基化、烷基化、聚乙二醇化、刪除1至2個羧基端處之胺基酸、於羧基端添加及/或取代為帶電胺基酸、以醯胺取代羧基端羧酸酯、添加一羧基端延伸、及保留性及/或非保留性胺基酸取代(諸如：第27號位置之甲硫胺酸取代為白胺酸或正白胺酸(N1e)、於第15號位置之天冬胺酸取代為麩胺酸(或類似胺基酸)、於第1及/或2號位置處係取代為達成第四型雙胜肽蛋白水解酶抗性之胺基酸、第2號位置之絲胺酸取代為丙胺酸、第10號位置之酪胺酸取代為纈胺酸或苯丙胺酸、第12號位置之離胺酸取代為精胺酸、第16號位置之絲胺酸取代為蘇胺酸或胺基異丁酸、第20及/或24號位置之麩醯胺酸取代為天冬胺酸、麩胺酸或胺基異丁酸、第16號位置之絲胺酸取代為麩胺酸或蘇胺酸、第18號位置精胺酸取代為丙胺酸、第20號位置之麩醯胺酸取代為離胺酸、第21號位置之天冬胺酸取代為麩胺酸以及第24號位置之麩醯胺酸取代為天冬醯胺酸或半胱胺酸。於某些實施例中，前述的胰高血糖素胜肽包含第29號位置處之麩醯胺酸或甘胺酸或一添加羧基端延伸，例如，第28號位置胺基酸至羧基端的GGPSSGAPPPS(SEQIDNO：26)。於一特定方面，胰高血糖素胜肽包含：一或多個替代羧基端羧酸酯之醯胺基、醯基(例如，C16脂肪酸)、及親水性基團(例如，聚乙二醇(PEG))。
此外，於另一特定方面，胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：1-25、30-64、及66-555中任何胺基酸序列，其係包含不超過十個相對於SEQIDNO：1之修飾且包含於第16、20、21、24號位置中一或多個胺基酸取代為胺基異丁酸，其中該胜肽於胜肽兩個胺基酸之側鏈間缺少一分子內架橋(例如，共價性分子內架橋)。因此，於一更特定方面，胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：556-561中任何胺基酸序列。
根據某些實施例，缺少分子內架橋之胰高血糖素胜肽包含於胺基酸第12至29號位置內之一或多個取代為α，α-雙取代胺基酸的取代，以及共價連接至胰高血糖素胜肽第10號位置處之胺基酸側鏈的醯基或烷基。於特定實施例中，該醯基或烷基並非自然生成於胺基酸上。於某些方面，醯基或烷基對於第10號位置處之胺基酸係非自然的。於例示實施例中，缺少分子內架橋之胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：556-561中任何胺基酸序列及共價連接至胰高血糖素胜肽第10號位置處胺基酸側鏈的醯基或烷基。此等缺少分子內架橋之經醯基化或烷基化的胰高血糖素胜肽相較於未經醯基化的相對胜肽，於胰高血糖素樣肽-1及胰高血糖素受體呈現增強之活性。於胰高血糖素樣肽-1受體及胰高血糖素受體，增強對缺少分子內架橋(例如：共價性分子內架橋)的胰高血糖素類似物胜肽活性，係可藉由添加醯基或烷基至該胜肽第10號位置胺基酸之側鏈而達成。加入或不加入間隔物之醯基化及烷基化將進一步於本文中說明。
第1號位置處之修飾
根據本發明之一實施例，具有增強胰高血糖素樣肽-1活性之胰高血糖素胜肽包含：(a)第1號位置之組胺酸取代為大的、芳香族胺基酸，及(b)穩定胰高血糖素胜肽羧基端部分(約於第12至29號位置)中α螺旋之分子內架橋。於一特定實施例中，第1號位置之胺基酸為酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、胺基苯丙胺酸、硝基苯丙胺酸、氯苯丙胺酸、磺酸基苯丙胺酸(su1fo-Phe)、4-比定丙胺酸(4-pyridy1-A1a)、甲基酪胺酸或3-胺基酪胺酸。於一特定方面，該分子內架橋藉由三個插入股基酸分隔之兩個胺基酸側鏈之間而形成，即：介於第i及i+4號位置之胺基酸側鏈間。於某些實施例中，該分子內架橋係內醯胺架橋。於本發明之一更具體實施例中，胰高血糖素胜肽包含有於第1號位置處之大的芳香族胺基酸以及於胜肽之第16及20號位置處之胺基酸間的內醯胺架橋。此一胰高血糖素胜肽可進一步包含一或多個(例如，二、三、四、五或更多)如本文所述之其他修飾。舉例來說，胰高血糖素胜肽可包含一醯胺以替代羧基端羧基。因此，於一實施例中，胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：555之胺基酸序列。
醯基化
根據一實施例，該胰高血糖素胜肽可包含一醯基，如：一對自然生成之胺基酸而言為非自然之醯基。該醯基導致胜肽具有一或多個下列作用：(i)於循環時延長半生期，(ii)延遲起效作用，(iii)延長作用期間，(iv)或增進對蛋白酶如：第四型雙胜肽蛋白水解酶之抗性，和(v)增加於胰高血糖素樣肽-1受體、胃抑胜肽受體及/或胰高血糖素受體之效能。如文中所示，經醯基化的胰高血糖素胜肽不會相較於對應的未經醯基化之胰高血糖素胜肽於胰高血糖素受體、胃抑胜肽受體、及/或胰高血糖素樣肽-1受體顯現減低之活性。反之，於一些例子中，經醯基化的胰高血糖素胜肽實際上於胰高血糖素樣肽-1受體、胃抑胜肽受體、及/或胰高血糖素受體顯現增加之活性。因此，如未增加的話，醯基化類似物之效能相較於未醯基化版胰高血糖素共同促效劑類似物之效能相當。
根據一實施例，該胰高血糖素胜肽經修飾而包含一醯基，其係透過透過酯、硫酯、或醯胺鍵結而連接，以達成於循環時延長半生期及/或延遲起效及/或延展作用期間及/或增進對蛋白酶(如：第四型雙胜肽蛋白水解酶)抗性之目的。
醯基化可以於胰高血糖素胜肽中任何位置實現，該位置包含第1至29號位置中任一個、位於羧基端延伸內之一位置或羧基端胺基酸，其限制條件為如未增強時，保留胰高血糖素及/或胰高血糖素樣肽-1及/或胃抑胜肽活性。非限定之例子包含：於第5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、29、30、37、38、39、40、41、42或43號位置(對應於SEQ ID NO:1之胺基酸編號)。於特定實施例中，醯基化係發生在胰高血糖素胜肽之第10或40號位置處，且胰高血糖素胜肽缺少一分子內架橋，例如，共價性分子內架橋(例如，內醯胺架橋)並包含一羧基端延伸。此等缺少分子內架橋並包含一羧基端延伸之經醯基化胜肽相較於對應之未經醯基化胜肽，於胰高血糖素樣肽-1、胃抑胜肽及胰高血糖素受體證實有增強之活性。因此，發生醯基化的位置可改變胰高血糖素類似物的總體活性分佈。
胰高血糖素胜肽可以於有親水性基團連結之相同或不同胺基酸位置醯基化。非限定之例子包含：係發生於第10或40號位置之醯基化及羧基端部分中一或多個位置之聚乙二醇化，例如第24、28、29或40號位置、於羧基端延伸內或在羧基端(例如：透過添加羧基端半胱胺酸)。
該醯基能直接共價性鍵結於胰高血糖素胜肽之一胺基酸，或間接透過間隔物(spacer)鍵結於胰高血糖素胜肽之胺基酸，其中該間隔物位於胰高血糖素胜肽之胺基酸及醯基間。
於本發明之一特定方面，胰高血糖素胜肽經修飾包含有一醯基，其係透過胰高血糖素胜肽胺基酸側鏈之胺基、羥基或硫醇基(thio1)而直接醯基化。於某些實施例中，胰高血糖素胜肽係透過胺基酸之側鏈胺基、羥基或硫醇基而直接醯基化。就此點而言，醯基化之胰高血糖素相關胜肽可包含：SEQIDNO：1之胺基酸序列，或其包含有如本文所述之一或多個胺基酸修飾之胺基酸序列。該胺基酸修飾具至少一個胺基酸位於第10、20、24、及29號位置對於任一包含胺基酸側鏈胺基、羥基、或硫醇基的胺基酸進行修飾。本發明某些特定實施例中，胰高血糖素胜肽之直接烷基化透過位於第10或40號位置胺基酸其側鏈之胺基、羥基、或硫醇基而發生。
於某些實施例中，該包含側鏈胺基之胺基酸係為如化學式I之胺基酸：
其中n=1至4[化學式I]
於某些例示實施例中，該化學式I之胺基酸，其中n為4(離胺酸)或n為3(鳥胺酸)。
於其他實施例中，該包含側鏈羥基之胺基酸係為如化學式II之胺基酸：
其中n=1至4[學式II]
於某些例示實施例中，該化學式II之胺基酸，其中n為1(絲胺酸)。
又一實施例中，該包含側鏈硫醇基之胺基酸係為如化學式III之胺基酸：
其中n=1至4[化學式III]
於某些例示實施例中，該化學式III之胺基酸，其中n為1(半胱胺酸)。
又另一實施例中，該包含側鏈胺基、羥基或硫醇基之胺基酸係為雙取代胺基酸，包含如同化學式I、化學式II或化學式III之結構，但排除化學式I、化學式II或化學式III中連接於胺基酸α碳之氫，其係以第二側鏈取代。
於本發明一實施例中，該醯基化之胰高血糖素胜肽包含一間隔物，其係位於該胜肽及醯基間。於某些實施例中，該胰高血糖素胜肽係共價性鍵結至該共價性鍵結至醯基之間隔物。
於某些實施例中，該間隔物為一包含有側鏈胺基、羥基、或硫醇基之胺基酸，或雙肽或三肽，該雙肽或三肽係包含有一含側鏈胺基、羥基、或硫醇基之胺基酸。該有間隔物連接之胺基酸係為任一包含能連接至間隔物基團之胺基酸(例如，經單一或雙重α-取代胺基酸)。舉例來說，包含一側鏈為NH2、-OH、或-COOH(例如：離胺酸、鳥胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸)之胺基酸為適當的。就此點而言，醯基化之胰高血糖素相關胜肽可包含：SEQIDNO：1之胺基酸序列，或一包含如本文所述之一或多個胺基酸修飾之經修飾胺基酸序列，該胺基酸修飾具至少一個對位於第10、20、24、29及40號位置修飾的任何包含一側鏈胺基、羥基、或羧基之胺基酸。
於某些實施例中，該間隔物為包含有側鏈胺基、羥基、或硫醇基之一胺基酸，或包含有一胺基酸之雙肽或三肽，而該胺基酸係包含側鏈胺基、羥基、或硫醇基。
當醯基化透過間隔物胺基酸之胺基而發生，則醯基化能發生於胺基酸之α胺基或側鏈胺基。此例子中，α胺基被醯基化，於該位置之間隔物胺基酸可為任何胺基酸。舉例來說，該間隔物胺基酸可為疏水性胺基酸，如：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、六-胺基己酸(6-amino hexanoic acid)、五-胺基戊酸(5-aminova1eric acid) 、七-胺基胺酸(7-aminoheptanoicacid)及八-胺基辛酸(8-aminooctanoicacid)。或者，間隔物胺基酸可以為酸性殘基，例如：天冬胺酸及麩胺酸。
該例子中，間隔物胺基酸之側鏈胺基被醯基化，於該位置之間隔物胺基酸可為包含側鏈胺基之胺基酸，例如：化學式I(如：離胺酸或鳥胺酸)之胺基酸。於此例子中，可能α胺基及側鏈胺基均被醯基化，如此以致該胰高血糖素胜肽被雙醯基化。本發明之實施例包含此等雙醯基化分子。
當醯基化透過一間隔物之羥基而發生，該胺基酸、或雙肽或三肽內胺基酸之一可以為如化學式II之胺基酸。於一特定例示之實施例中，該胺基酸為絲胺酸。
當醯基化透過一間隔物之硫醇基而發生，該胺基酸、或雙肽或三肽內胺基酸之一可以為如化學式III之胺基酸。於一特定例示之實施例中，該胺基酸為半胱胺酸。
於某些實施例中，該間隔物包含一親水性雙功能間隔物。於特定實施例中，該親水性雙功能間隔物包含二個或多個反應官能基，例如：胺基、羥基、硫醇基、及羧基或前述之任一組合。於某些實施例中，該親水性雙功能間隔物包含一羥基及一羧基。於其他實施例中，該親水性雙功能間隔物包含一胺基及一羧基。於其他實施例中，該親水性雙功能間隔物包含一硫醇基及一羧基。於一特定實施例中，該間隔物包含胺基多烷氧羧酸(amino po1y(a1ky1oxy)carboxy1ate)。就此點而言，該間隔物可包括例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m係為在1-6之間的任意整數，且n係為在2-12之間的任意整數，例如8-胺基-3，6-二氧辛酸(8-amino-3，6-dioxaoctanoic acid)，可由PeptidesInternationa1，Inc.(Louisvi11e，K Y)購得。
於某些實施例中，該間隔物為一疏水性雙功能間隔物。疏水性雙功能間隔物已為人所熟知。請參閱，例如Bioconjugate Techniques，G.T.Hermanson(Academic Press，San Diego，CA，1996)，其揭示內容全體皆弓用作為本說明書之參考資料。於特定實施例中，該疏水性雙功能間隔物包含二個或多個反應官能基，例如：胺基、羥基、硫醇基、及羧基或前述之任一組合。於特定實施例中，該疏水性雙功能間隔物包含一羥基及一羧基。於其他實施例中，該疏水性雙功能間隔物包含一胺基及一羧基。於其他實施例中，該疏水性雙功能間隔物包含一硫醇基及一羧基。包含一羧基及一羥基或一硫醇基的合適疏水性雙功能間隔物，已為人所熟知而包括例如：8-羥基辛酸(8-hydroxyoctanoic acid)及8-硫醇辛酸(8-m ercaptooctanoicacid)o
於某些實施例中，該功能間隔物並非包含有介於羧基1至7個碳原子無分支甲烯之雙羧酸(dicarboxy1ic acid)。於某些實施例中，該功能間隔物為包含有介於羧基1至7個碳原子無分支甲烯之雙羧酸(dicarboxy1ic acid)。
於特定實施例中，該間隔物(胺基酸、雙肽、三肽、親水性雙功能間隔物、或疏水性雙功能間隔物)有3至10個原子長度(如：6至10個原子，(如：6、7、8、9，或10個原子)。於更具體實施例中，該間隔物約有3至10個原子長度(如：6至10個原子)，且其醯基係為C12至C18脂肪醯基，例如：C14、C16脂肪醯基，此等間隔物及其醯基之總長度係14至28個原子，例如：約14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27，或28個原子。某些實施例中，該間隔物及其醯基之總長度係17至28個原子(例如：19至26、19至21)。
依據特定前述實施例，該雙功能間隔物係可為合成或自然生成之胺基酸(包含但不限於如本文所述者)，包含有3至10個原子長度之胺基酸主鏈。(例如：六-胺基己酸(6-amino hexanoic acid)、五-胺基戊酸(5-aminova1ericacid)、七-胺基胺酸(7-aminoheptanoicacid)、八-胺基辛酸(8-aminooctanoicacid))。或者，該間隔物係可為具有3至10個(如：6至10個原子)原子長度之胜肽主鏈的雙肽或三肽間隔物。雙肽或三肽間隔物之每一胺基酸，係可為與雙肽或三肽相同或不同之胺基酸，且係可選自於包含下列所組成之群組：自然生成及/或非自然生成之胺基酸，包含：如任何自然生成胺基酸之D或L異構物(丙胺酸(A1a)、半胱胺酸(Cys)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(G1u)、苯丙胺酸(Phe)、甘胺酸(G1y)、組胺酸(His)、異白胺酸(I1e)、離胺酸(Lys)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(M et)、天冬醯胺酸(Asn)、脯胺酸(Pro)、精胺酸(Arg)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、纈胺酸(Va1)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr))，或任何非自然生成胺基酸之D或L異構物選自於包含下列所組成之群組：β-丙胺酸(β-A1a)、N-α甲基丙胺酸(M e-A1a)、丁胺酸(aminobutyricacid，Abu)、γ-丁胺酸(γ-Abu)、aminohexanoic acid(ε-Ahx)、胺基異丁酸(aminoisobutyric acid， Aib)、胺甲基比咯羧酸(aminomethy1pyrro1e carboxy1ic acid)、胺基哌定羧酸(a minopiperidinecarboxy1icacid)、胺基絲胺酸(a minoserine，Ams)、 胺基四氫哌喃-4-羧酸(aminotetrahydropyran-4-carboxy1ic acid)、精胺酸N-甲氧基-N-甲基醯胺(arginine N-methoxy-N-methy1amide)、β-天冬胺酸(β-Asp)、三亞甲亞胺羧酸(azetidine carboxy1icacid) 、3-(2-苯并塞基)丙胺酸(3-(2-benzothiazo1y1)a1anine) 、α-第三丁基甘胺酸(α-tert-buty1g1ycine) 、2-胺基-5-脲基正戊酸(2-a mino-5-ureido-n-va1eric acid，又稱瓜胺酸(citru11ine，Cit))、β-環己基丙胺酸(β-Cyc1ohexy1a1anine，Cha)、乙醯胺甲基-半胱胺酸(acetamido methy1-cysteine)、乙醯二胺基丁酸(diaminobutanoic acid， Dab)、二胺基丙酸(diaminopropionic acid， Dpr) 、 二羥苯丙胺酸(dihydroxypheny1a1anine，D OPA))、α，α-雙甲基咪乙酸(dimethy1thiazo1idine，D M T A))、γ-麩胺酸(γ-麩胺酸)、同絲胺酸(hom oserine，Hse)、羥基脯胺酸(hydroxypro1ine，H yp)、異白胺酸N-甲氧基-N-甲基醯胺(iso1eucineN-methoxy-N-methy1 amide) 、 甲基異白胺酸(m ethy1-iso1eucine，M eI1e)、異哌定酸(isonipecotic acid，Isn)、甲基白胺酸(methy1-1eucine，M eLeu)、甲基離胺酸、二甲基離胺酸、三甲基離胺酸、甲醇基脯胺酸、甲硫胺酸-亞碸(m ethionine-su1foxide，M et(O))、甲硫胺酸-碸(methionine-su1fone，M et(O2))、正白胺酸(N1e)、甲基正白胺酸(Me-N1e)、正纈胺酸(Nva)、鳥胺酸(Orn)、對胺苯甲酸(para-aminobenzoic acid，PA B A)、青黴胺(penici11amine，Pen)、甲基苯丙胺酸(MePhe)、4-氯苯丙胺酸(4-Ch1oropheny1a1anine，Phe(4-C1))、4-氟苯丙胺酸(4-fluoropheny1a1anine，Phe(4-F))、4-硝基苯丙胺酸(4-nitropheny1a1anine，Phe(4-N O2))、4-氰基苯丙胺酸(4-cyanopheny1a1anine，Phe(4-C N))、苯甘胺酸(pheny1g1ycine，Phg)、六氫哌定丙胺酸(piperidiny1a1anine)、六氫哌定甘胺酸 (piperidiny1g1ycine) 、3，4-脫氫脯胺酸( 3，4-dehydropro1ine) 、 比咯定基丙胺酸(pyrro1idiny1a1anine) 、肌胺酸(Sar)、硒半胱胺酸(se1enocysteine， Sec) 、 O- 苯 基 磷 絲 胺 酸(O-Benzy1-phosphoserine)、 4-胺基-3羥基O-6甲基庚酸(4-amino-3-hydroxy-6-methy1heptanoic acid，Sta)、4-胺基-5環 己 基 -3- 羥 基 戊 酸(4-aminO-5-cyc1ohexy1-3-hydroxypentanoicacid，A C HPA)、4-胺基-3羥基-5-苯基戊酸(4-aminO-3-hydroxy-5-pheny1pentanoic acid， A HPPA)、1，2，3，4，-四 氫-異喹啉-3-羧酸(1，2，3，4，-tetrahydro-isoquino1ine-3-carboxy1ic acid，Tic)、四氫哌喃甘胺酸(tetrahydropyrang1ycine)、噻吩基丙胺酸(thieny1a1anine， Thi) 、 O- 苯 基 磷 酪 胺 酸( O-benzy1-phosphotyrosine) 、 O-磷酪胺酸(O-Phosphotyrosine)、甲氧基酪胺酸、乙氧基酪胺酸、O-(bis-雙甲基胺基-膦醯基)-酪胺酸(O-(bis-dimethy1amino-phosphono)-tyrosine)、酪胺酸硫酸鹽第三丁基胺(tyrosinesu1fatetetrabuty1a mine)、甲基胺酸(methy1-va1ine，M eVa1)、以及烷基化之3-硫氫丙酸(a1ky1ated3-m ercaptopropionic acid)o
於某些實施例中，該間隔物包含全部為帶負電，例如：包含一或兩個帶負電胺基酸。於某些實施例中，該雙肽並非任何一般性結構為A-B之雙肽，其中A選自於包含：甘胺酸、麩醯胺酸、丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸及脯胺酸所組成之群，其中B選自於包含：離胺酸、組胺酸及色胺酸所組成之群。於某些實施例中，該雙肽間隔物係選自於包含：丙胺酸-丙胺酸、β-丙胺酸-β-丙胺酸、白胺酸-白胺酸、脯胺酸-脯胺酸、γ胺基丁酸-γ胺基丁酸及γ-麩胺酸-γ-麩胺酸所組成之群。
於某些例示實施例中，胰高血糖素胜肽被修飾包含有透過間隔物之胺基、羥基、或硫醇基醯基化之醯基，其中該間隔物係連接於第10、20、24、29或40號位置之胺基酸側鏈或胰高血糖素胜肽之羧基端胺基酸。
於又更具體之實施例中，該醯基係連接至胰高血糖素胜肽之第10或40號位置之胺基酸，且間隔物及醯基之長度係14至28個原子。於某些方面，第10或40號位置之胺基酸係化學式I之胺基酸，例如，離胺酸，或與化學式I相關之雙取代胺基酸。於更具體實施例中，胰高血糖素胜肽缺少分子內架橋，例如，共價性分子內架橋。胰高血糖素胜肽，例如，可為包含一或多個α，α-雙取代胺基酸(例如，胺基異丁酸)之胜肽，以使胜肽之α螺旋穩定。因此，該醯基化之胰高血糖素胜肽可包含SEQIDNO：555-561及610-612中任一者之胺基酸序列、表20及28或SEQIDNOs：657-669之含胺基異丁酸胜肽。
適於透過胺類、羥基或硫醇基而醯基化胜肽之方法係為該領域具有通常知識者所熟知，可參閱例如：例如，Mi11er，Biochem Biophys ResCommun218：377-382(1996)，實施例19(關於透過胺類醯基化之方法)；Shimohigashi及 Stam mer，1ntJ Pept Protein Res 19：54-62(1982)；及PrevierO等人，Biochim Biophys Acta263：7-13(1972)(關於透過羥基醯基化之方法)；及San 及 Si1vius，JPeptRes66：169-180(2005)(關於透過硫醇醯基化之方法)；Bioconjugate Chem.「蛋白質之化學修飾：歷史及應用(Chemica1 M odificationsofProteins：History and App1ications)」，1、2-12頁(1990)；HashimotO等人，Pharmacuetica1Res.「胰島素之棕櫚醯基衍生物之合成及其生物活性(SynthesisofPa1mitoy1 DerivativesofInsu1in and their Bio1ogica1 Activity)」第6冊，No：2，171-176頁(1989)。
該醯基化胰高血糖素相關胜肽之醯基係可為係可為任何大小，如任何碳鏈長度，且可為直鏈或分支。於本發明某些實施例中，該醯基係為C4至C30脂肪酸。舉例來說，該醯基係可為C4、C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28或C30脂肪酸。於某些實施例中，該醯基係為C8至C20脂肪酸，例如：C14或C16脂肪酸。
於另一實施例中，該醯基係為膽汁酸。該膽汁酸係可為任何適合之膽汁酸，包括但不限於：膽酸(cho1ic acid)、鵝去氧膽酸(chenodeoxycho1icacid)、去氧膽酸(deoxycho1icacid)、石膽酸(1ithocho1ic acid)、牛膽酸(taurocho1ic acid)、甘膽酸(g1ycocho1ic acid)、膽固醇酸(cho1estero1acid)o
於某些實施例中，該胰高血糖素胜肽透過胰高血糖素胜肽長鏈烷類醯基化而包含有一醯基。於特定方面，該長鏈烷類包含胺基、羥基、硫醇基(例如：十八烷基胺(Octadecy1amine)、十四醇(tetradecano1)、十六烷硫醇(hexadecanethio1))，其係與胰高血糖素胜肽之羧基，或其活化形式反應。該羧基，或其活化形式係為胰高血糖素胜肽胺基酸(如：麩胺酸、天冬胺酸)側鏈之一部分或胜肽主鏈之一部分。
於某些實施例中，該胰高血糖素胜肽透過胰高血糖素胜肽長鏈烷類醯基化而包含有一醯基。於特定方面，該長鏈烷類包含胺基、羥基、硫醇基(例如：十八烷基胺(Octadecy1amine)、十四醇(tetradecano1)、十六烷硫醇(hexadecanethio1))，其係與胰高血糖素胜肽之羧基，或其活化形式反應。於特定實施例中，該包含有離去基之間隔物係可為任何如本文所述之間隔物，例如：胺基酸、雙肽、三肽、親水性雙功能間隔物、或疏水性雙功能間隔物)，其係進一步包含一適合之離去基。
如本文所使用之術語：「羧基之活化形式(activated formofa carboxy1group)」，係指具有一般性化學式R(C=O)X之羧基，其中X為離去基，且R為胰高血糖素胜肽或間隔物。舉例來說，羧基之活化形式係可包含但不限於：醯基氯化物(acy1ch1orides)、酸酐及酯類。於某些實施例中，活化之羧基係可為具有N-羥基琥珀硫亞氨(N-hydroxysuccinimide，NHS)離去基之酯類。
關於本發明之這些方面，該胰高血糖素胜肽或間隔物之長鏈烷類係經醯基化，其中該長鏈烷類係可為任何大小，並包含任何碳鏈長度。該長鏈烷類係可為直鏈或分支。於特定實施例中，其中該長鏈烷類係為C4至C30之烷類。舉例來說：該長鏈烷類係為C4、C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、或C30烷類之任一種。於某些實施例中，該長鏈烷類包含C8至C20之烷類，如C14、C16或C18烷類。
同時，於某些實施例中，該胰高血糖素胜肽之胺類、羥基或硫醇基係與膽固醇酸(cho1estero1acid)醯基化。於特定實施例中，該胰高血糖素胜肽係透過一烷基化之脫胺基半胱胺酸間隔物(即烷基化之3-硫氫丙酸(a1ky1ated3-mercaptopropionic acid))連接至膽固醇酸。烷基化之脫胺基半胱胺酸間隔物可為，例如，包含十二乙二醇基團之半胱胺酸間隔物。
如本文所述之醯基化胰高血糖素胜肽可進一步修飾而包含一親水性基團。於某些特定實施例中，該親水性基團可包含聚乙二醇(PE G)鏈。親水性基團之結合(incorporation)可透過任何適當方式達到，諸如任何本文述及之方式。就此點而言，該醯基化胰高血糖素相關胜肽包含SEQIDNO：1，其中包含任何本文述及之修飾：至少一個位於第10、20、24、29及40號位置之包含醯基胺基酸、及至少一個位於第10、20、24、29及40號位置之胺基酸、位於羧基端延伸、羧基端胺基酸(其係以半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸或乙醯苯丙胺酸修飾)，以及胺基酸側鏈(其係共價性鍵結至親水性基團(例如：聚乙二醇))。於某些實施例中，該醯基係連接至第10或40號位置，其係可視情況透過一間隔物連接，該間隔物包含：半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸或乙醯苯丙胺酸，且該親水性基團係結合於第24號位置之半胱胺酸殘基。或者，醯基化胰高血糖素胜肽包含有間隔物，其中該間隔物均被醯基化並修飾而包含親水性基團。適當間隔物之非限定例子包含一種間隔物，係包括有一或多個胺基酸係選自於包含：半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸及乙醯苯丙胺酸所組成之群。
於本發明之一特定方面，醯基化之胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：534-544、546-549及657-669中任何之胺基酸序列。
烷基化
根據某些實施例，該胰高血糖素胜肽可經修飾而包含一烷基，如：例如，非自然生成於胺基酸上之烷基(例如，對自然生成之胺基酸為非自然之烷基)。無任何特定理論規範下，據信胰高血糖素胜肽之烷基化將達成相似，即不相同之如：胰高血糖素胜肽之醯基化的效果，例如：於循環時延長半生期、延遲起效作用、延長作用期間、或增進對蛋白酶如：第四型雙胜肽蛋白水解酶之抗性、增加於胰高血糖素樣肽-1及胰高血糖素受體之效能。
烷基化可以於胰高血糖素相關胜肽中任何位置實現，該位置包含第1至29號位置中任一個、位於羧基端延伸內之一位置或羧基端胺基酸，其限制條件為胰高血糖素活性係經保留。非限定之例子包含：發生於第5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、29、30、37、38、39、40、41、42或43號位置(依據SEQIDNO：1之胺基酸編號)。該烷基能直接共價性鍵結於胰高血糖素胜肽之胺基酸，或間接透過間隔物鍵結於胰高血糖素胜肽之胺基酸，其中該間隔物位於胰高血糖素胜肽之胺基酸及烷基間。胰高血糖素胜肽可以於有親水性基團連結之相同或不同胺基酸位置烷基化。非限定之例子包含：烷基化，係發生於第40號位置且聚乙二醇化係發生於胰高血糖素胜肽之羧基端部分中一或多個位置，例如第24、28、29或40號位置、於羧基端延伸內或在羧基端(例如：透過添加羧基端半胱胺酸)。
於本發明之特定方面，胰高血糖素胜肽經修飾包含有烷基，其係透過胰高血糖素胜肽胺基酸側鏈之胺基、羥基、硫醇基(thio1)而直接烷基化。於某些實施例中，烷基化係位於第24、28、29或40號位置。就此點而言，烷基化之胰高血糖素相關胜肽可包含：SEQIDNO：1之胺基酸序列，或其包含如本文所述之一或多個胺基酸修飾之胺基酸序列，該胺基酸修飾具至少一個位於第24、28、29或40號位置的對於任一包含胺基酸側鏈胺基、羥基、或硫醇基之修飾。本發明某些特定實施例中，胰高血糖素胜肽之直接烷基化透過位於第40號位置之胺基酸側鏈胺基、羥基、或硫醇基而發生。
於某些實施例中，該包含側鏈胺基之胺基酸係為如化學式1之胺基酸。於某些例示實施例中，該化學式I之胺基酸，其中n為4(離胺酸)或n為3(鳥胺酸)。
於其他實施例中，該包含側鏈羥基之胺基酸係為如化學式II之胺基酸。於某些例示實施例中，該化學式II之胺基酸，其中n為1(絲胺酸)。
又一實施例中，該包含側鏈硫醇基之胺基酸係為如化學式III之胺基酸。於某些例示實施例中，該化學式III之胺基酸，其中n為1(半胱胺酸)。
於又另一實施例中，該包含一側鏈胺基、羥基或硫醇基之胺基酸係為雙取代之胺基酸，包含如同化學式I、化學式II，或化學式III之結構，但排除化學式I、化學式II或化學式III中連接於胺基酸α碳之氫，其係以第二側鏈取代。
於本發明某些實施例中，該烷基化之胰高血糖素胜肽包含間隔物，其係位於胰高血糖素胜肽之胺基酸及烷基間。於某些實施例中，該胰高血糖素胜肽係共價性鍵結至間隔物，係共價性鍵結至烷基。於某些例示實施例中，胰高血糖素胜肽被修飾包含有烷基，其係藉間隔物之胺基、羥基，或硫醇烷基化而修飾，該間隔物係連接於胰高血糖素胜肽胺基酸側鏈之第10、20、24、29或40號位置。該有間隔物連接之胺基酸係為任一包含能連接至間隔物基團之胺基酸。舉例來說，包含有一側鏈為NH2、-OH，或-COOH(例如：離胺酸、鳥胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸)之胺基酸為適當的。就此點而言，烷基化之胰高血糖素相關胜肽可包含：SEQIDNO：1之胺基酸序列，或包含如本文所述之一或多個胺基酸修飾之經修飾胺基酸序列，其中胺基酸修飾具至少一個位於第10、20、24、29及40號位置對於任一包含胺基酸側鏈胺基、羥基、或羧基之修飾。
於某些實施例中，該間隔物為一包含有側鏈胺基、羥基、或硫醇基之胺基酸，其係、或包含有一胺基酸之雙肽或三肽，而該胺基酸係包含側鏈胺基、羥基、或硫醇基。
當烷基化透過間隔物胺基酸之胺基而發生時，則烷基化能發生於胺基酸之α胺基或側鏈胺基。該例子中，α胺基被烷基化，於該位置之間隔物胺基酸可為任一胺基酸。舉例來說，該間隔物胺基酸可為疏水性胺基酸，例如：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、六-胺基己酸(6-aminohexanoicacid)、五-股基戊酸(5-aminova1eric acid)、七-胺基胺酸(7-aminoheptanoicacid)及八-胺基辛酸(8-aminooctanoicacid)。或者，若烷基化發生於酸性殘基之α胺基，則該間隔物胺基酸可以為酸性殘基(例如：天冬胺酸及麩胺酸)。該例子中，間隔物胺基酸之側鏈胺基被烷基化，於該位置之間隔物胺基酸可為包含側鏈胺基之胺基酸，例如化學式I(如：離胺酸或鳥胺酸)之胺基酸。於此例子中，可能α胺基及側鏈胺基均被烷基化，如此以致該胰高血糖素胜肽被雙烷基化。本發明之實施例包含此等雙烷基化分子。
當烷基化透過間隔物胺基酸之羥基而發生，前述之胺基酸或雙肽或三肽之該胺基酸可以為如化學式II之胺基酸。於一特定例示之實施例中，該胺基酸為絲胺酸。
當烷基化透過間隔物胺基酸之硫醇基而發生，該胺基酸、或雙肽或三肽之該胺基酸可以為如化學式III之胺基酸。於一特定例示之實施例中，該胺基酸為半胱胺酸。
於某些實施例中，該間隔物包含一親水性雙功能間隔物。於特定實施例中，該親水性雙功能間隔物包含二個或多個反應官能基，例如：胺基、羥基、硫醇基、及羧基或前述之任一組合。於某些實施例中，該親水性雙功能間隔物包含一羥基及一羧基。於其他實施例中，該親水性雙功能間隔物包含一胺基及一羧基。於其他實施例中，該親水性雙功能間隔物包含一硫醇基及一羧基。於一特定實施例中，該間隔物包含胺基多烷氧羧酸(amino po1y(a1ky1oxy)carboxy1ate)o就此點而言，該間隔物可包括例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m係為在1-6之間的任意整數，且n係為在2-12之間的任意整數，例如8-胺基-3，6-二氧辛酸(8-a mino-3，6-dioxaoctanoic acid)，可由PeptidesInternationa1，Inc.(Louisvi11e，K Y)購得。
於某些實施例中，該間隔物包含一疏水性雙功能間隔物。於特定實施例中，該疏水性雙功能間隔物包含二個或多個反應官能基，例如：胺基、羥基、硫醇基、及羧基或前述之任一組合。於特定實施例中，該疏水性雙功能間隔物包含一羥基及一羧基。於其他實施例中，該疏水性雙功能間隔物包含一胺基及一羧基。於其他實施例中，該親水性雙功能間隔物包含一硫醇基及一羧基。包含一羧基及一羥基或一硫醇基的合適疏水性雙功能間隔物，已為人所熟知而包括例如：8-羥基辛酸(8-hydroxyoctanoic acid)及8-硫醇辛酸(8-mercaptooctanoicacid)o
於特定實施例中，該間隔物(胺基酸、雙肽、三肽、親水性雙功能間隔物、或疏水性雙功能間隔物)有3至10個原子長度(如：6至10個原子，(如：6、7、8、9，或10個原子)。於更具體實施例中，該間隔物約有3至10個原子長度(如：6至10個原子)，且其烷基係為C12至C18烷基，例如：C14、C16烷基，此等間隔物及其烷基之總長度係14至28個原子，例如：約14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個原子。於某些實施例中，該胰高血糖素相關胜肽為第一類、第二類或第三類胰高血糖素相關胜肽，該間隔物及其烷基之總長度係17至28個原子(例如：19至26、19至21)o
依據特定前述實施例，該雙功能間隔物係可為合成或自然生成之胺基酸，包含有3至10個原子長度之胺基酸主鏈。(例如：六-胺基己酸(6-amino hexanoic acid)、五-胺基戊酸 (5-aminova1eric acid) 、 七-胺基胺酸(7-aminoheptanoicacid)、八-胺基辛酸(8-aminooctanoicacid))。或者，該間隔物係可為具有3至10個(如：6至10個原子)原子長度之胜肽主鏈的雙肽或三肽間隔物。該雙肽或三肽間隔物，係可由自然生成及/或非自然生成之胺基酸組成，舉例來說，任何本文所教示之胺基酸。於某些實施例中，該間隔物包含全部為帶負電，例如：包含一或兩個帶負電胺基酸。於某些實施例中，該雙肽間隔物係選自於包含：丙胺酸-丙胺酸、β-丙胺酸-β-丙胺酸、白胺酸-白胺酸、脯胺酸-脯胺酸、γ胺基丁酸-γ胺基丁酸及γ-麩胺酸-γ-麩胺酸所組成之群。
適合透過胺類、羥基或硫醇基而烷基化胜肽之方法係為該領域具有通常知識者所熟知，例如：威廉森醚類合成法(Wi11iamson ether synthesis)，係可用於胰高血糖素胜肽及烷基之間形成醚類鍵結。同時，以烷基鹵化物進行胜肽之親核劑取代反應係可形成酯基、醚基、硫醯基、或胺基鍵結。
該烷基化胰高血糖素胜肽之烷基係可為係可為任何大小，如任何碳鏈長度，且可為直鏈或分支。於某些實施例中，該烷基係為C4至C30烷基。舉例來說，該烷基係可為C4、C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、或C30烷基。於某些實施例中，該烷基係為C8至C20烷基，例如：C14或C16烷基。
於某些特定實施例中，烷基可以包括膽汁酸之類固醇基團，例如：膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸、石膽酸、牛膽酸、甘膽酸、膽固醇酸。
於本發明某些實施例中，該胰高血糖素胜肽經修飾而包含一烷基，該烷基係藉由以親核劑、長鏈烷類與胰高血糖素胜肽反應而形成，其中胰高血糖素胜肽包含有適合親核劑取代反應之離去基。於特定方面，該長鏈烷類之親核劑基包含胺基、羥基、硫醇基(例如：十八烷基胺(Octadecy1amine)、十四醇(tetradecano1)、十六烷硫醇(hexadecanethio1))。該胰高血糖素胜肽之離去基係為胺基酸側鏈之一部分或胜肽主鏈之一部分。適合之離去基包含，例如：N-羥基琥珀硫亞氨(N H S)、鹵素及磺酸酯(su1fonateesters)。
於特定實施例中，該胰高血糖素胜肽經修飾而包含一烷基，該烷基係藉由以親核劑、長鏈烷類與間隔物反應而形成，其中該間隔物包含有離去基。於特定方面，該長鏈烷類係包含胺基、羥基、或硫醇基。於特定實施例中，該包含有離去基之間隔物係可為任何如本文所述之間隔物，例如：胺基酸、雙肽、三肽、親水性雙功能間隔物、或疏水性雙功能間隔物)，其係進一步包含一適合之離去基。
關於本發明之這些方面，該胰高血糖素胜肽或間隔物之長鏈烷類係經烷基化，其中該長鏈烷類係可為任何大小，並包含任何碳鏈長度。該長鏈烷類係可為直鏈或分支。於特定實施例中，其中該長鏈烷類係為C4至C30之烷類。舉例來說：該長鏈烷類係為C4、C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、或C30烷類之任一種。於某些實施例中，該長鏈烷類包含C8至C20之烷類，如C14、C16或C18烷類。
同時，於某些實施例中，烷基化發生於胰高血糖素胜肽及膽固醇基團間。舉例來說，膽固醇之羥基係可取代長鏈烷類上之離去基，以形成膽固醇-胰高血糖素胜肽產物。
如本文所述之烷基化胰高血糖素胜肽可進一步修飾而包含一親水性基團。於某些特定實施例中，該親水性基團可包含聚乙二醇(PE G)鏈。親水性基團之結合(incorporation)可透過任何適當方式達到，諸如任何本文述及之方式。就此點而言，該烷基化胰高血糖素相關胜肽包含SEQIDNO：1，或包含一或多個如本文所述之修飾的經修飾胺基酸序列，其中該修飾係：位於第10、20、24、29或40號位置處之至少一個包含有烷基之胺基酸，及至少一個位於第10、20、24、29或40號位置處之胺基酸、位於羧基端延伸、羧基端胺基酸(其係以半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸，或乙醯基苯丙胺酸修飾)以及胺基酸側鏈(其係共價性鍵結至親水性基團(例如：聚乙二醇))。於某些實施例中，該烷基係連接至第40號位置，其係可視情況透過間隔物連接，該間隔物包含：半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸，或乙醯基苯丙胺酸，且該親水性基團係結合於第24號位置之半胱胺酸殘基。或者，烷基化胰高血糖素胜肽包含有間隔物，其中該間隔物均被烷基化並修飾而包含親水性基團。適當間隔物之非限定之例子包含一間隔物，其係包括一或多個胺基酸選自於包含：半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸，及乙醯基苯丙胺酸所組成之群。
羧基端截斷
於某些實施例中，如本文所述之胰高血糖素胜肽係可以進一步地以截斷或刪除一或二個羧基端之胺基酸而修飾(如，第29及/或28號位置)，且不影響對於胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體之活性及/或效能。就此點而言，胰高血糖素胜肽係可包含：天然胰高血糖素(SEQIDNO：1)胜肽之1至27或1至28胺基酸，視情況具有如本文所述之一或多個修飾。
於某些實施例中，該截斷之胰高血糖素促效劑胜肽包含SEQIDNO：550或SEQIDNO：551。於另一實施例中，該截斷之胰高血糖素促效劑胜肽包含SEQID NO：552或SEQIDNO：553。
帶電羧基端殘基
該包含SEQIDNO：20之胰高血糖素胜肽之溶解度係可進一步修飾，舉例來說，將一、二或三個帶電胺基酸導入SEQIDNO：20之胜肽羧基端部分，較佳為該羧基端位置至第27號位置。此等帶電胺基酸係可導入，藉由將天然胺基酸取代為帶電胺基酸而達成，例如：位於第28或第29號位置處，或者添加一個帶電胺基酸，例如：第27、28或29號位置後。於例示實施例中，一、二、三或全部之帶電胺基酸均帶負電。或者，溶解度亦可經由將親水性基團(如：聚乙二醇)共價連接至胜肽而增強。
例示實施例
依據某些實施例，提供一種胰高血糖素類似物，其係包含SEQIDNO：55之序列，其中該類似物與SEQIDNO：55有1至3個胺基酸之差異，該胺基酸係選自於第1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28、及29號位置，其中該胰高血糖素胜肽於胰高血糖素樣肽-1受體顯現至少20%之天然胰高血糖素樣肽-1活性。
依據某些實施例，提供一種胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑，包含序列：N H2-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-A1a-Xaa-Asp-Phe-Va1-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ IDNO：33)其中第15號位置之Xaa係選自於包含：天冬胺酸、麩胺酸、氧化半胱胺酸(cysteic acid)、同麩胺酸及同胱胺酸(homocysteicacid)所組成之群，第16號位置之Xaa係選自於包含：絲胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、同麩胺酸及同胱胺酸(homocysteicacid)所組成之群，第20號位置之Xaa係：麩醯胺酸或離胺酸，第24號位置之Xaa係：麩醯胺酸或麩胺酸，第28號位置之Xaa係：天冬醯胺酸、離胺酸或酸性胺基酸，第29號位置之Xaa係：蘇胺酸、甘胺酸或酸性胺基酸，且R係為COOH或CONH2，附加條件是當第16號位置為絲胺酸，則第20號位置為離胺酸，或者，當第16號位置為絲胺酸，則第24號位置為麩胺酸，且第20號或28位置亦為離胺酸。於某些實施例中，該胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑包含SEQIDNO：33之序列，其中第28號位置之胺基酸為天冬胺酸，且第29號位置之胺基酸為麩胺酸。於另一實施例中，第28號位置之胺基酸為天然天冬醯胺酸，且第29號位置之胺基酸為甘胺酸，且SEQIDNO：29或SEQIDNO：65之胺基酸序列，係共價性連接至SEQIDNO：33之羧基端。
於一實施例中，提供一種包含SEQIDNO：33序列之共同促效劑，其中係添加一額外的酸性胺基酸至該胜肽之羧基端。於另外實施例中，胰高血糖素類似物之羧基端胺基酸具有醯胺基以取代天然胺基酸之羧酸基。於一實施例中，該胰高血糖素類似物包含一序列，其係選自於包含SEQIDNO：40、SEQIDNO：41、SEQIDNO：42、SEQIDNO：43及SEQIDNO：44所組成之群。
依據一實施例，提供一種SEQIDNO：33之胰高血糖素類似物，其中該類似物與SEQIDNO：33有1至3個胺基酸之差異，該胺基酸係選自於第1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21及27號位置，其中當第16號位置為絲胺酸，則第20號位置為離胺酸，且內醯胺架橋形成於胺基酸第24號位置及第20或28號位置之胺基酸間。依據一實施例，該類似物與SEQIDNO：33有1至3個胺基酸之差異，該胺基酸係選自於第1、2、3、21及27號位置。於一實施例中，該SEQIDNO：33之胰高血糖素類似物有1至2個胺基酸之差異，或於一實施例中，有單一胺基酸之差異，該胺基酸係選自於第1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21及27號位置，附加條件為當第16號位置為絲胺酸，則第20號位置為離胺酸，且內醯胺架橋形成於序列編號第24號位置及第20或28號位置之胺基酸間。
依據另一實施例，提供一種相對選擇之胰高血糖素樣肽-1受體促效劑係包括序列：N H2-His-Ser-Xaa-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-A1a-Xaa-Asp-Phe-Va1-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：53)，其中第3號位置之Xaa係選自於包含：麩胺酸、鳥胺酸及正白胺酸所組成之群，第15號位置之Xaa係選自於包含：天冬胺酸、麩胺酸、氧化半胱胺酸(cysteic acid)、同麩胺酸及同胱胺酸(homocysteic acid)所組成之群，第16號位置之Xaa係選自於包含：絲胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、同麩胺酸及同胱胺酸(homocysteic acid)所組成之群，第20號位置之Xaa係：麩醯胺酸或離胺酸，第24號位置之Xaa係：麩醯胺酸或麩胺酸，第28號位置之Xaa係：天冬醯胺酸、離胺酸或酸性胺基酸，第29號位置之Xaa係：蘇胺酸、甘胺酸或酸性胺基酸，且R係為COOH或CONH2，SEQIDNO：26或SEQIDNO：29，附加條件為當第16號位置為絲胺酸，則第20號位置為離胺酸，或者當第16號位置為絲胺酸，則第24號位置為麩胺酸，且第20號或28位置亦為離胺酸。於一實施例中，第3號位置之胺基酸為麩胺酸。於一實施例中，該第28及/或29號位置之酸性胺基酸係取代為天冬胺酸或麩胺酸。於一實施例中，該胰高血糖素胜肽包含有一共同促效劑胜肽，其係包含SEQIDNO：33之序列，進一步包含一添加至胜肽羧基端之額外的酸性胺基酸。於另外實施例中，胰高血糖素類似物之羧基端胺基酸具有一醯胺基以取代天然胺基酸之羧酸基。
依據一實施例，提供一種胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1受體共同促效劑，其包含有經修飾之胰高血糖素胜肽，係包含下列序列：N H2-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-A1a-Xaa-Asp-Phe-Va1-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ IDNO：34)，其中第15號位置之Xaa係選自於包含：天冬胺酸、麩胺酸、氧化半胱胺酸(cysteic acid)、同麩胺酸及同胱胺酸(homocysteicacid)所組成之群，第16號位置之Xaa係選自於包含：絲胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、同麩胺酸及同胱胺酸(homocysteicacid)所組成之群，第20號位置之Xaa係：麩醯胺酸或離胺酸，第24號位置之Xaa係：麩醯胺酸或麩胺酸，第28號位置之Xaa係：天冬醯胺酸、天冬胺酸或離胺酸，R係為COOH或CONH2，第29號位置之Xaa係：蘇胺酸或甘胺酸，且R係為COOH、CONH2、SEQIDNO：26或SEQIDNO：29，附加條件為當第16號位置為絲胺酸，則第20號位置為離胺酸，或者當第16號位置為絲胺酸，則第24號位置為麩胺酸，且第20號或28位置亦為離胺酸。於一實施例中，其中R為CONH2，第15號位置之Xaa係為天冬胺酸，第16號位置之Xaa係選自於包含：麩胺酸、麩醯胺酸、同麩胺酸及同胱胺酸(homocysteicacid)所組成之群，第20及24號位置之Xaa每一均為麩醯胺酸，第28號位置之Xaa係：天冬醯胺酸或天冬胺酸且第29號位置之Xaa係為蘇胺酸。於一實施例中，第15及16號位置之Xaa每一均為麩胺酸，第20及24號位置之Xaa每一均為麩醯胺酸，第28號位置之Xaa係：天冬醯胺酸或天冬胺酸，第29號位置之Xaa係為蘇胺酸，且R係為CONH2。
據報導當保留至少原胜肽某些活性時，天然胰高血糖素胜肽之某些部分係可被修飾。因此，發明人預期一或多個位於SEQID NO：11胜肽之第2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29號位置胺基酸取代為不同於天然胰高血糖素胜肽之胺基酸，且仍於胰高血糖素受體保留活性。於一實施例中，天然胜肽第27號位置之甲硫胺酸取代為白胺酸或正白胺酸以防止胜肽之氧化性降解。於另一實施例中，於第20號位置之胺基酸取代為離胺酸、精胺酸、鳥胺酸或瓜胺酸及/或第21號位置之胺基酸取代為麩胺酸、同麩胺酸、或同胱胺酸(ho mocysteicacid)。
於一實施例中，提供一種SEQIDNO：20之胰高血糖素胜肽類似物，其中與SEQIDNO：1之胺基酸有1至6個胺基酸之差異，該胺基酸係選自於第1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、27、28或29號之類似物位置，附加條件為當第16號位置之胺基酸為絲胺酸，則第20號位置為離胺酸，或者當第16號位置為絲胺酸，則第24號位置為麩胺酸，且第20或28號位置亦為離胺酸。依據另一實施例，提供一種SEQIDNO：20之胰高血糖素胜肽類似物，其中1至6個胺基酸，選自於類似物第1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20、21、27、28或29號位置，其係不同於SEQIDNO：1之胺基酸。於另一實施例中，提供一種SEQIDNO：8、SEQIDNO：9或SEQIDNO：11之胰高血糖素胜肽類似物，其中1至2個胺基酸，選自於類似物第1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20或21號位置，其係不同於SEQIDNO：1之胺基酸，並於另外實施例中，該1至2個不同胺基酸代表相對於存在天然胰高血糖素序列(SEQIDNO：1)胺基酸中之保留性胺基酸取代。於一實施例中，提供一種SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14或SEQIDNO：15之胰高血糖素胜肽，其中胰高血糖素胜肽進一步包含：一、二或三個胺基酸取代，選自第2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20、21、27或29號位置。於一實施例中，第2、5、7、10、11、13、14、16、17、18、19、20、21、27或29號位置之取代係為保留性胺基酸取代。
依據一實施例，該胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-受體1共同促效劑包含SEQID NO：33之序列變異物，其中1至10個胺基酸，選自於該序列變異物第16、17、18、20、21、23、24、27、28以及29號位置，其係不同於SEQIDNO：1之胺基酸。依據一實施例，提供一種SEQIDNO：33之序列變異物，其中係藉由一或多個胺基酸取代而產生該序列變異物，該胺基酸取代係選自於包含：第17號位置麩醯胺酸(G1n17)、第18號位置丙胺酸(A1a18)、第21號位置麩胺酸(G1u21)、第23號位置異白胺酸(I1e23)、第24號位置丙胺酸(A1a24)、第27號位置纈胺酸(Va127)及第29號位置甘胺酸(G1y29)所組成之群組。依據一實施例，該胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-受體1共同促效劑包含SEQIDNO：33之序列變異物，其中1至2個胺基酸，選自於該序列變異物第17至26號位置，其係不同於SEQIDNO：1之胺基酸。依據一實施例，提供一種SEQIDNO：33之序列變異物，其中係藉由一個胺基酸取代而產生該序列變異物，該胺基酸取代係選自於包含：第17號位置麩醯胺酸(G1n17)、第18號位置丙胺酸(A1a18)、第21號位置麩胺酸(G1u21)、第23號位置異白胺酸(I1e23)及第24號位置丙胺酸(A1a24)所組成之群組。依據一實施例，提供一種SEQIDNO：33之序列變異物，其中係藉由於第18號位置之胺基酸取代而產生該序列變異物，該取代之胺基酸選自於包含：丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸所組成之群組。依據一實施例，提供一種SEQIDNO：33之序列變異物，其中係藉由於第18號位置丙胺酸之胺基酸取代而產生該序列變異物。此等序列變異物包含SEQIDNO：55。於另一實施例中，提供一種胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-受體1共同促效劑，包含SEQIDNO：33之序列變異物，其中1至2個胺基酸，選自於變異第17至22號位置，其係不同於SEQIDNO：1之胺基酸，於另外實施例中，該胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-受體1共同促效劑包含SEQIDNO：33之序列變異物，藉由於第20及21號位置之一或二個胺基酸取代而產生該序列變異物。依據某些實施例，提供一種胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑，包含序列：N H2-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-A1a-Xaa-Xaa-Phe-Va1-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：51)，其中第15號位置之Xaa係選自於包含：天冬胺酸、麩胺酸、氧化半胱胺酸(cysteic acid)、同麩胺酸及同胱胺酸(homocysteicacid)所組成之群，第16號位置之Xaa係絲胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、同麩胺酸或同胱胺酸(homocysteicacid)，第20號位置之Xaa係麩醯胺酸、離胺酸、精胺酸、鳥胺酸或瓜胺酸，第21號位置之Xaa係天冬胺酸、麩胺酸、同麩胺酸或同胱胺酸(homocysteic acid)，第24號位置之Xaa係麩醯胺酸或麩胺酸，第28號位置之Xaa係天冬醯胺酸、離胺酸或酸性胺基酸，第29號位置之Xaa係蘇胺酸或酸性胺基酸，且R係為COOH或CONH2。
於某些實施例中，R係為CONH2。依據一實施例，該胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-受體1共同促效劑包含SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：47、SEQIDNO：48或SEQIDNO：49之變異序列，其中係藉由於第20號位置之胺基酸取代而產生該序列變異物。於一實施例中，該於第20號位置之胺基酸取代係選自於包含：離胺酸、精胺酸、鳥胺酸及瓜胺酸所組成之群組。
於某些實施例中，提供一種胰高血糖素促效劑，其係包含SEQIDNO：34之類似物胜肽，其中該類似物藉由具有與第2號位置絲胺酸不同之其他胺基酸而不同於SEQIDNO：34。於一實施例中，該絲胺酸殘基取代為胺基異丁酸、D-丙胺酸，且於一實施例中，該絲胺酸殘基取代為胺基異丁酸。此等修飾係抑制第四型雙胜肽蛋白水解酶之切割，而仍保留原化合物固有之效能(例如，至少原化合物75、80、85、90、95%或更高之效能)。於一實施例中，類似物之溶解度增加，舉例來說，藉由將一、二、三或多個帶電胺基酸導入天然胰高血糖素之羧基端部分內而達成，較佳地，係羧基端至第27號位置。於例示實施例中，一、二、三或全部之帶電胺基酸均帶負電。於另一實施例中，該類似物進一步包含一酸性胺基酸，其係於第28或29號位置之天然胺基酸取代為酸性胺基酸或添加一酸性胺基酸至SEQIDNO：34胜肽之羧基端。
於一實施例中，如本文所述之胰高血糖素類似物係於第1或2號位置進一步修飾，其係可減少被第四型雙胜肽蛋白水解酶切割之敏感性。於一實施例中，提供一種SEQIDNO：9、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14或SEQIDNO：15之胰高血糖素類似物，其中該類似物與母分子不同，係其將第2號位置取代並顯現對於被第四型雙胜肽蛋白水解酶切割減少之敏感性(即：抗性)。更具體地說，於一實施例中，類似物胜肽第2號位置取代為胺基酸，其係選自於包含D-絲胺酸、D-丙胺酸、纈胺酸、胺基-N-丁酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸及胺基異丁酸(AIB)所組成之群。於一實施例中，該類似物胜肽第2號位置取代為胺基酸，其係選自於包含D-絲胺酸、D-丙胺酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸及胺基異丁酸(AIB)所組成之群。於另一實施例中，該類似物胜肽第2號位置取代為胺基酸，其係選自於包含D-絲胺酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸及胺基異丁酸(AIB)所組成之群。於一實施例中，該胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：21或SEQIDNO：22之序列。
於一實施例中，提供一種SEQIDNO：9、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14或SEQIDNO：15之胰高血糖素類似物，其中該類似物與母分子不同，係其將第1號位置取代並顯現對於被第四型雙胜肽蛋白水解酶切減少之敏感性(即：抗性)。更具體地說，類似物胜肽第1號位置取代為胺基酸，其係選自於包含：D-組胺酸、α，α-雙甲基咪乙酸(DMIA)、N-甲基組胺酸、α-甲基組胺酸、咪乙酸(imidazO1eaceticacid)、脫胺基組胺酸、羥基組胺酸、乙醯基組胺酸、及同組胺酸所組成之群。於另一實施例中，提供一種胰高血糖素促效劑，其係包含SEQIDNO：34之類似物胜肽，其中該類似物SEQIDNO：34不同，於第1號位置具有一胺基酸但非組胺酸。於一實施例中，類似物之溶解度增加，舉例來說，藉由將一、二、三或多個帶電胺基酸導入天然胰高血糖素之羧基端部分內而達成，較佳地，係羧基端至第27號位置。於例示實施例中，一、二、三或全部之帶電胺基酸均帶負電。於另一實施例中，該類似物進一步包含一酸性胺基酸，其係於第28或29號位置之天然胺基酸取代為酸性胺基酸或添加一酸性胺基酸至SEQIDNO：34胜肽之羧基端。於一實施例中，該酸性胺基酸係天冬胺酸或麩胺酸。
於一實施例中，該胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑包含SEQIDNO：20之序列，進一步包含一額外的胺基酸之羧基端延伸或一胜肽，該胜肽係選自於包含：SEQIDNO：26、SEQIDNO：27及SEQIDNO：28所組成之群。於該實施例中，單一胺基酸添加至SEQIDNO：20之羧基端，該胺基酸通常係選自20種一般胺基酸之一，並且於一實施例中，該額外的羧基端之胺基酸具有醯胺基，其係取代天然胺基酸之羧酸。於一實施例中，額外的胺基酸係選自包含麩胺酸、天冬胺酸及甘胺酸所組成之群。
於另一實施例中，提供一種胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑，其中包含至少一內醯胺環，其係形成於麩胺酸殘基及離胺酸殘基之側鏈，其中麩胺酸殘基及離胺酸殘基係間隔三個胺基酸。於一實施例中，含有內醯胺的胰高血糖素胜肽之羧基端胺基酸具有醯胺基以取代天然胺基酸之羧酸。更具體地說，於一實施例中，提供一種胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑，其包含有經修飾之胰高血糖素胜肽，係選自於包含下列序列所組成之群：
N H2-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-G1u-Arg-Arg-A1a-G1n-Asp-Phe-Va1-G1n-Trp-Leu- Met-Xaa-Xaa-R (SEQIDNO：66)
N H2-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-G1u-Arg-Arg-A1a-Lys-Asp-Phe-Va1-G1n-Trp-Leu- Met-Xaa-Xaa-R (SEQIDNO：67)
N H2-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-A1a-Lys-Asp-Phe-Va1-G1u-Trp-Leu- M et-Xaa-Xaa-R(SEQIDNO：68)
N H2-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-A1a-G1n-Asp-Phe-Va1-G1u-Trp-Leu- M et-Lys-Xaa-R(SEQIDNO：69)
N H2-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-G1u-Arg-Arg-A1a-Lys-Asp-Phe-Va1-G1u-Trp-Leu- M et-Asn-Thr-R(SEQIDNO：16)
N H2-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-G1u-Arg-Arg-A1a-G1n-Asp-Phe-Va1-G1u-Trp-Leu- M et-Lys-Thr-R(SEQIDNO：17)
N H2-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-G1u-Arg-Arg-A1a-Lys-Asp-Phe-Va1-G1u-Trp-Leu- Met-Lys-Thr-R (SEQID N 0：18)
其中於第28號位置之Xaa=天冬胺酸或天冬醯胺酸，於第29號位置之Xaa=蘇胺酸或甘胺酸，R選自於包含COOH、CONH2、麩胺酸、天冬胺酸、甘胺酸、SEQIDNO：26、SEQIDNO：27及SEQIDNO：28所組成之群，且內醯胺架橋形成於SEQIDNO：66中第12號位置之離胺酸及第16號位置之麩胺酸間，於SEQIDNO：67中第16號位置之麩胺酸及第20號位置之離胺酸間，於SEQIDNO：68中第20號位置之離胺酸及第24號位置之麩胺酸間，於SEQIDNO：69中第24號位置之麩胺酸及第28號位置之離胺酸間，於SEQIDNO：16中第12號位置之離胺酸及第16號位置之麩胺酸間，以及第20號位置之離胺酸及第24號位置之麩胺酸間，於SEQIDNO：17中第12號位置之離胺酸及第16號位置之麩胺酸間，以及第24號位置之離胺酸及第28號位置之麩胺酸間，於SEQIDNO：18中第16號位置之麩胺酸及第20號位置之離胺酸間，以及第24號位置之麩胺酸及第28號位置之離胺酸間。於一實施例中，其中R選自於包含COOH、CONH2、麩胺酸、天冬胺酸及甘胺酸所組成之群，第28號位置之胺基酸為天冬醯胺酸，且於第29號位置之胺基酸為蘇胺酸。於一實施例中，R為CONH2，第28號位置之胺基酸為天冬醯胺酸，且於第29號位置之胺基酸為蘇胺酸。於另一實施例中，R選自於包含SEQIDNO：26、SEQIDNO：29及SEQIDNO：65所組成之群，且於第29號位置之胺基酸為甘胺酸。
於另外實施例中，該胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑係選自於包含：SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17及SEQIDNO：18所組成之群，其中該胜肽進一步包含一額外的胺基酸之羧基端延伸或一胜肽，該胜肽係選自於包含：SEQIDNO：26、SEQIDNO：27及SEQIDNO：28所組成之群。於一實施例中，該末端延伸包含SEQIDNO：26、SEQIDNO：29或SEQIDNO：65之序列，且該胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：55之序列。於一實施例中，該胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑包含SEQIDNO：33之序列，其中第16號位置之胺基酸為麩胺酸，第20號位置之胺基酸為離胺酸，第28號位置之胺基酸為天冬醯胺酸，且SEQDNo：26或SEQIDNO：29之序列連接至SEQIDNO：33之羧基端。
於該實施例中，單一胺基酸添加至SEQIDNO：20之羧基端，該胺基酸通常係選自20種一般胺基酸之一，並且於一實施例中，該胺基酸具有醯胺基，其係取代天然胺基酸之羧酸。於一實施例中，添加之胺基酸係選自包含：麩胺酸、天冬胺酸及甘胺酸所組成之群。於該實施例中，其中該胰高血糖素類似物進一步包含一羧基端延伸、該延伸之羧基端胺基酸，於一實施例中，其終端係為醯胺基或酯基，而非羧酸。
於另一實施例中，該胰高血糖/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑包含序列 ：N H2-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-G1u-Arg-Arg-A1a-G1n-Asp-Phe-Va1-G1n-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Xaa-C O NH2(SEQID NO：19)，其中於第30號位置之Xaa代表任何胺基酸。於一實施例中，Xaa係選自20種一般胺基酸之一，且於一實施例中，該胺基酸為麩胺酸、天冬胺酸或甘胺酸。於一實施例中，Xaa係選自20種一般胺基酸之一，且於一實施例中，該胺基酸為麩胺酸、天冬胺酸或甘胺酸。此胜肽之溶解度係可進一步改善，藉由共價性鍵結一聚乙二醇鏈至SEQIDNO：19之第17、21、24或30號位置而達成。於另外實施例中，該胜肽包含一額外的胜肽之羧基端延伸，該胜肽係選自於包含：SEQIDNO：26、SEQIDNO：27及SEQIDNO：28所組成之群。依據一實施例，該胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑包含SEQIDNO：30、SEQIDNO：31及SEQIDNO：32之序列。
額外的點特異修飾(sitespecific m odifications)於SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQID NO：15、SEQIDNO：16、SEQID NO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19及SEQIDNO：64之胰高血糖素序列內可製造量產一系列擁有各種程度胰高血糖素樣肽-1促效作用之胰高血糖素促效劑。因此，可製備及特徵化於每一受體具有與體外效能幾乎相同之胜肽。同樣地，可辨識及特徵化於兩受體中每一受體具有10倍選擇性增加效能之胜肽。如同上述指出之取代，即第16號位置之絲胺酸殘基取代為麩胺酸，係可增加於胰高血糖素受體及胰高血糖素樣肽-1受體兩者之天然胰高血糖素效能，但於胰高血糖素受體維持大約10倍之選擇性。此外，第3號位置之天然麩醯胺酸取代為麩胺酸(SEQIDNO：22)產生一種胰高血糖素類似物，其係於胰高血糖素樣肽-1受體顯現大約10倍之選擇性。
胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑之溶解度可進一步於生理pH值之水溶液中增加，而維持相對於天然胰高血糖素之高生物活性，其係藉由於胜肽之第16、17、21及24號位置導入親水性基團，或於胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑之羧基端添加單一修飾胺基酸(例如：一股基酸經修飾以包含有親水性基團)而達成。依據於一實施例，該親水性基團可包含聚乙二醇(PEG)鏈。更具體地說，於一實施例中，該胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQID NO：15、SEQIDNO：16、SEQID NO：17或SEQIDNO：18之序列，其中聚乙二醇鏈共價性鍵結於胰高血糖素胜肽中第16、17、21、24、29號位置、或羧基端胺基酸，附加條件為當該胜肽包含SEQIDNO：10、SEQID NO：11、SEQIDNO：12或SEQIDNO：13時，該聚乙二醇鏈共價性鍵結於第17、21或24號位置之胺基酸殘基，當該胜肽包含SEQIDNO：14或SEQIDNO：15時，該聚乙二醇鏈共價性鍵結於第16、17或21號位置之胺基酸殘基，且當該胜肽包含SEQIDNO：16、SEQIDNO：17或SEQIDNO：18時，該聚乙二醇鏈共價性鍵結於第17或21號位置之胺基酸殘基。
於一實施例中，該胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：11、SEQIDNO：12或SEQIDNO：13之序列，其中該聚乙二醇鏈共價性鍵結於胰高血糖素胜肽中第17、21、24號位置之胺基酸殘基，或羧基端胺基酸，且該胜肽之羧基端胺基酸具有醯胺基以取代天然胺基酸之羧酸基。於一實施例中，該胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑胜肽包含序列，其係選自於包含：SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18及SEQIDNO：19所組成之群，其中該聚乙二醇鏈共價性鍵結於胰高血糖素胜肽之SEQIDNO：12、SEQIDNO：13及SEQIDNO：19第17、21或24號位置之胺基酸側鏈，或於SEQIDNO：14及SEQIDNO：15中第16、17或21號位置，或SEQIDNO：16、SEQIDNO：17及SEQIDNO：18中第17或21號位置。於另一實施例中，該胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑包含SEQIDNO：11或 SEQIDNO：19之序列，其中該聚乙二醇鏈共價性鍵結於胰高血糖素胜肽中第17、21或24號位置之胺基酸側鏈，或羧基端胺基酸。
依據一實施例，限於前述章節之附加條件限制，該胰高血糖素共同促效劑胜肽經修飾而包含一或多個於第16、17、21、24或29號位置，或羧基端胺基酸之胺基酸取代，其中天然胺基酸取代為一具有適合與親水性基團交聯之側鏈，包含例如：聚乙二醇。該天然胜肽係取代為自然生成之胺基酸或合成(非自然)胺基酸。合成或非自然胺基酸係指不會於體外自然生成之胺基酸，然而可納入如本文所述之胜肽結構。或者，該胺基酸具有一適合與親水性基團交聯之側鏈，包含例如：聚乙二醇，其係可添加至如本文所述之任何胰高血糖素類似物之羧基端。依據某些實施例，於胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑之胺基酸修飾，其修飾位置係選自於包含：第16、17、21、24或29號位置，其係將天然胺基酸取代為選自於包含：離胺酸、半胱胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸及乙醯基苯丙胺酸所組成之群，其中，該取代胺基酸進一步包含一共價性鍵結至胺基酸之側鏈的聚乙二醇鏈。於一實施例中，該胰高血糖素胜肽係選自包含：SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQID NO：14、SEQID NO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、及SEQIDNO：19所組成之群，進一步修飾以包含一聚乙二醇鏈，該聚乙二醇鏈共價性鍵結於胰高血糖素胜肽第17或21號位置之胺基酸。於一實施例中，該聚乙二醇化胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1受體共同促效劑進一步包含SEQID NO：26、SEQIDNO：27或SEQIDNO：29之序列。
於另一實施例中，該胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：55或SEQID NO：56之序列，進一步包含SEQID NO：26、SEQIDNO：29或SEQIDNO：65之羧基端延伸，其係連接至SEQIDNO：55或SEQIDNO：56之羧基端胺基酸，並視情況進一步包含聚乙二醇鏈，該聚乙二醇鏈共價性鍵結於胜肽第17、18、21、24或29號位置之胺基酸或羧基端胺基酸。於另一實施例中，該胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：55或SEQIDNO：56之序列，其中該聚乙二醇鏈共價性鍵結於胰高血糖素胜肽第21或24號位置之胺基酸側鏈，且該胜肽進一步包含SEQIDNO：26或SEQIDNO：29之羧基端延伸。
於另一實施例中，該胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：55、SEQIDNO：33或SEQIDNO：34之序列，其中，一額外的胺基酸添加至SEQIDNO：33或SEQIDNO：34之羧基端，以及一其係共價性鍵結至添加胺基酸的側鏈之聚乙二醇鏈。於另外實施例中，該聚乙二醇化胰高血糖素類似物進一步包含SEQIDNO：26或SEQIDNO：29之羧基端延伸，其係連接至SEQID NO：33或SEQID NO：34之羧基端胺基酸。於另一實施例中，該胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：19之序列，其中，一聚乙二醇鏈共價性鍵結於胰高血糖素胜肽第30號位置之胺基酸側鏈，且該胜肽進一步包含SEQIDNO：26或SEQID NO：29之羧基端延伸，其係連接至SEQIDNO：19之羧基端胺基酸。
該聚乙二醇鏈係可為直鏈或支鏈之形式。依據一實施例，聚乙二醇鏈之平均分子量選自約500至10，000道耳吞之範圍。於一實施例中，聚乙二醇鏈之平均分子量係選自約1，000至5，000道耳吞之範圍。於另一實施例中，聚乙二醇鏈之平均分子量係選自約10，000至20，000道耳吞之範圍。依據一實施例，該聚乙二醇化胰高血糖素胜肽包括二或多個聚乙二醇鏈，其係共價鍵結至該胰高血糖素胜肽，其中胰高血糖素鏈之整體分子量約為1，000至5，000道耳吞。於一實施例中，該聚乙二醇化之胰高血糖素促效劑包含SEQIDNO：5之胜肽，或一SEQIDNO：5之胰高血糖素促效劑類似物，其中聚乙二醇鏈係共價性鍵結至於第21及24號位置之胺基酸殘基，且其中該二條聚乙二醇鏈之結合分子量約為1，000至5，000道耳吞。
於某些例示實施例中，該胰高血糖素胜肽包含具有高達10個胺基酸修飾之SEQIDNO：1之胺基酸序列，且包含係位於第10號位置之醯基化或烷基化胺基酸。於某些實施例中，該第10號位置之醯基化或烷基化胺基酸係為C4至C30脂肪酸。於特定方面，第10號位置之胺基酸包含有醯基或烷基，其中該醯基或烷基對自然生成之胺基酸來說是非自然的。
於特定實施例中，該於第10號位置包含有胺基酸之胰高血糖素胜肽，其係經醯基化或烷基化以包含有一穩定化之α螺旋。因此，於特定方面，該胰高血糖素胜肽包含：一如本文所述之醯基或烷基，以及一分子內架橋(例如，共價性分子內架橋(例如，內醯胺架橋))，分子內架橋係介於第i及i+4號位置之胺基酸側鏈間(其中i為12、16、20或24)。該胰高血糖素胜肽係以取代或添加方式包含有：一如本文所述之醯基或烷基，並於胰高血糖素胜肽第16、20、21及/或24號位置中一、二、三或多個取代為α，α-雙取代胺基酸，如：胺基異丁酸。於某些例子中，該非天然胰高血糖素胜肽包含：第16號位置之麩胺酸及第20號位置之離胺酸，其中視情況以一內醯胺架橋連接該麩胺酸及離胺酸，且視情況，該胰高血糖素胜肽進一步包含一或多個選自於包含下列所組成群組之修飾：麩醯胺酸(於第17號位置)、丙胺酸(於第18號位置)、麩胺酸(於第21號位置)、異白胺酸(於第23號位置)、及丙胺酸(於第24號位置)。
同時，於任何實施例中，其中該包含有於第10號位置經醯基化或烷基化胺基酸之胰高血糖素胜肽，係可進一步包含有一羧基端醯胺以取代羧基端α羧酸基。
於某些實施例中，該胰高血糖素胜肽包含一如本文所述之醯基或烷基，其係進一步包含於第1號位置、第2號位置或第1號及2號位置處之胺基酸取代，其中該胺基酸取代係可達成第四型雙胜肽蛋白水解酶抗性。舉例來說，於第1號位置之組胺酸取代為一胺基酸，其係選自於包含：D-組胺酸、α，α-雙甲基咪。乙酸(DMIA)、N-甲基組胺酸、α-甲基組胺酸、咪乙酸(imidazo1e aceticacid)、脫胺基組胺酸、羥基組胺酸、乙醯基組胺酸及同組胺酸所組成之群。替代地或添加地，於第2號位置之絲胺酸係取代為一胺基酸，其係選自於包含：D-絲胺酸、D-丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸、N-甲基丙胺酸以及胺基異丁酸所組成之群。
該於第10號位置包含有如本文所述醯基化或烷基化胺基酸之胰高血糖素胜肽，係可包含任何基本上與SEQIDNO：1相關之胺基酸序列。舉例來說，該胰高血糖素胜肽包含具有高達10個胺基酸修飾之SEQIDNO：1之胺基酸序列。(例如：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個修飾)。於特定實施例中，該胰高血糖素胜肽之醯基化或烷基化胺基酸序列，與SEQIDNO：1相較，具有大於25%之同一性(例如，大於30%、35%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或幾乎100%與SEQIDNO：1相同)。於某些特定實施例中，該胰高血糖素胜肽係為一包含SEQIDNOs：55，並於第10號位置如本文所述醯基化或烷基化胺基酸之胰高血糖素胜肽。該胰高血糖素胜肽係為任何SEQIDNOs：55，於第2至4、9至18、20、23至25、33、40至44、53、56、61、62、64、66至514以及534號胺基酸位置具有一或二個胺基酸修飾。
此類實施例中之醯基或烷基係為任何如本文所述之醯基或烷基。舉例來說：該醯基係為C4至C30(例如：C8至C24)脂肪醯基且烷基係為C4至C30烷基(例如：C8至C24)。
該連接至醯基或烷基之胺基酸係任何如本文所述之胺基酸，例如：化學式I(例如：離胺酸)、II或III之胺基酸。
於某些實施例中，該醯基或烷基係直接連接至第10號位置之胺基酸側鏈。於某些實施例中，該醯基或烷基係透過間隔物連接至第10號位置之胺基酸側鏈，例如：具3至10個原子長度之間隔物，例如：胺基酸或雙肽。 適合連接至醯基或烷基之間隔物係如本文所述。
於本發明某些實施例中，提供一種胰高血糖素胜肽之類似物，係可於胃抑胜肽受體顯現促效劑活性。該類似物於某些實施例中，包含具有至少1個胺基酸修飾之SEQIDNO：1之胺基酸序列(視情況高達15個胺基酸修飾)，及一種由類似物1至21個胺基酸之羧基端至第29號位置之延伸。
於某些方面，該類似物至少包含一個胺基酸修飾並最高可達15個胺基酸修飾(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個胺基酸修飾，亦可最高達10個胺基酸修飾)。於特定實施例中，該類似物包含至少一個胺基酸修飾，高達10個胺基酸修飾以及額外之保留性胺基酸修飾。保留性胺基酸取代係如本文所述。
於某些方面，該至少一個之胺基酸修飾係賦予穩定類似物的羧基端部分一穩定化之α螺旋結構。達成穩定化之α螺旋結構之修飾係如本文所述。請參見，例如於「α螺旋結構之穩定/分子內架橋」章節中之教學。於某些方面，該類似物包含一形成於類似物兩股基酸側鏈間之分子內架橋(例如：共價性或非共價性分子內架橋)。於某些方面，分子內架橋連接第i及i+4號位置之胺基酸側鏈，其中i為12、13、16、17、20或24。於其他方面，分子內架橋連接第j及j+3號位置之胺基酸側鏈，其中j為17，或第k及k+7號位置，其中k為任何介於12及22間之整數。於特定實施例中，分子內架橋係為共價性分子內架橋，例如：內醯胺架橋。於特定方面，該內醯胺架橋係連接第16及20號位置間胺基酸側鏈，於具體方面，該第16及20號位置中一個為帶正電胺基酸，另一則為帶負電胺基酸。舉例來說，該內醯胺架橋係連接第16號位置麩胺酸與第20號位置離胺酸之側鏈。於其他方面，該帶正電胺基酸及帶負電胺基酸形成鹽橋。於此例子中，分子內架橋係為非共價性分子內架橋。
於具體方面，賦予穩定化之α螺旋結構之胺基酸修飾係將SEQIDNO：1之胺基酸插入或取代為α，α-雙取代胺基酸。適合穩定α螺旋結構之α，α-雙取代胺基酸係如本文所述，並包含，例如：胺基異丁酸。於某些方面，SEQIDNO：1中第16、20、21及24號位置之一、二、三個以上位置取代為α，α-雙取代胺基酸，例如：胺基異丁酸。於具體實施例中，該第16號位置之胺基酸為胺基異丁酸。
該於胃抑胜肽受體顯現促效劑活性之類似物包含有額外之胺基酸修飾，例如任何如本文所述者。舉例來說，該胺基酸修飾係增加或降低於胰高血糖素受體以及胰高血糖素樣肽-1受體之一或兩者之活性。胺基酸修飾係可增加胜肽穩定度，例如：提高對第四型雙胜肽蛋白水解酶降解之抗性，穩定於第15及16號位置之胺基酸。胺基酸修飾係可增加胜肽溶解度及/或改變任何於胃抑胜肽、胰高血糖素、及胰高血糖素樣肽-1受體之類似物作用時間。任何此等類型修飾之組合係可存在於類似物，其係可於胃抑胜肽受體顯現促效劑活性。
因此，於某些方面，該類似物包含SEQIDNO：1之胺基酸序列，其係具有下列一或多個：第17號位置之麩醯胺酸、第18號位置之丙胺酸、第21號位置之麩胺酸、第23號位置之異白胺酸、第24號位置之丙胺酸、天冬醯胺酸或半胱胺酸或其保留性取代。於某些方面，該類似物包含一羧基端醯胺，其係取代羧基端α羧酸基。於特定實施例中，該類似物包含於第1號位置、第2號位置或第1號及2號位置處之胺基酸取代，其中該胺基酸取代係可達成第四型雙胜肽蛋白水解酶抗性。適合之胺基酸取代係如本文所述。舉例來說，第1號位置為α，α-雙甲基咪乙酸(DMIA)及/或第2號位置為D-絲胺酸或胺基異丁酸。
於某些實施例中，該類似物於第27及/或28號位置經修飾， 並視情況於第29號位置。舉例來說，第27號位置之甲硫胺酸取代為大的脂肪族胺基酸，視情況為白胺酸，第28號位置之天冬醯胺酸取代為小的脂肪族胺基酸，視情況為丙胺酸，以及第29號位置之蘇胺酸取代為小的脂肪族胺基酸，視情況為甘胺酸。不需任何理論下，據信於第27-29號位置取代為LAG(白胺酸、丙胺酸、甘胺酸)胺基酸相較於原來在此等位置之SEQIDNO：1序列，其胃抑胜肽活性增加。於某些方面，第1號位置之胺基酸包含一咪環(例如：組胺酸、組胺酸類似物)之胺基酸以及一如本文所述於第27及/或28號位置之胺基酸修飾，且視情況於第29號位置經修飾之類似物。
替代或添加地，該類似物包含下列任一種或其組合：(a)第2號位置之絲胺酸取代為絲胺酸；(b)第3號位置之麩醯胺酸取代為麩胺酸或麩醯胺酸類似物；(c)第7號位置之蘇胺酸取代為異白胺酸；(d)第10號位置之酪胺酸取代為色胺酸或包含醯基或烷基之胺基酸，其中該醯基或烷基對自然生成之胺基酸來說是非自然的；(e)第12號位置之離胺酸取代為異白胺酸；(f)第15號位置之天冬胺酸取代為麩胺酸；(g)第16號位置之絲胺酸取代為麩胺酸；(h)第20號位置之麩醯胺酸取代為絲胺酸、蘇胺酸、丙胺酸或胺基異丁酸；(i)第24號位置之麩醯胺酸取代為絲胺酸、蘇胺酸、丙胺酸或胺基異丁酸；(j)第27號位置之甲硫胺酸取代為白胺酸或正白胺酸(N1e)；(k)第29號位置之天冬醯胺酸取代為帶電荷胺基酸，視情況為天冬胺酸或麩胺酸；以及(1)第29號位置之蘇胺酸取代為甘胺酸或帶電荷胺基酸，視情況為天冬胺酸或麩胺酸。
於特定方面，該類似物並不包含於第1號位置之賦予胃抑胜肽促效劑活性的胺基酸修飾。於某些方面，於第1號位置之胺基酸非大的、芳香族胺基酸，例如：酪胺酸。於某些實施例中，第1號位置之胺基酸包含咪唑環，例如：組胺酸、組胺酸類似物。於特定實施例中，該類似物並非任何美國申請案61/151，349號所揭示之化合物。於特定實施例中，該類似物包含SEQIDNOs：657-669任一胺基酸序列。於特定方面，該類似物包含一SEQIDNOs：657-669之任一經修飾胺基酸序列，其中第12號位置之胺基酸為異白胺酸及/或第27號位置之胺基酸為白胺酸及/或第28號位置之胺基酸為丙胺酸。於某些方面，該類似物包含SEQIDNOs：676、677、679、680號之任一胺基酸序列。
有關於胃抑胜肽受體顯現促效劑活性之類似物，該類似物包含1至21個胺基酸之一延伸(例如：5至19、7至15、9至12個胺基酸)。若該類似物之延伸為1至21個胺基酸，則該延伸包含任何胺基酸序列。於某些方面，該類似物之延伸為7至15個胺基酸，且於其他方面，該類似物之延伸為9至12個胺基酸。於某些實施例中，該延伸包含：(i)SEQIDNO：26或674之胺基酸序列，(ii)與SEQIDNO：26或674胺基酸序列相比具有高序列相似度(例如：至少80%、85%、90%、95%、98%、99%)之胺基酸序列：或(iii)具有一或多個保留性胺基酸修飾之(i)或(ii)胺基酸序列。
於某些實施例中，該延伸中至少一個胺基酸經醯基化或烷基化。該包含醯基或烷基之胺基酸係位於類似物之延伸中任何位置。於特定實施例中，該延伸之醯基化或烷基化胺基酸係位於類似物之第37、38、39、40、41或42號位置(根據SEQIDNO：1之編號)。於特定實施例中，該醯基化或烷基化胺基酸係位於類似物之第40號位置。
於例示實施例中，該醯基或烷基係指對自然發生之胺基酸來說是非自然之胺基酸的醯基或烷基。舉例來說：該醯基或烷基係為C4至C30(例如：C12至C18)脂肪醯基或C4至C30烷基。該醯基或烷基係任何如本文所述者。
於某些實施例中，該醯基或烷基係直接連接至胺基酸，例如：透過胺基酸側鏈。於其他實施例中，該醯基或烷基係可藉由間隔物(例如：單一胺基酸、雙肽、三肽、親水性雙功能間隔物、疏水性雙功能間隔物)連接至醯基或烷基。於特定實施例中，該間隔物係為3至10個原子長度。於某些實施例中，該間隔物為單一胺基酸或雙肽包含有一或二個六-胺基己酸(6-amino hexanoic acid)丙胺酸、脯胺酸、白胺酸、β-丙胺酸、γ-麩胺酸(如：γ-麩胺酸γ-麩胺酸)。於特定實施例中，該間隔物係為14至28個原子長度。
同樣地，於例示實施例中，該連接至醯基或烷基之胺基酸係任何如本文所述之胺基酸，例如：化學式I、II或III之胺基酸。舉例來說，該醯基化或烷基化之胺基酸係可為離胺酸。適合包含醯基或烷基之胺基酸，也適合如本文所述之醯基及烷基。請參見，例如於「醯基化及烷基化」章節中之教學。
於其他實施例中，延伸之1至6個胺基酸(例如：1至2個、1至3個、1至4個、1至5個胺基酸)為帶正電胺基酸，例如：化學式IV之胺基酸，如：離胺酸。如本文所使用之術語：「帶正電胺基酸(positive-charged amino acid)」係指包含於生理pH下之任何自然生成或非自然生成，於其側鏈原子上帶正電之胺基酸。於特定方面，該帶正電胺基酸係位於第37、38、39、40、41、42及43號位置中任一位置。於特定實施例中，該帶正電胺基酸係位於第40號位置。
於特定例子中，該延伸中係如本文所述經醯基化或烷基化，並包含如本文所述之1至6個帶正電胺基酸。
於又一實施例中，該胃抑胜肽受體顯現促效劑活性之類似物包含：(i)SEQIDNO：1，其係具有至少一個胺基酸修飾，(ii)一種延伸，係1至21個胺基酸(例如：5至18、7至15、9至12個胺基酸之羧基端至類似物第29號位置之胺基酸，以及(iii)一包含醯基或烷基之胺基酸，該醯基或烷基係指對位於羧基端延伸外的自然生成之胺基酸來說是非自然(例如：第1至29號位置中任何位置)。於某些實施例中，該類似物包含於第10號位置醯基化或烷基化之胺基酸。於特定方面，該醯基或烷基係為C4至C30脂肪醯基或C4至C30烷基。於某些實施例中，該醯基或烷基係可藉由間隔物(例如：單一胺基酸、雙肽、三肽、親水性雙功能間隔物、疏水性雙功能間隔物)連接至醯基或烷基。於特定方面，該類似物包含穩定α螺旋之胺基酸修飾，例如：鹽橋，其係介於第16號位置之麩胺酸及第20號位置胺基酸之離胺酸間，或位於第16、20、21、及24號位置之任何一、二、三或多個位置的一α，α雙取代胺基酸。於特定方面，該類似物額外地包含胺基酸修飾，其係賦予對第四型雙胜肽蛋白水解酶切割之抗性，例如：於第1號位置之α-雙甲基咪唑乙酸(DMIA)，於第2號位置之胺基異丁酸(AIB)。包含進一步胺基酸修飾之類似物需於此處考慮。
於特定實施例中，其中當該類似物缺少一親水性基團，例如：聚乙二醇(PEG)時，該具胃抑胜肽受體活性之類似物於胃抑胜肽受體顯現至少約0.1%(例如：至少0.5%、1%、2%、5%、10%、15%或20%)之天然胃抑胜肽活性。於某些實施例中，該類似物於胃抑胜肽受體顯現超過10%(例如：超過20%、50%、75%、100%、200%、300%、500%)之天然胃抑胜肽活性。於某些實施例中，該胃抑胜肽受體於胰高血糖素樣肽-1受體及胰高血糖素受體中之一或前述兩者顯現可觀之促效劑活性。於某些方面，對此類受體之效能及/或選擇性(其係指胃抑胜肽受體及胰高血糖素樣肽-1受體及/或胰高血糖素受體)為1000倍以內、於750倍內、於500倍內、於250倍內、於100倍內(較高或較低)。舉例來說，該具有胃抑胜肽受體活性之類似物，其於胃抑胜肽受體之選擇性係少於1000倍、500倍、100倍、於50倍內、於25倍內、於15倍內、於10倍內(較高或較低)，該選擇性係於胃抑胜肽受體及/或胰高血糖素受體。
於如本文所述之任何方面，本發明排除任何揭示於國際申請公開案第No.W O2010/011439、W O2008/101017、No.WO2009/155258之胜肽。
用途
如於例子中詳細描述者，本發明之胰高血糖素促效劑具有增強之生物物理穩定度及水溶液溶解度，同時相對於天然胜肽證實有增強之生物活性。因此，據信本發明之胰高血糖素促效劑適用於前述用於天然胰高血糖素胜肽之任何用途。因此，如本文所述之經修飾胰高血糖素胜肽係可用於：治療低血糖症或提高血糖值、弓起腸道暫時性麻痺供放射性用途、或治療其他由胰高血糖素之低血值所弓起之代謝疾病。亦預期如本文所述之胰高血糖素胜肽可用於：降低或維持體重、或治療高血糖症、或降低血糖值、或使血糖值正常化。
本發明之胰高血糖素胜肽係可單獨使用，或與其他抗糖尿病或抗肥胖藥劑合併用藥。該領域所熟知或正在研究中之抗糖尿病藥物包括：胰島素、磺醯脲類(su1fony1ureas)(例如：甲苯磺丁脲(to1buta mide)(Orinase)、乙醯苯磺醯環己脲(acetohexamide)(Dyme1or)、杜拉胺(to1azamide)(To1inase)、氯磺丙脲(ch1orpropa mide)(Diabinese)、克比噻(g1ipizide)(G1ucotro1)、甘布若(g1yburide)(Diabeta，Micronase，G1ynase)、格列美脲(g1imepiride)(A m ary1)、或格列齊特(g1ic1azide)(Dia micron)) ；氯茴苯酸類(m eg1itinides)(例如：瑞格列耐(repag1inide)(Prandin)或拿貼葛奈(nateg1inide)(Star1ix))；雙胍類(biguanides)(例如：二甲雙胍(metformin)(G1ucophage)或苯乙雙胍(phenformin))；硫偶氮定二酮類(thiazo1idinediones)(例如：羅西塔松(rosig1itazone)(A vandia)、皮格塔松(piog1itazone)(A ctos)、或曲格塔松(trog1itazone)(Rezu1in)或其他PPARγ抑制劑)；抑制碳水化合物消化之葡萄糖苷酶抑制劑(例如：米格列醇(mig1ito1)(G1yset)、阿卡波糖(acarbose)(Precose/G1ucobay)；依森泰德(exenatide)(Byetta)或普拉立替(pra m1intide))；第四型雙胜肽蛋白水解酶抑制劑(例如：維達格利普丁(vi1dag1iptin)或西塔葛菌素(sitag1iptin)) ；鈉離子依賴型葡萄糖轉運蛋白(sodium-dependentg1ucosetransporter1，SG LT)抑制劑；葡萄糖激酶活化劑(GKA)；胰高血糖素受體拮抗劑(GRA)；或果糖-1，6-雙磷酸酶(fructose 1，6-bisphosphatase，FBPase)抑制劑。
該領域所熟知或正在研究中之抗肥胖藥劑包括：食慾抑制劑，包括：苯乙胺(phentermine)型興奮劑、吩特明(phentermine)(視情況為芬氟拉明(enfluramine)或右芬氟拉明(dexfenf1ura mine))、二乙基丙酸(diethy1propion)(Tenuate)、芬二美曲秦(phendimetrazine)(Pre1u-2，Bontri1)、苄非他命(benzphetamine)(Didrex)、西布他命(sibutra mine) (M eridia，Reducti1)、莫利那班(rimonabant) (Acomp1ia)、其他類大麻(cannabinoid)受體拮抗劑；調酸素；鹽酸氟希定(fluoxetine hydroch1oride)(Prozac)、奎克司(Qnexa) (托比酯(topiramate)以及吩特明)、依賽利爾(Exca1ia)(安非他酮(bupropion)以及抗痙孿劑尼沙胺(zonisaminde))或康曲維(Contrave)(安非他酮以及納曲酮(na1trexone))；或脂酶抑制劑，類似奧麗斯特(O r1istat)(xenica1)或西替利司他(C eti1istat)(亦稱ATL-962)，或GT389-255。
本發明之一方面係指一種用於治療低血糖症之本發明所揭示之胰高血糖素促效劑的預配置水溶液。如本文所述之促效劑組合物的改良穩定度及溶解度允許用於製備供快速施予及治療低血糖症用之胰高血糖素之預配置水溶液。於一實施例中，提供一種用於施予罹患低血糖症之病患的包含有經聚乙二醇化之胰高血糖素促效劑之溶液，其中連接至經聚乙二醇化之胰高血糖素促效劑之聚乙二醇鏈之總分子量係介於約500至約5，000道耳吞之間。於一實施例中，經聚乙二醇化之胰高血糖素促效劑包含一胜肽，係選自由SEQIDNO：23、SEQIDNO：24、及SEQIDNO：25所組成之群，及SEQIDNO：23、SEQIDNO：24、及SEQIDNO：25之胰高血糖素促效劑類似物，或包含SEQIDNO：20序列之胰高血糖素的一經聚乙二醇化內醯胺衍生物，其中該胰高血糖素胜肽之胺基酸殘基側鏈係共價鍵結至聚乙二醇鏈。
依據本發明之治療方法，包括但不限於治療低血糖症，可包括使用任何標準的使用任何標準給藥途徑(包括：非經腸道，諸如靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內、鞘內、經皮、經直腸、經口、經鼻或經吸入)而將本文揭示之胰高血糖素促效劑施予病患之步驟。於一實施例中，組合物係經皮下或肌肉內施予。於一實施例中，組合物係非經腸道投與，且胰高血糖素組合物係預包裝於注射器中。於另一實施例中，組合物係預包裝於吸入器或其他霧化藥物傳送裝置中。
令人驚奇地，申請人已發現可製備得保有原胜肽之生物活性及特異性之經聚乙二醇化之胰高血糖素胜肽。然而，增加聚乙二醇鏈長度，或將多個聚乙二醇鏈連接至胜肽，以致連接至聚乙二醇之總分子量大於5，000道耳吞，可開始延遲經修飾胰高血糖素之作用時間。根據一實施例，提供一種SEQIDNO：23、SEQIDNO：24、及SEQIDNO：25之胰高血糖素胜肽，或其之胰高血糖素促效劑類似物，或包含SEQIDNO：20序列之胰高血糖素的聚乙二醇化內醯胺衍生物，其中該胜肽包含一或多個聚乙二醇鏈，其中該連接至聚乙二醇之總分子量係大於5，000道耳吞，且在一實施例中係大於10，000道耳吞但小於40，000道耳吞。此等經修飾之胰高血糖素胜肽具有經延遲或延長的活性時間，但沒有生物活性的損失。因此，可施予此等化合物以延長經施予之胰高血糖素胜肽的作用。
經修飾以共價鍵結至具有大於10，000道耳吞分子量之聚乙二醇鏈的胰高血糖素胜肽可與胰島素結合施予，以緩衝胰島素之作用並協助維持糖尿病患中之穩定血糖值。本發明之經修飾胰高血糖素胜肽可與胰島素作為單一組合物共同施予、作為個別溶液同時投與或者胰島素及經修飾胰高血糖素胜肽可相對於彼此在不同時間施予。於一實施例中，包含胰島素之組合物及包含經修飾胰高血糖素胜肽之組合物係在相隔不到12小時內施予。經修飾胰高血糖素胜肽相對於經施予胰島素的精確比率將部分視測定病患之胰高血糖素含量而定，且可透過例行實驗而決定。
根據一實施例，提供一種包含胰島素及一經修飾之胰高血糖素胜肽(選自由SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5及其之胰高血糖素促效劑類似物所組成之群)之組合物，其中該經修飾胰高血糖素胜肽進一步包含共價鍵結至第17、21、24或21及24號位置處之胺基酸側鏈之聚乙二醇鏈。於一實施例中，組合物係包含胰島素及胰高血糖素類似物的水溶液。於其中胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：24或SEQIDNO：25之序列的實施例中，聚乙二醇鏈係共價鍵結於胰高血糖素胜肽之第21或24號位置。於一實施例中，聚乙二醇鏈之分子量係為約10，000至40，000。
根據一實施例，使用本文所揭示之經修飾胰高血糖素胜肽來誘發腸道之暫時麻痺。此方法有用於放射性用途，且包括施予一有效量醫藥組合物之步驟，其係包含有經聚乙二醇化之胰高血糖素胜肽、包含此等胜肽之羧基端延伸或二聚體之胰高血糖素胜肽。於一實施例中，胰高血糖素胜肽包含一序列，係選自由SEQID NO：2、SEQID NO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14及SEQIDNO：15所組成之群之。於一實施例中，胰高血糖素胜肽進一步包含一聚聚乙二醇鏈其係約1，000至40，000道耳吞並共價鍵結至第21或24號位置處之胺基酸殘基。於一實施例中，胰高血糖素胜肽係選自由SEQID NO：10、SEQID NO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14及SEQIDNO：15所組成之群。於一實施例中，聚乙二醇鏈之分子量係為約500至5，000道耳吞。
於再一實施例中，用於誘發腸道暫時麻痺之組合物包含一第一經修飾之胰高血糖素胜肽及一第二經修飾之胰高血糖素胜肽。該第一經修飾之胜肽包含一序列，係選自由SEQIDNO：23、SEQIDNO：24及SEQIDNO：25所組成之群，視情況連接至一約500至約5，000道耳吞之聚乙二醇鏈，且該第二胜肽包含一序列，係選自由SEQIDNO：23、SEQIDNO：24及SEQID NO：25所組成之群，其共價性連接至約10，000至約40，000道耳吞之聚乙二醇鏈。於此實施例中，每一胜肽之聚乙二醇鏈係互相獨立地共價性鍵結至個別胜肽之第17、21或24號位置處之胺基酸殘基。
調酸素(一種存在於小腸中之自然生成之消化激素)據報告當施予大鼠或人類時會導致體重減輕(參見Diabetes2005；54：2390-2395)。調酸素係為37個胺基酸胜肽，包含胰高血糖素之29個胺基酸序列(即SEQIDNO：1)其後接SEQIDNO：27之8個胺基酸羧基端延伸(KRNRNNIA)。因此，申請人相信藉由將調酸素之胰高血糖素胜肽部分取代為如本文所揭示之經修飾胰高血糖素胜肽，可維持調酸素之生物活性(即食慾抑制及誘發體重減輕/體重維持)，同時並改良化合物的溶解度及穩定度並改善藥物動力學。此外，申請人亦相信一經截斷之調酸素分子(其係包含有一本發明之胰高血糖素胜肽，具有調酸素經移除之末端四個胺基酸者)，將亦可有效地抑制食慾及誘發體重減輕/體重維持。
因此，本發明亦涵蓋本發明之經修飾胰高血糖素胜肽，其係具有SEQIDNO：27(KRNRNNIA)或SEQIDNO：28之羧基端延伸。可將此等化合物施予個體以誘發體重減輕或預防體重增加。根據一實施例，將SEQIDNO：33或SEQIDNO：20之胰高血糖素促效劑類似物(其進一步包含連接至胰高血糖素胜肽之第29號胺基酸之SEQID NO：27(KRNRNNIA)或SEQIDNO：28之胺基酸序列)施予個體，以誘導體重減輕或預防體重增加。更具體地說，胰高血糖素胜肽包含一序列，係選自由SEQIDNO：10、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14及SEQIDNO：15所組成之群，其進一步包含連接至胰高血糖素胜肽第29號胺基酸之SEQIDNO：27(KRNRNNIA)或SEQIDNO：28之胺基酸序列。
促胰島素分泌素-4係一種由39個胺基酸組成的胜肽。其係已知為胰高血糖素樣肽-1之受體的有力刺激物。此胜肽亦據報告可抑制食慾及誘發體重減輕。申請人發現當將促胰島素分泌素-4之末端序列添加於胰高血糖素之羧基端時，可改良胰高血糖素的溶解度及穩定度，而無損於胰高血糖素的生物活性。於一實施例中，促胰島素分泌素-4之末端十個胺基酸(即SEQID NO：26(GPSSGAPPPS)之序列)係連接至本發明揭示之胰高血糖素胜肽的羧基端。預期此等融合蛋白對於抑制食慾及誘發體重減輕/體重維持具有藥理活性。根據一實施例，將SEQIDNO：33或SEQIDNO：20之胰高血糖素促效劑類似物(其進一步包含連接至胰高血糖素胜肽第29號胺基酸之SEQID NO：26(GPSSGAPPPS)或SEQID NO：29之胺基酸序列)施予個體，以誘發體重減輕或預防體重增加。更具體地說，胰高血糖素胜肽包含一序列，係選自由SEQIDNO：10、SEQID NO：12、SEQIDNO：13、SEQID NO：14、SEQID NO：15、SEQID NO：16、SEQID NO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：66、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68、SEQID NO：69、SEQID NO：55及SEQID NO：56所組成之群，其係進一步包含有連接至胰高血糖素胜肽第29號胺基酸之SEQID NO：26(GPSSGAPPPS)或SEQID NO：29之胺基酸序列。於一實施例中，施予之胰高血糖素胜肽類似物包含SEQIDNO：64之序列。
多聚體
本發明亦涵蓋如本文所述之經修飾胰高血糖素胜肽之多聚體。可使用以為人所熟知之標準的連接劑及程序將兩個或兩個以上之經修飾胰高血糖素胜肽連接在一起。舉例來說，可透過使用雙官能硫醇交聯劑及雙官能胺交聯劑於兩個經修飾胰高血糖素胜肽之間形成二聚體，尤其係對於取代為半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸或乙醯基苯基丙胺酸殘基之胰高血糖素胜肽而言(例如，SEQIDNO：3及SEQIDNO：4)。該二聚體係可為同二聚體或異二聚體。於特定實施例中，該連接物係聚乙二醇，例如：5kDa聚乙二醇、20kDa聚乙二醇。於某些實施例中，該連接物係雙硫鍵。舉例來說，該二聚體之每一單體係可包含半胱胺酸殘基(例如一位於末端或內部半胱胺酸)，以及某一半胱胺酸殘基中硫原子均可參與形成雙硫鍵。於本發明之某些方面，該單體係藉末端胺基酸(例如：胺基端或羧基端)、內部胺基酸、位於至少一單體之末端胺基酸、位於至少另一單體之內部胺基酸而連接。於特定方面，該單體不透過胺基端胺基酸連接。於某些方面，多聚體中之單體係以「尾接尾」(‘‘tai1-to-tai1”)方位相接，其係以每一單體之羧基端胺基酸相接。
於一實施例中，二聚體包含有：一胰高血糖素融合胜肽之同二聚體，其中該胰高血糖素胜肽部分包含SEQIDNO：11或SEQID NO：20及連接至胰高血糖素胜肽第29號胺基酸之SEQ ID NO：26(GPSSGAPPPS)、 SEQ IDNO：27(KRNRNNIA)或SEQID NO：28(KRNR)之胺基酸序列。於另一實施例中，二聚體包含一SEQIDNO：11之胰高血糖素促效劑類似物之同二聚體，其中該胰高血糖素胜肽進一步包含共價性鍵結至胰高血糖素胜肽之第21或24號位置之聚乙二醇鏈。
根據一實施例，提供一種二聚體，其係包含有透過連接物鍵結至一第二胰高血糖素胜肽之一第一胰高血糖素胜肽，其中該第一胰高血糖素胜肽包含有一胜肽，係選自由SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10及SEQIDNO：11所組成之群，且該第二胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO：20。根據另一實施例，提供一種二聚體，其係包含透過連接物鍵結至一第二胰高血糖素胜肽之一第一胰高血糖素胜肽，其中該第一胰高血糖素胜肽包含有一序列，選自由SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11所組成之群，且該第二胰高血糖素胜肽包含SEQIDNO；11，及該等胰高血糖素多肽之藥學可接受鹽類。根據另一實施例，提供一種二聚體，其係包含透過連接物鍵結至一第二胰高血糖素胜肽之一第一胰高血糖素胜肽，其中該第一胰高血糖素胜肽係選自由SEQIDNO：11、SEQID NO：12、SEQID NO：13、SEQID NO：14、SEQID NO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17及SEQIDNO：18所組成之群，且該第二胰高血糖素胜肽係獨立地選自由SEQID NO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQID NO：16、SEQID NO：17及SEQID NO：18所組成之群，及該等胰高血糖素多肽之藥學可接受鹽類。於一實施例中，該第一胰高血糖素胜肽係選自由SEQIDNO：20所組成之群，且該第二胰高血糖素胜肽係獨立地選自由SEQIDNO：8、SEQIDNO：9及SEQIDNO：11所組成之群。於一實施例中，二聚體形成於兩個胜肽之間，其中每一胜肽包含SEQIDNO：11之胺基酸序列。
套組
根據一實施例，本發明之經修飾胰高血糖素胜肽可經提供作為一套組之部分。於一實施例中，提供一種用於將胰高血糖素促效劑施予有需要之病患的套組，其中該套組包含選自由下列所組成之群之經修飾胰高血糖素胜肽：1)一胰高血糖素胜肽，係包含SEQID NO：20、SEQID NO：9、SEQIDNO：10或SEQID NO：11之序列；2)一胰高血糖素融合胜肽，係包含SEQIDNO：11、SEQIDNO：20或SEQIDNO：55之胰高血糖素促效劑類似物，及連接至胰高血糖素胜肽之第29號胺基酸之SEQ ID NO：26(GPSSGAPPPS)、SEQIDNO：27(KRNRNNIA)或SEQID NO：28(KRNR)之胺基酸序列；及3)一SEQID NO：11或SEQID NO：51之經聚乙二醇化之胰高血糖素胜肽，其進一步包含連接至胰高血糖素胜肽之第29號之SEQ ID NO：26(GPSSGAPPPS)、SEQIDNO：27(KRNRNNIA)或SEQID NO：28(KRNR)之胺基酸序列，其中該聚乙二醇鏈共價鍵結至第7、21或24位置處，具有約500至約40，000道耳吞之分子量。於一實施例中，該套組包含一胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑，其中該胜肽包含有一序列，選自由SEQID NO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17及SEQIDNO：18所組成之群。
於一實施例中，該套組提供一將胰高血糖素組合物施予病患之裝置，例如：注射器針頭、筆裝置、噴射注入器或其他不含針之注入器。另一種方式或除此之外，該套組可包括一或多個容器，例如：小藥瓶、管、瓶、單室或多室預填充注射器、卡匣、輸注泵(外部或可植入式)、噴射注入器、預填充筆裝置及其類似物，其視情況含有呈一冷凍乾燥形式或水溶液之胰高血糖素胜肽。較佳地，該套組亦包括使用說明。根據一實施例，套組之該裝置係氣溶膠配送裝置，其中該組合物係預包裝於氣溶膠裝置內。於另一實施例中，該套組包括注射器及針，且於一實施例中，將無菌胰高血糖素組合物預包裝於注射器內。
醫藥調配物
依據一實施例，提供一種藥學組合物，包括本發明之胰高血糖素胜肽或其藥學可接受鹽類，及一藥學可接受載體。該藥學組合物係可包含任何藥學可接受成分，包含，舉例來說，酸化劑、添加劑、吸附劑、推噴劑、空氣置換劑、鹼化試劑、防結塊劑、抗凝聚劑、抗菌防腐劑、抗氧化劑、防腐劑、鹼、黏合劑、緩衝劑、螯合劑、塗佈劑、著色劑、乾燥劑、清潔劑、稀釋劑、消毒劑、崩解佐劑、分散劑、助溶劑、染料、潤滑劑、乳化劑、乳化穩定劑、填充劑、膜形成劑、風味增強劑、助流劑、膠凝劑、粒化劑、保濕劑、潤滑劑、黏膜黏著劑、軟膏基、軟膏、油性賦形劑、有機鹼、片狀鹼(pasti11e bases)、色素、可塑劑、磨光劑、防腐劑、多價螯合劑、皮膚滲透劑、增溶劑、溶劑、安定劑、栓劑基體、表面活性劑、界面活性劑、懸浮劑、甜味劑、治療劑、增稠劑、張力劑、毒性劑、增黏劑、吸水劑、水相互共溶劑、軟水劑或濕潤劑。
於某些實施例中，該藥學組合物包含下列任一種或其組合：阿拉伯膠、醋磺內酯鉀(Acesu1fame K)、乙醯檸檬酸三丁酯、乙醯檸檬酸三乙酯、洋菜、白蛋白、酒精、無水酒精、變性酒精、稀釋酒精、油桐酸、藻酸、脂肪族聚酯、鋁氧、氫氧化鋁、十八酸鋁、支鏈澱粉、α-直鏈澱粉、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、阿斯巴甜、注射用制菌水、皂土、皂黏土乳、羥基氯苯胺、氯化苯齊松(benzethoniu m ch1oride)、安息香酸、苄醇、安息酸甲苯、溴硝醇、丁基羥基甲氧苯、二丁基羥基甲苯、羥苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸丁酯鈉、褐藻酸鈣、抗壞血酸鈣、碳酸鈣、環己胺磺鈣、磷酸氫鈣(無水)、磷酸氫鈣(2個結晶水)、磷酸鈣、丙酸鈣、矽酸鈣、山梨酸鈣、十八酸鈣、硫酸鈣、半水合硫酸鈣、菜籽油、卡波姆、二氧化碳、羥甲基纖維素鈣、羥甲基纖維素鈣、β-胡蘿蔔素、鹿角菜膠、篦蔴油、氫化篦蔴油、陽離子乳化蠟、乙酸纖維素、醋酸鄰苯二甲酸纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、粉狀纖維素、矽化微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉鹽、十八十六醇、溴化十六基三甲銨、十六碳醇、氯已定、 氯丁醇、氯甲酚、膽固醇、氯已定醋酸鹽、氯已定葡糖酸鹽、氯已定二鹽酸鹽、 二氟氯乙烷(HCFC)、氯二氟甲烷、氟氯碳化物(CFC)、氯苯氧基乙醇、氯二甲酚、玉米糖漿固體物、無水檸檬酸、單水合檸檬酸、可可脂、著色劑、玉米油、棉花子油、甲酚、m-甲酚、0-甲酚、p-甲酚、交聯羧甲基纖維素鈉鹽、交聯聚維酮、環己基氨基磺酸、環糊精、葡萄糖結合劑、糊精、右旋糖、無水右旋糖、双咪烷基脲、鄰苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、鄰苯二乙酸、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-環糊精、環糊精化合物，例如Captiso1、二甲基乙醚、鄰苯二甲酸二甲酯、四乙酸乙二胺二鉀、四乙酸乙二胺二鈉、磷酸氫二鈉、多庫酯鈣、多庫酯鉀、多庫酯鈉、五倍子酸十二酯、十二烷基三甲基溴化銨、 四乙酸乙二胺二鈉鈣、乙二胺四乙酸、葡乙胺(eg1umine)、乙醇、乙基纖維素、五倍子酸乙酯、月桂酸乙酯、乙麥芽醇、油酸乙酯、羥苯甲酸乙酯、羥苯甲酸乙酯鉀鹽、 羥苯甲酸乙酯鈉鹽、乙香草醛、 果糖、果糖液、經研磨之果糖、無熱原之果糖、粉狀果糖、反丁烯二酸、明膠、葡萄糖、葡萄糖液、飽和植物脂肪酸之甘油酯混合物、甘油酯、山萮酸甘油酯、單油酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、自發性乳化單硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕櫚酸甘油酯、甘胺酸、甘油、四氫喃聚乙二醇醚、瓜爾膠、七氟丙烷(HFC)、十六烷基三甲基溴化銨、高果糖糖漿、人類血清白蛋白、碳氫化合物(HC)、稀釋氫氯酸、氫化植物油第二型、羥乙基纖維素、2-羥乙基-β-環糊精、羥丙基纖維素、低取代羥丙基纖維素、2-羥丙基-β-環糊精、羥丙基甲纖維素、羥丙甲纖維素酞酸酯、咪烷基脲、靛胭脂、離子交換樹脂、氧化物、異丙醇、肉荳蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、等張鹽溶液、高嶺土、乳酸、乳糖醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、無水羊毛脂、卵磷脂、矽酸鎂鋁、碳酸鎂、正常碳酸鎂、無水碳酸鎂、碳酸氫氧鎂、氫氧化鎂、月桂醇硫酸酯鎂鹽、氧化鎂、矽酸鎂、硬脂酸鎂、三矽酸鎂、無水三矽酸鎂、蘋果酸、麥芽、麥芽糖醇、麥芽糖醇溶液、麥芽糖糊精、麥芽酚、麥芽糖、甘露醇、 中鏈脂肪酸甘油三酯、葡甲胺、薄荷醇、甲基纖維素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、羥苯甲酯、羥苯甲酯鉀鹽、羥苯甲酯鈉鹽、微晶纖維素及羧甲基纖維素鈉鹽、礦物油、輕質礦物油、液體石蠟羊毛醇、油、橄欖油、單乙醇胺、高嶺石、棓酸辛酯、油酸、軟脂酸、石蠟、花生油、凡士林、凡士林羊毛醇、藥用釉料、苯酚、液化苯酚、苯氧乙醇、苯氧丙醇、苯乙醇、醋酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、波拉克林(po1acri1in) 、波拉克林鉀 、泊洛沙姆(po1oxamer)、葡聚糖、聚乙二醇、聚氧乙烯、聚丙烯酸樹脂、聚乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物、聚甲基丙烯酸樹脂、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚山梨酯、硬脂酸聚氧乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯比咯烷酮、藻酸鉀、苯甲酸鉀、碳酸氫鉀、亞硫酸氫鉀、氯化鉀、檸檬酸鉀、無水檸檬酸鉀、磷酸氫鉀、焦亞硫酸鉀、磷酸二氫鉀、丙酸鉀、山梨酸鉀、聚維酮、丙醇、丙酸、碳酸丙烯酯、丙二醇、藻酸丙二醇酯、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丙酯鉀、對羥基苯甲酸丙酯鈉、硫酸魚精蛋白、菜子油、林格氏溶液、糖精、糖精銨、糖精鈣、糖精鈉、紅花子油、皂石、血清蛋白、芝麻油、膠態氧化矽、膠態二氧化矽、藻酸鈉、抗壞血酸鈉、苯甲酸鈉、碳酸氫鈉、亞硫酸氫鈉、氯化鈉、無水檸檬酸鈉、檸檬酸鈉二水合物、氯化鈉、環拉酸鈉、四乙酸乙二胺鈉、十二基硫酸鈉、月桂硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉、無水丙酸鈉、丙酸鈉、山梨酸鈉、羧甲澱粉鈉、硬脂反丁烯二酸鈉、亞硫酸鈉、山梨酸、山梨坦酯(山梨坦脂肪酯)，山梨醇、山梨醇溶液70% 、大豆油、鯨蠟、澱粉、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、預膠化澱粉、滅菌玉米澱粉、硬脂酸、純化硬脂酸，硬脂醇、蔗糖、醣類、可壓性蔗糖、蔗糖粉、蔗糖球形顆粒、轉化糖、Sugartab、SunsetYe11ow FCF、合成石蠟、滑石粉、酒石酸、酒石黃、四氟乙烷(HFC)、可可脂、硫柳汞、二氧化鈦、α-生育酚、乙酸生育酚、α酸式琥珀酸生育酚、β生育酚、δ生育酚、γ生育酚、黃蓍膠、甘油三乙酸酯、檸檬酸三丁酯、三乙醇胺、檸檬酸三乙酯、三甲基-β-環糊精、三甲基十四烷基氯化銨、Tris緩衝液、乙二胺四乙基三鈉、香草醛、第一型氫化植物油、水、軟水、硬水、無二氧化碳水、無熱原水、注射用水、無菌吸入水、無菌注射用水、無菌透析水、蠟、陰離子乳化蠟、卡那巴蠟、陽離子乳化蠟、十六醇酯蠟、微晶蠟、非離子性乳化蠟、塞劑蠟、白臘、黃蠟、液體石蠟、羊毛脂、黃原酸膠、木糖醇、玉米蛋白、丙酸鋅、鋅鹽、硬脂酸鋅鹽，或任何賦形劑，其係於Handbook ofPharmaceutica1 Excipients，Third Edition，A.H.Kibbe(Pharmaceutica1Press，London，U K，2000)，前述揭示內容全體皆弓用作為本說明書之參考資料。Remington，sPharm aceutica1 Sciences，Sixteenth Edition，E.W.M artin(M ack Pub1ishing Co.，Easton，Pa.，1980)，前述揭示內容全體皆弓用作為本說明書之參考資料，其係揭露各種使用於配置藥學可接受組合物及其已為人所熟知之準備方法。排除於此範圍內任何與藥學組合物不相容之傳統藥劑，其於藥學組合物之用途需列入考慮。補充活性成分係亦可納入組合物中。
如本文所述之該醫藥調配物係可設計為如下所述之短效劑型、快速釋放劑型、長效劑型或持續釋放劑型。該醫藥調配物係可設計為立即釋放劑型、控制釋放劑型或緩慢釋放劑型。該立即組合物進一步包含，例如，膠囊或微脂體，或某些其他膠囊劑型，或施予延長釋放劑型以提供延長儲存及/或輸送之效果。本發明揭示之醫藥調配物係可依據任何給藥方式，舉例來說，每天(每天一次、二次、三次、四次、五次、六次)，每兩天、每三天、每四天、每五天、每六天每週、每兩週、每三週、每月或每兩月。
於某些實施例中，前述存在於藥學組合物之成分係為任何濃度範圍，例如，舉例來說，至少為A，其中A為0.0001%w/v、0.001% w/v、0.01% w/v、0.1% w/v、1%w/v、2%w/v、5%w/v、10%w/v、20%w/v、30%w/v、40%w/v、50%w/v、60%w/v、70%w/v、80%w/v、或90%w/v。於某些實施例中，前述存在於藥學組合物之成分係為任何濃度，例如，舉例來說，為最大值B，其中B為90%w/v、80%w/v、70%w/v、60%w/v、50%w/v、40%w/v、30%w/v、20%w/v、10%w/v、5%w/v、2%w/v、1% w/v、0.1% w/v、0.001% w/v、或0.0001%。於其他實施例中，前述存在於藥學組合物之成分係為任何濃度範圍，例如，舉例來說，約由A至B。於某些實施例中，A為0.0001%且B為90%。
該藥學組合物係可配製以達到一生理相容pH。於某些實施例中，該藥學組合物之pH係至少為5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、 10、或至少達到10.5且於11之內，係取決於其配方及給藥途徑。於特定實施例中，該藥學組合物係可包含緩衝劑以達到一生理相容pH。緩衝劑係可包含任何於期望pH中具緩衝能力之化合物，例如，舉例來說，磷酸鹽緩衝液(例如：PBS)、三乙醇胺(triethano1a mine)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二羥乙甘胺酸(bicine)、3-[三(羥基甲基)甲基]胺基-1-磺酸(T A PS)、N-[三(羥甲基)甲基]甘胺酸(tricine)、4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪-乙磺酸(HEPES)、N-[三(羥甲基)甲基]-2-胺基乙磺酸(TES)、3-[N-嗎啉基]丙磺酸(MOPS)、六氫哌嗪-1，4-雙(2-乙磺酸))(PIPES)、二甲基胂酸鹽(cacody1ate)、2-嗎啉基乙磺酸(MES)及其他。(為行文方便，以下緩衝液出現時以其英文名稱表示)。於特定實施例中，緩衝液強度為至少0.5mM、1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM、150mM或至少200mM。於特定實施例中，緩衝液強度為不超過300mM(例如：最大為200mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM、5mM、1mM)。
第3號位置之修飾
任何胰高血糖素胜肽包含：胰高血糖素類似物、胰高血糖素促效劑類似物、胰高血糖共同促效劑，以及胰高血糖/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑分子，如本文所述經修飾而包含於第3號位置之修飾，例如：麩醯胺酸取代為麩胺酸，以產生具高選擇性之胜肽，例如10倍選擇性，(其係對胰高血糖素樣肽-1受體，相較於胰高血糖素受體之選擇性)。
任何胰高血糖素胜肽包含：胰高血糖素類似物、胰高血糖素促效劑類似物、胰高血糖共同促效劑，以及胰高血糖/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑分子，如本文所述被修飾而包含於第3號位置之修飾，例如：麩醯胺酸取代為麩醯胺酸類似物(例如，乙醯二胺基丁酸Dab(Ac))，而對胰高血糖素受體之活性並無實質損失，且於一些情況中，具有增強之胰高血糖素受體活性。
製備方法
如本文所述之化合物係可經標準合成方法製備、DNA重組技術，或任一其他製備胜肽或融合蛋白質之方法。雖然某些特定非天然胺基酸無法以一般DNA重組技術表現，但其製備技術在該領域仍已為人所熟知。本發明之化合物包括非胜肽部分可經由標準有機化學反應合成，或以標準胜肽化學反應亦可適用。
【實施方式】
一般合成實驗指南：
於經修改的App1ied Biosystem Mode1430A胜肽合成儀上使用HBTU-活化之「FastBoc」單一偶合劑自0.2毫莫耳之Boc Thr(OBz1)Pam樹脂開始合成得胰高血糖素類似物。Boc-胺基酸及H BT U購買自Midwest Biotech(Fishers，IN)。所使用之側鏈保護基為：精胺酸(Tos)、天冬醯胺酸(Xan)、天冬胺酸(OcHex)、半胱胺酸(pMeBz1)、組胺酸(Bom)、離胺酸(2C1-Z)、絲胺酸(OBz1)、蘇胺酸(OBz1)、酪胺酸(2Br-Z)以及色胺酸(CHO)。胺基酸端之組胺酸上之側鏈保護基為Boco
用哌定於二甲基甲醯胺(dimethy1formamide，以下簡稱DMF))之20%溶液處理各完成的胜肽基樹脂，以自色胺酸移除甲醯基。在對甲酚及二甲基硫之存在下進行液態氟化氫(hydrof1uoric acid，以下簡稱H F)分裂。分裂係使用HF裝置(Penninsu1a Labs)於冰浴中進行1小時。於蒸發掉HF後，將殘留物懸浮於二乙醚中並過濾出固體物質。將各胜肽萃取至30-70毫升之乙酸水溶液中，並利用HPLC[BeckmanSystem Go1d，0.46x5cm ZorbaxC8，1m1/min，45C，214nm，A緩衝液=0.1%三氟醋酸(trifluoroacetic acid，以下簡稱TFA)，B=0.1%TFA/90%乙腈，於10分鐘內10%至80%B之梯度]分析經稀釋的等分試樣。
於FPLC上在2.2x25公分Kromasi1 C18管柱上進行純化，同時並監測214奈米處之UV且收集5分鐘的溶離份。將均勻的溶離份結合並凍乾得>95%之產物純度。使用MALDI質譜分析確認準確的分子質量及純度。
一般聚乙二醇化實驗指南(半胱胺酸-馬來醯亞胺，Cys-ma1eimido)
典型上，胰高血糖素半胱胺酸類似物於磷酸鹽緩衝溶液(5-10mg/m1)中 ，並加入0.01M 乙二胺四乙酸(M ethy1enedia minetetraaceticacid)(總體積之10-15%)。加入過量(2倍)之加入過量(2倍)的馬來醯亞胺甲氧基聚乙二醇試劑(Nektar)，並將反應於室溫下攪拌同時並利用高效液相層析法(high performance1iquid chromatography，以下簡稱HPLC)監測反應。於8-24小時後，將反應混合物酸化，且裝填於製備型逆相管柱(preparative reverse phaseco1umn)上，以使用0.1%TFA/乙腈梯度進行純化。將適當之的溶離份結合並凍乾得期望經聚乙二醇化類似物。
例子1
胰高血糖素Cys17(1-29)及類似單半胱胺酸類似物之合成使用FastBocHBTU-活化之單一偶合劑將存於60毫升反應容器中之0.2毫莫耳Boc Thr(OBz1)Pam樹脂(SynChem Inc)及以下序列輸入及於經修改的App1ied Biosystems430A胜肽合成儀上執行。
HSQGTFTSDYSKYLDSCRAQDFVQWLMNT(SEQIDNO：35)
使用以下之側鏈保護基：精胺酸(Tos)、天冬胺酸(OcHex)、天冬醯胺酸(Xan)、半胱胺酸(pMeBz1)、麩胺酸(LcHex)、組胺酸(Boc)、離胺酸(2C1-Z)、絲胺酸(Bz1)、蘇胺酸(Bz1)、色胺酸(CHO)以及酪胺酸(2Br-Z)。利用20%哌定/二甲基甲醯胺處理完成的胜肽基樹脂，以移除色胺酸之甲醯基保護，然後轉移至HF反應容器中並於真空中乾燥。加入1.0毫升對甲酚及0.5毫升二甲基硫連同一磁石攪拌棒。將容器連接至HF裝置(Pennisu1a Labs)，於乾冰/甲醇浴中冷卻，抽真空，及凝結入大約10毫升之液態氟化氫。將反應於冰浴中攪拌1小時，然後於真空中移除HF。將殘留物懸浮於乙醚中；將固體過濾，以乙醚洗滌，且將胜肽萃取至50毫升乙酸水溶液中。利用分裂萃取物之小樣品進行分析HPLC[0.46x5cm Zorbax C8，1m1/min，45C，214nm，A緩衝液為0.1%TFA，B緩衝液為0.1%TFA/90%ACN，梯度=於10分鐘內10%B至80%B]。將剩餘的萃取物裝填於2.2x25公分Kromasi1C18製備型逆相管柱上，且使用PharmaciaFPLC系統執行乙腈梯度。收集5分鐘的溶離份，同時並監測214奈米處之UV(2.0A)。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%乙腈。梯度=於450分鐘內30%B至100%B。
將含有最純產物的溶離份(48-52)組合冰凍，且凍乾得30.1毫克。產物的HPLC分析顯示純度>90%，且MALDI質譜分析顯示3429.7之期望質量。類似地製備得胰高血糖素Cys21、胰高血糖素Cys24、及胰高血糖素Cys29。
例子2
胰高血糖素-Cex及其他羧基端延伸類似物之合成
將285毫克(0.2毫莫耳)甲氧二苯甲基胺(methoxybenzhydry1amine)樹脂(Midwest Biotech)置於60毫升反應容器中，且使用FastBocHBTU-活化之單一偶合劑於經修改的App1ied Biosystems430A胜肽合成儀上輸入並執行以下序列。
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS (SEQIDNO：36)
使用以下之側鏈保護基：精胺酸(Tos)、天冬胺酸(OcHex)、天冬醯胺酸(Xan)、半胱胺酸(pMeBz1)、麩胺酸(OcHex)、組胺酸(Boc)、離胺酸(2C1-Z)、絲胺酸(Bz1)、蘇胺酸(Bz1)、色胺酸(CHO)以及酪胺酸(2Br-Z)。利用20%哌定/二甲基甲醯胺處理完成的胜肽基樹脂，以移除色胺酸之甲醯基保護，然後轉移至HF反應容器中並於真空中乾燥。加入1.0毫升對甲酚及0.5毫升二甲基硫連同一磁石攪拌棒。將容器連接至HF裝置(Pennisu1aLabs)，於乾冰/甲醇浴中冷卻，抽真空，及凝結入大約10毫升之液態氟化氫。將反應於冰浴中攪拌1小時，然後於真空中移除HF。將殘留物懸浮於乙醚中；將固體過濾，以乙醚洗滌，且將胜肽萃取至50毫升乙酸水溶液中。對分裂萃取物之等分試樣進行分析HPLC[0.46x5cm Zorbax C8，1m1/min，45C，214nm，A緩衝液為0.1%TFA，B緩衝液為0.1%TFA/90%ACN，梯度=於10分鐘內10%B至80%B]。將萃取物裝填於2.2x25公分Kromasi1C18製備型逆相管柱上，且使用PharmaciaFPLC系統執行乙腈梯度以進行溶離。收集5分鐘的溶離份，同時並監測214奈米處之UV(2.0A)。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%乙腈。梯度=於450分鐘內30%B至100%B。將溶離份58-65組合，冰凍且凍乾得198.1毫克。
產物的HPLC分析顯示純度大於95%。MALDI質譜分析顯示存在作為羧基端醯胺產物之4316.7之期望理論質量。以經適當裝填之PAM樹脂開始，類似地製備得作為羧基端羧酸的調酸素及調酸素-KRNR。
例子3
胰高血糖素Cys17Ma1-聚乙二醇-5K
將15.1毫克之胰高血糖素Cys17(1-29)及27.3毫克之甲氧基聚(乙二醇)馬來醯亞胺平均M.W.5000(m聚乙二醇-M a1-5000，Nektar Therapeutics)溶解於3.5毫升之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，並加入0.5毫升之0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)。將反應於室溫下攪拌，並利用HPLC分析[0.46x5cm ZorbaxC8，1m1/min，45C，214nm(0.5A)，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=於10分鐘內10%B至80%B]監測反應之進行。
於5小時後，將反應混合物裝填於2.2x25公分Kromasi1C18製備型逆相管柱上。於 Pharmacia FPLC上執行乙腈梯度，同時並監測214奈米處之UV波長且收集5分鐘之溶離份。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%乙腈，梯度=於450分鐘內自30%B至100%B。將對應於產物的溶離份組合，冰凍且凍乾得25.9毫克。
於HPLC[0.46x5cm Zorbax C8，1m1/min，45C，214nm(0.5A)，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=於10分鐘內自10%B至80%B]上分析此產物，其顯示純度大約為90%。MALDI(基質輔助雷射脫附游離)質譜分析顯示8700至9500之寬廣質量範圍(聚乙二醇衍生物之典型值)。此顯示將大約5，000a.m.u添加至起始胰高血糖素胜肽(3429)之質量。
例子4
胰高血糖素Cys21Ma1-聚乙二醇-5K
將21.6毫克之胰高血糖素Cys21(1-29)及24毫克之m聚乙二醇-M AL-5000(Nektar Therapeutics)溶解於3.5毫升之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，並加入0.5毫升之0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)。將反應於室溫下攪拌。於2小時後，加入另一12.7毫克之m聚乙二醇-MAL-5000。於8小時後，將反應混合物裝填於2.2x25公分VydacC18製備型逆相管柱上，且於PharmaciaFPLC上於4毫升/分鐘下執行乙腈梯度，同時收集5分鐘之溶離份。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。梯度=於450分鐘內自20%至80%B。
將對應於出現產物的溶離份組合，冰凍且凍乾得34毫克。利用分析HPLC[0.46x5cm ZorbaxC8，1m1/min，45C，214nm(0.5A)，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=於10分鐘內自10%B至80%B]分析產物顯示不同於起始胰高血糖素胜肽的均勻產物。MALDI(基質輔助雷射脫附游離)質譜分析顯示8700至9700之寬廣質量範圍(聚乙二醇之典型值)。此顯示將大約5，000a.m.u加成至起始胰高血糖素胜肽(3470)之質量。
例子5
胰高血糖素Cys24Ma1-聚乙二醇-5K
在攪拌下將20.1毫克之胰高血糖素C24(1-29)及39.5毫克之m聚乙二醇-M a1-5000(Nektar Therapeutics)溶解於3.5毫升之PBS中，並加入0.5毫升之0.01M EDTA。將反應於室溫下攪拌7小時，然後加入另一40毫克之m聚乙二醇-Ma1-5000。於大約15小時後，將反應混合物裝填於2.2x25公分Vydac C18製備型逆相管柱上，且使用PharmaciaFPLC執行乙腈梯度。收集5分鐘之溶離份，同時並監測214奈米(2.0A)處之UV。A緩衝液=0.1%TFA，B緩衝液=0.1%TFA/50%ACN，梯度=於450分鐘內自30%B至100%B。將對應於產物的溶離份組合，冰凍且凍乾得45.8毫克。MALDI質譜分析顯示最大值位於9175.2(其大約比胰高血糖素C24(3457.8)多5，000a.m.u.)之典型的聚乙二醇寬信號。
例子6
胰高血糖素Cys24Ma1-聚乙二醇-20K
在室溫於攪拌下將25.7毫克之胰高血糖素Cys24(1-29)及40.7毫克之m聚乙二醇-M a1-20K(Nektar Therapeutics)溶解於3.5毫升之PBS中，並加入0.5毫升之0.01M EDTA。於6小時後，如利用HPLC所測得，起始物料對產物之比大約為60：40。加入另一25.1毫克之m聚乙二醇-Ma1-20K且使反應再多攪拌16小時。產物比率並未顯著地改善，因此將反應混合物裝填於2.2x25公分Kromasi1C18製備型逆相管柱上，且於Pharmacia FPLC上使用於450分鐘內自30%B 至100%B之梯度進行純化。A緩衝液=0.1%TFA，B緩衝液=0.1%TFA/50%ACN，流率=4毫升/分鐘，且收集5分鐘之溶離份同時並監測214奈米(2.0A)處之UV。將含有均勻產物的溶離份組合，冰凍且凍乾得25.7毫克。利用分析HPLC測得之純度為~90%。M ALDI質譜分析顯示自23，000至27，000之寬峰，其大約比起始胰高血糖素C24(3457.8)多20，000a.m.u.o
例子7
胰高血糖素Cys29Ma1-聚乙二醇-5K
在室溫於攪拌下將20.0毫克之胰高血糖素Cys29(1-29)及24.7毫克之m聚乙二醇-M a1-5000(Nektar Therapeutics)溶解於3.5毫升之PBS中，並加入0.5毫升之0.01M EDTA。於4小時後，加入另一15.6毫克之m聚乙二醇-Ma1-5000以驅使反應完全。於8小時後，將反應混合物裝填於2.2x25公分VydacC18製備型逆相管柱上，且於PharmaciaFPLC系統上執行乙腈梯度。收集5分鐘之溶離份，同時並監測214奈米(2.0A)處之UV。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將溶離份75-97組合，冰凍且凍乾得40.0毫克之不同於在HPLC上之回收起始材料(溶離份58-63)的產物。利用分析HPLC[0.46x5cmZorbax C8，1m1/min，45C，214nm(0.5A)，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=於10分鐘內自10%B至80%B]分析產物顯示純度大於95%。MALDI質譜分析顯示存在具8，000至10，000之質量範圍(最大值在9025.3)的聚乙二醇成分，其較起始物料(3484.8)大5，540a.m.u.。
例子8
胰高血糖素Cys24(2-丁內酯)
於24.7毫克之胰高血糖素Cys24(1-29)中加入4毫升之0.05M碳酸氫銨/50%乙腈及5.5微升(u1)之2-溴-4-羥基丁酸-γ-內酯之溶液(100微升於900微升乙腈中)。於在室溫下攪拌3小時後，將另一105微升之內酯溶液加至反應混合物，將其再多攪拌15小時。以10%乙酸水溶液將反應混合物稀釋至10毫升，並將其裝填於2.2x25公分Kromasi1C18製備型逆相管柱上。於PharmaciaFPLC上執行乙腈梯度(於450分鐘內自20%B至80%B)，同時收集5分鐘之溶離份並監測214奈米(2.0A)處之UV。流率=4毫升/分鐘，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將溶離份74-77組合，冰凍且凍乾得7.5毫克。HPLC分析顯示純度為95%，且MALDI質譜分析顯示3540.7之質量或較起始物料多84個質量單位。此結果與添加一單一之丁內酯部分一致。
例子9
胰高血糖素Cys24(S-羧甲基)
將18.1毫克之胰高血糖素Cys24(1-29)溶解於9.4毫升之0.1M磷酸鈉緩衝液(pH=9.2)中，並加入0.6毫升之溴乙酸溶液(1.3毫克/毫升於乙腈中)。將反應於室溫下攪拌並利用分析HPLC追蹤反應的進行。於1小時後，加入另一0.1毫升之溴乙酸溶液。將反應再多攪拌60分鐘，然後用乙酸水溶液酸化並裝填於2.1x25公分Kromasi1C18製備型逆相管柱上進行純。於 PharmaciaFPLC(流率=4毫升/分鐘)上執行乙腈梯度，同時收集5分鐘之溶離份並監測214奈米(2.0A)處之UV。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將溶離份26-29組合，冰凍且凍乾得數毫克之產物。
分析HPLC顯示純度為90%，且MALDI質譜分析確認3515之期望產物的質量。
例子10
胰高血糖素Cys24馬來醯亞胺基，聚乙二醇-3.4K-二聚體
將16毫克之胰高血糖素Cys24及1.02毫克之Ma1-聚乙二醇-Ma1-3400，聚(乙二醇)-雙-馬來醯亞胺平均M.W.3400(Nektar Therpeutics)溶解於3.5毫升之磷酸鹽緩衝鹽水及0.5毫升之0.01MEDTA中，並將反應於室溫下攪拌。於16小時後，加入另一16毫克之胰高血糖素Cys24並持續攪拌。於大約40小時後，將反應混合物裝填於Pharmcia PepRPC16/10管柱上，並於Pharmacia FPLC上執行乙腈梯度，同時收集2分鐘之溶離份並監測214奈米(2.0A)處之UV。流率=2毫升/分鐘，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將溶離份69-74組合，冰凍且凍乾得10.4毫克。分析HPLC顯示純度為90%，且M ALDI質譜分析顯示在9500-11，000範圍內之成分，其與期望的二聚體一致。
例子11
胰高血糖素內醯胺之合成
將285毫克(0.2毫莫耳)之甲氧二苯甲基胺樹脂(MidwestBiotech)加至60毫升之反應容器，且使用BocDEPBT-活化之單一偶合劑在經修改的App1ied Biosystems430A胜肽合成儀上組裝以下序列。
HSQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVQWLMNT-NH2(12-16內醯胺；SEQIDNO：12)
使用以下之側鏈保護基：精胺酸(Tos)、天冬胺酸(OcHx)、天冬醯胺酸(Xan)、麩胺酸(OFm)、組胺酸(BOM)、離胺酸(Fmoc)、絲胺酸(Bz1)、色胺酸(CHO)以及酪胺酸(2Br-Z)。若內醯胺係由16-20、20-24、或24-28所構成，則於第12號位置處使用離胺酸(C1-Z)。在旋轉下用20%哌定/二甲基甲醯胺將完成的胜肽基樹脂處理1小時，以移除色胺酸之甲醯基以及自離胺酸12及麩胺酸16移除Fmoc及OFm保護。當由陽性水合三酮(positive ninhydrin)試驗確認移除時，將樹脂先用二甲基甲醯胺，接著用二氯甲烷及隨後再次用二甲基甲醯胺洗滌。用存於二甲基甲醯胺及二異丙基乙基胺(DIEA)中之520毫克(1毫莫耳)苯并三-1-基-氧基-三-比咯烷基膦六氟磷酸鹽(PyBOP)處理樹脂。使反應進行8-10小時，且由陰性水合茚三酮反應確認環化。將樹脂先用二甲基甲醯胺，接著再用二氯甲烷洗滌，及隨後用三氟乙酸處理10分鐘。由陽性水合茚三酮反應確認Boc基團之移除。將樹脂用二甲基甲醯胺及二氯甲烷洗滌並乾燥，隨後再轉移至氫氟酸(HF)反應容器。加入500微升對甲酚連同一磁石攪拌棒。將容器連接至HF裝置(Peninsu1a Labs)，於乾冰/甲醇浴中冷卻，抽真空，及將大約10毫升之液態氫氟酸凝結至容器中。將反應於冰浴中攪拌1小時，隨後於真空中移除HF。將殘留物懸浮於乙醚中；將固體過濾，以乙醚洗滌，且將胜肽用150毫升之20%乙腈/1%乙酸溶解。
在下列條件[4.6X30mm Xterra C8，1.50mL/min，220nm，A緩衝液為0.1%TFA/10%ACN，B緩衝液為0.1%TFA/100%ACN，梯度為於15分鐘內5-95%B]下進行粗製溶解胜肽的分析性HPLC分析。將萃取液用水稀釋兩倍，且裝填於2.2X25公分Vydac C4製備型逆相管柱上，並於WatersHPLC系統上使用乙腈梯度溶離(A緩衝液為0.1%TFA/10%ACN，B緩衝液為0.1%TFA/10%ACN，及在15.00毫升/分鐘之流率下於120分鐘內0-100%B之梯度)。經純化胜肽之H PL C分析顯示純度大於95%，且電噴灑游離(e1ectrosprayionization)質譜分析確認12-16內醯胺之3506D a的質量。類似地製備來自16-20、20-24、及24-28的內醯胺。
例子12
胰高血糖素溶解度測定方法：
製備存於0.01NHC1中之胰高血糖素(或類似物)的溶液(1毫克/毫升或3毫克/毫升)。用0.01N HC1將100微升之儲存溶液稀釋至1毫升，並測定UV吸光度(276奈米)。使用200-250微升之0.1MNa2HPO4(pH9.2)將剩餘儲存溶液之pH調整至pH7o
使溶液於4℃下靜置隔夜然後離心。接著用0.01NHC1將100微升之上清液稀釋至1毫升，並測定UV吸光度(重複兩次)o
補償起始吸光度讀數之體積的增加，且使用以下計算於確定溶解度百分比：
結果顯示於表1，其中胰高血糖素-Cex代表野生型胰高血糖素(SEQIDNO：1)加上SEQIDNO：26之羧基端之添加且胰高血糖素-CexR12代表SEQIDNO：39。
表一胰高血糖素類似物之溶解度數據
例子13
胰高血糖素受體結合測定方法：
利用閃爍鄰近(scinti11ation proximity)測定技術於競爭結合測定方法中測量胜肽對胰高血糖素受體的親和力。將於閃爍鄰近測定緩衝液(0.05MTris-HC1，pH7.5，0.15MNaC1，0.1%w/v牛血清白蛋白)中製得之胜肽的連續3倍稀釋液於96孔白色/透明底盤(Corning Inc.，Acton，M A)中與0.05n M(3-[125I]-碘酪胺醯基)Tyr10胰高血糖素(A mershamBiosciences，Piscataway，NJ)(每孔1-6微克)、由過度表現人類胰高血糖素受體之細胞製備得之細胞質膜片段、及1毫克/孔之經聚乙烯亞胺處理之小麥胚芽凝集素(agg1utinin)A型閃爍鄰近測定珠粒(A mersham Biosciences，Piscataway，NJ)混合。當於旋轉搖盪器上在800rpm下搖盪5分鐘後，將盤置於室溫下培養12小時，然後於MicroBeta1450液體閃爍計數器(Perkin-E1mer，W e11es1ey，M A)上進行讀取。於具有較測試樣品中之最高濃度大4倍濃度之「冷」天然配體的孔中測量非特異結合(NSB)放射性，且於沒有競爭物的孔中偵測總結合放射性。特異結合百分比係計算如下：特異結合%=((結合-NSB)/(總結合-NSB))X100。IC50值係經由使用Origin軟體(OriginLab，Northampton，M A)而測得。
例子14
功能測定方法-cAMP合成
基於螢火蟲螢光素酶之報導測定方法中測量胰高血糖素類似物誘導cAMP的能力。經由於經補充0.25%牛生長血清(HyC1one，Logan，UT)之 D M E M(Invitrogen，Car1sbad，CA)中培養16小時，然後再用胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1或新穎胰高血糖素類似物之連續稀釋液於37℃，於96孔經塗布聚-D-離胺酸之「Biocoat」盤(BDBiosciences，SanJose，CA)中之5%CO2下培養5小時，而將經共轉染胰高血糖素受體或胰高血糖素樣肽-1受體之HEK293細胞及連接至cAMP反應單元之螢光素酶基因除去血清。於培養結束時，將100微升之LucLite發光基質試劑(Perkin-E1mer，W e11es1ey，M A)添加至各孔。短暫地搖晃該盤，於暗處培養10分鐘，並於MicroBeta-1450液體閃爍計數器(Perkin-E1m er，W e11es1ey，M A)上測量光輸出。經由使用Origin軟體(OriginLab，Northampton，M A)計算有效的50%濃度。結果顯示於圖3-9及表2至10中。
表2透過具羧基端延伸之胰高血糖素類似物之cAMP誘導
表3
透過經聚乙二醇化胰高血糖素類似物之cAMP誘導
表4
透過E16胰高血糖素類似物之cAMP誘導
表6
透過E16胰高血糖素類似物之cAMP誘導的EC50值
表8
透過E16胰高血糖素類似物之cAMP誘導的EC50值
當並行測試化合物時，E16G1ucNH2於胰高血糖素受體之效能相對於G16-COOH 及T16G1ucNH2多四倍。
例子15
胰高血糖素Cys-馬來醯亞胺基聚乙二醇類似物之穩定度測定方法
將各胰高血糖素類似物溶解於水或PBS中，並進行起始HPLC分析。於調整pH(4、5、6、7)後，將樣品於37℃下在指定的期間內培養，並再次利用HPLC分析以測定胜肽的完整性。測定特定相關胜肽之濃度，並相對於起始分析計算保持完整的百分比。關於胰高血糖素Cys21-馬來醯亞胺基聚乙二醇5K的結果示於圖1及2。
例子16
大致如上述例子1-11中所述，建構以下的胰高血糖素胜肽：在以下所有序列中，「a」係指羧基端醯胺。
其中在前述序列中，X1=(脫胺基)組胺酸
其中在前述序列中，X2=胺基異丁酸
其中在前述序列中，X2=(D-丙胺酸)
其中在前述序列中，X1=(脫胺基)組胺酸
其中在前述序列中，X2=胺基異丁酸
其中在前述序列中，X2=(D-丙胺酸)
其中在前述序列中，X1=(脫胺基)組胺酸；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中在前述序列中，X2=胺基異丁酸；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中在前述序列中，X2=(D-丙胺酸)；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中在前述序列中，X1=(脫胺基)組胺酸；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中在前述序列中，X2=胺基異丁酸；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中在前述序列中，X2=(D-丙胺酸)；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中，X1=(脫胺基)組胺酸；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中，X2=胺基異丁酸；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中，X2=(D-丙胺酸)；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中，X1=(脫胺基)組胺酸；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中，X2=(D-丙胺酸)；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中，X2=(D-丙胺酸)；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中在前述序列中，X1=(脫胺基)組胺酸
其中在前述序列中，X2=胺基異丁酸
其中在前述序列中，X2=(D-丙胺酸)
其中在前述序列中，X1=(脫胺基)組胺酸
其中在前述序列中，X2=胺基異丁酸
其中在前述序列中，X2=(D-丙胺酸)
亦大致如以上於實施例1-11中所述，構造以下具有約5或以上之胰高血糖素樣肽-1/胰高血糖素活性比的胰高血糖素胜肽。一般而言，在此等胜肽中，第2號位置之胺基異丁酸提供第四型雙胜肽蛋白水解酶抗性，但亦顯著地降低胰高血糖素活性。
其中在前述序列中，X2=胺基異丁酸；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中在前述序列中，X2=胺基異丁酸；且其中.C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
亦大致如上述例子1-11中所述，構造以下作為胰高血糖素樣肽-1/胰高血糖素共同促效劑的胰高血糖素胜肽。於第16與20胺基酸之間形成內醯胺架橋使因第2號位置處之取代所導致之胰高血糖素活性的降低恢復。
其中在前述序列中，X2=胺基異丁酸；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
PSSGAPPPSa(內醯胺@16-20；SEQID NO：513)
其中在前述序列中， X1=α，α-雙甲基咪乙酸(a1pha，a1pha-dimethy1imidiazo1e acetic acid，D MIA)；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
HSQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFIC*WLMNTa(視情況地具內醯胺＠16-20；SEQIDNO：514)其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中在前述序列中，X2=胺基異丁酸；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中在前述序列中， X1=α，α-雙甲基咪乙酸(a1pha，a1pha-dimethy1imidiazo1e acetic acid，D MIA)；且其中C*為半胱胺酸(Cys)，或連接至親水性聚合物之半胱胺酸，或者C*為連接至約20kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸，或者C*為連接至約40kD平均分子量之聚乙二醇的半胱胺酸。
其中X1=組胺酸、D-組胺酸、脫胺基組胺酸、羥基組胺酸、乙醯基組胺酸、同組胺酸、α，α-雙甲基咪乙酸(DMIA)、N-甲基組胺酸、α-甲基組胺酸、或咪乙酸(imidazo1eaceticacid)，X2=絲胺酸、D-絲胺酸、丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸或胺基異丁酸(AIB)、N-甲基丙胺酸以及D-丙胺酸。
X3=丙胺酸、麩醯胺酸或Cys-PEG。
X4=Thr-CONH2或Cys-PEG或GGPSSGAPPPS(SEQIDNO：515)或GGPSSGAPPPSC-PEG(SEQID NO：516)其限制條件為當X3為Cys-PEG，X4不為Cys-PEG或GGPSSGAPPPSC-PEG(SEQID NO：516)，及當X2=絲胺酸，X1不為組胺酸。X5=丙胺酸或精胺酸。
X1X2QGTFTSDYSKYLDEQX5AKEFIX3WLMNX4(SEQIDNO：62)其中X1=組胺酸、D-組胺酸、脫胺基組胺酸、羥基組胺酸、乙醯基組胺酸、同組胺酸、α，α-雙甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基組胺酸、α-甲基組胺酸、或咪唑乙酸(imidazo1eaceticacid)，X2=絲胺酸、D-絲胺酸、丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸或胺基異丁酸(AIB)、N-甲基丙胺酸以及D-丙胺酸。
X3=丙胺酸、麩醯胺酸或Cys-PEG。
X4=Thr-CONH2或Cys-PEG或GGPSSGAPPPS(SEQIDNO：515)或GGPSSGAPPPSC-PEG(SEQID NO：516)
其限制條件為當X3為Cys-PEG，X4不為Cys-PEG或GGPSSGAPPPSC-PEG(SEQID NO：516)，及當X2=絲胺酸，X1不為組胺酸。X5=丙胺酸或精胺酸。
HSEGTFTSDYSKYLDEQAAKEFIAW LXNTa(SEQIDNO：554)，其中第27號位置處之X為正白胺酸，其中第29號位置處之胺基酸經醯胺化。
任何前述之序列皆可包括額外的修飾，例如，1、2、3、4或5個不會破壞活性的修飾，包括但不限於，可用於增強效能的W10或R20取代。任何前述之序列亦可經製成為沒有賦予第四型雙胜肽蛋白水解酶抗性的修飾，即其中天然組胺酸係位於第1號位置且天然絲胺酸係位於第2號位置。此外，任何前述之化合物可視情況鍵聯至一結合物，諸如異源多肽、免疫球蛋白或其之一部分(例如，Fc區域)、標靶試劑、診斷標記、或診斷或治療劑。
例子17
大致如上述例子1-11中，構造以下經修飾成包含連接至胰高血糖素胜肽之羧基端之SEQIDNO：26之羧基端延伸的胰高血糖素胜肽，並使用例子14中所述之體外測定方法測定對胰高血糖素樣肽-1及胰高血糖素受體之活性。
表11顯現各種胰高血糖素類似物對胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體的活性。數據顯示對於包含SEQIDNO：26之羧基端延伸的胰高血糖素類似物，第16、20、28及29號位置處之胺基酸取代會影響對胰高血糖素樣肽-1受體的類似物活性。
表11
胰高血糖素-Cex
結構活性關係
例子18
表12顯現各種胰高血糖素類似物對胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體的體外活性數據。
例子19
如下製備經醯基化及/或聚乙二醇化之胜肽。使用CSBiO4886胜太合成儀或App1ied Biosystems430A胜肽合成儀於固態載體樹脂上合成胜肽。使用如Schno1zer等人，Int.J.Peptide Protein Res.40：180-193(1992)所述之原位中和化學。對於經醯基化胜肽，以Nε-FMOC離胺酸殘基取代待醯基化的目標胺基酸殘基(例如，第10號位置)。以於DMF中之20%哌定將完成的胺基端受BOC保護之胜肽處理30分鐘而移除FMOC/甲醯基。經由於DMF/DIEA中偶合十倍莫耳過量的受FMOC保護之間隔物胺基酸(例如FMOC-(N-BOC)-色胺酸-OH)或醯基鏈(例如C17-COOH)及PyBOP或DEPBT偶合試劑，而達成對自由ε-胺基離胺酸殘基的偶合。在移除間隔物胺基酸之FMOC基之後，接著再重複用醯基鏈偶合。最後用100%TFA處理導致移除任何的側鏈保護基及N-端BOC基。將胜肽樹脂用5%DIEA/DMF中和，乾燥，然後使用HF/對甲酚(95：5)在0℃下自載體分裂歷時1小時。於乙醚萃取後，使用5%HOAc溶液於將粗製胜肽溶劑合。然後利用ESI-MS確認溶液樣品包含正確分子量的胜肽。利用RP-HPLC使用10%CH3CN/0.1%TFA至0.1%TFA 於100%CH3CN中之線性梯度純化正確的胜肽。使用Vydac C1822毫米x 250毫米蛋白質管柱來進行純化。經醯基化的胜肽類似物一般係藉由20:80之緩衝比完成溶離。將溶離份匯集在一起並利用分析性RP-HPLC檢查純度。將純溶離份凍乾得白色固體胜肽。產量典型上視合成法而在10毫克至100毫克範圍內。
若胜肽包含內醯胺架橋及待醯基化的目標殘基，則醯基化係如前所述在將該胺基酸添加至胜肽主鏈之後進行。
對於胜肽聚乙二醇化，使用將胜肽及聚乙二醇兩者溶解成澄清溶液所需之最少量的溶劑(對於使用2-3毫克胜肽之反應一般低於2毫升)使40kDa甲氧基聚(乙二醇)馬來醯亞胺基-丙醯胺(Chirotech Techno1ogy Ltd.)與莫耳當量的胜肽於7M尿素、50m M Tris-HC1緩衝劑中反應。開始在室溫下劇烈攪拌4-6小時，且利用分析性RP-HPLC分析反應。經聚乙二醇化之產物由於減少的滯留時間而明顯不同於起始材料。於VydacC4管柱上利用與起始胜肽純化所用者類似的條件進行純化。溶離係在50：50的緩衝比附近發生。發現純的經聚乙二醇化胜肽之溶離份並凍乾。產率高於50%，依據反應而異。
經由將HEK293細胞共轉染胰高血糖素受體(GLUR)或胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)及連接至cAMP反應單元之螢光素酶基因，而測定胜肽的生物活性。經轉染的細胞經由於經補充0.25%牛生長血清之DMEM中培養16小時，然後分別利用選定類似物及作為標準之胰高血糖素或胰高血糖素樣肽-1之連續稀釋液培育5小時，而除去血清。於Genesys 6光譜光度計(Thermo E1ectron Corporation)上自280奈米處之UV吸光度測量值獲得胜肽吸光度讀數。使用比爾定律(Beer，sLaw)來基於各類似物中之色胺酸及酪胺酸之數目計算溶液濃度。於培養結束時，將100微升之LucLite發光基質試劑添加至各孔，將盤密封並振搖，且置於W a11ac Tri1ux發光計數器中進行cA MP偵測。使用Origin軟體(OriginLab，Northampton，M A)計算有效的50%濃度(EC50)。
製備基於經醯基化胰高血糖素的共同促效劑胜肽。此等胜肽的體外結果之集合顯示於表13。雖然未經醯基化胜肽如同天然胰高血糖素不可以1毫克/毫升濃度溶於磷酸鹽緩衝鹽水溶液中，但觀察到醯基化可在中性pH下增強胜肽之溶解度。
所有四種經醯基化胜肽皆對胰高血糖素樣肽-1受體呈現提高的效能。包含色胺酸間隔物對胰高血糖素受體提供較佳的效能。C18之醯基鏈長度稍佳。
雖然醯基化可使胜肽之半衰期延長至數小時或以上，但具有在數十kDa範圍內之重複之聚乙二醇化的效果甚至更大。製備包含兩種類型修飾之胜肽。預期此等胜肽呈現延長的循環半衰期，以及對第四型雙胜肽蛋白水解酶及其他蛋白酶之抗性。此等胜肽的體外結果之集合顯示於表14。
三種胜肽中之兩種維持其對胰高血糖素樣肽-1及胰高血糖素受體兩者的高效能，其具有低於1nM之EC50。K10-W-C18經醯基化及聚乙二醇化之胜肽於兩受體呈現約十倍的效能損失。此系列的胜肽顯示第10號位置醯基化與胰高血糖素胜肽之羧基端部分(例如，第24、28或29號位置)、羧基端延伸內、或羧基端處的聚乙二醇化相容(例如，透過添加羧基端半胱胺酸)。
例子20
基本上如例子19所述製得各種經醯基化的胰高血糖素共同促效劑胜肽並測試活體內活性。明確言之，胜肽A(經修飾成包含第2號位置之胺基異丁酸、第16號位置之麩胺酸、第17號位置之麩醯胺酸、第18號位置之丙胺酸、第20號位置之離胺酸、第21號位置之麩胺酸、第23號位置之異白胺酸、第24號位置之半胱胺酸(該半胱胺酸係鍵結至40K聚乙二醇)、及羧基端醯胺的SEQIDNO：1)經進一步修飾成包含第10號位置之離胺酸。離胺酸10係經C8脂肪酸鏈、C14脂肪酸鏈、C16脂肪酸鏈、或C18脂肪酸鏈醯基化。
如例子14所述測定各經醯基化胜肽對胰高血糖素樣肽-1受體之活性且與作為控制組之胰高血糖素樣肽-1(7-37)酸(SEQIDNO：50)的活性作比較。表15所顯示之各經醯基化胜肽對胰高血糖素樣肽-1受體的EC50與胰高血糖素樣肽-1胜肽的EC50相似。
然後經由飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠皮下注射各種經醯基化及未經醯基化胜肽，或僅賦形劑，QW(70奈莫耳/公斤/週)歷時兩週，而於活體內測試胜肽。測試每組6隻具有44克初始平均體重之老鼠。定期測定體重、體組成、食物攝取量、及血糖值。
如圖11所示，經醯基化胜肽可導致與未經醯基化胜肽相似程度的重量減輕。如圖11所示，在用經醯基化胜肽治療的前三天內達成介於約7及12%間的重量減輕。如圖12所示，經醯基化胜肽導致食物攝取量減少。此外，如圖13所示，經醯基化胜肽的任意血糖值於治療1天後降低。
例子21
基本上如例子19所述製得以下的經醯基化胰高血糖素共同促效劑胜肽。
(A)‘‘嵌合物-2Aib2Lys10-C18Cys24(40K)”：包含下列修飾之天然胰高血糖素胺基酸序列(SEQIDNO：1)：第16號位置之麩胺酸、第17號位置之麩醯胺酸、第18號位置之丙胺酸、第20號位置之離胺酸、第21號位置之麩胺酸、第23號位置之異白胺酸、第24號位置之丙胺酸及羧基端醯胺(「嵌合物2」)，其進一步經修飾為具有第2號位置之胺基異丁酸、經C18脂肪酸醯基化之離胺酸10及第24號位置之處經40K聚乙二醇基團聚乙二醇化之半胱胺酸；(B)‘‘嵌合物-2Aib2Lys10-C16Cys24(40K)”：嵌合物2進一步經修飾為具有第2號位置之胺基異丁酸、經C16脂肪酸醯基化之離胺酸10及經40K聚乙二醇基團聚乙二醇化之半胱胺酸24；(C)‘‘胰高血糖素Lys10-C18E16K20 Cys24(40K)”：包含以下修飾的天然胰高血糖素胺基酸序列(SEQIDNO：1)：第16號位置之麩胺酸、第20號位置之離胺酸、及羧基端醯胺(「E16K20-胰高血糖素-NH2」)進一步經修飾成具有經C18脂肪酸醯基化之離胺酸10及經40K聚乙二醇基團聚乙二醇化之半胱胺酸24；(D)‘‘胰高血糖素 Lys10-TrpC16 E16 K20Cys24(40K)”：E16K20-胰高血糖素-NH2進一步經修飾為具有連接至經C16脂肪酸醯基化之色胺酸間隔物的離胺酸10；(E)‘‘胰高血糖素 Lys10-TrpC18 E16 K20Cys24(40K)”：E16K20-胰高血糖素-NH2進一步經修飾為具有連接至經C18脂肪酸醯基化之色胺酸間隔物的離胺酸10。
大致如例子14所述測試經醯基化之胰高血糖素共同促效劑胜肽於胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體的活性。對各胰高血糖素受體及胰高血糖素樣肽-1受體之EC50與控制組(GLP-1(7-37)OH(胰高血糖素樣肽-1之胺基酸7-37)、胰高血糖素(1-29)OH(SEQID NO：1)、及嵌合物2Cys24(40K)(具有位於Cys24之40K聚乙二醇的嵌合物2))的比較如表16所。
表16
例子22
基本上如例子19所述製得以下的經醯基化胰高血糖素共同促效劑胜肽：(A)胜肽A：包含以下修飾的天然胰高血糖素胺基酸序列(SEQIDNO：1)：包含以下修飾的天然胰高血糖素胺基酸序列(SEQIDNO：1)：第16號位置之麩胺酸、第20號位置之離胺酸、及羧基端醯胺(「E16K20-胰高血糖素-NH2」)；(B)胜肽B：進一步包含經C16脂肪酸醯基化之離胺酸10的E16K20-胰高血糖素-NH2；(C)胜肽C：進一步包含經C18脂肪酸醯基化之離胺酸10的E16K20-胰高血糖素-NH2；(D)胜肽D：進一步包含連接至經C16脂肪酸醯基化之麩胺酸(間隔物殘基)之離胺酸10的E16K20-胰高血糖素-NH2；(E)胜肽E：進一步包含連接至經C18脂肪酸醯基化之色胺酸(間隔物殘基)之離胺酸10的E16K20-胰高血糖素-NH2。
大致根據例子14測定胜肽之活性且於各胰高血糖素受體及胰高血糖素樣肽-1受體之EC50顯示於表17。
例子23
製得包含SEQIDNO：1之胺基酸序列與以下修飾的胰高血糖素共同促效劑胜肽：第16號位置之麩胺酸、第17號位置之麩醯胺酸、第18號位置之丙胺酸、第20號位置之離胺酸、第21號位置之麩胺酸、第23號位置之異白胺酸、第24號位置之丙胺酸、第27號位置之纈胺酸、第28號位置之離胺酸及羧基端醯胺(「嵌合物1」)。經由將嵌合物1之第29號位置之胺基酸刪除(「Chi1(1-28)」)，或經由將嵌合物1之第28及29號位置處之胺基酸刪除(「Chi1(1-27)」)，而製得羧基端截斷形式的嵌合物1。
包含SEQIDNO：1之胺基酸序列與以下修飾的胰高血糖素胜肽：第16號位置之麩胺酸，亦經由將第29號位置處之胺基酸刪除(「E16G1ucNH2(1-28)」)，或經由將第28及29號位置處之胺基酸刪除(「E16G1ucNH2(1-27)」)，而將羧基端醯胺(「E16G1uc-NH2」)羧基端截斷。
大致根據例子14測定經截斷胜肽以及未經截斷胜肽於胰高血糖素受體及胰高血糖素樣肽-1受體之活性的功能活性。刪除E16G1ucNH2胜肽或嵌合物1胜肽之第28及29號位置處之胺基酸不會顯著地影響胜肽於胰高血糖素受體之活性。刪除E16G1ucNH2之第28及29號位置處之胺基酸不會明顯改變胜肽於胰高血糖素樣肽-1受體的效能。刪除嵌合物1之第28及29號位置處之胺基酸不會影響其對胰高血糖素樣肽-1受體的活性。
刪除嵌合物1胜肽或E16G1ucNH2胜肽之第29號位置處之胺基酸不會顯著地影響於胰高血糖素受體或胰高血糖素樣肽-1受體的活性。
例子24
於-15分鐘時間點時飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠經腹膜內注射0.2、2、20、或70奈莫耳/公斤之下列中之一者：(A)僅賦形劑，(B)包含下列修飾之天然胰高血糖素胺基酸序列(SEQIDNO：1)：第16號位置之麩胺酸、第17號位置之麩醯胺酸、第18號位置之丙胺酸、第20號位置之離胺酸、第21號位置之麩胺酸、第23號位置之異白胺酸、第24號位置之丙胺酸及羧基端醯胺(「嵌合物2」)，其進一步經修飾為具有第2號位置之胺基異丁酸、第24號位置之半胱胺酸，該半胱胺酸係經40K聚乙二醇聚乙二醇化(「嵌合物-2-AIB2Cys24-40kD」)，(C)進一步經修飾為包含第2號位置之胺基異丁酸、第10號位置之離胺酸(該離胺酸係經C8脂肪酸醯基化)、及第24號位置之半胱胺酸(該半胱胺酸係經40K聚乙二醇聚乙二醇化)(「嵌合物-2AIB2K10-C8Cys24-40kD」)，或(D)進一步經修飾為包含第2號位置之胺基異丁酸、第10號位置之離胺酸(該離胺酸係經C16脂肪酸醯基化)、及第24號位置之半胱胺酸(該半胱胺酸係經40K聚乙二醇聚乙二醇化)(「嵌合物-2AIB2K10-C16Cys24-40kD」)。
於0分鐘時間點時以1.5克/公斤之劑量注射包含25%(v/v)葡萄糖的鹽水溶液。血糖值於第-15、0、15、30、60及120分鐘時間點測量。
圖15-17分別顯示於指示時間點時注射2、20、及70奈莫耳/公斤之老鼠的血糖值(mg/dL)。對於所有測試劑量，嵌合物-2AIB2K10-C8Cys24-40kD於老鼠中展現最大的降低血糖能力。如圖17所示，此胜肽具有與嵌合物-2-AIB2Cys24-40kD相似的活性。
例子25
於-24小時時間點時對DIO小鼠經腹膜內注射70奈莫耳/公斤之下列中之一者：(A)僅賦形劑，(B)如上述例子24中之嵌合物-2-AIB2Cys24-40kD，(C)如上述例子24中之嵌合物-2AIB2K10-C8Cys24-40kD，或(D)如上述例子24中之嵌合物-2AIB2K10-C16Cys24-40kD。
於0分鐘時間點時以1.5克/公斤體重之劑量注射包含25%(v/v)葡萄糖的鹽水溶液。於0、15、30、60、及120分鐘時間點時測量血糖值。
圖18展現於指示時間點時之老鼠的血糖值(mg/dL)。所有三種胜肽皆對降低老鼠之血糖展現顯著的活性。
例子26
對DIO老鼠經腹膜內注射僅賦形劑或15或70奈莫耳/公斤之下列中之一者：(A)如上述例子24中之嵌合物-2-AIB2Cys24-40kD，(B)如上述例子24中之嵌合物-2AIB2K10-C8Cys24-40kD，或(C)如上述例子24中之嵌合物-2AIB2K10-C16Cys24-40kD。
於注射前及於注射後1、3、5、及7天測量體重。
圖19展現各組老鼠的體重變化%。於兩者測試劑量下，嵌合物-2AIB2K10-C8Cys24-40kD及嵌合物-2AIB2Cys24-40kD展現相當的降低體重能力。在較高測試劑量下，嵌合物-2AIB2K10-C16Cys24-40kD展現顯著的降低體重能力。
例子27
基本上如上述合成得包含第1號位置處之酪胺酸及E16與K20間之內醯胺架橋(及替代羧基端羧酸酯之醯胺)之SEQIDNO：555的胜肽，且根據例子14於體外測試對胰高血糖素樣肽-1及胰高血糖素受體之活性。胜肽對各受體之EC50顯示於表18。
表18
相對活性係相對於指示受體之天然激素的活性。
基於此等數據，經判定SEQIDNO：555之胜肽為例示的胰高血糖素/胰高血糖素樣肽-1共同促效劑胜肽。
例子28
基本上如上述合成得SEQIDNO：1之胜肽(胰高血糖素(1-29))、具有取代羧基端羧酸酯之醯胺之SEQIDNO：1之胜肽(胰高血糖素(1-29a))、及具有在第2號位置及第16號位置各者處之胺基異丁酸及取代羧基端羧酸酯之醯胺之SEQIDNO：1之胜肽(胰高血糖素(1-29a)Aib2Aib16)。接著利用例子14所述之方法於體外測試此等胜肽於胰高血糖素樣肽-1受體及胰高血糖素受體之活性。各胜肽之EC50顯示於表19。
例子29
基本上如上述合成得以下胜肽：(1)如上述例子28中之胰高血糖素(1-29)，(2)胰高血糖素(1-29a)Aib2Aib16(如例子28中所述)，具有第24號位置處之半胱胺酸及共價鍵結至包含C16脂肪酸之色胺酸之第10號位置處之離胺酸(「胰高血糖素(1-29a)Aib2Lys10-Trp-C16Aib16Cys24」)，(3)胰高血糖素(1-29a)Aib2Lys10-Trp-C16Aib16Cys24，其中該半胱胺酸包含40kD聚乙二醇基團(「胰高血糖素(1-29a)Aib2Lys10-Trp-C16Aib16Cys24-40kD」)，(4)胰高血糖素(1-29a)Aib2Lys10-Trp-C16Aib16Cys24，包含於第20號位置之胺基異丁酸(「胰高血糖素(1-29a)Aib2Lys10-Trp-C16Aib16Aib20 Cys24」)，以及(5)胰高血糖素(1-29a)Aib2Lys10-Trp-C16Aib16Aib20Cys24，其中該半胱胺酸包含40kD聚乙二醇基團(「胰高血糖 素(1-29a)Aib2 Lys10-Trp-C16 Aib16 Aib20Cys24-40kD」)。
接著利用例子14之方法於體外測試此等胜肽於胰高血糖素樣肽-1受體及胰高血糖素受體之活性。各胜肽之EC50顯示於表20。
例子30
於飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠中測試經醯基化及經聚乙二醇化胰高血糖素胜肽之活體內作用。具體地說，將6組飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠(每組8隻老鼠)(各組具有58克之平均初始體重)以腹膜內注射10、20、40、或80奈莫耳/公斤之經醯基化及經聚乙二醇化胰高血糖素胜肽或一賦形劑控制組，每週一次歷時2週。用於研究之經醯基化及經聚乙二醇化胰高血糖素胜肽為嵌合物-2AIB2K10-C8Cys24-40kD(如例子26中所述)及胜肽A K10-C14(如例子20中所述)。
於注射後0、1、3、5、7、8、10、12、及14天測量老鼠的體重變化及食物攝取量。在整個14天期間內監測老鼠的血糖值。藉由在施予經醯基化或經聚乙二醇化胜肽後1小時或24小時注射存於鹽水溶液中之25%葡萄糖而進行葡萄糖耐受性試驗，且於葡萄糖注射後之-60、0、15、30、60、或120分鐘測量血糖值。
如圖20所示，經注射40或80奈莫耳/公斤之經醯基化及經聚乙二醇化胜肽AK10-C14之老鼠的總體重相較於經注射賦形劑控制組之老鼠降低。
如圖21所示，經注射20、40或80奈莫耳/公斤之胜肽AK10-C14或20奈莫耳/公斤之嵌合物-2AIB2K10-C8Cys24-40kD之老鼠反應葡萄糖注射的血糖值相較於賦形劑控制組降低。
例子31
經由固相合成製得包含或缺少一共價性分子內架橋之經醯基化的胰高血糖素類似物胜肽，且測試於胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體之體外活性。對各受體之EC50(nM)及胜肽於相關受體相對於天然胜肽之活性%顯示於表21。
基本上如本文所述製得數種缺少共價性分子內架橋且包含第2號位置處之胺基異丁酸(AIB)、第16號位置處之胺基異丁酸(AIB)、及透過間隔物連接至第10號位置處之離胺酸殘基之脂肪醯基的胰高血糖素類似物。經醯基化胰高血糖素類似物的差異在於間隔物之類型、是否存在聚乙二醇化、及/或醯基之大小。基本上如例子14所述測試經醯基化之胰高血糖素類似物對胰高血糖素受體及胰高血糖素樣肽-1受體的體外活性。各胜肽之結構及於胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體之體外活性的概述顯示於表22及23。
胺酸)其中該半胱胺酸共價性連接至一PEG分子。
如表22及23所示，包含透過間隔物連接之脂肪醯基之胜肽相較於包含直接連接至胜肽主鏈之脂肪醯基之胜肽顯著地提高其效能。
例子32
將各具有48.7克平均體重之DIO老鼠(每組8隻老鼠)每天皮下注射單一賦形劑、30奈莫耳/公斤或100奈莫耳/公斤之經醯基化胰高血糖素類似物胜肽、或長效型胰高血糖素樣肽-1類似物里拉盧的胜肽(Lirag1utide)(N ovoNordisk，Denmark)歷時七天。經醯基化胰高血糖素類似物係如下：「(C16)胰高血糖素醯胺」包含野生型胰高血糖素(SEQIDNO：1)之胺基酸序列，其中第10號位置處之酪胺酸經修飾成經醯基化的離胺酸殘基，其中該經醯基化離胺酸包含C16脂肪醯基，且羧基端羧酸酯經醯胺基取代； 「γE-γE-C16胰高血糖素醯胺」包含C16胰高血糖素醯胺之相同結構，僅除了C16脂肪醯基係透過γG1u-γG1u雙肽間隔物連接至第10號位置處之離胺酸(見以下經醯基化離胺酸之結構)；
「AA-C16胰高血糖素醯胺」包含C16胰高血糖素醯胺之相同結構，僅除了C16脂肪醯基係透過丙胺酸-丙胺酸雙肽間隔物連接至第10號位置處之離胺酸；以及「βAβA-C16胰高血糖素醯胺」包含C16胰高血糖素醯胺之相同結構，僅除了C16脂肪醯基係透過β-丙胺酸-β-丙胺酸雙肽間隔物連接至第10號位置處之離胺酸。
每天監測老鼠的體重且體重總變化(%)顯示於圖22。如圖22所示，在各劑量下之大部分的經醯基化胰高血糖素胜肽皆導致體重減輕。雖然里拉盧的胜肽展現大約12%的體重減低，但胰高血糖素類似物胜肽γE-γE-C16胰高血糖素醯胺於老鼠中在配合劑量下顯現最大的導致體重減輕能力。即使係較低劑量的γE-γE-C16胰高血糖素醯胺亦可導致體重的實質減低。
於研究的第7天測量老鼠的脂肪質量。如圖23所示，經施予100奈莫耳/公斤γE-γE-C16胰高血糖素醯胺之老鼠顯現最低的脂肪質量。
亦於測定過程期間監測老鼠的血糖值。如圖24所示，較高劑量下的胰高血糖素類似物胜肽γE-γE-C16胰高血糖素醯胺以及里拉盧的胜肽可有效地於老鼠中減低血糖值。
例子33
如下評估具有胰高血糖素樣肽-1活性之胰高血糖素類似物胜肽的醯基化。將包含嵌合物2之結構與第2號位置處之胺基異丁酸及第24號位置處之半胱胺酸的未經醯基化胰高血糖素類似物胜肽(包含40kDa聚乙二醇分子)修飾成包含第10號位置處之經醯基化的離胺酸殘基。未經醯基化胰高血糖素類似物胜肽包含SEQIDNO：580之胺基酸序列。第10號 位置之離胺酸係經C8、C14、C16、或C18脂肪醯基醯基化，且經醯基化胜肽分別包含SEQIDNO：534-537之結構。基本上如本文所述測試未經醯基化胜肽及其經醯基化形式於胰高血糖素樣肽-1受體的體外活性。各胜肽對胰高血糖素樣肽-1受體的EC50顯示於表24。
例子34
如文中所述經由固相胜肽合成製得胰高血糖素類似物胜肽，且於胜肽的第10號或30號位置處醯基化。胜肽及其結構如下：「胜肽dS2E16K20K30-C14 G1uc醯胺」 包含HXQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVQWLMNTK-醯胺(SEQIDNO：581)之胺基酸序列，其中第2號位置之X為d-絲胺酸，其中第30號位置之離胺酸係經C14脂肪醯基醯基化，且羧基端羧酸酯取代為一醯胺；「胜肽 dS2K10(C14)E16K20-G1uc醯胺」 包含HXQGTFTSDKSKYLDERRAKDFVQWLMNT-醯胺(SEQIDNO：582)之胺基酸序列；其中第2號位置之X為d-絲胺酸，其中第10號位置之離胺酸係經C14脂肪醯基醯基化，且羧基端羧酸酯取代為一醯胺；「胜肽 dS2E16K20K30-C16G1uc醯胺」 包含HXQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVQWLMNTK-醯胺(SEQIDNO：583)之胺基酸序列，其中第2號位置之X為d-絲胺酸，其中第30號位置之離胺酸係經C16脂肪醯基醯基化，且羧基端羧酸酯取代為一醯胺；「胜肽 dS2K10(C16)E16K20-G1uc醯胺」 包含HXQGTFTSDKSKYLDERRAKDFVQWLMNT-醯胺(SEQIDNO：584)之胺基酸序列，其中第2號位置之X為d-絲胺酸，其中第10號位置之離胺酸係經C16脂肪醯基醯基化，且羧基端羧酸酯取代為一醯胺；「胜肽嵌合物 2-AIB2-K10-醯基化」 包含HXQGTFTSDKSKYLDEQAAKEFICWLMNT-醯胺(SEQIDNO：585)之胺基酸序列；其中第2號位置之X為胺基異丁酸，第10號位置之K係經C18脂肪醯基醯基化，第24號位置之半胱胺酸包含40kDa聚乙二醇分子，且羧基端羧酸酯取代為一醯胺；以及「胜肽嵌合物 2-AIB2-K30-醯基化」 包含HXQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNTK-醯胺(SEQIDNO：586)之胺基酸序列；其中第2號位置之X為胺基異丁酸，第10號位置之K係經C18脂肪醯基醯基化，第24號位置之半胱胺酸包含40kDa聚乙二醇分子，且羧基端羧酸酯取代為一醯胺。
基本上如例子14所述測試各胜肽於胰高血糖素樣肽-1受體及胰高血糖素受體的體外活性。結果顯示於表25。
例子35
使用固相胜肽合成於組裝序列XSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVCWLMNT-NH2， 其中X=DMIA(SEQIDNO：587)。
於選擇性去保護第16號位置之麩胺酸及第20號位置之離胺酸後，透過樹脂上之內醯胺架橋使胜肽環化。然後藉由製備型RP-HPLC純化於分裂後的粗製胜肽且以MS定性([M+H]之計算值：3479.9；實測值3480.9)。經由在室溫下將胜肽前驅物及碘乙醯基-官能化40kDa聚乙二醇(NOF)(1：1)於7M尿素/50mMTris緩衝液(pH8.5)中混合45分鐘進行聚乙二醇化，而於胜肽之聚乙二醇與半胱胺酸間形成共價硫醚鍵，如下所示
藉由製備型HPLC純化經聚乙二醇之胜肽，且收集期望的溶離份並凍乾而得灰白色粉末。產物經MALDI-TOF-MS(44000-46000，寬峰)確認。
基本上如例子14所述測試對胰高血糖素樣肽-1受體及胰高血糖素受體的體外活性。於胰高血糖素樣肽-1受體及胰高血糖素受體的EC50分別為0.327nM及0.042nM。
例子36
使用固相胜肽合成於製備胜肽前驅物HXEGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNT-NH2，其中X=胺基異丁酸(AIB)(SEQID NO：589)。然後藉由製備型RP-HPLC純化粗製胜肽且以MS定性([M+H]之計算值：3412.8；實測值3413.9)。經由在室溫下將胜肽前驅物及碘乙醯基-官能化40kDa聚乙二醇(NOF)(1：1)於7M尿素/50mMTris緩衝液(pH8.5)中混合45分鐘進行聚乙二醇化，而於胜肽之聚乙二醇與半胱胺酸間形成共價硫醚鍵，如下所示
藉由製備型HPLC純化經聚乙二醇之胜肽，且收集期望的溶離份並凍乾而得灰白色粉末。產物經MALDI-TOF-MS(44000-46000，寬峰)確認。
基本上如例子14所述測試對胰高血糖素樣肽-1受體及胰高血糖素受體的體外活性。於胰高血糖素樣肽-1受體及胰高血糖素受體的EC50分別為0.027nM及33nM。
例子37
基本上如本文所述經由固相胜肽合成製得以下包含胜肽 JHS-X-GTFTSDYSKYLDTRRAAEFVAWL(N1e)DE(SEQID NO：591) 或 胜 肽KHS-X-GTFTSDYSKYLD(Aib)RRAADFVAWLMDE(SEQIDNO：592)之主鏈，與第3號位置之額外修飾的胰高血糖素類似物胜肽。
基本上如例子14所述測試胜肽於胰高血糖素受體的體外活性。各胜肽的EC50(nM)顯示於表26。
表26
Q=麩醯胺酸；C(Acm)=乙醯胺甲基-半胱胺酸；Dab(Ac)=乙醯二胺基丁酸；Dap(脲)=胺甲醯二胺基丙酸；Q(Me)=甲基麩醯胺酸；M(O)=甲硫胺酸-亞碸；Orn(Ac)=乙醯鳥胺酸。
如表26所示，多種胺基酸可位於第3號位置，而不會有對胰高血糖素受體之活性的實質損失，且在一些情況中，修飾實際上提高活性，例如，在胜肽K主鏈上的Dab(Ac)及Q(Me)。
例子38
基本上如本文所述製得包含在各種胰高血糖素類似物主鏈上之第3號位置之Dab(Ac)的胰高血糖素類似物胜肽，並測試對胰高血糖素受體的體外活性。各胜肽的結構及活性顯示於表27。
例子39
基本上如本文所述製得包含SEQIDNO：1與第2號及第16號位置處之胺基異丁酸(AIB)、第10號位置之離胺酸的第一胰高血糖素類似物胜肽(AIB2，AIB16，K10(C16)G1uc醯胺)，其中第10號位置處之離胺酸係共價連接至C16脂肪醯基，且以醯胺取代羧基端羧酸酯。
第二胰高血糖素類似物胜肽(AIB2，AIB16，K10(C16)，K30 G1uc醯胺)具有與第一胰高血糖素類似物胜肽相同的結構，僅除了將離胺酸添加至羧基端。
基本上如例子14所述測試胜肽的體外活性，且額外於包含20%人類血漿的溶液中進行測試。胜肽對各受體的EC50(nM)顯示於表28。
例子40
瘦體素之發現證明存在調節能量平衡及身體肥胖症的內分泌系統。亦於肥胖研究中吸取關注及投資來作為找出管理已成為全球流行病之環境及藥理途徑的手段。尚未出現對於肥胖症之充分有效且安全的藥物治療法，而外科手術成為維持減重之唯一經證實的選擇。此處據報告於兩內分泌激素受體之受體促效作用的組合效能可於單一胜肽的長期作用期間達成有效的弓發飽足及脂肪分解作用。於嚙齒動物肥胖模型中對兩種於GLP1-R具有與天然胰高血糖素樣肽-1相當之活性，但互相不同處在於其之胰高血糖素受體促效作用程度的特定胰高血糖素類似物。每週施予一次此等選自一系列具不同胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1活性之高效能類似物之經聚乙二醇化胜肽在一個月內使飲食誘導肥胖老鼠(平均體重約50克)的肥胖及葡萄糖耐受性程度回歸正常。體重減輕係由減少食物攝取量及增加能量消耗所導致之體脂損耗的結果，其隨胰高血糖素受體促效作用程度的增加而增加。此等共同促效劑化合物亦使包括脂肪肝之葡萄糖及脂質代謝正常化。效果亦與劑量相關且於飲食誘導肥胖的大鼠中成功地再現。此等臨床前研究指示當利用適當的胰高血糖素受體活化程度增強完全的胰高血糖素樣肽-1促效作用時，可實質且安全地加速體脂減少。文中所示之發現建立臨床測試之基礎且提出對於代謝症候群之弓人矚目的新穎治療選擇。
例子41
以下之材料及方法係關於實施例42至51中所述之實驗。
Boc胜肽合成及切割
於經修改的App1ied Biosystems430A胜肽合成儀上使用0.2毫莫耳之4-甲基二苯甲胺(MBHA)樹脂(MidwestBiotech，Fishers，Indiana)進行胜肽合成。固相胜肽合成法利用對Boc化學原位中和作用(Schno1zer，M.等人，國際胜肽研究及治療期刊(Internationa1Journa1of Peptide ResearchandTherapeutics)，13：31-44(2007))。將完成的胜肽基樹脂用H F/對甲酚(10：0.5v/v)於0℃下處理1小時。將HF於真空中移除，且使經去保護的胜肽沈澱並於二乙醚中洗滌。將胜肽溶解於20%乙腈/1%乙酸中並凍乾。藉由Boc化學製得大部分的胜肽。對Boc-胺基酸(Midwest Biotech)使用以下的側鏈保護基：精胺酸(Tos)、天冬胺酸(OcHex)、天冬醯胺酸(Xan)、麩胺酸(OcHex)、組胺酸(BOM)、離胺酸(2-C1-Z)、絲胺酸(Bz1)、蘇胺酸(Bz1)、色胺酸(CHO)、酪胺酸(Br-Z)。利用電噴灑游離或MALDI-TOF質譜術確認胜肽分子量，且如文中他處所述進行純化。
內醯胺合成
於樹脂上合成具有i至i+4內醯胺形成的環化胜肽。G1u(O F m)-O Hγ酯(PeptidesInternationa1，Louisvi11e，Kentucky)及Lys(F m oc)-O H(Peptides Internationa1)在參與內醯胺形成的位置處取代G1u(OcHex)及Lys(2-C1-Z)。將完全受保護的胜肽基樹脂用存於DMF中之20%哌定處理45分鐘，以移除Fmoc及 OFm保護基。於樹脂上，在用存於DMF/DIEA中之5當量苯并三-1-基-氧基-三-比咯烷基膦六氟磷酸鹽( benzotriazo1e-1-y1oxy-tris-pyrro1idino-phosphoniumhexafluorophosphate，PyB OP)(F1uka)處理5小時後，達成內醯胺形成。由水合茚三酮分析確認內醯胺形成，且質量相對於開放形式的胜肽減少18。
胜肽純化
於自樹脂切割後，利用分析性逆相HPLC分析粗製胜肽萃取物。於 ZorbaxC8管柱(0.46X5cm)上於具有乙腈梯度的0.1%TFA中進行分析性分離。於分析性分析後，利用半製備型層析術於VydacC4或C18管柱(2.2X25cm)上於具有乙腈梯度的0.1%TFA中純化粗製萃取物。使用相同條件純化經聚乙二醇化之胜肽。利用分析性逆相HPLC利用關於分析分離所列之條件分析製備溶離份的純度(>95%)。利用電噴灑游離質譜術(ESI-MS)或基質輔助雷射脫附/游離飛行時間(MALDI-TOF)質譜術確認胜肽質量及純度。經聚乙二醇化之胜肽經MALDI-TOF顯現跨越43400的寬質量範圍。將經純化胜肽凍乾並儲存於4℃下。
胜肽之聚乙二醇化
將經純化胜肽與甲氧基聚(乙二醇)馬來醯亞胺基-丙醯胺-40K(Chirotech Techno1ogy Ltd，Cambridge)以1：1莫耳比混合於7M尿素/50mM Tris(pH 8.0)中。利用分析性逆相HPLC監測反應進行，且游離胜肽於30分鐘內耗盡。使反應於0.1% TFA中停止，如他處所述進行純化及定性。
胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體媒介之cAMP合成
測試各胜肽類似物透過胰高血糖素(Gcg)及胰高血糖素樣肽-1受體刺激cAMP產生的能力。將HEK293細胞共轉染GcgR或GLP-1RcDNA及連接至cAMP反應單元(CRE)之螢光素酶報導基因。經由於經補充0.25%牛生長血清(HyC1one，Logan，UT)之 D M E M(Invitrogen，Car1sbad，CA)中進行培養，將細胞除去血清歷時16小時。將胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1類似物之連續稀釋液添加至含有經共轉染HEK293細胞之96孔經塗佈聚-D-離胺酸之盤(BD Biosciences,San Jose,CA)中，且將盤於37℃、5% CO2下培養5小時。於培養後，將當量體積(100微升)之LucLite發光基質試劑(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)添加至各孔，且將盤於800rpm下振搖3分鐘。將盤於暗處培養10分鐘，並於MicroBeta1450液體閃爍計數器(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)上定量光輸出。利用Origin軟體(OriginLab,Northampton,MA)計算有效的50%濃度(EC50)。
圓二色性(Circular dichroism)測量
將胜肽溶解於具有漸增TFE濃度的10mM磷酸鹽緩衝液pH 5.9中，且定量胜肽濃度。將各樣品稀釋至10μM以進行CD測量。於具有恒定氮氣流及設定於25℃之1毫米路徑長度單元的JASCOJ-715圓二色性光譜偏光計上收集CD數據。對自270-190奈米以100奈米/分鐘之掃描速度及1奈米波長步進之5次掃描累積光譜數據。於JASCO光譜管理(SpectraM anager)軟體中，減去溶劑訊號且將數據平滑化(Savitzky及Go1ay，Ana1.Chem.36：1627(1964))。將所獲得的毫度值轉變為具有deg.cm2.dmo1-1單位的平均殘餘橢圓率。將計算得的平均殘餘橢圓率值輸入至DICHRO WEB(Whitmore及W a11ace，生物聚合物(Biopo1y mers)89：392-400(2008)；Whitmore 及 Wa11ace ， 核酸研究(Nuc1eic AcidsResearch)32：W668-W673(2004))中，而得百分螺旋度(he1icity)值。
動物
C57BI/6 老鼠係獲自傑克森實驗室(JacksonLaboratories)，且經餵食來自Research Diets的致糖尿病飲食(58%kca1來自脂肪的高蔗糖飲食)。老鼠係獨居或群居於22℃下的12：12小時晝夜循環中，且可自由進食及飲水。所有研究皆係根據辛辛那提大學(U niversity of Cincinnati)之實驗動物管理及使用委員會(Institutiona1 Anima1Careand UseCom mittee)的綱領經認可及進行。
體組成測量
使用N M R技術(EchoM RI，Houston，TX)測量全部體組成(脂肪及瘦肉質量)。
能量平衡生理測量
利用組合間接量熱系統(TSE Systems，BadHomburg，Germany)評估能量攝取及消耗、以及飼養籠活動。每隔45分鐘測量氧氣消耗及CO2產生總共歷時120小時(包括12小時的適應)，以測定呼吸商數及能量消耗。在間接量熱評估的同時經由將量尺整合至密封籠環境中，而連續測定食物及水的攝取及進餐模式歷時120小時。將進餐定義為持續時間最少60秒的食物攝取量事件，且在食物攝取量事件之間中斷300秒。使用多維紅外光束系統，使光束掃描籠的底部及頂部而測定居籠活動力，且將活動力表示為光束中斷。不動活動(坐立不安)係定義為在籠底部之單一光束的連續中斷，步行移動係定義為在籠底部之任兩不同光束的中斷，及跳動係定義為在籠底部及頂部兩者的光束同時中斷。
血液參數
於禁食6小時後使用經塗佈EDTA 的 Microvette管(Sarstedt，Nurem berg，Germany)自尾部靜脈收集血液，且立即冷凍於冰塊中。於在3，000g及4℃下離心15分鐘後，將血漿儲存於-80℃下。利用獲自Linco(Sensitive Rat Insu1inRIA；Linco Research，St.Char1es，M O)的放射免疫測定方法定量血漿胰島素。利用酵素測定套組(ThermoE1ectron，W a1tham，M A)測量血漿TG及膽固醇濃度。個別地分析樣品，僅除了使來自5隻動物/組的匯集樣品(0.25毫升)在兩個串聯連接的Superose6管柱上進行速效液相層析(FPLC)凝膠過濾以分離脂蛋白。所有測定係根據製造商的指示進4丁。
葡萄糖耐受性試驗
為測定葡萄糖耐受性，使老鼠禁食6小時且經腹膜內注射(i.p.)2克葡萄糖/公斤體重(50%D-葡萄糖(Sigma)存於0.9%鹽水中)，以進行葡萄糖耐受性試驗(GTT)。於注射前(0分鐘)及於注射後15、30、60、90及120分鐘利用手持式血糖計(TheraSense Freesty1e)測量尾部血糖值(m g/d1)。
W AT HS1之西方墨點(Westernb1ot)
將脂肪組織置於1.5毫升微量離心管中，且使用組織研磨器(Retsch，Inc Newtown，PA Cat.#85210)在30hz下於冰冷的RIPA緩衝液(1X PBS、1%NonidetP40、0.5%去氧膽酸鈉、具有50mM NaF之0.1%SDS、0.5M苯甲基磺醯氟、0.1mM釩酸鈉、20μg/m1Aprotinin、10μg/m1Leupeptin)中溶解3分鐘。使樣品於12，000rpm下旋轉15分鐘(4℃)，此時將內部澄清液移至新的管，並於冰上超音波震盪15秒。使樣品於14，000rpm下旋轉10分鐘(4℃)，且將內部澄清液收集至新的管。使樣品再次於19，000rpm下旋轉10分鐘(4℃)，且將內部澄清液收集至新的管。然後取出等份樣品進行蛋白質測定。接著使樣品於4xSDS/DTT緩衝液中沸騰2分鐘。使來自細胞溶解產物的50微克蛋白質於9%(w/v)丙烯醯胺分解凝膠上接受SDS/PAGE，且轉移至HybondECL硝基纖維素薄膜。將薄膜封阻且用相關的主要抗體(來自Ce11 Signa1ing的HSL(4107)； 來自Ce11 Signa1ing 的 Phospho-HSL(ser660)(4126))探測於洗滌後，使用HRP-結合抗-(兔IgG)或抗-(老鼠IgG)(HRP-結合抗-兔及抗-老鼠次要抗體係購自Bio-Rad(170-6515＆170-6516))進行主要抗體偵測，且使用增強化學發光(A mersham Biosciences)偵測並暴露至CL-Xposure膜(Pierce)o
免疫組織化學
如說明將白色副睪脂肪組織的石蠟包埋切片(5微米)用蘇木精/曙紅染色(Ogden，C. L. 等人，JAMA295：1549-1555(2006))。對於各個別的老鼠組織區塊，使用Image Pro P1us 5.1 軟 體 (MediaCybernetics，Bethesda，M D，USA)定量來自三個不同高功率場之各者之100個細胞的脂肪細胞大小作為面積測量值。
油紅染色
為觀察於肝組織中的脂質累積，將於犧牲時取得之肝臟的4-8毫米橫切片用Oi1RedO染料染色。使用[複合透鏡]顯微鏡取得在20X及40X倍率下的影像。
定量RT-PCR程序
經由於飽食狀態(在晨間餵食後1-4小時)斬首使動物犧牲，且將各種組織取樣、冷凍鉗制、及儲存於-80℃下，供隨後利用即時定量PCR(icyc1er，BioRad)測量PEPCK、G6P、及HPRT(管家)之mRNA表現用。
使用R Neasy Lipid Tissue Kit(Qiagen，Ca#74804)使用標準方案自冷凍組織樣品萃取總RNA。利用光譜光度測定法使用Nanodrop測定RNA濃度及純度。使用總RNA的2微克獲得供RT-PCR用的cDNA模板。利用10X DNaseI反應緩衝液、DNaseI，Amp Grade，1U/μ1，depc-H20、25m M EDTA、10mMdNTP Mix、寡(dT)20(50μM)、5X First-Strand緩衝液、0.1MD TT、R NaseO U T、及SuperScriptIII(Invitrogen)進行逆轉錄反應。
使用含有最終濃度0.5μM之前置及反置弓子之螢光染料SYBR綠(BioRad，Ca#1708882)經由PCR將合成得的cDNA進一步放大。經由解離曲線確認產物純度。在所有測定中包括無模板控制組，其未產生一致的放大。使用標準曲線於獲得PEPCK或G6P之相對濃度，且根據用作管家基因之HPRT的濃度校正結果。將結果表示為賦形劑之百分比，將賦形劑組之平均值設定為100%，然後計算3組研究動物的各個別值。
弓子序列
自NIH網站取得PEPCK、G6P、及HPRT的弓子序列，且利用IDTDNA產生弓子。
逆轉錄及定量即時RT-PCR
如說明利用即時RT-PCR定量CD68mRNA表現(Nomiyama，T.等人，臨床研究期刊(Journa1 of C1inica1Investigation)117：2877-2888(2007))。簡而言之，在犧牲後，將100毫克副睪脂肪組織於TRIZOL中均質化，且將總mRNA逆轉錄至cDN A中。使用iCyc1er(Bio-Rad)及SYBR GreenI系統(Bio-Rad)進行PCR反應。將各樣品重複分析三次且對TFIIB mRNA表現之值正常化。所使用的老鼠弓子序列如下：CD68，5'-CAAGGTCCAGGGAGGTTGTG-3'(前置)(SEQID NO：638)，5'-CCAAAGGTAAGCTGTCCATAAGGA-3'(反置)(SEQIDNO：639)；及TFIIB，5'-CTCTCCCAAGAGTCACATGTCC(SEQ IDNO：640)，5-CAATAACTCGGTCCCCTACAAC-3'(反置)(SEQIDNO：641)。
統計分析
除非另作指示，否則所有統計分析係使用GraphPadPrism單因子A N O V As及欄統計學(co1u m nstatistics)進行。所述之P值係用於單因子變異數分析。將所有結果呈現為平均值±SE。(受體活化數據為±S.D.)。
例子42
如本文所述製得兩種包含SEQIDNO：1之胺基酸序列與胺基酸修飾的胰高血糖素胜肽(胜肽X及Y)。兩種胜肽包含第2號位置之胺基異丁酸、第16號位置之麩胺酸、第17號位置之麩醯胺酸、第18號位置之丙胺酸、第20號位置之離胺酸、第21號位置之麩胺酸、第23號位置之異白胺酸、及第24號位置之半胱胺酸。透過與馬來醯亞胺官能化直鏈聚乙二醇反應在第24號位置之半胱胺酸達成點特異的40-kd聚乙二醇化，而產生胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇。胜肽Y及Y-聚乙二醇與胜肽X及X-聚乙二醇之不同處分別在於在胜肽Y或胜肽Y-聚乙二醇之中間導入單一側鏈內醯胺架橋，以使次要結構穩定及增強胰高血糖素促效作用。第16號位置之麩胺酸及第20號位置之離胺酸的兩側鏈在胜肽組裝過程中共價性偶合為側鏈醯胺。此胜肽的巨環化呈現21-原子內醯胺。測試胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇之溶解度，發現其可以超過25毫克/毫升之濃度溶解於生理緩衝液中，且胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇經證實可完全抵抗利用血漿的體外培養歷時1星期之期間。
例子43
藉由圓二色性分析當胜肽溶解於各種濃度之三氟乙醇(TFE)水溶液中時的第二構形(圖25)。胰高血糖素係經測試之最少螺旋度的胜肽，且其於0、10及20%之TFE溶液中分別具有10、15及33%之經計算螺旋度(表29)。在相同的實驗條件下，胰高血糖素樣肽-1具有14、29及55%之增強螺旋度，顯示此兩胜肽的主要以及次要結構不同。當胜肽X及Y經聚乙二醇化時，儘管聚乙二醇化部份佔分子的多於90質量%，但其之螺旋度並無顯著變化(表29)。相對地，胜肽Y在磷酸鹽緩衝液中在不存在TFE下的明顯螺旋度(apparenthe1icity)大約為胜肽X的兩倍，自17%至36%。因此，此兩嵌合物胜肽之聚乙二醇化形式(胜肽X-聚乙二醇及胜肽Y-聚乙二醇)的次要結構明顯不同(圖25)，且生物性質之差異可能係此等次要結構差異的函數。
例子44
評估兩種胜肽(胜肽X及Y)及其40-kd聚乙二醇化衍生物(胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇)於基於細胞之CRE-螢光素酶報導測定方法中刺激cAMP合成的能力(圖26)。如表30所示，天然胰高血糖素在0.055±0.014nM之有效濃度(EC50)及胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)在甚高的濃度(3.20.39nM之EC50)下半最大地活化胰高血糖素受體。相對地，胰高血糖素樣肽-1以0.028±0.009nM之EC50活化其受體且由於以超過1μM之EC50發生之對胰高血糖素受體(GcgR)的交互作用而經證實高度特異。天然配體對其受體所呈現之特異性的動態範圍超過一百萬。胜肽X-聚乙二醇對GLP-1R之效能為天然胰高血糖素樣肽-1的兩倍，且對GcgR甚至更以相對的方式增強。然而，GcgR活性僅為天然胰高血糖素的大約10%。導入內醯胺恢復完全的胰高血糖素促效作用，而無對GLP-1R的變化。結果，胜肽Y-聚乙二醇係相對於天然配體於兩各別受體之完全有效、接近平衡的共同促效劑。各胜肽之聚乙二醇化使對GcgR之效能降低多至十倍及對GLP-1R降低五倍。對GcgR之活性之稍微增加的損失可能係羧基端序列對胰高血糖素受體交互作用之較大相對重要性的函數。經聚乙二醇化之胜肽(胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇)對GLP-1R較天然胰高血糖素樣肽-1稍微無效，但仍具有低於nM的EC50。胜肽X-聚乙二醇較此胜肽的內醯胺形式(即：胜肽Y-聚乙二醇)對GLP-1R的選擇性多七倍。因此，此兩DPP-4抗性胜肽適用於承受活體內時間作用實驗且對GLP-1R促效作用的配合良好，但胰高血糖素促效作用不同。
例子45
於飲食誘導肥胖(D10)C57B6老鼠中使用40-kd聚乙二醇化胜肽(胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇)作為單次每週皮下(s.c)注射。單次注射325奈莫耳/公斤之胜肽Y-聚乙二醇使體重於一週內減少25.8%，自50.9±1.4克至37.8±0.8克(p<0.0001，n=8隻/組)。相當地施予胜肽X-聚乙二醇有效，但效能顯著較低，由於體重減少為9%(49.1±1.51克至44.68±1.38g)。經注射鹽水的對照老鼠並未改變其體重(之前：50.61±1.32克，之後：50.87±1.46克；圖27A)o體重改變係脂肪質量減少的結果(內醯胺胜肽為41.9%，開放形式為22.2%，控制組為2.3%，p<0.001；圖27B)，且伴隨平均每日食物攝取量的顯著減少(胜肽Y-聚乙二醇：0.40±0.29克/天，胜肽X-聚乙二醇：1.83±0.81克/天，鹽水：2.70±0.78克/天，p<0.0001，圖27C)。當與控制組比較時，兩種胜肽的血糖顯著地減低，且胜肽Y-聚乙二醇稍微更大(胜肽Y-聚乙二醇：-90.1mg/dL，胜肽X-聚乙二醇：-79.6mg/dL，控制組：-23.9g/dL，p=0.0433；圖27D)。兩種胜太(胜肽X-聚乙二醇及胜肽Y-聚乙二醇)之間的相對差異不具統計意義。
例子46
在一個別的實驗中，單次s.c.注射六種不同劑量(0、7、14、35、70、140及350奈莫耳/公斤)之胜肽Y-聚乙二醇及胜肽X-聚乙二醇於體重及血糖中顯現線性反應、劑量相關性減少(圖28A、28B、28C及28D)。此顯示觀察到的作用具藥理相關性，其除了體重快速、過度減輕的間接作用外，並無明顯毒性。胜肽Y-聚乙二醇的作用大小更為明顯，且顯示胰高血糖素促效作用的額外元素可改善胜肽的效能。
例子47
在一個別的實驗中，每週s.c.注射70奈莫耳/公斤之胜肽Y-聚乙二醇或胜肽X-聚乙二醇分別使DIO老鼠之體重減少28.1%及20.1%(p<0.0001，n=7-8/組；圖29A)。體重變化伴隨脂肪質量的減少(胜肽Y-聚乙二醇為-62.9%，胜肽X-聚乙二醇為-52.2%，及控制組為5.1%，p<0.0001；圖29B)。此等較低劑量對食物攝取量的長期作用(p=0.95；圖29C)較利用較高劑量的短期作用(圖27C)不明顯。胜肽Y-聚乙二醇的能量消耗(14.60±0.69kca1/[kg*h])及胜肽X-聚乙二醇的(17.19±1.49kca1/[kg*h]) 較 賦 形 劑 的(12.71±0.45kca1/[kg*h])，p=0.0187)增加，而呼吸商數傾向於減低(圖29D及29E；胜肽Y-聚乙二醇為0.719±0.01，胜肽X-聚乙二醇為0.725±0.01，及賦形劑為0.755±0.01，p=0.1028)，顯示增加的熱生成(thermogenesis)及改變的營養分配可說明總體的負能量平衡。由於在治療組與控制組間的活動力並無不同(p=0.4281；圖29F)，因而增加的能量消耗與自發物理活動所弓發之熱生成(NEAT)的改變並無關聯。自動線上監測急性餵食及慢性監測食物攝取量皆未顯示熱量攝取的任何差異(自動p=0.667，慢性p=0.9484；圖30A)。
在自初次注射後第3天起之治療期間內的血糖值顯著地減低(平均減低：胜肽Y-聚乙二醇-32%，胜肽X-聚乙二醇-24.5%，控制組：-2.7%，p<0.0001；圖29G)。回應第3天的腹膜內(i.p.)葡萄糖施予，血糖峰(圖29H)及分佈(AUC)(圖30F)於兩接受治療組(胜肽Y-聚乙二醇14183±1072，胜肽X-聚乙二醇 13794±824.1)中較經賦形劑治療的控制組(34125±3142，p<0.0001)顯著地減低。於用胜肽Y-聚乙二醇或胜肽X-聚乙二醇治療一個月後，於治療組中的血漿胰島素(1194pg/m1，1034pg/m1，p=0.0244)較控制組的(2675pg/m1)低，顯示改良的胰島素敏感性(圖29I)。於用胜肽Y-聚乙二醇或胜肽X-聚乙二醇治療一個月後的血漿C-胜肽濃度(738.8pg/m1 ， 624.7pg/m1)傾 向 於較賦形劑(1077pg/m1)(p=0.108)減低(圖30G)。
為判定主要現象是否跨越物種，將兩種化合物施予飲食誘導肥胖的大鼠(平均重量777.4+/-2.1克，劑量70奈莫耳/公斤/週，每週注射一次，治療三週)。胜肽Y-聚乙二醇及胜肽X-聚乙二醇各使DIO大鼠的體重(胜肽X-聚乙二醇：-11.15+/-0.88%；胜肽Y-聚乙二醇：-20.58+/-2.26%，賦形劑：1.09+/-0.56%)(p<0.0001)及脂肪質量(胜肽X-聚乙二醇：-19.17+/-2.03%；胜肽Y-聚乙二醇：-33.76+/-4.76%，賦形劑：0.65+/-1.20%；p<0.0001)減低，證實此抗肥胖治療方法之與物種無關的適用性。
例子48
在27天內用胜肽X-聚乙二醇及胜肽Y-聚乙二醇之慢性s.c.治療使DIO老鼠的總膽固醇(分別為106.9±6.3mg/dL及200.8±29.58mg /dL) 相 對 於 賦 形 劑(254.025.33mg/dL，p=0.0441；圖31A)減低。在一個別的實驗中，使DIO老鼠於第0及7天時接受70奈莫耳/公斤s.c.之胜肽X-聚乙二醇、胜肽Y-聚乙二醇或賦形劑，且於第9天時進行評估。胜肽Y-聚乙二醇使血漿三酸甘油酯、LDL膽固醇及總膽固醇減低(總膽固醇63.02.49mg/dL相較於賦形劑之177.7±11.8mg/dL)(p<0.0001)，同時可能導致從LDL轉變為HDL膽固醇(圖31B)。胜肽X-聚乙二醇使LDL及HDL膽固醇兩者減低，但對三酸甘油酯沒有顯著作用(圖31C)。瘦體素有顯著的減少(胜肽Y-聚乙二醇為3343±723.3pg/m1；胜肽X-聚乙二醇為7308±2927，及賦形劑為18，642±6124；p=0.0426；圖31D、31E、31F)。慢性治療27天亦使肝臟脂防含量回歸正常，而對照DIO老鼠則維持明顯的脂肪肝(未顯示數據)。
例子49
用胜肽X-聚乙二醇或胜肽Y-聚乙二醇治療一個月導致DIO老鼠之白色脂肪組織(WAT)中之激素敏感性脂解酶(HSL)之增加的磷酸化(胜肽X-聚乙二醇：1.135±0.315；胜肽Y-聚乙二醇：1.625±0.149；賦形劑：0.597±0.204；p=0.0369；圖32B)，顯示胰高血糖素特異之對WAT脂肪分解的直接作用。伴隨經以胜肽Y-聚乙二醇及胜肽X-聚乙二醇以35奈莫耳/公斤/週之劑量治療2星期之老鼠之脂肪質量的減少，當與控制組老鼠比較時，副睪脂肪組織之脂肪細胞的大小有顯著的減小(未顯示數據)。然而，儘管具有減少的脂肪質量及較小的脂肪細胞，但此利用胜肽Y-聚乙二醇及胜肽X-聚乙二醇短期治療2星期末伴隨如由對CD68之即時RT-PCR所定量之脂肪組織巨噬細胞含量的顯著減少(圖33C)。於棕色脂肪組織(BAT)中之解偶聯蛋白質I(UCP1)含量經由胜肽X-聚乙二醇治療提高，但未由胜肽Y-聚乙二醇治療提高(胜肽X-聚乙二醇2.167±0.429，胜肽Y-聚乙二醇1.287±0.1558，及賦形劑1.0±0.118；p=0.0264；圖32A)，此與對BAT休息生熱之胰高血糖素樣肽-1特異作用一致。反映肝臟糖質新生(g1uconeogenesis)的肝臟基因表現未受胜肽X-聚乙二醇或胜肽Y-聚乙二醇影響(圖30H及30I)。組織學顯示胰島在胜肽X-聚乙二醇治療後傾向於較小(未顯示數據)。
例子50
為仔細研究胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇之GLP-1R及GcgR促效劑成分的貢獻；將其各施予維持高脂肪飲食的胰高血糖素樣肽-1受體基因易除(GLP-1R-/-)老鼠歷時一個月。胜肽X-聚乙二醇與鹽水相比導致體重(p>0.05；圖34A及34B)及脂肪質量(p>0.05；圖34C)的減少。胜肽Y-聚乙二醇於GLP-1R-/-老鼠中導致體重(p=0.0025)及脂肪質量(p=0.0025)的顯著減小(圖34A-34C)。胜肽X-聚乙二醇對GLP-1R-/-老鼠的食物攝取量沒有影響，而胜肽Y-聚乙二醇則顯著地抑制食物攝取量(p=0.017)(圖34D)。胜肽Y-聚乙二醇(但非胜肽X-聚乙二醇)具有在葡萄糖耐受性試驗中在不存在功能性GLP-1R下提高血糖的傾向(p=0.03)(圖34E及34F)，顯示需要共同促效劑的胰高血糖素樣肽-1成分來防止由胰高血糖素所誘導的高血糖症。
例子51
為獨立評估可歸因於胰高血糖素促效作用之胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇的作用，研究兩種具有相當的GLP-1R效能但顯著不同之GcgR活性的額外胜肽促效劑。兩種胜肽(胜肽U及V)係與胜肽X-聚乙二醇及Y-聚乙二醇相關。胜肽U及V包含SEQIDNO：1之胺基酸序列與以下的修飾：第16號位置之麩胺酸、第17號位置之麩醯胺酸、第18號位置之丙胺酸、第20號位置之離胺酸、第21號位置之麩胺酸、第23號位置之異白胺酸、及第24號位置之半胱胺酸，但包含第24號位置之半胱胺酸的20-kd聚乙二醇化且不包含第2號位置之胺基異丁酸。胜肽V另外包含麩醯胺酸3取代為麩胺酸，其使胰高血糖素促效作用選擇性地降低超過十倍。胜肽U及胜肽V皆不包含內醯胺架橋。每天用胜肽V以50奈莫耳/公斤s.c.治療DIO老鼠歷時1星期相對於胜肽U顯現對降低體重的降低效果(分別為-9.09±0.80相對於-13.71±0.92克，p<0.0001；圖35A)。
例子52
基本上如本文所述製得包含透過γ-麩胺酸間隔物或γ-麩胺酸-γ-麩胺酸雙肽間隔物連接至離胺酸殘基之C16脂肪醯基的胰高血糖素胜肽，其中該離胺酸殘基係位於第10號位置或羧基端(於第29號位置)處。如本文所述測試胜肽於胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體的體外活性。結果顯示於表31。
例子53
基本上如本文所述製得表32所示之胜肽：
除了SEQIDNO：624、631、及632之胜肽外，表32之所有胜肽於胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體兩者顯現強效的體外活性。
基本上如本文所述製得除了表33中概述的變化外，包含天然胰高血糖素之胺基酸序列(SEQIDNO：1)之A組的胜肽。
基本上如本文所述製得除了第27號位置之甲硫胺酸取代為正白胺酸外，具有與A組胜肽相同結構的胜肽。此等經修飾胜肽為B組之胜肽。
基本上如本文所述製得除了第24號位置之麩醯胺酸取代為共價性連接至40kDa聚乙二醇之半胱胺酸外，具有與A及B組胜肽相同結構的胜肽。此等經聚乙二醇化之胜肽形成C組之胜肽。
基本上如本文所述製得除了第10號位置之酪胺酸經共價連接至C8、C12、C14、C16、或C18脂肪醯基之離胺酸取代外，具有與A、B、或C組胜肽相同結構的胜肽。經C8脂肪醯基醯基化之胜肽形成D組之胜肽。經C12脂肪醯基醯基化之胜肽形成E組之胜肽。經C14脂肪醯基醯基化之胜肽形成F組之胜肽。經C16脂肪醯基醯基化之胜肽形成G組之胜肽。經C18脂肪醯基醯基化之胜肽形成H組之胜肽。
基本上如本文所述製得除了脂肪醯基透過一間隔物連接至第10號位置之離胺酸外，具有與D至H組胜肽相同結構的胜肽。包含γ-麩胺酸-γ-麩胺酸間隔物之胜肽形成I組之胜肽。包含γ-麩胺酸間隔物之胜肽形成J組之胜肽。包含丙胺酸-丙胺酸間隔物之胜肽形成K組之胜肽。包含β-丙胺酸-β-丙胺酸間隔物之胜肽形成L組之胜肽。
例子54
基本上如本文所述製得包含具有15個胺基酸修飾(一1至21個胺基酸之羧基端延伸)之SEQIDNO：1之胰高血糖素胜肽，其中：(a)該延伸經醯基化或烷基化，及/或(b) 該延伸包括1至6個帶正電胺基酸。基本上如例子14所述測試胜肽於胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1及胃抑胜肽受體的體外活性。該胜肽之結構及其體外活性總結於表34。
如於表34所示，證實於胃抑胜肽受體之促效劑活性大於0.1%之所有未聚乙二醇化之胜肽(胜肽mt-345、mt-362以及mt-364)證實於胃抑胜肽受體有異常強效的活性。胜肽mt-350、mt-351以及mt-352證實活性小於0.1%可能是由於此類胜肽經聚乙二醇化的事實。
例子55
mt-345(具有SEQIDNO：657之結構)的活體內效果與其他經醯基化胜肽(里拉盧的，mt-261(SEQIDNO：670)、及mt-347(SEQID NO：659))及一未經醯基化胜肽(mt-348；SEQID NO：660)。胜肽mt-345、mt-261以及mt-347包含具有胺基酸修飾之胰高血糖素(SEQIDNO：1)的胺基酸序列，並進一步包含GPSSGAPPPS(SEQID NO：26)至第29號位置處胺基酸接著一第40號位置處的經醯基化離胺酸的一延伸。胜肽mt-345包含第2號位置之胺基異丁酸、第16號位置之麩胺酸、第17號位置之麩醯胺酸、第18號位置之丙胺酸、第20號位置之離胺酸、第21號位置之麩胺酸、第23號位置之異白胺酸、第24號位置之半胱胺酸、第29號位置之甘胺酸、SEQIDNO：26羧基端至第29號位置處甘胺酸以及一第40號位置處的經醯基化的離胺酸。mt-345之醯基一為C14脂肪醯基。胜肽mt-261具有與mt-345相似之結構，除了mt-261包含第1號位置之酪胺酸、第3號位置之麩胺酸、第12號位置之異白胺酸、第16號位置之離胺酸、第17號位置之麩醯胺酸、第18號位置之丙胺酸、第20號位置之胺基異丁酸、第23號位置之纈胺酸、第24號位置之天冬醯胺酸、第27號位置之白胺酸、第28號位置之丙胺酸以及第40號位置處的一C16脂肪醯基。該mt-347及mt-348與mt-345之結構相同，除了mt-347及mt-348包含第16號位置之胺基異丁酸。該mt-347與mt-348之結構相同，除了mt-347包含第40號位置處的一C14脂肪醯基，而mt-348缺少一醯基。
基本上如例子14所述測試各胜肽於於胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1及胃抑胜肽受體的體外活性。該相對活性結果顯示於表35。
%相對活性係相對於指示受體之天然激素。
該胜肽以10或30奈莫耳/公斤劑量皮下注射而每日施予至8C57B1/6老鼠11組中歷時兩週。老鼠的初始平均體重為51克。該老鼠係6個月大且經餵食致糖尿病飲食4個月。老鼠中一組接受一賦形劑控制組且另一組接受包含具有一羧基端醯胺化以代替羧酸端α羧酸基之SEQIDNO：1胺基酸序列的胜肽。
接受一胜肽之老鼠，相較於賦形劑控制組，其每一組之體重係於研究過程中穩定下降。然而，如圖36所示，接受mt-261或mt-345為10奈莫耳/公斤的老鼠體重總變化最為顯著(約20%)。施予胰高血糖素醯胺胜肽的老鼠亦證實有如同mt-261及mt-345之一相似之體重總下降，儘管胰高血糖素醯胺之劑量為mt-261及mt-345之三倍。在體重之效果明顯地比里拉盧的(1irag1utide)之效果更顯著。
由老鼠組別的食物攝取量亦在研究期間評估。接受mt-261或mt-345的老鼠證實有最低的食物攝取量。
老鼠的血糖值亦研究。施予里拉盧的(1irag1utide)、mt-261或mt-345的老鼠證實在第七天(胜肽首次施予後之第七天)有一血糖值總下降。然而當第14天測量時其下降程度較小。
例子56
基本上如本文所述製得包含一經醯基化羧基端延伸之胰高血糖素胜肽。胜肽mt-278、mt-261、mt-297以及mt-358包含具有下列胺基酸修飾之SEQIDNO：1的胺基酸序列：第1號位置之酪胺酸、第2及20號位置之胺基異丁酸、第16號位置之離胺酸、第12號位置之異白胺酸、第17號位置之麩醯胺酸、第18號位置之丙胺酸、第21號位置之麩胺酸、第29號位置之甘胺酸、SEQIDNO：26羧基端至第29號位置之胺基酸以及一第40號位置處的經醯基化的離胺酸。胜肽mt-364藉由包含一第1號位置之組胺酸、第16號位置之麩胺酸、以及一第20號位置之離胺酸而與其他胜肽不同。此類胜肽結構之詳細敘述以此處所附之序列表敘述：mt-364(SEQIDNO：669)、mt-261(SEQID NO：270)、mt-278(SEQIDNO：271)、mt-297(SEQID NO：272)以及mt-358(SEQIDNO：673)。
基本上如例子14所述測試胜肽於胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1及胃抑胜肽受體的體外活性。該胜肽之活性與天然激素於指示受體之比較顯示於表36。
%相對活性係相對於指示受體之天然激素。
該胜肽接著活體內測試已8個月大且經餵食致糖尿病飲食6個月的C57B1/6老鼠在體重、食物攝取量、血糖值以及脂肪質量上的效果。8隻老鼠有11組以每日以10奈莫耳/公斤的胜肽皮下注射歷時一週。老鼠的初始體重為53克。
以mt-278、mt-261或mt-364注射的老鼠體重相較於僅以賦形劑注射的老鼠組，其體重係於研究過程中穩定下降。如圖37所示，經注射mt-364之老鼠證實在一週長的研究結束前有最大的體重下降，達到大於15%的體重減低。經注射mt-278或mt-261之老鼠亦證實有大幅的(大於10%)體重減低。
監控老鼠的總食物攝取量且研究結束前，由老鼠注射mt-364或mt-261的總食物攝取量證實其總食物攝取量比老鼠注射僅含賦型劑者少15%。
在整個研究中測量老鼠的脂肪質量。以mt-364、mt-278或mt-261注射的老鼠顯示一小於僅以賦形劑注射的老鼠者之脂肪重量。
在血糖值上的效果額外地評估。在研究的最後一天(第7天)，以mt-364或mt-261注射的老鼠顯示比在第0天測量的血糖值超過60%之一血糖值下降。經注射mt-278之老鼠額外地證實有大幅的(下降超過40%)血糖值下降。
例子57
基本上如本文所述製得具有一羧基端醯胺以取代羧基端α羧酸基之類似物。
胜肽83包含具有第2號位置之胺基異丁酸、第16號位置之胺基異丁酸以及第10號位置離胺酸之SEQIDNO：1的結構，其中離胺酸透過一γ-麩胺酸-γ-麩胺酸雙肽間隔物包含一C16脂肪醯基。
胜肽900包含具有第2號位置之胺基異丁酸、第16號位置之胺基異丁酸、包含SEQIDNO：26之一羧基端延伸以及第40號位置離胺酸之SEQIDNO：1的結構，其中離胺酸透過一γ-麩胺酸-γ-麩胺酸雙肽間隔物包含一C16脂肪醯基。
胜肽901包含具有第2號位置之胺基異丁酸、第16號位置之胺基異丁酸、包含SEQIDNO：26之一羧基端延伸以及第10號位置離胺酸之SEQIDNO：1的結構，其中離胺酸透過一γ-麩胺酸-γ-麩胺酸雙肽間隔物包含一C16脂肪醯基。
胜肽mt-364包含SEQIDNO：669的結構。
基本上如本文所述測試胜肽於胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1及胃抑胜肽受體中每一個的體外活性。結果顯示於表37o
8隻DIO老鼠中九組(品系：C57B16WT)每日以表37之胜肽之一種的10奈莫耳/公斤皮下注射歷時七天。該老鼠之初始平均體重為57.6g。該老鼠約10個月大且以高脂肪含量食物餵食約8個月。
於研究的第7天測量體重之總變化。如圖38所示，所有經注射表37之胜肽的老鼠證實與賦形劑控制組相較有一體重下降。在胜肽83、900及901間，所有胜肽具有一相似的胜肽結構，胜肽900及901證實有最大的體重下降。有趣的是，相較於83(經醯基化但不包含羧基端延伸)，胜肽900及901中每一個包含有一羧基端延伸並經醯基化。於第10號位置經醯基化之胜肽901證實下降(約15%下降)較於第40號位置經醯基化之胜肽900(約10%下降)更大。然而，此類胜在體重上之活體內效果仍未如同MT-364者顯著。經以MT-364注射之老鼠證實有約20%的下降。
將文中弓述之所有參考文獻，包括公告、專利申請案、及專利，以如同各參考文獻經個別且明確地指示為經併入本文為參考資料且以其全體記述於文中之相同程度併入本文為參考資料。
除非文中另作指示或前後文明顯相互衝突，否則應將在描述本發明之文中(尤其係在以下申請專利範圍之文中)之術語「一」及「一個」及「該」及類似指示物的使用解釋為涵蓋單數及複數。除非另作指示，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應作為開放式術語解釋(即意指「包括，但不限於」)。
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文中說明本發明之較佳實施例，包括發明者已知為實施本發明的最佳方式。熟悉技藝人士在閱讀先前說明後當可明白該等較佳實施例的變化。本發明人預期熟悉技藝人士可適當地使用該等變化，且本發明人預期本發明可以除明確說明於文中者外的方式實施。因此，本發明包括如由適用法條所許可之於隨附申請專利範圍中所引述之主題內容的所有修改及等效物。此外，除非文中另作指示或者前後文明顯地相互衝突，否則本發明涵蓋前述要素之所有可能變化的任何組合。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
<220>
<223>　合成胜肽
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<222>　(40)..(40)
<223>　羧基端醯胺化
<400>　668
<210>　669
<211>　40
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<223>　MT-364
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　以一C16脂肪醯基而醯基化
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　羧基端醯胺化
<400>　669
<210>　670
<211>　40
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成多肽
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<223>　MT-261
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(20)..(20)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　以一C16脂肪醯基而醯基化
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　羧基端醯胺化
<400>　670
<210>　671
<211>　40
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成多肽
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<223>　mt-278
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(20)..(20)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　以一C16脂肪醯基而醯基化
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　羧基端醯胺化
<400>　671
<210>　672
<211>　40
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成多肽
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<223>　MT-297
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(20)..(20)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　以一C16脂肪醯基而醯基化
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　羧基端醯胺化
<400>　672
<210>　673
<211>　40
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成多肽
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<223>　MT-358
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(20)..(20)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　以一C16脂肪醯基而醯基化
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　羧基端醯胺化
<400>　673
<210>　674
<211>　11
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　misc_feature
<222>　(1)..(1)
<223>　Xaa係為任何自然發生之胺基酸
<400>　674
<210>　675
<211>　42
<212>　PRT
<213>　人類
<220>
<221>　mat_胜肽
<222>　(1)..(42)
<223>　胃抑多肽
<400>　675
<210>　676
<211>　40
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(20)..(20)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(40)..(40)
<223>　以C16脂肪醯基而醯基化
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　羧基端醯胺化
<400>　676
<210>　677
<211>　40
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(20)..(20)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(40)..(40)
<223>　以C16脂肪醯基而醯基化
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　羧基端醯胺化
<400>　677
<210>　678
<400>　678
000
<210>　679
<211>　40
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<223>　MT-387
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(12)..(12)
<223>　Xaa為離胺酸或異白胺酸
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(40)..(40)
<223>　以C16脂肪醯基而醯基化
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　羧基端醯胺化
<400>　679
<210>　680
<211>　40
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa為胺基異丁酸
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(12)..(12)
<223>　Xaa為離胺酸或異白胺酸
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(40)..(40)
<223>　以C16脂肪醯基而醯基化
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(40)..(40)
<223>　羧基端醯胺化
<400>　680
圖1本發明一較佳實施例之。圖1係呈現胰高血糖素Cys21馬來醯亞胺基PEG5K分別在37℃下培養24、48、72、96、144及166小時穩定度之長條圖；
圖2現分別由胰高血糖素Cys21馬來醯亞胺基PEG5K在pH5於37℃下培養24、72或144小時之HPLC分析所產生之數據；
圖3現利用胰高血糖素類似物顯示受體媒介之cAMP誘導數據。更具體地說，圖3A比較胰高血糖素受體受胰高血糖素類似物E16,K20●、E15,E16▲、E16,K20▼、E15,E16、E16及Gluc-NH2■的誘導；
圖4A及4B呈現利用胰高血糖素類似物顯示受體媒介之cAMP誘導數據。更具體地說，圖4A比較胰高血糖素受體受胰高血糖素類似物Gluc-NH2●、E16Gluc-NH2▲、E3,E16 Gluc-NH2▼、Orn3,E16 Gluc-NH2及Nle3,E16 Gluc-NH2,相對於天然胰高血糖素■的誘導，而圖4B比較胰高血糖素樣肽-1受體受胰高血糖素類似物Gluc-NH2●、E16Gluc-NH2▲、E3,E16Gluc-NH2▼、Orn3，E16 Gluc-NH2及N1e3,E16 Gluc-NH2相對於天然胰高血糖素樣肽-1■的誘導；
圖5A及5B呈現利用胰高血糖素類似物顯示受體媒介之cAMP誘導數據。更具體地說，圖5A比較胰高血糖素受體受胰高血糖素類似物(E16,K20 Gluc-NH2●(5nM,儲存溶液)、E15,E16 Gluc-NH2▲(5nM,儲存溶液)、E16,K20 Gluc-NH2▼(10nM,儲存溶液)、E15,E16 Gluc-NH2(10nM,儲存溶液)及E16 Gluc-NH2)相對於胰高血糖素-NH2(■)的誘導，而圖5B比較胰高血糖素樣肽-1受體受胰高血糖素類似物(E16,K20 Gluc-NH2●、E15,E16 Gluc-NH2▲、及E16 Gluc-NH2)相對於胰高血糖素樣肽-1(■)及胰高血糖素-NH2(□)的誘導；
圖6A及6B呈現利用胰高血糖素類似物顯示受體媒介之cAMP誘導數據。更具體地說，圖6A比較胰高血糖素受體受胰高血糖素類似物(Gluc-NH2●、K12E16-NH2內醯胺▲、E16K20-NH2內醯胺▼、K20E24-NH2內醯胺及E24K28-NH2內醯胺)相對於胰高血糖素(■)的誘導，而圖6B比較胰高血糖素樣肽-1受體受胰高血糖素類似物(Gluc-NH2●、K12E16-NH2內醯胺▲、E16K20-NH2內醯胺▼、K20E24-NH2內醯胺及E24K28-NH2內醯胺)相對於胰高血糖素樣肽-1受體(■)的誘導；
圖7A及7B呈現利用胰高血糖素類似物顯示受體媒介之cAMP誘導數據。更具體地說，圖7A比較胰高血糖素受體受胰高血糖素類似物(Gluc-NH2●、E16 Gluc-NH2,▲、K12,E16 Gluc-NH2內醯胺▼、E16,K20 Gluc-NH2及E16,K20 Gluc-NH2內醯胺)相對於胰高血糖素(■)的誘導，而圖7B比較胰高血糖素樣肽-1受體受胰高血糖素類似物(Gluc-NH2●、E16 Gluc-NH2▲、K12,E16 Gluc-NH2內醯胺▼、E16,K20 Gluc-NH2及E16,K20 Gluc-NH2內醯胺)相對於胰高血糖素樣肽-1(■)的誘導；
圖8A～8F呈現由胰高血糖素類似物對胰高血糖素受體(圖8A、8C及8E)或胰高血糖素樣肽-1受體(圖8B、8D及8F)顯示受體媒介cAMP誘導的數據，其中hE=同麩胺酸(homoglutamic acid)及hC=同胱胺酸(homocysteic acid)；
圖9A及9B：呈現利用胰高血糖素樣肽-1(17-26)胰高血糖素類似物顯示受體媒介cAMP誘導的數據，其中天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)之第17至26號位置胺基酸經天然胰高血糖素樣肽-1(SEQ ID NO: 50)之第17至26號位置胺基酸取代。更具體地說，圖9A比較胰高血糖素受體受指定胰高血糖素樣肽(17-26)胰高血糖素類似物的誘導，及圖9B比較胰高血糖素樣肽-1受體受指定胰高血糖素樣肽(17-26)胰高血糖素類似物的誘導；
圖10A~10E：係提供展現本發明之胰高血糖素胜肽於經皮下注射指示量各別化合物之老鼠中，誘發減重能力之活體內(in vivo)數據的圖。圖10A-10E中所列之關於胰高血糖素胜肽的序列識別號(Sequence Identifiers)係如下，關於圖10A:Chimera 2 Aib2 C24 40K PEG(SEQ ID NO: 486)、Aib2 C24 Chimera 2 40K內醯胺(SEQ ID NO: 504)及Aib2 E16 K20 Gluc-NH2 Lac 40K(SEQ ID NO: 528)；圖10B: Aib2 C24 Chi 2內醯胺40K(SEQ ID NO: 504)、DMIA1 C24 Chi 2內醯胺40K(SEQ ID NO: 505)、Chimera 2 DMIA1 C24 40K(SEQ ID NO: 519)、及Chimera 2 Aib2 C24 40K(SEQ ID NO: 486)，其中在序列末端的數字係指示70或350nmol/kg的使用劑量；Fig.10C: AIB2 w/內醯胺C24 40K(SEQ ID NO: 504)、AIB2 E16 K20 w/內醯胺C24 40K(SEQ ID NO: 528)、DMIA1 E16 K20 w/內醯胺C24 40K(SEQ ID NO: 510)、DMIA1 E16 K20 w/內醯胺CEX 40K(SEQ ID NO: 513)及DMIA1 E16 K20 w/o內醯胺CEX 40K(SEQ ID NO: 529)；圖10D:AIB2 w內醯胺C24 40K(SEQ ID NO: 504)、AIB2 E16 K20 w內醯胺C24 40K(SEQ ID NO: 528)、DMIA1 E16 K20 w內醯胺C24 40K(SEQ ID NO: 510)及DMIA1 E16 K20 w內醯胺/Cex C24 40K(SEQ ID NO: 513)，其中在序列末端的數字係指示14或70奈莫耳/公斤/週(nmol/kg/wk)的使用劑量；Fig. 10E:AIB2 w/o內醯胺C24 40K(SEQ ID NO: 486)、Chi 2 AIB2 C24 CEX 40K(SEQ ID NO: 533)、AIB2 E16 A18 K20 C24 40K(SEQ ID NO: 492),AIB2 w/o內醯胺CEX G29 C40 40K(SEQ ID NO: 488)、AIB2 w/o內醯胺CEX C40 C41-2(SEQ ID NO: 532)、AIB2 w/o內醯胺CEX C24 C40-2(SEQ ID NO: 531)及AIB2 w/o內醯胺C24 60K(SEQ ID NO: 498)，其中40K或60K之指示係代表連接至胰高血糖素胜肽之聚乙二醇鏈的分子量；
圖11-13係提供經乙醯化之胰高血糖素胜肽於經皮下注射指示量各別化合物之老鼠中，展現能力的活體內(in vivo)數據圖表，該能力係指該經乙醯化之胰高血糖素胜肽誘發減重(圖11)、減少食物攝取量(圖12)、及降低血糖值；
圖14A及14B呈現利用胰高血糖素類似物分別顯示胰高血糖素及胰高血糖素樣肽-1受體媒介之cAMP誘導數據；
圖15表示一飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠中血糖值(mg/dL)與時間(分鐘)關係之圖表，該老鼠係以下述物質治療：2奈莫耳/公斤(nmol/kg)之賦形劑(以三角形代表)、Chimera-2 AIB2、K10-C8 Cys24-40kD PEG(以空心正方形代表)、或Chimera-2 AIB2、K10-C16 Cys24-40kD PEG (以倒三角形代表)，接著在該胜肽施予後以葡萄糖注射15分鐘；
圖16表示一飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠中血糖值(mg/dL)與時間(分鐘)關係之圖表，該老鼠係以下述物質治療：20奈莫耳/公斤(nmol/kg)之賦形劑(以三角形代表)、Chimera-2 AIB2、K10-C8 Cys24-40kD PEG(以空心正方形代表)、或Chimera-2 AIB2、K10-C16 Cys24-40kD PEG(以倒三角形代表)，接著在該胜肽施予後以葡萄糖注射15分鐘；
圖17表示一飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠中血糖值(mg/dL)與時間(分鐘)關係之圖表，該老鼠係以下述物質治療：70奈莫耳/公斤(nmol/kg)之賦形劑(以倒三角形代表)、Chimera-2 AIB2、K10-C8 Cys24-40kD PEG(以空心三角形代表)、或Chimera-2 AIB2、K10-C16 Cys24-40kD PEG(以鑽石形代表)、或Chimera-2 AIB2,Cys24-40kD PEG(以空心正方形代表)，接著在該胜肽施予後以葡萄糖注射15分鐘；
圖18表示一飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠中血糖值(mg/dL)與時間(分鐘)關係之圖表，該老鼠係以下述物質治療：70奈莫耳/公斤(nmol/kg)之賦形劑(以倒三角形代表)、Chimera-2 AIB2、K10-C8 Cys24-40kD PEG(以空心三角形代表)、或Chimera-2 AIB2、K10-C16 Cys24-40kD PEG(以鑽石形代表)、或Chimera-2 AIB2,Cys24-40kD PEG(以空心正方形代表)，接著在該胜肽施予後以葡萄糖注射24小時；
圖19表示一飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠中體重變化((%))與時間(天)關係之圖表，該老鼠係以下述物質治療：劑量15或70奈莫耳/公斤(nmol/kg)劑量之賦形劑(以實線鑽石形代表)、Chimera-2 AIB2,Cys24-40kD PEG(15奈莫耳/公斤以虛線空心鑽石形代表；70奈莫耳/公斤以實線空心三角形代表)；Chimera-2 AIB2、K10-C8 Cys24-40kD PEG(15奈莫耳/公斤以虛線實心三角形代表；70奈莫耳/公斤以實線實心三角形代表)、或Chimera-2 AIB2、K10-C16 Cys24-40kD PEG(15奈莫耳/公斤以虛線倒三角形代表；70奈莫耳/公斤以實線倒三角形代表)；
圖20表示一老鼠體重總變化圖表(%)，係在每週一次(QW)注射10、20、40或80奈莫耳/公斤(nmol/kg)之胜肽A K10-C14、或20 nmol/kg Chimera-2 AIB2 K10-C8 Cys24-40kD、或一賦形劑控制組；
圖21表示一血糖值(mg/dL)圖表，該血糖值係對應於老鼠之一葡萄糖注射，其係注射有10、20、40或80奈莫耳/公斤(nmol/kg)之胜肽A K10-C14、或20 nmol/kg Chimera-2 AIB2 K10-C8 Cys24-40kD、或在該葡萄糖注射前24小時之一賦形劑控制組；
圖22表示一老鼠體重總變化圖表(%)，該老鼠注射有標示劑量的賦形劑控制組、里拉盧的(liraglutide)、(C16)胰高血糖素醯胺、γE-γE-C16胰高血糖素醯胺、AA-C16胰高血糖素醯胺、或βAβA-C16胰高血糖素醯胺；
圖23表示一在此研究第七天測量的老鼠脂肪重量(g)圖表，該老鼠注射有標示劑量的賦形劑控制組、里拉盧的(liraglutide)、(C16)胰高血糖素醯胺、γE-γE-C16胰高血糖素醯胺、AA-C16胰高血糖素醯胺、或βAβA-C16胰高血糖素醯胺；
圖24表示一老鼠血糖值變化圖表(mg/dL；第七天的值-第0天的值)，該老鼠注射有標示劑量的賦形劑控制組、里拉盧的(liraglutide)、(C16)胰高血糖素醯胺、γE-γE-C16胰高血糖素醯胺、AA-C16胰高血糖素醯胺、或βAβA-C16胰高血糖素醯胺；
圖25表示在有10% TFE或沒有10% TFE的10 mM磷酸(pH5.9)中對胜肽X-PEG或胜肽Y-PEG之平均殘餘橢圓率(mean residue ellipticity)與波長(nm)關係之圖表；
圖26表示對應胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1、胜肽X、胜肽X-PEG、胜肽Y或結合有胰高血糖素受體(左)或胰高血糖素樣肽-1受體的胜肽Y-PEG而產生的% cAMP與波長(nm)胜肽濃度關係之圖表；
圖27表示以賦形劑控制組、胜肽X-PEG、胜肽Y-PEG治療一週之飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠中展現活體內(in vivo)效果之圖表集合，該效果係A)體重、B)脂肪質量、C)食物攝取量及D)空腹血糖值。更具體地說，圖27A表示一%體重(BW)變化與天數(天)關係之圖表，圖27B表示一在第7天測量之%脂肪重量變化(與初始脂肪重量測量比較)之圖表，圖27C表示一在第7天測量之此研究時間內總食物攝取量(g)之圖表，及圖27D表示一在第7天測量之血糖值變化(mg/dL)(與初始血糖值比較)之圖表；
圖28表示在各種劑量(nmol/kg/week)下，胜肽X-PEG(圖28A和圖28B)或胜肽Y-PEG(圖28C和圖28D)治療之老鼠中展現活體內(in vivo)效果之圖表集合，係：體重(圖28A和圖28C)及D)空腹血糖值(圖28B和圖28D)之圖表集合；
圖29表示以賦形劑控制組、胜肽X-PEG或胜肽Y-PEG治療一個月之飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠中展現活體內(in vivo)效果之圖表集合，係A)體重、B)脂肪質量、C)整體食物攝取量、D)能量消耗、E)呼吸商數(respiratory quotient)、F)動作行為活性(locomotor activity)、G)空腹血糖值(fasting blood glucose)、H)葡萄糖耐量及I)總血漿胰島素值之圖表集合；
圖30表示以賦形劑控制組、胜肽X-PEG或胜肽Y-PEG治療一個月之飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠中展現活體內(in vivo)第三週對熱量測量效果之圖表集合，係A)食物攝取量、B)總能量消耗、C)總呼吸商數、D)動作行為活性、E)總動作行為活性、F)ipGTT曲線下的面積、G)血漿C胜肽值(plasma C-peptide levels)、H)PEPCK/HPRT倍數表現(fold expression)、及I)G6P/HPRT倍數表現之圖表集合；
圖31表示以賦形劑控制組、胜肽X-PEG、胜肽Y-PEG治療一個月之飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠中展現活體內(in vivo)對血漿效果之圖表集合，係A)膽固醇、B)膽固醇FPLC、C)三酸甘油酯、D)瘦體素(leptin)、E)抵抗素(resistin)、及F)脂締素(adiponectin)之圖表集合；
圖32表示以賦形劑控制組、胜肽X-PEG、胜肽Y-PEG治療之老鼠中，藉由激素敏感性脂解酶(pHSL)之磷酸化所反映在A)BATUCP-1表現值及B)白色脂肪組織展現活體內(in vivo)效果之圖表集合；
圖33表示以賦形劑控制組、胜肽X-PEG或胜肽Y-PEG治療之飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠中展現活體內(in vivo)效果之圖表集合，係A)體重及B)脂肪質量之圖表集合。圖33C表示一即時RT-PCR所定量評估之CD68對TFIIB相對表現之圖表，係由賦形劑控制組、胜肽X-PEG或胜肽Y-PEG治療兩週之老鼠分離出之副睪脂肪組織之圖表。數據係經顯現為對TF1IB mRNA表現正常化的相對CD68 mRNA表現，且表示為平均崆EM；
圖34A至34F表示以賦形劑控制組、胜肽X-PEG或胜肽Y-PEG治療之GLP-1-R基因剔除老鼠中展現活體內(in vivo)效果之圖表集合，係對體重(BW；34A及34B)、脂肪質量(34C)、食物攝取量(34D)及血糖值(34E及34F)之圖表集合；
圖35A至35C表示以賦形劑控制組、胜肽V、或胜肽U治療之飲食誘導肥胖模式(DIO)老鼠中展現活體內(in vivo)效果之圖表系列，係體重(35A)、血糖(35B)及脂肪質量(35C)之圖表系列；
圖36表示一在此研究第十四天測量的老鼠體重總變化圖表(%)，該老鼠注射有標示劑量的賦形劑、里拉盧的(liraglutide)、胰高血糖素醯胺、MT-261、MT-345、MT-347、或MT-348；
圖37表示一在此研究第七天測量的老鼠體重總變化圖表(%)，該老鼠注射有標示劑量的賦形劑、MT-278、MT-358、MT-261、MT-297、或MT-364；
圖38表示一在此研究第七天測量的老鼠體重總變化圖表(%)，該老鼠注射有標示劑量的唯一賦形劑、胜肽83、胜肽900、胜肽901或MT-364。

Claims (21)

  1. 一種胰高血糖素胜肽之一類似物，該類似物包含下列胺基酸修飾的胺基酸序列SEQ ID NO：1：(i)該類似物的第2號位置之胺基酸係選自於D-絲胺酸、丙胺酸、D-丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸、N-甲基丙胺酸以及胺基異丁酸(AIB)所組成之群；(ii)該類似物的第3號位置為麩醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸類似物；(iii)該類似物的第7號位置為蘇胺酸或異白胺酸；(iv)該類似物的第10號位置為酪胺酸、色胺酸或包含對自然生成之胺基酸來說是非自然的一醯基或烷基之一胺基酸；(v)該類似物的第12號位置為離胺酸或異白胺酸；(vi)該類似物的第15號位置為天冬胺酸或麩胺酸；(vii)該類似物的第16號位置為麩胺酸；(viii)該類似物的第17號位置為麩醯胺酸；(ix)該類似物的第18號位置為丙胺酸；(x)該類似物的第20號位置為離胺酸；(xi)該類似物的第21號位置為麩胺酸；(xii)該類似物的第23號位置為異白胺酸；(xiii)該類似物的第24號位置為丙胺酸；(xiv)該類似物的第27號位置為白胺酸、甲硫胺酸或正白胺酸(Nle)；(xv)該類似物的第28號位置為丙胺酸或天冬醯胺酸； (xvi)該類似物的第29號位置為甘胺酸、蘇胺酸或丙胺酸；(xvii)該類似物包括GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：26)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：674)之胺基酸序列，其中X為任何胺基酸，其中該胺基酸序列係連接至該類似物之第29號位置之羧基端；及(xviii)該類似物包括一延伸之胺基酸，其包含有對自然發生之胺基酸來說是非自然的一醯基或一烷基，且該延伸之胺基酸係連接至SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：674之羧基端；其中當該類似物缺少一親水性基團時，該類似物於胃抑胜肽(GIP)受體顯現至少約10%之天然胃抑胜肽(GIP)活性，且其中該類似物之胰高血糖素樣肽-1受體的選擇性係小於100倍(高於或低於)於該胰高血糖素樣肽受體的選擇性。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之類似物，係包含一羧基端醯胺。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之類似物，係包含位在第2號位置的丙胺酸或胺基異丁酸(AIB)。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之類似物，係包含一或多個下列修飾：a.第2號位置為丙胺酸；b.第3號位置為麩胺酸或麩醯胺酸類似物；c.第7號位置為異白胺酸；d.第10號位置為色胺酸或包含對自然生成之胺基酸來說是非自然的一醯基或烷基之一胺基酸；e.第12號位置為異白胺酸；f.第15號位置為麩胺酸； g.第27號位置為白胺酸或正白胺酸(Nle)；及h.第29號位置為甘胺酸。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之類似物，其中包含一醯基或烷基之該胺基酸係為化學式I、II或III，其中化學式I之結構為： 其中n為1至4；其中化學式II之結構為： 其中n為1至4；其中化學式III之結構為： 其中n為1至4。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之類似物，其中包含該醯基或烷基的該胺基酸係為離胺酸。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之類似物，其中該醯基係為一C4至C30脂肪醯基。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之類似物，其中該醯基係為C12至C18脂肪醯基。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之類似物，其中該醯基係為C14至C16脂肪醯基。
  10. 如申請專利範圍第5項所述之類似物，其中該醯基或烷基係藉由一間隔物共價性連接至該胺基酸之該側鏈。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之類似物，其中該間隔物係為一胺基酸或雙肽。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之類似物，其中該雙肽選自於由丙胺酸-丙胺酸、β-丙胺酸-β-丙胺酸、白胺酸-白胺酸及脯胺酸-脯胺酸所組成之群。
  13. 如前述申請專利範圍第1項所述之類似物，其中該類似物係共價性連接至於第16、17、20、21、24、29、40號位置之胺基酸任何位置之一親水性基團。
  14. 如前述申請專利範圍第1項所述之類似物，其係包含SEQ ID NO：669之胺基酸序列。
  15. 一種包含兩胰高血糖素肽肽之二聚體，其中該胰高血糖素胜肽中至少一個如申請專利範圍第1項至第14項中任一項所述之類似物，透過一連接物連接至另一者。
  16. 一種結合物(conjugate)，其包含如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之類似物，其中該類似物係鍵結至一結合物基團。
  17. 如申請專利範圍第16項之結合物，其中該結合物基團係為選自於由血漿蛋白、免疫球蛋白或其部位所組成之群的多肽。
  18. 一種藥學組合物，包含如申請專利範圍第1項至第14項中任一項所述之一類似物以及一其藥學可接受鹽類，及一藥 學可接受載體。
  19. 一種藥學組合物，包含如申請專利範圍第15項中所述之二聚體。
  20. 一種藥學組合物，包含如申請專利範圍第16項中所述之結合物。
  21. 一種如申請專利範圍第1項至第14項中任一項所述之一類似物之用途，其係用於製造治療糖尿病、減少體重增加或導致體重降低之藥劑。
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