HK1098764A - 包含人hsp70 atpase结构域与抗原肽的融合蛋白及其应用 - Google Patents

Description

包含人HSP70 ATPase结构域与抗原肽的融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种包含热休克蛋白的三磷酸腺苷酶(以下简称ATPase)结构域和抗原肽的融合蛋白，更具体地说，本发明涉及包含人HSP70 ATPase结构域与人乳头瘤病毒E7、E6蛋白或者哺乳动物p53蛋白的融合蛋白。本发明还涉及包含上述融合蛋白的药物组合物、编码上述融合蛋白的基因、包含所述基因的表达载体及其在制备用于治疗或预防人乳头瘤病毒相关的肿瘤或p53蛋白过量表达有关的肿瘤的药物中的用途。

背景技术

很久以前就发现热休克蛋白(heat shock protein，Hsp)具有促进蛋白质分子正确折叠的作用。最近又发现Hsp70、Hsp90及Grp94(也称gp96)可以将肿瘤抗原肽提交给抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)的MHC分子上，并被T细胞识别(综述见Srivastava and Amato，2001；Srivastava，2003)。Hsps通过肽结合域以非共价形式和肿瘤抗原肽结合，形成Hsp和抗原肽复合物，作用于APCs表面的Hsp受体(CD91)后被内吞入细胞内，然后Hsp和抗原肽复合物进入内质网，抗原肽从Hsp上释放出来并和MHC分子结合，抗原肽被MHC分子呈递到APC表面。此外，Hsp分子还可通过促炎细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的产生(van Eden et al，2003)，强烈激活先天免疫。因此，Hsp和肿瘤抗原肽复合物可通过先天免疫和后天免疫的加强，抵抗癌症的发生以及病毒和细菌感染。

Hsp分子和抗原肽融合蛋白是通过共价键将Hsp分子和抗原肽连接在一起。有证据表明，这种融合蛋白可有效地促进针对抗原肽的免疫反应(Chu etal，2000)。WO2004/098526A2和RU2229307C1中公开了可将HSP70或其C端活性结构域与HPV的E6或E7蛋白融合构建成融合蛋白，用于抗肿瘤或感染性疾病，并且可增强免疫反应。WO0049041A1中提及在抗癌或治疗感染的融合蛋白中可用热休克蛋白的ATPase结构域与抗原肽融合。CN1401778A中公开了可将腺病毒载体与人p53基因构建成重组体用于治疗恶性肿瘤。CN1380392A提供了一种新的共表达人p53基因和人细胞因子(如白细胞介素2)基因的重组腺病毒。

但是，全长的Hsp70和肿瘤抗原肽或病原体抗原形成的融合蛋白表达量很低，很难进行工业生产规模的放大。

发明内容

本发明一方面提供了一种融合蛋白，包含人Hsp70的ATPase结构域以及人乳头瘤病毒的E7蛋白和人乳头瘤病毒的E6蛋白中的一种。

本发明还提供了一种用于治疗或预防人乳头瘤病毒相关肿瘤的药物组合物，包含有效量的本发明的融合蛋白。

本发明还提供了一种核酸分子，其编码本发明的融合蛋白。本发明还提供了包含所述核酸分子以及必要的基因调控元件的表达载体。

本发明还提供了所述融合蛋白、核酸分子以及表达载体在制备用于治疗或预防人乳头瘤病毒相关肿瘤的药物中的用途。

在本发明的这一方面中，所述人乳头瘤病毒相关肿瘤选自：宫颈癌、肛门上皮内瘤、子宫颈上皮内瘤、肛门生殖器疣、复发呼吸道乳头状瘤及阴道上皮内肿瘤。

本发明另一方面提供了一种融合蛋白，包含人Hsp70的ATPase结构域以及哺乳动物的p53蛋白。在一个优选实施方式中，所述的p53蛋白来源于人。

本发明还提供了一种用于治疗或预防与突变引起的p53蛋白过量表达有关的肿瘤的药物组合物，包含有效量的本发明的融合蛋白。

本发明还提供了一种核酸分子，其编码本发明的融合蛋白。本发明还提供了包含所述核酸分子以及必要的基因调控元件的表达载体。

本发明还提供了所述融合蛋白、核酸分子以及表达载体在制备用于治疗或预防与突变引起的p53蛋白过量表达有关的肿瘤的药物中的用途。

本发明采用Hsp70的ATPase结构域构建融合蛋白，使其在E.coli中的表达水平大幅提高。用Hsp70的ATPase结构域构建的融合蛋白仍然保留了ATPase活性，而且对与之结合的肿瘤抗原或病原体抗原具有强免疫反应。

与现有技术中采用的细菌热休克蛋白相比，本发明采用人源HSP70的ATPase结构域构建融合蛋白，使机体的不良反应更小，免疫效果更好。

本发明人意外地发现，本发明的融合蛋白取得了特别好的效果，对肿瘤细胞的杀伤活性显著高于对照组。在小鼠中进行的试验表明，本发明的融合蛋白作为疫苗免疫动物，既能产生治疗性作用，也能产生预防性作用。所以，本发明融合蛋白在抗肿瘤或感染疾病的治疗上具有广阔前景。

附图说明

附图不一定是成比例的，其目的仅仅在于更好地解释本发明，以便于读者理解。将附图与具体实施方式结合在一起，可以更好地理解本发明。

图1示出了AE7预防性免疫对TC-1荷瘤小鼠的保护作用。第2次免疫后10天，在小鼠右侧接种1.3×10⁵TC-1细胞，观察38天内肿瘤发生率。第44天时(弯箭头)对无瘤小鼠再次接种(左侧)5×10⁵TC-1细胞，同时新取1组未经处理的小鼠也接种同样剂量的TC-1细胞，作为对照组，继续观察40天。

图2示出了AE7治疗性免疫对TC-1荷瘤小鼠的保护作用。在小鼠右侧接种1.3×10⁵TC-1细胞后第5和第19天，用135μg AE7或PBS免疫小鼠，观察肿瘤发生率。第49天时(弯箭头)对无瘤小鼠再次接种(左侧)5×10⁵TC-1细胞，同时新取1组未经处理的小鼠也接种同样剂量的TC-1细胞，作为对照组，继续观察39天。AE7免疫治疗可显著降低肿瘤发生率(A)、提高长期存活(B)、抑制肿瘤生长(C)。

图3示出了AE7诱导的特异性CTL反应。C57BL/6(n＝3)分别用PBS、AE7或E7免疫，7天后，取脾细胞和丝裂霉素C处理的TC-1细胞孵育5天，分别以TC-1细胞(A)和Lewis肺癌细胞(B)作为靶细胞检测CTL活性。

图4示出了AE6预防性免疫对TC-1荷瘤小鼠的保护作用。第2次免疫后10天，在小鼠右侧接种1.3×10⁵TC-1细胞，观察32天内肿瘤发生率。第36天时(弯箭头)对无瘤小鼠再次接种(左侧)5×10⁵TC-1细胞，同时新取1组未经处理的小鼠也接种同样剂量的TC-1细胞，作为对照组，继续观察30天。

图5示出了AE6治疗性免疫对TC-1荷瘤小鼠的保护作用。在小鼠右侧接种1.3×10⁵TC-1细胞后第5和第19天，用127μg AE6或PBS免疫小鼠，观察肿瘤发生率。第42天时(弯箭头)对无瘤小鼠再次接种(左侧)5×10⁵TC-1细胞，同时新取1组未经处理的小鼠也接种同样剂量的TC-1细胞，作为对照组，继续观察39天。AE6免疫治疗可显著降低肿瘤发生率(A)，提高长期存活(B)。

图6示出了hAP53预防性免疫延长荷瘤小鼠的存活(Kaplan-Meier分析)。

图7示出了hAP53治疗性免疫延长荷瘤小鼠的存活。

图8示出了hAP53诱导的mp53-p815细胞特异性的CTL反应。其中，A：mp53-p815靶细胞，B：p815靶细胞；^*P＜0.05，^**P＜0.01：与PBS组比较。

图9示出了hAP53免疫对NK细胞杀伤活性的影响。

具体实施方式

本发明的融合蛋白中，除了人HSP70的三磷酸腺苷酶结构域以及人乳头瘤病毒的E7/E6蛋白或者哺乳动物p53蛋白之外，还可以含有其它序列，例如亲和纯化标签(例如His Tag)等。

本发明还提供了一种药物组合物，其中包含治疗或预防有效量的本发明的融合蛋白。本发明的药物组合物中还可以含有合适量的药学上可接受的载体，以便提供适于向病人给药的形式。在一个具体实施方式中，术语“药学上可接受的”是指经国家药品管理机构批准或列在中国药典或其它公认的用于哺乳动物尤其是人的外国药典上。术语“载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、佐剂、赋形剂等。这样的药物载体可以是无菌液体，如水和油的盐溶液，包括石油，动物，植物或合成的来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物用于静脉施用时，盐溶液是优选的载体。盐溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以作为液体载体，特别是作为注射用溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、干粉脱脂牛奶、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

术语“有效量的”是指提供临床医师或者其他有资格的观察人员注意到的客观上可鉴定的改善的药物剂量。

编码本发明融合蛋白的核酸分子可以和必要的基因调控元件可操作地连接，例如启动子、增强子、筛选标记等。

在本文中，术语“蛋白”、“蛋白质”、“肽”、“多肽”可以互换使用，表示由两个或更多个氨基酸通过肽键连接而形成的聚合物。

本文中所用的术语“人乳头瘤病毒相关肿瘤”是指与人乳头瘤病毒有关的肿瘤，包括但不限于宫颈癌(cervical cancer)、肛门上皮内瘤(analintraepithelial neoplasia)、子宫颈上皮内瘤(cervical intraepithelialneoplasia)、肛门生殖器疣(anogenital warts)、复发呼吸道乳头状瘤(recurrent respiratory papillomatosis)及阴道上皮内肿瘤(vulvalintraepithelial neoplasia)等。

本文中所用的术语“与突变引起的p53蛋白过量表达有关的肿瘤”是指该肿瘤的发展与突变引起的p53蛋白过量表达有关。该肿瘤可以发生在机体的各个部位，包括肝脏、肺、肾、结肠、子宫等部位。在该类肿瘤中，p53基因发生突变从而导致p53蛋白过量表达，并被提呈至肿瘤细胞的表面。

为了更加详细地解释本发明，下面将结合附图给出本发明的具体实施方式。这些具体实施方式仅仅是出于解释和说明的目的，不应该被理解为是对本发明范围的限制。在对这些具体实施方式进行描述时，没有对公知的实验方法、仪器、试剂和材料等进行详细的描述，以避免喧宾夺主、淡化了本发明的主要内容。

实施例1、重组人HSP70 ATPase结构域与HPV E7融合蛋白(AE7)编码

                基因的构建及表达

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)的E7和E6蛋白在HPV感染病人的肿瘤发生方面具有重要作用(Fehrmann and Laimins，2003)，因此，HPV感染病人细胞表面的E7和E6蛋白作为肿瘤抗原可以被T细胞识别。Hsp70的ATPase域和E7/E6组成的融合蛋白可以增强人体对HPV病毒及其引发的宫颈癌的免疫反应。我们将Hsp70的ATPase域和E7的融合蛋白称为AE7，将Hsp70的ATPase域和E6的融合蛋白称为AE6。

人Hsp70 ATPase域基因(氨基酸残基1-386)从人Hsp70全长基因通过PCR获得。HPV病毒16型E7基因从该病毒基因组PCR获得。Hsp70ATPase域PCR产物用限制性内切酶NdeI和BamH I酶切连接到S28b载体，并命名为S28bA。HPV E7的PCR产物用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切连接到S28bA，命名为S28bAE7，对AE7核酸序列进行测序确证。AE7纯品的ATPase活性用孔雀绿法检测，结果表明重组AE7具有水解ATP的全部功能。

将转化有AE7表达质粒的大肠杆菌菌株BL21(DE3)在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中于37℃高密度发酵，OD₆₀₀达45-50时，加入500mM IPTG诱导表达5小时，离心收菌。用A液(25mM Tris-HCl，50～100mM NaCl，5mM EDTA，pH7.5)洗涤3次后，再用A液悬浮沉淀，超声破碎，1200～1800W功率，每次10秒，间隔10秒，共超破60～80次，超破温度10度；超破结束后离心收集沉淀即为包涵体。包涵体依次用B液(25mM Tris-HCl，50～100mM NaCl，pH7.5)和C液(25mM Tris-HCl，50～100mM NaCl，1.5％TritonX-100，1.5～2.0M(NH₂)₂CO，pH7.5)各洗涤3次后，再用B液洗涤1次。将沉淀按重量体积比为1∶1的比例加入B液混匀，再按重量体积比为1∶10～1∶20的比例加入D液(25mM Tris-HCl，50～100mMNaCl，5～10mM DDT，6～8M(NH₂)₂CO，pH7.5)混匀，室温搅拌2小时以上，10000～18000rpm离心30分钟，收集上清即为包涵体变性液G。

缓慢将G液滴加入E液(25mM Tris-HCl，0.1～0.3mM NaCl，1mMDDT，1M(NH₂)₂CO，5mM EDTA，10mM KCl，0.3M Arg，pH8.0)中，至蛋白终浓度为0.2～0.5mg/ml，即为稀释复性液H，然后，将H液灌透析袋和E液按1∶5的体积比例透析过夜。

用I液(25mM Tris-HCl，pH8.0)平衡DEAE层析柱，取透析后的H液上样，然后用I液冲洗，再依次用J液(25mM Tris-HCl，0.1mM NaCl，pH8.0)和K液(25mM Tris-HCl，0.5mM NaCl，pH8.0)洗脱，收集洗脱峰，即为AE7 DEAE收集峰S。

用N液(25mM Tris-HC，0.2NaCl pH8.0)平衡层析柱，取S液上样，上样结束后依次用N液、O液(25mM Tris-HC，0.2NaCl，25mM咪唑，pH8.0)和P液(25mM Tris-HC，0.2NaCl，0.5％Triton，pH8.0)冲洗，用Q液(25mM Tris-HC，0.2NaCl，500mM咪唑，pH8.0)洗脱收集洗脱峰，即为AE7亲和收集峰T。

用R液(10mM柠檬酸钠，0.2NaCl)平衡层析柱，取T液按柱体积的1～3％上样，上样结束后，用R洗脱，收集洗脱峰，即为AE7纯化液。用SDS-PAGE检验纯度＞95％。

实施例2、重组人HSP70 ATPase结构域与HPV E6融合蛋白(AE6)编码基因

                        的构建及表达

HPV病毒16型E6基因从该病毒基因组PCR获得，PCR产物用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切连接到S28bA，命名为S28bAE6，对AE6核酸序列进行测序确证。

S28bAE6质粒转化入E coli BL21(DE3)菌株进行蛋白表达。AE6蛋白的表达方法与AE7相同。AE6蛋白复性和纯化与AE7类似，AE6的ATPase活性用孔雀绿法检测，结果表明重组AE6具有水解ATP的全部功能。

实施例3、重组人HSP70 ATPase结构域与人p53融合蛋白(hAP53)编码基因

                         的构建及表达

人p53基因以人肝cDNA文库为模板通过PCR获得。人p53基因的PCR产物用限制性内切酶酶切后连接到S28bA，命名为S28bhAP53，通过DNA测序确证目的基因的核酸序列。

hAP53的蛋白表达、复性和纯化方法与AE7类似，ATPase活性用孔雀绿法检测，结果表明重组hAP53具有水解ATP的全部功能。

实施例4、本发明药物AE7和AE6对C57BL/6小鼠TC-1移植瘤的

                     预防和治疗作用

在本实施例中，所用动物为雌性C57BL/6小鼠，6-8周大小。

瘤株：TC-1细胞株(ATCC)，来自C57BL/6小鼠原代肺上皮细胞，携带HPV-16(人乳头瘤病毒)的E6/E7及人c-Ha-ras致癌基因。

TC-1细胞培养：以RPMI1640(Gibco)+10％FBS(Hyclone)为培养基，在37℃，5％CO₂孵箱中培养。

TC-1细胞接种：剪去小鼠右侧被毛(或用8％Na₂S脱毛)，75％酒精消毒皮肤，取0.2ml TC-1细胞悬液(约含1.3×10⁵个细胞)皮下注射，此后每隔3-4天观察肿瘤生长情况，并用游标卡尺测量肿瘤的长宽径，按公式长×宽²÷2计算肿瘤体积，绘制肿瘤体积生长变化图。

免疫程序：

1治疗作用研究：右侧接种1.3×10⁵个TC-1细胞后5天，取0.2ml AE7(135μg)、AE6(127μg)或等体积PBS注射于小鼠颈部皮下(每组10只)，进行初次免疫；14天后以相同剂量免疫第2次。接种肿瘤后约40天，在AE7或AE6组无瘤小鼠的左侧接种5×10⁵个TC-1细胞，继续观察约30天。同时另取一批未接受过任何处理的小鼠，左侧接种5×10⁵个TC-1细胞作为对照。

2预防作用研究：取0.2ml AE7(135μg)、AE6(127μg)或等体积PBS注射于小鼠颈部皮下(每组10只)，进行初次免疫，14天后以相同剂量免疫第2次。再10天后，给小鼠接种1.3×10⁵个TC-1细胞，约30天后，在AE7或AE6组无瘤小鼠的左侧接种5×10⁵个TC-1细胞，继续观察约30天。同时另取一批未接受过任何处理的小鼠，左侧接种5×10⁵个TC-1细胞作为对照。

免疫小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对TC-1的体外杀伤活性检测：

C57BL/6小鼠(每组3-4只)分别颈部皮下注射AE7(135μg)、E7或PBS，共两次，间隔7天，末次免疫后7天，将每组分离的小鼠脾细胞合并后，用淋巴细胞分离液分离，2×10⁷个脾细胞和1×10⁶个丝裂霉素C处理的TC-1细胞在6孔板中混合培养5天，然后用淋巴细胞分离液分离出脾细胞，作为效应细胞；以TC-1作为靶细胞，每孔10000个，效应细胞和靶细胞的比例分别为11∶1、33∶1、100∶1(重复3次)，培养4h后，取上清，用非放射性的细胞毒检测试剂盒(Promega)检测乳酸脱氢酶的释放量。按下述公式计算细胞裂解百分率：

结果：

一、AE7免疫对TC-1荷瘤小鼠的保护作用

1AE7预防性免疫对接种TC-1肿瘤小鼠的保护作用

经两次AE7免疫后接种TC-1，PBS对照组3-4天后开始形成肿瘤结节，在观察期内，肿瘤发生率为100％；AE7组仅在观察后期，发现10只小鼠中的1只有肿瘤，AE7的保护率为90％。AE7组的无瘤小鼠再次接种更大剂量的TC-1后，9只小鼠中仍然有8只无肿瘤，而同期对照组肿瘤发生率为100％。(Fig1)

2AE7治疗性免疫对TC-1荷瘤小鼠的保护作用

接种TC-1后第5天，AE7和PBS对照组均有30％-40％的小鼠形成肿瘤，此时开始免疫，免疫后第9天，对照组肿瘤发生率达100％，AE7组为60％，随后AE7组小鼠肿瘤逐渐消失，至第2次免疫前，AE7组肿瘤发生率已降至30％，而对照组仍为100％。第2次免疫后，AE7组肿瘤发生率降至20％。AE7组的8只无瘤小鼠，再次接种更大剂量的TC-1后，最终也未发现肿瘤(Fig2a)。在88天的观察期内，AE7组小鼠无死亡，对照组死亡90％(Fig2b)。与对照组比较，AE7组两只小鼠的肿瘤生长速度非常缓慢(Fig2c)。

3AE7免疫可增加TC-1特异性的CTL细胞的杀伤活性

AE7免疫小鼠的脾细胞中TC-1细胞特异性的CTL的杀伤活性显著高于E7对照组和PBS对照组(p＜0.01)，而E7免疫小鼠脾细胞对TC-1细胞的的杀伤活性与PBS对照组无明显差别(p＞0.05)(Fig3)。

二、AE6免疫对TC-1荷瘤小鼠的保护作用

1AE6预防性免疫对接种TC-1肿瘤小鼠的保护作用

用与AE7相同剂量(按摩尔数)的AE6免疫后，可提供70％的保护率，即70％小鼠不出现肿瘤；PBS组的1只无瘤小鼠再次接种更大剂量的TC-1后，很快长出肿瘤，而AE6组无瘤小鼠再次接种TC-1后，7只小鼠中仍然有6只无肿瘤(Fig4)。

2AE6治疗性免疫对TC-1荷瘤小鼠的保护作用

先接种TC-1，再用AE6治疗，仅50％小鼠不出现肿瘤；该组的无瘤小鼠再次接种更大剂量的TC-1后，有1只小鼠一过性出现肿瘤，观察期末，均未有肿瘤(Fig5)。

结论：AE6和AE7无论是预防性免疫还是治疗性免疫，均对表达E6/E7抗原的肿瘤细胞TC-1有显著的抑制作用，而且AE7对接种TC-1小鼠的保护作用明显优于AE6。小鼠CTL细胞对TC-1的特异性裂解实验表明，细胞免疫的诱导可能是AE7/AE6发挥作用的主要机制。

实施例5、本发明药物hAP53对Balb/c小鼠mp53-p815移植瘤的

                    预防和治疗作用

在本实施例中，所用动物为雌性Balb/c小鼠，6-8周大小。

肿瘤细胞系mp53-P815的建立：

将质粒pRC/CMVp53(含135位Cys→Tyr点突变的人p53基因)，采用lipofectamine共转染法导入P815小鼠肥大瘤细胞系(mouse mastocytoma cellline，from ATCC)，以含600mg/L G418的培养液选择抗性克隆，并以免疫细胞化学染色法初检p53蛋白的表达，所获阳性克隆进一步用有限稀释法再克隆化培养，用Westernblot检测p53蛋白的表达。挑选p53表达高、全阳性的克隆作为表达突变p53蛋白的肿瘤细胞系mp53-P815，置于含600mg/L G418的DMEM培养基中培养。本实施例中构建含135位Cys→Tyr点突变的人p53基因，是因为癌症患者经常伴有该位点基因突变，发生该突变的人p53基因大量异常表达有功能缺陷的p53蛋白，并被MHC I类分子提呈至肿瘤细胞表面。而在正常人体内，人p53基因的表达量很低。

免疫程序：

1治疗作用研究：20只小鼠，分两组(n＝10)：hAP53治疗组和PBS对照组。分别于小鼠尾静脉接种致死剂量1×10⁶的mp53-P815细胞后第3天和第13天，取0.2ml hAP53 200μg或等体积PBS注射于小鼠颈部皮下，进行免疫。观察各免疫组小鼠的存活时间和存活率。

2预防作用研究：20只小鼠，分两组(n＝10)：hAP53组和PBS对照组。取0.2ml hAP53 200μg或等体积PBS注射于小鼠颈部皮下，进行首次免疫，间隔10天后，行第2次免疫。此后第10天，给小鼠尾静脉接种致死剂量(1×10⁶)的P815-mp53细胞，观察各免疫组小鼠的存活时间和存活率。

CTL及NK细胞杀伤活性的测定：

将合并的各组小鼠的脾细胞(每组3-4只)，用淋巴细胞分离液分离，2×10⁷个脾细胞和2×10⁶个丝裂霉素C处理的mp53-P815细胞在6孔板中混合培养5天，然后用淋巴细胞分离液分离出脾细胞，作为效应细胞；以mp53-P815细胞作为靶细胞，每孔10000个，效应细胞和靶细胞的比例分别为20∶1、40∶1、80∶1(重复3次)，培养4h后，取上清，用非放射性的细胞毒检测试剂盒(Promega)检测乳酸脱氢酶的释放量。按下述公式计算细胞裂解百分率：

小鼠脾细胞分离后可立即进行NK细胞活性检测，每孔10000个YAC-1靶细胞，效应细胞和靶细胞的比例及检测方法同上。

结果：

1hAP53预防性免疫对mp53-P815荷瘤小鼠的保护作用

在接种致死剂量的mp53-P815肿瘤细胞13天后，对照组小鼠开始陆续死亡，28天内全部死去，平均存活期为22.4±1.33天。而hAP53组在接种肿瘤25天后开始死亡，70天的观察期内仅有4只(40％)小鼠死去，平均存活期为57.1±5.19天，显著长于对照组(P＜0.001)，表明hAP53的预防免疫可显著延长荷瘤小鼠的存活期。(图6)

2hAP53治疗性免疫对mp53-P815荷瘤小鼠的保护作用

对照组小鼠在接种mp53-P815肿瘤后35天内全部死去，平均存活期为25.7±2.27天。而接种肿瘤3天后开始的hAP53免疫治疗，仍然使小鼠的存活期大大延长，观察结束时，只有7只小鼠死亡，平均存活期为47.9±2.27天，显著长于对照组(P＜0.01)(图7)。

3hAP53免疫可增加特异性CTL细胞的杀伤活性

hAP53或PBS加强免疫后1周，取两组各3只小鼠的脾细胞，进行mp53-p815细胞特异性的CTL的杀伤活性检测，可见hAP53组mp53-p815细胞特异性的CTL反应显著高于PBS对照组(p＜0.01，或＜0.05)，而hAP53组对p815细胞的CTL反应与PBS组无明显差别(p＞0.05，图8)。对NK细胞的杀伤活性检测表明，hAP53组和PBS组的NK细胞对YAC-1靶细胞的杀伤活性无明显差别(p＞0.05，图9)。以上结果表明，hAP53增强了特异性的T细胞介导的细胞免疫反应。

结论：hAP53无论是预防性免疫还是治疗性免疫，均可显著延长接种mp53-p815肿瘤小鼠的生存期，特异性CTL杀伤活性的增强是hAP53发挥抗肿瘤作用的主要机制。

上述实施例中所涉及的具体实验方法可以参考Molecular Cloning：ALABORATORY MANUAL(3rd Edition)(J.Sambrook，P.MacCallum，D.Russell，Cold Spring Harber Laboratory Press，2001)以及黄培堂等(2002)译的《分子克隆实验指南》。

本文中所涉及的参考文献，包括专利文件、学术论文、出版物等，均以引用的方式将其全部内容包括在本文中。

应当注意，本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，如果在文中没有特别说明，则本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。

本文中所涉及的各种实验用品(包括但不限于：化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等)之中，对于那些特殊的或不易获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，在本发明申请日之前，可以通过各种方式(例如购买、自行制备等)很方便地获得。

应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。例如，根据密码子简并原则或碱基互补原则所获得的功能基本相同的核酸分子，以及在对蛋白质功能不起主要作用的位点上进行氨基酸替换所得到的功能基本相同的蛋白质或多肽，均被认为落入了本发明的保护范围。

参考文献

Basu，S.，R.J.Binder，T.Ramalingam，P.K.Srivastava.2001.CD91 is acommon receptor for heat shock proteins gp96，hsp90，hsp70，and calreticulin.Immunity 14：303.

Chu NR，Wu HB，Wu T，Boux LJ，Siegel MI，Mizzen LA.Immunotherapyof a human papillomavirus(HPV)type 16 E7-expressing tumour byadministration of fusion protein comprising Mycobacterium bovis bacilleCalmette-Guerin(BCG)hsp65 and HPV16 E7.Clin Exp Immunol.2000

Fehrmann F，Laimins LA.Human papillomaviruses：targetingdifferentiating epithelial cells for malignant transformation.Oncogene.2003

Srivastava，PK.Hypothesis：controlled necrosis as a tool forimmunotherapy of human cancer.Cancer Immun.2003

Srivastava PK，Amato RJ.Heat shock proteins：the′Swiss Army Knife′vaccines against cancers and infectious agents.Vaccine.2001

van Eden W，Koets A，van Kooten P，Prakken B，van der Zee R.Immunopotentiating heat shock proteins：negotiators between innate dangerand control of autoimmunity.Vaccine.2003

Claims (13)

1.一种融合蛋白，包含：

人HSP70的三磷酸腺苷酶结构域；以及

人乳头瘤病毒的E7蛋白和人乳头瘤病毒的E6蛋白中的一种。

2.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白由如下组分构成：

人HSP70的三磷酸腺苷酶结构域；以及

人乳头瘤病毒的E7蛋白和人乳头瘤病毒的E6蛋白中的一种。

3.一种用于治疗或预防人乳头瘤病毒相关肿瘤的药物组合物，其中包含有效量的权利要求1或2的融合蛋白。

4.一种核酸分子，其编码权利要求1或2的融合蛋白。

5.一种表达载体，包含权利要求4的核酸分子以及必要的基因调控元件。

6.权利要求1或2的融合蛋白、权利要求4的核酸分子或权利要求5的表达载体在制备用于治疗或预防人乳头瘤病毒相关肿瘤的药物中的用途。

7.一种融合蛋白，包含人HSP70的三磷酸腺苷酶结构域以及哺乳动物的p53蛋白。

8.根据权利要求7的融合蛋白，其中所述融合蛋白由人HSP70的三磷酸腺苷酶结构域以及哺乳动物的p53蛋白构成。

9.根据权利要求7或8的融合蛋白，其中所述哺乳动物为人。

10.一种用于治疗或预防与突变引起的p53蛋白过量表达有关的肿瘤的药物组合物，包含有效量的权利要求7-9之任一项的融合蛋白。

11.一种核酸分子，其编码权利要求7-9之任一项的融合蛋白。

12.一种表达载体，包含权利要求11的核酸分子以及必要的基因调控元件。

13.权利要求7-9之任一项的融合蛋白、权利要求11的核酸分子或权利要求12的表达载体在制备用于治疗或预防与突变引起的p53蛋白过量表达有关的肿瘤的药物中的用途。