TWI492757B

TWI492757B - 對人類蛋白酶活化受體－２之高親和性人類抗體

Info

Publication number: TWI492757B
Application number: TW099130262A
Authority: TW
Inventors: 琳麥可唐納; 安德魯墨菲; 尼裘拉斯帕帕都伯勞斯; 馬克莫拉; 羅勃特塞爾斯勒; 麥可雷克羅西佛列
Original assignee: 再生元醫藥公司
Priority date: 2009-09-09
Filing date: 2010-09-08
Publication date: 2015-07-21
Also published as: WO2011031695A1; CA2773541A1; PT2475684T; UY32883A; SI2475684T1; KR20120059611A; ES2609780T3; NZ599204A; HK1166509A1; EP2475684A1; LT2475684T; US20120093824A1; TW201121565A; MY159551A; SMT201700102T1; JO3246B1; IL218501A; JP2015227381A; US20110059095A1; ZA201201730B

Description

對人類蛋白酶活化受體-2之高親和性人類抗體

本發明係有關對蛋白酶活化受體-2(PAR-2)具特異性之抗體，及其抗原結合片段。

蛋白酶活化受體(「PARs」)為七跨膜G蛋白偶聯受體(seven-transmembrane G-protein-coupled receptors)家族。於七跨膜G蛋白偶聯受體中，PARs具有獨特之活化模式；亦即，PARs藉由胺基端蛋白水解切割被活化，產生作為「繫留配體」用之新N端功能域。繫留配體與受體之胞外環-2互相作用，因而產生受體活化作用。目前，有四個已知之PAR家族成員，稱為PAR-1、PAR-2、PAR-3與PAR-4。

PAR-2亦被稱為「C140」(US 5,874,400)。人類及鼠科動物PAR-2均具有蛋白酶切割功能域SKGRSLIG(SEQ ID NO:852之殘基6-13，及SEQ ID NO:856之殘基8-15)。此序列於R與S殘基間被例如胰蛋白酶之多種蛋白酶、以及被肥大細胞中性蛋白酶、組織因子/因子VIIa複合物與因子Xa、嗜中性球蛋白酶3(PR-3)、人類白血球彈性蛋白酶、及源自病原生物之蛋白酶切割。

PAR-2活性與數種疾病與症狀牽連或相關，包括炎性疾病、疼痛、胃腸疾病、神經性疾病、與心血管疾患(參見，例如，Linder et al.,2000,J. Immunol. 165:6504-6510；Vergnolle et al.,2001,Nature Medicine 7:821-826；Cenac et al.,2007,J. Clin. Investigation 117:636-647；Vergnolle,2004,British J. Pharmacol. 141:1264-1274；Knight et al.,2001,J. Allergy Clin. Immunol. 108:797-803；Schmidlin et al.,2002,J. Immunol. 169:5315-5321)。與PAR-2結合之抗體具有於活體內拮抗PAR-2活性之潛力；因此抗PAR-2抗體可能用於治療及/或改善多種疾病狀況。

與PAR-2結合之抗體及其特定治療用途已見述於US 5,874,400、US 2007/0237759、WO 2009/005726、與US 2010/0119506。儘管如此，此項技藝中對於可用以治療PAR-2媒介之疾病與症狀之新穎PAR-2調節劑，包括抗PAR-2抗體，仍有所需求。

發明簡述

本發明提供與人類PAR-2結合之人類抗體。本發明抗體尤其係用於抑制PAR-2媒介之傳訊，及用於治療由PAR-2活化引起或與PAR-2活化相關之疾病與失調症。

本發明包含一種抗體，該抗體與PAR-2 N端區域互相作用，並在活化的PAR-2蛋白酶切割位點(如本文所界定)阻斷蛋白水解切割，惟在一或多個未活化的蛋白酶切割位點並不阻斷蛋白水解切割。根據某些具體實例，展現此等蛋白水解切割阻斷性質之抗PAR-2抗體與活化之PAR-2蛋白酶切割位點附近之特定胺基酸互相作用。舉例而言，本發明提供具蛋白酶切割阻斷活性之抗PAR-2抗體，其與人類PAR-2(SEQ ID NO:851)之Val-42與Asp-43互相作用，並可進一步與選自包括Ser-37、Leu-38、Ile-39、Gly-40及Gly-44之組群的一或多個人類PAR-2殘基互相作用。

根據其他具體實例，本發明之抗PAR-2抗體特異性地與人類PAR-2及猴PAR-2結合，惟不與選自包括小鼠、大鼠、兔、犬與豬PAR-2之組群之至少一員結合。本發明亦包括能抑制或減弱PAR-2之蛋白水解活化惟不阻斷PAR-2之蛋白水解切割之抗體。本文中敘述用於測定/評估抗體阻斷PAR-2切割或蛋白水解活化能力之例示方法。

本發明抗體可為全長(舉例而言，IgG1或IgG4抗體)或可僅包含抗原結合部分(舉例而言，Fab、F(ab’)₂ 或scFv片段)，及可經改造以影響功能性，例如，消除殘基效應子功能(Reddy et al.,2000,J. Immunol. 164:1925-1933)。

本發明提供一種抗體或抗體之抗原結合片段，其含有具選自包括SEQ ID NO: 2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、94、98、114、118、122、138、142、146、162、166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、242、258、262、266、282、286、290、306、310、314、330、334、338、354、358、362、378、382、386、402、406、410、426、430、434、450、454、458、474、478、482、498、502、506、522、526、530、546、550、554、570、574、578、594、598、602、618、622、626、642、646、650、666、670、674、690、694、698、714、718、722、738、742、746、762、766、770、786、790、794、810、814、818、834、與838之組群的胺基酸序列、或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上相似序列的重鏈可變區(HCVR)。根據某些具體實例，該抗體或抗體之抗原結合部分含有具選自包括SEQ ID NO: 98、146、338、與714之組群的胺基酸序列之HCVR。

本發明亦提供一種抗體或抗體之抗原結合片段，其含有具選自包括SEQ ID NO: 10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、120、130、140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260、264、274、284、288、298、308、312、322、332、336、346、356、360、370、380、384、394、404、408、418、428、432、442、452、456、466、476、480、490、500、504、514、524、528、538、548、552、562、572、576、586、596、600、610、620、624、634、644、648、658、668、672、682、692、696、706、716、720、730、740、744、754、764、768、778、788、792、802、812、816、826、836、與840之組群之胺基酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上相似序列的輕鏈可變區(LCVR)。根據某些具體實例，該抗體或抗體之抗原結合部分含有具選自包括SEQ ID NO: 106、154、346、與692之組群的胺基酸序列之LCVR。

本發明亦提供一種抗體或其抗原結合片段，其含有具選自包括SEQ ID NO: 2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、450/452、454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500、502/504、506/514、522/524、526/528、530/538、546/548、550/552、554/562、570/572、574/576、578/586、594/596、598/600、602/610、618/620、622/624、626/634、642/644、646/648、650/658、666/668、670/672、674/682、690/692、694/696、698/706、714/716、714/692、718/720、722/730、738/740、742/744、746/754、762/764、766/768、770/778、786/788、790/792、794/802、810/812、814/816、818/826、834/836及838/840之組群的HCVR及LCVR(HCVR/LCVR)序列對。根據某些具體實例，該抗體或其片段含有選自SEQ ID NO: 98/106、146/154、338/346、與714/692之胺基酸序列對之HCVR及LCVR。

本發明亦提供一種抗體或抗體之抗原結合片段，其含有具選自包括SEQ ID NO: 8、32、56、80、104、128、152、176、200、224、248、272、296、320、344、368、392、416、440、464、488、512、536、560、584、608、632、656、680、704、728、752、776、800、與824之組群之胺基酸序列、或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上相似序列的重鏈CDR3(HCDR3)功能域；及具選自包括SEQ ID NO: 16、40、64、88、112、136、160、184、208、232、256、280、304、328、352、376、400、424、448、472、496、520、544、568、592、616、640、664、688、712、736、760、784、808及832之組群的胺基酸序列、或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上相似序列的輕鏈CDR3(LCDR3)功能域。

於某些具體實例中，抗體或抗體之抗原結合部分含有選自包括SEQ ID NO: 8/16、32/40、56/64、80/88、104/112、128/136、152/160、176/184、200/208、224/232、248/256、272/280、296/304、320/328、344/352、368/376、392/400、416/424、440/448、464/472、488/496、512/520、536/544、560/568、584/592、608/616、632/640、656/664、680/688、704/712、728/736、752/760、776/784、800/808及824/832之組群的HCDR3/LCDR3胺基酸序列對。根據某些具體實例，該抗體或抗體之抗原結合部分含有選自包括SEQ ID NO: 104/112、152/160、344/352與704/712之組群之HCDR3/LCDR3胺基酸序列對。具有彼等HCDR3/LCDR3對之抗PAR-2抗體之非限制性實例係分別稱為H4H588N、H4H591N、H4H618N、與H4H581P之抗體。

本發明亦提供一種抗體或其片段，其進一步含有具選自包括SEQ ID NO: 4、28、52、76、100、124、148、172、196、220、244、268、292、316、340、364、388、412、436、460、484、508、532、556、580、604、628、652、676、700、724、748、772、796及820之組群之胺基酸序列、或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上相似序列的重鏈CDR1(HCDR1)功能域；具選自包括SEQ ID NO: 6、30、54、78、102、126、150、174、198、222、246、270、294、318、342、366、390、414、438、462、486、510、534、558、582、606、630、654、678、702、726、750、774、798及822之組群的胺基酸序列、或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上相似序列的重鏈CDR2(HCDR2)功能域；具選自包括SEQ ID NO: 12、36、60、84、108、132、156、180、204、228、252、276、300、324、348、372、396、420、444、468、492、516、540、564、588、612、636、660、684、708、732、756、780、804及828之組群的胺基酸序列、或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上相似序列的輕鏈CDR1(LCDR1)功能域；及具選自包括SEQ ID NO: 14、38、62、86、110、134、158、182、206、230、254、278、302、326、350、374、398、422、446、470、494、518、542、566、590、614、638、662、686、710、734、758、782、806及830之組群的胺基酸序列、或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上相似序列的輕鏈CDR2(LCDR2)功能域。

本發明之某些非限制性、例示抗體及抗原結合片段分別含有HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2與LCDR3功能域，其選自下述組群：(i) SEQ ID NO: 100、102、104、108、110與112(例如，H4H588N)；(ii) SEQ ID NO: 148、150、152、156、158與160(例如，H4H591N)；(iii) SEQ ID NO: 340、342、344、348、350與352(例如，H4H618N)；及(iv) SEQ ID NO: 700、702、704、708、710與712(例如，H4H581P)。彼等例示CDRs之胺基酸序列見述於第2圖及第3圖。

於相關具體實例中，本發明包含特異性地結合PAR-2之抗體或抗體之抗原結合片段，其中具有選自包括SEQ ID NO: 2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、450/452、454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500、502/504、506/514、522/524、526/528、530/538、546/548、550/552、554/562、570/572、574/576、578/586、594/596、598/600、602/610、618/620、622/624、626/634、642/644、646/648、650/658、666/668、670/672、674/682、690/692、694/696、698/706、714/716、714/692、718/720、722/730、738/740、742/744、746/754、762/764、766/768、770/778、786/788、790/792、794/802、810/812、814/816、818/826、834/836及838/840之組群的重鏈及輕鏈序列之抗體或片段含有重鏈及輕鏈CDR功能域。根據某些具體實例，該抗體或其片段於選自SEQ ID NO: 98/106、146/154、338/346與714/692之胺基酸序列對之HCVR與LCVR中含有CDR序列。

於另一態樣中，本發明提供編碼抗PAR-2抗體或其片段之核酸分子。帶有本發明核酸之重組表現載體、已引入此等載體之宿主細胞、以及於容許產生抗體之條件下培養宿主細胞以製造抗體，並回收所製造抗體之方法，亦涵蓋於本發明之內。

於一具體實例中，本發明提供一種抗體或其片段，其含有由選自包括SEQ ID NO: 1、17、21、25、41、45、49、65、69、73、89、93、97、113、117、121、137、141、145、161、165、169、185、189、193、209、213、217、233、237、241、257、261、265、281、285、289、305、309、313、329、333、337、353、357、361、377、381、385、401、405、409、425、429、433、449、453、457、473、477、481、497、501、505、521、525、529、545、549、553、569、573、577、593、597、601、617、621、625、641、645、649、665、669、673、689、693、697、713、717、721、737、741、745、761、765、769、785、789、793、809、813、817、833及837之組群的核酸序列、或具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同質性之實質上相同序列所編碼的HCVR。根據某些具體實例，該抗體或其片段含有選自包括SEQ ID NO: 97、145、337與713之組群的核酸序列所編碼的HCVR。

本發明亦提供一種抗體或其片段，其含有由選自包括SEQ ID NO: 9、19、23、33、43、47、57、67、71、81、91、95、105、115、119、129、139、143、153、163、167、177、187、191、201、211、215、225、235、239、249、259、263、273、283、287、297、307、311、321、331、335、345、355、359、369、379、383、393、403、407、417、427、431、441、451、455、465、475、479、489、499、503、513、523、527、537、547、551、561、571、575、585、595、599、609、619、623、633、643、647、657、667、671、681、691、695、705、715、719、729、739、743、753、763、767、777、787、791、801、811、815、825、835與839之組群的核酸序列、或具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同質性之實質上相同序列所編碼的LCVR。根據某些具體實例，該抗體或其片段含有由選自包括SEQ ID NO: 105、153、345與715之組群的核酸序列所編碼的LCVR。

本發明亦提供一種抗體或抗體之抗原結合片段，其含有由選自包括SEQ ID NO: 7、31、55、79、103、127、151、175、199、223、247、271、295、319、343、367、391、415、439、463、487、511、535、559、583、607、631、655、679、703、727、751、775、799及823之組群的核苷酸序列、或具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同質性之實質上相同序列所編碼的HCDR3功能域；及由選自包括SEQ ID NO: 15、39、63、87、111、135、159、183、207、231、255、279、303、327、351、375、399、423、447、471、495、519、543、567、591、615、639、663、687、711、735、759、783、807及831之組群的核苷酸序列、或具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同質性之實質上相同序列所編碼的LCDR3功能域。根據某些具體實例，該抗體或其片段含有由選自包括SEQ ID NO: 103/111、151/159、343/351與703/711之組群的核酸序列對所編碼的HCDR3及LCDR3序列。

本發明亦提供一種抗體或其片段，其進一步含有由選自包括SEQ ID NO: 3、27、51、75、99、123、147、171、195、219、243、267、291、315、339、363、387、411、435、459、483、507、531、555、579、603、627、651、675、699、723、747、771、795與819之組群的核苷酸序列、或具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同質性之實質上相同序列所編碼的HCDR1功能域；由選自包括SEQ ID NO: 5、29、53、77、101、125、149、173、197、221、245、269、293、317、341、365、389、413、437、461、485、509、533、557、581、605、629、653、677、701、725、749、773、797與821之組群的核苷酸序列、或具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同質性之實質上相同序列所編碼的HCDR2功能域；由選自包括SEQ ID NO: 11、35、59、83、107、131、155、179、203、227、251、275、299、323、347、371、395、419、443、467、491、515、539、563、587、611、635、659、683、707、731、755、779、803與827之組群的核苷酸序列、或具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同質性之實質上相同序列所編碼的LCDR1功能域；及由選自包括SEQ ID NO: 13、37、61、85、109、133、157、181、205、229、253、277、301、325、349、373、397、421、445、469、493、517、541、565、589、613、637、661、685、709、733、757、781、805、829之組群之核苷酸序列、或其具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同質性之實質上相同序列所編碼的LCDR2功能域。

根據某些具體實例，該抗體或其片段含有核酸序列SEQ ID NO: 97與105；SEQ ID NO: 145與153；SEQ ID NO: 337與345；或SEQ ID NO: 713與715所編碼的重鏈及輕鏈CDR序列。

本發明亦提供一種含有HCDR3與LCDR3之特異性地結合PAR-2的單離抗體或抗體之抗原結合片段，其中該HCDR3含有式X¹ -X² -X³ -X⁴ -X⁵ -X⁶ -X⁷ -X⁸ -X⁹ -X¹⁰ -X¹¹ -X¹² (SEQ ID NO:843)之胺基酸序列，式中X¹ 為Ala或Val，X² 為Lys，X³ 為Gly或Glu，X⁴ 為Asp或Gly，X⁵ 為Phe或Asp，X⁶ 為Trp或Ser，X⁷ 為Ser或Gly，X⁸ 為Gly或Tyr，X⁹ 為Tyr或Asp，X¹⁰ 為Phe或Leu，X¹¹ 為Asp或Ala，及X¹² 為Tyr；且LCDR3含有式X¹ -X² -X³ -X⁴ -X⁵ -X⁶ -X⁷ -X⁸ -X⁹ (SEQ ID NO:846)之胺基酸序列，式中X¹ 為Met或Gln，X² 為Gln，X³ 為Ala或Tyr，X⁴ 為Thr或Lys，X⁵ 為Gln，Ser或Ile，X⁶ 為Phe或Ser，X⁷ 為Pro，X⁸ 為Thr或Leu，及X⁹ 為Thr或不存在。

於更明確之具體實例中，本發明之特徵為一種特異性地結合PAR-2之單離抗體或其片段，其含有式X¹ -X² -X³ -X⁴ -X⁵ -X⁶ -X⁷ -X⁸ (SEQ ID NO:841)之HCDR1序列，式中X¹ 為Gly，X² 為Phe，X³ 為Thr，X⁴ 為Phe，X⁵ 為Ser或Arg，X⁶ 為Ser或Arg，X⁷ 為Tyr，及X⁸ 為Gly，Ala或Thr；式X¹ -X² -X³ -X⁴ -X⁵ -X⁶ -X⁷ -X⁸ (SEQ ID NO:842)之HCDR2序列，式中X¹ 為Ile，X² 為Ser，Gly或Thr，X³ 為Tyr，Gly或Asp，X⁴ 為Asp，Gly或Ser，X⁵ 為Gly或Arg，X⁶ 為Ile，Gly或Ala，X⁷ 為Asn、Ser、Arg或Gly，及X⁸ 為Lys，Ala或Thr；式X¹ -X² -X³ -X⁴ -X⁵ -X⁶ -X⁷ -X⁸ -X⁹ -X¹⁰ -X¹¹ -X¹² (SEQ ID NO:843)之HCDR3序列，式中X¹ 為Ala或Val，X² 為Lys，X³ 為Gly或Glu，X⁴ 為Asp或Gly，X⁵ 為Phe或Asp，X⁶ 為Trp或Ser，X⁷ 為Ser或Gly，X⁸ 為Gly或Tyr，X⁹ 為Tyr或Asp，X¹⁰ 為Phe或Leu，X¹¹ 為Asp或Ala，及X¹² 為Tyr；式X¹ -X² -X³ -X⁴ -X⁵ -X⁶ -X⁷ -X⁸ -X⁹ -X¹⁰ -X¹¹ (SEQ ID NO:844)之LCDR1序列，式中X¹ 為Gln，X₂ 為Ser或Gly，X³ 為Leu或Ile，X⁴ 為Val或Ser，X⁵ 為His、Asn或Thr，X⁶ 為Ser，Asn或Tyr，X⁷ 為Asp或不存在，X⁸ 為Gly或不存在，X⁹ 為Asn或不存在，X¹⁰ 為Thr或不存在，及X¹¹ 為Tyr或不存在；式X¹ -X² -X³ (SEQ ID NO:845)之LCDR2序列，式中X¹ 為Lys或Ala，X² 為Ile，Ala或Thr，及X³ 為Ser；及含有式X¹ -X² -X³ -X⁴ -X⁵ -X⁶ -X⁷ -X⁸ -X⁹ (SEQ ID NO:846)胺基酸序列之LCDR3，式中X¹ 為Met或Gln，X² 為Gln，X³ 為Ala或Tyr，X⁴ 為Thr或Lys，X⁵ 為Gln、Ser或Ile，X⁶ 為Phe或Ser，X⁷ 為Pro，X⁸ 為Thr或Leu，及X⁹ 為Thr或不存在。

本發明涵蓋具有經修飾之醣基化模式之抗PAR-2抗體。於若干應用中，修飾去除不需要的醣基化位點可能有用，或缺乏出現於寡糖鏈上的岩藻糖部分之抗體，舉例而言，以增加抗體依賴性細胞胞毒性(ADCC)功能(參見Shield et al.(2002) JBC 277:26733)。於其他應用中，可修飾半乳糖基化作用俾使改進補體依賴性胞毒性(CDC)。

於另一態樣中，本發明提供包含特異性地結合PAR-2之重組人類抗體或其片段及醫藥上可接受載劑之醫藥組成物。於相關態樣中，本發明之特徵為一種組成物，其係PAR-2抑制劑與第二治療劑之組合物。於一具體實例中，PAR-2抑制劑係抗體或其片段。於一具體實例中，第二治療劑係有利地與PAR-2抑制劑組合之任何製劑。可有利地與PAR-2抑制劑組合之例示製劑包括，惟不限於，抑制PAR-2活性之其他製劑(包括其他抗體或其抗原結合片段，胜肽抑制劑，小分子拮抗劑等)及/或干擾PAR-2上游或下游傳訊之製劑。

於又另一態樣中，本發明提供使用本發明抗PAR-2抗體或抗體之抗原結合部分抑制PAR-2活性之方法，其中該治療方法包括投與有效治療量之含有本發明抗體或抗體之抗原結合片段之醫藥組成物。所處理之失調症為藉由去除、抑制或減少PAR-2活性而改進、改善、抑制或預防之任何疾病或症狀。本發明之抗PAR-2抗體或抗體片段具有阻斷PAR-2與蛋白酶(例如，胰蛋白酶或類胰蛋白酶絲胺酸蛋白酶)間之相互作用或者抑制蛋白酶媒介之PAR-2活化之功能。或者是，或附加地，本發明之抗PAR-2抗體可干擾PAR-2繫留配體與一或多個PAR-2胞外環間之互相作用(參見，例如，MacFarlane et al.,2001,Pharmacological Reviews 53:245-282有關PAR-2蛋白水解切割與活化之一般性討論)。抗體或抗體片段可單獨使用或與一或多個附加治療劑組合使用。

本發明亦包括使用本發明抗PAR-2抗體或抗體之抗原結合部分製造藥劑以治療病患與PAR-2活性有關或由PAR-2活性引起的疾病或失調症之用途。

其他具體實例從審查下文之詳細說明將明顯可見。

詳細說明

於敘述本發明之前，須瞭解的是，本發明不受限於所敘述之特定方法及實驗條件，因為此等方法及條件可能有所不同。亦須瞭解的是，本文所用之專門用語僅為說明特定具體實例之目的，而不擬構成侷限，本發明範圍僅受隨附申請專利範圍之限制。

除非另行界定，否則本文所用之所有技術及科學用語具有熟習此項技藝(本發明所屬)者一般瞭解之相同意義。本文所用之「約」一詞，於用於有關特定列舉數值時，意指該數值與列舉數值之不同不超過1%。舉例而言，本文所用「約100」之表示法包括99與101及其間之所有數值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

儘管於實施或測試本發明時可使用與本文所述相似或等同之任何方法與材料，茲於下文僅敘述較佳之方法與材料。

定義

本文所用之「蛋白酶活化受體-2」、與「PAR-2」等詞係指全長PAR-2蛋白。人類PAR-2由SEQ ID NO:850所示之核酸序列編碼，且具有SEQ ID NO:851之胺基酸序列。非人類物種(例如，小鼠、猴、兔、犬、豬等)PAR-2分子之胺基酸序列可自公共來源獲得。

本文所用之「PAR-2片段」一詞意指包含位於活化之PAR-2蛋白酶切割位點(如下文所界定)上游(亦即其N端)之4、5、6、7、8、9、10或10個以上連續胺基酸，及/或位於活化之PAR-2蛋白酶切割位點(如下文所界定)下游(亦即其C端)之4、5、6、7、8、9、10或10個以上連續胺基酸之胜肽或多肽。PAR-2片段之例示見實例2，表2(名稱為「A」至「J」之胜肽；亦即，分別為SEQ ID NOs:852至861)。

本文所用「PAR-2」與「PAR-2片段」等表示法除非指明為得自非人類物種(例如，「小鼠PAR-2」、「小鼠PAR-2片段」、「猴PAR-2」、「猴PAR-2片段」等)，否則係指人類PAR-2蛋白或片段。

本揭示之說明書中，所用之表示法「活化之PAR-2蛋白酶切割位點」意指人類PAR-2(SEQ ID NO:851)殘基Arg-36與Ser-37接合處。活化PAR-2蛋白酶切割位點為切割時於天然存在之蛋白質中導致形成PAR-2繫留配體之位點。

本文所用之「PAR-2蛋白酶」一詞意指能於活化PAR-2蛋白酶切割位點切割PAR-2或PAR-2片段之酵素。PAR-2蛋白酶之實例包括胰蛋白酶、細胞自溶酶G、精蟲頭粒蛋白、組織因子VIIa、組織因子Xa、人類呼吸道類胰蛋白酶蛋白酶、中性蛋白酶、膜式絲胺酸蛋白酶-1(MT-SP1)、TMPRSS2、蛋白酶-3、彈性蛋白酶、激肽釋放酶-5、激肽釋放酶-6、激肽釋放酶-14、活化之蛋白C、十二指腸酶(duodenase)、牙齦菌蛋白酶-R、Der p1、Der p3、Der p9、嗜熱菌蛋白酶、沙雷肽酶(serralysin)、與齒螺旋體(T. denticla )蛋白酶。

本文所用之「抗體」一詞意指包含四個多肽鏈、利用雙硫鍵互相連接的兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈之免疫球蛋白分子，以及其多聚體(例如，IgM)。各重鏈包含重鏈可變區(於本文中縮寫為HCVR或V_H )及重鏈恒定區。重鏈恒定區包含C_H 1、C_H 2與C_H 3三個功能域。各輕鏈包含輕鏈可變區(於本文中縮寫為LCVR或V_L )及輕鏈恒定區。輕鏈恒定區包含一個功能域(C_L 1)。V_H 及V_L 區可進一步細分為稱為互補決定區(CDRs)之高度可變區，其間散置著更保守之區域，稱為框架區(FR)。各V_H 與V_L 由三個CDRs及四個FRs組成，自胺基端至羧基端之排列順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。於本發明之不同具體實例中，抗Ang-2抗體之FRs(或其抗原結合部分)可與人類種系(germline)序列相同，或可為自然或經人工修飾。胺基酸一致序列可根據兩個或兩個以上CDRs之並排分析予以界定。

本文所用之「抗體」一詞亦包括全抗體分子之抗原結合片段。本文所用之抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」等詞係包括特異性地結合抗原形成複合物之任何天然存在、可利用酵素獲得、合成、或經基因工程改造之多肽或醣蛋白。抗體之抗原結合片段舉例而言，可使用任何適當標準技術，例如涉及操作及表現編碼抗體可變功能域及視需要之恒定功能域之DNA的蛋白質分解或基因重組遺傳工程技術，衍生自完整抗體分子。此等DNA為已知及/或容易地得自，例如，商業來源、DNA庫(包括，例如，噬菌體-抗體庫)、或可予以合成。DNA可定序及進行化學操作，或藉由使用分子生物技術，例如，安置一或多個可變及/或恒定功能域至適當結構中，或引入密碼子、產生半胱胺酸殘基、更改、增加或刪除胺基酸等。

抗原結合片段之非限制性實例：(i)Fab片段；(ii)F(ab')₂ 片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)模擬抗體高度可變區(例如，單離之互補決定區(CDR))之由胺基酸殘基組成之最小識別單元。其他經基因工程改造之分子、例如二聚抗體(diabodies)、三聚抗體(triabodies)、四聚抗體(tetrabodies)與微型抗體(minibodies)亦均涵蓋於本文所用之「抗原結合片段」表示法中。

抗體之抗原結合片段典型地包含至少一個可變功能域。可變功能域可為任何大小或胺基酸組成，通常包含與一或多個框架序列鄰接或於框架內之至少一個CDR。於具有與V_L 功能域相關的V_H 功能域之抗原結合片段中，V_H 及V_L 功能域可呈任何適當排列互相關連。舉例而言，該可變區可由兩部分組成及含有V_H -V_H 、V_H -V_L 或V_L -V_L 二聚體。替代地，抗體之抗原結合片段可含單體之V_H 或V_L 功能域。

於某些具體實例中，抗體之抗原結合片段可含有與至少一個恒定功能域共價連接之至少一個可變功能域。於本發明抗體之抗原結合片段中可發現的可變及恒定功能域之非限制性、例示結構包括：(i) V_H -C_H 1；(ii) V_H -C_H 2；(iii) V_H -C_H 3；(iv) V_H -C_H 1-C_H 2；(v) V_H -C_H 1-C_H 2-C_H 3；(vi) V_H -C_H 2-C_H 3；(vii) V_H -C_L ；(viii) V_L -C_H 1；(ix) V_L -C_H 2；(x) V_L -C_H 3；(xi) V_L -C_H 1-C_H 2；(xii) V_L -C_H 1-C_H 2-C_H 3；(xiii) V_L -C_H 2-C_H 3；及(xiv) V_L -C_L 。於可變及恒定功能域之任何結構(包括上文列舉之任何例示結構)中，該等可變及恒定功能域可直接彼此互相連接或者利用完整或部分鉸合或鏈接區連接。鉸合區可由至少2個(例如，5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸組成，彼等於單一多肽分子之相鄰可變及/或恒定功能域間產生柔性或半柔性之鏈結。再者，本發明抗體之抗原結合片段可包含上文列舉的任何可變及恒定功能域結構彼此，及/或與一或多個單體V_H 或V_L 功能域呈非共價結合(例如，利用雙硫鍵)之同質二聚體或異質二聚體(或其他多聚體)。

與完整抗體分子相同地，抗原結合片段可具單一特異性或多重特異性(例如，雙特異性)。抗體之多重特異性抗原結合片段典型地包含至少兩個不同的可變功能域，其中各可變功能域能特異性地與個別抗原或與相同抗原上之不同抗原決定部位結合。任何多重特異性抗體形式，包括本文揭示之例示雙特異性抗體形式，可使用此項技藝中可利用之例行技術，使其適用於本發明抗體之抗原結合片段。

抗體恒定區對抗體固定補體及傳介細胞依賴性胞毒性之能力相當重要。因此，同型抗體可根據抗體傳介胞毒性之滿意度而選定。

本文所用之「人類抗體」一詞意欲包括具有衍生自人類種系免疫球蛋白序列的可變及恒定區之抗體。本發明之人類抗體可包括，例如於CDRs中，特別是CDR3中，非由人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，由活體外無規或定位突變或由活體內體細胞突變引起之變異)。然而，本文所用之「人類抗體」一詞不欲包括其中衍生自另一哺乳類物種(例如小鼠)種系之CDR序列嫁接至人類框架序列上之抗體。

本文所用之「重組人類抗體」一詞意欲包括利用基因重組方式製備、表現、產生或單離之所有人類抗體，例如使用重組表現載體轉染至宿主細胞中表現之抗體(於下文進一步敘述)、自重組體、組合人類抗體庫(於下文進一步敘述)單離之抗體、自經人類免疫球蛋白基因基因轉殖動物(例如，小鼠)單離之抗體(參見例如，Taylor et al.(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295)，或利用涉及將人類免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列接合之任何其他方式製備、表現、產生或單離之抗體。此等重組人類抗體具有衍生自人類種系免疫球蛋白序列之可變及恒定區。然而，於某些具體實例中，此等重組人類抗體發生活體外突變(或，於使用經人類Ig序列基因轉殖之動物時，發生活體內體細胞突變)，因而該等重組抗體VH及VL區之胺基酸序列，雖然衍生自人類種系VH及VL序列及與其相關，可能為不存在活體內天然人類抗體種系目錄中之序列。

人類抗體可呈與鉸合異質性相關之兩種形式存在。於一形式中，免疫球蛋白分子包含大約150-160 kDa之穩定四鏈構築體，其中二聚體係利用分子間重鏈雙硫鍵結而連接在一起。於第二形式中，二聚體並未經由分子間雙硫鍵連接，而形成由共價連接之輕及重鏈組成之約75-80 kDa之分子(半抗體)。彼等形式即使於親和純化後亦難以分離。

於各種完整IgG同型中，第二形式之出現頻率係由於，惟不限於，與抗體鉸合區同型相關之結構差異。人類IgG4鉸鏈鉸合區中之單一胺基酸置換可明顯降低第二形式之出現(Angal et al.(1993) Molecular Immunology 30:105)至通常使用人類IgG1鉸鏈觀察到的程度。本發明涵蓋於鉸合、CH2或CH3區具有一或多個變異之抗體，該等變異可能，例如，於生產時為提高所需抗體形式產量而被期盼。

本文所用之「單離抗體」意指經鑑定及自其天然環境之至少一成分分離及/或回收之抗體。例如，自生物、組織或細胞之至少一成分分離或移取之抗體，其中該抗體天然存在或天然產生者為供本發明用途之「單離抗體」。單離抗體亦包括在重組細胞原處之抗體，以及已進行至少一個純化或單離步驟之抗體。根據某些具體實例，單離抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學品。

「特異性地結合」等詞意指抗體或其抗原結合片段於生理條件下與相當穩定之抗原形成複合物。特異性結合之特徵為可具有1x10^-6 M或更小之解離常數。測定兩個分子是否特異性結合之方法於此項技藝中已悉知及包括，例如，平衡透析、表面電漿共振等。舉例而言，本發明說明書中所用之「特異性地結合」人類PAR-2之抗體包括，如表面電漿共振測定法所測，以小於約1000 nM、小於約500 nM、小於約300 nM、小於約200 nM、小於約100 nM、小於約90 nM、小於約80 nM、小於約70 nM、小於約60 nM、小於約50 nM、小於約40 nM、小於約30 nM、小於約20 nM、小於約10 nM、小於約5 nM、小於約4 nM、小於約3 nM、小於約2 nM、小於約1 nM或小於約0.5 nM之K_D 結合人類PAR-2或其部分(例如，包含活化之蛋白酶切割位點之PAR-2片段)之抗體(參見，例如，本文中之實例4)。然而，特異性地結合人類PAR-2之單離抗體可對其他抗原(例如得自其他物種之PAR-2分子)具交叉反應性。

本文所用之「中和」或「阻斷」抗體擬意指與PAR-2之結合：(i)干擾PAR-2或PAR-2片段與一或多個蛋白酶間之互相作用、(ii)阻止PAR-2或PAR-2片段被PAR-2蛋白酶切割、(iii)抑制PAR-2繫留配體與PAR-2胞外環間之互相作用、及/或(iv)導致抑制至少一種PAR-2之生物功能的抗體。只要使用適當測定法可予以檢測，則PAR-2中和或阻斷抗體引起之抑制作用不需要完成。本文中亦敘述用於檢測PAR-2抑制作用之例示測定法。

本文揭示之全人類抗PAR-2抗體可包含重鏈及輕鏈可變功能域之框架及/或CDR區中，相較於對應種系序列之一或多個胺基酸置換、插入及/或刪除。此等變異藉由比較本文揭示之胺基酸序列與自公開抗體序列資料庫取得之種系序列，可容易地確定。本發明涵蓋抗體及其抗原結合片段，該等抗原結合片段係衍生自本文揭示之任何胺基酸序列，其中一或多個框架及/或CDR區內之一或多個胺基酸回復變異至對應種系殘基，或至對應種系殘基之保守性胺基酸置換(天然或非天然)(此等序列變化於本文中稱為「種系回復變異」)。熟習此項技藝人士，從本文揭示之重鏈及輕鏈可變區序列出發，可容易地製造許多包含一或多個個別種系回復變異或其組合之抗體及抗原結合片段。於某些具體實例中，V_H 及/或V_L 功能域中之所有框架及/或CDR殘基均回復變異成為種系序列。於其他具體實例中，只有特定殘基回復變異成為種系序列，例如，僅於FR1之頭8個胺基酸中或FR4之最後8個胺基酸中發現變異殘基，或僅於CDR1、CDR2或CDR3中發現變異殘基。再者，本發明抗體可含有框架及/或CDR區內兩個或兩個以上種系回復變異之任何組合，亦即，其中特定個別殘基回復變異成為種系序列，而仍保留與種系序列不同之特定其他殘基。一旦獲得含有一或多個種系回復變異抗體及抗原結合片段，則可容易地測試其一或多個所需性質，例如，增進之結合特異性、增加之結合親和性、改善或增強之拮抗或促效性生物性質(視情況而定)、降低之免疫原性等。於此一般方式中獲得之抗體及抗原結合片段均涵蓋於本發明範圍之內。

本發明亦包括一種抗PAR-2抗體，其包含本文揭示之任何HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列之具有一或多個保守性置換之變異體。舉例而言，本發明包括一種抗PAR-2抗體，相較於本文揭示之任何HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列，其具有帶著例如，10個或10個以下、8個或8個以下、6個或6個以下、4個或4個以下等保守性胺基酸置換之HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列。於一具體實例中，該抗體包含具有帶著8個或8個以下保守性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO:698之HCVR。於另一具體實例中，該抗體包含具有帶著6個或6個以下保守性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO:698之HCVR。於另一具體實例中，該抗體包含具有帶著4個或4個以下保守性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO:698之HCVR。於另一具體實例中，該抗體包含具有帶著2個或2個以下保守性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO:698之HCVR。於一具體實例中，該抗體包含具有帶著8個或8個以下保守性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO:706之LCVR。於另一具體實例中，該抗體包含具有帶著6個或6個以下保守性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO:706之LCVR。於另一具體實例中，該抗體包含具有帶著4個或4個以下保守性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO:706之LCVR。於另一具體實例中，該抗體包含具有帶著2個或2個以下保守性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO:706之LCVR。

本文所用之「表面電漿共振」一詞係指於生物感應器基質內，例如使用BIAcore^TM 系統(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare,Piscataway、NJ)，藉由檢測蛋白質濃度變化，得以分析即時互相作用之一種光學現象。

本文所用之「K_D 」一詞擬意指特定抗體-抗原互相作用之平衡解離常數。

「抗原決定部位(epitope)」係指在被認知為互補位之抗體分子可變區中，與特異性抗原結合位點互相作用之抗原決定區。單一抗原可能具有一個以上抗原決定部位。因此，不同抗體可結合於抗原上之不同區域，且可具有不同生物效應。抗原決定部位可為構形或線型。構形抗原決定部位係由空間並列線型多肽鏈不同區段之胺基酸而產生。線型抗原決定部位則係由多肽鏈中之相鄰胺基酸殘基所產生。於某些情況下，抗原決定部位可包括抗原上之醣類、磷醯基、或磺醯基等基團。

「實質上相同性」或「實質上相同」等詞於述及核酸或其片段時，如下文所詳述，係指與另一核酸(或其互補股)進行適當核苷酸插入或刪除之最適排比時，利用任何悉知序列相同性演算法(例如FASTA、BLAST或Gap)所測定，核苷酸鹼基存在至少約95%，更佳為至少約96%、97%、98%或99%之核苷酸序列相同性。於特定情況下，與參考核酸分子具有實質上相同性之核酸分子，編碼與由該參考核酸分子編碼之多肽具有相同或實質上相似胺基酸序列之多肽。

應用於多肽時，「實質上相似性」或「實質上相似」等詞意指兩個胜肽序列進行最適排比(例如利用GAP或BESTFIT程式，使用預設空位權重(gap weights))時，享有至少95%序列相同性，又更佳為至少98%或99%序列相同性。較佳為，殘基位置不相同者保守性胺基酸置換亦不同。「保守性胺基酸置換」乃其中胺基酸殘基被具有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)側鏈(R基團)之胺基酸殘基置換者。一般而言，保守性胺基酸置換不會實質上改變蛋白質之功能性。於兩個或多個胺基酸序列之保守性置換彼此不同之情形下，可向上調整序列相同性百分比或相似度以校正該置換之保守性。進行此調整之方法為熟習此項技藝者所悉知。參見，例如，Pearson(1994)方法Mol. Biol. 24:307-331。具有相似化學性質側鏈之胺基酸組群之實例包括(1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸與異白胺酸；(2)脂族-羥基側鏈：絲胺酸與蘇胺酸；(3)含醯胺之側鏈：天冬醯胺與麩醯胺；(4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸、與色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸、與組胺酸；(6)酸性側鏈：天冬胺酸與麩胺酸、及(7)含硫側鏈為半胱胺酸與甲硫胺酸。較佳之保守性胺基酸置換組群為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸、及天冬醯胺-麩醯胺。替代地，保守性替換乃於Gonnetet al .(1992)Science 256: 1443-1445中揭示之PAM250似對數矩陣中具有正值之任何變化。「適度保守性」替換乃於PAM250似對數矩陣中具有非負值之任何變化。

多肽之序列相似性，亦被稱為序列相同性，典型地係使用序列分析軟體測定。蛋白質分析軟體使用指定各種置換、刪除及其他修改(包括保守性胺基酸置換)之相似性測量法，使相似序列匹配。舉例而言，GCG軟體含有例如Gap及Bestfit之程式，可使用預設參數以測定密切相關多肽間之序列同質性或序列相同性，例如得自不同生物物種或野生型蛋白與其變異蛋白間之同源多肽。參見，例如，GCG Version 6.1。亦可使用預設或建議參數之FASTA(GCG Version 6.1中之程式)比較多肽序列。FASTA(例如，FASTA2及FASTA3)提供查詢與搜尋序列間最佳重疊區域之排比及序列相同性百分比(Pearson(2000)文獻同前)。比較本發明序列與含有得自不同生物大量序列之資料庫之另一較佳演算法為電腦程式BLAST，尤其是使用預設參數之BLASTP或TBLASTN。參見，例如，Altschulet al .(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410及Altschulet al .(1997)Nucleic Acids Res. 25:3389-402。

人類抗體之製備

產生單株抗體(包括完全人類單株抗體)之方法為此項技藝中已知。任何此等已知方法均可於本發明場合中使用，以製造特異性地與人類PAR-2結合之人類抗體。

使用產生單株抗體之VELOCIMMUNE^TM 技術或任何其他已知方法，首先單離出具有人類可變區與小鼠恒定區之對PAR-2之高親和性嵌合抗體。與下文實驗部分一樣地，就期盼之特性(包括親和性、選擇性、抗原決定部位等)鑑定及選擇抗體。小鼠恒定區以所需之人類恒定區替換，以產生本發明之全人類抗體，例如野生型或經改造之IgG1或IgG4。雖然所選定之恒定區可能根據特定用途而不同，惟高親和性抗原結合及標的特異性特徵係存在可變區中。

生物等效性

本發明之抗PAR-2抗體及抗體片段涵蓋具有與所述抗體不同惟保留結合人類PAR-2能力的胺基酸序列之蛋白質。此等變異抗體及抗體片段相較於母序列時，含有一或多個胺基酸增添、刪除、或置換，惟展現實質上等同所述抗體之生物活性。同樣地，本發明之編碼抗PAR-2抗體之DNA序列涵蓋相較於所揭示序列時，含有一或多個核苷酸增添、刪除、或置換，惟編碼實質上與本發明抗PAR-2抗體或抗體片段具生物等效性之抗PAR-2抗體或抗體片段之序列。此等變異胺基酸及DNA序列之實例已於上文中討論。

舉例而言，兩個抗原結合蛋白或抗體若於類似實驗條件下，投與相同莫耳劑量(無論單一劑量或多次劑量)時，其吸收率及吸收程度未顯示明顯差異，為醫藥等效物或醫藥替代物，則被認為具生物等效性。一些抗體之吸收程度相同惟其吸收率不同，卻仍被視為具生物等效性，因為此等吸收率差異乃有意圖且反映在標記測定上，對於獲得有效體內藥物濃度並非必要，例如，長期使用；被認為對於所研究之特定藥品就醫藥上而言無足輕重，因此被視為係等效物或醫藥替代物。

於一具體實例中，兩個抗原結合蛋白若其安全性、純度、及效力無臨床上具意義之差異，則具生物等效性。

於一具體實例中，若病患可於參考產品與生物產品間轉換一或多次，相較於無此等轉換之持續治療下，無預期之不利影響(包括免疫原性於臨床上顯著變化或有效性減少)風險增加，則此二抗原結合蛋白具生物等效性。

於一具體實例中，兩個抗原結合蛋白若均經由使用狀況之共同機制作用至該等機制為已知之程度，則此二抗原結合蛋白具生物等效性。

生物等效性可利用活體內及活體外方法證明。生物等效性測定法包括，例如，(a)於人類或其他哺乳動物中之活體內試驗，其中係以時間為函數測定血液、血漿、血清、或其他生物液體中抗體或其代謝物之濃度；(b)相關聯並合理預測人類活體內生物利用率數據之活體外試驗；(c)於人類或其他哺乳動物中之活體內試驗，其中係以時間為函數測定抗體(或其標的物)之適當急性藥理效應；及(d)建立抗體之安全性、功效、或生物利用性或生物等效性之經良好控制之臨床試驗。

本發明抗PAR-2抗體之生物等效性變異體可利用，例如，進行非生物活性需要之殘基或序列置換或終端或內部殘基或序列之刪除予以構築。舉例而言，可刪除非生物活性必要之半胱胺酸殘基或以其他胺基酸替換，以防止復性後形成不需要或不正確之分子內雙硫橋鍵。於其他情況下，生物等效性抗體可包括含有修飾抗體之醣基化特性(例如，消除或移去醣基化作用之變異)的胺基酸改變之抗PAR-2抗體變異體。

抗體之生物特性

本發明抗體可經由補體依賴性胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞媒介胞毒性(ADCC)而作用。「補體依賴性胞毒性(CDC)」係指抗原表現細胞於補體存在下被本發明抗體分解。「抗體依賴性細胞媒介胞毒性」(ADCC)係指一種細胞媒介反應，其中表現Fc受體(FcRs)之非特異性細胞毒性細胞(例如，天然殺手(NK)細胞、嗜中性球、與巨噬細胞)識別標的細胞上之結合抗體，因而導致標的細胞分解。CDC及ADCC可使用此項技藝中悉知可用之測定法進行測定(參見，例如，U.S. 5,500,362與5,821,337、及Clyneset al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)95 :652-656)。

或者，或附加地，本發明抗體可阻斷PAR-2相互作用或抑制受體成分相互作用而具治療用途。於本發明PAR-2抗體之情形下，該抗體尤其可利用阻斷或遮掩活化之PAR-2蛋白酶切割位點而運作。替代地，本發明抗體可利用干擾繫留配體與一或多個胞外環(例如，環-1、環-2及/或環-3)間之互相作用而運作。

更具體而言，本發明抗PAR-2抗體可展現下述一或多個特性：(1)與人類PAR-2或人類PAR-2片段及非人類(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、犬、豬等)PAR-2或PAR-2片段結合之能力；(2)與人類PAR-2或人類PAR-2片段結合，惟不與非人類(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、犬、豬等)PAR-2或PAR-2片段結合之能力；(3)與人類PAR-2或人類PAR-2片段及猴PAR-2或猴PAR-2片段結合，惟不與小鼠、大鼠、兔、犬或豬PAR-2或PAR-2片段結合之能力；(4)與人類PAR-2或人類PAR-2片段及人類PAR-1、PAR-3或PAR-4或其片段結合之能力；(5)與人類PAR-2或人類PAR-2片段結合惟不與人類PAR-1、PAR-3、或PAR-4或其片段結合之能力；(6)與人類PAR-2或人類PAR-2片段及非人類(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、犬、豬等)PAR-1、PAR-3或PAR-4或其片段結合之能力；(7)與人類PAR-2或人類PAR-2片段結合惟不與非人類(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、犬、豬等)PAR-1、PAR-3或PAR-4或其片段結合之能力；(8)阻斷PAR-2或PAR-2片段蛋白水解切割之能力；(9)阻斷人類PAR-2或人類PAR-2片段及非人類(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、犬、豬等)PAR-2或PAR-2片段蛋白水解切割之能力；(10)阻斷人類PAR-2或人類PAR-2片段蛋白水解切割，惟不阻斷非人類(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、犬、豬等)PAR-2或PAR-2片段蛋白水解切割之能力；(11)阻斷人類PAR-2或人類PAR-2片段及人類PAR-1、PAR-3或PAR-4或其片段蛋白水解切割之能力；(12)阻斷人類PAR-2或人類PAR-2片段蛋白水解切割，惟不阻斷人類PAR-1、PAR-3或PAR-4或其片段蛋白水解切割之能力；(13)阻斷人類PAR-2或人類PAR-2片段及非人類(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、犬、豬等)PAR-1、PAR-3或PAR-4或其片段蛋白水解切割之能力；及/或(14)阻斷人類PAR-2或人類PAR-2片段蛋白水解切割，惟不阻斷非人類(例如，小鼠、猴、大鼠、兔、犬、豬等)PAR-1、PAR-3或PAR-4或其片段蛋白水解切割之能力。

上文(8)至(14)項所用之「蛋白水解切割」一詞意指PAR分子(PAR-1、PAR-2、PAR-3或PAR-4)或其片段被能於活化之PAR-2蛋白酶切割位點切割PAR-2之PAR-2蛋白酶或其他酵素切割。

人類PAR-2之N端區域具有至少兩個「未活化之」蛋白酶切割位點，亦即，能被胰蛋白酶切割但並不導致受體活化之位點。該N端未活化之蛋白酶切割位點位於：(a)人類PAR-2(SEQ ID NO:851)殘基Arg-31與Ser-32接合處；及(b)人類PAR-2(SEQ ID NO:851)殘基Lys-34與Gly-35接合處。PAR-2N端活化與未活化之切割位點說明於圖5(白色三角形指出未活化之蛋白酶切割位點，黑色三角形指出活化之PAR-2蛋白酶切割位點)；亦參見圖4。本發明包括阻斷活化之PAR-2蛋白酶切割位點，惟不阻斷一個或兩個未活化蛋白酶切割位點之抗PAR-2抗體。候選抗體是否阻斷或不阻斷特定蛋白酶切割位點可由熟習此項技藝人士使用任何適當測定法(例如本文實例8提出之活體外阻斷試驗例示)進行測定。如實例8所闡明，例示抗體H4H581P被證明阻斷位於人類PAR-2(SEQ ID NO:851)殘基Lys-34與Gly-35接合處之活化PAR-2蛋白酶切割位點及未活化蛋白酶切割位點之胰蛋白酶切割，惟不阻斷位於人類PAR-2(SEQ ID NO:851)殘基Arg-31與Ser-32接合處之未活化蛋白酶切割位點之切割。對照之下，實例8所用之比較抗體阻斷活化PAR-2蛋白酶切割位點及兩個未活化位點之切割。彼等例示抗PAR-2抗體之不同阻斷能力最可能反映出與彼等抗體結合之PAR-2分子特定區域之差異(參見，例如，本文實例9)。

於本文中，若抗體於25℃，表面電漿共振測定法中，測試與標的分子結合時，展現大於500 nM之K_D ；或於25℃，酵素免疫測定法(ELISA)中，測試與標的分子結合時，展現大於50 nM之EC₅₀ ；或於任何測定法或其等同方法中，未展現任何結合；則稱該抗體與特定標的分子(例如，小鼠PAR-2、大鼠PAR-2、兔PAR-2、犬PAR-2、豬PAR-2、或其片段)「不結合」。

本發明之某些抗PAR-2抗體於活體外細胞試驗中能抑制或減弱PAR-2活化。PAR-2活化作用之非限制性、活體外例示細胞試驗說明於本文實例6。於此實例中，使用表現PAR-2及懷有含融合NF-κB於報導分子(例如，螢光素酶)的構築體之細胞。簡言之，此等細胞與抗PAR-2抗體結合，隨後以PAR-2蛋白酶處理。相較於抑制性抗PAR-2抗體不存在下以蛋白酶處理之細胞，於抑制性抗PAR-2抗體存在下以蛋白酶處理之細胞將展現明顯少或無報導訊號。使用此等測定法可計算達到報導訊號半數最高抑制所需抗體濃度(IC₅₀ )。本發明包括於如上述進行PAR-2活化之活體外細胞試驗時，展現小於300 nM之IC₅₀ 之抑制性抗PAR-2抗體。舉例而言，本發明包括於如上述，使細胞與抗體於37℃一起培育1小時，隨後於37℃以20 nM胰蛋白酶(或其他PAR-2蛋白酶)處理5小時，進行PAR-2活化之活體外細胞試驗時，IC₅₀ 小於300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1 nM之抗PAR-2抗體。

本發明包括與一或多個下述胜肽結合之抗PAR-2抗體及其抗原結合片段：胜肽A(GTNRSSKGRSLIGKVDGT，SEQ ID NO:852)；胜肽B(SLIGKVDGTSHVTG，SEQ ID NO:853)；胜肽C(SLIGKV，SEQ ID NO:854)；胜肽D(人類PAR-2 N端功能域一小鼠IgG，SEQ ID NO:855)；胜肽E(LAPGRNNSKGRSLIGRLETQ，SEQ ID NO:856)；胜肽F(GTNRSSKGRSLIGRVDGT，SEQ ID NO:857)；胜肽G(GPNSKGRSLIGRLDTP，SEQ ID NO:858)；胜肽H(GTNKTSKGRSLIGRNTGS，SEQ ID NO:859)；胜肽I(GTNRTSKGRSLIGKTDSS，SEQ ID NO:860)；胜肽J(GTSRPSKGRSLIGKADNT，SEQ ID NO:861)；胜肽K(ATNATLDPRSFLLRNPND，SEQ ID NO:862)；胜肽L(DTNNLAKPTLPIKTFRGA，SEQ ID NO:863)；或胜肽M(ESGSTGGGDDSTPSILPAP，SEQ ID NO:864)。有關彼等胜肽之更多資訊可於本文實例3中發現。彼等胜肽可不含額外標記或部分，或彼等可含N端或C端標記或部分。於一具體實例中，該標記或部分為生物素。於結合試驗中，標記(若有)的位置可決定相對於胜肽結合面之胜肽定位。舉例而言，若表面被覆抗生物素蛋白，則含有N端生物素之胜肽，其定位將使該胜肽C端部分在該表面之遠側。

至於上述胜肽類，本發明包括具有一或多個下述結合概況之抗PAR-2抗體：(1)與胜肽A及B結合，惟不與胜肽C結合；(2)與胜肽A、B及D，惟不與胜肽C結合；(3)與胜肽A、B、D及F結合，惟不與胜肽C結合；(4)與胜肽A、B、D及F結合，惟不與胜肽C或E結合；(5)與胜肽A、B及D結合，惟不與K、L或M任何胜肽結合；(6)與胜肽A、B及F結合，惟不與K、L或M任何胜肽結合；(7)與胜肽A、B、D及F結合，惟不與K、L或M任何胜肽結合；及/或(8)與A、B、C、D、E、F、G、I及J之至少三胜肽結合，惟不與胜肽H結合。本發明抗體之其他結合概況從本文實施例中明顯可見。

抗原決定部位圖譜定位(Mapping)及相關技術

為了篩選結合於特定抗原決定部位之抗體(例如，阻斷IgE與其高親和性受體結合者)，可進行例行之敘述抗體之交叉阻斷試驗例如Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)。其他方法包括丙胺酸掃描式突變分析、胜肽墨點分析法(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248:443-463)、或胜肽切割分析法。此外，可使用例如去除抗原決定部位、抽取抗原決定部位及抗原之化學修飾等方法(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。

「抗原決定部位」一詞係指於抗原上對於B及/或T細胞有反應之位點。B細胞抗原決定部位可藉由蛋白質三級摺疊而自相鄰之連續胺基酸或者非連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成之抗原決定部位暴露於變性溶劑時通常仍保留；而由三級摺疊形成之抗原決定部位以變性溶劑處理時通常會喪失。於獨特空間構形中，抗原決定部位通常包括至少3個，更通常為至少5個或8至10個胺基酸。

Modification-Assisted Profiling(MAP)，亦為所謂以抗原結構為基礎之抗體剖析(ASAP)，乃根據各抗體與經化學或酵素修飾之抗原表面結合概況之相似性，針對相同抗原將大量單株抗體(mAbs)分類之方法(US 2004/0101920)。各類別可能反映出獨特抗原決定部位與其他類別所示抗原決定部位係明顯不同或係部分重疊。此技術容許迅速過濾基因相同之抗體，俾使集中精力鑑定基因不同之抗體。應用於融合瘤篩選時，MAP有助於確認產生具有所需特徵之mAbs之罕見融合瘤株。MAP可用於將本發明抗PAR-2抗體依結合抗原決定部位之不同進行分類。

本發明包括在活化之PAR-2蛋白酶切割位點或靠近該位點處(例如，於其5、10、15或20個胺基酸之內)與抗原決定部位結合之抗PAR-2抗體。於某些具體實例中，抗PAR-2抗體結合於位於活化PAR-2蛋白酶切割位點上游(亦即，其N端)之抗原決定部位。於本發明其他某些具體實例中，抗PAR-2抗體結合於位於活化PAR-2蛋白酶切割位點下游(亦即，其C端)之抗原決定部位。於另外一些具體實例中，本發明之抗PAR-2抗體可結合之抗原決定部位包括位於活化PAR-2蛋白酶切割位點上游之胺基酸序列，以及位於活化PAR-2蛋白酶切割位點下游之胺基酸序列。

或者，於某些具體實例中，本發明之抗PAR-2抗體可結合於位於PAR-2蛋白的一或多個胞外環(例如，胞外環1、胞外環2及/或胞外環3)上之抗原決定部位。

本發明包括與活化之PAR-2蛋白酶切割位點下游之特定胺基酸殘基互相作用之單離人類抗體或其抗原結合片段。舉例而言，本發明包括與人類PAR-2(SEQ ID NO:851)之Val-42及Asp-43互相作用之單離人類抗體或其抗原結合片段。除了彼等兩個殘基外，單離人類抗體或其抗原結合片段亦可與位於活化PAR-2蛋白酶切割位點下游之一或多個下述殘基互相作用:人類PAR-2(SEQ ID NO:851)之Ser-37、Leu-38、Ile-39、Gly-40或Gly-44。於某些具體實例中，單離人類抗體或其抗原結合片段不與人類PAR-2(SEQ ID NO:851)之Lys-41互相作用。舉例而言，本發明包括與人類PAR-2(SEQ ID NO:851)之Ser-37、Leu-38、Ile-39、Gly-40、Val-42及Asp-43互相作用，惟不與人類PAR-2(SEQ ID NO:851)之Lys-41互相作用之單離人類抗體或其抗原結合片段。於實例9中說明之實驗程序可用於測定候選抗PAR-2抗體與PAR-2之特定胺基酸殘基係「互相作用」或係「不互相作用」。舉例而言，若使用實例9之程序測試候選抗體與具有SEQ ID NO:879(對應於PAR-2之Val-42突變成為丙胺酸之PAR-2 N端區域，參見，例如，表24至28)之胜肽之結合，而抗體之T_1/2 少於30%測試候選抗體與野生型胜肽(SEQ ID NO:871)結合所觀察之T_1/2 ，則就本揭示內容之意圖而言，該候選抗體被認為與突變成為丙胺酸之胺基酸(於此例中，Val-42)「互相作用」；亦即，當對應於Val-42之胺基酸突變成為丙胺酸(於圖5中，該等殘基以黑色圓圈繪出)時，候選抗體之結合實質上減少了。另一方面，若使用實例9之程序測試候選抗體與具有SEQ ID NO:878(對應於PAR-2之Lys-41突變成為丙胺酸之PAR-2 N端區域，參見，例如，表24至28)之胜肽之結合，而抗體之T_1/2 大於或等於30%測試候選抗體與野生型胜肽(SEQ ID NO:871)結合所觀察之T_1/2 ，則就本揭示內容之意圖而言，該候選抗體被認為與突變成為丙胺酸之胺基酸(於此例中，Lys-41)「不會互相作用」；亦即，當對應於Lys-41之胺基酸突變成為丙胺酸(於圖5中，該等殘基以白色圓圈繪出)時，候選抗體之結合實質上並未減少。

本發明包括與如本文所述任何特定例示抗體(例如，H4H581P、H4H588N、H4H591N或H4H618N)相同抗原決定部位結合之抗PAR-2抗體。同樣地，本發明亦包括與本文所述任何特定例示抗體(例如，H4H581P、H4H588N、H4H591N或H4H618N)交叉競爭與PAR-2或PAR-2片段結合之抗PAR-2抗體。

使用此項技藝中已知之例行方法易於測定抗體是否與參考抗PAR-2抗體結合於相同抗原決定部位，或與參考抗PAR-2抗體競爭結合。舉例而言，欲確定測試抗體與本發明之參考抗PAR-2抗體是否結合於相同抗原決定部位時，則於飽和條件下，令參考抗體與PAR-2蛋白或胜肽結合。接著，評估測試抗體與PAR-2分子結合之能力。若測試抗體能結合於與參考抗PAR-2抗體飽和結合後之PAR-2，即可斷定該測試抗體與參考抗PAR-2抗體結合於不同抗原決定部位。另一方面，若測試抗體不能結合於與參考抗PAR-2抗體飽和結合後之PAR-2分子，則該測試抗體可能結合於與本發明參考抗PAR-2抗體結合之相同抗原決定部位；然後可進行附加之例行實驗(例如，胜肽突變及結合分析)，以確定所觀察測試抗體之未結合是否事實上是由於結合於與參考抗體相同之抗原決定部位，或者立體位阻(或另一種現象)為所觀察之未結合之主因。此類實驗可使用此項技藝中可用之ELISA、RIA、Biacore、流式細胞測量術或任何其他定量或定性抗體結合試驗進行。根據本發明某些具體實例，於競爭性結合試驗(參見，例如，Junghans et al.,Cancer Res. 1990:50:1495-1502)之測定中，若，例如，1-、5-、10-、20-或100-倍過量之一抗體抑制至少50%，惟較佳為75%、90%或甚至99%另一抗體之結合，則兩個抗體結合於相同(或重疊)抗原決定部位。替代地，若實質上抗原中減少或消除一抗體之結合之所有胺基酸變異亦減少或消除另一抗體之結合，則兩個抗體被認為結合於相同抗原決定部位。只要減少或消除一抗體之結合之胺基酸變異子集亦減少或消除另一抗體之結合，則兩個抗體被認為具有「重疊抗原決定部位」。

欲確定抗體是否與參考抗PAR-2抗體競爭結合，乃從兩個方向進行上述結合方法：於第一個方向中，於飽和條件下，令參考抗體結合於PAR-2分子，隨後評估測試抗體與該PAR-2分子之結合；於第二個方向中，於飽和條件下，令測試抗體結合於PAR-2分子，隨後評估參考抗體與該PAR-2分子之結合。若，於兩個方向中，僅有第一個(飽和)抗體能與PAR-2分子結合，則可斷定測試抗體與參考抗體競爭結合於PAR-2。熟習此項技藝人士將察知，與參考抗體競爭結合之抗體不必然與參考抗體結合於相同抗原決定部位，惟可能藉由結合重疊或相鄰抗原決定部位而立體位阻參考抗體之結合。

物種選擇性及物種交叉反應性

根據本發明之某些具體實例，抗PAR-2抗體與人類PAR-2結合，惟不與得自其他物種之PAR-2結合。或者，於某些具體實例中，本發明之抗PAR-2抗體與人類PAR-2及與得自一或多個非人類物種之PAR-2結合。舉例而言，本發明之抗PAR-2抗體可與人類PAR-2結合，且視情況可與小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、犬、兔、山羊、綿羊、乳牛、馬、駱駝、獼猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩PAR-2之一或多者結合或不結合。

免疫接合物

本發明涵蓋與具療效部分(例如細胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素)接合之抗PAR-2單株抗體(「免疫接合物」)。細胞毒素藥劑包括對細胞有害之任何製劑。用於形成免疫接合物之適當細胞毒素藥劑與化學治療劑為此項技藝中已知，參見，例如WO 05/103081。

多重特異性抗體

本發明抗體可具單一特異性、雙重特異性、或多重特異性。多重特異性抗體可對標的多肽之不同抗原決定部位具特異性或可含有對一種以上標的多肽具特異性之抗原結合功能域；參見，例如，Tutt et al.,1991,J. Immunol. 147:60-69；Kufer et al. ,2004,Trends Biotechnol. 22:238-244。本發明之抗PAR-2抗體可連接於另一功能分子(例如，另一個胜肽或蛋白質)或與其共表現。舉例而言，抗體或其片段可功能性地連接(例如，利用化學偶聯、基因融合、非共價結合或其他方法)於一或多個其他分子實體(例如另一抗體或抗體片段)以產生具有第二個結合特異性之雙重特異性或多重特異性抗體。舉例而言，本發明包括一種雙重特異性抗體，其中免疫球蛋白之一部分對人類PAR-2或其片段具特異性，及該免疫球蛋白之另一部分對第二個治療標的具特異性或接合於治療部分(例如胰蛋白酶抑制劑)。

可用於本發明場合之例示雙重特異性抗體形式涉及使用第一個免疫球蛋白(Ig)C_H 3功能域及第二個Ig C_H 3功能域，其中該第一及第二個IgC_H 3功能域至少一個胺基酸彼此不同，及其中至少一個胺基酸差異，相較於缺乏該胺基酸差異之雙重特異性抗體，減少了雙特異性抗體蛋白A之結合。於一具體實例中，第一個Ig C_H 3功能域結合蛋白A，第二個Ig C_H 3功能域含有減少或破壞蛋白A結合之突變，例如H95R修飾(根據IMGT表現序列編號；H435R，根據EU編號)。第二個C_H 3可進一步包含Y96F修飾(根據IMGT；Y436F，根據EU)。可於第二個C_H 3中發現之進一步修飾包括於IgG1抗體情形下之D16E、L18M、N44S、K52N、V57M、與V82I(根據IMGT；D356E、L358M、N384S、K392N、V397M、與V422I，根據EU)；於IgG2抗體情形下之N44S、K52N、與V82I(IMGT；N384S、K392N、與V422I，根據EU)；及於IgG4抗體情形下之Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、與V82I(根據IMGT；Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、與V422I，根據EU)。雙重特異性抗體形式上之上述變異均涵蓋於本發明範圍之內。

治療調配物及投藥

本發明提供包含本發明抗PAR-2抗體或其抗原結合片段之治療組成物。根據本發明治療組成物之投藥係與併入調配物中之適當載劑、賦形劑、及其他製劑一起投與以提供增進轉移、遞送、耐受性等。許多適當調配物可於所有醫藥化學家已知之處方中發現：Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。舉例而言，彼等調配物包括粉劑、糊劑、軟膏、凝膠、蠟類、油類、脂質類、含囊泡之脂質(陽離子性或陰離子性)(例如LIPOFECTIN^TM )、DNA接合物、無水吸收糊劑、水包油型及油包水型乳劑、碳蠟乳劑(各種分子量之聚乙二醇)、半固態凝膠、及含碳蠟之半固態混合物。亦參見Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。

抗體劑量可隨投藥對象年齡與大小、目標疾病、狀況、投藥途徑等而不同。較佳劑量通常係根據體重或體表面積計算。當本發明抗體用於治療成人病患與PAR-2活性相關之症狀或疾病時，可有利地經靜脈內投與單一劑量通常約0.01至約20毫克/公斤體重，更佳為約0.02至約7、約0.03至約5、或約0.05至約3毫克/公斤體重之本發明抗體。視症狀嚴重性而定，可調整治療頻率及持續時間。投與PAR-2抗體之有效劑量及療程可憑經驗決定；舉例而言，藉由定期評估可監測病患進展情形，因而調整劑量。再者，不同動物間劑量之比例調整可使用此項技藝中悉知之方法進行(例如，Mordentiet al., 1991,Pharmaceut. Res. 8 :1351)。

已知有多種遞送系統可用於投與本發明醫藥組成物，例如：封裝於脂質體、微粒、微膠囊中；能表現突變病毒之重組細胞；受體傳介之細胞吞噬作用(參見，例如，Wu et al.,1987.,J. Biol. Chem. 262:4429-4432)。引入之方法包括，惟不限於，皮膚內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上、及經口等途徑。組成物可利用任何方便之途徑投與，例如輸注或推注、經由上皮或皮膚黏膜層(例如，口腔黏膜、直腸與腸黏膜等)吸收，及可與其他生物活性劑一起投與；投與可為全身性或局部性。

本發明醫藥組成物可使用標準注射針與注射器經由皮下或靜脈內遞送。此外，關於皮下遞送、一種筆型遞送裝置很容易地已應用於遞送本發明醫藥組成物。此等筆型遞送裝置可為重複使用式或拋棄式。重複使用式筆型遞送裝置通常利用含有醫藥組成物之可置換匣；匣內所有醫藥組成物一旦投與完畢成為空匣，則該空匣即被丟棄，替換成含有醫藥組成物之新匣；然後重複使用該筆型遞送裝置。拋棄式筆型遞送裝置中則無可置換匣；而於裝置內儲存器中預先裝填醫藥組成物；儲存器內之醫藥組成物一旦用完後，整個裝置即被丟棄。

許多重複使用式筆型及自動注射器遞送裝置已應用於本發明醫藥組成物之皮下遞送；其實例包括，惟不限於AUTOPEN^TM (Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONIC^TM 筆型(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25^TM 筆型、HUMALOG^TM 筆型、HUMALIN 70/30^TM 筆型(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPEN^TM I、IIh與III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIOR^TM (Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BD^TM 筆型(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPEN^TM 、OPTIPEN PRO^TM 、OPTIPEN STARLET^TM 、及OPTICLIK^TM (sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)等等。已應用於本發明醫藥組成物皮下遞送之拋棄式筆型遞送裝置之實例包括，惟不限於SOLOSTAR^TM 筆型(sanofi-aventis)、FLEXPEN^TM (Novo Nordisk)、與KWIKPEN^TM (Eli Lilly)、SURECLICK^TM 自動注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLET^TM (Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)、及HUMIRA^TM 筆型(Abbott Labs,Abbott Park IL)等等。

於特定情況下，醫藥組成物可於控制釋放系中遞送。於一具體實例中，可使用泵(參見Langer，文獻同前；Sefton,1987,CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201)。於另一具體實例中，可使用聚合物材料；參見，Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。於又另一具體實例中，控制釋放系係置於組成物之標的附近，因此只需要全身性劑量之一小部分(參見，例如，Goodson,1984,Medical Applications of Controlled Release，文獻同前，vol. 2,pp. 115-138)。其他控制釋放系於Langer,1990,Science 249:1527-1533之回顧中討論。

注射製劑可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌內注射、滴注等劑量型。彼等注射製劑可利用公開已知之方法製備；舉例而言，注射製劑可例如在習用於注射之無菌水性介質或油性介質中溶解、懸浮或乳化上述抗體或其鹽進行製備。舉例而言，注射用水性介質為生理鹽液、含有葡萄糖及其他輔助劑之等張溶液等，彼等可與適當助溶劑例如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非離子性界面活性劑[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚氧乙烯(50莫耳)加成物)]等組合使用。可使用例如芝麻油、大豆油等油性介質，彼等可與例如苯甲酸苄酯、苄醇等助溶劑組合使用。如此製備之注射劑較佳為裝填於適當安瓿瓶中。

有利地，供上述經口或非經腸用途之醫藥組成物係配合活性成分之劑量，製備為呈單位劑量之劑量型。此等呈單位劑量之劑量型包括，舉例而言，錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。每一呈單位劑量之劑量型所含前述抗體之量通常為約5至約500毫克；特別是呈注射形式，較佳為所含前述抗體為約5至約100毫克，其他劑量型則為約10至約250毫克。

抗體之治療用途

本發明抗體特別係用於治療、預防及/或改善與PAR-2活性相關之任何疾病或失調症，包括與PAR-2之蛋白水解活化相關之疾病或失調症。可使用本發明抗PAR-2抗體治療之例示疾病與失調症包括疼痛症例如傷害性疼痛與內臟性疼痛、以及與例如發炎、手術後傷口、神經病變、骨折、灼傷、骨質疏鬆骨折、骨癌、痛風、偏頭痛、纖維肌痛等症狀相關之疼痛。本發明抗體亦可用於治療、預防及/或改善例如關節發炎、呼吸道發炎(例如，氣喘)、皮膚發炎、皮膚炎(例如，異位性皮膚炎、過敏性接觸皮膚炎等)、炎性腸道疾病(IBD)、腎絲球性腎炎、間質性膀胱炎、膀胱發炎、痛覺過敏、類風溼性關節炎、骨關節炎、炎性關節炎、多發性硬化症、抗磷脂症候群、α-1-抗胰蛋白酶缺乏等炎性症狀。本發明抗體可用於治療包括，例如，硬皮症、膽汁性肝硬化、移植後纖維變性、腎纖維變性、肺纖維變性、肝纖維變性、胰纖維變性、睪丸纖維變性、增生性疤痕與皮膚瘢瘤等纖維化症狀。於某些具體實例中，本發明抗體係用於治療胃腸疾病(例如，腹腔疾病、克隆氏症(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、自發性胃輕癱、胰臟炎、大腸激躁症候群(IBS)及潰瘍(包括胃潰瘍與十二指腸潰瘍))；急性肺損傷；急性腎損傷；及敗血症。本發明抗PAR-2抗體亦可用於治療搔癢症；例如，皮膚/搔癢、神經性、神經源性、與心理性發癢、以及與異位性皮膚炎、牛皮癬、灼傷疤痕(灼傷相關癢)、增生性疤痕、瘢瘤、腎衰竭及肝衰竭相關之搔癢症。本發明抗PAR-2抗體之其他治療用途包括治療、預防及/或改善阿茲海默症、內塞頓氏症(Netherton's disease)、病理性血管新生、慢性蕁麻疹、血管性水腫、肥大細胞增生症、子宮內膜異位症、不育症(例如，與睪丸纖維變性相關之男性不育症)、肥大細胞傳介之疾病、困難腸梭菌(Clostridium difficile )毒素-A引起之腸炎、及癌症(例如，血液細胞癌、腦癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌症、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌症、胃癌等)。

組合治療

本發明包括投與本發明抗PAR-2抗體組合至少一個附加治療性活性成分之治療投與療法。此等附加治療性活性成分之非限制性實例包括其他PAR-2拮抗劑(例如，抗PAR-2抗體或PAR-2之小分子抑制劑(例如，N1-3-甲基丁醯基-N4-6-胺基己醯基-哌；ENMD-1068))、細胞介素抑制劑(例如，介白素-1(IL-1)抑制劑(例如利納西普(rilonacept)或阿那白滯素(anakinra)、小分子IL-1拮抗劑、或抗IL-1抗體)；IL-18抑制劑(例如小分子IL-18拮抗劑或抗IL-18抗體)；IL-4抑制劑(例如小分子IL-4拮抗劑、抗IL-4抗體或抗IL-4受體抗體)；IL-6抑制劑(例如小分子IL-6拮抗劑、抗IL-6抗體或抗IL-6受體抗體)；抗癲癇藥物[例如，嘉巴噴汀(gabapentain)]；神經生長因子(NGF)抑制劑(例如，小分子NGF拮抗劑或抗NGF抗體)；低劑量秋水仙素；阿斯匹靈；NSAIDs；類固醇(例如，強體松、胺甲喋呤等)；低劑量環孢靈(cyclosporine)A；腫瘤壞死因子(TNF)或TNF受體抑制劑(例如，小分子TNF或TNFR拮抗劑或抗TNF或TNFR抗體)；尿酸合成抑制劑(例如，別嘌呤醇)；尿酸排泄促進劑(例如，丙磺舒、磺吡酮(sulfinpyrazone)、本補麻隆(benzbromarone)等)；其他炎性抑制劑(例如，卡斯蛋白酶(caspase)-1、p38、IKK1/2、CTLA-4Ig等之抑制劑)；及/或皮質類固醇。附加之治療性活性成分可於投與本發明抗PAR-2抗體之前、同時、或之後投與。

抗體之診斷用途

本發明之抗PAR-2抗體亦可用以檢測及/或測定試樣中之PAR-2，例如，以供診斷用途。舉例而言，抗PAR-2抗體、或其片段可用以診斷其特徵為PAR-2異常表現(例如，過度表現、表現不足、沒有表現等)之症狀或疾病。PAR-2之診斷分析法可包含，例如，以本發明抗PAR-2抗體接觸得自病患之試樣，其中該抗PAR-2抗體以可檢測標記或報導分子予以標記。替代地，於診斷應用中可組合使用未標記之抗PAR-2抗體及其本身已具檢測標記之二次抗體。可檢測標記或報導分子可為放射性同位素，例如³ H、¹⁴ C、³² P、³⁵ S、或¹²⁵ I；螢光或化學發光部分例如異硫氰酸螢光素、或若丹明(rhodamine)；或酵素例如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶、或螢光素酶。可用以檢測或測定試樣中之PAR-2之特定測定法實例包括酵素免疫測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)、及螢光活化細胞分類法(FACS)。

於根據本發明PAR-2診斷分析法可使用之試樣包括，於正常或病理狀況下，可自病患獲得之含有可檢測量之PAR-2蛋白、或其片段之任何組織或流體試樣。通常，係測定自健康病患(例如，未罹患與異常PAR-2量或活性相關疾病或症狀之病患)可獲得之特定試樣中PAR-2之量，首先建立PAR-2之基線或標準量。然後將此PAR-2基線量與得自懷疑具有PAR-2相關疾病或症狀的個體之試樣中測得之PAR-2量進行比較。

實例

茲提出下述實例以提供一般熟習此項技藝者如何製造及使用本發明方法與組成物之完整揭示內容與說明，惟不擬限制發明人等視為其發明之範圍。發明人等已致力於確保有關所用數值(例如，量、溫度等)之準確性，惟若干實驗誤差及偏差應予以說明。除非另行指示，否則份數為重量份，分子量為平均分子量、溫度為攝氏度數，壓力則接近大氣壓力。

實例1.　產生對人類PAR-2之人類抗體

直接投與含有具胺基酸序列GTNRSSKGRSLIGKVDGT(SEQ ID NO:852)的人類PAR-2胜肽之免疫原(帶有激發免疫反應之佐劑)於含有編碼人類免疫球蛋白重鏈與κ輕鏈可變區之DNA之小鼠；利用PAR-2-特異性免疫分析法監測抗體免疫反應。於達成所需免疫反應時，收集脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合以保存其活力及形成融合瘤細胞株。篩檢融合瘤細胞株，鑑別出產生PAR-2特異性抗體之細胞株。使用此技術獲得數個抗PAR-2嵌合抗體(亦即，具有人類可變功能域及小鼠恒定功能域之抗體)；將以此方法產生之例示抗體標明如下：H2M588、H2M589、H1M590、H2M591、H1M592、H1M595、H2M609、H2M610、H2M611、H1M612、H1M613、H2M614、H1M615、H1M616、H3M617、H2M618、H1M619、與H3M620。

如U.S. 2007/0280945A1所述，直接自未融合於骨髓瘤細胞之抗原陽性B細胞中單離出抗PAR-2抗體。使用此方法，獲得數個完全人類抗PAR-2抗體(亦即，具有人類可變功能域及人類恒定功能域之抗體)；將以此方法產生之例示抗體標明如下：H1H571、H1H572、H1H573、H1H574、H1H575、H1H576、H1H577、H1H578、H1H579、H1H580、H1H581、H1H583、H1H584、H1H585、H1H586、與H1H587。

茲於下文提出之實例中詳細敘述根據此實例方法產生之例示抗PAR-2抗體之生物性質。

實例2.　重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列

表1列載所選定抗PAR-2抗體及其對應識別抗體之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列對。N、P與G等標示係指具有相同CDR序列惟序列變異落在CDR序列外側區域(亦即，於框架區中)之重鏈及輕鏈之抗體。因此，特定抗體之N、P與G變異體於其重鏈及輕鏈可變區內具有相同CDR序列，惟其框架區內彼此不同。

實例3.與PAR-2胜肽結合之抗體

產生PAR-2及PAR-2相關序列之合成胜肽(Celtek Bioscience,Nashville,TN)以抗PAR-2抗體之結合輪廓為特徵。產生各種胜肽之生物素化及未生物素化型，以供下文提供之諸實例之用。關於生物素化型，生物素部分係經由G₄ S鏈接子共價連接於胜肽之C端或N端。表2列載彼等胜肽之序列及衍生序列。

測試抗PAR-2抗體與PAR-2胜肽結合之能力。以2微克/毫升之濃度，將各種PAR-2胜肽(表3)塗覆於96槽盤上，保溫隔夜，隨後於適當阻斷劑中阻斷一小時。以類似方式，就生物素化胜肽(N-Term：N端經生物素化；C-Term：C端經生物素化)而言，將抗生物素蛋白(濃度2微克/毫升)塗覆於96槽盤上，隨後與濃度0.2微克/毫升之生物素化PAR-2胜肽一起保溫一小時。添加純化之抗PAR-2抗體於塗覆PAR-2胜肽之槽盤至最終濃度在0.2至2.0微克/毫升之範圍內，於室溫保溫一小時。結合抗體之檢測係以接合抗小鼠或人類IgG之辣根過氧化酶(HRP)(Jackson Immuno Research Lab,West Grove,PA)進行測定，以使用四甲基聯苯胺(TMB)基質之標準比色反應呈色；讀取於OD₄₅₀ 之吸光0.1秒。

相較於未結合(-)之經測試之各抗PAR-2抗體，根據觀察OD₄₅₀ 值(分別為1.0-4.0、0.50-0.99、0.1-0.49、0.0-0.09)之與未生物素化(No Biotin)或生物素化胜肽A、B與C之相對結合(+++、++、+)示於表3。對照組：「Sam11」，為結合人類PAR-2之市售可得之小鼠單株抗體(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)。

於類似實驗中，測試轉殖至突變體人類IgG4(SEQ ID NO:849)上之經選定之抗PAR-2抗體與未生物素化及生物素化型之人類PAR-2胜肽(如上述)結合之能力。結果示於表4。

於另一實驗中，測試經選定之抗PAR-2抗體與未生物素化胜肽D、K、L及M之結合(如上述)。嵌合抗體(例如H2M588N)與完全人類抗體(例如H4H572P)之結果分別示於表5及表6。關於胜肽D，結合抗體之檢測係以接合抗小鼠κ之辣根過氧化酶(HRP)(Southern Biotech,Birmingham,AL)進行測定。

於另一實驗中，測試經選定之抗PAR-2抗體與N端生物素化小鼠(胜肽E N-Term)及猴(胜肽F N-Term)PAR-2胜肽(如上述)之結合。

於另一實驗中，測試轉殖至人類IgG4上之經選定之抗PAR-2抗體與未生物素化及生物素化型之胜肽E至J(如上述)之結合。結果示於表8。

於另一實驗中，測試轉殖至人類IgG4上之經選定之抗PAR-2抗體與未生物素化及生物素化型之PAR-2胜肽(胜肽A、E、F及G；如上述)之結合。此實驗中，於塗覆胜肽之槽盤上，使從13.3 nM連續稀釋3倍至0.22 pM之抗PAR-2抗體於室溫保溫一小時。於GraphPad Prism中，使用S形劑量反應模式分析450奈米處之吸光值(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)並記述EC₅₀ 值(表9)。EC₅₀ 值係界定為達成50%與PAR-2胜肽最大結合需要之抗體濃度。

如前述實驗所示，抗體H4H581P、H4H588N、H4H591N或H4H618N均顯示實質上與含有序列SLIGKVDGT(SEQ ID NO:852之胺基酸10-18)之人類胜肽A、B與D，以及含有序列SLIGRVDGT(SEQ ID NO:857之胺基酸10-18)之猴胜肽F結合。就抗體H4H588N、H4H591N與H4H618N而言，位於活化之PAR-2蛋白酶切割位點下游之序列VDGT對結合作用似乎特別重要，因為此序列之變化實質上導致彼等抗體結合減少或未結合(參見，例如，胜肽E(小鼠)、G(大鼠)、H(兔)、I(犬)及J(豬)之結合數據)。

實例4.　抗原結合親和性測定

使用即時表面電漿共振生物感應器測定法，利用表面動力學測定抗原與經選定之純化PAR-2抗體結合之平衡解離常數(K_D 值)。於經由直接胺化學偶聯於BIACORE^TM CM5感測晶片製造之兔抗小鼠IgG多株抗體(GE Healthcare,Piscataway,NJ)表面或山羊抗人類IgG多株抗體(Jackson Immuno Research Lab,West Grove,PA)表面捕捉抗體，以形成捕捉抗體表面。以100微升/分鐘之速率，於捕捉抗體表面注入各種濃度(於15.6至250 nM範圍內)之人類PAR-2胜肽單體(胜肽A及B)90秒。於室溫，即時監測抗原-抗體結合及解離。進行動力學分析以計算K_D 及抗原/抗體複合物解離之半衰期(表10)。未顯示T_1/2 值之抗體，使用穩定狀態分析以計算K_D 值。NB：現行實驗條件下，未觀察到結合。ND：未測定。

於類似實驗中，測定轉殖於人類IgG4上之經選定抗體與未生物素化單體小鼠(胜肽E)及N端生物素化猴(胜肽F N-Term) PAR-2胜肽結合之K_D 值(如上述)(表11)。抗體H4H588N、H4H591N、及H4H618N未與胜肽E結合；對照抗體不與胜肽E或F結合。

於另一系列實驗中，使用即時表面電漿共振生物感應器測定法，利用表面動力學測定純化抗體與經選定之生物素化及未生物素化型PAR-2胜肽結合之平衡解離常數(K_D 值)。使用胺偶聯化學，令Neutravidin(Pierce,Rockford,IL)共價連接於Biacore^TM C1晶片或CM5晶片表面。經由生物素與該胺偶聯Neutravidin間之高親和性結合相互作用，使生物素化(N-Term或C-Term)之PAR-2胜肽(胜肽A及B)固定於該表面。

於使用此模式之第一個實驗中，以50微升/分鐘之速率，將各種濃度(於5至100微克/毫升範圍內)之純化抗體注入至低密度(<1RU)塗覆之固定胜肽表面300秒。於25℃，即時監測抗體-胜肽結合及解離(表12)。

於另一類似實驗中，測定轉殖於人類IgG4上之經選定抗體與低密度表面(<1RU)生物素化型之胜肽A、B、C、E、F及G結合之K_D 值(如上述)。與C端及N端生物素化PAR-2胜肽之結合結果分別示於表13及表14。於此實驗中，只有抗體H4H581P展示對N端生物素化胜肽C之親和性(其K_D >100 nM)；所有其他測試抗體，包括對照組，均顯示未與此胜肽結合。

於類似實驗中，測定轉殖於人類IgG4上之經選定抗體與單體生物素化及未生物素化型PAR-2胜肽(胜肽A、B、E-M)結合之K_D 值(如上述有關捕捉抗體表面)；結果示於表15至16。所測試抗體無一者顯示與胜肽K、L或M結合。

實例5.與經基因工程改造之表現PAR-2的細胞結合之抗體

為了進一步鑑別抗PAR-2抗體，使人類胚胎腎293細胞株之細胞(HEK293)經基因工程改造以大量表現全人類(SEQ ID NO:851)或小鼠(SEQ ID NO:866)PAR-2。

以NF-κB-螢光素酶-IRES-eGFP報導質體轉染HEK293細胞。透過流式細胞測量術及螢光素酶活性，以eGFP表現檢測IL-1β，利用對IL-1β之反應證明轉染細胞之穩定性。使用流式細胞測量術，以一系列細胞族群連續分類製造以IL-1β誘發時具有低背景值螢光素酶活性及高表現量eGFP之名稱為D9之轉殖細胞株。然後以人類PAR-2或小鼠PAR-2分別轉染該293/D9細胞株，分別製造出穩定之293/D9/hPAR-2rec及293/D9/mPAR-2rec細胞株。

利用ELISA測定抗PAR-2抗體與293/D9/hPAR-2rec細胞之結合。以5X10⁴ 細胞/槽之密度，於培養基中培養293/D9及293/D9/hPAR-2rec細胞，於37℃及5% CO₂ 下，培養隔夜。添加純化抗體於細胞中至最終濃度為10微克/毫升，於室溫培養一小時。固定及洗滌細胞後，以接合抗小鼠IgG之HRP檢測結合抗體，藉由使用TMB基質之標準比色反應呈色；讀取於OD₄₅₀ 之吸光0.1秒。相較於293/D9細胞，抗體與293/D9/hPAR-2rec細胞結合之A₄₅₀ 比率示於表17。

於類似實驗中，使用電化學發光技術(Meso Scale Discovery,MSD,Gaithersburg,MD)，測試抗PAR-2抗體與293/D9、293/D9/hPAR-2rec及293/D9/mPAR-2rec細胞之結合。於PBS中，以4X10⁴ 細胞/槽之密度，使細胞於MSD高結合96槽盤上培養，於室溫保溫一小時。然後於PBS中，以2% BSA阻斷細胞，於室溫保溫一小時。於PBS中，以0.5% BSA將抗PAR-2抗體(於100 nM至0.098 nM範圍內)2倍系列稀釋，於室溫，與細胞一起保溫一小時，隨後於PBS中，以0.5% BSA洗滌。然後添加濃度0.1微克/毫升之硫-標記之抗人類IgG抗體(MSD)至該細胞/抗體混合物中，於室溫再保溫1小時。經另一次洗滌後，添加含有讀取緩衝液(read buffer)之1X非界面活性劑，於MSD Sector Imager上讀取電化學發光訊號。從抗體與293/D9/hPAR-2rec或293/D9/mPAR-2rec細胞結合之訊號中扣除與293/D9細胞結合之訊號。於GraphPad Prism中，使用S形劑量反應模式分析扣除後之數據並記述EC₅₀ 與B_max 值(表18)。EC₅₀ 值係界定為達成50%與細胞最大結合(B_max )需要之抗體濃度。

實例6.　以抗PAR-2抗體活體外阻斷人類PAR-2活化

以螢光素酶測定法，利用經選定之純化抗PAR-2抗體與293/D9/hPAR-2rec細胞之結合，測定PAR-2活化(傳訊)之阻斷(參見實例5)。於低血清培養基中，以5X10⁴ 至10⁵ 細胞/槽範圍內之濃度，於96槽盤培養293/D9/hPAR-2rec細胞，於37℃，5% CO₂ 下，培養隔夜。移除培養基，添加各種濃度(於51 pM至1 μM範圍內)之純化抗PAR-2抗體至細胞中，於37℃，5% CO₂ 下，培養一小時。然後分別添加各種濃度之不同絲胺酸蛋白酶(胰蛋白酶、人類胰蛋白酶1、因子Xa與肺中性蛋白酶)至細胞/抗體混合物中，於37℃，5% CO₂ 下，培養五小時。此測定法中，PAR-2之蛋白水解切割導致NF-κB-螢光素酶報導構築體之表現，而減少或減弱量之螢光素酶訊號表示PAR-2切割受抑制。IC₅₀ 值示於表19中。ND：未測定。

如表20所示，抗體H4H581P、H4H588N、H4H591N及H4H618N能顯著阻斷報導細胞中PAR-2之蛋白酶活化作用。對照之下，抗PAR-2抗體H4H592N、H4H595N、H4H611N、H4H613N、H4H614N、H4H615N、H4H616N、H4H617N及H4H619N於此測定法中，未展示任何可測量之PAR-2切割/活化之阻斷。

以類似方式，利用轉殖於人類IgG4上之經選定純化抗PAR-2抗體之結合，測定由20 nM胰蛋白酶傳介之PAR-2傳訊之抗體阻斷。

於此實例所用實驗條件下，未觀察到抗體H4H572P、H4H573P、H4H576P、H4H578P或H4H587P對PAR-2傳訊之阻斷作用，而觀察到抗體H4H579P、H4H580P、H4H581P、H4H583P、H4H584P、H4H585P、H4H588N、H4H591N及H4H618N之顯著阻斷作用(至不同程度)。

於另一類似實驗中，測定轉殖於人類IgG4上之經選定純化抗PAR-2抗體之由人類胰蛋白酶1、因子Xa及肺中性蛋白酶傳介之PAR-2傳訊之抗體阻斷(如上述)。結果示於表21。

表現人類、猴、小鼠或大鼠PAR-2之HEK293/NFκB-螢光素酶細胞以增量之抗PAR-2抗體H4H581P預保溫後，進行各種蛋白酶處理，測定IC₅₀ 。結果摘述於表22。

於所用特定實驗條件下，H4H581P抗體有效地抑制人類與猴PAR-2之蛋白酶活化作用，對小鼠或大鼠PAR-2則不然。

實例7.　人類PAR-2依賴性鈣移動之活體外抗體阻斷

於鈣移動FLIPR測定法(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中，以轉殖於人類IgG4上之經選定純化抗PAR-2抗體處理HEK293細胞，測定胰蛋白酶激發之PAR-2活化(傳訊)之阻斷。於此測定法中，亦測試非PAR-2特異性對照抗體。

簡言之，於低血清培養基(含0.5% FBS之DME)中，使8X10⁴ 個HEK293細胞在聚-D-離胺酸盤(BD Biosciences,San Jose,CA)上培養，於37℃，5% CO₂ 下，培養隔夜。第二天，使細胞與各種濃度(於0至1 μM範圍內)經選定之抗PAR-2抗體、或對照抗體一起保溫，隨後添加胰蛋白酶。PAR-2之胰蛋白酶媒介活化作用以鈣移動表示。於FlexStation 3(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)上，使用Fluo-4 NW鈣測定套組(Invitrogen,Carlsbad,CA)進行鈣傳訊之細胞內測定。測定各實驗抗體及對照抗體引起胰蛋白酶媒介之鈣傳訊半數最大抑制所需抗體濃度(IC₅₀ )。結果以IC₅₀ (nM)示於表23。

如此實例所顯示，相較於對照抗體，抗體H4H581P及H4H588N各自於很大程度上抑制胰蛋白酶激發之鈣傳訊。

實例8.PAR-2胜肽由胰蛋白酶傳介之切割之活體外阻斷

展開基質輔助雷射脫附游離法-飛行時間(MALDI-TOF)測定法以測定經選定純化抗PAR-2抗體對於人類PAR-2胜肽(胜肽A，SEQ ID NO:852)由胰蛋白酶傳介之切割之阻斷能力。使生物素化形式之胜肽A(含有C端或N端生物素)與抗PAR-2抗體混合，至達成抗體對胜肽莫耳比為3:1，然後添加胰蛋白酶至該胜肽-抗體混合物。以免疫沉澱法(IP)經由單抗生物素蛋白回收生物素化之胜肽，利用MALDI-TOF進行分析。

於典型實驗中，針對轉殖於人類IgG4上之經選定純化抗PAR-2抗體(H4H581P及H4H588N)，測試其阻斷生物素化PAR-2胜肽由胰蛋白酶傳介的切割之能力。使用相同之同型非PAR-2特異性抗體作為負對照組(圖3之「Neg Ctrl」)。H4H581P與負對照抗體係使用最終濃度4.75 μM之生物素化胜肽及使用14.25 μM之抗體。H4H588N係使用最終濃度2.45 μM之生物素化胜肽及使用7.35 μM之抗體。於PBS中，使胜肽與抗體混合，於室溫令其達到平衡1小時。然後添加胰蛋白酶(96奈克)，此混合物於37℃保溫0、5、10及15分鐘。每個時間點，移取相當於100奈克生物素化胜肽之份量，與10微升單體抗生物素蛋白樹脂(Pierce)混合1分鐘。此結合胜肽以200微升PBS輕洗3次，然後以20微升100 mM甘胺酸(pH 2，5)溶洗。使用ZipTips(Millipore)，從溶洗出之胜肽混合物中去除鹽。如MALDI-TOF分析所展示，胰蛋白酶切割後產生的主要生物素化PAR-2胜肽之分子量摘述於圖3。

於彼等實驗中使用之PAR-2胜肽含有兩個R/S蛋白酶切割位點。第一個位點(圖3中標示為位點「(1)」)係位於活化PAR-2蛋白酶切割位點N端之「上游」切割位點。活化之PAR-2蛋白酶切割位點(圖3中標示為位點「(2)」)係切割時於天然存在之蛋白質中形成PAR-2繫留配體之位點。於不同位點切割後所檢測之胜肽大小示於圖3上半部(A組)。

如圖3(B組)所示，C端生物素PAR-2胜肽以同型匹配之對照抗體處理，隨後進行胰蛋白酶保溫時，產生1558 Da之切割片段(含SEQ ID NO:852之殘基10-18)。該1558 Da片段係於活化之PAR-2蛋白酶切割位點(2)切割之結果。於使用H4H588N抗PAR-2抗體之實驗中，亦觀察到此切割模式。因此，根據此測定法，對照抗體及H4H588N抗體均未抑制於活化PAR-2蛋白酶切割位點(2)之胰蛋白酶切割。

對照之下，C端生物素PAR-2胜肽以H4H581P抗體處理，隨後進行胰蛋白酶保溫時，產生2073 Da之切割片段(含SEQ ID NO:852之殘基5-18)。該2073 Da片段係僅於上游切割位點(1)切割所產生之片段。因此，於活化PAR-2蛋白酶切割位點(2)之切割顯然被H4H581P抗體阻斷。

於所有測試抗體存在下，使用N端生物素PAR-2胜肽之實驗顯示上游切割位點(1)之胰蛋白酶切割，因而產生988 Da N-生物素化片段(含SEQ ID NO:852之殘基1-4)。因此，於彼等實驗條件下，所測試抗體無一者阻斷於上游切割位點(1)之切割。

如以上實例6與7所示，於細胞系測定法中，H4H581P與H4H588N均阻斷PAR-2被胰蛋白酶活化。然而，於本實例中，只有H4H581P阻斷於活化PAR-2蛋白酶切割位點之胰蛋白酶切割。不被任何機械理論約束下，H4H588N因而似乎可藉由干擾繫留配體與PAR-2一或多個胞外環(例如，環1、環2及/或環3)間之互相作用而發揮其抑制性效力。另一方面，H4H581P可能主要藉由阻斷蛋白酶切割而抑制PAR-2活性，惟亦可能干擾與繫留配體之相互作用。

為了進一步研究抗PAR-2抗體之蛋白酶切割阻斷性質，乃使用C端生物素化之小鼠、大鼠及人類PAR-2胜肽進行附加之MALDI-TOF實驗(參見圖4)。於彼等實驗中測試之抗體為H4H581P、H4H588N、具有於WO 2009/005726中稱為「1A1」的抗體之重鏈及輕鏈可變區之比較抗體(於圖5中稱為「Comp. Ab」)、及負對照抗體(於圖4中稱為「Neg Ctrl」)。此實驗中亦使用先前MALD-TOF實驗中所用之相同實驗程序(上述)。

彼等實驗所用之胜肽各具有能被胰蛋白酶切割之多個位點(於圖5中稱為「(1)」、「(2)」、與「(3)」)。各胜肽之位點(3)為活化之蛋白酶切割位點。於不同位點切割後產生之胜肽大小示於圖4上半部分(A組)。

如圖4所摘述，生物素化人類PAR-2胜肽以H4H581P處理及進行胰蛋白酶保溫後，只產生對應於位點(1)切割之2074 kDa胜肽。因此，H4H581P阻斷於位點(2)以及位點(3)之切割。對照之下，人類PAR-2胜肽以比較抗體處理及進行胰蛋白酶保溫後，保持於2502 kDa，表示未切割。因此，於此測定法中，比較抗體阻斷所有三個蛋白酶切割位點，包括最N端之位點(1)。於以抗體H4H588N預處理時，人類PAR-2胜肽於胰蛋白酶切割後產生1772 kDa及1558 kDa片段。此切割模式表示H4H588N部分阻斷於活化之位點(3)之切割，惟完全阻斷中間之位點(2)。

亦使用具有稱為Sam-11(Molinoet al .,Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:825-832(1998))的抗體之重鏈及輕鏈可變區之比較抗體進行此實驗。如預期地，此特定比較抗體未阻斷於任何蛋白酶切割位點之切割(數據未顯示)。

實例9.　利用PAR-2胜肽之丙胺酸掃描式突變分析之抗原決定部位圖譜定位

為了更具體鑑別與PAR-2抗體相互作用的PAR-2之胺基酸，乃使用含有活化PAR-2蛋白酶切割位點之胜肽進行丙胺酸掃描研究。於彼等實驗中，合成11個不同之C端生物素化胜肽，其中從人類PAR-2(SEQ ID NO:851)位置35至45之各個胺基酸個別以丙胺酸替換(SEQ ID NOs：871-882)；亦使用另一組C端生物素化胜肽，其中包含位於緊接著活化PAR-2蛋白酶切割位點C端之14個胺基酸，其Val-42及/或Asp-43變為丙胺酸(SEQ ID NOs：884-887)。

使用生物膜層反射光干涉技術(Octet Red；ForteBio)測定各胜肽突變體與PAR-2抗體結合之能力。於塗覆抗生物素鏈菌素之生物感應器頂端(Octet SA感應器)捕捉各胜肽(2.5微克/毫升)10秒。欲測定各胜肽與PAR-2抗體間之結合及解離時，使塗覆胜肽之生物感應器與PAR-2抗體之200nM溶液接觸5分鐘(結合)，隨後移至無抗體之緩衝液中10分鐘(解離)。為了校正個別生物感應器上胜肽裝載之些微偏差，PAR-2抗體與各胜肽之結合以將個別抗體結合訊號除以各胜肽所觀察到之原始胜肽裝載(loading)訊號後之原生訊號百分比表示。使用Scrubber版本2.0a曲線擬合軟體，由解離曲線計算解離半衰期(T_1/2 )，將個別胜肽所觀察半衰期除以天然胜肽半衰期，計算出相對半衰期。彼等結果以相對於WT胜肽之結合百分比及T_1/2 百分比表示(表24至28)。[比較抗體1=具有於WO 2009/005726中稱為「1A1」的抗體之重鏈及輕鏈可變區之抗體；比較抗體2=具有稱為Sam-11(Molinoet al. ,Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:825-832(1998))的抗體之重鏈及輕鏈可變區之抗體；及比較抗體3=具有於US 2010/0119506中稱為「PAR-B」的抗體之重鏈及輕鏈可變區之抗體]。於特定狀況下，重複進行結合實驗(示於欄名實驗1及實驗2下方)。NB=未觀察到結合。

丙胺酸掃描實驗結果摘述於圖5，其中黑色圓圈表示變為丙胺酸時，實質上減少與對應抗體之結合(亦即，與變異胜肽結合的抗體之T小於30%與野生型胜肽結合的抗體之T)之PAR-2之胺基酸。(圖5中之空三角形表示非活化之上游蛋白酶切割位點，黑色三角形表示活化之蛋白酶切割位點)。如圖5所示，比較抗體1與3對活化蛋白酶切割位點兩側殘基之變異敏感。對照之下，抗體H4H581P及H4H588N只對活化蛋白酶切割位點C端所見之殘基變異敏感。因此，相對於比較抗體1與3之結合位點，H4H581P於PAR-2上之結合位點似乎往C端方向移動約2至4個胺基酸；H4H588N結合位點則從H4H581P結合位點往C端方向移動約2至4個胺基酸。比較抗體2僅結合於含有活化PAR-2蛋白酶切割位點下游14個胺基酸[亦即，SLIGKVDGTSHVTG(SEQ ID NO:884之殘基1-14)]之胜肽，及對天冬胺酸殘基(SEQ ID NO:851之Asp-43)之變異敏感，惟對纈胺酸殘基(SEQ ID NO:851之Val-42)之變異不敏感。

值得注意的是，此實驗表示抗體H4H581P及H4H588N均與位於活化PAR-2蛋白酶切割位點C端之第一個V與D殘基(亦即，SEQ ID NO:851之Val-42與Asp-43)相互作用，而比較抗體1與3不與任何彼等殘基相互作用，比較抗體2則與Asp-43惟不與Val-42相互作用。於PAR-2上H4H581P相較於比較抗體之移動結合可能說明了如下述活體內實例所展示之H4H581P與比較抗體相較下之功能優越性。

實例10.　搔癢症模式中抗PAR-2抗體之劑量反應列

於此實例中，係評估抗PAR-2抗體H4H581P在兩個不同蛋白酶引發之搔癢症模式中減輕癢之能力。彼等實驗中，所有群組均使用表現人類PAR-2(hPAR2^+/+ )之基因轉殖小鼠。不同群組之小鼠接受150毫克/公斤(皮下注射)之同型對照組mAb或10、25、50、75、100、及150毫克/公斤(皮下注射)之H4H581P。抗體給藥24小時後，所有群組均接受產生搔癢行為發作30至60分鐘之150微克豬胰蛋白酶，或10微克重組人類β中性蛋白酶(皮下注射，於肩胛間)。觀察胰蛋白酶注射之前接受H4H581P小鼠之劑量反應關係，估計ED₅₀ 為25毫克/公斤。彼等實驗結果以投與胰蛋白酶後30分鐘期間、或投與中性蛋白酶後60分鐘期間記錄之搔癢發作總次數變化百分比表示，示於表29(所有數據均以平均值±SEM表示；ND=未測定；*=相較於同型對照組p<0.05)。

如此實例所顯示，於使用兩個不同蛋白酶引發之癢模式中，mAb H4H581P能以劑量依賴性方式阻斷蛋白酶引發之搔癢症行為。

實例11. 　於輔抗原引發之慢性皮膚炎模式中，利用投與抗PAR-2抗體減少搔癢行為

為了進一步評估抗PAR-2抗體H4H581P於生理相關疾病狀態中減少搔癢行為之能力，乃使用慢性皮膚炎之小鼠模式。於此模式中，小鼠重複接受唑酮(輔抗原化劑)之皮膚施敷。此慢性唑酮引發之皮膚炎模式已被證實可再現人類異位性皮膚炎之許多臨床、組織學、及免疫學上之特徵(Manet al .,2008,J .Invest .Dermatol .128(1) :79-86)。

小鼠於左耳單次皮膚施敷1%唑酮或載劑(100毫克/公斤，皮下注射)以致敏。然後於致敏施敷7天後，使小鼠於肩胛間接受總共九次0.6%唑酮皮膚施敷(加強)。於第一次唑酮加強之前24小時開始H4H581P抗PAR2抗體之每週投藥(共3次)(100毫克/公斤，皮下注射)。由於測定出之最終唑酮加強引起的搔癢發作次數減少，因此，此投藥模式明顯減少搔癢行為。所有數據均以搔癢發作平均次數±SEM表示(n=6隻小鼠/組)；*=相較於唑酮+IgG對照組p<0.05，Tukey因果關係試驗；#=相較於載劑+IgG對照組p<0.05，Tukey因果關係試驗)。

組織學分析顯示，經唑酮加強之動物，其表皮增生及免疫細胞浸潤物顯著增加(數據未顯示)。於H4H581P抗PAR2抗體及同型對照物間，未觀察到任何彼等參數之顯著差異。

實例12. mAb H4H581P搔癢症抑制活性之比較

於此實例中，比較mAb H4H581P與抗PAR-2 mAb比較抗體(WO 2009/005726中敘述之比較抗體「1A1」)於小鼠搔癢症模式中減輕癢發作之能力。

將表現人類PAR-2(hPAR2^+/+ )之基因轉殖小鼠分成3個群組。群組A接受50毫克/公斤(皮下注射)同型對照物mAb，群組B接受50毫克/公斤(皮下注射)H4H581P，及群組C接受50毫克/公斤(皮下注射)抗PAR-2比較抗體。抗體給藥24小時後，所有組別均接受產生搔癢行為發作30分鐘之150微克胰蛋白酶(皮下注射，於肩胛間)。相較於對照物處理小鼠，於處理小鼠群組觀察到之搔癢發作次數變化百分比示於表29(所有數據均以平均值±SEM表示)。

如此實例所顯示，於本文所用之胰蛋白酶引發之癢模式中，就減少搔癢行為而言，mAb H4H581P實質上比比較抗體mAb更有效。

本發明範圍不擬受限於本文敘述之某些具體實例。更確切而言，從前述說明內容及隨附之圖式，除了本文敘述內容以外之本發明之各種修飾對熟習此項技藝者而言屬明顯可見之事。該等修飾意欲隸屬隨附專利申請之範圍內。

<400>　822

<210>　823

<211>　36

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　823

<210>　824

<211>　12

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　824

<210>　825

<211>　327

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　825

<210>　826

<211>　109

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　826

<210>　827

<211>　21

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　827

<210>　828

<211>　7

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　828

<210>　829

<211>　9

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　829

<210>　830

<211>　3

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　830

<210>　831

<211>　27

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　831

<210>　832

<211>　9

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　832

<210>　833

<211>　357

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　833

<210>　834

<211>　119

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　834

<210>　835

<211>　324

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　835

<210>　836

<211>　108

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　836

<210>　837

<211>　357

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　837

<210>　838

<211>　119

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　838

<210>　839

<211>　325

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　839

<210>　840

<211>　108

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　840

<210>　841

<211>　8

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<220>

<221>　變異體

<222>　(1)...(1)

<223>　Xaa=Gly

<220>

<221>　變異體

<222>　(2)...(2)

<223>　Xaa=Phe

<220>

<221>　變異體

<222>　(3)...(3)

<223>　Xaa=Thr

<220>

<221>　變異體

<222>　(4)...(4)

<223>　Xaa=Phe

<220>

<221>　變異體

<222>　(5)...(5)

<223>　Xaa=Ser或Arg

<220>

<221>　變異體

<222>　(6)...(6)

<223>　Xaa=Ser或Arg

<220>

<221>　變異體

<222>　(7)...(7)

<223>　Xaa=Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(8)...(8)

<223>　Xaa=Gly,Ala,或Thr

<400>　841

<210>　842

<211>　8

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<220>

<221>　變異體

<222>　(1)...(1)

<223>　Xaa=Ile

<220>

<221>　變異體

<222>　(2)...(2)

<223>　Xaa=Ser,Gly,或Thr

<220>

<221>　變異體

<222>　(3)...(3)

<223>　Xaa=Tyr,Gly,或Asp

<220>

<221>　變異體

<222>　(4)...(4)

<223>　Xaa=Asp,Gly,或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(5)...(5)

<223>　Xaa=Gly或Arg

<220>

<221>　變異體

<222>　(6)...(6)

<223>　Xaa=Ile,Gly,或Ala

<220>

<221>　變異體

<222>　(7)...(7)

<223>　Xaa=Asn,Ser,Arg,或Gly

<220>

<221>　變異體

<222>　(8)...(8)

<223>　Xaa=Lys,Ala,或Thr

<400>　842

<210>　843

<211>　12

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<220>

<221>　變異體

<222>　(1)...(1)

<223>　Xaa=Ala或Val

<220>

<221>　變異體

<222>　(2)...(2)

<223>　Xaa=Lys

<220>

<221>　變異體

<222>　(3)...(3)

<223>　Xaa=Gly或Glu

<220>

<221>　變異體

<222>　(4)...(4)

<223>　Xaa=Asp或Gly

<220>

<221>　變異體

<222>　(5)...(5)

<223>　Xaa=Phe或Asp

<220>

<221>　變異體

<222>　(6)...(6)

<223>　Xaa=Trp或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(7)...(7)

<223>　Xaa=Ser或Gly

<220>

<221>　變異體

(222>　(8)...(8)

<223>　Xaa=Gly或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(9)...(9)

<223>　Xaa=Tyr或Asp

<220>

<221>　變異體

<222>　(10)...(10)

<223>　Xaa=Phe或Leu

<220>

<221>　變異體

<222>　(11)...(11)

<223>　Xaa=Asp或Ala

<220>

<221>　變異體

<222>　(12)...(12)

<223>　Xaa=Tyr

<400>　843

<210>　844

<211>　11

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<220>

<221>　變異體

<222>　(1)...(1)

<223>　Xaa=Gln

<220>

<221>　變異體

<222>　(2)...(2)

<223>　Xaa=Ser或Gly

<220>

<221>　變異體

<222>　(3)...(3)

<223>　Xaa=Leu或Ile

<220>

<221>　變異體

<222>　(4)...(4)

<223>　Xaa=Val或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(5)...(5)

<223>　Xaa=His,Asn,或Thr

<220>

<221>　變異體

<222>　(6)...(6)

<223>　Xaa=Ser,Asn,或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(7)...(7)

<223>　Xaa=Asp或不存在

<220>

<221>　變異體

<222>　(8)...(8)

<223>　Xaa=Gly或不存在

<220>

<221>　變異體

<222>　(9)...(9)

<223>　Xaa=Asn或不存在

<220>

<221>　變異體

<222>　(10)...(10)

<223>　Xaa=Thr或不存在

<220>

<221>　變異體

<222>　(11)...(11)

<223>　Xaa=Tyr或不存在

<400>　844

<210>　845

<211>　3

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<220>

<221>　變異體

<222>　(1)...(1)

<223>　Xaa=Lys或Ala

<220>

<221>　變異體

<222>　(2)...(2)

<223>　Xaa=Ile,Ala,或Thr

<220>

<221>　變異體

<222>　(3)...(3)

<223>　Xaa=Ser

<400>　845

<210>　846

<211>　9

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<220>

<221>　變異體

<222>　(1)...(1)

<223>　Xaa=Met或G1n

<220>

<221>　變異體

<222>　(2)...(2)

<223>　Xaa=G1n

<220>

<221>　變異體

<222>　(3)...(3)

<223>　Xaa=Ala或Tyr

<220>

<221>　變異體

<222>　(4)...(4)

<223>　Xaa=Thr或Lys

<220>

<221>　變異體

<222>　(5)...(5)

<223>　Xaa=G1n,Ser,或Ile

<220>

<221>　變異體

<222>　(6)...(6)

<223>　Xaa=Phe或Ser

<220>

<221>　變異體

<222>　(7)...(7)

<223>　Xaa=Pro

<220>

<221>　變異體

<222>　(8)...(8)

<223>　Xaa=Thr或Leu

<220>

<221>　變異體

<222>　(9)...(9)

<223>　Xaa=Thr或不存在

<400>　846

<210>　847

<211>　330

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　847

<210>　848

<211>　327

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　848

<210>　849

<211>　327

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　849

<210>　850

<211>　1194

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　850

<210>　851

<211>　397

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　851

<210>　852

<211>　18

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　852

<210>　853

<211>　14

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　853

<210>　854

<211>　6

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　854

<210>　855

<211>　276

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　855

<210>　856

<211>　20

<212>　PRT

<213>　小鼠

<400>　856

<210>　857

<211>　18

<212>　PRT

<213>　猴子

<400>　857

<210>　858

<211>　16

<212>　PRT

<213>　大鼠

<400>　858

<210>　859

<211>　18

<212>　PRT

<213>　兔

<400>　859

<210>　860

<211>　18

<212>　PRT

<213>　犬

<400>　860

<210>　861

<211>　18

<212>　PRT

<213>　豬

<400>　861

<210>　862

<211>　18

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　862

<210>　863

<211>　18

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　863

<210>　864

<211>　19

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　864

<210>　865

<211>　2772

<212>　DNA

<213>　小鼠

<400>　865

<210>　866

<211>　399

<212>　PRT

<213>　小鼠

<400>　866

<210>　867

<211>　3011

<212>　DNA

<213>　大鼠

<400>　867

<210>　868

<211>　397

<212>　PRT

<213>　大鼠

<400>　868

<210>　869

<211>　22

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　869

<210>　870

<211>　23

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　870

<210>　871

<211>　24

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　871

<210>　872

<211>　24

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　872

<210>　873

<211>　24

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　873

<210>　874

<211>　24

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　874

<210>　875

<211>　24

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　875

<210>　876

<211>　24

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　876

<210>　877

<211>　24

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　877

<210>　878

<211>　24

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　878

<210>　879

<211>　24

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　879

<210>　880

<211>　24

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　880

<210>　881

<211>　24

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　881

<210>　882

<211>　24

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　882

<210>　883

<211>　20

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　合成

<400>　883

圖1. 抗體H4H581P、H4H588N、H4H591N及H4H618N之重鏈可變區與CDRs之序列比較表。

圖2. 抗體H4H581P、H4H588N、H4H591N及H4H618N之輕鏈可變區與CDRs之序列比較表。

圖3. 上半部(A)顯示對應於圍繞活化PAR-2蛋白酶切割位點的序列之C端及N端經生物素標記之胜肽。(GTNRSSKGRSLIGKVDGT；SEQ ID NO:852)。蛋白酶切割位點標明為1號(上游，未活化之蛋白酶切割位點)與2號(活化之PAR-2蛋白酶切割位點)。未切割及切割片段之預期大小示於上表。下半部(B)顯示於抗PAR-2抗體或負對照組存在下，以胰蛋白酶處理0、5、及15分鐘後所觀察之片段大小。

圖4. 上半部(A)顯示對應於圍繞活化PAR-2蛋白酶切割位點的序列之小鼠、大鼠及人類胜肽(分別為SEQ ID NOs:883、858及852)。蛋白酶切割位點標明為1號、2號(上游，未活化的蛋白酶切割位點)與3號(活化之PAR-2蛋白酶切割位點)。未切割及切割片段之預期大小示於上表。下半部(B)顯示於抗PAR-2抗體或負對照組存在下，以胰蛋白酶處理0及5分鐘後所觀察之片段大小。

圖5. 　丙胺酸掃描抗原決定部位圖譜定位之敘述說明抗體結合於圍繞PAR-2活化蛋白酶切割位點的序列(SEQ ID NO:852)之結果。空三角形代表位於活化PAR-2蛋白酶切割位點上游之蛋白酶切割位點。活化之PAR-2蛋白酶切割位點以閉合三角形標明。括號中之數字代表全長人類PAR-2序列(SEQ ID NO:851)中之胺基酸編號。胺基酸殘基下面圓圈中之數字代表相對於抗體結合於野生型胜肽之T，抗體結合於丙胺酸掃描突變胜肽之T百分比，如表24至26及表28所示。進行重複實驗時，T百分比平均值示於圓圈中。具白色數字之黑色圓圈表示變為丙胺酸時，減少抗體結合之T至抗體結合於野生型胜肽之T之30%或30%以下的胺基酸。此等胺基酸於本文中係界定為與抗體相互作用之殘基。

Claims

一種單離人類抗體或其抗原結合片段，其特異性地與人類PAR-2(SEQ ID NO：851)結合，其中該抗體或其抗原結合片段：(a)與人類PAR-2之Ser-37、Leu-38、Ile-39、Gly-40、Val-42及Asp-43互相作用；(b)不與人類PAR-2之Lys-41互相作用；(c)在人類PAR-2之Arg-36與Ser-37殘基接合處的活化切割位點阻斷人類PAR-2之胰蛋白酶切割；(d)在位於人類PAR-2之Arg-31與Ser-32殘基接合處的未活化切割位點並不阻斷人類PAR-2之胰蛋白酶切割；及(e)與一參考抗體競爭結合至人類PAR-2，該參考抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：700-702-704之重鏈互補決定區(HCDR1-HCDR2-HCDR3)，及具有胺基酸序列SEQ ID NO：708-710-712之輕鏈互補決定區(LCDR1-LCDR2-LCDR3)。
根據申請專利範圍第1項之單離人類抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)，其中該HCVR含有具胺基酸序列SEQ ID NO：700-702-704之重鏈CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3)，及其中該LCVR含有具胺基酸序列SEQ ID NO：708-710-712之輕鏈CDR(LCDR1-LCDR2-LCDR3)。
根據申請專利範圍第2項之單離人類抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：714之HCVR，及具有胺基酸序列SEQ ID NO：692之LCVR。
根據申請專利範圍第1項之單離人類抗體或抗原結合片段，其實質上如參照本發明任何實施例及/或圖示中所述者。
一種醫藥組成物，其含有根據申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體或抗原結合片段，及醫藥上可接受之載劑。
一種調配物，其包含：醫藥上可接受之載劑；及有效量之一種單離人類抗體或其抗原結合片段，其特異性地與人類PAR-2(SEQ ID NO：851)結合，其中該抗體或其抗原結合片段：(a)與人類PAR-2之Ser-37、Leu-38、Ile-39、Gly-40、Val-42及Asp-43互相作用；(b)不與人類PAR-2之Lys-41互相作用；(c)在人類PAR-2之Arg-36與Ser-37殘基接合處的活化切割位點阻斷人類PAR-2之胰蛋白酶切割；(d)在位於人類PAR-2之Arg-31與Ser-32殘基接合處的未活化切割位點並不阻斷人類PAR-2之胰蛋白酶切割；及(e)與一參考抗體競爭結合至人類PAR-2，該參考抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：700-702-704之重鏈 CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3)，及具有胺基酸序列SEQ ID NO：708-710-712之輕鏈CDR(LCDR1-LCDR2-LCDR3)。
根據申請專利範圍第6項之調配物，其用於治療與異位性皮膚炎、牛皮癬、灼傷疤痕、增生性疤痕、瘢瘤、腎衰竭或肝衰竭相關之搔癢症。
根據申請專利範圍第6項之調配物，其中該抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)，其中該HCVR含有具胺基酸序列SEQ ID NO：700-702-712之重鏈CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3)。
根據申請專利範圍第6項之調配物，其中該抗體或抗原結合片段包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：714之HCVR，及具有胺基酸序列SEQ ID NO：692之LCVR。
根據申請專利範圍第6項之調配物，其中當投與至少25mg/kg之劑量至hPAR2+/+小鼠蛋白酶誘發之搔癢症模式時，該抗體或抗原結合片段在搔癢行為中產生劑量-依賴性降低。
根據申請專利範圍第6項之調配物，其進一步包含選自由下列群組所組成之治療劑：IL-1抑制劑、IL-18抑制劑、IL-4抑制劑、IL-4受體抑制劑、IL-6抑制劑、IL-6受體抑制劑、神經生長因子(NGF)抑制劑、腫瘤壞死因子(TNF)抑制劑、TNF受體抑制劑、尿酸合成抑制劑與皮質類固醇。
根據申請專利範圍第6項之調配物，其實質上如參照本發明任何實施例及/或圖示中所述者。
一種根據申請專利範圍第6項之調配物於製造藥劑上之用途，該藥劑用以治療與異位性皮膚炎、牛皮癬、灼傷疤痕、增生性疤痕、瘢瘤、腎衰竭或肝衰竭相關之搔癢症。