TWI488965B - 用於杜顯氏肌肉萎縮症（ｄｍｄ）之多重外顯子跳躍組合物 - Google Patents

Description

用於杜顯氏肌肉萎縮症(DMD)之多重外顯子跳躍組合物

本發明係關於適用於促成人類肌縮蛋白基因中之外顯子略過(exon skipping)的新穎反義化合物及組合物。其亦提供使用適用於本發明方法中之反義組合物來誘導外顯子略過的方法。

交叉申請

本申請案根據35 U.S.C.§ 119(e)主張2008年10月24日申請之美國臨時專利申請案第61/108,416號之權益；其中此臨時申請案係以全文引用的方式併入本文中。

反義技術在不斷發展，其使用多種化學物質在多個不同層面(轉錄、拼接、穩定性、轉譯)影響基因表現。大部分研究集中於使用反義化合物來校正或抵償多種適應症中之異常或與疾病相關之基因。反義分子能夠特異性地抑制基因表現且因此，許多與作為基因表現之調節劑的寡核苷酸相關之研究努力集中於抑制目標基因表現或順式作用元件(cis-acting element)之功能。反義寡核苷酸通常係針對RNA，在一些病毒RNA目標之狀況下，係針對有義股(例如mRNA)或負股。為達成特異性基因下調之所需作用，寡核苷酸一般促進目標mRNA衰變，阻斷mRNA轉譯或阻斷順式作用RNA元件之功能，從而有效阻止目標蛋白質重新合成或病毒RNA複製。

然而，當目標為上調天然蛋白質產生或抵償誘導轉譯提前終止之突變(諸如無意義或框架轉移突變)時，該等技術不適用。在此等狀況下，缺陷型基因轉錄物將不會經受目標降解或空間抑制，因此反義寡核苷酸化學物質將不會促進目標mRNA衰變或阻斷轉譯。

在多種遺傳性疾病中，突變對基因最終表現之影響可在拼接過程期間經由目標外顯子略過之方法來調節。拼接過程受複雜多組件機構引導，該機構使前mRNA中之相鄰外顯子-內含子接合點緊密接近且在內含子末端進行磷酸二酯鍵裂解，並隨後在一起拼接之外顯子之間再形成內含子。此複雜且高度精確之過程由前mRNA中之序列基元介導，該等序列基元為與各種核拼接因子結合之相對短半保守RNA區段，該等核拼接因子在結合之後參與拼接反應。藉由改變方式，拼接機構讀取或識別參與前mRNA加工之基元，有可能形成差異拼接之mRNA分子。現已認識到大多數人類基因在正常基因表現期間係替代性拼接，不過所涉及之機制尚未確定。

在正常功能蛋白由於其中的突變而提前終止之狀況下，已證明經由反義技術恢復一些功能蛋白產生之方式有可能經由在拼接過程期間介入來實現，且若可特異性地使與致病突變相關之外顯子自一些基因中缺失，則有時會產生縮短的蛋白質產物，其具有與天然蛋白質相似之生物特性或具有足以改善由與外顯子相關之突變所引起之疾病的生物活性(Sierakowska,Sambade等人，1996；Wilton,Lloyd等人，1999；van Deutekom,Bremmer-Bout等人，2001；Lu,Mann等人，2003；Aartsma-Rus,Janson等人，2004)。Kole等人(美國專利第5,627,274號、第5,916,808號、第5,976,879號及第5,665,593號)揭示使用不促進目標前mRNA衰變的經修飾反義寡核苷酸類似物來對抗異常拼接之方法。Bennett等人(美國專利第6,210,892號)描述亦使用不誘導核糖核酸酶H介導之目標RNA裂解的反義寡核苷酸類似物來反義調節野生型細胞mRNA加工。

目標外顯子略過之方法可能尤其適用於長基因，其中存在多個外顯子及內含子，其中外顯子之基因組成(genetic constitution)存在冗餘或其中蛋白質能夠在不存在一或多個特定外顯子之情況下起作用。重新引導基因加工以治療與由各種基因中之突變所引起之截短有關之遺傳性疾病的努力集中於使用反義寡核苷酸，該等反義寡核苷酸：(1)完全或部分與參與拼接過程之元件重疊；或(2)與前mRNA在足夠靠近元件之位置處結合以破壞通常介導在彼元件處發生之特定拼接反應的拼接因子之結合及功能。

杜顯氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)係由蛋白質肌縮蛋白之表現缺陷所導致。編碼該蛋白質之基因含有79個外顯子，其展開大於2百萬個DNA核苷酸。任何改變外顯子之閱讀框架或引入終止密碼子或特徵在於移除掉整個框架外顯子或一或多個外顯子重複的外顯子突變具有中斷功能性肌縮蛋白產生，從而引起DMD之潛能。

已發現肌肉萎縮症之較輕度形式貝克爾肌肉萎縮症(Becker muscular dystrophy，BMD)在突變(通常一或多個外顯子缺失)沿整個肌縮蛋白轉錄物產生正確閱讀框架，從而使得mRNA轉譯為蛋白質未提前終止之情況下發生。若在加工突變型肌縮蛋白前mRNA中，上游與下游外顯子之接合維持該基因之正確閱讀框架，則結果為編碼具有短內部缺失從而保留一些活性之蛋白質的mRNA，引起貝克爾表型。

不改變肌縮蛋白之閱讀框架之外顯子缺失會引起BMD表型，而引起框架轉移之外顯子缺失將引起DMD(Monaco,Bertelson等人，1988)。一般而言，改變閱讀框架且從而中斷適當蛋白質轉譯之肌縮蛋白突變(包括點突變及外顯子缺失)會引起DMD。亦應注意一些BMD及DMD患者具有覆蓋多重外顯子之外顯子缺失。

儘管反義分子可提供治療杜顯氏肌肉萎縮症(DMD)之手段，但使用反義分子誘導外顯子略過之努力僅已獲得部分成功。使用針對參與如Errington等人所述之外顯子界定的外顯子內之側接拼接位點或基元的反義分子成功自肌縮蛋白前mRNA略過肌縮蛋白外顯子19(Errington,Mann等人，2003)。

第一個在mdx 小鼠模型中之特定且可重現外顯子略過之實例係由Wilton等人報導(Wilton,Lloyd等人，1999)。藉由使反義分子針對供體拼接位點，在處理培養細胞6小時內，在肌縮蛋白mRNA中誘導出外顯子23略過。Wilton等人亦描述用較長反義寡核苷酸靶向小鼠肌縮蛋白前mRNA之受體區。雖然針對內含子23供體拼接位點之第一反義寡核苷酸在原生培養肌母細胞中誘導外顯子略過，但發現此化合物對表現較高肌縮蛋白含量之永生化細胞培養物的有效性低得多。

儘管作出此等努力，但仍需要用於DMD治療應用之靶向多重肌縮蛋白外顯子之經改良反義寡聚物及經改良肌肉傳遞組合物及方法。

本發明之實施例大體關於能夠結合選定目標以誘導外顯子略過之反義化合物及使用其誘導外顯子略過之方法。在某些實施例中，可將兩個或兩個以上本發明之反義寡核苷酸組合於一起來誘導單一或多重外顯子略過。

在某些實施例中，可藉由使兩個或兩個以上反義寡核苷酸分子共價連接於一起來改良單一或多重外顯子之外顯子略過(參見例如Aartsma-Rus,Janson等人，2004)。

在某些實施例中，本發明之反義化合物在人類肌縮蛋白基因中誘導外顯子略過，且從而使肌細胞產生功能性肌縮蛋白。

本發明之反義寡核苷酸化合物(在本文中亦稱作寡聚物)通常：(i)包含N-嗎啉基次單位及將一個次單位之N-嗎啉基氮與相鄰次單位之5'環外碳聯接的含磷次單位間鍵聯，(ii)含有介於10-40個之間的核苷酸鹼基，較佳20-35個鹼基，(iii)包含有效與肌縮蛋白前mRNA中目標序列之至少12個連續鹼基雜交且誘導外顯子略過之鹼基序列。

在某些實施例中，根據下列結構(I)，本發明之反義化合物可包含將一個次單位之N-嗎啉基氮與相鄰次單位之5'環外碳聯接的含磷次單位間鍵聯：

其中：Y₁ 為-O-、-S-、-NH-或-CH₂ -；Z為O或S；Pj為藉由鹼基特異性氫鍵結與聚核苷酸中之鹼基有效結合之嘌呤或嘧啶鹼基配對部分；且X為氟、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烷氧基、視情況經取代之硫代烷氧基、胺基、視情況經取代之烷基胺基或視情況經取代之雜環基。

在某些實施例中，不帶電之上述次單位間鍵聯可與在生理pH值下帶正電之鍵聯相交替，其中帶正電鍵聯之總數介於2與至多鍵聯總數一半之間。舉例而言，帶正電鍵聯可具有X為視情況經取代之1-哌嗪基的上述結構。在其他實施例中，帶正電鍵聯可具有X為經取代之1-哌嗪基的上述結構，其中該1-哌嗪基在4位經視情況經取代之烷基胍基部分所取代。

當所投與之反義化合物有效靶向經預加工之人類肌縮蛋白之拼接位點時，其可具有與含有經預加工信使RNA(mRNA)人類肌縮蛋白轉錄物中之至少12個連續鹼基的目標區域互補之鹼基序列。例示性反義序列包括標識為SEQ ID NO:1至569及612至633之反義序列。

在某些實施例中，本發明之反義序列係包含於以下序列內：

(a)標識為SEQ ID NO:1-20，較佳SEQ ID NO:4、8、11及12且更佳SEQ ID NO:12，用於在加工人類肌縮蛋白經預加工mRNA時引起外顯子44略過之序列中之任一者；

(b)標識為SEQ ID NO:21-76及612至624，較佳SEQ ID NO:27、29、34及39且更佳SEQ ID NO:34，用於在加工人類肌縮蛋白經預加工mRNA時引起外顯子45略過之序列中之任一者；

(c)標識為SEQ ID NO:77-125，較佳SEQ ID NO:21至53，且更佳SEQ ID NO:82、84-87、90、96、98、99及101，用於在加工人類肌縮蛋白經預加工mRNA時引起外顯子46略過之序列中之任一者；

(d)標識為SEQ ID NO:126-169，較佳SEQ ID NO:126-149，且更佳SEQ ID NO:126、128-130、132、144及146-149，用於在加工人類肌縮蛋白經預加工mRNA時引起外顯子47略過之序列中之任一者；

(e)標識為SEQ ID NO:170-224及634，較佳SEQ ID NO:170-201及634，且更佳SEQ ID NO:176、178、181-183、194及198-201，用於在加工人類肌縮蛋白經預加工mRNA時引起外顯子48略過之序列中之任一者；

(f)標識為SEQ ID NO:225-266，較佳SEQ ID NO:225-248，且更佳SEQ ID NO:227、229、234、236、237及244-248，用於在加工人類肌縮蛋白經預加工mRNA時引起外顯子49略過之序列中之任一者；

(g)標識為SEQ ID NO:267-308，較佳SEQ ID NO:277、287及290且更佳SEQ ID NO:287，用於在加工人類肌縮蛋白經預加工之mRNA時引起外顯子50略過之序列中之任一者；

(h)標識為SEQ ID NO:309-371，較佳SEQ ID NO:324、326及327且更佳SEQ ID NO:327，用於在加工人類肌縮蛋白經預加工之mRNA時引起外顯子51略過之序列中之任一者；

(i)標識為SEQ ID NO:372-415，較佳SEQ ID NO:372-397，且更佳SEQ ID NO:379-382、384、390及392-395，用於在加工人類肌縮蛋白經預加工之mRNA時引起外顯子52略過之序列中之任一者；

(j)標識為SEQ ID NO:416-475及625-633，較佳SEQ ID NO:428、429及431且更佳SEQ ID NO:429，用於在加工人類肌縮蛋白經預加工之mRNA時引起外顯子53略過之序列中之任一者；

(k)標識為SEQ ID NO:476-519，較佳SEQ ID NO:476-499，且更佳SEQ ID NO:479-482、484、489及491-493，用於在加工人類肌縮蛋白經預加工之mRNA時引起外顯子54略過之序列中之任一者；及

(1)標識為SEQ ID NO:520-569及635，較佳SEQ ID NO:520-546及635且更佳SEQ ID NO:524-528、537、539、540、542及544，用於在加工人類肌縮蛋白經預加工之mRNA時引起外顯子55略過之序列中之任一者。

在某些實施例中，該化合物可與有效促進細胞對該化合物之攝取的富含精胺酸之多肽結合。例示性肽包括本文所述之肽中標識為SEQ ID NO:570至578之肽。

在一例示性實施例中，富含精胺酸之多肽在其N-末端或C-末端殘基處與反義化合物之3'或5'末端共價偶合。亦在一例示性實施例中，反義化合物由N-嗎啉基次單位及將一個次單位之N-嗎啉基氮與相鄰次單位之5'環外碳聯接的含磷次單位間鍵聯構成。

一般而言，肽-寡聚物結合物可進一步包含對選定哺乳動物組織具有選擇性之導向肽(homing peptide)，亦即相同組織由細胞穿透肽所靶向。結合物可具有以下形式：細胞穿透肽-導向肽-反義寡聚物，或更佳具有以下形式：導向肽-細胞穿透肽-反義寡聚物。舉例而言，如上文所述用於治療杜顯氏肌肉萎縮症之肽結合化合物可進一步包含對肌肉組織具有選擇性之導向肽，諸如具有標識為SEQ ID NO:579之序列的肽，其與細胞穿透肽結合。此類型之例示性結合物包括在本文中表示為CP06062-MSP-PMO(細胞穿透肽-導向肽-反義寡聚物)及MSP-CP06062-PMO(導向肽-細胞穿透肽-反義寡聚物)(參見SEQ ID NO:580-583)之結合物。

在一些實施例中，肽經由連接子部分與寡聚物結合。在某些實施例中，該連接子部分可包含視情況經取代之哌嗪基部分。在其他實施例中，連接子部分可進一步包含β丙胺酸及/或6-胺基己酸次單位。在其他實施例中，肽直接與寡聚物結合而不存在連接子部分。

肽可與寡聚物在任何適於在肽與寡聚物之間或在連接子部分與寡聚物之間形成共價鍵的位置處結合。舉例而言，在一些實施例中，肽可在寡聚物之3'末端結合。在其他實施例中，肽可與寡聚物在寡聚物之5'末端結合。在其他實施例中，肽可經由任何次單位間鍵聯與寡聚物結合。

在一些實施例中，肽與寡聚物在寡聚物之5'末端結合。在包含含磷次單位間鍵聯之實施例中，肽可經由與末端鍵聯基團之磷的共價鍵與寡聚物結合。以此方式結合可需要或不需要上文所述之連接子部分。

在其他實施例中，肽可與寡聚物在寡聚物之3'末端結合。在另外一些實施例中，肽可與寡聚物之3'未端N-嗎啉基之氮原子結合。在此態樣中，肽可直接或經由上文所述之連接子部分與寡聚物結合。

在一些實施例中，寡聚物可與增強寡聚物在水性介質中之溶解性的部分結合。在一些實施例中，增強寡聚物在水性介質中之溶解性的部分為聚乙二醇。在其他實施例中，增強寡聚物在水性介質中之溶解性的部分為三乙二醇。舉例而言，在一些實施例中，增強於水性介質中之溶解性的部分可與寡聚物在寡聚物之5'末端結合。增強寡聚物在水性介質中之溶解性的部分可直接或經由上文所述之連接子部分與寡聚物結合。

本發明之某些實施例提供選用於及/或適於協助預防性或治療性處理遺傳性病症之反義分子，其包含至少一種呈適於向患者傳遞之形式的反義分子。

本發明之某些實施例提供治療罹患遺傳性疾病之患者的方法，在該遺傳性疾病中編碼特定蛋白質之基因中存在突變且可藉由外顯子略過來消除突變之影響，其包含以下步驟：(a)根據本文所述之方法選擇反義分子；及(b)向需要該治療之患者投與該分子。本發明亦包括本發明經純化及分離之反義寡核苷酸的用途，其係用於製造治療遺傳性疾病之藥劑。

某些實施例提供治療肌肉萎縮症(諸如特徵在於杜顯氏肌肉萎縮症之病狀)之方法，該方法包含向需要治療之患者投與有效量的如本文所述經適當設計與彼患者體內之特定遺傳性病變有關之反義寡核苷酸。此外，某些實施例提供預防性治療患者以預防肌肉萎縮症(包括杜顯氏肌肉萎縮症)或至少使肌肉萎縮症(包括杜顯氏肌肉萎縮症)降至最輕的方法，其包含以下步驟：向患者投與有效量之反義寡核苷酸或包含一或多種此等生物分子之醫藥組合物。

某些實施例係關於治療個體之肌肉萎縮症之方法，其包含向該個體投與有效量之含有20-35個由含磷次單位間鍵聯連接之N-嗎啉基次單位的實質上不帶電反義化合物，該等含磷次單位間鍵聯將一個次單位之N-嗎啉基氮與相鄰次單位之5'環外碳聯接，該反義化合物包含選自由SEQ ID NO:1至569及612至635組成之群，且能夠與肌縮蛋白基因外顯子中之互補mRNA序列形成該化合物與mRNA之間的Tm為至少45℃之異雙螺旋(heteroduplex)結構的序列，其中該外顯子係選自由外顯子44-55組成之群。

在某些實施例中，肌肉萎縮症為杜顯氏肌肉萎縮症(DMD)。在某些實施例中，肌肉萎縮症為貝克爾肌肉萎縮症(BMD)。

在某些實施例中，該序列係選自由SEQ ID NO:1-20組成之群，且該外顯子為外顯子44。在某些實施例中，該序列係選自由SEQ ID NO:21-76及612至624組成之群，且該外顯子為外顯子45。

在某些實施例中，該序列係選自由SEQ ID NO:77-125組成之群，且該外顯子為外顯子46。在某些實施例中，該序列係選自由SEQ ID NO:126-169組成之群，且該外顯子為外顯子47。

在某些實施例中，該序列係選自由SEQ ID NO:170-224及634組成之群，且該外顯子為外顯子48。在某些實施例中，該序列係選自由SEQ ID NO:225-266組成之群，且該外顯子為外顯子49。

在某些實施例中，該序列係選自由SEQ ID NO:267-308組成之群，且該外顯子為外顯子50。在某些實施例中，該序列係選自由SEQ ID NO:309-371組成之群，且該外顯子為外顯子51。

在某些實施例中，該序列係選自由SEQ ID NO:372-415組成之群，且該外顯子為外顯子52。在某些實施例中，該序列係選自由SEQ ID NO:416-475及625-633組成之群且該外顯子為外顯子53。在某些實施例中，該序列係選自由SEQ ID NO:476-519組成之群，且該外顯子為外顯子54。在某些實施例中，該序列係選自由SEQ ID NO:520-569及635組成之群，且該外顯子為外顯子55。在某些實施例中，該序列包含SEQ ID NO:287或基本上由SEQ ID NO:287組成。

某些實施例提供治療遺傳性疾病之套組，該等套組包含包裝於適合容器中之至少一種本發明反義寡核苷酸，及其使用說明書。

當結合圖式閱讀本發明之以下實施方式時，將更充分理解此等及其他目的及特徵。

本發明之實施例大體關於經改良之反義化合物及其使用方法，其經特定設計以在肌縮蛋白基因中誘導外顯子略過。肌縮蛋白在肌肉功能中發揮重要作用，且各種肌肉相關疾病特徵在於此基因之突變形式。因此，在某些實施例中，本文所述之經改良反義化合物在人類肌縮蛋白基因之突變形式中誘導外顯子略過，該等突變形式諸如在杜顯氏肌肉萎縮症(DMD)及貝克爾肌肉萎縮症(BMD)中所發現之突變型肌縮蛋白基因。

歸因於由突變引起之異常mRNA拼接事件，此等突變型人類肌縮蛋白基因表現缺陷型肌縮蛋白或根本不表現可量測之肌縮蛋白，此病狀導致各種形式之肌肉萎縮症。為治療此病狀，本發明之反義化合物通常與突變型人類肌縮蛋白基因之經預加工RNA之選定區域雜交，在彼以其他方式異常拼接之肌縮蛋白mRNA中誘導外顯子略過及差異拼接，且從而使肌細胞產生編碼功能性肌縮蛋白之mRNA轉錄物。在某些實施例中，所產生之肌縮蛋白不必為「野生型」肌縮蛋白形式，而為截短型但具功能性或半功能性之肌縮蛋白形式。

藉由增加肌細胞中功能性肌縮蛋白之含量，此等及相關實施例可適用於預防及治療肌肉萎縮症，尤其彼等特徵在於歸因於異常mRNA拼接而表現缺陷型肌縮蛋白之肌肉萎縮症形式(諸如DMD及BMD)。本文所述之特定寡聚物進一步提供優於其他正使用之寡聚物的改良之肌縮蛋白-外顯子特異性靶向，且從而提供優於治療相關肌肉萎縮症形式之替代方法的顯著且實際的優勢。

除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所瞭解相同之含義。儘管在本發明之實施或測試中，可使用與本文所述相似或等效的任何方法及材料，但描述較佳方法及材料。出於本發明之目的，下文定義以下術語。

定義

本文所用之冠詞「一(a及an)」係指一個或一個以上(亦即至少一個)該冠詞之語法上之賓語。舉例而言，「一要素」意謂一個要素或不只一個要素。

「約」意謂與參考數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度相差多達30%、25%、20%、25%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。

「編碼序列」意謂任何有助於編碼基因之多肽產物的核酸序列。相反，術語「非編碼序列」係指任何無助於編碼基因之多肽產物的核酸序列。

在本說明書整篇中，除非上下文另外要求，否則「包含」一詞將理解為表示包括規定步驟或要素或步驟或要素組，而不排除任何其他步驟或要素或步驟或要素組。

「由...組成」意謂包括且限於跟隨於「由...組成」一詞後之任何事物。因此「由...組成」一詞指示所列要素為必需或強制性的，且不存在其他要素。「基本上由...組成」意謂包括該詞後所列之任何要素，且限於其他不干擾或有助於所列要素在本發明中說明之活性或作用的要素。因此，「基本上由...組成」一詞指示所列要素為必需或強制性的，但其他要素為視情況存在的或可視其是否實質上影響所列要素之活性或作用而存在或不存在。

術語「互補」及「互補性」係指按照鹼基配對規則相關之聚核苷酸(亦即核苷酸序列)。舉例而言，序列「A-G-T」與序列「T-C-A」互補。互補可為「部分的」，其中僅一些核酸鹼基根據鹼基配對規則匹配。或者，核酸之間可存在「完全」或「全」互補。核酸股之間的互補程度對核酸股之間的雜交效率及強度具有顯著影響。雖然通常需要理想互補，但一些實施例可相對於目標RNA包括一或多個，但較佳6、5、4、3、2或1個錯配。包括寡聚物中任何位置上之變異。在某些實施例中，接近寡聚物末端之序列中之變異一般優於內部之變異，且若存在，則通常在5'及/或3'末端之約6、5、4、3、2或1個核苷酸以內。

術語「細胞穿透肽」或「CPP」可互換使用，且係指陽離子型細胞穿透肽，亦稱作轉運肽、載體肽或肽轉導域。如本文所示之肽具有在指定細胞培養物群體之30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%(包括其間所有整數)細胞中誘導細胞穿透的能力，且在全身性投藥後在活體內允許大分子在多種組織內轉移。

術語「反義寡聚物」或「反義化合物」可互換使用且係指環狀次單位之序列，該等環狀次單位各帶有由次單位間鍵聯所連接之鹼基配對部分，該等次單位間鍵聯使鹼基配對部分藉由華特生-克里克(Watson-Crick)鹼基配對與核酸(通常為RNA)中之目標序列雜交以在目標序列中形成核酸：寡聚物異雙螺旋體。環狀次單位係以核糖或另一戊糖，或在一較佳實施例中以N-嗎啉基(參見下文對N-嗎啉基寡聚物之描述)為基礎。

該種反義寡聚物可經設計以阻斷或抑制mRNA轉譯或抑制天然前mRNA拼接加工，且可稱為「針對」或「靶向」其所雜交之目標序列。在某些實施例中，目標序列包括包含mRNA之AUG起始密碼子、經預加工mRNA之3'或5'拼接位點或分支點的區域。目標序列可處於外顯子或內含子中。拼接位點之目標序列可包括具有經預加工mRNA中正常拼接受體接合點下游之5'末端1至約25個鹼基對的mRNA序列。拼接之較佳目標序列為經預加工mRNA中包括拼接位點或完全包含於外顯子編碼序列內或涵蓋拼接受體或供體位點之任何區域。當寡聚物以上文所述之方式靶向目標之核酸時，更通常稱該寡聚物「靶向」生物學上相關之目標，諸如蛋白質、病毒或細菌。包括包含SEQ ID NO:1至569及612至635中之一或多者，基本上由或由SEQ ID NO:1至569及612至635中之一或多者組成的反義寡聚物。亦包括此等反義寡聚物之變異體，包括與SEQ ID NO:1至569及612至635中之任一者具有80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%(包括其間所有整數)序列一致性或序列同源性之變異型寡聚物，及/或與此等序列有約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸不同之變異體，較佳誘導一或多個選定人類肌縮蛋白外顯子之外顯子略過的彼等變異體。亦包括SEQ ID NO:584-611及634-635中任一或多者之寡聚物，其包含適合數目之如本文所述之帶電鍵聯(例如每2-5個不帶電鍵聯至多約1個，諸如每10個不帶電鍵聯約4-5個)，及/或其包含亦如本文所述與其相連之富含Arg之肽。

術語「N-嗎啉基寡聚物」或「PMO(磷醯胺酸或磷醯二胺酸N-嗎啉基寡聚物)」係指由N-嗎啉基次單位結構構成之寡核苷酸類似物，其中(i)該等結構係由含磷鍵聯連接於一起，該等含磷鍵聯長1至3個原子，較佳長2個原子，且較佳不帶電或呈陽離子型，其將一個次單位之N-嗎啉基氮與相鄰次單位之5'環外碳聯接，且(ii)各N-嗎啉基環帶有有效藉由鹼基特異性氫鍵結與聚核苷酸中之鹼基結合之嘌呤或嘧啶鹼基配對部分。參見例如圖1A中之結構，其展示較佳磷醯二胺酸鍵聯類型。可對此鍵聯進行改變，只要其不干擾結合或活性即可。舉例而言，與磷連接之氧可用硫取代(硫代磷醯二胺酸)。5'氧可用胺基或經低碳烷基取代之胺基取代。與磷連接之側位氮可未經取代、經(視情況經取代之)低碳烷基單取代或二取代。亦參見下文對陽離子型鍵聯之論述。N-嗎啉基寡聚物之合成、結構及結合特徵詳述於美國專利第5,698,685號、第5,217,866號、第5,142,047號、第5,034,506號、第5,166,315號、第5,521,063號或第5,506,337號及PCT申請案第PCT/US07/11435號(陽離子型鍵聯)中，該等文獻全部係以引用的方式併入本文中。

嘌呤或嘧啶鹼基配對部分通常為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或肌苷。亦包括以下鹼基，諸如吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、胺基苯基、5-烷基胞苷(例如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如核糖胸苷)、5-鹵尿苷(例如5-溴尿苷)或6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷(quesosine)、2-硫尿苷、4-硫尿苷、懷丁苷(wybutosine)、wybutoxosine、4-乙醯基胞苷、5-(羧基羥基甲基)尿苷、5'-羧甲基胺基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基胺基甲基尿苷、β-D-半乳糖基Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿苷、5-甲基胺基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基Q核苷、尿苷-5-氧基乙酸、2-硫胞苷、蘇胺酸衍生物及其他鹼基(Burgin等人，1996,Biochemistry,35,14090；Uhlman及Peyman，同上)。在此態樣中「經修飾鹼基」意謂如上文所說明之除腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)以外之核苷酸鹼基；該等鹼基可用於反義分子中之任何位置。熟習此項技術者應瞭解視寡聚物之用途而定，T與U可互換。舉例而言，在其他更類似RNA之反義化學物質(諸如2'-O-甲基反義寡核苷酸)之狀況下，T鹼基可展示為U(參見例如序列ID列表)。

「胺基酸次單位」或「胺基酸殘基」可指α-胺基酸殘基(例如-CO-CHR-NH-)或β-胺基酸殘基或其他胺基酸殘基(例如-CO-(CH₂ )_n CHR-NH-)，其中R為側鏈(其可包括氫)且n為1至6，較佳1至4。

術語「天然存在之胺基酸」係指在自然界中發現之蛋白質中存在的胺基酸，諸如在蛋白質生物合成期間利用之20種(L)-胺基酸以及其他胺基酸，諸如4-羥基脯胺酸、羥基離胺酸、鎖鏈賴胺素(desmosine)、異鎖鏈賴胺素、高半胱胺酸、瓜胺酸及鳥胺酸。術語「非天然胺基酸」係指不存在於自然界中發現之蛋白質中的胺基酸，實例包括β-丙胺酸(β-Ala或B)、6-胺基己酸(Ahx)及6-胺基戊酸。「非天然胺基酸」之其他實例包括(但不限於)(D)-胺基酸、正白胺酸、正纈胺酸、對氟苯丙胺酸、乙硫胺基酪酸及其類似物，其為熟習此項技術者所知。

「有效量」或「治療有效量」係指治療化合物(諸如反義寡聚物)以單一劑量或以一系列劑量之一部分投與哺乳動物個體之量，其在個體內有效產生所需生理反應或治療作用。所需生理反應之一個實例包括與無反義寡聚物或對照寡聚物相比，主要增加含有缺陷型肌縮蛋白或不含肌縮蛋白之肌肉組織或細胞中之肌縮蛋白的相對功能性或生物活性形式的表現。所需治療作用之實例包括(但不限於)改善肌肉萎縮症之症狀或病變、減少肌肉萎縮症之症狀或病變之進行及減緩肌肉萎縮症之症狀或病變發作。該等症狀之實例包括疲勞、智力遲鈍、肌肉無力、運動技能困難(例如跑、單腳跳、跳躍)、時常跌倒及步行困難。肌肉萎縮症病變之特徵在於例如肌肉纖維損傷及膜滲漏。對於反義寡聚物，此作用通常藉由改變選定目標序列(例如肌縮蛋白)之剪接加工，諸如誘導外顯子略過來達成。

「外顯子」係指編碼蛋白質之限定核酸部分，或在剪接移除經預加工(或前驅)RNA之任一部分後以RNA分子之成熟形式呈現之核酸序列。成熟RNA分子可為信使RNA(mRNA)或非編碼RNA之功能形式(諸如rRNA或tRNA)。人類肌縮蛋白基因具有約75個外顯子。

「內含子」係指不轉譯為蛋白質之核酸區域(於基因內)。內含子為非編碼部分，其轉錄為前驅mRNA(前mRNA)，隨後在成熟RNA形成期間藉由剪接移除。

「外顯子略過」一般係指自指定經預加工RNA移除整個外顯子或其部分，且從而經排除而不存在於成熟RNA(諸如轉譯為蛋白質之成熟mRNA)中的過程。因此，在所表現之蛋白質形式中不存在另外由所略過外顯子編碼的蛋白質部分，通常形成經改變但仍具功能性之蛋白質形式。在某些實施例中，所略過之外顯子為人類肌縮蛋白基因之異常外顯子，其在其另外引起異常拼接之序列中可能含有突變或其他變化。在某些實施例中，所略過之外顯子為肌縮蛋白基因之外顯子1-75中之任一或多者，然而人類肌縮蛋白基因之外顯子44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54及/或55中之任一或多者較佳。

「肌縮蛋白」為桿狀細胞質蛋白，且為經由細胞膜連接肌纖維之細胞骨架與周圍細胞外基質之蛋白質複合物的重要部分。肌縮蛋白含有多個功能域。舉例而言，肌縮蛋白含有大致位於胺基酸14-240之肌動蛋白結合域及大致位於胺基酸253-3040之中心桿結構域。此大型中心結構域係由具有約109個胺基酸之24個收縮蛋白(spectrin)樣參重螺旋元件形成，該等元件與α輔肌動蛋白及收縮蛋白具有同源性。重複序列通常間雜有4個富含脯胺酸之非重複區段(亦稱作絞鏈區)。重複序列15與16間隔有似乎提供用於蛋白水解裂解肌縮蛋白之主要位點的18胺基酸段。大部分重複序列之間的序列一致性在10%-25%之範圍內。一個重複序列含有3個α-螺旋：1、2及3。α-螺旋1及3各自由7個螺旋轉角形成，該等螺旋轉角可能經由疏水性介面相互作用形成捲曲螺旋。α-螺旋2具有較複雜之結構且由以甘胺酸或脯胺酸殘基間隔之具有4個及3個螺旋轉角之區段形成。各重複序列係由2個外顯子編碼，該等外顯子通常在α-螺旋2之第一部分中之胺基酸47與48之間間雜有內含子。在重複序列之不同位置發現其他內含子，其通常散布於螺旋-3上。肌縮蛋白亦大致在胺基酸3080-3360含有富含半胱胺酸之結構域(包括富含半胱胺酸之區段)(亦即280個胺基酸中15個為半胱胺酸)，其展示與黏液黴菌(盤基網柄菌(Dictyostelium discoideum ))α-輔肌動蛋白之C-端結構域具有同源性。羧基端結構域大致位於胺基酸3361-3685。

肌縮蛋白之胺基末端與F-肌動蛋白結合且羧基末端與位於肌膜之肌縮蛋白相關性蛋白質複合物(DAPC)結合。DAPC包括肌營養不良蛋白聚糖(dystroglycan)、肌聚糖(sarcoglycan)、整合素(integrin)及微囊蛋白(caveolin)，且此等組份中任一者之突變均會導致體染色體遺傳性肌營養不良。當缺乏肌縮蛋白時，會使DAPC不穩定，引起成員蛋白含量降低且轉而導致進行性纖維損傷及膜滲漏。在各種形式之肌肉萎縮症，諸如杜顯氏肌肉萎縮症(DMD)及貝克爾肌肉萎縮症(BMD)中，主要歸因於基因序列中導致不正確拼接之突變，致使肌細胞產生改變及功能缺陷型肌縮蛋白形式或根本不產生肌縮蛋白。如上文所述，主要表現缺陷型肌縮蛋白，或完全缺乏肌縮蛋白或肌縮蛋白樣蛋白質會導致快速之肌肉退化進展。在此方面，「缺陷型」肌縮蛋白特徵在於如此項技術中所知某些罹患DMD或BMD之個體產生之肌縮蛋白形式或特徵在於不存在可偵測肌縮蛋白。

表A提供各種肌縮蛋白結構域、涵蓋此等結構域之胺基酸殘基及編碼其之外顯子的說明。

如本文中所用，術語「功能」及「功能性」及其類似者係指生物、酶或治療功能。

「功能性」肌縮蛋白一般係指通常與某些罹患DMD或BMD之個體體內存在之改變或「缺陷型」肌縮蛋白形式相比，具有足以降低另外肌肉萎縮症特有之肌肉組織進行性降解之生物活性的肌縮蛋白。在某些實施例中，如根據此項技術中之常規技術所量測，功能性肌縮蛋白可具有野生型肌縮蛋白活體外或活體內生物活性之約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%(包括其間所有整數)。作為一實例，可根據肌管尺寸、肌原纖維組織(或結構紊亂)、收縮活性及乙醯膽鹼受體之自發聚集來量測活體外肌肉培養物中之肌縮蛋白相關活性(參見例如Brown等人，Journal of Cell Science. 112:209-216,1999)。動物模型亦為研究疾病發病機制之有價值資源且提供測試肌縮蛋白相關活性之手段。2種最廣泛使用之DMD研究動物模型為mdx 小鼠及金毛獵犬肌肉萎縮症(GRMD)犬，其兩者皆呈肌縮蛋白陰性(參見例如Collins及Morgan,Int J Exp Pathol 84:165-172,2003)。可使用此等及其他動物模型來量測各種肌縮蛋白之功能活性。包括截短型肌縮蛋白形式，諸如由本發明之某些外顯子略過反義化合物產生之彼等形式。

「基因」意謂佔據染色體上之特定基因座且由轉錄及/或轉譯調控序列及/或編碼區及/或非轉譯序列(亦即內含子、5'及3'非轉譯序列)組成之遺傳單位。

「經分離」意謂材料實質上或基本上不含在其天然狀態下通常伴隨其存在之組份。舉例而言，如本文所用之「經分離聚核苷酸」可指經純化或移除在天然存在之狀態下側接其之序列的聚核苷酸，例如已移除通常與DNA片段鄰接之序列的DNA片段。

「增強」或「增加」或「刺激」一般係指相較於在無反義化合物之情況下或由對照化合物引起之反應，一或多種反義化合物或組合物在細胞或個體中產生或引起較大生理反應(亦即下游效應)的能力。可量測生理反應可包括功能性肌縮蛋白形式表現增加或肌肉組織中之肌縮蛋白相關生物活性增加以及其他由對此項技術之瞭解及本文中之描述而明顯的反應。亦可量測增加之肌肉功能，包括肌肉功能增加或改善約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。亦可量測表現功能性肌縮蛋白之肌肉纖維的百分比，包括約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之肌肉纖維的肌縮蛋白表現增加。舉例而言，已展示若25%-30%之纖維表現肌縮蛋白，則會出現約40%肌肉功能改善(參見例如DelloRusso等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:12979-12984,2002)。「增加」或「增強」量通常為「統計顯著」量，且可包括1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多倍(例如500、1000倍)(包括其間且大於1之所有整數及小數點，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)於在無反義化合物(不存在藥劑)情況下或由對照化合物產生之量的增加。

術語「降低」或「抑制」一般可指如根據診斷技術中之常規技術所量測，一或多種本發明反義化合物「減弱」相關生理或細胞反應(諸如本文所述之疾病或病狀之症狀)之能力。相關生理或細胞反應(活體內或活體外)對於熟習此項技術者應顯而易見，且可包括肌肉萎縮症之症狀或病變減輕，或缺陷型肌縮蛋白形式(諸如罹患DMD或BMD之個體體內表現之已改變肌縮蛋白形式)表現減少。與在無反義化合物之情況下或由對照組合物產生之反應相比，反應之「減弱」可在統計上顯著，且可包括減弱1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括其間所有整數)。

「同源性」係指相同或構成保守取代之胺基酸的百分比數。同源性可使用序列比較程式(諸如GAP)來測定(Deveraux等人，1984,Nucleic Acids Research 12,387-395)。以此方式，可藉由將間隙插入比對來比較具有與本文中引用之彼等序列相似或實質上不同長度之序列，該等間隙例如由GAP所用之比較算法來確定。

如本文所用之陳述語「序列一致性」(或例如包含「序列與......50%一致」)係指在比較窗上序列以核苷酸對核苷酸或胺基酸對胺基酸為基礎相同的程度。因此，「序列一致性百分比」可藉由在比較窗上比較2個經最佳對準之序列，測定兩個序列中存在相同核酸鹼基(例如A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及Met)的位置數目以得到匹配位置之數目，用匹配位置數目除以比較窗中之位置總數(亦即窗尺寸)且將結果乘以100，得到序列一致性之百分比來計算。

用於描述兩個或兩個以上聚核苷酸或多肽之間的序列關係之術語包括「參照序列」、「比較窗」、「序列一致性」、「序列一致性百分比」及「實質一致性」。「參照序列」之長度為至少8個或10個，但常為15個至18個且經常為至少25個單體單元(包括核苷酸及胺基酸殘基)。由於2個聚核苷酸可能各自包含(1)在2個聚核苷酸之間相似之序列(亦即，僅完全聚核苷酸序列之一部分)及(2)在2個聚核苷酸之間相異之序列，所以2個(或2個以上)聚核苷酸之間的序列比較通常藉由在「比較窗」上比較2個聚核苷酸之序列以鑑別並比較具有序列相似性之局部區域來進行。「比較窗」係指具有至少6個連續位置(通常約50個至約100個，更通常約100個至約150個)之概念區段，其中在最佳對準序列與具有相同數目之連續位置的參照序列後，比較該2個序列。對於最佳對準2個序列，比較窗可包含與參照序列(其不包含添加或缺失)相比約20%或20%以下之添加或缺失(亦即間隙)。用於對準比較窗之最佳序列對準可藉由電腦化執行算法(威斯康星遺傳學軟體包版本7.0(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group,575 Science Drive Madison,WI,USA)中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)或藉由檢驗及由所選各種方法中之任一者所產生之最佳對準(亦即在比較窗上得到最高同源性百分比)來進行。亦可參考如例如由Altschul等人，1997,Nucl. Acids Res . 25:3389揭示之BLAST程式家族。序列分析之詳細論述可見於Ausubel等人，「Current Protocols in Molecular Biology,」John Wiley ＆ Sons Inc,1994-1998,第15章之第19.3單元。

「治療」個體(例如哺乳動物，諸如人類)或細胞可包括用於試圖改變個體或細胞之天然進程的任何類型之介入。治療包括(但不限於)投與醫藥組合物且可以預防形式或在病理事件開始或與病原體接觸後進行。治療包括對與肌縮蛋白相關之疾病或病狀之症狀或病變(如在某些形式之肌肉萎縮症中)的任何所需作用，且可包括例如所治療疾病或病狀之一或多個可量測標誌之最小改變或改善。亦包括「預防性」治療，其可關於降低所治療疾病或病狀之進展速率，延遲彼疾病或病狀之發作或降低其發作之嚴重度。「治療」或「預防」不一定表明完全根除、治癒或預防疾病或病狀或其相關症狀。

因此，包括藉由向有需要之個體投與視情況作為醫藥調配物或劑型之一部分的一或多種本發明反義寡聚物(例如SEQ ID NO:1至569及612至635及其變異體)治療肌肉萎縮症(諸如DMD及BMD)之方法。亦包括藉由投與一或多種反義寡聚物來在個體中誘導外顯子略過之方法，其中該外顯子為肌縮蛋白基因、較佳人類肌縮蛋白基因之外顯子44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54及/或55之一。如本文所用之「個體」包括展現症狀或具有展現症狀之風險的任何動物，該症狀可用本發明之反義化合物來治療，諸如患有DMD或BMD或與此等病狀相關症狀中之任一者(例如肌肉纖維損失)或具有患上DMD或BMD或與此等病狀相關症狀中之任一者之風險的個體。適合個體(患者)包括實驗室動物(諸如小鼠、大鼠、家兔或天竺鼠)、農畜及家畜或寵物(諸如貓或犬)。包括非人類靈長類動物，且較佳為人類患者。

亦包括能夠表現本發明之寡聚肌縮蛋白靶向序列的載體傳遞系統，諸如表現如本文中所述，包含SEQ ID NO:1至569及612至635中任一或多者或其變異體之聚核苷酸序列的載體。「載體」或「核酸構築體」意謂來源於例如其中可插入或選殖聚核苷酸之質體、噬菌體、酵母或病毒的聚核苷酸分子，較佳DNA分子。載體較佳含有一或多個獨特限制性位點且能夠在包括目標細胞或組織或其祖細胞或組織之規定宿主細胞中自主複製或能夠與規定宿主之基因組整合以使所選殖之序列可複製。因此，載體可為自主複製載體，亦即以染色體外實體形式存在之載體，其複製與染色體複製無關，例如線性或閉環狀質體、染色體外元件、極微染色體或人工染色體。載體可含有任何確保自體複製之構件。或者，載體可為在引入宿主細胞中時整合至基因組中且連同所整合之染色體一起複製之載體。

載體或核酸構築體系統可包含單一載體或質體共同含有待引入至宿主細胞基因組中之總DNA之兩種或兩種以上載體或質體或轉座子。通常應視載體與載體所引入之宿主細胞的相容性來選擇載體。在本發明狀況下，載體或核酸構築體較佳為在哺乳動物細胞(諸如肌細胞)中具有可操作功能性之載體或核酸構築體。載體亦可包括可用於選擇或鑑別適合轉型體或轉染體之選擇標誌，諸如抗生素或藥物抗性基因，或報導基因(亦即綠色螢光蛋白、螢光素酶)。例示性傳遞系統可包括病毒載體系統(亦即病毒介導之轉導)，包括(但不限於)反轉錄病毒(例如豆狀病毒)載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體及疱疹病毒載體及其他此項技術中已知之病毒載體。

如本文所用之術語「可操作連接」意謂使寡聚物編碼序列處於啟動子之調控控制下，該啟動子接著控制寡聚物之轉錄。

野生型基因或基因產物為在族群中最常觀察到之基因或基因產物且因此任意稱為該基因之「正常」或「野生型」形式。

「烷基」或「伸烷基」係指含有1至18個碳之飽和直鏈或分支鏈烴基。實例包括(但不限於)甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第三丁基、正戊基及正己基。術語「低碳烷基」係指含有1與8個之間的碳之如本文定義之烷基。

「烯基」係指含有2至18個碳且包含至少一個碳碳雙鍵之不飽和直鏈或分支鏈烴基。實例包括(但不限於)乙烯基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基、異丁烯基、第三丁烯基、正戊烯基及正己烯基。術語「低碳烯基」係指含有2與8個之間的碳之如本文定義之烯基。

「炔基」係指含有2至18個碳且包含至少一個碳碳參鍵之不飽和直鏈或分支鏈烴基。實例包括(但不限於)乙炔基、丙炔基、異丙炔基、丁炔基、異丁炔基、第三丁炔基、戊炔基及己炔基。術語「低碳炔基」係指含有2與8個之間的碳之如本文定義之炔基。

「環烷基」係指單環或多環烷基。實例包括(但不限於)環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基。

「芳基」係指含有5至18個碳且具有一或多個閉合環之環狀芳族烴部分。實例包括(但不限於)苯基、苯甲基、萘基、蒽基、菲基(phenanthracenyl)及聯苯。

「芳烷基」係指式RaRb之基團，其中Ra為如上文定義之伸烷基鏈且Rb為一或多個如上文定義之芳基，例如苯甲基、二苯基甲基及其類似基團。

「硫烷氧基」係指式-SRc之基團，其中Rc為如本文定義之烷基。術語「低碳硫烷氧基」係指含有1與8個之間的碳之如本文定義之烷氧基。

「烷氧基」係指式-ORda之基團，其中Rd為如本文定義之烷基。術語「低碳烷氧基」係指含有1與8個之間的碳之如本文定義之烷氧基。烷氧基之實例包括(但不限於)甲氧基及乙氧基。

「烷氧基烷基」係指經烷氧基取代之烷基。

「羰基」係指基團-C(=O)-。

「胍基」係指基團H₂ N(C=NH₂ )-NH-。

「甲脒基」係指基團H₂ N(C=NH₂ )CH-。

「胺基」係指基團-NH₂ 。

「烷基胺基」係指式-NHRd或-NRdRd之基團，其中各Rd獨立地為如本文定義之烷基。術語「低碳烷基胺基」係指含有1與8個之間的碳之如本文定義之烷基胺基。

「雜環」意謂飽和、不飽和或芳族5員至7員單環，或7員至10員雙環雜環，且其含有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子，且其中氮及硫雜原子可視情況經氧化，且氮雜原子可視情況經季銨化，包括任何上述雜環與苯環稠合之雙環。雜環可經由任何雜原子或碳原子連接。雜環包括如下文所定義之雜芳基。因此，除下文所列之雜芳基以外，雜環亦包括嗎啉基、吡咯啶酮基、吡咯啶基、哌啶基、哌嗪基、乙內醯脲基、戊內醯胺基、環氧乙基、氧雜環丁基、四氫呋喃基、四氫哌喃基、四氫吡啶基、四氫噻吩基、四氫硫哌喃基、四氫嘧啶基、四氫硫哌喃基及其類似基團。

「雜芳基」意謂具有5員至10員且具有至少一個選自氮、氧及硫之雜原子且含有至少一個碳原子之芳族雜環，包括單環及雙環系統。代表性雜芳基為吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、喹啉基、吡咯基、吲哚基、噁唑基、苯并噁唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、異噁唑基、吡唑基、異噻唑基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、啉基、酞嗪基及喹唑啉基。

術語「視情況經取代之烷基」、「視情況經取代之烯基」、「視情況經取代之烷氧基」、「視情況經取代之硫烷氧基」、「視情況經取代之烷基胺基」、「視情況經取代之低碳烷基」、「視情況經取代之低碳烯基」、「視情況經取代之低碳烷氧基」、「視情況經取代之低碳硫烷氧基」、「視情況經取代之低碳烷基胺基」及「視情況經取代之雜環基」意謂當取代時，至少一個氫原子經取代基置換。在側氧基取代基(=O)之狀況下，2個氫原子經置換。在此方面，取代基包括：氘、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜環、視情況經取代之環烷基、側氧基、鹵素、-CN、-ORx、NRxRy、NRxC(=O)Ry、NRxSO2Ry、-NRxC(=O)NRxRy、C(=O)Rx、C(=O)ORx、C(=O)NRxRy、-SOmRx及-SOmNRxRy，其中m為0、1或2，Rx及Ry相同或不同且獨立地為氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜環或視情況經取代之環烷基，且該視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜環及視情況經取代之環烷基取代基各自可進一步經一或多個側氧基、鹵素、-CN、-ORx、NRxRy、NRxC(=O)Ry、NRxSO2Ry、-NRxC(=O)NRxRy、C(=O)Rx、C(=O)ORx、C(=O)NRxRy、-SOmRx及-SOmNRxRy取代。

構建反義寡核苷酸

在圖1A-1C中說明具有含磷主鏈鍵聯之N-嗎啉基寡核苷酸之實例。磷醯二胺酸連接之N-嗎啉基寡核苷酸(諸如圖1C中所示)尤其較佳，其根據本發明之一態樣經修飾以含有帶正電基團，較佳佔其主鏈鍵聯之10%-50%。具有不帶電主鏈鍵聯之N-嗎啉基寡核苷酸及其製備(包括反義寡核苷酸)詳述於例如(Summerton及Weller 1997)及共同擁有之美國專利第5,698,685號、第5,217,866號、第5,142,047號、第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,521,063號及第5,506,337號中，該等文獻全部皆以引用的方式明確併入本文中。

基於N-嗎啉基之次單位的重要特性包括：1)能夠藉由穩定、不帶電或帶正電主鏈鍵聯以寡聚形式連接；2)能夠支撐核苷酸鹼基(例如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸苷、尿嘧啶及肌苷)使得所形成之聚合物可與互補鹼基目標核酸(包括目標RNA)雜交，對於相對較短之寡核苷酸(例如10-15個鹼基)，Tm值高於約45℃；3)能使寡核苷酸主動或被動轉運至哺乳動物細胞中；及4)能使反義寡核苷酸：RNA異雙螺旋體分別抵抗核糖核酸酶及核糖核酸酶H降解。

所主張標的物之反義寡核苷酸之例示性主鏈結構包括圖1D-G中所示之N-嗎啉基次單位類型，其各自由不帶電或帶正電之含磷次單位鍵聯連接。圖1D展示形成5原子重複單元主鏈之含磷鍵聯，其中N-嗎啉基環由單原子磷醯胺鍵聯連接。圖1E展示形成6原子重複單元主鏈之鍵聯。在此結構中，連接5'N-嗎啉基碳與磷基團之原子Y可為硫、氮、碳或較佳為氧。磷側位之X部分可為氟、烷基或經取代烷基、烷氧基或經取代烷氧基、硫烷氧基或經取代硫烷氧基或未經取代、經單取代或經二取代之氮，包括環狀結構，諸如嗎啉或哌啶。烷基、烷氧基及硫烷氧基較佳包括1-6個碳原子。Z部分為硫或氧，且較佳為氧。

圖1F及1G中所示之鍵聯係為7原子單元長之主鏈而設計。在結構1F中，X部分係如結構1E中，且Y部分可為亞甲基、硫或較佳為氧。在結構1G中，X及Y部分係如結構1E中。尤其較佳N-嗎啉基寡核苷酸包括由圖1E中所示之形式的N-嗎啉基次單位結構構成之N-嗎啉基寡核苷酸，其中X為NH₂ 、N(CH₃ )₂ 、視情況經取代之1-哌嗪基或其他帶電基團，Y為O且Z為O。

如上文所述，不帶電或實質上不帶電之寡核苷酸可根據本發明之一態樣經修飾以包括帶電鍵聯，例如每2-5個不帶電鍵聯至多約1個帶電鍵聯，諸如每10個不帶電鍵聯約4-5個帶電鍵聯。當約25%(包括約20%至約30%)之主鏈鍵聯為陽離子型鍵聯時，可見最佳反義活性改良。亦包括約35%、40%、45%、50%、55%、60%(包括其間所有整數)或更多主鏈鍵聯為陽離子型鍵聯的寡聚物。在存在少量(例如5%或10%-20%)陽離子型鍵聯之情況下亦觀察到增強作用。

寡核苷酸類似物中實質上不帶電之含磷主鏈通常為如下之主鏈，其中大部分次單位鍵聯(例如其鍵聯之50%-100%之間，通常至少60%至100%或75%或80%)在生理pH值下不帶電且含有單個磷原子。

為支持本發明進行之其他實驗指示，在一些狀況下，在增加陽離子型主鏈電荷之情況下觀察到之增強可藉由使大部分電荷分布接近於反義寡核苷酸之「中心區」主鏈鍵聯來進一步增強，例如在具有8個陽離子型主鏈鍵聯之20聚體寡核苷酸中，使至少70%之此等帶電鍵聯定位於10個最中心鍵聯中。

反義化合物可藉由逐步固相合成，使用上文及下文關於合成具有不帶電及陽離子型主鏈鍵聯之混合物的寡核苷酸引用之參考文獻中詳述之方法來製備。在一些狀況下，可能需要將其他化學部分添加至反義化合物中以例如增強藥物動力學或利於捕獲或偵測該化合物。根據標準合成方法，通常可使該種部分與寡聚物末端共價連接。舉例而言，添加聚乙二醇部分或其他親水性聚合物(例如具有10-100個單體次單位之聚合物)可適用於增強溶解性。一或多個帶電基團(例如陰離子型帶電基團，諸如有機酸)可增強細胞攝取。出於偵測之目的，可連接報導部分，諸如螢光素或放射性標記基團。或者，與寡聚物連接之報導標記可為能夠結合經標記抗體或抗生蛋白鏈菌素之配位體，諸如抗原或生物素。在選擇用於連接或修飾反義化合物之部分時，一般必然需要選擇具有生物相容性且可能為個體所耐受而不存在不合需要副作用之基團的化合物。

如上文所述，反義化合物可經構建以包含選定數目之與上文所述類型之不帶電鍵聯交替之陽離子型鍵聯。不帶電及陽離子型次單位間鍵聯皆較佳為具有結構(II)之含磷鍵聯：

其中W為-S-或-O-，且較佳為-O-，X為-NR¹ R² 或-OR⁶ ，Y為-O-或-NR⁷ ，且寡聚物中之該鍵聯各自選自：

(a)不帶電鍵聯(a)，其中R¹ 、R² 、R⁶ 及R⁷ 各自獨立地選自氫及低碳烷基；

(b1)陽離子型鍵聯(b1)，其中X為-NR¹ R² 且Y為-O-，且-NR¹ R² 表示視情況經取代之哌嗪基部分，使得R¹ R² 為-CHRCHRN(R³ )(R⁴ )CHRCHR-，其中：各R獨立地為H或-CH₃ ，R⁴ 為H、-CH₃ 或電子對，且R³ 係選自H、視情況經取代之低碳烷基、-C(=NH)NH₂ 、-Z-L-NHC(=NH)NH₂ 及[-C(=O)CHR'NH]_m H，其中：Z為-C(=O)-或直接鍵，L為至多18個原子長，較佳至多12個原子長且更佳至多8個原子長之視情況選用之連接基團，具有選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烷氧基及視情況經取代之烷基胺基的鍵，R'為天然存在胺基酸之側鏈或其單碳或雙碳同系物，且m為1至6，較佳為1至4；

(b2)陽離子型鍵聯(b2)，其中X為-NR¹ R² 且Y為-O-，R¹ 為H或-CH₃ ，且R² 為LNR³ R⁴ R⁵ ，其中L、R³ 及R⁴ 係如上文所定義，且R⁵ 為H、視情況經取代之低碳烷基或視情況經取代之低碳(烷氧基)烷基；及

(b3)陽離子型鍵聯(b3)，其中Y為-NR⁷ 且X為-OR⁶ ，且R⁷ 為-LNR³ R⁴ R⁵ ，其中L、R³ 、R⁴ 及R⁵ 係如上文所定義，且R⁶ 為H或視情況經取代之低碳烷基；且至少一個該鍵聯係選自陽離子型鍵聯(b1)、(b2)及(b3)。

較佳地，寡聚物包括至少兩個連續的(a)型鍵聯(亦即不帶電鍵聯)。在其他實施例中，寡聚物中至少5%之鍵聯為陽離子型鍵聯(亦即(b1)、(b2)或(b3)型)，舉例而言，10%至60%，且較佳20%-50%鍵聯可為陽離子型鍵聯。

在一實施例中，至少一個鍵聯為(b1)型鍵聯，其中，較佳地，各R為H，R⁴ 為H、-CH₃ 或電子對，且R³ 係選自H、視情況經取代之低碳烷基、-C(=NH)NH₂ 及-C(=O)-L-NHC(=NH)NH₂ 。R³ 之後兩個實施例分別提供直接與哌嗪環連接或側接至連接基團L的胍基部分。為便於合成，如所示，R³ 中之代號Z較佳為-C(=O)-。

如上文所述，連接基團L在其主鏈中含有選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烷氧基及視情況經取代之烷基胺基的鍵，其中L中之未端原子(例如與羰基或氮鄰接之彼等原子)為碳原子。儘管分支鍵聯為可能的，但連接基團較佳未分支。在一實施例中，連接基團為直鏈烷基連接基團。該種連接基團可具有結構-(CH₂ )_n -,，其中n為1-12，較佳為2-8，且更佳為2-6。

N-嗎啉基次單位具有以下結構(III)：

其中Pi為鹼基配對部分，且上文所述之鍵聯將(III)之氮原子與相鄰次單位之5'碳連接。鹼基配對部分Pi可相同或不同，且一般經設計以提供與目標核酸結合之序列。

使用上述(b1)、(b2)及(b3)型鍵聯之實施例連接N-嗎啉基次單位(III)可如下以圖式方式說明：

較佳地，寡聚物中之所有陽離子型鍵聯具有相同類型，亦即所有皆為(b1)型，所有皆為(b2)型，或所有皆為(b3)型。

在其他實施例中，陽離子型鍵聯係選自如下文所示之鍵聯(b1')及(b1")，其中(b1')在本文中稱作「Pip」鍵聯且(b1")在本文中稱作「GuX」鍵聯：

在上述結構中，W為S或O，且較佳為O；R¹ 及R² 各自獨立地選自氫及視情況經取代之低碳烷基，且較佳為甲基；且A表示在(b1')及(b1")中一或多個碳原子上之氫或非干擾性取代基(亦即對寡聚物與其預定目標結合之能力無不利影響的取代基)。較佳地，哌嗪環中之環碳係未經取代；然而，哌嗪環之環碳可包括非干擾性取代基，諸如甲基或氟。較佳地，至多一或兩個碳原子經如此取代。

在其他實施例中，至少10%之鍵聯為(b1')或(b1")型鍵聯，舉例而言，10%-60%且較佳20%至50%之鍵聯可為(b1')或(b1")型鍵聯。

在其他實施例中，寡聚物不含上述(b1')型鍵聯。或者，寡聚物不含各R為H，R³ 為H或-CH₃ ，且R⁴ 為H、-CH₃ 或電子對的(b1)型鍵聯。

如下文所進一步描述，N-嗎啉基次單位亦可由非磷基次單位間鍵聯連接，其中至少一個鍵聯經如上文所述之側位陽離子型基團修飾。

可使用在未經修飾狀態下不帶電而亦可帶有側位胺取代基之其他寡核苷酸類似鍵聯。舉例而言，N-嗎啉基環上之5'氮原子可用於磺醯胺鍵聯或脲鍵聯(其中，磷分別經碳或硫置換)中且可以與上述結構(b3)中5'氮原子相似之方式修飾。

提供具有任何數目陽離子型鍵聯的寡聚物，包括完全陽離子型連接之寡聚物。然而較佳地，寡聚物部分帶電(例如10%-80%)。在較佳實施例中，約10%至60%，且較佳20%至50%之鍵聯為陽離子型鍵聯。

在一實施例中，陽離子型鍵聯沿主鏈散布。部分帶電之寡聚物較佳含有至少兩個連續不帶電鍵聯，亦即寡聚物沿其整個長度較佳不具有嚴格交替之模式。

亦考慮具有陽離子型鍵聯之嵌段及不帶電鍵聯之嵌段的寡聚物；舉例而言，不帶電鍵聯之中心嵌段可側接有陽離子型鍵聯之嵌段，或反之亦然。在一實施例中，寡聚物具有長度大致相等之5'、3'及中心區域，且陽離子型鍵聯在中心區域中之百分比大於約50%，較佳大於約70%。

用於反義應用中之寡聚物的長度一般在約10個至約40個次單位，更佳約10個至30個次單位，且通常15-25個鹼基之範圍內，包括具有10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個或40個鹼基之寡聚物。在某些實施例中，具有19-20個次單位(適用於反義化合物之長度)之本發明寡聚物理想地可具有2至10個(例如4至8個)陽離子型鍵聯且其餘鍵聯為不帶電鍵聯。具有14-15個次單位之寡聚物理想地可具有2至7個(例如3至5個)陽離子型鍵聯且其餘鍵聯為不帶電鍵聯。

各N-嗎啉基環結構支撐鹼基配對部分以形成鹼基配對部分之序列，其通常經設計以與細胞中或所治療個體之選定反義目標雜交。鹼基配對部分可為在天然DNA或RNA中存在之嘌呤或嘧啶(例如A、G、C、T或U)或其類似物，諸如次黃嘌呤(核苷肌苷之鹼基組份)或5-甲基胞嘧啶。

肽轉運體

本發明之反義化合物可包括與有效增強化合物轉運至細胞中的富含精胺酸之肽轉運部分結合之寡核苷酸部分。如例如圖1B及1C中所示，轉運部分較佳連接至寡聚物末端。肽轉運部分較佳包含6至16個選自X'次單位、Y'次單位及Z'次單位之次單位，

其中：

(a)各X'次單位獨立地表示離胺酸、精胺酸或精胺酸類似物，該類似物為包含結構R¹ N=C(NH₂ )R² 之側鏈的陽離子性α-胺基酸，其中R¹ 為H或R；R² 為R、-NH₂ 、-NHR或-NR₂ ，其中R為視情況經取代之低碳烷基或視情況經取代之低碳烯基；R¹ 與R² 可聯接於一起形成環；且該側鏈係經由R¹ 或R² 與該胺基酸連接；

(b)各Y'次單位獨立地表示中性胺基酸-C(=O)-(CHR)_n -NH-，其中n為2至7且各R獨立地為H或甲基；及

(c)各Z'次單位獨立地表示具有中性芳烷基側鏈之α-胺基酸；其中該肽包含由(X'Y'X')_p 、(X'Y')_m 及/或(X'Z'Z')_p 中至少一者表示之序列，其中p為2至5且m為2至8。某些實施例包括獨立地選自(X'Y'X')_p 、(X'Y')_m 及/或(X'Z'Z')_p 之各種組合，包括例如具有序列(X'Y'X')(X'Z'Z')(X'Y'X')(X'Z'Z')(SEQ ID NO:637)之肽。

在所選實施例中，對於各X'，如在胺基酸次單位精胺酸(Arg)中，側鏈部分為胍基。在某些實施例中，各Y'獨立地為-C(=O)-(CH₂ )_n -CHR-NH-，其中n為2至7且R為H。舉例而言，當n為5且R為H時，Y'為6-胺基己酸次單位，本文中縮寫為Ahx；當n為2且R為H時，Y'為β-丙胺酸次單位，本文中縮寫為B。某些實施例係關於具有不同中性胺基酸之組合的載體肽，包括例如包含序列-RahxRRBRRAhxRRBRAhxB-(SEQ ID NO:578)之肽，其含有β-丙胺酸及6-胺基己酸。

較佳之此類型肽包括彼等包含與單個Y'次單位交替之精胺酸二聚體的肽，其中Y'較佳為Ahx或B或兩者。實例包括具有式(RY'R)_p 及/或式(RRY')_p 之肽，其中p為1至2至5且其中Y'較佳為Ahx。在一實施例中，Y'為6-胺基己酸次單位，R為精胺酸且p為4。某些實施例包括(RY'R)_p 及(RRY')_p 中至少兩者的各種線性組合，包括例如具有序列(RY'R)(RRY')(RY'R)(RRY')(SEQ ID NO:638)或(RRY')(RY'R)(RRY')(SEQ ID NO：639)之說明性肽。涵蓋其他組合。在另一說明性實施例中，各Z'為苯丙胺酸，且m為3或4。

如例如圖1B及1C中所示，結合肽較佳經由連接子Ahx-B與寡聚物末端連接，其中Ahx為6-胺基己酸次單位且B為β-丙胺酸次單位。

在所選實施例中，對於各X'，側鏈部分獨立地選自由胍基(HN=C(NH₂ )NH-)、甲脒基(HN=C(NH₂ )CH-)、2-胺基二氫嘧啶基、2-胺基四氫嘧啶基、2-胺基吡啶基及2-胺基嘧啶酮基組成之群，且其較佳選自胍基及甲脒基。在一實施例中，如在胺基酸次單位精胺酸(Arg)中，側鏈部分為胍基。

在某些實施例中，Y'次單位可因無X'次單位插入Y'次單位之間而連續，或單獨散布於X'次單位之間。在某些實施例中，連接次單位可介於Y'次單位之間。在一實施例中，Y'次單位處於轉運體末端；在其他實施例中，其側接有X'次單位。在其他較佳實施例中，各Y'為-C(=O)-(CH₂ )_n -CHR-NH-，其中n為2至7且R為H。舉例而言，當n為5且R為H時，Y'為6-胺基己酸次單位，本文中縮寫為Ahx。在此基團之所選實施例中，如在精胺酸次單位中，各X'包含胍基側鏈部分。較佳之此類型肽包括彼等包含與單個Y'次單位交替之精胺酸二聚體的肽，其中Y'較佳為Ahx。實例包括具有式(RY'R)₄ 或式(RRY')₄ 之肽，其中Y'較佳為Ahx。在後者狀況下，如例如圖1B及1C中所示，核酸類似物較佳與末端Y'次單位(較佳處於C末端)連接。較佳連接子具有結構AhxB，其中Ahx為6-胺基己酸次單位且B為β-丙胺酸次單位。

相對於在不存在連接轉運部分之情況下對寡聚物之攝取，及相對於藉由缺乏疏水性次單位Y'之連接轉運部分的攝取，如上文所述之轉運部分已展示大大增強所連接寡聚物進入細胞。在哺乳動物細胞對化合物之攝取中，相對於藉由缺乏疏水性次單位Y'之連接轉運部分的藥劑攝取，該增強之攝取較佳經證明增加至少2倍，且較佳增加4倍。相對於非結合型化合物，攝取較佳增強至少20倍，且更佳增強40倍。

轉運部分之另一益處為其預期能夠使反義化合物與其目標核酸序列之間的雙鏈體穩定，可能藉由帶正電轉運部分與帶負電核酸之間的靜電相互作用來達成。如上文所述，轉運體中帶電次單位之數目低於14，且較佳介於8與11之間，因為過高帶電次單位數目可能導致序列特異性降低。

使用富含精胺酸之肽轉運體(亦即細胞穿透肽)尤其適用於實施本發明。某些肽轉運體已展示高度有效地將反義化合物傳遞至原生細胞(包括肌細胞)內(Marshall,Oda等人，2007；Jearawiriyapaisarn,Moulton等人，2008；Wu,Moulton等人，2008)。此外，與其他肽轉運體(諸如穿膜肽(Penetratin)及Tat肽)相比，本文所述之肽轉運體當與反義PMO結合時，表現增強之改變若干基因轉錄物之拼接的能力(Marshall,Oda等人，2007)。以下表3中所列之P007、CP06062及CP04057轉運肽(分別為SEQ ID NO:573、578及577)尤其較佳。

以下在下表B中給出例示性肽轉運體(包括連接子(B或AhxB))。較佳序列為彼等命名為CP06062(SEQ ID NO:578)、P007(SEQ ID NO:573)及CP04057(SEQ ID NO:577)之序列。

調配物

在某些實施例中，本發明提供適用於治療性傳遞如本文所述之反義寡聚物的調配物或組合物。因此，在某些實施例中，本發明提供醫藥學上可接受之組合物，其包含與一或多種醫藥學上可接受之載劑(添加劑)及/或稀釋劑一起調配的治療有效量之本文所述之一或多種寡聚物。雖然有可能單獨投與本發明之寡聚物，但較佳以醫藥調配物(組合物)形式投與化合物。

傳遞核酸分子之方法描述於例如Akhtar等人，1992,Trends Cell Bio., 2:139及Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, Akhtar編；Sullivan等人，PCT WO 94/02595中。可使用此等及其他方案來傳遞實際上任何核酸分子，包括本發明之經分離寡聚物。

如下文所詳述，本發明之醫藥組合物可經特定調配供以固體或液體形式投與，包括彼等適於以下之固體或液體形式：(1)經口投藥，例如灌服劑(水性或非水性溶液或懸浮液)、錠劑(例如彼等目標在於經頰、舌下及全身性吸收之錠劑)、大丸劑、散劑、顆粒劑、供施用於舌之糊劑；(2)非經腸投藥，例如藉由皮下、肌肉內、靜脈內或硬膜外注射，例如呈無菌溶液或懸浮液或持續釋放調配物形式；(3)局部施用，例如呈施用於皮膚之乳膏、軟膏或控制釋放貼片或噴霧形式；(4)陰道內或直腸內投藥，例如呈子宮托、乳膏或泡沫劑形式；(5)舌下投藥；(6)眼部投藥；(7)經皮投藥；或(8)經鼻投藥。

「醫藥學上可接受」一詞在本文中用以指在正確醫學判斷範疇內適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理利益/風險比相稱的彼等化合物、物質、組合物及/或劑型。

如本文所用之「醫藥學上可接受之載劑」一詞意謂參與將本發明化合物自身體之一個器官或一部分載運或轉運至身體之另一器官或另一部分的醫藥學上可接受之物質、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、製造助劑(例如潤滑劑、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鋅或硬脂酸)或溶劑囊封材料。各載劑須在與調配物之其他成份相容且對患者無害之意義上為「可接受的」。

可用作醫藥學上可接受之載劑之物質的一些實例包括(但不限於)：(1)糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；(3)纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；(4)粉末狀黃著膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；(9)油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；(10)二醇，諸如丙二醇；(11)多元醇，諸如甘油、山梨糖醇、甘露醇及聚乙二醇；(12)酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；(15)褐藻酸；(16)無熱原質水；(17)等張食鹽水；(18)林格氏溶液(Ringer's solution)；(19)乙醇；(20)pH值緩衝溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯及/或聚酸酐；及(22)其他用於醫藥調配物中之無毒可相容物質。

適用於與本發明反義寡聚物一起調配之藥劑的其他非限制性實例包括：PEG結合之核酸、磷脂結合之核酸、含有親脂性部分之核酸、硫代磷酸酯、可增強藥物進入各種組織中之P-醣蛋白抑制劑(諸如普盧蘭尼克P85(Pluronic P85))；生物可降解聚合物，諸如用於植入後持續釋放傳遞之聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)微球體(Emerich,DF等人，1999,Cell Transplant, 8,47-58，Alkermes,Inc. Cambridge,Mass.)；及負載奈米粒子，諸如由聚氰基丙烯酸丁酯製成之奈米粒子，其可穿過血腦障壁傳遞藥物且可改變神經元攝取機制(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23,941-949,1999)。

本發明特徵亦在於使用包含含有聚(乙二醇)脂質之經表面改質脂質體(PEG修飾之分支及未分支或其組合或長循環脂質體或隱匿脂質體)的組合物。本發明之寡聚物亦可包含共價連接之各種分子量的PEG分子。此等調配物提供增加藥物在目標組織中積聚之方法。此類藥物載劑抵抗單核吞噬細胞系統(MPS或RES)之調理作用及消除作用，從而對於所囊封之藥物能夠延長血液循環時間及增強組織暴露(Lasic等人，Chem. Rev. 1995,95,2601-2627；Ishiwata等人，Chem. Pharm. Bull. 1995,43,1005-1011)。該等脂質體已展示可能藉由外滲及捕獲於新生血管之目標組織中而選擇性積聚於腫瘤中(Lasic等人， Science 1995,267,1275-1276；Oku等人， 1995,Biochim. Biophys. Acta,1238,86-90)。尤其與習知陽離子型脂質體(已知其積聚於MPS之組織中)相比，長循環脂質體增強DNA及RNA之藥物動力學及藥效學(Liu等人，J. Biol. Chem. 1995,42,24864-24870；Choi等人， 國際PCT公開案第WO 96/10391號；Ansell等人，國際PCT公開案第WO 96/10390號；Holland等人，國際PCT公開案第WO 96/10392號)。與陽離子型脂質體相比，長循環脂質體亦可能基於其能夠避免積聚於代謝旺盛之MPS組織(諸如肝臟及脾臟)中而較大程度上保護藥物免遭核酸酶降解。

在另一實施例中，本發明包括如美國專利第6,692,911號、第7,163,695號及第7,070,807號中所述製備供傳遞之寡聚物組合物。在此方面，在一實施例中，本發明以組合物提供本發明寡聚物，該組合物包含單獨或與PEG(例如分支或未分支PEG或兩者之混合物)組合之如美國專利第7,163,695號、第7,070,807號及第6,692,911號中所述離胺酸及組胺酸之共聚物(HK)，以及PEG及靶向部分或任何上述成份以及交聯劑。在某些實施例中，本發明以組合物提供反義寡聚物，該組合物包含經葡萄糖酸改質之聚組胺酸或葡萄糖化聚組胺酸/轉鐵蛋白-聚離胺酸。熟習此項技術者亦認識到可在組合物內以具有與His及Lys相似之特性的胺基酸來替代。

本文所述寡聚物之某些實施例可含有鹼性官能基(諸如胺基或烷基胺基)且因此能夠與醫藥學上可接受之酸形成醫藥學上可接受之鹽。術語「醫藥學上可接受之鹽」在此方面係指本發明化合物之相對無毒、無機及有機酸加成鹽。此等鹽可在投藥媒劑或劑型製造過程中現場製備，或藉由使本發明之經純化化合物以其游離鹼形式與適合有機酸或無機酸單獨反應，並在後續純化期間分離由此形成之鹽來製備。代表性鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、萘二甲酸鹽、甲磺酸鹽、葡萄糖酸鹽、乳糖酸鹽及月桂基磺酸鹽及其類似物。(參見例如Berge等人，(1977)「Pharmaceutical Salts」,J. Pharm. Sci. 66:1-19)。

本發明寡聚物之醫藥學上可接受之鹽包括該等化合物與例如無毒有機酸或無機酸之習知無毒鹽或四級銨鹽。舉例而言，該等習知無毒鹽包括彼等得自以下無機酸之鹽：諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、胺基磺酸、磷酸、硝酸及其類似酸；及自以下有機酸製備之鹽：諸如乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、棕櫚酸、順丁烯二酸、羥基順丁烯二酸、苯乙酸、麩胺酸、苯甲酸、水楊酸、對胺基苯磺酸、2-乙醯氧基苯甲酸、反丁烯二酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙基磺酸及其類似酸。

在某些實施例中，本發明之寡聚物可含有一或多個酸性官能基且因此能夠與醫藥學上可接受之鹼形成醫藥學上可接受之鹽。術語「醫藥學上可接受之鹽」在此等情況下係指本發明化合物之相對無毒、無機及有機鹼加成鹽。此等鹽可同樣在投藥媒劑或劑型製造過程中現場製備，或藉由使經純化化合物以其游離酸形式與適合鹼(諸如醫藥學上可接受之金屬陽離子的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽)、與氨或與醫藥學上可接受之有機一級、二級或三級胺單獨反應來製備。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及鋁鹽及其類似物。適用於形成鹼加成鹽之代表性有機胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪及其類似物(參見例如Berge等人，同上)。

濕潤劑、乳化劑及諸如月桂基硫酸鈉及硬脂酸鎂之潤滑劑以及著色劑、脫模劑、塗布劑、甜味劑、調味劑及芳香劑、防腐劑及抗氧化劑亦可存在於組合物中。

醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基甲氧苯(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。

本發明之調配物包括彼等適於經口、經鼻、局部(包括經頰及舌下)、經直腸、經陰道及/或非經腸投藥之調配物。調配物宜以單位劑型提供且可藉由藥學技術中熟知之任何方法來製備。可與載劑物質組合以製備單一劑型之活性成份之量視所治療之宿主及特定投藥模式而變化。可與載劑物質組合以製備單一劑型之活性成份之量一般為產生治療作用之化合物的量。一般而言，以百分之一百計，此量在約0.1%至約99%，較佳約5%至約70%，最佳約10%至約30%之活性成份的範圍內。

在某些實施例中，本發明之調配物包含選自環糊精、纖維素、脂質體、微胞形成劑(例如膽酸)及聚合載劑(例如聚酯及聚酸酐)之賦形劑；及本發明之寡聚物。在某些實施例中，上述調配物使本發明之寡聚物具有經口生物可用性。

製備此等調配物或組合物之方法包括使本發明寡聚物與載劑及視情況選用之一或多種配合劑結合之步驟。一般而言，藉由使本發明化合物與液體載劑或細粉狀固體載劑或兩者均勻且緊密地結合，且接著必要時使產物成形來製備調配物。

適於經口投藥之本發明調配物可呈膠囊、扁膠劑、藥丸、錠劑、口含劑(使用調味基質，通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃著膠)、散劑、顆粒劑之形式或呈於水性或非水性液體中之溶液或懸浮液形式或呈水包油或油包水液體乳液形式，或呈酏劑或糖漿形式或呈片劑(使用惰性基質，諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠)形式及/或呈漱口劑形式及其類似形式，每一者均含有預定量之本發明化合物作為活性成份。亦可以大丸劑、舐劑或糊劑形式投與本發明之寡聚物。

在用於經口投藥之本發明固體劑型(膠囊、錠劑、藥丸、糖衣藥丸、散劑、顆粒劑、糖衣錠及其類似物)中，活性成份可與一或多種醫藥學上可接受之載劑(諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣)及/或以下任一者混合：(1)填充劑或增充劑，諸如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇及/或矽酸；(2)黏合劑，諸如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯啶酮、蔗糖及/或阿拉伯膠；(3)保濕劑，諸如甘油；(4)崩解劑，諸如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、褐藻酸、某些矽酸鹽及碳酸鈉；(5)溶解延遲劑，諸如石蠟；(6)吸收加速劑，諸如四級銨化合物及界面活性劑，諸如泊洛沙姆(poloxamer)及月桂基硫酸鈉；(7)濕潤劑，諸如十六醇、單硬脂酸甘油酯及非離子型界面活性劑；(8)吸收劑，諸如高嶺土及膨潤土；(9)潤滑劑，諸如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉、硬脂酸鋅、硬脂酸鈉、硬脂酸及其混合物；(10)著色劑；及(11)控制釋放劑，諸如交聯聚維酮或乙基纖維素。在膠囊、錠劑及藥丸之狀況下，醫藥組合物亦可包含緩衝劑。相似類型之固體組合物亦可用作使用諸如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇及其類似物之賦形劑的軟殼及硬殼式明膠膠囊中之填充物。

可藉由視情況與一或多種配合劑一起壓製或模製來製備錠劑。壓製錠劑可使用黏合劑(例如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如羥基乙酸澱粉鈉或交聯羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑來製備。模製錠劑可藉由在合適機器中模製經惰性液體稀釋劑濕潤之粉末狀化合物之混合物來製備。

本發明醫藥組合物之錠劑及其他固體劑型(諸如糖衣藥丸、膠囊、藥丸及顆粒劑)可視情況經刻痕或用包衣或外殼(諸如腸溶衣及醫藥調配技術中熟知之其他包衣)來製備。其亦可使用例如呈不同比例以提供所需釋放概況之羥丙基甲基纖維素、其他聚合物基質、脂質體及/或微球體來調配以提供其中活性成份之緩慢或控制釋放。其可經調配以用於快速釋放，例如冷凍乾燥。其可藉由例如經細菌滯留過濾器過濾或藉由以臨用前可溶解於無菌水或一些其他無菌可注射介質中之無菌固體組合物形式併入殺菌劑來殺菌。此等組合物亦可視情況含有遮光劑且可為僅在或優先在胃腸道之某一部分中視情況以延遲方式釋放活性成分之組合物。可使用之嵌埋式組合物之實例包括聚合物質及蠟。適當時，活性成份亦可與一或多種上述賦形劑一起呈微囊封形式。

用於經口投與本發明化合物的液體劑型包括醫藥學上可接受之乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿及酏劑。除活性成份之外，液體劑型還可含有此項技術中常用之惰性稀釋劑，諸如水或其他溶劑；增溶劑及乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特定而言，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及脫水山梨糖醇之脂肪酸酯及其混合物。

除惰性稀釋劑外，經口組合物亦可包括佐劑，諸如濕潤劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、調味劑、著色劑、芳香劑及防腐劑。

除活性化合物以外，懸浮液還可含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇及脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂及黃蓍膠及其混合物。

用於經直腸或經陰道投藥之調配物可以栓劑形式提供，該栓劑可藉由使本發明之一或多種化合物與一或多種適合無刺激性賦形劑或載劑混合來製備，該等賦形劑或載劑包含例如可可脂、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸酯，且該栓劑在室溫下為固體，但在體溫下為液體且因此將在直腸或陰道腔內熔融並釋放活性化合物。

用於局部或經皮投與如本文提供之寡聚物的調配物或劑型包括散劑、噴霧、軟膏、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠劑、溶液、貼片及吸入劑。活性寡聚物可在無菌條件下與醫藥學上可接受之載劑及與任何可能需要之防腐劑、緩衝劑或推進劑混合。軟膏、糊劑、乳膏及凝膠劑除本發明之活性化合物外還可含有賦形劑，諸如動物及植物脂肪、油、蠟、石蠟、澱粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚矽氧、膨潤土、矽酸、滑石粉及氧化鋅或其混合物。

散劑及噴霧除本發明之寡聚物外還可含有賦形劑，諸如乳糖、滑石粉、矽酸、氫氧化鋁、矽酸鈣及聚醯胺粉末，或此等物質之混合物。噴霧另外還可含有常用推進劑，諸如氯氟烴及揮發性未經取代烴，諸如丁烷及丙烷。

經皮貼片具有向身體提供本發明寡聚物之控制傳遞的額外優勢。該等劑型可藉由將寡聚物溶解或分散於適當介質中來製備。亦可使用吸收增強劑來增加藥劑穿過皮膚之流量。該流量之速率可藉由提供速率控制膜或使藥劑分散於聚合物基質或凝膠中以及其他此項技術中已知之方法來控制。

適於非經腸投藥之醫藥組合物可包含本發明之一或多種寡聚物，以及一或多種醫藥學上可接受之無菌等張水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液或可在臨用前復原為無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末，其可含有糖、醇、抗氧化劑、緩衝劑、抑細菌劑、使得調配物與預定接受者之血液等張之溶質或懸浮劑或增稠劑。可用於本發明醫藥組合物中之適合水性及非水性載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。可例如藉由使用諸如卵磷脂之塗層物質，在分散液之狀況下藉由保持所需粒子尺寸，及藉由使用界面活性劑來保持適當流動性。

此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。可藉由納入各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚山梨酸及其類似物)來確保防止微生物對本發明寡聚物之作用。在組合物中亦可能需要納入等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，藉由納入諸如單硬脂酸鋁及明膠之延遲吸收劑可使可注射醫藥形式之吸收延長。

在一些狀況下，為延長藥物之作用，需要減緩皮下或肌肉內注射之藥物的吸收。此作用可藉由使用具有弱水溶性之結晶或非晶形物質的液體懸浮液以及其他此項技術中已知之方法來達成。藥物之吸收速率因而視其溶解速率而定，而其溶解速率轉而可視晶體尺寸及結晶形式而定。或者，藉由使藥物溶解或懸浮於油性媒劑中來達成非經腸投與之藥物形式的延遲吸收。

可注射儲槽形式可藉由在生物可降解聚合物(諸如聚乳酸交酯-聚乙交酯)中形成本發明寡聚物之微囊封基質來製備。視寡聚物與聚合物之比率及所用特定聚合物之性質而定，可控制寡聚物釋放速率。其他生物可降解聚合物之實例包括聚(原酸酯)及聚(酸酐)。儲槽式可注射調配物亦可藉由將藥物截留於與身體組織相容之脂質體或微乳液中來製備。

當向人類及動物以藥品形式投與本發明之寡聚物時，其可原樣給與或以含有例如0.1%至99%(更佳10%至30%)活性成份以及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物形式給與。

如上文所述，本發明之調配物或製劑可經口、非經腸、局部或經直腸給與。其通常係以適於各投藥途徑之形式給與。舉例而言，其係以錠劑或膠囊形式投與，藉由注射、吸入投與，以眼部洗劑、軟膏、栓劑等形式投與，藉由注射、輸注或吸入投與，藉由洗劑或軟膏局部投與，及藉由栓劑經直腸投與。

如本文所用之「非經腸投藥」及「非經腸投與」一詞意謂除腸內及局部投藥以外，通常藉由注射進行之投藥模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內及胸骨內注射及輸注。

如本文所用之短語「全身性投藥」、「全身性投與」、「周邊性投藥」及「周邊性投與」意謂除直接投與至中樞神經系統中以外的投與化合物、藥物或其他物質，從而使其進入患者全身且因此進行代謝及其他類似過程，例如皮下投藥。

不考慮所選投藥途徑，可以適合水合形式使用之本發明寡聚物及/或本發明醫藥組合物可藉由熟習此項技術者已知之習知方法調配成醫藥學上可接受之劑型。本發明醫藥組合物中活性成份之實際劑量可變化以獲得有效達成特定患者、組合物及投藥模式之所需治療反應而對該患者無不可接受毒性之量的活性成份。

所選劑量應視多種因素而定，包括所用本發明特定寡聚物或其酯、鹽或醯胺之活性、投藥途徑、投藥時間、所用特定寡聚物之排泄或代謝速率、吸收之速率及程度、治療持續時間、與所用特定寡聚物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史及醫藥技術中熟知之類似因素。

一般熟習此項技術之醫師或獸醫可易於確定及規定所需醫藥組合物之有效量。舉例而言，醫師或獸醫可以低於達成所需治療作用所需之劑量的劑量開始醫藥組合物中所用之本發明化合物的給藥，且逐漸增加劑量直至達成所需作用。一般而言，本發明化合物之適合日劑量為作為有效產生治療作用之最低劑量的化合物量。該種有效劑量一般視上文所述之因素而定。一般而言，當用於指定作用時，用於患者之本發明化合物之經口、靜脈內、腦室內及皮下劑量應在每日每公斤體重約0.0001mg至約100mg之範圍內。

必要時，可以2個、3個、4個、5個、6個或更多個子劑量投與有效日劑量之活性化合物，該等子劑量可在全天內以合適時間間隔，視情況以單位劑型單獨投與。在某些情況下，給藥係每日投與一次。在某些實施例中，需要時，給藥係每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12週，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月投與一或多次以維持功能性肌縮蛋白之所需表現。

如本文所述且此項技術中所已知，可藉由多種熟習此項技術者已知之方法向細胞投與核酸分子，包括(但不限於)囊封於脂質體中，藉由離子導入療法或藉由併入其他媒劑(諸如水凝膠、環糊精、生物可降解奈米膠囊及生物黏附性微球體)中。在某些實施例中，可使用微乳化技術來改良親脂性(水不溶性)醫藥劑之生物可用性。實例包括Trimetrine(Dordunoo,S. K.等人，Drug Development and Industrial Pharmacy, 17(12),1685-1713,1991)及REV 5901(Sheen,P. C等人，J Pharm Sci 80(7),712-714,1991)。在其他益處中，微乳化藉由優先引導淋巴系統而非循環系統吸收，從而繞過肝臟且防止化合物在肝膽循環中遭到破壞來提供增強之生物可用性。

在本發明之一態樣中，調配物含有由如本文提供之寡聚物及至少一種兩親媒性載劑形成之微胞，其中該等微胞具有小於約100nm之平均直徑。更佳實施例提供平均直徑小於約50nm之微胞且甚至更佳實施例提供平均直徑小於約30nm或甚至小於約20nm之微胞。

雖然涵蓋所有適合兩親媒性載劑，但當前較佳之載劑一般為具有普遍公認安全(GRAS)狀態且可溶解本發明化合物且在稍後階段當溶液與複雜水相(諸如人類胃腸道中存在之水相)接觸時將其微乳化的載劑。通常，滿足此等要求之兩親媒性成份具有2-20之HLB(親水性與親脂性平衡)值且具結構含有C-6至C-20範圍內之直鏈脂族基團。實例為聚乙二醇化脂肪酸甘油酯及聚乙二醇。

兩親媒性載劑之實例包括飽和及單不飽和聚乙二醇化脂肪酸甘油酯，諸如自完全或部分氫化之各種植物油獲得之聚乙二醇化脂肪酸甘油酯。該等油宜由三脂肪酸甘油酯、二脂肪酸甘油酯及單脂肪酸甘油酯及相應脂肪酸之二聚乙二醇酯及單聚乙二醇酯組成，且尤其較佳脂肪酸組合物包括癸酸(4%-10%)、癸酸(3%-9%)、月桂酸(40%-50%)、肉豆蔻酸(14%-24%)、棕櫚酸(4%-14%)及硬脂酸(5%-15%)。另一類適用兩親媒性載劑包括經飽和或單不飽和脂肪酸部分酯化之脫水山梨糖醇及/或山梨糖醇(SPAN系列)或相應乙氧基化類似物(TWEEN系列)。

市售兩親媒性載劑可尤其適用，包括節路斯爾(Gelucire)系列、拉布菲爾(Labrafil)、拉布斯爾(Labrasol)或勞拉二醇(Lauroglycol)(皆由Gattefosse Corporation,Saint Priest,France製造及配銷)、PEG-單油酸酯、PEG-二油酸酯、PEG-單月桂酸酯及PEG-二月桂酸脂、卵磷脂、聚山梨醇酯80等(由美國及全世界多個公司生產及配銷)。

在某些實施例中，可藉由使用脂質體、奈米膠囊、微粒子、微球體、脂質粒子、微脂粒及其類似物來進行傳遞以將本發明組合物引入適合宿主細胞中。詳言之，本發明之組合物可經調配供囊封於脂質粒子、脂質體、微脂粒、奈米球體、奈米粒子及其類似物中來傳遞。可使用已知及習知技術來進行該等傳遞媒劑之調配及使用。

適用於本發明中之親水性聚合物為易於溶於水，可與微脂粒形成脂質共價連接，且活體內可耐受而無毒性作用(亦即生物相容性)之親水性聚合物。適合聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(亦稱作聚丙交酯)、聚乙醇酸(亦稱作聚乙交酯)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物及聚乙烯醇。在某些實施例中，聚合物具有約100道爾頓(dalton)或120道爾頓直至約5,000道爾頓或10,000道爾頓，或約300道爾頓至約5,000道爾頓之分子量。在其他實施例中，聚合物為具有約100道爾頓至約5,000道爾頓之分子量，或具有約300道爾頓至約5,000道爾頓之分子量的聚乙二醇。在某些實施例中，聚合物為750道爾頓之聚乙二醇(PEG(750))。聚合物亦可由其中之單體數目來定義，本發明之較佳實施例使用具有至少約3個單體之聚合物，該等PEG聚合物由3個單體組成(約150道爾頓)。

其他可能適用於本發明中之親水性聚合物包括聚乙烯吡咯啶酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚二甲基丙烯醯胺及衍生纖維素(諸如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素)。

在某些實施例中，本發明之調配物包含選自由以下組成之群的生物相容性聚合物：聚醯胺、聚碳酸酯、聚烯烴、丙烯酸酯及甲基丙烯酸酯之聚合物、聚乙烯聚合物、聚乙交酯、聚矽氧烷、聚胺基甲酸酯及其共聚物、纖維素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸與乙醇酸之聚合物、聚酸酐、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己內酯)、多醣、蛋白質、聚玻糖醛酸、聚氰基丙烯酸酯及其摻合物、混合物或共聚物。

環糊精為環狀寡醣，其由6、7或8個葡萄糖單元組成(分別由希臘字母α、β或γ指定)。葡萄糖單元係由α-1,4-糖苷鍵連接。作為糖單元之椅式構形的結果，所有二級羥基(位於C-2、C-3)皆位於環之一側，而位於C-6之所有一級羥基皆位於另一側。因此，外部面為親水性的，使得環糊精可溶於水。相反，環糊精之內腔為疏水性的，因為其襯有原子C-3及C-5之氫及類醚氧。此等基質允許與多種相對疏水性化合物錯合，包括例如類固醇化合物(諸如17α-雌二醇)(參見例如van Uden等人，Plant Cell Tiss. Org. Cult. 38:1-3-113(1994))。錯合藉由凡得瓦爾力相互作用(Van der Waals interaction)及藉由氫鍵形成來進行。關於環糊精化學之一般評述，參見Wenz,Agnew. Chem. Int. Engl.編，33:803-822(1994)。

環糊精衍生物之物理化學特性強烈取決於取代之類型及程度。舉例而言，其在水中之溶解性處於不可溶(例如三乙醯基-β-環糊精)至147%可溶(w/v)(G-2-β-環糊精)之範圍內。另外，其可溶於多種有機溶劑中。環糊精之特性使得能夠藉由增加或降低其溶解性來控制各種調配物組份之溶解性。

已描述多種環糊精及其製備方法。舉例而言，Parmeter(I)等人(美國專利第3,453,259號)及Gramera等人(美國專利第3,459,731號)描述電中性環糊精。其他衍生物包括具有陽離子特性之環糊精[Parmeter(II),美國專利第3,453,257號]、不可溶性交聯環糊精(Solms,美國專利第3,420,788號)及具有陰離子特性之環糊精[Parmeter(III),美國專利第3,426,011號]。在具有陰離子特性之環糊精衍生物中，羧酸、亞磷酸、亞膦酸、膦酸、磷酸、硫代膦酸、硫代亞磺酸及磺酸附於母環糊精上[參見Parmeter(III)，同上]。此外，磺基烷基醚環糊精衍生物已由Stella等人(美國專利第5,134,127號)描述。

脂質體由至少一個封閉水性內部隔室之脂質雙層膜組成。脂質體可由膜類型及尺寸表徵。單層小微脂粒(SUV)具有單層膜且通常直徑在0.02μm與0.05μm之間的範圍內；單層大微脂粒(LUV)通常大於0.05μm。寡層大微脂粒及多層微脂粒具有多層、通常同心之膜層且通常大於0.1μm。具有若干非同心膜之脂質體(亦即在較大微脂粒中含有若干較小微脂粒)稱作多囊微脂粒。

本發明之一態樣係關於包含容納本發明寡聚物之脂質體的調配物，其中脂質體膜經調配以提供載運能力增加之脂質體。或者或另外，本發明化合物可容納於脂質體之脂質體雙層中或吸附至脂質體之脂質體雙層上。本發明寡聚物可與脂質界面活性劑一起聚集並承載於脂質體內部空間中，在此等狀況下，脂質體膜可經調配以抵抗活性劑-界面活性劑聚集體之破壞性作用。

根據本發明之一實施例，脂質體之脂質雙層含有經聚乙二醇(PEG)衍生化之脂質，使得PEG鏈自脂質雙層之內表面延伸至由脂質體囊封之內部空間中，及自脂質雙層之外部延伸至周圍環境中。

本發明脂質體中所容納之活性劑係呈溶解形式。界面活性劑與活性劑之聚集體(諸如含有相關活性劑之乳液或微胞)可截留於本發明脂質體之內部空間中。界面活性劑用於分散及溶解活性劑，且可選自任何適合脂族、環脂族或芳族界面活性劑，包括(但不限於)具有不同鏈長度(例如自約C14至約C20)之生物相容性溶血磷脂醯膽鹼(LPC)。經聚合物衍生化之脂質(諸如PEG-脂質)亦可用於形成微胞，因為其起作用抑制微胞/膜融合，且因為向界面活性劑分子添加聚合物會降低界面活性劑之CMC且有助於形成微胞。較佳為具有處於微莫耳濃度範圍內之CMC的界面活性劑；可使用較高CMC界面活性劑來製備本發明脂質體中所截留之微胞。

本發明之脂質體可藉由此項技術中已知之多種技術中之任一者來製備。參見例如美國專利第4,235,871號；公開PCT申請案WO 96/14057；New RRC,Liposomes:A practical approach,IRL Press,Oxford(1990),第33-104頁；Lasic DD,Liposomes from physics to applications,Elsevier Science Publishers BV,Amsterdam,1993。舉例而言，本發明脂質體可藉由使經親水性聚合物衍生化之脂質擴散於預先形成之脂質體中，諸如藉由將預先形成之脂質體暴露於由脂質接枝聚合物構成之微胞(脂質濃度相當於脂質體中所需之衍生化脂質的最終莫耳百分數)來製備。含有親水性聚合物之脂質體亦可藉由如此項技術中已知之均質化、脂質-場水合作用或擠壓技術來形成。

在另一例示性調配程序中，首先藉由音波處理使活性劑分散於易於溶解疏水性分子之溶血磷脂醯膽鹼或其他低CMC界面活性劑(包括聚合物接枝脂質)中。接著使用活性劑之所得微胞懸浮液來使含有適合莫耳百分數之聚合物接枝脂質或膽固醇的乾燥脂質樣品再水合。接著使用如此項技術中已知之擠壓技術使脂質及活性劑懸浮液形成脂質體，且藉由標準管柱分離使所得脂質體與未囊封溶液分離。

在本發明之一態樣中，脂質體經製備具有處於選定尺寸範圍內之實質上均一之尺寸。一種有效定尺寸方法包括擠壓脂質體之水性懸浮液穿過一系列具有選定均一微孔尺寸之聚碳酸酯膜，該膜之微孔尺寸大致與藉由擠壓穿過彼膜產生之最大脂質體尺寸相對應。參見例如美國專利第4,737,323號(1988年4月12日)。在某些實施例中，可使用諸如DharmaFECT及Lipofectamine之試劑來將聚核苷酸或蛋白質引入細胞中。

本發明調配物之釋放特徵視囊封材料、所囊封藥物之濃度及釋放調節劑之存在而定。舉例而言，釋放可操控為依賴於pH，例如使用僅在低pH(如在胃中)或較高pH(如在腸中)釋放之pH敏感性包衣。可使用腸溶衣來阻止釋放在通過胃之前發生。可使用囊封於不同材料中之多個氰胺包衣或混合物來獲得在胃中初始釋放，繼而隨後在腸中釋放。亦可藉由納入鹽或成孔劑來操控釋放，該等鹽或成孔劑可藉由膠囊擴散來增加水吸收或藥物釋放。亦可使用調節藥物溶解性之賦形劑來控制釋放速率。亦可併入增強基質降解或自基質釋放之試劑。彼等可添加至藥物中，以分散相(亦即呈微粒狀)添加，或可共同溶解於聚合物相中，視化合物而定。在大部分狀況下，量應介於0.1%與30%(w/w聚合物)之間。降解增強劑之類型包括無機鹽，諸如硫酸銨及氯化銨；有機酸，諸如檸檬酸、苯甲酸及抗壞血酸；無機鹼，諸如碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣、碳酸鋅及氫氧化鋅；及有機鹼，諸如硫酸魚精蛋白、精胺、膽鹼、乙醇胺、二乙醇胺及三乙醇胺；及界面活性劑，諸如Tween及Pluronic。將微結構加入基質之成孔劑(亦即水溶性化合物，諸如無機鹽及糖)係以微粒添加。範圍通常介於1%與30%(w/w聚合物)之間。

亦可藉由改變粒子在消化道中之滯留時間來操控攝取。此可例如藉由黏膜黏附性聚合物塗覆粒子或選用作囊封材料來達成。實例包括大部分具有游離羧基之聚合物，諸如聚葡萄胺糖、纖維素，尤其聚丙烯酸酯(如本文中所用，聚丙烯酸酯係指包括丙烯酸酯基及經修飾之丙烯酸酯基(諸如氰基丙烯酸酯基及甲基丙烯酸酯基)的聚合物)。

寡聚物可經調配以容納於外科或醫療裝置或植入物中，或適於藉由外科或醫療裝置或植入物釋放。在某些態樣中，植入物可用寡聚物塗覆或用寡聚物以其他方式處理。舉例而言，可使用水凝膠或其他聚合物(諸如生物相容性及/或生物可降解聚合物)來塗覆具有本發明組合物之植入物(亦即，組合物可藉由使用水凝膠或其他聚合物而適於與醫療裝置一起使用)。用於塗覆具有藥劑之醫療裝置的聚合物及共聚物在此項技術中為熟知的。植入物之實例包括(但不限於)血管支架、藥物溶離支架、縫合線、修補物、血管導管、透析導管、血管移植物、人工心臟瓣膜、心臟起搏器、可植入複律器除顫器、IV針頭、骨定位及形成裝置(諸如銷、螺釘、板及其他裝置)及用於創傷癒合之人工組織基質。

除本文提供之方法以外，自其他藥品類推，根據本發明使用之寡聚物可經調配供以任何用於人類或獸醫學中之適當方式投與。反義寡聚物及其相應調配物在治療肌肉萎縮症中可單獨或與其他治療策略組合投與，該等治療策略諸如肌母細胞移植、幹細胞治療、投與胺基醣苷抗生素、蛋白酶體抑制劑及上調治療(例如上調肌營養相關蛋白(utrophin)，肌縮蛋白之體染色體旁系同源物)。

本說明書中引用之所有公開案及專利申請案係以引用之方式併入本文中，如同特定且個別指示每一個別公開案或專利申請案以引用之方式併入一般。

儘管出於清楚瞭解之目的，已藉助於說明及實例在一定程度上詳細地描述上述本發明，但對於一般熟習此項技術者，根據本發明之教示顯而易見的是可對本發明進行某些改動及修改而不偏離隨附申請專利範圍之精神或範疇。僅以說明方式而非以限制方式提供以下實例。熟習此項技術者應易於識別出多種可改變或修改以得到基本上類似結果之非關鍵性參數。

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實例

材料及方法

細胞及組織培養處理條件

在37℃水浴槽中解凍以低繼代數保存於5% DMSO溶液(Sigma)中之人類橫紋肌肉瘤細胞(ATCC，CCL-136；RD細胞)直至冰片不再明顯為止。將細胞於24mL溫熱DMEM(含有L-麩胺醯胺(HyClone)，10%胎牛血清及1%青黴素-鏈黴素抗生素溶液(CelGro))中以1.5×10⁶ 個細胞/燒瓶接種於經組織培養處理之T75燒瓶(Nunc)中，24小時後，吸出培養基，在溫熱PBS中將細胞洗滌一次且添加新鮮培養基。在37℃培育箱中，於5.0% CO₂ 下，使細胞長至80%匯合度。

自T75燒瓶吸出培養基；將細胞在溫熱PBS中洗滌一次且吸出。將3mL於37℃水浴槽中溫熱之胰蛋白酶/EDTA添加至各T75中。在和緩搖動下，將細胞在37℃下培育2-5分鐘直至其自燒瓶脫離。將細胞懸浮液轉移至15.0mL錐形管中，用1.0mL胰蛋白酶/EDTA溶液清洗燒瓶以收集剩餘細胞。用Vi-Cell XR細胞計數器(Beckman Coulter)計數細胞。將細胞於1.0mL培養基中以每孔2.0×10⁵ 個活細胞接種於經組織培養處理之12孔板(Falcon)中。在37℃培育箱中，於5.0% CO₂ 下培育細胞隔夜。

檢查12孔接種板之均勻細胞分布及板附著。使經冷凍乾燥之肽結合磷醯二胺酸N-嗎啉基寡聚物(PPMO)以2.0mM再懸浮於無核酸酶之水(Ambion)中且在細胞處理期間保持於冰上，為確定莫耳濃度，使用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific)量測PPMO。在即將進行PPMO處理之前，吸出培養基且在溫熱PBS中清洗細胞。在溫熱培養基中將PPMO稀釋至所需莫耳濃度，以每孔總共1.0mL PPMO處理細胞。一式三份測試PPMO。對於未處理對照，添加1.0mL總體積之新鮮溫熱培養基。在37℃培育箱中，於5.0% CO₂ 下，培育細胞48小時。

RNA提取

吸出培養基，且在溫熱PBS中清洗細胞。使用製造商建議方案，用QuickGene-Mini80系統、QuickGene RNA培養細胞HC套組S及MagNAlyser在瓷珠均質化下提取RNA。簡言之，在處理板中用350μL LRP(每100μL LRP添加10μLβ-巰基乙醇)溶解緩衝液溶解細胞，輕緩研磨勻漿以確保完全溶解，且轉移至MagNAlyser管中。在MagNAlyser中，使管以2800rpm旋轉30秒以確保完全均質化，並短暫冰凍。添加50μL SRP增溶緩衝液且渦旋勻漿15秒。將170μL>99%乙醇添加至各管中，且渦旋勻漿60秒。快速旋轉勻漿且將其轉移至Mini80 RNA濾筒中，對樣品加壓且棄去流出液。在750μL WRP洗滌緩衝液中洗滌濾筒且加壓。將40μL脫氧核糖核酸酶溶液(1.25μL Qiagen脫氧核糖核酸酶I、35μL RDD緩衝液、3.75μL無核酸酶之水)直接添加至濾筒膜，將濾筒在室溫下培育4分鐘。用750μL WRP將濾筒洗滌2次，各次洗滌後加壓。將濾筒置放於無核酸酶之管上。向各膜添加50μL CRP溶離緩衝液，將膜在室溫下培育5分鐘。對濾筒加壓且收集溶離液。將RNA儲存於-80℃下以待定量。使用NanoDrop^TM 2000分光光度計定量RNA。

巢式RT-PCR

使用如以下表1中所示之針對各肌縮蛋白外顯子之引子對組來進行引子特異性、外顯子特異性、經優化之巢式RT-PCR擴增。

所指示之引子對係展示為分別對應於一級或二級擴增之正向或反向(F/R)及外或內引子對(I/O)。在外顯子欄中指示引子目標之定位且目的指示可偵測外顯子略過事件。舉例而言，PS170及PS176引子在一級擴增中擴增外顯子48至53之區域。引子PS172及PS174接著在二級擴增中擴增外顯子49至52之區域。此巢式PCR反應將偵測外顯子50及/或外顯子51之外顯子略過。下文提供特定巢式RT-PCR反應條件。

對於所有樣品，將自經處理細胞提取之RNA(上文所述)稀釋至20ng/μl。

凝膠電泳分析

將10微升5×菲科爾加樣染料(Ficoll loading dye)添加至各50微升巢式RT-PCR反應物中。在300伏特下，使15微升PCR/染料混合物在10% TBE凝膠上電泳30分鐘。電泳後，在去離子水中洗滌凝膠至少1小時，每30分鐘換水。接著在Typhoon Trio可變模式成像器(GE Healthcare)上掃描凝膠。對於外顯子44略過，全長肌縮蛋白轉錄物之巢式RT-PCR產物為571bp，而外顯子44略過mRNA之巢式RT-PCR產物為423bp(外顯子44為148bp)。對於外顯子45，全長肌縮蛋白轉錄物之巢式RT-PCR產物為571bp，而外顯子45略過mRNA之巢式RT-PCR產物為395bp(外顯子45為176bp)。對於外顯子53，全長肌縮蛋白轉錄物之PCR產物為365bp，而外顯子53略過mRNA之PCR產物為153bp(外顯子53為212bp)。

藉由量測全長PCR產物相比於外顯子略過產物的色帶強度對凝膠影像進行定量分析。在一些狀況下，使用在固定PPMO濃度(例如3微莫耳濃度)下之略過百分比來測定一系列PPMO誘導指定外顯子之外顯子略過的相對活性。在其他情況下，使用PPMO劑量範圍來處理細胞(例如0.1、0.3、1.0、3.0及10微莫耳濃度)，且基於在各濃度下所誘導之略過百分比來計算EC₅₀ 。

實例1外顯子51掃描

設計、合成一系列靶向人類肌縮蛋白外顯子51之重疊反義PPMO且用於處理人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)或原生人類骨骼肌細胞。此策略稱作「外顯子掃描」且類似地用於如下文所述之若干其他肌縮蛋白外顯子。所有PPMO皆使用CP06062肽(SEQ ID NO:578)及3'未端PMO鍵聯合成為肽結合之PMO(PPMO)。對於外顯子51，如圖2A中所示，製備一系列26種PPMO(SEQ ID NO:309-311、314、316、317、319、321、323、324、326、327、329-331、333、335、336、338-345)，各長26個鹼基。藉由如上文在材料及方法中所述，以各種濃度處理RD細胞來評估PPMO之外顯子略過功效。3種PPMO(SEQ ID NO:324、326及327)鑑別為有效誘導外顯子略過且選用於另外評估。使用在RD細胞及原生人類骨骼肌細胞中之劑量範圍實驗來確定此等3種PPMO序列之相對功效。如圖2B及2C中所示，SEQ ID NO:327展示為最有效誘導外顯子51略過。

如上文所述，在RD細胞及原生人類骨骼肌細胞中進行SEQ ID NO:327與其他外顯子51靶向反義序列之相對有效性的比較。所有所評估序列皆使用CP06062肽(SEQ ID NO:578)製備為肽結合PMO。此舉允許直接比較反義序列之相對有效性而無需考慮反義化學或細胞傳遞。某些外顯子51靶向寡聚物相較於SEQ ID NO:327之相對位置展示於圖2D中。如圖2C中所示，外顯子略過有效性存在排列等級，其中SEQ ID NO:327最有效，與其他序列相比，其有效性為至少數倍。

實例2外顯子50掃描

設計及合成一系列靶向人類肌縮蛋白外顯子50之重疊反義PPMO。對於外顯子50，如圖3A中所示，製備一系列17種PPMO(SEQ ID NO:267、269、271、273、275、277、279、280、282及284-291)，各長25個鹼基。藉由如上文在材料及方法中所述，以各種濃度處理RD細胞來評估PPMO之外顯子略過功效。4種PPMO(SEQ ID NO:277、287、290及291)鑑別為有效誘導外顯子略過且選用於另外評估。使用在RD細胞中之劑量範圍實驗來確定此等4種PMO序列之相對功效。如圖3B中所示，SEQ ID NO:584(AVI-5656)及287(AVI-5038)展示為最有效誘導外顯子50略過。EC₅₀ 值係自劑量範圍實驗得出且表示相對於由含有外顯子50之mRNA產生之PCR產物，50%之PCR產物來自缺乏外顯子50之mRNA的計算濃度。如圖3B中所示，在RD細胞檢定中，與其他序列(參見例如SEQ ID NO:584及585分別對應於WO2006/000057中之SEQ ID NO:173及175)相比，AVI-5038(SEQ ID NO:287)具有等效或更佳之誘導外顯子略過之活性。

實例3外顯子53掃描設計及合成一系列靶向人類肌縮蛋白外顯子53之重疊反義PPMO。對於外顯子53，如圖4A中所示，製備一系列24種PPMO(SEQ ID NO:416、418、420、422、424、426、428、429、431、433、434、436、438-440及443-451)，各長25個鹼基。藉由如上文在材料及方法中所述以各種濃度處理RD細胞及原生人類骨骼肌細胞來評估PPMO之外顯子略過功效。3種PPMO(SEQ ID NO:428、429及431)鑑別為有效誘導外顯子略過且選用於另外評估。使用在RD細胞中之劑量範圍實驗來確定此等3種PMO序列之相對功效。如圖4B-F中所示，SEQ ID NO:429展示為最有效誘導外顯子53略過。然而，當與其他外顯子53反義序列相比時，SEQ ID NO:429證明與H53A(+23+47)相同，該H53A(+23+47)在WO2006/000057中列為SEQ ID NO:195且在本申請案中列為SEQ ID NO:609。將SEQ ID NO:429與其他序列比較，該等其他序列包括H53A(+39+69)及H53A(-12+10)(在WO2006/000057中分別列為SEQ ID NO:193及199)及h53AON1(在美國申請案第11/233,507號中列為SEQ ID NO:39)而在本申請案中分別列為SEQ ID NO:608、611及610。所有所評估序列皆使用CP06062肽(SEQ ID NO:578)製備為肽結合PMO。此舉允許直接比較反義序列之相對有效性而無需考慮反義化學或細胞傳遞。如圖4I及4G-H中所示，SEQ ID NO:429經展示優於此等4種序列中之任一者。

實例4外顯子44掃描

設計及合成一系列靶向人類肌縮蛋白外顯子44之重疊反義PPMO。對於外顯子44，如圖5A中所示，製備一系列PPMO(SEQ ID NO:1-20)，各長25個鹼基。藉由如上文在材料及方法中所述以各種濃度處理RD細胞來評估PPMO之外顯子略過功效。5種PPMO(SEQ ID NO:4、8、11、12及13)鑑別為有效誘導外顯子略過且選用於另外評估。如圖5C至5H中所示，使用在RD細胞中之劑量範圍實驗來確定此等5種PPMO序列之相對功效。如圖5H中所示，SEQ ID NO:8、11及12展示為最有效誘導外顯子44略過，其中SEQ ID NO:12證明為最高效。在RD細胞及人類原生骨骼肌細胞中進行SEQ ID NO:12與其他外顯子44反義序列之比較。所有所評估序列皆使用CP06062肽(SEQ ID NO:578)製備為肽結合PMO。此舉允許直接比較反義序列之相對有效性而無需考慮反義化學或細胞傳遞。

序列(SEQ ID NO:600、601、602及603)與SEQ ID NO:4、8、11及12之比對係展示於圖5B中。SEQ ID NO:601及603在WO2006/000057中列為SEQ ID NO:165及167。SEQ ID NO:602列於WO2004/083446中且在美國申請案第11/233，507號中列為SEQ ID NO:21。SEQ ID NO:600在2007年公開(Wilton,Fall等人，2007)。RD細胞中之比較展示SEQ ID NO:602及603皆優於SEQ ID NO:12(圖5I)。然而，如圖5J中所示，在人類原生骨骼肌細胞中，SEQ ID NO:12(8.86%外顯子略過)優於SEQ ID NO:602(6.42%)。對SEQ ID NO:603進行類似實驗。

實例5外顯子45掃描

設計及合成一系列靶向人類肌縮蛋白外顯子45之重疊反義PPMO。對於外顯子45，如圖6A中所示，製備一系列22種PPMO(SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31、32、34、35、37、39、41、43及45-53)，各長25個鹼基。藉由如上文在材料及方法中所述以各種濃度處理RD細胞及人類原生骨骼肌細胞來評估PPMO之外顯子略過功效。5種PPMO(SEQ ID NO:27、29、34及39)鑑別為有效誘導外顯子略過且選用於另外評估。如圖6C-G中所示，使用在RD細胞中之劑量範圍實驗來確定此等4種PMO序列之相對功效且概述於圖6H中。在此等實驗中SEQ ID NO:49用作陰性對照。如圖6H中所示，SEQ ID NO:29及34展示為最有效誘導外顯子45略過。

在RD細胞及人類原生骨骼肌細胞中進行SEQ ID NO:34與其他外顯子45反義序列之比較。所有所評估序列皆使用CP06062肽(SEQ ID NO:578)製備為肽結合PMO。此舉允許直接比較反義序列之相對有效性而無需考慮反義化學或細胞傳遞。序列(SEQ ID NO:604、605、606及607)與SEQ ID NO:27、29、34及39之比對展示於圖6B中。SEQ ID NO:604及607在WO2006/000057中分別列為SEQ ID NO:211及207。SEQ ID NO:605及606分別在美國申請案第11/233,507號中列為SEQ ID NO:23及1。如圖6I中所示，RD細胞中之比較展示SEQ ID NO:34優於所有4種所評估之序列。如上文所述，在不同人類原生骨骼肌細胞群體中進行此等化合物之測試。

序列ID列表

使用常用於DNA之核苷酸鹼基符號:A、G、C及T來展示序列。其他反義化學物質(諸如2'-O-甲基)使用U替代T。尤其對於3個或3個以上G殘基段，可用肌苷(I)替代任何鹼基。

圖1A展示具有磷醯二胺酸鍵聯之例示性N-嗎啉基寡聚物結構；

圖1B展示根據本發明之一實施例，富含精胺酸之肽與反義寡聚物之結合物；

圖1C展示如圖1B中之結合物，其中主鏈鍵聯含有一或多個帶正電基團；

圖1D-G展示例示性N-嗎啉基寡核苷酸之重複次單位區段，稱為D至G。

圖2A展示經設計以誘導人類肌縮蛋白外顯子51略過之反義寡聚物外顯子51掃描之相對位置及結果。圖2B-C展示選自外顯子51掃描之3種最佳寡聚物(SEQ ID NO:324、326及327)在所培養之人類橫紋肌肉瘤(RD)細胞及人類原生骨骼肌細胞中相對於有效誘導外顯子51略過之序列(AVI-5658；SEQ ID NO:588及h51AON1；SEQ ID NO:594)的相對活性。圖2D展示3種選定寡聚物在外顯子51中相較於某些序列之相對位置。

圖3A展示與誘導外顯子50略過之其他序列相比，經設計以誘導人類肌縮蛋白外顯子50略過之反義寡聚物外顯子50掃描之相對位置及結果。

圖3B展示選自外顯子50掃描之反義序列(SEQ ID NO:277、287、290及291)相較於其他序列(SEQ ID NO:584及585)之相對位置及活性。

4A展示經設計以誘導人類肌縮蛋白外顯子53略過之反義寡聚物外顯子53掃描之相對位置及結果。圖4B展示某些用於比較彼等在外顯子53掃描中選定為最具活性之寡聚物之外顯子略過活性的序列之相對位置。

圖4C-F展示使用在外顯子53掃描中選定為最有效之寡聚物(SEQ ID NO:422、428、429及431)的劑量範圍研究結果(概述於圖4G中)。

圖4H及4I展示某些序列(SEQ ID NO:608-611)在RD細胞及人類原生骨骼肌細胞中相較於最具活性之外顯子53略過寡聚物(SEQ ID NO:429)活性之相對活性。

圖5A展示經設計以誘導人類肌縮蛋白外顯子44略過之反義寡聚物外顯子44掃描之相對位置及結果。圖5B展示某些用於比較彼等在外顯子44掃描中選定為最具活性之寡聚物之外顯子略過活性的序列在外顯子44中之相對位置。

圖5C-G展示使用在外顯子44掃描中選定為最有效之寡聚物(SEQ ID NO:4、8、11、12及13)的劑量範圍研究結果(概述於圖5H中)。

圖5I及5J展示某些序列(SEQ ID NO:600-603)在RD細胞及人類原生骨骼肌細胞中相較於最具活性之外顯子53略過寡聚物(SEQ ID NO:12)活性之相對活性。

圖6A展示經設計以誘導人類肌縮蛋白外顯子45略過之反義寡聚物外顯子45掃描之相對位置及結果。圖6B展示某些用於比較彼等在外顯子45掃描中選定為最具活性之寡聚物之外顯子略過活性的序列在外顯子45中之相對位置。

圖6C-F展示使用在外顯子45掃描中選定為最有效之寡聚物(SEQ ID NO:27、29、34及39)的劑量範圍研究結果(概述於圖6H中)。圖6G使用相對無活性之寡聚物(SEQ ID NO:49)作為陰性對照。

圖6I及6J展示某些序列(SEQ ID NO:604-607)在RD細胞及人類原生骨骼肌細胞中相較於最具活性之外顯子53略過寡聚物(SEQ ID NO:34)活性之相對活性。

(無元件符號說明)

Claims (24)

1. 一種反義寡核苷酸，其包含20至35個嗎啉基(morpholino)次單位，其由含磷次單位間鍵聯連接，將一個次單位之嗎啉基氮與相鄰次單位之5'環外碳聯接，其中該寡核苷酸包含至少17個選自於SEQ ID NO：277、287、290及291之序列之鹼基，其中該反義寡核苷酸與人類肌縮蛋白(dystrophin)前mRNA結合以誘發外顯子50略過(skipping)。
2. 如請求項1之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含SEQ ID NO：277所示序列。
3. 如請求項1之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含SEQ ID NO：287所示序列。
4. 如請求項1之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含SEQ ID NO：290所示序列。
5. 如請求項1之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含SEQ ID NO：291所示序列。
6. 如請求項1之反義寡核苷酸，其中該序列為25個核苷酸，且由選自於SEQ ID NO：277、287、290及291之序列所組成。
7. 如請求項1至6中任一項之反義寡核苷酸，其具有尿嘧啶鹼基(U)取代胞腺嘧啶鹼基(T)。
8. 如請求項1至6中任一項之反義寡核苷酸，其中該化合物與富含精胺酸之肽結合。
9. 如請求項8之反義寡核苷酸，其中該富含精胺酸之肽包 括選自於SEQ ID NO：570至578之序列。
10. 如請求項1至6中任一項之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸與增強該寡核苷酸在水性介質中之溶解性的部分結合，其中該寡核苷酸視情況經由連接子部分與溶解性增強部分結合。
11. 如請求項1至6中任一項之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸與聚乙二醇部分結合。
12. 如請求項1至6中任一項之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸與三乙二醇部分結合。
13. 如請求項10之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸經由連接子部分與溶解性增強部分結合，且其中該連接子部分為哌嗪基部分。
14. 如請求項11之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸經由連接子部分與溶解性增強部分結合，且其中該連接子部分為哌嗪基部分。
15. 如請求項12之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸經由連接子部分與溶解性增強部分結合，且其中該連接子部分為哌嗪基部分。
16. 如請求項1至6中任一項之反義寡核苷酸，其包含由實質上不帶電之含磷次單位間鍵聯連接之嗎啉基次單位，該實質上不帶電之含磷次單位間鍵聯將一個次單位之嗎啉基氮與相鄰次單位之5'環外碳聯接。
17. 如請求項16之反核苷酸，其中5%至35%之鍵聯帶正電。
18. 如請求項1至6中任一項之反義寡核苷酸，其中該次單位 間鍵聯不帶電且與在生理pH值下帶正電之鍵聯相交替，其中帶正電鍵聯之總數介於2與至多鍵聯總數一半之間。
19. 如請求項1至6中任一項之反義寡核苷酸，包含嗎啉基次單位及磷醯二胺酸次單位間鍵聯。
20. 如請求項1至6中任一項之反義寡核苷酸，其中至少1且最高約50%之次單位間鍵聯經側位陽離子型基團修飾。
21. 一種組合物，其包含如請求項1至20中任一項之反義寡核苷酸及醫藥上可接受之載劑。
22. 如請求項21之組合物，其係用於治療肌肉萎縮症。
23. 如請求項22之組合物，其中該肌肉萎縮症為杜顯氏肌肉萎縮症(Duchenne's muscular dystrophy，DMD)或貝克爾肌肉萎縮症(Becker muscular dystrophy，BMD)。
24. 一種如請求項1至20中任一項之反義寡核苷酸之用途，其係用於調配誘導人類肌縮蛋白基因前加工mRNA轉錄物外顯子略過之藥物。