CN102203253A

CN102203253A - 用于dmd的多外显子跳跃组合物

Info

Publication number: CN102203253A
Application number: CN2009801423212A
Authority: CN
Inventors: 彼得·萨扎尼; 瑞斯扎德·科勒
Original assignee: AVI Biopharma Inc
Current assignee: Sarepta Therapeutics Inc
Priority date: 2008-10-24
Filing date: 2009-10-23
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2029-10-23
Also published as: US20180066259A1; SMT201900159T1; JP2019178163A; IL304042A; HK1200868A1; TW201831687A; JP6406782B2; US20150376617A1; US20160002633A1; ES2955539T3; TW202500744A; TWI689587B; EP2350281A1; TWI488965B; CN112574988A; JP2021088595A; JP2016195616A; DK3133160T3; US8865883B2; PT3133160T

Abstract

提供了能够结合人肌营养不良蛋白基因中选定的靶位点以便诱导外显子跳跃的反义分子，和使用其治疗肌营养不良的方法。

Description

用于DMD的多外显子跳跃组合物

引用的相关申请

按照35 U.S.C.§119(e)的规定，本申请要求2008年10月24日提交的美国临时专利申请第61/108,416号的优先权，其中该临时申请通过引用整体并入本文。

关于序列表的声明

本申请提供了文本格式的相关序列表用于替代纸件拷贝，这些序列表通过引用并入本说明书中。含有这些序列表的文本文件的名称是120178_410PC_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为156KB，于2009年10月23日创建，是通过EFS-Web以电子方式提交。

发明领域

本申请涉及适合促进人肌营养不良蛋白基因的外显子跳跃的新反义化合物和组合物。还提供了使用适合用于本发明方法的反义组合物诱导外显子跳跃的方法。

发明背景

使用多种化学制剂在不同水平上(转录、剪接、稳定性、翻译)影响基因表达，发展了反义技术。这类研究中有许多在指征的宽泛范围内专注于使用反义化合物校正或补偿异常或疾病相关基因。反义分子能够特异性地抑制基因表达，因此，许多研究，其致力于作为基因表达调节剂的寡核苷酸，已关注于抑制靶向基因(targeted gene)的表达或顺式作用元件的功能。在一些病毒RNA靶标的情况下，反义寡核苷酸通常针对RNA，或正义链(如mRNA)或是负链。为了实现特定基因减量调节的期望效果，寡核苷酸通常促进靶向mRNA的降解，阻断mRNA的翻译或阻断顺式作用RNA元件的功能，由此有效地防止靶蛋白的从头合成或病毒RNA的复制。

然而，如果目的是上调天然蛋白的产生或补偿诱导翻译的提前终止的突变，例如无义或移码突变，则这些技术不起作用。在这些情况中，缺陷型基因转录物不会进行靶向降解(targeted degration)或空间抑制，所以反义寡核苷酸化学制剂不会促进靶mRNA降解或阻断翻译。

在许多遗传疾病中，突变对基因最终表达的影响可通过剪接过程中靶向外显子跳跃的过程进行调节。该剪接过程受复杂多成分机制的指导，该机制使mRNA前体(pre-mRNA)中的相邻外显子-内含子连接紧密相连并切割内含子末端的磷酸二酯键，伴随着它们在要剪接在一起的外显子之间的后续改造。这个复杂且高度精确过程是通过mRNA前体中的序列基元介导的，所述序列基元是相对半保守的RNA片段，参与之后剪接反应的许多核剪接因子都与其结合。通过改变剪接机制读取或识别参与mRNA前体加工的基元的方式，可以产生差异化的剪接mRNA分子。现在已认识到大部分人基因在正常基因表达过程中可选地剪接，尽管仍未鉴定出相关机制。

在正常功能蛋白因突变而提前终止的情况中，通过反义技术恢复一些功能蛋白产生的方式已经表明，在剪接过程通过干扰是可能的，并且如果与致病突变相关的外显子可被从一些基因中特异性地缺失，则有时会产生缩短的蛋白产物，其具有与天然蛋白相似的生物特性或具有足以改善由与外显子相关的突变导致的疾病的生物活性(Sierakowska，Sambade et al.1996；Wilton，Lloyd et al.1999；van Deutekom，Bremmer-Bout et al.2001；Lu，Mann et al.2003；Aartsma-Rus，Janson et al.2004)。Kole等(美国专利第5,627,274号、第5,916,808号、第5,976,879号以及第5,665,593号)公开了使用不会促进靶向mRNA前体降解的修饰的反义寡核苷酸类似物与异常剪接斗争的方法。Bennett等(美国专利第6,210,892号)描述了野生型细胞mRNA加工的反义调控也使用不会诱导RNAse H-介导的靶RNA切割的反义寡核苷酸类似物。

靶向外显子跳跃的过程可能特别可用于长基因，在所述长基因中，有许多外显子和内含子，有多余的外显子的基因组成或蛋白无需一个或多个特定外显子就能够发挥功能。使基因加工重定向用于治疗与各种基因中的突变所导致的截短相关的遗传疾病的努力，致力于使用以下反义寡核苷酸：其(1)与参与剪接过程的元件完全或部分重叠；或(2)在足够接近元件位置上与mRNA前体结合以阻止正常介导在该元件中发生的特定剪接反应的剪接因子的结合和功能。

杜兴肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是由于肌营养不良蛋白表达上的缺陷导致的。编码该蛋白的基因含有遍布于超过2百万个核苷酸的DNA中的79个外显子。任何外显子突变，会改变外显子读码框(reading frame)，或引入终止密码子，或特征在于去除完整的框外外显子或多个外显子或一个或多个外显子的副本，因此都可有潜力干扰功能性肌营养不良蛋白的产生，从而导致DMD。

肌营养不良不太严重的形式是贝克肌营养不良(Becker muscular dystrophy，BMD)，据发现，其发生的原因在于，突变通常是一个或多个外显子的缺失导致沿着整个肌营养不良蛋白转录物的正确读码框，使得mRNA翻译为蛋白不会提前终止。如果在突变的肌营养不良蛋白mRNA前体加工中，上游和下游外显子的连接保持了基因的正确读码框，则结果是编码具有短的内部缺失的蛋白的mRNA，所述蛋白保留了导致贝克表型的一些活性。

一个外显子或多个外显子的缺失不会改变肌营养不良蛋白的读码框，但会引起BMD表型，而导致移码的外显子缺失将引起DMD(Monaco，Bertelson et al.1988)。通常，肌营养不良蛋白突变包括改变读码框从而阻断正常蛋白翻译的点突变和外显子缺失，因而导致DMD。还应该指出，一些BMD和DMD患者具有覆盖多个外显子的外显子缺失。

尽管反义分子可以为治疗杜兴肌营养不良(DMD)提供工具，使用反义分子诱导外显子跳跃的尝试成效不一。使用定向于外显子内的侧翼接剪接位点或基元的多种反义分子成功实现了肌营养不良蛋白外显子19从肌营养不良蛋白mRNA前体的跳跃，所述外显子包含在如Errington等(Errington，Mann et al.2003)所述的外显子定义中。

Wilton等(Wilton，Lloyd et al.1999)首次报道了在mdx小鼠模型中特异性的可重复的外显子跳跃的实例。通过使反义分子定向于供体剪接位点，在将培养的细胞处理6小时之内，在肌营养不良蛋白mRNA中诱导了外显子23跳跃。Wilton等还描述了用更长的反义寡核苷酸靶向小鼠肌营养不良蛋白mRNA前体的受体区域。尽管定向于内含子23供体剪接位点的第一反义寡核苷酸诱导了原代培养的成肌细胞(primary cultured myoblast)中的外显子跳跃，但是发现该化合物在表达更高水平的肌营养不良蛋白的永生细胞培养物中效力低得多。

尽管有这些努力，仍需要用于DMD治疗应用的靶向多个肌营养不良蛋白外显子的改善的反义寡聚体和改善的肌送递组合物和方法。

发明概述

本发明的实施方案通常涉及能够结合选定的靶标以诱导外显子跳跃的反义化合物，和使用所述反义化合物诱导外显子跳跃的方法。在某些实施方案中，可以将本发明的两个或多个反义寡核苷酸组合在一起，来诱导单个或多个外显子跳跃。

在某些实施方案中，可以通过将两个或多个反义寡核苷酸分子共价连接在一起，改善单个或多个外显子的外显子跳跃(参见例如Aartsma-Rus，Janson et al.2004)。

在某些实施方案中，本发明的反义化合物诱导了人肌营养不良蛋白基因中的外显子跳跃，由此使得肌肉细胞产生功能性肌营养不良蛋白。

本发明的反义寡核苷酸化合物(在本文中也称为寡聚体)通常：(i)包含吗啉代亚基和将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接的含磷亚基间连接，(ii)含有10-40个碱基，优选20-35个碱基，(iii)包含可有效地与肌营养不良蛋白mRNA前体中靶序列的至少12个连续碱基交杂并诱导外显子跳跃的碱基序列。

在某些实施方案中，根据下述结构(I)，本发明的反义化合物可包含含磷亚基间连接，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接：

其中：

Y₁是-O-、-S-、-NH-或-CH₂-；

Z是O或S；

Pj是通过碱基特异性氢键合有效地与多核苷酸碱基结合的嘌呤或嘧啶碱基对部分；和

X是氟，任选地取代的烷基，任选地取代的烷氧基，任选地取代的硫代烷氧基，氨基，任选地取代的烷氨基，或任选地取代的杂环基。

在某些实施方案中，不带电的上述亚基间连接可以散布着在生理pH中带正电荷的连接，其中正电荷的连接的总数在2和不大于连接总数一半之间。例如，带正电荷的连接可具有上述结构，其中X是任选地取代的1-哌嗪基。在其他实施方案中，带正电荷连接可具有上述结构，其中X是取代的1-哌嗪基，其中1-哌嗪基是在4位上被任选地取代的烷基胍基部分取代。

如果给予的反义化合物可有效地靶向预加工的人肌营养不良蛋白的剪接位点，则它可具有与含有预加工的信使RNA(mRNA)人肌营养不良蛋白转录物中的至少12个连续碱基的靶区域互补的碱基序列。示例性反义序列包括SEQ ID NOS：1-569和612-633所确定的那些序列。

在某些实施方案中，本发明的反义序列包含于：

(a)SEQ ID NOS：1-20，优选地SEQ ID NOS：4、8、11和12，和更优选地SEQ IDNO：12所确定的任何序列，用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子44跳跃；

(b)SEQ ID NOS：21-76和612-624，优选地SEQ ID NOS：27、29、34和39，和更优选地SEQ IDNO：34所确定的任何序列，用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子45跳跃；

(c)SEQ ID NOS：77-125，优选地SEQ ID NOS：21-53，和更优选地SEQ IDNO：82、84-87、90、96、98、99和101所确定的任何序列，用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子46跳跃；

(d)SEQ ID NOS：126-169，优选地SEQ ID NOS：126-149，和更优选地SEQ IDNO：126、128-130、132、144和146-149所确定的任何序列，用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子47跳跃；

(e)SEQ ID NOS：170-224和634，优选地SEQ ID NOS：170-201和634，和更优选地SEQ IDNO：176、178、181-183、194和198-201所确定的任何序列，用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子48跳跃；

(f)SEQ ID NOS：225-266，优选地SEQ ID NOS：225-248，和更优选地SEQ IDNO：227、229、234、236、237和244-248所确定的任何序列，用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子49跳跃；

(g)SEQ ID NOS：267-308，优选地SEQ ID NOS：277、287和290，和更优选地SEQ IDNO：287所确定的任何序列，用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子50跳跃；

(h)SEQ ID NOS：309-371，优选地SEQ ID NOS：324、326和327，和更优选地SEQ IDNO：327所确定的任何序列，用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子51跳跃；

(i)SEQ ID NOS：372-415，优选地SEQ ID NOS：372-397，和更优选地SEQ IDNO：379-382、384、390和392-395所确定的任何序列，用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子52跳跃；

(j)SEQ ID NOS：416-475和625-633，优选地SEQ ID NOS：428、429和431，和更优选地SEQ IDNO：429所确定的任何序列，用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子53跳跃；

(k)SEQ ID NOS：476-519，优选地SEQ ID NOS：476-499，和更优选地SEQ IDNO：479-482、484、489和491-493所确定的任何序列，用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子54跳跃；

(1)SEQ ID NOS：520-569和635，优选地SEQ ID NOS：520-546和635，和更优选地SEQ IDNO：524-528、537、539、540、542和544所确定的任何序列，用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子55跳跃；

在某些实施方案中，化合物可与能有效促进细胞吸收化合物的富含精氨酸的多肽偶联。示例性肽，除了本文所述的其他肽外，还包括SEQ ID NOS：570-578所确定的肽。

在一个示例性实施方案中，富含精氨酸的多肽在其N末端或C末端残基与反义化合物的3’或5’端共价偶联。还在示例性实施方案中，反义化合物由吗啉代亚基和将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接的含磷亚基间连接组成。

通常，肽-寡聚体偶联物还可包含对选定的哺乳动物组织即与细胞穿透肽所靶向的相同组织具有选择性的导向肽(homing peptide)。该偶联物可以是以下形式：细胞穿透肽-导向肽-反义寡聚体，或更优选以下形式：导向肽-细胞穿透肽-反义寡寡聚体。例如如上所述用于治疗杜兴肌营养不良的肽偶联化合物还可包含对肌肉组织具有选择性的导向肽，例如具有SEQ ID NO：579所确定的序列的肽，其与细胞穿透肽偶联。这种类型的示例性偶联物包括本文中表示为CP06062-MSP-PMO(细胞穿透肽-导向肽-反义寡聚体)和表示为MSP-CP06062-PMO(导向肽-细胞穿透肽-反义寡聚体)(参见SEQ ID NOs：580-583)的那些偶联物。

在一些实施方案中，肽通过连接体部分与寡聚体偶联。在某些实施方案中，连接体部分可包含任选地取代的哌嗪部分。在其他实施方案中，连接体部分还可包含β丙氨酸和/或6-氨基己酸亚基。仍然在其他实施方案中，肽直接与寡聚体偶联，而无需连接体部分。

肽与寡聚体的偶联可以位于任何适合在肽和寡聚体之间或在连接体部分和寡聚体之间形成共价键的位置。例如，在一些实施方案中，肽的偶联可以位于寡聚体的3’端。在其他实施方案中，肽与寡聚体的偶联可以位于寡聚体的5’端。仍然在其他实施方案中，肽可以通过任何亚基间连接与寡聚体偶联。

在一些实施方案中，肽在寡聚体的5’端与寡聚体偶联。在包含含磷亚基间连接的实施方案中，肽可以通过与末端连接基团的磷的共价键与寡聚体偶联。这种方式的偶联可能需要或不需要上述连接体部分。

仍然在其他实施方案中，肽在寡聚体的3’端与寡聚体偶联。在一些其他实施方案中，肽与寡聚体3’末端吗啉代基团的氮原子偶联。在这方面，肽可以直接或通过上述连接体部分与寡聚体偶联。

在一些实施方案中，寡聚体可以与能增强寡聚体在水性介质中溶解度的部分偶联。在一些实施方案中，能增强寡聚体在水性介质中溶解度的部分是聚乙二醇。仍然在其他实施方案中，能增强寡聚体在水性介质中溶解度的部分是三乙二醇(triethylene glycol)。例如，在一些实施方案中，能增强在水性介质中溶解度的部分可以在寡聚体的5’端与寡聚体偶联。能增强寡聚体在水性介质中溶解度的部分与寡聚体的偶联可以是直接的或通过上述连接体部分。

本发明的某些实施方案提供了选定和/或适合辅助遗传疾病的预防性治疗或治疗性治疗的反义分子，其包含至少一个具有适合送递至患者形式的反义分子。

本发明的某些实施方案提供了治疗患有遗传疾病的患者的方法，其中，在编码特定蛋白的基因中存在突变且突变的影响可通过外显子跳跃消除，其包括以下步骤：(a)按照本文所述方法选择反义分子；和(b)将分子给予需要这种治疗的患者。本发明也包括纯化和分离的本发明反义寡核苷酸在制备用于治疗遗传疾病的药物中的用途。

某些实施方案提供了治疗肌营养不良例如特征为杜兴肌营养不良的疾病状况的方法，该方法包括给予需要治疗的患者有效量的如本文所述的适当设计的反义寡核苷酸，该反义寡核苷酸与该患者中的具体基因病变相关。而且，某些实施方案提供了预防性治疗患者以便预防或至少最小化包括杜兴肌营养不良在内的肌营养不良的方法，其包括以下步骤：给予患者有效量的反义寡核苷酸或包含一种或多种这些生物分子的药物组合物。

某些实施方案涉及治疗个体的肌营养不良的方法，其包括给予患者有效量的基本不带电的反义化合物，该反义化合物含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基，该连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，该反义化合物包含选自SEQ ID NOS：1-569和612-635且能够与肌营养不良蛋白基因外显子中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体的序列，其中该外显子选自外显子44-55。

在某些实施方案中，肌营养不良是杜兴肌营养不良(DMD)。在某些实施方案中，肌营养不良是贝克肌营养不良(BMD)。

在某些实施方案中，序列选自SEQ ID NOS：1-20，且外显子是外显子44。在某些实施方案中，序列选自SEQ ID NOS：21-76和612-624，且外显子是外显子45。

在某些实施方案中，序列选自SEQ ID NOS：77-125，且外显子是外显子46。在某些实施方案中，序列选自SEQ ID NOS：126-169，且外显子是外显子47。

在某些实施方案中，序列选自下组SEQ ID NOS：170-224和634，且外显子是外显子48。在某些实施方案中，序列选自SEQ ID NOS：225-266，且外显子是外显子49。

在某些实施方案中，序列选自SEQ ID NOS：267-308，且外显子是外显子50。在某些实施方案中，序列选自下组SEQ ID NOS：309-371，且外显子是外显子51。

在某些实施方案中，序列选自下组SEQ ID NOS：372-415，且外显子是外显子52。在某些实施方案中，序列选自SEQ ID NOS：416-475和625-633，且外显子是外显子53。在某些实施方案中，序列选自SEQ ID NOS：476-519，且外显子是外显子54。在某些实施方案中，序列选自SEQ ID NOS：520-569和635，且外显子是外显子55。在某些实施方案中，序列包含SEQ ID NOS：287或基本上由其组成。

某些实施方案提供了治疗遗传疾病的试剂盒，该试剂盒包含被包装在适宜容器中的至少一种本发明的反义寡核苷酸，及其使用说明。

结合附图阅读以下本发明的详细说明将会更深入地理解这些和其他目的和特征。

附图简要说明

图1A显示了具有磷酸二氨酯连接的示例性吗啉代寡聚体结构。

图1B显示了本发明实施方案的富含精氨酸的肽与反义寡聚体的偶联物。

图1C显示了如图1B的偶联物，其中主链连接含有一个或多个带正电荷的基团。

图1D-G显示了示例性吗啉代寡核苷酸的重复亚基片段，其称为D-G。

图2A显示了经设计诱导人肌营养不良蛋白外显子51跳跃的反义寡聚体外显子51扫描的相对位置和结果。

图2B-C显示了相对于可有效诱导外显子51跳跃的的序列(AVI-5658；SEQ ID NO：588和h51 AON1；SEQ ID NO：594)，选自外显子51扫描的三个最佳寡聚体(SEQ ID NOs：324、326和327)在培养的人横纹肌肉瘤(RD)细胞和人原代骨骼肌细胞中的相对活性。图2D显示了与某些序列相比，三个选定的寡聚体在外显子51内的相对位置。

图3A显示了与诱导外显子50跳跃的其他序列相比，经设计诱导人肌营养不良蛋白外显子50跳跃的反义寡聚体外显子50扫描的相对位置和结果。

图3B显示了与其他序列(SEQ ID NOS：584和585)相比，选自外显子50扫描的反义序列(SEQ ID NOS：277、287、290和291)的相对位置和活性。

图4A显示了经设计诱导人肌营养不良蛋白外显子53跳跃的反义寡聚体外显子53扫描的相对位置和结果。图4B显示了用于比较选定为在外显子53扫描中最有活性的那些寡聚体的外显子跳跃活性的某些序列的相对位置。

图4C-F显示了使用选定为在外显子53扫描中最有效的寡聚体(SEQ ID NOS：422、428、429和431)的剂量范围研究结果，其总结在图4G中。

图4H和4I显示了与在RD细胞和人原代骨骼肌细胞中最有活性的外显子53跳跃寡聚体(SEQ ID NO：429)的活性相比，某些序列(SEQ ID NOS：608-611)的相对活性。

图5A显示了经设计诱导人肌营养不良蛋白外显子44跳跃的反义寡聚体外显子44扫描的相对位置和结果。图5B显示了用于比较选定为在外显子44扫描中最有活性的那些寡聚体的外显子跳跃活性的某些序列在外显子44内的相对位置。

图5C-G显示了使用选定为在外显子44扫描中最有效的寡聚体(SEQ ID NOS：4、8、11、12和13)的剂量范围研究结果，其总结在图5H中。

图5I和5J显示了与在RD细胞和人原代骨骼肌细胞中最有活性的外显子53跳跃寡聚体(SEQ ID NO：12)的活性相比，某些序列(SEQ ID NOS：600-603)的相对活性。

图6A显示了经设计诱导人肌营养不良蛋白外显子45跳跃的反义寡聚体外显子45扫描的相对位置和结果。图6B显示了用于比较选定为在外显子45扫描中最有活性的那些寡聚体的外显子跳跃活性的某些序列在外显子45内的相对位置。

图6C-F显示了使用选定为在外显子45扫描中最有效的寡聚体(SEQ ID NOS：27，29，34和39)的剂量范围研究结果，其总结在图6H中。图6G使用相对非活性的寡聚体(SEQ ID NO：49)作为阴性对照。

图6I和6J显示了与在RD细胞和人原代骨骼肌细胞中最有活性的外显子53跳跃寡聚体(SEQ ID NO：34)的活性相比，某些序列(SEQ ID NOS：604-607)的相对活性。

发明的详细描述

本发明的实施方案通常涉及经特别设计诱导肌营养不良蛋白基因中的外显子跳跃的改善的反义化合物，及其使用方法。肌营养不良蛋白蛋白在肌肉功能中发挥极其重要的作用，并且各种肌肉相关疾病特征都在于这个基因的突变形式。因此，在某些实施方案中，本文所述的改善的反义化合物诱导突变形式的人肌营养不良蛋白基因中的外显子跳跃。例如在杜兴肌营养不良(DMD)和贝克肌营养不良(BMD)中发现的突变的肌营养不良蛋白基因。

由于突变所导致异常mRNA剪接事件，这些突变的人肌营养不良蛋白基因或表达缺陷型肌营养不良蛋白或表达几乎测量不到的肌营养不良蛋白，这是导致多种形式的肌营养不良的疾病状况。为了治疗这种疾病状况，本发明的反义化合物通常与突变的人肌营养不良蛋白基因的预加工RNA的选定区域杂交，在以别的方式异常剪接的该肌营养不良蛋白mRNA中诱导外显子跳跃和差异化剪接，由此使肌细胞产生编码功能性肌营养不良蛋白的mRNA转录物。在某些实施方案中，得到的肌营养不良蛋白不一定是“野生型”形式的肌营养不良蛋白，而是截短的，然而是功能性或半功能性形式的肌营养不良蛋白。

通过提高肌细胞中功能性肌营养不良蛋白的水平，这些及相关实施方案可用于预防和治疗肌营养不良，特别是，诸如DMD和BMD的这些形式的肌营养不良，它们的特征在于由于异常的mRNA剪接表达缺陷型肌营养不良蛋白。本文所述的具体寡聚体还提供了超过其他在用的寡聚体的改善的肌营养不良蛋白外显子特异性靶向，由此提供了优于治疗肌营养不良相关形式的可选方法的明显的实际优势。

除非另有规定，本文所用的所有技术和科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的具有相同的含义。尽管类似于或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料都可用于实践或检验本发明，仍描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，下文定义了以下术语。

定义

本文所用的冠词“a(一个)”和“an(一个)”是指一个或多于一个(即至少一个)的该冠词的语法对象。通过举例的方式，“一个元件”表示一个元件或多于一个元件。

“约”表示变动范围高达参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、维数、大小、量、重量或长度的30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的数量、水平、值、数量、频率、百分比、维数、大小、量、重量或长度。

“编码序列”表示促进基因的多肽产物编码的任何核苷酸序列。相对而言，术语“非编码序列”是指不促进基因的多肽产物编码的任何核苷酸序列。

在本说明书全文中，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”都应理解为表示包括所述步骤或元件或步骤或元件组，但是不排除任何其他步骤或元件或步骤或元件组。

“由......组成”表示包括并限于短语“由......组成”之内的任何事物。因此，短语”由......组成”表示所列元件是必需的或强制的，且不存在其他元件。“基本由......组成”表示包括短语内所列的任何元件，并限于不会干扰或促进所列元件在公开中指定的活性或作用的其他元件。因此，短语“基本由......组成”表示所列元件是必需的或强制的，但其他元件是任选的且可以存在或不存在，这取决于它们本质上是否影响所列元件的活性或作用。

术语“互补”和”互补性”是指通过碱基配对规律而相关联的多核苷酸(即核苷酸的序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基按照碱基配对规律匹配。或，在核酸之间可以存在“完全”或“全部”的互补性。核酸链之间互补性程度对核酸链之间的杂交效能和强度有明显影响。尽管通常期望完美的互补性，但是一些实施方案可以包括一个或多个但是优选6、5、4、3、2或1个与靶RNA的错配。包括在寡聚体内任何位置的变异。在某些实施方案中，接近寡聚体末端的序列上的变异通常比内部变异更可取，并且如果存在，通常处于5’和/或3’末端约6、5、4、3、2或1个核苷酸之内。

术语“细胞穿透肽”或“CPP”可交替使用，是指阳离子细胞穿透肽，也称为运输肽、载体肽或肽转导结构域。本文所示的该肽能在30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的给定的细胞培养群中诱导细胞穿透，包括之间的所有整数，并允许大分子在全身给药后在体内多个组织内迁移。

术语“反义寡聚体”或“反义化合物”可交替使用，是指通过亚基间连接而连接的环状亚基序列，每个亚基都携带碱基配对部分，该亚基连接使碱基配对部分与核酸(通常是RNA)中的靶序列通过沃森-克里克碱基配对交杂，在靶序列内形成核酸：寡聚体异源双链体。环状亚基是基于核糖或其他戊糖，或在优选实施方案中，基于吗啉代基团(参见以下的吗啉代寡聚体的说明)。

这种反义寡聚体可以设计为阻断或抑制mRNA的翻译或抑制天然mRNA前体的剪接加工，可以认为是“定向”或“靶向”与其杂交的靶序列。在某些实施方案中，靶序列包括含有mRNA的AUG起始密码子、预加工的mRNA的3’或5’剪接位点或分支点的区域。靶序列可以位于外显子或内含子内。剪接位点的靶序列可包括在其5’端具有位于预加工的mRNA的正常剪接位点受体联结处下游的1到约25个碱基对的mRNA序列。用于剪接的优选靶序列是包括剪接位点或被整体包含在外显子编码序列之内或横跨剪接受体或供体位点的预加工的mRNA的任何区域。当寡聚体以上述方式靶向靶标的核酸时，所述寡聚体更常被称为“靶向”生物相关靶标，例如蛋白、病毒或细菌。所包括的反义寡聚体包含SEQ ID NOS：1-569和612-635中的一个或多个，或基本由SEQ ID NOS：1-569和612-635中的一个或多个组成，或由SEQ ID NOS：1-569和612-635中的一个或多个组成。还包括这些反义寡聚体的变体，包括与SEQ ID NOS：1-569和612-635中任一个具有80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％(包括之间的所有整数)序列同一性或序列同源性的变异的寡聚体，和/或与这些序列差异为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的变体，优选诱导一个或多个选定的人肌营养不良蛋白外显子外显子跳跃的那些变体。还包括SEQ ID NOS：584-611和634-635的中任一个或多个的寡聚体，如本文所述，其包含适宜数量的带电连接，例如每2-5个不带电连接高达约1个，例如每10个不带电连接约4-5个，和/或如本文所述，其包含与其连接的富含Arg的肽。

术语“吗啉代寡聚体”或“PMO”(氨基磷酸酯(phosphoramidate)或磷酸二氨酯吗啉代寡聚体)是指由吗啉代亚基结构组成的寡核苷酸类似物，其中(i)所述结构通过含磷的连接而连接，所述含磷的连接，其长度为1-3个原子，优选2个原子，优选不带电或是阳离子，将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，和(ii)每个吗啉代环携带通过碱基特异性氢键合有效地与多核苷酸上的碱基结合的嘌呤或嘧啶碱基配对部分。参见例如图1A的结构，其显示了优选的磷酸二氨酯连接类型。这个连接可以进行变化只要不会干扰结合或活性。例如，连接于磷上的氧可被硫取代(硫代磷酸二氨酯(thiophosphorodiamidate))。5’氧可被氨基或低级烷基取代的氨基取代。连接于磷上的悬挂氮(pendant nitrogen)可以是非取代的或被低级烷基单取代或双取代(任选取代)的。参见以下阳离子连接的讨论。吗啉代寡聚体的合成、结构和结合特征详述于美国专利第5,698,685号、第5,217,866号、第5,142,047号、第5,034,506号、第5,166,315号、第5,521,063号和第5,506,337号以及PCT申请第PCT/US07/11435(阳离子连接体)号中，所有上述专利文献通过引用并入本文。

嘌呤或嘧啶碱基配对部分通常是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或次黄嘌呤。也包括以下碱基：诸如4-吡啶酮、2-吡啶酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯(trime115 thoxy benzene)、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨苯基、5-烷基胞苷(如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(如核糖胸腺嘧啶核苷)、5-卤代尿苷尿苷(如5-溴代尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(如6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷(quesosine)、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、怀丁苷、怀丁氧苷(wybutoxosine)、4-乙酰胞苷(acetyltidine)、5-(羧基羟基甲基)尿苷、5′-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿苷、β-D-半乳糖苷Q核苷(queosine)、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基乙基尿苷(5-methylcarbonyhnethyluridine)、5-甲基氧代尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基Q核苷(queosine)、尿苷-5-氧代乙酸、2-硫代胞嘧啶、苏氨酸衍生物以及其它(Burgin et al.，1996，Biochemistry，35，14090；Uhlman & Peyman，同上)。在这方面，“修饰碱基”表示除了腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)之外的核苷酸碱基，如上所述的；这些碱基可用在反义分子的任何位置。本领域技术人员应当认识到，根据所用的寡聚体，Ts和Us是可以互换的。例如，更像RNA的其他反义化学制剂，例如2’-O-甲基反义寡核苷酸，T碱基可表示为U(参见例如序列Sequence ID列表(Sequence IDlisting，标识符列表))。

“氨基酸亚基”或“氨基酸残基”是指α-氨基酸残基(如-CO-CHR-NH-)或β-或其他氨基酸残基(如-CO-(CH₂)_nCHR-NH-)，其中R是侧链(其可包括氢)且n是1-6，优选1-4。

术语“天然存在的氨基酸”是指天然发现的蛋白中存在的氨基酸，例如在蛋白生物合成期间所用的20种(L)-氨基酸以及诸如4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链赖氨酸、异锁链赖氨酸、高半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸的前体氨基酸。术语“非天然氨基酸”是指天然发现的蛋白中不存在的氨基酸，实例包括β-丙氨酸(β-Ala；或B)、6-氨基己酸(Ahx)和6-氨基戊酸。”“非天然氨基酸”的其他实例包括但不限于(D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、p-氟苯丙氨酸、乙硫氨酸等等，这些都是本领域技术人员已知的。

“有效量”或“有效治疗量”是指作为单次剂量或系列剂量的一部分给予哺乳动物个体的诸如反义寡聚体的治疗化合物的量，该量可有效地在所述个体中产生期望的生理反应或治疗效果。期望的生理反应的一个实例包括与反义寡聚体或对照寡聚体相比，相对功能性或生物活性形式的肌营养不良蛋白的表达增强，其主要是在含有缺陷型肌营养不良蛋白或没有肌营养不良蛋白的肌肉组织或细胞中。期望的治疗效果的实例包括但不限于肌营养不良症状或病状的改善、减轻肌营养不良症状或病状的发展和减缓肌营养不良症状或病状的发作，以及其他。这种症状的实例包括疲劳、智力低下、肌无力、运动技能困难(如奔跑、弹跳、跳跃)、频繁摔倒和步行困难。肌营养不良病理特征在于，例如肌纤维损伤和膜渗漏。对于反义寡聚体，这种效果通常通过改变选定靶序列(如肌营养不良蛋白)的剪接加工例如诱导外显子跳跃所带来的。

“外显子”是指编码蛋白的核酸的限定部分，或在通过剪接去除预加工的RNA(前体)任一部分之后以成熟形式的RNA分子为代表的核酸序列。成熟RNA分子可以是信使RNA(mRNA)或功能性形式的非编码RNA，例如rRNA或tRNA。人肌营养不良蛋白基因具有约75个外显子。

“内含子”是指不被翻译成蛋白的核酸区域(基因内)。内含子是转录成前体mRNA(mRNA前体)之后在形成成熟RNA期间通过剪接而去除的非编码部分。

“外显子跳跃”通常是这样一个过程：通过该过程，整个外显子或其部分从给定的预加工的RNA中去除，由此被排除在成熟RNA例如被翻译成蛋白的成熟mRNA之外。因此，由跳跃的外显子编码的蛋白部分不存在于蛋白的表达形式中，通常形成改变的但仍是功能性形式的蛋白。在某些实施方案中，被跳跃的外显子是来自人肌营养不良蛋白基因的异常外显子，在其序列上可含有以其他方式导致异常剪接的突变或其他改变。在某些实施方案中，被跳跃的外显子是肌营养不良蛋白基因外显子1-75中的任一个或多个，尽管优选人肌营养不良蛋白基因外显子44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55中的任一个或多个。

“肌营养不良蛋白”是杆状细胞质蛋白，并且是通过细胞膜将肌纤维的细胞主链与周围胞外基质连接的蛋白复合物的重要部分。肌营养不良蛋白含有多个功能性结构域。例如，肌营养不良蛋白含有在约氨基酸14-240处的肌动蛋白结合结构域和在氨基酸253-3040处的中心杆状结构域。这个大的中心结构域是由约109个氨基酸的24个膜收缩蛋白样三螺旋元件形成的，它们与α肌动蛋白和膜收缩蛋白具有同源性。这些重复通常被四个富含脯氨酸的非重复片段间断，该非重复片段也称为铰链区。重复15和16被18个氨基酸一段序列隔离，该序列看起来为肌营养不良蛋白的蛋白水解切割提供主要位点。大部分重复之间的序列同一性范围为10-25％。一个重复含有三个α螺旋：1、2和3。α螺旋1和3每个都由7个螺旋转角形成，该螺旋转角可能通过疏水界面作为卷曲螺旋相互作用。α螺旋2具有更为复杂的结构，并且由被甘氨酸或脯氨酸残基隔离的四个和三个螺旋转角的片段形成。两个外显子编码一个重复，所述外显子通常被在α螺旋2的第一部分中的氨基酸47和48之间的内含子所间断。在重复的其他位置发现其他内含子，通常分散在螺旋3中。肌营养不良蛋白也含有在约氨基酸3080-3360处的富含半胱氨酸的结构域，其包括显示出与粘液菌(盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum))α肌动蛋白的C末端结构域具有同源性的富含半胱氨酸的片段(即在280个氨基酸的15个半胱氨酸)。羧基末端结构域位于约氨基酸3361-3685处。

肌营养不良蛋白的氨基末端与F-肌动蛋白结合而羧基末端与肌膜上的肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(dystrophin-associated protein complex，DAPC)结合。DAPC包括肌营养不良蛋白聚糖、肌膜聚糖、整联蛋白和小窝蛋白，并且这些成分中任何成分内的突变导致常染色体遗传的肌营养不良。若缺乏肌营养不良蛋白则DAPC是不稳定的，这会引起膜蛋白水平降低，然后导致渐进性纤维损伤和膜渗漏。在多种形式的肌营养不良中，例如在杜兴肌营养不良(DMD)和贝克肌营养不良(BMD)中，肌肉细胞产生改变的和功能性缺陷型形式的肌营养不良蛋白，或根本不产生肌营养不良蛋白，主要是由于导致非正确剪接的基因序列突变造成的。缺陷型肌营养不良蛋白的优势表达，或肌营养不良蛋白或肌营养不良样蛋白的完全缺乏，导致肌肉变性的快速发展，如上所述。在这方面，“缺陷型”肌营养不良蛋白特征在于，在本领域已知的某些DMD或BMD个体中产生的肌营养不良形式或特征在于缺乏可检测的肌营养不良蛋白。

表A提供多种肌营养不良蛋白结构域、包含这些结构域的氨基酸残基以及编码它们的外显子的说明。

表A

如本文所用的，术语“功能”和“功能性”等是指生物、酶促或治疗功能。

“功能性”肌营养不良蛋白通常是指，通常与存在于某些患有DMD或BMD个体中的改变的或”缺陷型”形式的肌营养不良蛋白相比，具有足以降低肌肉组织渐进性变性的生物活性的肌营养不良蛋白，这是肌营养不良的特征。在某些实施方案中，功能性肌营养不良蛋白可具有约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(包括之间的所有整数)的野生型肌营养不良蛋白的体内或体外生物活性，这可根据本领域常规技术测量。作为一个实例，可按照肌管大小、肌原纤维组织状态(或分解)、收缩活性和乙酰胆碱受体的自发成簇测量体外肌肉培养物中肌营养不良蛋白相关活性(参见如Brown et al.，Journal of Cell Science.112：209-216，1999)。动物模型也是研究疾病病理的重要资源，其提供了检测肌营养不良蛋白相关活性的手段。DMD研究使用最广泛的两个动物模型是mdx小鼠和金毛猎犬肌营养不良(golden retriever muscular dystrophy，GRMD)狗，这两者都是肌营养不良蛋白阴性(参见如Collins & Morgan，Int J Exp Pathol 84：165-172，2003)。这些和其他动物模型可用于测量各种肌营养不良蛋白的功能活性。包括截断形式的肌营养不良蛋白，例如本发明的某些外显子跳跃反义化合物所产生的那些形式。

“基因”表示占据染色体上特定位置的遗传单位，其由转录和/或翻译调控序列和/或编码区域和/或非翻译序列(即内含子、5’和3’非翻译序列)组成。

“分离”表示基本或实质不含有在其天然状态通常伴随它的成分的物质。例如本文所用的“分离的多核苷酸”是指纯化的或在其天然存在状态已从位于其侧翼的序列去除的多核苷酸，例如已经从通常与其相邻的序列去除的DNA片段。

“增强(enhance)”或“增强(enhancing)”，或“增加(increase)”或“增加(increasing)”，或“刺激(stimulate)”或“刺激(stimulating)”通常是指与无反义化合物或对照化合物导致的反应相比，一个或多个反义化合物或组合物在细胞或个体中产生或导致更多生理反应(即下游效果)的能力。除了根据本领域理解和本文描述显而易见的其他反应外，可测量的生理反应还可以包括功能性形式的肌营养不良蛋白的表达增加，或肌肉组织中肌营养不良蛋白相关生物活性的增加。增加的肌肉功能也可测量，包括肌肉功能增加或改善约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。表达功能性肌营养不良蛋白的肌纤维百分比也是可以测量的，包括在约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％的肌纤维中肌营养不良蛋白表达增加。例如，已显示如果25-30％的纤维表达肌营养不良蛋白则会发生约40％的肌肉功能改善(参见例如DelloRusso et al，Proc Natl Acad Sci USA 99：12979-12984，2002)。“增加”或“增强”量通常是“统计显著”量，可包括增加由无反义化合物(缺乏试剂)或对照化合物产生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多倍(如500、1000倍)(包括所有整数，和在中间大于1以的小数点)，如1.5、1.6、1.7、1.8等)。

术语“降低”或“抑制”通常是指本发明的一个或多个反义化合物“减少”相关生理或细胞反应的能力，例如本文所述的疾病症状或疾病状况，这可按照诊断领域的常规技术测量。相关生理或细胞反应(体内或体外)对于本领域技术人员是显而易见的，可包括肌营养不良症状或病状的降低，或缺陷型形式的肌营养不良蛋白表达的降低，例如在患有DMD或BMD个体中表达的改变形式的肌营养不良蛋白。与无反义化合物或对照化合物相比，反应的“减少”是统计显著的，并且可包括减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，包括之间所有整数。

“同源性”是指相同或构成保守取代的氨基酸百分比数。使用诸如GAP(Deveraux et al.，1984，Nucleic Acids Research 12，387-395)的序列对比程序可确定同源性。以此方式，与本文所引用那些序列的长度相似或实质不同的序列可通过在比对中插入缺口，通过例如GAP所用的比对算法所确定此类缺口进行比较。

如本文所用的“序列同一性”或例如包含“与......50％相同的序列”是指在比较窗中核苷酸对核苷酸基础上或氨基酸对氨基酸基础上序列相同的程序。因此“序列同一性百分比”可通过如下计算：在比较窗中比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中都存在相同核酸碱基(如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys and Met)的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数(即窗口大小)，并将该结果乘以100产生序列同一性百分比。

用于描述两个或多个多核苷酸或多肽之间序列关系的术语包括“参照序列”、“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“实质同一性”。“参照序列”是长度为至少8或10个但经常是15-18个且通常是至少25个单体单位，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸每个都包含(1)两个多核苷酸之间相似的序列(即仅完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)两个多核苷酸之间不同的序列，两个(或多个)多核苷酸之间的序列比较通常是通过在”比较窗”中比较两个多核苷酸序列以确定和比较序列相似性的局部区域来实施。“比较窗”是指至少6个连续位置，通常是大约50-100，更通常是大约100-150的概念片断，其中在进行最佳比对后，将该序列与具有相同数目的连续位置的参照序列进行比较。对于两个序列的最佳比对，与参照序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗可包含约20％或更少的添加或缺失(即缺口)。用于比对比较窗的序列的最佳比对可通过计算机执行算法(GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA)或通过检查和任何多种选定方法生成的最佳比对(即在比较窗中获得最高百分比同源性)进行操作。也可以参考例如Altschul et al.，1997，Nucl.Acids Res.25：3389公开的BLAST族程序。序列分析的详细讨论可见于Unit 19.3 of Ausubel et al.，“Current Protocols in Molecular Biology，”John Wiley & Sons Inc，1994-1998，Chapter 15。

个体(如哺乳动物，例如人)或细胞的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”可包括用在试图改变个体或细胞自然进程的任何类型的干扰。治疗包括但不限于给予药物组合物，可以是预防性的，或开始发病或与病原体接触之后实施。治疗包括对于如在某些形式的肌营养不良中与肌营养不良蛋白相关的疾病或疾病状况的症状或病理的任何期望影响，可包括例如所治疗疾病或疾病状况的一个或多个可测量标记的最小变化或改善。也包括“预防性”治疗，其可涉及降低所治疗的疾病或疾病状况的发展速度，或延迟该疾病或疾病状况的发作，或降低其发作的严重性。“治疗”或“预防”不一定表示完全根除、治愈或预防疾病或疾病状况，或其相关症状。

因此，包括治疗肌营养不良例如DMD和BMD的方法，通过给予有需要的个体一种或多种本发明的反义寡聚体(如SEQ ID NOS：1-569和612-635，及其变体)，任选地作为药物制剂或剂型的一部分。也包括通过给予一种或多种反义寡聚体诱导个体外显子跳跃的方法，其中外显子是肌营养不良基因，优选人肌营养不良基因的外显子44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、和/或55之一。如本文所用的“个体”包括表现出症状，或处于表现症状的风险中并可用本发明反义化合物治疗的任何动物，例如患有DMD或BMD或与这些疾病状况相关的任何症状(如肌纤维损失)或处于患有DMD或BMD与这些疾病状况相关的任何症状(如肌纤维损失)风险的个体。适宜的个体(患者)包括实验动物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、耕作动物和家畜(domestic animal)或宠物(例如猫或狗)。包括非人灵长类和优选人患者。

还包括载体送递系统，其能够表达本发明的低聚肌营养不良蛋白靶向序列，例如表达包含本文所述的SEQ ID NOS：1-569和612-635中任一个或其变体的多核苷酸序列的载体。“载体”或“核酸构建体”表示来自例如可以插入或克隆多核苷酸的质粒、噬菌体、酵母或病毒的多核苷酸分子，优选DNA分子。载体优选含有一个或多个独特的限制性位点并能够在限定的宿主细胞中自主复制，包括靶细胞或组织或其祖细胞或组织，或能够与限定的宿主细胞的基因组整合，以便克隆的序列可繁殖。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体而存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如线性或闭环质粒，染色体外元件，微型染色体，或人工染色体。载体可含有确保自我复制的任何手段。可选地，载体可以是当被导入宿主细胞内能整合至基因组并与其所整合的染色体一起复制的载体。

载体或核酸构建体系统可包含单个载体或质粒，两个或多个载体或质粒，它们一起含有要导入宿主细胞基因组的总DNA或转座子。载体的选择通常取决于载体与要导入载体的宿主细胞的相容性。在这种情况下，载体或核酸构建体优选是在哺乳动物细胞例如肌肉细胞中具有可操作地发挥功能的载体。载体也可包括选择标记，如抗生素或药物抗性基因，或报告基因(即绿色荧光蛋白，荧光素酶)，其可用于选择或鉴别适宜的转化体或转染子。示例性送递系统可包括病毒载体系统(即病毒介导的转导)包括但不限于逆转录病毒(如慢病毒)载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和疱疹病毒载体，除本领域已知的其他载体外。

本文所用的术语”可操作地连接”表示将寡聚体编码序列置于启动子的可调控控制下，所述启动子随后控制所述寡聚体的转录。

野生型基因或基因产物是在种群中最常见的因而任意地设计“正常”或“野生型”形式的基因。

“烷基”或“烷撑(alkylene)”都是指含有1-18个碳的饱和的直链或支链烃基。实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、n-戊基和n-己基。术语“低级烷基”是指如本文所定义的含有1-8个碳的烷基。

“烯基”是指含有2-18个碳并包含至少一个碳碳双键的不饱和的直链或支链烃基。实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、叔丁烯基、n-戊烯基和n-己烯基。术语“低级烯基”是指如本文所定义的含有2-8个碳的烯基。

“炔基”是指含有2-18个碳并包含至少一个碳碳三键的不饱和的直链或支链烃基。实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、异丙炔基、丁炔基、异丁炔基、叔丁炔基、戊炔基和己炔基。术语“低级炔基”是指如本文所定义的含有2-8个碳的炔基。

“环烷基”是指单或多环烷基。实例包括但不限于环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。

“芳基”是指含有5-18个碳形成的一个或多个闭环的环状芳烃部分。实例包括但不限于苯基、苄基、萘基、蒽基、菲基(phenanthracenyl)和联苯基。

“芳烷基”是指式RaRb的基团，其中Ra是上文所定义的烷撑链而Rb是一个或多个如上所定义的芳基，例如苄基、二苯甲基等。

“硫代烷氧基”是指式-SRc的基团，其中Rc是本文所定义的烷基。术语“低级硫代烷氧基”是指含有1-8个碳的本文所定义的烷氧基。

“烷氧基”是指式-ORda的基团，其中Rd是本文所定义的烷基。术语“低级烷氧基”是指含有1-8个碳的本文所定义的烷氧基。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基和乙氧基。

“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基。

“羰基”是指-C(＝O)-基团。

“胍基(Guanidynyl)”是指H₂N(C＝NH₂)-NH-基团。

“脒基(Amidinyl)”是指H₂N(C＝NH₂)CH-基团。

“氨基”是指-NH₂基团。

“烷氨基”是指式-NHRd或-NRdRd的基团，其中每个Rd独立地是本文所定义的烷基。术语“低级烷氨基”是指含有1-8个碳的本文所定义的烷氨基。

“杂环”表示5-7元单环或7-10元双环、杂环，其是饱和、不饱和或芳族的，且其含有1-4个独立选自氮、氧和硫的杂原子，其中氮和硫杂原子任选地是氧化的，氮杂原子任选地被季铵化，包括任何上述杂环被稠合至苯环的双环。杂环可通过任何杂原子或碳原子连接。杂环包括如下所定义的杂芳基。因而，除了以下所列杂芳基之外，杂环也包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基(piperizynyl)、乙内酰脲基、戊内酸氨基(valerolactamyl)、环氧乙基、环氧丁基(oxetanyl)、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢硫苯基、四氢硫代吡喃基、四氢嘧啶基、四氢硫代吡喃基等等。

“杂芳基”表示具有至少一个选自氮、氧和硫的杂原子并含有至少1个碳原子的5-10元芳族杂环，包括单环和双环系统。代表性杂芳基是吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、苯硫基、苯并苯硫基、喹啉基、吡咯基、吲哚基、恶唑基、苯并恶唑基、咪唑啉基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异恶唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、酞嗪基和喹唑啉基。

术语“任选地取代的烷基”、“任选地取代的烯基”、“任选地取代的烷氧基”、“任选地取代的硫代烷氧基”、“任选地取代的烷氨基”、“任选地取代的低级烷基”、“任选地取代的低级烯基”、“任选地取代的低级烷氧基”、“任选地取代的低级硫代烷氧基”、“任选地取代的低级烷氨基”和“任选地取代的杂环基”表示，被取代时至少一个氢原子被取代基所取代。如果是含氧取代基(＝O)的情况，则两个氢原子都被取代。在这方面，取代基包括：氘、任选地取代的烷基、任选取代取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂环、任选地取代的环烷基、氧(oxo)、卤素、-CN、-ORx、NRxRy、NRxC(＝O)Ry、NRxSO₂Ry、-NRxC(＝O)NRxRy、C(＝O)Rx、C(＝O)ORx、C(＝O)NRxRy、-SOmRx和-SOmNRxRy，其中m是0、1或2，Rx和Ry是相同或不同且独立的氢、任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂环或任选地取代的环烷基，且每个所述任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂环和任选地取代的环烷基取代基可以被氧、卤素、-CN、-ORx、NRxRy、NRxC(＝O)Ry、NRxSO₂Ry、-NRxC(＝O)NRxRy、C(＝O)Rx、C(＝O)ORx、C(＝O)NRxRy、-SOmRx和-SOmNRxRy中的一个或多个进一步取代。

构建反义寡核苷酸

具有含磷主链连接的吗啉代寡核苷酸的实例如图1A-1C所示。特别优选的是磷酸二氨酯连接的吗啉代寡核苷酸例如图1C所示的，按照在本发明的一方面，其修饰为优选在其10-50％的主链连接上含有带正电荷的基团。具有不带电主链连接的吗啉代寡核苷酸包括反义寡核苷酸及其制备在例如(Summerton and Weller 1997)和共同拥有美国专利第5,698,685号、第5,217,866号、第5,142,047号、第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,521,063号和5第,506,337号中有详细描述，明确地将它们通过引用并入本文。

基于吗啉代的亚基的重要特性包括：1)在寡聚体形式中通过稳定的不带电或带正电的主链连接连接的能力；2)支撑核苷酸碱基(如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和次黄嘌呤)以便所形成的聚合物可与碱基互补靶核苷酸杂交的能力，包括靶RNA，在相对短的寡核苷酸(如10-15个碱基)中Tm值高于大约45℃；3)寡核苷酸主动或被动运输至哺乳动物细胞内的能力；和4)反义寡核苷酸：RNA异源双链体分别抵抗RNAse和RNaseH降解的能力。

要求保护主题的反义寡核苷酸的示例性主链结构包括图1D-G所示的吗啉代亚基类型，每个都通过不带电或带正电的含磷亚基连接而连接。图1D显示了形成五个原子重复单元主链的含磷连接，其中吗啉代环通过1-原子磷酰胺连接而连接。图1E显示了产生6原子重复单元主链的连接。在这个结构中，连接5’吗啉代碳和磷基团的原子Y可以是硫、氮、碳，或优选是氧。悬挂在磷上的X部分可以是氟、烷基或取代的烷基、烷氧基或取代的烷氧基、硫代烷氧基或取代的硫代烷氧基，或非取代、单取代或双取代的氮，包括环状结构例如吗啉或哌啶。烷基、烷氧基和硫代烷氧基优选包括1-6个碳原子。Z部分是硫或氧，优选是氧。

图1F和1G所示的连接是为7原子单元长度主链而设计的。在结构1F中，X部分如结构1E所示，而Y部分可以是亚甲基、硫，或优选是氧。在结构1G中，X和Y部分如结构1E所示。特别优选的吗啉代寡核苷酸包括由图1E所示吗啉代亚基结构形式所组成的那些，其中X＝NH₂、N(CH₃)₂、任选地取代的1-哌嗪基，或其它带电基团，Y＝O，和Z＝O。

如上所述的，按照本发明的一个方面，不带电或基本不带电的寡核苷酸被修饰成包括带电连接，例如例如每2-5个不带电连接中高达约1个带电连接，例如每10个不带电连接体中约4-5个带电连接。当约25％主链连接是阳离子包括约20％-30％时，可以观察到对反义活性的最佳改善。还包括寡聚体中约35％、40％、45％、50％、55％、60％(包括之间所有整数)或更多主链连接是阳离子。小数目例如5％或10％-20％的阳离子连接，也可观察到增强。

在寡核苷酸类似物中的基本不带电的含磷主链通常是在生理pH下大部分亚基连接，如其中50％-100％的连接，通常至少60％-100％或75％或80％的连接不带电并含有单个磷原子。

支持本发明而进行的其他实验表明，添加阳离子主链电荷观察到的增强在一些情况下可通过使大多数电荷接近反义寡核苷酸“中心区域”主链连接体分布在如具有8个阳离子主链连接的20mer寡核苷酸中，其具有至少70％这些带电连接定位于10个最中心连接中。

反义化合物可通过逐步的固相合成，采用上文所以引用的参考文献中详述的方法和下文关于具有混合的不带电和阳离子主链连接的寡核苷酸的合成而制备。在一些情况中，可以期望在反义化合物中添加其他化学部分，以便如增强药代动力学或促进化合物的捕捉或检测。按照标准合成方法，这些部分可以共价连接于，通常是连接于寡聚体的末端。例如，添加聚乙二醇部分或其他亲水聚合物如具有10-100个单体亚基的亲水聚合物，可用于增强溶解性。一个或多个带电基团如带电基团，例如诸如有机酸的阴离子带电基团，可增强细胞摄取。为检测目的，可连接报告部分例如荧光素或放射标记基团。可选地，连接于寡聚体的报告标记可以是能够结合标记的抗体或链霉抗生物素的配体，例如抗原或抗生素。在用于连接或修饰反义化合物的部分中，当然通常期望选择生物可相容的，可能被个体耐受且无非期望的副作用的化合物集合。

如上所示的，反义化合物可被构建成含有选定数量的阳离子连接，所述连接分散着上述不带电的连接类型中。亚基间连接，包括不带电和阳离子连接，优选是含磷连接，其具有结构(II)：

其中：

W是-S-或-O-，并优选是-O-，

X＝-NR¹R²或-OR⁶，

Y＝-O-或-NR⁷，和

寡聚体中每个所述连接选自：

(a)不带电连接(a)，其中R¹、R²、R⁶和R⁷中每个都独立地选自氢和低级烷基；

(b1)阳离子连接体(b1)，其中X＝-NR¹R²和Y＝-O-，和-NR¹R²代表任选地取代的哌嗪部分，这样R¹R²＝-CHRCHRN(R³)(R⁴)CHRCHR-，其中：

每个R都独立地是H或-CH₃，

R⁴是H、-CH₃或电子对，和

R³是选自H、任选地取代的低级烷基、-C(＝NH)NH₂、-Z-L-NHC(＝NH)NH₂和[-C(＝O)CHR’NH]_mH，其中：Z是-C(＝O)-或直接结，L是长度高达18个原子的任选的连接体，优选长度高达12个原子，更优选高达8个原子，具有选自任选地取代的烷基、任选地取代的烷氧基和任选地取代的烷氨基的键，R’是天然存在的氨基酸的侧链或其一碳或二碳类似物，和m是1-6，优选1-4。

(b2)阳离子连接(b2)，其中X＝-NR¹R²和Y＝-O-，R¹＝H或-CH₃，和R²＝LNR³R⁴R⁵，其中L、R³和R⁴如上文所定义，和R⁵是H、任选地取代的低级烷基或任选地取代的低级(烷氧基)烷基；和

(b3)阳离子连接(b3)，其中Y＝-NR⁷和X＝-OR⁶，和R⁷＝-LNR³R⁴R⁵，其中L、R³、R⁴和R⁵如上文所定义，和R⁶是H或任选地取代的低级烷基；和

至少一个所述连接选自阳离子连接(b1)、(b2)和(b3)。

优选，寡聚体包括类型(a)(即不带电的连接)的至少两个连续连接。在其他实施方案中，寡聚体至少5％的连接是阳离子连接(即(b1)、(b2)或(b3)类型)；例如，10％-60％、优选20-50％的连接可以是阳离子连接。

在一个实施方案中，至少一个连接是(b1)类型的连接，其中优选每个R都是H，R⁴是H、-CH₃或电子对，和R³是选自H、任选地取代的低级烷基、-C(＝NH)NH₂和-C(＝O)-L-NHC(＝NH)NH₂。R³的后两个实施方案提供了胍基部分，其分别直接连接于哌嗪环上，或悬垂在连接体基团L上。为了易于合成，R³中的变量Z优选是所示的-C(＝O)-。

如上文所述，连接体基团L在其主链中含有选自任选地取代的烷基、任选地取代的烷氧基和任选地取代的烷氨基的键，其中L的末端原子(如邻近羰基或氮的那些)是碳原子。尽管分支的连接是可能的，但连接体优选是不分支的。在一个实施方案中，连接体是线性烷基连接体。这种连接体可具有结构-(CH₂)_n-，其中n是1-12，优选2-8，更优选2-6。

吗啉代亚基具有以下结构(III)：

其中Pi是碱基配对部分，以上所述的连接将(III)的氮原子与相邻亚基的5’碳连接。碱基配对部分Pi可以相同或不同，通常设计成提供与靶核酸结合的序列。

使用上文的(b1)、(b2)和(b3)连接类型的实施方案连接吗啉代亚基(III)，按以下进行了图示说明：

优选地，寡聚体中所有阳离子连接是相同类型的；即所有(b1)类型，所有(b2)类型，或所有(b3)类型。

在其他实施方案中，阳离子连接选自下文所示的连接(b1’)和(b1”)，其中(b1’)在本文中成为“Pip”连接，且(b1”)在本文中称为“GuX”连接：

在以上结构中，W是S或O，优选是O；R¹和R²中的每一个独立地选自氢和任选地取代的低级烷基，并且优选是甲基；和A代表在(b1’)和(b1”)中一个或多个碳原子上的氢或非干扰取代基(即不会对寡聚体结合其预定靶标的能力产生消极影响的取代基)。优选地，哌嗪环中的环碳原子是非取代的；但是，哌嗪环的环碳原子可包括非干扰取代基，例如甲基或氟。优选地，至多一个或两个碳原子是这样取代的。

在其他实施方案中，至少10％的连接是(b1’)或(b1”)类型；例如10％-60％、优选20％-50％的连接可以是(b1’)或(b1”)类型。

在其他实施方案中，寡聚体不含有上文本(b1’)类型的连接。可选地，寡聚体不含有上文(b1)类型的连接，其中每个R第一是H，R³是H或-CH₃，且R⁴是H、-CH₃，或电子对。

如下文所述，吗啉代亚基也可以通过基于非磷亚基间连接而连接，其中至少一个连接被上文所述的悬垂阳离子基团修饰。

可以使用其他寡核苷酸类似物连接，其在它们的非修饰状态时不带电但也可携带悬垂氨基取代基。例如，吗啉代环上的5’氮原子可以用在磺胺连接或脲连接中(其中磷分别被碳或硫取代)且修饰方式类同于以上结构(b3)中的5’氮原子。

提供了具有任何数目的阳离子连接的寡聚体，包括完全是阳离子连接的寡聚体。然而，优选地，寡聚体是部分带电的，具有例如10％-80％。在优选实施方案中，约10％-60％优选20％-50％的连接是阳离子的。

在一个实施方案中，阳离子连接是分散在主链上。部分带电的寡聚体优选含有至少两个连续不带电的连接；换而言之，寡聚体优选沿其整个长度都不具有严格交替的模式。

也可考虑具有阳离子连接块和不带电连接体区(block)的寡聚体；例如不带电连接的中心侧翼可以是阳离子连接区，或反之亦然。在一个实施方案中，寡聚体具有约等长的5’、3’和中心区，在中心域的阳离子连接百分比大于约50％，优选大于约70％。

用于反义应用的寡聚体的长度通常是约10-约40个亚基，更优选约10-约30个亚基，并且通常15-25个碱基，包括具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基的那些。在某些实施方案中，本发明具有19-20个亚基的寡聚体，该长度可用于反义化合物中，可理想地具有2-10，例如，4-8个阳离子连接，剩余的是不带电的连接。有14-15个亚基的寡聚体理想地具有2-7如3-5个阳离子连接，剩余的是不带电的连接。

每个吗啉代环结构支撑碱基配对部分，以便形成碱基配对部分的序列，该序列通常被设计成可与要治疗的细胞或个体中选定的反义靶标杂交。碱基配对部分可以是在天然DNA或RNA(如A、G、C、T或U)或诸如次黄嘌呤(核苷肌苷的成分)或5-甲基胞嘧啶的类似物中发现的嘌呤或嘧啶。

肽转运蛋白

本发明的反义化合物可包括与能有效增强化合物向细胞转运的富含精氨酸的肽转运部分偶联的寡核苷酸部分。转运部分优选连接于寡聚体的末端，例如如图1B和1C所示。肽转运部分优选包含6-16个选自X’亚基、Y’亚基和Z’亚基的亚基，

其中：

(a)每个X’亚基独立地代表赖氨酸、精氨酸或精氨酸类似物，所述类似物是包含结构R¹N＝C(NH₂)R²的侧链的阳离子α-氨基酸，其中R¹是H或R；R²是R、-NH₂、-NHR或-NR₂，其中R是任选地取代的低级烷基或任选地取代的低级烯基；R¹和R²可连接在一起形成环；且侧链是通过R¹或R²与所述氨基酸连接；

(b)每个Y’亚基独立地代表中性氨基酸-C(＝O)-(CHR)_n-NH-，其中n是2-7，且每个R都独立地是H或甲基；和

(c)每个Z’亚基都独立地代表具有中性芳烷基侧链的α-氨基酸；

其中肽包含由(X’Y’X’)_p、(X’Y’)_m和/或(X’Z’Z’)_p中至少一个所代表的序列，其中p是2-5和m是2-8。特定实施方案包括独立选自(X’Y’X’)_p、(X’Y’)_m和/或(X’Z’Z’)_p的多种组合，包括例如具有序列(X’Y’X’)(X’Z’Z’)(X’Y’X’)(X’Z’Z’)(SEQ ID NO：637)的肽。

在选定的实施方案中，对于每个X’，侧链部分是胍基，如在氨基酸亚基精氨酸(Arg)中。在某些实施方案中，每个Y’都独立地是-C(＝O)-(CH₂)_n-CHR-NH-，其中n是2-7而R是H。例如，当n是5且R是H时，Y’是6-氨基己酸亚基，在本文中缩写成Ahx；当n是2且R是H时，Y’是β-丙氨酸亚基，在本文中缩写成B。某些实施方案涉及具有不同中性氨基酸组合的载体肽，包括例如包含序列-RahxRRBRRAhxRRBRAhxB-(SEQ ID NO：578)的肽，其含有β-丙氨酸和6-氨基己酸两者。

优选的这类型肽包括包含与单个Y’亚基交替的精氨酸二聚体的那些肽，其中Y’优选是Ahx或B或两者。实例包括具有式(RY’R)_p和/或式(RRY’)_p的肽，其中p是1-2-5而其中Y’优选是Ahx。在一个实施方案中，Y’是6-氨基己酸亚基，R是精氨酸而p是4。某些实施方案包括至少两个(RY’R)_p和(RRY’)_p的多种线性组合，包括例如，具有序列(RY’R)(RRY’)(RY’R)(RRY’)(SEQ ID NO：638)，或(RRY’)(RY’R)(RRY’)(SEQ ID NO：639)的说明性的肽。考虑了其他组合。在另一说明性实施方案中，每个Z’都是苯丙氨酸，且m是3或4。

偶联的肽优选通过连接体Ahx-B与寡聚体末端连接，其中Ahx是6-氨基己酸亚基，而B是β-丙氨酸亚基，如图1B和1C所示。

在选定的实施方案中，对于每个X’，侧链部分独立地选自：胍基(HN＝C(NH₂)NH-)、脒基(HN＝C(NH₂)CH-)、2-氨基二氢嘧啶、2-氨基四氢嘧啶、2-氨基嘧啶和2-氨基嘧啶，其优选选自胍基和脒基。在一个实施方案中，侧链部分是如氨基酸亚基精氨酸(Arg)中的胍基。

在某些实施方案中，Y’亚基可以是连续的，因为在Y’亚基之间没有X’亚基干扰，或在X’亚基之间单独散布。在某些实施方案，连接亚基可以在Y’亚基之间。在一个实施方案中，Y’亚基是在转运蛋白的末端；在其他实施方案中，它们的侧翼是X’亚基。在另一优选实施方案中，每个Y’都是-C(＝O)-(CH₂)_n-CHR-NH-，其中n是2-7而R是H。例如，当n是5和R是H时，Y’是6-氨基己酸亚基，在本文中缩写成Ahx。在这些基团选定的实施方案中，每个X’都包含如精氨酸亚基的胍基侧链部分。优选的这类型肽包括包含与单个Y’亚基交替的精氨酸二聚体的那些肽，其中Y’优选是Ahx。实例包括具有式(RY’R)₄或式(RRY’)₄的肽，其中Y’优选是Ahx。在后面的情况中，核酸类似物优选与末端Y’亚基相连，优选在C-末端，例如如图1B和1C所示。优选的连接体具有AhxB结构，其中Ahx是6-氨基己酸亚基而B是β-丙氨酸亚基。

相对于不存在连接的转运部分时寡聚体的摄取，和相对于缺乏疏水亚基Y’的连接的转运部分的摄取，上述的运输部分表现出极大地增强所连接寡聚体进入细胞。相对于缺乏亚基Y’的连接的转运部分对试剂的摄取，在哺乳动物细胞对化合物的摄取上，这种增强摄取被证明优选增加至少2倍，优选增加4倍。相对于非偶联化合物，摄取优选增强至少20倍，更优选40倍。

转运部分的另一优势在于其稳定反义化合物与其靶核酸序列之间双链体的预期能力，推测借助于带正电的转运部分和带负电的核酸之间的静电作用。如上所述，转运蛋白中带电亚基的数目小于14，优选8-11之间，因为太高数目的带电亚基可导致序列特异性降低。

使用富含精氨酸的肽转运蛋白(即细胞穿透肽)特别可用于实施本发明。已经证明某些肽转运蛋白可非常有效地将反义化合物送递至初级细胞(primary cell)包括肌肉细胞中(Marshall，Oda et al。2007；Jearawiriyapaisarn，Moulton et al。2008；Wu，Moulton et al。2008)。而且，与其他肽转运蛋白例如Penetratin和Tat肽相比，本文所述的肽转运蛋白，当与反义PMO偶联时，表现出增强的改变几个基因转录物的剪接的能力(Marshall，Oda et al。2007)。特别优选的是下表3所列的P007、CP06062和CP04057转运肽(分别是SEQ ID NOS：573、578和577)。

示例性的肽转运蛋白，包括连接体(B或AhxB)在内，在下表B中给出。优选的序列是称为CP06062(SEQ ID NO：578)、P007(SEQ ID NO：573)和CP04057(SEQ ID NO：577)的序列。

表B.用于细胞内送递PMO的示例性肽转运蛋白

制剂

在某些实施方案中，本发明提供了适宜于治疗送递本文所述反义寡聚体的制剂和组合物。因此，在某些实施方案中，本发明提供了药物可接受的组合物，其包含治疗有效量的一种或多种本文所述寡聚体，所述寡聚体与一种或多种药物可接受载体(添加剂)和/或稀释剂配制在一起。尽管可以单独给予本发明的寡聚体，但优选以药物制剂(组合物)给予所述化合物。

送递核酸分子的方法描述于例如Akhtar et al.，1992，Trends Cell Bio.，2：139；和Delivery Strategies for Antisense Olionucleotide Therapeutics，ed.Akhtar；Sullivan et al.，PCT WO 94/02595中。这些或其他方案可用于送递实际上任何核酸分子，包括本发明的分离的寡聚体。

如下文所详述的，本发明的药物组合物可特别地制剂成用于固体或液体形式给药，包括适用于以下的那些：(1)口服给药，例如兽用顿服药(drench，水性或非水性溶液或悬浮液)，片剂，如靶向颊、舌下和全身吸收的那些片剂，大药丸，粉剂，颗粒，应用于舌头的糊剂(paste)；(2)通过皮例如下、肌肉内、静脉内或脑膜注射肠胃外给药，例如无菌溶液或悬浮液，或持续释放的制剂；(3)局部应用，例如作为应用于皮肤的乳剂、膏剂(ointment)，或控制释放的贴剂或喷雾；(4)经阴道或直肠的，例如阴道栓剂、乳剂或泡沫；(5)舌下的；(6)经眼睛的；(7)经皮的；或(8)经鼻的。

术语“药物可接受的”在本文用于表示，在合理医学判断范围之内，适宜用于与人类和动物组织接触且无过量毒性、炎症、过敏反应或其他问题或并发症，具有合理的优势/风险比的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。

本文所用的术语“药物可接受的载体”表示药物可接受的物质、组合物或媒介，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制备辅剂(如润滑剂、云母、硬脂酸镁、钙或锌，或硬脂酸)，或溶剂封装物质，参与将主题化合物从一个器官，或身体一部分携带或转运至另一器官，或身体其他部分。每个载体在与制剂的其他成分相容的意义上必须是“可接受的”且对患者无害。

可作为药物可接受的载体的物质的一些实例包括但不限于：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)云母；(8)赋形剂，例如可可油和栓蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)乙二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热源水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙基醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；和(22)药物制剂中所用的其他非毒性相容物质。

适宜与本发明反义寡聚体一起配制的试剂的其他非限制性实例包括：PEG偶联的核酸，磷脂偶联的核酸，含亲脂部分的核酸，硫代磷酸酯，可以增强药物进入多种组织的P-糖蛋白抑制剂(例如Pluronic P85)；生物可降解聚合物，例如植入后持续释放送递的聚(DL-乳酸-钴乙交酯)微球(Emerich，DF et al.，1999，Cell Transplant，8，47-58)Alkermes，Inc.Cambridge，Mass.；和装载的纳米微粒，例如由聚丁基氰基丙烯酸酯制成的纳米微粒，其可送递药物穿过血管脑屏障并改变神经元吸收机制(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，23，941-949，1999)。

本发明特征还在于包含含有聚(乙烯乙二醇)脂质的表面修饰脂质体(PEG-修饰的、分支和不分支或其组合，或长循环脂质体或隐形脂质体)的用途。本发明的寡聚体也可包含多种分子量的共价连接的PEG分子。这些制剂提供了增强药物在靶组织中累积的方法。这类药物载体抵抗单核噬菌体系统(MPS或RES)的调理和清除，由此实现封装药物更长的血液循环时间和增强的组织暴露(Lasic et al.Chem.Rev.1995，95，2601-2627；Ishiwata et al.，Chem.Pharm.Bull.1995，43，1005-1011)。已经表明，这些脂质体选择性地累积于肿瘤中，推测这借助于溢出和捕获于新血管形成的靶组织中(Lasic et al.，Science 1995，267，1275-1276；Oku et al.，1995，Biochim.Biophys.Acta，1238，86-90)。特别是与已知在MPS组织中累积的常规阳离子脂质体相比，长循环脂质体增强DNA和RNA的药代动力学和药物效力学(Liu et al.，J.Biol.Chem.1995，42，24864-24870；Choi et al.，International PCT Publication No.WO 96/10391；Ansell et al.，International PCT Publication No.WO 96/10390；Holland et al.，International PCT Publication No.WO 96/10392)。基于它们避免在代谢活跃的MPS组织例如肝和脾中累积的能力，与阳离子脂质体相比，长循环脂质体也可能更大程度地保护药物免受核酸酶降解。

在另一实施方案中，本发明包括制备用于送递的寡聚体组合物，如美国专利第6,692,911号、第7,163,695号和第7,070,807号所述。在这方面，在一个实施方案中，本发明提供了在含有如美国专利第7,163,695号、第7,070,807号和第6,692,911号所述的赖氨酸和组氨酸(HK)共聚物的组合物中的本发明寡聚体，其是单独的或与PEG(如分支或不分支的PEG或两者的混合)组合，与PEG和靶向部分组合或前述任何与交联剂的组合。在某些实施方案中，本发明提供了在包含葡萄糖酸修饰的聚组氨酸或葡萄糖化-聚组氨酸/运铁蛋白-聚组氨酸的组合物中的反义寡聚体。本领域技术人员也应当认识到，组合物内具有与His和Lys类似特性的氨基酸可被取代。

本文所述寡聚体的某些实施方案可含有碱性功能基团，例如氨基或烷氨基，因而能够与药物可接受的酸形成药物可接受的盐。在这方面，术语“药物可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒性的无机和有机酸加成盐。这些盐可在给药媒介或剂型制备过程中原位制备，或通过使纯化的本发明化合物以其游离碱性形式与适宜的有机或无机酸个别反应，并分离在后续纯化期间所形成的酸来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、二硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡萄糖庚酸盐、乳糖酸盐和十二烷基磺酸盐等等(参见如Berge et al.(1977)“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.66：1-19)。

主题寡聚体的药物可接受的盐包括所述化合物的常规无毒性盐或季铵盐，如来自无毒性有机酸或无机酸。例如，这些常规无毒性盐包括衍生于无机酸的盐，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磺胺酸、磷酸、硝酸等；和由有机酸的制备盐，所述有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯基乙酸、谷氨酸、苯甲酸、脂环酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸、草酸、异硫酸等制备的盐。

在某些实施方案，本发明的寡聚体可含有一个或多个酸性功能基团，因而其能够与药物可接受的碱形成药物可接受的盐。在这些情况中，术语“可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒性的无机和有机碱加成盐。这些盐同样可在给药媒介或剂型制备过程中原位制备，或通过使纯化的化合物以其游离的酸形式，与诸如药物可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或重碳酸盐的适宜的碱，与氨，或与药物可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺个别反应，来制备。代表性碱性或碱土盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。(参见如Berge et al.，同上)。

润湿剂、乳化剂和润滑剂，例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、隔离剂、包衣、甜味剂、风味剂和增香剂、防腐剂和抗氧化剂，也可存在于组合物中。

药物可接受抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、丙基五倍子酸盐、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

本发明制剂包括适宜口服、鼻、局部(包括颊和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外给药的那些制剂。制剂可便利地存在于单位剂型中并通过药物领域公知的任何方法制备。可与载体物质组合产生单剂型的活性成分的量会根据要治疗的宿主、具体给药模式而变化。可与载体物质组合产生单剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。通常，在百分率中，该量的范围通常为约0.1％-99％的活性成分，优选约5％-70％，最优选约10％-30％。

在某些实施方案中，本发明制剂包含选自环状糊精、纤维素、脂质体、诸如胆汁酸的胶束形成剂和诸如聚酯和聚酸酐的聚合载体的赋形剂；和本发明的寡聚体。在某些实施方案中，前述制剂使本发明的寡聚体是口服生物有效的。

制备这些制剂或组合物的方法包括使本发明寡聚体与载体和任选的一种或多种辅助成分结合的步骤。通常，制剂是通过以下制备：使本发明化合物与液体载体或精细固体载体或两者均匀且密切地结合，然后如果需要使产物成型。

适宜口服给药的本发明制剂可以是胶囊、药包(cachet)、丸剂、片剂、糖锭(使用风味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉剂、颗粒形式或作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水液体乳剂，或作为酏剂或糖浆，或作为锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口剂等，每个都含有预定量的本发明化合物作为活性成分。本发明寡聚体也可以作为大药丸、舔剂或贴剂给药。

在用于口服给药的本发明固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣片、粉剂、颗粒、trouches等)中，活性成分可与一种或多种诸如柠檬酸钠或磷酸二钙的药物可接受的载体和/或任何以下物质混合：(1)填充剂或增补剂例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)润湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂-琼脂、碳酸钙，马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂例如石蜡；(6)吸收加速剂，例如季铵化合物和表面活性剂，例如泊洛沙姆和月桂基硫酸钠；(7)润湿剂，例如十六烷基醇、单硬脂酸甘油酯和非离子表面活性剂；(8)吸收剂，例如高岭土和皂粘土；(9)润滑剂，例如云母、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙烯二醇、月桂基硫酸钠、硬脂酸锌、硬脂酸钠、硬脂酸以及其混合物；(10)着色剂；和(11)控释剂，例如交聚维酮(crospovidone)或乙基纤维素。在胶囊/片剂和丸剂的情况下，药物组合物也可包含缓冲剂。相似类型的固体组合物也可用作软和硬壳胶囊的填充剂，其使用如乳糖或奶糖类以及高分子量聚乙烯二醇等的赋形剂。

通过任选地与一种或多种辅助成分压缩或成型可制备片剂。压缩片剂的制备可使用粘合剂(如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉羟乙酸钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性或分散剂。成型片剂可通过在适宜机械中将用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物成型进行制备。

本发明药物组合物的片剂和其他固体剂型，例如糖衣片，胶囊和颗粒可任选地与包衣和壳例如肠溶衣和药物制剂领域公知的其他包衣压痕或制备。它们也可使用例如提供期望释放特征的不同比例的羟丙基甲基纤维素、其他聚合基质、脂质体和/或微球体配制，以便提供其中活性成分的缓释或控释。它们可制剂成快速释放，如冻干。它们可以通过细菌保持过滤器(bacteria-retaining filter)过滤或者通过并入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂可在使用前立即溶解于无菌水或一些其他无菌可注射介质中。这些组合物也可任选含有遮光剂(opacifying agent)，可以是这样的组合物：其任选地以延迟方式的组合物仅释放活性成分，或优选在胃肠道的某些部分中。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。活性成分可以是微胶囊形式，如果适合，与一种或多种上述赋形剂一起的微胶囊形式。

用于口服给予本发明化合物的液体剂型包括药物可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水，或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙基醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别是，棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，及其混合物。

除了惰性稀释剂，口服组合物也可含有佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、风味剂、着色剂、增香剂和防腐剂。

悬浮液除了活性化合物之外还可含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨聚糖酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、皂粘土(bentonite)、琼脂-琼脂和黄蓍胶，及其混合物。

用于直肠或阴道给药的制剂可以呈现为栓剂，其可通过将一种或多种本发明化合物与一种或多种适宜的包含例如可可油、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸的无刺激赋形剂或载体混合而制备，所述栓剂在室温下是固体，但在体温下为液体，因此会在直肠或阴道腔内融化并释放活性化合物。

用于局部或经皮肤给予本文所提供的寡聚体的制剂或剂型包括粉剂、喷雾、膏剂、糊剂、乳剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。活性寡聚体可以在无菌条件下与药物可接受的载体，和与任何必需的防腐剂、缓冲剂、推进剂混合。除本发明活性化合物之外，膏剂、糊剂，乳剂和凝胶可含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、皂粘土、硅酸、云母和氧化锌，或其混合物。

除本发明活性寡聚体之外，粉剂和喷雾可含有赋形剂，例如乳糖、云母、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰氨粉末，或这些物质的混合物。喷雾可额外含有常规推进剂，例如氯氟代烃，和挥发性非取代烃，例如丁烷和丙烷。

经皮贴剂具有控制送递本发明寡聚体至身体的额外优势。这种剂型可通过将寡聚体溶解或分散在适当介质而制备。吸收增强剂可也用于增加试剂穿过皮肤的流动。除了本领域已知其他方法外，这种流动的速度还可以通过提供速度控制膜或将试剂分散在聚合物基质或凝胶中来控制。

适宜胃肠外给药的药物组合物可包含一种或多种本发明寡聚体和一种或多种药物可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳化液，或在使用前马上复原成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，可注射溶液或分散液可以含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预定受体的血液等渗的的溶质或悬浮或增稠剂。可用于本发明药物组合物的适宜的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适宜混合物，植物油，例如橄榄油，和可注射有机酯，例如油酸乙酯。通过使用包衣物质，例如卵磷脂，通过在分散液的情况下维持必要的颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以维持适当流动性。

这些组合物也可含有佐剂例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。预防微生物对主题寡聚体的作用，可通过包含多种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等来确保。也可期望将等渗剂，例如糖、氯化钠等包含于组合物中。此外，通过包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射药物形式的延长吸收。

在一些情况中，为了延长药物效果，期望减缓皮下或肌肉注射的药物的吸收。除了本领域已知的其他方法外，这可以通过使用具有弱水溶性的结晶或无定形物质的液体悬浮液来实现。药物的吸收速度随后取决于其溶解速度，而溶解速度反过来取决于晶体大小和结晶形式。可选地，胃肠外给予的药物形式的延迟吸收可通过将药物溶解或悬浮在油媒介中来实现。

可注射的贮库(depot)形式可通过在生物可降解聚合物例如聚乳酸-聚乙二醇中形成主题寡聚体的微胶囊基质来制备。根据寡聚体和聚合物的比例，以及所用特定聚合物的特性，可以控制寡聚体释放速度。其他生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯(orthoester))和聚(酸酐)。贮库可注射制剂也可通过将药物陷入与身体组织相容的脂质体或微乳剂来制备。

当本发明寡聚体作为药物给予人和动物时，它们可以给予本身或作为药物组合物给予，所述药物组合物含有例如与药物可接受载体组合的0.1-99％(优选10-30％)的活性成分。

如上所述，本发明制剂或制品可以口服、胃肠外、局部或直肠给予。它们以适宜每种给药途径的形式给予。例如，它们以片剂或胶囊形式通过注射、吸入、眼睛洗剂、膏剂、栓剂等给药，通过注射、输注或吸入；通过洗剂或膏剂局部给药；和栓剂直肠给药。

本文所用的短语“胃肠外给药(parenteral administration)”和“胃肠外给药(administered parenterally)”表示除肠和局部给药外的给药模式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。

本文所用的短语“全身给药”，“全身地给药”，“外周给药”和“外周地给药”表示除了向中枢神经系统直接给药外，化合物、药物或其他物质的给药，例如皮下给药，以便它进入患者全身，因而进行代谢和其他类似过程。

无论所选给药途径，以适宜水合形式使用的本发明寡聚体，和/或本发明药物组合物可以通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药物可接受的剂型。本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平是可以变化的，以便获得对于特定患者、组合物和给药模式而言有效实现期望治疗反应且对患者无不可接受毒性的活性成分的量。

选定的剂量水平会取决于多种因素，包括所用的本发明具体寡聚体或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，所用具体寡聚体的排泄或代谢速度，吸收速度和吸收程度，治疗持续时间，与所用的具体寡聚体组合使用的其他药物、化合物和/或物质，所治疗患者的年龄、性别、体重、疾病状况、整体健康和先前病历，以及医学领域公知的类似因素。

具有本领域普通技术的医生或兽医可容易地确定和规定所需要的药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以比所需的水平低的水平开始药物组合物中所用的本发明化合物的剂量，以便实现期望治疗效果并逐渐增加剂量直至实现期望效果。通常本发明化合物适宜的每日剂量是该化合物有效产生治疗效果的最低剂量。这种有效剂量通常取决于上述因素。通常，当用于指定效果时，对于患者而言，本发明化合物的口服、静脉内、脑室内和皮下剂量是每天每千克体重约0.0001mg至约100mg。

如果期望，活性化合物的有效每日剂量可以在全天，任选地以单位剂型，作为以适当间隔单独给予的两个、三个、四个、五个、六个或更多亚剂量给予。在某些情况下，每天进行一次剂量给药。在某些实施方案中，按照需要每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月进行一次或多次剂量给药，以维持功能性肌营养不良蛋白的期望表达。

核酸分子可通过熟悉本领域的人所已知的多种方法给予细胞，包括但不限于如本领域已知和本文所述的通过电离子渗透法，或通过并入其他媒介，例如水溶胶，环状糊精，生物可降解纳米胶囊，和生物粘附微球封装在脂质体内。在某些实施方案中，微乳化技术可用于改善亲脂性(不溶于水)药剂的生物有效性。实例包括Trimetrine(Dordunoo，S.K.，et al.，Drug Development and Industrial Pharmacy，17(12)，1685-1713，1991 and REV 5901(Sheen，P.C.，et al.，J Pharm Sci 80(7)，712-714，1991)。除了其他优势外，微乳化还提供了通过优选将吸收定向至淋巴系统而非循环系统增强的生物有效性，这由此绕过肝并防止化合物在肝胆循环中被破坏。

在本发明的一个方面，制剂含有本文提供的寡聚体和至少一种两性载体所形成的微团，其中该微团的平均直径小于约100nm。更优选的实施方案提供了平均直径小于约50nm的微团，还更优选的实施方案提供了平均直径小于约30nm，或甚至小于约20nm的微团。

尽管考虑了所有适宜两性载体，但目前优选的载体通常是具有公认安全(GRAS)状态的那些两性载体，并且其能够溶解本发明的化合物并在当溶液开始与复合水相(complex water phase，例如在人胃肠道所发现的)接触的稍后阶段将其微乳化。通常，满足这些要求的两性成分的HLB(亲水比亲脂平衡值)为2-20，它们的结构含有C-6至C-20的直链脂族基。实例是聚乙烯-乙二醇化的脂肪酸甘油酯和聚乙二醇。

两性载体实例包括饱和和单不饱和聚乙烯乙二醇化脂肪酸甘油酯，例如由完全或部分氢化的多种植物油获得的那些。这类油优选由三、双和单脂肪酸甘油酯和相应脂肪酸的双和单聚乙烯乙二醇酯组成，特别优选的脂肪酸组成包括癸酸4-10、癸酸3-9、月桂酸40-50、肉豆蔻酸14-24、棕榈酸4-14和硬脂酸5-15％。另类一可用的两性载体包括部分酯化的山梨聚糖和/或山梨醇，具有饱和或单不饱和脂肪酸(SPAN系列)或相应的乙氧基化类似物(TWEEN系列(TWEEN-series))。

特别可用的是商购可获得的两性载体，包括Gelucire系列、Labrafil，Labrasol或Lauroglycol(都是由Gattefosse Corporation，Saint Priest，France制造和销售)、PEG-单-油酸酯、PEG-双-油酸酯、PEG-单-月桂酸酯和双-月桂酸酯、卵磷脂、聚山梨醇酯80等(USA和全世界的许多公司都生产和销售)。

在某些实施方案中，送递可通过使用脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等进行，用于将本发明组合物导入适宜的宿主细胞内。特别是，本发明组合物可配制用于通过封装在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球、纳米颗粒等进行送递。制剂和这种送递媒介的使用可使用已知和常规技术实施。

适宜用于本发明的亲水性聚合物这样的亲水性聚合物：其易溶于水，可以共价连接于形成囊泡的脂质上，并且在体内可以是耐受的且无毒性作用(即是生物相容的)。适宜的聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(也称为聚交酯)、聚乙醇酸(也称为聚乙醇酸交酯)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇。在某些实施方案中，聚合物的分子量是约100或120道尔顿，高达约5000或10000道尔道，或约300道尔道至约5000道尔道。在其他实施方案中，聚合物是分子量为约100至约5000道尔道，或约300至约5000道尔道的聚乙二醇。在某些实施方案中，聚合物是750道尔道的聚乙二醇(PEG(750))。聚合物也可以由其中单体数目来定义；本发明的优选实施方案利用至少约3个单体的聚合物，这种PEG聚合物由三个单体(约150道尔道)组成。

适宜用于本发明的其他亲水聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基恶唑啉(polymethoxazoline)、聚乙基恶唑啉(polyethyloxazoline)、聚羟丙基甲基丙烯酰胺(polyhydroxypropyl methacrylamide)、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺(polydimethylacrylamide)和衍生纤维素，例如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。

在某些实施方案中，本发明的制剂包含生物相容的聚合物，其选自以下组：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃(polyalkylene)、丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物、聚乙烯聚合物、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚亚安酯及其共聚物、纤维素、聚丙烯、聚乙烯，聚苯乙烯、乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚(原)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(乳酸-钴-己内酯)、多糖、蛋白、聚透明质酸、聚氰基丙烯酸酯和它们的掺合物、混合物或共聚物。

环状糊精是由分别称为希腊字母α、β或γ的6、7或8个葡萄糖单元组成的环状寡糖。葡萄糖单元通过1，4糖苷键连接。作为糖单元椅型构象的结果，所有仲羟基(在C-2，C-3)都位于环的一侧，而在C-6的所有伯羟基都位于另一侧。结果，外部面是亲水性的，使得环状糊精是水溶性的。相反，环状糊精的腔内是疏水性的，因为它们通过C-3和C-5原子的氢和通过酯样的氧而连接。这些基质实现了与多种相对疏水性化合物的复合，包括例如类固醇化合物，例如17α-雌二醇(参见如van Uden et al.Plant Cell Tiss.Org.Cult.38：1-3-113(1994))。由范德华相互作用和形成氢键实现复合。环状糊精化学性质的概览参见Wenz，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.，33：803-822(1994)。

环状糊精衍生物的物化特性强烈地取决于取代的种类和程度。例如它们在水中的溶解度从不溶(如三乙酰-β-环状糊精)至147％的可溶(w/v)(G-2-β-环状糊精)。此外，它们可溶于许多有机溶剂。环状糊精的特性使得可通过增加或减少它们的溶解度来控制多种制剂成分的溶解度。

许多环状糊精及其制备方法已有描述。例如Parmeter(I)，et al.(U.S.Pat.No.3,453,259)和Gramera，et al.(U.S.Pat.No.3,459,731)描述了电中性环状糊精。其他衍生物包括具有阳离子特性的环状糊精[Parmeter(II)，U.S.Pat.No.3,453,257]、不溶的交联环状糊精(Solms，U.S.Pat.No.3,420,788)和具有阴离子特性的环状糊精[Parmeter(III)，U.S.Pat.No.3,426,011]。具有阴离子特性的环状糊精衍生物中，羧酸、亚磷酸(phosphorous acid)、三价膦酸、膦酸、磷酸、硫代膦酸、硫代磺酸和磺酸可附加在母环状糊精上[参见Parmeter(III)，supra]。而且，Stella，et al.描述了硫烷基醚环状糊精衍生物(美国专利第5,134,127号)。

脂质体由至少一种密封水性内部空间的脂质双层膜组成。脂质体的特征在于膜类型和大小。小单层囊泡(small unilamellar vesicles，SUVs)具有单层膜，其直径通常在0.02-0.05μm之间；大单层囊泡(large unilamellar vesicles，LUVs)通常大于0.05μm。几层大囊泡和多层大囊泡具有多层通常同中心膜层，并且通常大于0.1μm。具有几个非同中心膜的脂质体即在较大囊泡中含有几个较小囊泡，被称为多囊泡囊泡。

本发明的一个方面涉及包含含有本发明寡聚体的脂质体的制剂，其中脂质体膜制剂成可提供携带性能增强的脂质体。可选地或另外，本发明化合物可包含在在脂质体的脂质体双层内或吸附在其上。本发明的寡聚体可用脂质表面活性剂聚集并在脂质体内部空间运载；在这些情况中，脂质体膜被制剂成可抵御活性剂-表面活性剂聚集体的破坏作用。

根据本发明的一个实施方案，脂质体的脂质双层含有用聚乙二醇(PEG)衍生的脂质，以便PEG链从脂质双层内表面延伸至被脂质体密封的内部空间，并从脂质双层的外部延伸至周围环境。

包含在本发明脂质体内的活性剂是溶解形式的。表面活性剂和活性剂(例如含有感兴趣活性剂的乳剂或微团)的聚集体可以陷入本发明所述脂质体的内部空间。表面活性剂的作用是分散和溶解活性剂，并可选自任何适宜的脂肪族、脂环族或芳族表面活性剂，包括但不限于生物相容的不同链长的溶血磷脂酰胆碱(LPCs)(例如从约C14至约C20)。聚合物衍生脂质，例如PEG-脂质，也可用于微团形成，因为它们的作用是抑制微团/膜融合，因为添加聚合物至表面活性剂分子减少了表面活性剂的CMC并辅助微团的形成。优选的是具有微摩尔范围的CMCs的表面活性剂；更高CMC表面活性剂可用于制备陷入本发明脂质体内的微团。

本发明所述脂质体可通过本领域已知的任何多种技术制备。参见如美国专利第4,235,871号、公开的PCT申请WO 96/14057、New RRC，Liposomes：A practical approach，IRL Press，Oxford(1990)，pages 33-104；Lasic DD，Liposomes from physics to applications，Elsevier Science Publishers B V，Amsterdam，1993。例如，本发明脂质体可通过将亲水性聚合物衍生的脂质扩散到预成型的脂质体内来制备，例如以对应于脂质体所需的衍生的脂质的最终摩尔百分比的脂质浓度，通过将预成型的脂质体暴露于由脂质接枝聚合物组成的微团。含有亲水性聚合物的脂质体也可通过本领域已知的均质、脂质场水合作用(lipid-field hydration)或挤压技术形成。

在另一示例性制剂程序中，首先通过在易于溶解疏水性分子的溶血磷脂酰胆碱或其他低CMC表面活性剂(包括聚合物接枝脂质)中通过超声处理分散活性剂。然后将制得的活性剂的微团悬浮液用于再水合干燥的脂质样品，所述干燥的脂质样品含有聚合物接枝脂质或胆固醇的适宜的摩尔百分比。然后使用本领域已知的挤压技术将脂质和活性剂悬浮液形成在脂质体，通过标准柱分离将所得的脂质体与未封装的溶液分离。

在本发明的一个方面，脂质体被制备成在选定大小范围内具有基本均匀的大小。一个有效的控制大小方法涉及挤压脂质体的水性悬浮液使其通过一系列具有选定的统一孔径的聚碳酸膜；膜的孔径大小会大致符合挤压通过该膜所产生的脂质体的最大大小。参见如美国专利第4,737,323号(1988年4月12日)。在某些实施方案中，诸如DharmaFECT

和Lipofectamine

的试剂可用于将多核苷酸或蛋白导入细胞。

本发明制剂的释放特征取决于封装物质、封装的药物的浓度、释放修饰剂的存在。例如，释放可操作成pH依赖性的，例如使用仅在低pH如在胃中或更高pH如在肠道中释放的pH选择性包衣。肠包衣可用于防止释放的发生，直至通过胃之后。封装在不同物质中的多包衣或氰胺混合物可用于获取胃中初始释放，之后在肠道的后期释放。也可通过包含盐或孔形成剂操作释放，它们可通过从胶囊扩散增强药物的水摄取或释放。修饰药物溶解度的赋形剂也可用于控制释放速度。也可以并入增强基质降解或从基质释放的试剂。根据化合物，它们也可添加至药物中，所添加的作为分离相(即微粒)，或共溶解在聚合物相中。在大部分情况中量应该介于0.1-30％(w/w聚合物)。降解增强剂的类型包括无机盐，例如硫酸铵和氯化铵；有机酸例如，柠檬酸、苯甲酸和抗坏血酸；无机碱，例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸锌和氢氧化锌；和有机碱，例如鱼精蛋白硫酸盐、精胺、胆碱、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；和表面活性剂，例如Tween

和Pluronic

。添加孔形成剂(即水溶性化合物例如无机盐和糖)，作为颗粒，其向基质添加微结构。范围通常为1％-30％(w/w聚合物)。

吸收也可通过改变颗粒在消化道中的驻留时间来操作。这可通过例如用或选择作为封装物质即粘膜粘附聚合物包被颗粒来实现。实例包括大部分具有游离羧基的聚合物，例如壳聚糖、纤维素，特别是聚丙烯酸酯(如本文所用的，聚丙烯酸酯是指包括丙烯酸酯基团和修饰的丙烯酸酯基团的聚合物，例如氰基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯)。

通过，寡聚体可配制成包含在外科手术或医学装置或植入物中，或适于通过外科手术或医疗装置或植入物释放。在某些方面，植入物可以包被或用寡聚体处理。例如，水凝胶或其他聚合物，例如生物相容和/或生物可降解聚合物，可以用于包被具有本发明组合物的植入物(即通过使用水凝胶或其他聚合物，组合物可适合与医疗装置一起使用)。用于包被具有试剂的医疗装置的聚合物和共聚物是本领域公知的。植入物的实例包括但不限于支架、药物洗脱支架、缝合线、假体、血管导管、透析导管、血管移植物、人工心脏瓣膜、心脏起搏器，可植入的心律转变器除颤器、IV针，用于骨骼框架和形成的装置例如针状物(pin)、螺钉(screw)、钢板(plate)和其他装置，以及用于创伤愈合的人工组织基质。

除了本文提供的方法之外，通过由其他药物类推，本发明所用的寡聚体可制剂成以任何常规方式给药，用于人和动物医学中。在肌营养不良的治疗中，反义寡聚体和它们相应的制剂可单独给药或与其他治疗策略组合给药，例如成肌细胞移植、干细胞治疗、氨基糖苷类抗生素给药、蛋白体抑制剂，和上调治疗(如上调肌营养不良蛋白相关蛋白，即肌营养不良蛋白的常染色体旁系同源物(paralogue))。

本说明书引用的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，就如单个出版物或专利申请特别且单独指出通过引用并入。

尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实例的方式对前述发明进行了一些详细描述，但在本发明的教导基础上，对本领域普通技术人员显而易见的是，可以对本发明做出某些变化和修饰而不偏离所附权利要求的实质或范围。仅通过说明性而非限制性方式提供了以下实施例。本领域技术人员应当容易地认识到可以变化或修饰许多非关键参数，以产生实质类似的结果。

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实施例

材料与方法

细胞和组织培养处理条件

以低传代数保存在5％DMSO溶液(Sigma)中的人横纹肌肉瘤细胞(ATCC，CCL-136；RD细胞)在37℃水浴中解冻，直至不再能看见冰银色(ice sliver)为止。将细胞以1.5x 10⁶细胞/烧瓶接种到组织培养处理的T75烧瓶(Nunc)内，烧瓶中含有24mL具有L-谷氨酰胺(HyClone)、10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素抗生素溶液(CelGro)的加热的DMEM；24小时之后，吸出培养基，并用加热的PBS将细胞洗涤一次，添加新鲜培养基。在37℃培养箱中，在5.0％CO₂下，使细胞生长至80％汇合。

从T75烧瓶中吸出培养基；用加热的PBS将细胞洗涤一次并吸出。在每个T75中添加于37℃水浴加热的3mL胰蛋白酶/EDTA。在37℃，将细胞孵育52-5分钟并温和振荡，直至它们从烧瓶中释放。将细胞悬浮液转移至15.0mL圆锥管中；用1.0mL胰蛋白酶/EDTA溶液洗涤烧瓶以收集剩余细胞。用Vi-细胞XR细胞计数器(Beckman Coulter)对细胞进行计数。以每孔2.0x 10⁵活细胞，将细胞接种在组织培养处理的12孔板(Falcon)中，每孔含有1.0mL培养基。细胞在37℃培养箱中于5.0％CO₂下，孵育过夜。

检查十二孔接种板的平坦细胞分布和板粘附。将冻干的肽偶联的磷酸二氨酯吗啉代寡聚体(PPMOs)以2.0mM重悬在无核酸酶的水(Ambion)中，在细胞处理期间保持在冰上；为了验证摩尔浓度，使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)，测量PPMOs。PPMO处理之前，直接吸出培养基，用加热的PBS洗涤细胞。用加热的培养基将PPMOs稀释至期望的摩尔浓度；以每孔总计1.0mL PPMO，处理细胞。检测PPMOs，一式三份。对于未处理的对照，添加1.0mL总体积的新鲜的加热的培养基。将细胞在37℃培养箱中于5.0％CO₂下，孵育48小时。

RNA提取

吸出培养基，用加热的PBS洗涤细胞。按照供应商的推荐方案用QuickGene-Mini80系统，QuickGene RNA培养的细胞HC试剂盒S，和具有陶瓷珠均质化的MagNAlyser提取RNA。简而言之，用350uL LRP(每100uL LRP添加10uLβ-巯基乙醇)的裂解缓冲液将细胞裂解在处理板中；温和研碎匀浆以确保完全裂解，并将其转移至MagNAlyser管中。在MagNAlyser中将管以2800rpm旋转30秒，以确保完全均质化，并短暂冰冻。添加50uL SRP增溶缓冲液并将匀浆涡旋60秒。每管添加170uL＞99％乙醇，并将匀浆涡旋60秒。将匀浆快速旋转并转移至Mini80RNA盒中，对样品加压并丢弃流通物。用750uL WRP洗涤缓冲液洗涤盒并加压。将40uL DNase(脱氧核糖核酸酶)溶液(1.25uL Qiagen DNasel，35uL RDD缓冲液，3.75uL无核酸酶水)直接添加至盒膜中；将盒在室温下孵育4分钟。用750uL WRP将盒洗涤两次，每次洗涤之后加压。将盒置于无核酸酶的管上。向每个膜添加50uL CRP的洗脱缓冲液；将膜在室温下孵育5分钟。对盒加压并收集洗脱物。将待定量的RNA存储在-80℃。使用NanoDrop^TM 2000分光光度计对RNA进行定量。

巢式RT-PCR

使用下表1所示的每个肌营养不良蛋白外显子的引物对组实施引物特异性、外显子特异性最佳巢式RT-PCR扩增。

表1.用于PCR扩增人肌营养不良蛋白mRNA 以检测外显子跳跃的引物对组

所示的引物对表示为分别对应初次或二次扩增的正向或反向(F/R)和外部或内部引物对(I/O)。引物靶标的位置表示在外显子栏中而目的表示可以检测的外显子跳跃事件。例如PS170和PS176引物在初次扩增中扩增外显子48-53区域。然后引物PS172和PS174在二次扩增中扩增外显子49-52区域。这种巢式PCR反应将检测外显子50和/或外显子51两者的外显子跳跃。特异性巢式RT-PCR反应条件提供于下文。

对于所有样品，将从处理的细胞中提取的RNA(如上所述)稀释成20ng/ul。

表2：RT-PCR和初次扩增的反应设置(50ul反应)

2x反应混合物	25μl
		PS XXX正向引物(30μM)(参见表1)	0.5μl
PS XXX反向引物(30μM)(参见表1)	0.5μl
		Superscript III铂Taq混合物	2μl
模板RNA(20ng/μl)	10μl
		无核酸酶的水(50μl总体积)	12μl

表3：RT-PCR和初次扩增程序

表4：巢式二次扩增的反应设置(50ul反应)

表5：巢式二次扩增程序

凝胶电泳分析

每50微升巢式RT-PCR反应添加10微升5x Ficoll加样染料(loading dye)。将15微升PCR/染料混合物在10％TBE凝胶中于300伏特下运行30分钟。电泳之后，用diH₂O将凝胶洗涤至少一个小时，每30分钟换水。然后在Typhoon三变量模式成像系统(Typhoon Trio Variable Mode Imager，GE Healthcare)中扫描凝胶。对于外显子44跳跃，来自全长肌营养不良蛋白转录物的巢式RT-PCR产物是571bp，且423bp来自外显子44跳跃的mRNA(外显子44是148bp)。对于外显子45，来自全长肌营养不良蛋白转录物的巢式RT-PCR产物是571bp，且395bp来自外显子45跳跃的mRNA(外显子45是176bp)。对于外显子53，来自全长肌营养不良蛋白转录物的巢式RT-PCR产物是365bp，且153bp来自外显子53跳跃的mRNA(外显子53是212bp)。

通过与外显子跳跃产物相比较，测量全长PCR产物的带亮度对凝胶图像进行定量分析。在一些情况中，在固定PPMO浓度(如3微摩尔)下的跳跃百分比用于确定一系列PPMO诱导给定外显子的外显子跳跃的相对活性。在其他情况中，PPMO剂量范围用于处理细胞(如0.1、0.3、1.0、3.0和10微摩尔)，并根据每个浓度所诱导的跳跃百分比计算EC₅₀。

实施例1

外显子51扫描

设计并合成了一系列靶向人肌营养不良蛋白外显子51的重叠反义PPMOs，并用它们处理人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)或原代人骨骼肌细胞。该策略被称为“外显子扫描”并同样用于以下所述的其他几个肌营养不良蛋白外显子。使用CP06062肽(SEQ ID NO：578)和3′末端PMO连接将所有PPMOs合成为肽偶联的PMO(PPMO)。对于外显子51，制备了一系列26个PPMOs(SEQ ID NOS：309-311、314、316、317、319、321、323、324、326、327、329-331、333、335、336、338-345)，每个长度都为26个碱基，如图2A所示。通过在如上材料和方法所述的不同浓度下处理RD细胞，评估PPMOs的外显子跳跃效能。鉴别了3个有效诱导外显子跳跃的PPMOs(SEQ ID NOS：324，326和327)，并选定用于其他评估。RD细胞和原代人骨骼肌细胞的剂量范围实验用于确认这3个PPMO序列的相对效能。表明SEQ ID NOS：327最有效地诱导外显子51跳跃，如图2B和2C所示。

在如上所述，在RD细胞和原代人骨骼肌细胞中实施了SEQ ID NOS：327与其他靶向外显子51的反义序列相对效力的比较。使用CP06062肽(SEQ ID NO：578)，将所有评估的序列制备成肽偶联的PMOs。这允许直接比较反义序列的相对效力，而不必考虑反义化学性质或细胞送递。与SEQ ID NO：327相比的某些靶向外显子51的寡聚体的相对位置如图2D所示。如图2C所示，存在外显子跳跃效力的等级，SEQ ID NO：327是最有效的，与其他序列相比至少几倍。

实施例2

外显子50扫描

设计并合成了一系列靶向人肌营养不良蛋白外显子50的重叠反义PPMOs。对于外显子50，制备了一系列17个PPMOs(SEQ ID NOS：267、269、271、273、275、277、279、280、282和284-291)，每个长度都为25个碱基，如图3A所示。通过在如上材料和方法所述的不同浓度下处理RD细胞，评估PPMOs的外显子跳跃效能。鉴别了4个有效诱导外显子跳跃的PPMOs(SEQ ID NOS：277、287、290和291)，并选定用于其他评估。RD细胞的剂量范围实验用于确认这4个PPMO序列的相对效能。表明SEQ ID NOs：584(AVI-5656)和287(AVI-5038)最有效地诱导外显子50跳跃，如图3B所示。由剂量范围实验导出EC₅₀值，其代表当相对于含外显子50的mRNA所产生的PCR产物，50％的PCR产物来自缺乏外显子50的mRNA时的计算浓度。其他序列(参见如SEQ ID NOs：584和585分别对应WO2006/000057中的SEQ ID NOs：173和175)，AVI-5038(SEQ ID NO：287)相比，在RD细胞试验中，在诱导外显子跳跃活性方面，是等效的或更好的，如图3B所示。

实施例3

外显子53扫描

设计并合成了一系列靶向人肌营养不良蛋白外显子53的重叠反义PPMOs。对于外显子53，制备了一系列24个PPMOs(SEQ ID NOS：416、418、420、422、424、426、428、429、431、433、434、436、438-440和443-451)，每个长度都为25个碱基，如图4A所示。通过在如上材料和方法所述的不同浓度下处理RD细胞和原代人骨骼肌细胞，评估PPMOs的外显子跳跃效能。鉴别了3个有效诱导外显子跳跃的PPMOs(SEQ ID NOS：428、429和431)，并选定用于其他评估。RD细胞的剂量范围实验用于确认这3个PPMO序列的相对效能。表明SEQ ID NOS：429最有效地诱导外显子53跳跃，如图4B-F所示。但是，当与其他外显子53反义序列比较时，SEQ ID NOS：429被证明与H53A(+23+47)相同，其在WO2006/000057中列为SEQ ID NO：195而在本申请列为SEQ ID NO：609。将其他序列与SEQ ID NO：429进行比较，包括H53A(+39+69)和H53A(-12+10)(在WO2006/000057中分别列为SEQ ID NOs：193和199)和h53AON1(在美国申请第11/233,507号中列为SEQ ID NO：39)在内，本申请中分别列为SEQ ID NOs：608、611和610。使用CP06062肽(SEQ ID NO：578)将所有评估的序列制备成肽偶联的PMOs。这允许直接比较反义序列的相对效力，而不必考虑反义化学性质或细胞送递。如图4I和4G-H所示的，表明SEQ ID NO：429优于这四种序列中的每一种。

实施例4

外显子44扫描

设计并合成了一系列靶向人肌营养不良蛋白外显子44的重叠反义PPMOs。对于外显子44，制备了一系列PPMOs(SEQ ID NOS：1-20)，每个长度都为25个碱基，如图5A所示。通过在如上材料和方法所述的不同浓度下处理RD细胞，评估PPMOs的外显子跳跃效能。鉴别了5个有效诱导外显子跳跃的PPMOs(SEQ ID NOS：4、8、11、12和13)，并选定用于其他评估。RD细胞的剂量范围实验用于确认这5个PPMO序列的相对效能，如图5C-5H所示。表明SEQ ID NOS：8、11和12最有效地诱导外显子44跳跃，如图5H所示，SEQ ID NOS：12被证明是最有效的。

在RD细胞和人原代骨骼肌细胞中都进行了SEQ ID NOS：12与其他外显子44反义序列的比较。使用CP06062肽(SEQ ID NO：578)，将所有评估的序列制备成肽偶联的PMOs。这允许直接比较反义序列的相对效力，而不必考虑反义化学性质或细胞送递。

序列(SEQ ID NOS：600、601、602和603)与SEQ ID NOS：4、8、11和12的比对如图5B所示。在WO2006/000057中，SEQ ID NOS：601和603列为SEQ ID NOS：165和167。在WO2004/083446中列出了SEQ ID NO：602，其在美国申请第11/233,507号中列为SEQ ID NO：21。SEQ ID NO：600公开于2007年(Wilton，Fall et al.2007)。在RD细胞中的比较表明，SEQ ID NOS：602和603都优于SEQ ID NO：12(图5I)。但是，如图5J所示，在人原代骨骼肌细胞中，SEQ ID NO：12(8.86％外显子跳跃)优于SEQ ID NO：602(6.42％)。用SEQ ID NO：603实施了类以实验。

实施例5

外显子45扫描

设计并合成了一系列靶向人肌营养不良蛋白外显子45的重叠反义PPMOs。对于外显子45，制备了一系列22个PPMOs(SEQ ID NOS：21、23、25、27、29、31、32、34、35、37、39、41、43和45-53)，每个长度都为25个碱基，如图6A所示。通过在如上材料和方法所述的不同浓度下处理RD细胞和人原代骨骼肌细胞，评估PPMOs的外显子跳跃效能。鉴别了4个有效诱导外显子跳跃的PPMOs(SEQ ID NOS：27、29、34和39)，并选定用于其他评估。RD细胞的剂量范围实验用于确认这4个PMO序列的相对效能，如图6C-G所示，并总结在图6H中。SEQ ID NOs：49在这些实验中用作阴性对照。表明SEQ ID NOs：29和34最有效地诱导外显子45跳跃，如图6H所示。

在RD细胞和人原代骨骼肌细胞中都进行了SEQ ID NOS：34与其他外显子45反义序列的比较。使用CP06062肽(SEQ ID NO：578)，将所有评估的序列制备成肽偶联的PMOs。这允许直接比较反义序列的相对效力，而不必考虑反义化学性质或细胞送递。序列(SEQ ID NOS：604、605、606和607)与SEQ ID NOS：27、29、34和39的比对如图6B所示。在WO2006/000057中，SEQ ID NOS：604和607分别列为SEQ ID NOS：211和207。在美国申请第11/233,507号中SEQ ID NOS：605和606分别列为SEQ ID NO：23和1。在RD细胞中的比较表明，SEQ ID NOS：34优于评估的所有四种序列，如图6I所示。如上所述，在不同的人原代骨骼肌细胞群中实施了这些化合物的检测。

Sequence ID列表

使用DNA常见的核苷酸碱基符号A、G、C和T表示序列。其他反应化学制剂，例如2′-O-甲基，用U代替T。任何碱基可被次黄核苷(I)所取代，特别是在3个或多个G残基的一段序列中。

^*Ahx是氨基己酸而B是β-丙氨酸。

Claims

1.用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子44跳跃的组合物，包含

含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基的基本不带电的反义化合物，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，所述反义化合物包含选自SEQ ID NOS：1-20且能够与肌营养不良蛋白基因外显子44中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体的序列。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：8、11和12的序列。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述化合物与具有选自SEQ ID NOS：570-578的序列的富含精氨酸的肽偶联。

4.用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子45跳跃的组合物，包含

含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基的基本不带电的反义化合物，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，所述反义化合物包含选自SEQ ID NOS：21-76和612-624且能够与肌营养不良蛋白基因外显子45中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体结构的序列。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：27、29、34和39的序列。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：29和34的序列。

7.如权利要求4所述的组合物，其中所述化合物与具有选自SEQ ID NOS：570-578的序列的富含精氨酸的肽偶联。

8.用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子46跳跃的组合物，包含

含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基的基本不带电的反义化合物，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，所述反义化合物包含选自SEQ ID NOS：77-125且能够与肌营养不良蛋白基因外显子46中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体结构的序列。

9.如权利要求8所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：77-105的序列。

10.如权利要求9所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：82、84-87、90、96、98、99和101的序列。

11.如权利要求8所述的组合物，其中所述化合物与具有选自SEQ ID NOS：570-578的序列的富含精氨酸的肽偶联。

12.用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子47跳跃的组合物，包含

含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基的基本不带电的反义化合物，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，所述反义化合物包含选自SEQ ID NOS：126-169且能够与肌营养不良蛋白基因外显子47中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体结构的序列。

13.如权利要求12所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：126-149的序列。

14.如权利要求13所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：126、128-130、132、144和146-149的序列。

15.如权利要求12所述的组合物，其中所述化合物与具有选自SEQ ID NOS：570-578的序列的富含精氨酸的肽偶联。

16.用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子48跳跃的组合物，包含

含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基的基本不带电的反义化合物，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，所述反义化合物包含选自SEQ ID NOS：170-224和634且能够与肌营养不良蛋白基因外显子48中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体结构的序列。

17.如权利要求16所述的组合物，其中化合物含有选自SEQ ID NOS：170-201和634的序列。

18.如权利要求17的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：176、178、181-183、194和198-201的序列。

19.如权利要求16所述的组合物，其中所述化合物与具有选自SEQ ID NOS：570-578的序列的富含精氨酸的肽偶联。

20.用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子49跳跃的组合物，包含

含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基的基本不带电的反义化合物，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，所述反义化合物包含选自SEQ ID NOS：225-266且能够与肌营养不良蛋白基因外显子49中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体结构的序列。

21.如权利要求20所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：225-248的序列。

22.如权利要求21所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：227、229、234、236、237和244-248的序列。

23.如权利要求20所述的组合物，其中所述化合物与具有选自SEQ ID NOS：570-578的序列的富含精氨酸的肽偶联。

24.用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子50跳跃的组合物，包含

含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基的基本不带电的反义化合物，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，所述反义化合物包含选自SEQ ID NOS：267-308且能够与肌营养不良蛋白基因外显子50中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体结构的序列。

25.如权利要求24所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：277、287、290和291的序列。

26.如权利要求25所述的组合物，其中所述化合物含有由SEQ ID NOS：287组成的序列。

27.如权利要求24所述的组合物，其中所述化合物与具有选自SEQ ID NOS：570-578的序列的富含精氨酸的肽偶联。

28.用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子51跳跃的组合物，包含

含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基的基本不带电的反义化合物，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，所述反义化合物包含选自SEQ ID NOS：309-371且能够与肌营养不良蛋白基因外显子51中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体结构的序列。

29.如权利要求28所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：324、326和327的序列。

30.如权利要求29所述的组合物，其中所述化合物含有由SEQ ID NOS：327组成的序列。

31.如权利要求28所述的组合物，其中所述化合物与具有选自SEQ ID NOS：570-578的序列的富含精氨酸的肽偶联。

32.用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子52跳跃的组合物，包含

含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基的基本不带电的反义化合物，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，所述反义化合物包含选自SEQ ID NOS：372-415且能够与肌营养不良蛋白基因外显子52中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体结构的序列。

33.如权利要求32所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：372-397的序列。

34.如权利要求33所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：379-382、384、390和392-395的序列。

35.如权利要求32所述的组合物，其中所述化合物与具有选自SEQ ID NOS：570-578的序列的富含精氨酸的肽偶联。

36.用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子53跳跃的组合物，包含

含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基的基本不带电的反义化合物，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，所述反义化合物包含选自SEQ ID NOS：416-475和625-633且能够与肌营养不良蛋白基因外显子53中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体结构的序列。

37.如权利要求36所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：428、429和431的序列。

38.如权利要求37所述的组合物，其中所述化合物含有由SEQ ID NOS：429组成的序列。

39.如权利要求36所述的组合物，其中所述化合物与具有选自SEQ ID NOS：570-578的序列的富含精氨酸的肽偶联。

40.用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子54跳跃的组合物，包含

含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基的基本不带电的反义化合物，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，所述反义化合物包含选自SEQ ID NOS：476-519且能够与肌营养不良蛋白基因外显子54中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体结构的序列。

41.如权利要求40所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：476-499的序列。

42.如权利要求41所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：479-482、484、489和491-493的序列。

43.如权利要求40所述的组合物，其中化合物与具有选自SEQ ID NOS：570-578的序列的富含精氨酸的肽偶联。

44.用于在人肌营养不良蛋白预加工的mRNA的加工中产生外显子55跳跃的组合物，包含

含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基的基本不带电的反义化合物，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，所述反义化合物包含选自SEQ ID NOS：520-569和635且能够与肌营养不良蛋白基因外显子55中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体结构的序列。

45.如权利要求44所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：520-546和635的序列。

46.如权利要求45所述的组合物，其中所述化合物含有选自SEQ ID NOS：524-528、537、539、540、542和544的序列。

47.如权利要求44所述的组合物，其中所述化合物与具有选自SEQ ID NOS：570-578的序列的富含精氨酸的肽偶联。

48.治疗个体肌营养不良的方法，包括给予个体有效量的含有20-35个通过含磷亚基间连接而连接的吗啉代亚基的基本不带电的反义化合物，所述连接将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5’环外碳连接，所述反义化合物包含选自SEQ ID NOS：1-569和612-635且能够与肌营养不良蛋白基因外显子中的互补mRNA序列在所述化合物和mRNA之间形成Tm为至少45℃的异源双链体结构的序列，其中所述外显子选自外显子44-55。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述肌营养不良是杜兴肌营养不良(DMD)。

50.如权利要求48所述的方法，其中所述肌营养不良是贝克肌营养不良(BMD)。

51.如权利要求48所述的方法，其中所述序列选自SEQ ID NOS：1-20，且所述外显子是外显子44。

52.如权利要求48所述的方法，其中所述序列选自SEQ ID NOS：21-76和612-624，且所述外显子是外显子45。

53.如权利要求48所述的方法，其中所述序列选自SEQ ID NOS：77-125，且所述外显子是外显子46。

54.如权利要求48所述的方法，其中所述序列选自SEQ ID NOS：126-169，且所述外显子是外显子47。

55.如权利要求48所述的方法，其中所述序列选自SEQ ID NOS：170-224和634，且所述外显子是外显子48。

56.如权利要求48所述的方法，其中所述序列选自SEQ ID NOS：225-266，且所述外显子是外显子49。

57.如权利要求48所述的方法，其中所述序列选自SEQ ID NOS：267-308，且所述外显子是外显子50。

58.如权利要求48所述的方法，其中所述序列选自SEQ ID NOS：309-371，且所述外显子是外显子51。

59.如权利要求48所述的方法，其中所述序列选自SEQ ID NOS：372-415，且所述外显子是外显子52。

60.如权利要求48所述的方法，其中所述序列选自SEQ ID NOS：416-475和625-633，且所述外显子是外显子53。

61.如权利要求48所述的方法，其中所述序列选自SEQ ID NOS：476-519，且所述外显子是外显子54。

62.如权利要求48所述的方法，其中所述序列选自SEQ ID NOS：520-569和635，且所述外显子是外显子55。

63.如权利要求48所述的方法，其中所述序列包含SEQ ID NOS：287。

64.如权利要求48所述的方法，其中所述化合物与富含精氨酸的肽偶联。

65.如权利要求64所述的方法，其中所述富含精氨酸的肽包含选自SEQ ID NOS：570-578的序列。