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TWI483735B - 佐劑 - Google Patents

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TWI483735B
TWI483735B TW099114518A TW99114518A TWI483735B TW I483735 B TWI483735 B TW I483735B TW 099114518 A TW099114518 A TW 099114518A TW 99114518 A TW99114518 A TW 99114518A TW I483735 B TWI483735 B TW I483735B
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TW
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rlipo
protein
tlr2
sequence
cells
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TW099114518A
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TW201127399A (en
Inventor
Shih Jen Liu
Hsueh Hung Liu
Yan-Chak Kwok
Chih Hsiang Leng
Hsin Wei Chen
Pele Choi-Sing Chong
Original Assignee
Nat Health Research Institutes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Nat Health Research Institutes filed Critical Nat Health Research Institutes
Publication of TW201127399A publication Critical patent/TW201127399A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI483735B publication Critical patent/TWI483735B/zh

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Description

佐劑
本發明係關於脂肽或脂蛋白，特別是關於含有Ag473脂質化序列之脂肽或脂蛋白，以及其相關的組成物及相關的製造與使用方法。
 相關申請案
本發明為(A)美國專利申請案No.12/329,026(申請日為2008年12月5日，對於2007年12月7日提出申請之美國臨時申請案No.61/012,263主張優先權)；及(B)美國專利申請案No.12/331,576(申請日為2008年12月10日，對於2007年12月12日提出申請之美國臨時申請案No.61/013,206主張優先權)之部份延續發明。此等先申請案之內容皆以引用方式納入本文做為參考。
發明背景
疫苗接種被認為是用來預防病原體感染之最有效且最具效率的方式。然而，至今仍有許多感染性疾病尚無可利用的疫苗，或還未能達到足夠的免疫作用。此外，許多疫苗因為其效能太低、會產生嚴重副作用、穩定性低或是價格昂貴而不適用。因此，亟需研發出更有效的疫苗或相關試劑。
疫苗含有用以誘發保護性免疫反應之衍生自病原體的抗 原性物質，例如蛋白質。一般而言，經修飾之蛋白質(例如經脂質化之蛋白質)較未經修飾之蛋白質更具致免性。某些疫苗產品中之蛋白質係藉由使用重組技術在大腸桿菌中表現而製備得。但是，大腸桿菌通常被認為不適合用來製造經修飾之蛋白質，包括經脂質化之蛋白質。更特別地，大腸桿菌細胞將天然具有脂質化的蛋白質脂質化之執行力差，亦不會製造出呈現經脂質化形式之非天然具有脂質化的蛋白質。
本發明(至少一部份)係基於意外發現(1)一種Ag473之脂質化序列可促使具有該脂質化序列的融合蛋白進行脂質化作用；及(2)經脂質化之融合蛋白或其片段不僅本身具有高致免性，且能夠增強其他抗原的致免性。
前述之Ag473為一種腦膜炎雙球菌Neisseria Mengitidis 的脂質蛋白質，係由四個功能域(SP及功能域1-3)所組成。以下列示此蛋白質具有四個已確定功能域之胺基酸序列(SEQ ID NO：1)：
SP：SEQ ID NO：1中之胺基酸殘基1-17(SEQ ID NO：2)
功能域1：SEQ ID NO：1中之胺基酸殘基18-40(粗斜體標示，SEQ ID NO：3)
功能域2：SEQ ID NO：1中之胺基酸殘基41-71(粗體標示，SEQ ID NO：4)
功能域3：SEQ ID NO：1中之胺基酸殘基72-121(斜體標示，SEQ ID NO：5)
D1：SEQ ID NO：1中之胺基酸殘基1-40(SEQ ID NO：6)
D2：SEQ ID NO：1中之胺基酸殘基1-71(SEQ ID NO：9)
D3：SEQ ID NO：1中之胺基酸殘基1-121(SEQ ID NO：10)
於一方面，本發明特徵在於提供一種具有式(I)結構之脂肽、脂多肽或脂蛋白：
R1 、R2 與R3 其中一者為C14-20 烯基，且其他二者各別獨立地為C14-20 烷基或C14-20 烯基；X為長度1-100(例如，2-50、3-20或5-15)個胺基酸殘基之胺基酸序列。例如，R2 可為C14-20 烯基。R1 與R3 各別可為C14-20 烷基。於一項具體態樣，R2 為-(CH2 )7 -CH=CH-(CH2 )5 CH3 。而R1 與R3 各別為-(CH2 )14 CH3 。於另一項具體態樣，該脂肽或脂蛋白具有下列結構式：
尤其，該脂肽為：
X之N-端可與如式(I)所示與X相鄰的羰基基團連接。X之長度可具有3-20個胺基酸殘基。例如，X具有序列SQEAK或SQEAKQEVK(SEQ ID NO：7或8)。例如，該脂蛋白/脂肽可為Lipo-CSQEAK或Lipo-CSQEAKQEVK(SEQ ID NO：11或12)。
於一項具體態樣，R1 、R2 與R3 其中一者為C14-20 烯基，且其他二者各別獨立地為C16-20 烷基或C16-20 烯基。例如，R2 或R3 其中一者為C14-20 烯基，而R1 為C16-20 烷基。
術語“烷基”意指一種飽和、直鏈或支鏈烴部份。除非另行指定，其包括1-30個碳原子。烷基之實例包括(但不限定於)－(CH2 )13 CH3 、－(CH2 )15 CH3 、－(CH2 )17 CH3 及－(CH2 )19 CH3 。
術語“烯基”意指一種含有一、二、三或甚至三個以上雙鍵之直鏈或支鏈烴部份。除非另行指定，其包括2-30個碳原子。烯基之實例包括(但不限定於)－(CH2)7－CH=CH－(CH2)5CH3。
本文所述之烷基與烯基包括經取代與未經取代部份。可能的取代基包括(但不限定於)C3-20 環烷基、C3-20 環烯基、C3-20 雜環烷基、C3-20 雜環烯基、C1-10 烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、胺基、C1-10 烷基胺基、C1-20 二烷基胺基、芳基胺基、二芳基胺基、C1-10 烷基磺胺基、芳基磺胺基、C1-10 烷基亞胺基、芳基亞胺基、C1-10 烷基磺醯亞胺基、芳磺醯亞胺基、羥基、鹵基、硫基、C1-10 烷硫基、芳硫基、C1-10 烷磺醯基、芳磺醯基、醯基胺基、胺基醯基、胺基硫醯基、醯胺基、胍基、脲基、氰基、硝基、亞硝基、氮基、醯基、硫醯基、醯基氧基、羧基及羧酸酯。
本發明亦提供(1)一種包含或基本上由前述脂肽或脂蛋白組成的佐劑組成物，及(2)一種含有抗原與該脂肽或脂蛋白的免疫生成性組成物。本發明亦關於一種在個體內誘發免疫學反應之方法，其包含將抗原與該脂肽或脂蛋白投藥予有其需要的個體。
“個體”意指人類及非人類動物。非人類動物之實例包括所有脊椎動物，例如哺乳動物如非人類靈長類(特別是高等靈長類)、狗、囓齒類(例如小鼠或大鼠)、天竺鼠、貓及非哺乳動物如鳥類。於一項較佳具體態樣，該個體為人類。於另一項較佳具體態樣，該個體為實驗動物或適合做為疾病模式之動物。
本發明包含一種製備前述脂肽或脂蛋白之方法。該方法包括提供一宿主大腸桿菌細胞，其含有編碼具有脂質化序列之第一片段的蛋白質之核酸，該脂質化序列包括SEQ ID NO: 3或1、6、7、8、9或10之序列；將大腸桿菌宿主細胞於培養基中，於可使該蛋白質表現呈脂質化形式之條件下進行培養；以及將該蛋白質之脂質化形式從該細胞或該培養基中分離出。或者，可將該核酸於活體外進行轉錄及轉譯，例如使用T7啟動子調節序列與T7聚合酶，於得自(例如)大腸桿菌之細胞溶解產物中進行。一種例舉性脂質化融合蛋白(從N-端至C-端)可包括Ag473之SP與D1功能域(D1)，及登革熱病毒外膜蛋白功能域III(E3)。此重組脂質蛋白係命名為rlipo-D1E3。該方法可進一步包括將該蛋白質以蛋白酶處理，而產生脂肽(例如下列實施例中所述之lipo-Nter)的步驟。該核酸對於該細胞可為異源性的。
經分離的蛋白質、多肽或肽類意指實質上已不含在天然狀態下與其締合之分子，例如其純度至少達75%(亦即，任何介於75%至100%之數值)的重量百分比。可藉由任何適當的標準方法，例如藉由管柱層析術、聚丙烯醯胺凝膠電泳術或HPLC分析法來測量純度。經分離的肽、多肽或蛋白質可分離自天然來源、經由重組DNA技術製造，或是藉由化學方法製得。
術語“蛋白質”與“多肽”用於本文係可交替地用於描述任意胺基酸長鏈，而不論其鏈長或是否具有轉譯後修飾(例如糖基化或磷酸化)。因此，術語“本發明之多肽”包括：本發明全長、天然的蛋白質；經重組或合成方法製得之相當於本發明全長天然蛋白質的多肽；或該天然蛋白質的特殊功能域或部份。該術語亦包含具有所添加之胺基-末端甲硫胺酸(可用於在原核細胞中表現)的成熟多肽。肽意指其長度足夠以合成方式從連續胺基酸製得之短鏈。通常，肽之長度為50個胺基酸殘基或更短(例如長50、40、30、20、10或5個殘基)。
異源性多肽、核酸或基因係指其來源自外來物種者，或是(若物種相同)實質上從其原始形式經過修飾的。兩種經融合之功能域或序列，若彼等在其天然蛋白質或核酸狀態下不相鄰，則對彼等而言互相為異源性的。
於下述實施方式中進一步詳述本發明之一或多項具體實施態樣。本發明之其他特徵或優點將藉由下列圖式與實施例之詳述，以及亦自所附之申請專利範圍彰顯出來。
本發明係關於新穎的脂蛋白或脂肽類，其可用做為用以增強疫苗效能之佐劑。位於該等脂蛋白或脂肽類N-端之脂質部份係負責提供佐劑活性。該脂質部份可為二醯基或三醯基化脂質。
脂蛋白可利用一種脂質化序列製造得。術語“脂質化序列”意指一種非天然胺基酸序列，其(a)包括與Ag473之SP具有同一性至少達80%(85%、90%、95%或99%)之第一片段，及與Ag473之功能域1具有同一性至少達80%(85%、90%、95%或99%)之第二片段，該第一片段係位於該脂質化序列的N-端；且(b)有助於在大腸桿菌中將在其N-端帶有該脂質化序列之多肽或蛋白質(亦即，融合蛋白質)脂質化。於該脂質化序列中，第一片段係直接或經由連接肽而連接至第二片段。較佳地，此序列具有最大長度為40-100(例如，40-80)個胺基酸。於一項實例，本文中所描述之脂質化序列包括SP與功能域1。
如用於本文，兩種胺基酸序列之“同源性百分比”係使用經描述於Karlin與Altschul，Proc,Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268,1990之演算法(其修改描述於Karlin與Altschul，Proc,Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877,1993)而測定得。此種演算法被納入Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410,1990所述之NBLAST及XBLAST程式中。BLAST蛋白質搜尋係以XBLAST程式來執行，分數=50，字長=3，而獲得相對於參考多肽之序列同源性。為達比較目的而得到具有空隙之比對，遂使用如Altschul等人，於Nucleic Acids Res. 25:3389-3402,1997所述之具空隙BLAST(Gapped BLAST)。當利用BLAST與具空隙BLAST程式時，係使用該等各別程式(例如XBLAST與NBLAST)之不履行參數。參見，網站www.ncbi.nlm.nih.gov。
“肽”意指聚合物中之胺基酸殘基排列。肽可由標準20種天然胺基酸組成，此外亦可包含稀有胺基酸與合成的胺基酸類似物。“重組肽”意指藉由重組DNA技術製得之肽；亦即從經由編碼所希望肽之外源DNA構體轉形的細胞製得。“合成肽”意指藉由化學合成製得之肽。
前述之融合蛋白可以合成多肽或重組多肽之形式獲得。對於重組多肽之製備，可將編碼該多肽之核酸與另一編碼融合夥伴，例如谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、6x-His抗原表位標籤或M13基因3蛋白之核酸連接。可將經分離之融合蛋白進一步(例如)藉由酵素分解作用處理，以將融合夥伴移除而獲得本發明之重組脂蛋白或脂肽。
於本發明之一項具體態樣，係將前述所提及之脂質化序列連接至登革熱病毒cED III而形成一種融合蛋白質(rlipo-D1E3)，當其藉由習知重組技術在大腸桿菌中進行表現時，係呈脂質化形式。以下描述一種實例。將編碼脂質化序列之DNA片段與編碼登革熱病毒cED III之DNA片段，插入一種表現載體(其較佳地帶有強啟動子，例如T7、T5、T3或SP6)中，而構築得表現質體。該強啟動子可為可誘導性，例如可被異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導。接著將該表現質體導入大腸桿菌宿主菌株中，並將顯示為陽性之轉形株培養於適於蛋白質表現之條件下。較佳地，該大腸桿菌宿主菌株對於因過度表現外源性蛋白質所誘導的毒性作用具有抗性。此類大腸桿菌菌株可經由美國專利案號6,361,966中所描述之方法鑑定/產生。此等大腸桿菌菌株之實例包括(但不限定於)C43(DE3)(ECCC B96070445)、C41(DE3)(ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S(NCIMB 40885)及C2014(DE3)(NCIMB 40884)。
較佳地，係將經此所表現得之融合蛋白質從大腸桿菌宿主細胞分離出，並且經由該項技藝已知之方法，例如以抗-脂蛋白抗體進行之免疫轉漬法，或質譜分析法確認其脂質化狀態。
融合蛋白質可進一步進行蛋白酶處理，而產生較小的脂蛋白或肽類。此等脂蛋白或肽類可用於，用以在個體(例如人類個體)產生對抗各種抗原之免疫生成組合物(例如，疫苗)中做為佐劑。此類組成物可(例如)以下述之方法，或藉由該項技藝中已知之任何其他相等方法製備得。
分枝桿菌脂蛋白會影響先天與適應性免疫作用。彼等已顯示可誘導抗微生物活性，並經由類-Toll受體引發宿主防禦機制。而且，有數種分枝桿菌脂蛋白已證明是引起對抗分枝桿菌之體液與細胞免疫反應的重要誘導劑。除了引起免疫系統之活化作用以外，脂蛋白已經鑑定為結核分枝桿菌(M. tuberculosis )、豬鼻黴漿菌(Mycoplasma hyorhinis )及白密螺旋體(Treponema pallidum )的主要抗原。
布氏疏螺旋體Borrelia burgdorferi 之外表面蛋白(OspA)是一種Braun脂蛋白(BLP)。OspA為藉由脂質化N-端半胱胺酸而結合固定於膜上的31kDa單體蛋白質。已顯示，以全長OspA進行免疫能保護小鼠、狗及恆河猴對抗布氏疏螺旋體。然而，未脂質化OspA蛋白之保護作用並不完全，且不能引發對布氏疏螺旋體的保護性免疫(Bockenstedt等人1993,J Immunol 151: 900-906；Johnson等人1995,疫苗Vaccine 13: 1086-1094)。於1998年，重組脂蛋白OspA已獲得美國FDA核准為第一種疾病疫苗(LYMErix,SmithKline Beecham)。雖然OspA是一種有效的疫苗，但使用全長OspA做為疫苗有引起自體免疫反應危險之疑慮(Gross等人1998,科學Science 281: 703-706)，而且該疫苗已被停用。
除了OspA以外，已證明BLPs在將人類內皮細胞刺激成發炎表型方面，與脂多糖(LPS)具有相同活性。然而不像LPS，由BLP誘導之耐受性可保護小鼠對抗、活菌及多種微生物引發的致死性。反之，LPS耐受性只能提供對抗LPS致死效應的保護作用。
Braun已於1973年提出細菌蛋白具有N-醯基-S-二醯基甘油基-半胱胺醯基修飾。之後，已在所有細菌中鑑定出Braun脂蛋白(BLP)(Madan Babu與Sankaran 2002,生物資訊學Bioinformatics )，且其可為結構蛋白、酵素、受體或是在膜-水界面執行必要功能之載運蛋白。然而，有許多脂蛋白已在各種細菌中被鑑定出其失去N-端脂肪酸，而製造出二-醯基化脂質。二或三-醯基化脂蛋白已顯示能經由TLR2-介導之傳訊途徑活化免疫反應。TLR2可根據N-端脂肪酸鏈的長度及C-端胺基酸之電荷，與TLR1或TLR6形成雙體，表示細菌脂蛋白N-端部份之不同脂質構造會誘導不同層級的下游基因表現，並促使調節免疫反應。
大腸桿菌表現系統(包括各種變異株)已被廣泛用於製造同源及/或異源性蛋白質。然而，在具有趨異脂蛋白訊號肽之大腸桿菌中過度表現脂蛋白，往往會導致修飾不完全或是脂質部份完全缺失。差的脂質修飾作用可藉由將標靶基因與不同訊號肽融合來加以改善。此等方法可使脂蛋白之表現量增加到可被免疫轉漬法偵測到的程度，或可達到總體細胞蛋白質之3%。對於製造重組脂質化免疫原(脂質-免疫原)而言，能以高量過度表現脂蛋白仍然是一項挑戰與障礙。
為解決上述挑戰與障礙，本案發明人曾研發一種高產量之脂蛋白表現系統，並鑑定出一種必要的引導序列(參見美國申請案20090176273)。此表現系統被用來表現一種含有登革熱病毒外膜蛋白功能域3之異源性脂蛋白。
已製得此重組lipo-D1E3(rlipo-D1E3)蛋白，並針對其生物功能進行分析。所預期含有不飽和脂肪酸之N-端脂質結構，與得自已知細菌脂蛋白的不相同。脂質部份推定的結構含有一位於N-端位置之十六醯基部份、一醯基部份及一位於二醯基甘油殘基上之不飽和脂肪酸。rlipo-D1E3可活化由骨髓衍生之樹突細胞，而增加細胞激素(IL-1α、IL-23與IL-27)及趨化激素(MIP α與MCP)RNA轉錄產物。不同的基因表現情形可反應出不同的免疫調節效應。
如本文所述，rlipo-D1E3(lipo-Nter)之N-端部份係藉由以胰蛋白酶分解，並使用液相層析術進行純化而獲得。純化得之lipo-Nter經發現能夠活化由骨髓衍生之樹突細胞，並經由TLR2活化NF-κB傳訊作用。於lipo-Nter存在下，以突變型(或去毒性)HPV E7蛋白免疫小鼠可增強體液(抗體力價)及細胞免疫反應(抗-腫瘤效應)。亦發現，lipo-Nter可增加CTL抗原表位肽(衍生自HPV E7蛋白)之抗-腫瘤功效，其抗-腫瘤功效較合成型三棕櫚醯基脂肽強。此等數據顯示經純化之lipo-Nter可用做為增強抗原-特異性體液及細胞免疫作用的佐劑。換言之，經純化之N-端片段可用做為增進抗體力價及細胞毒性T淋巴細胞殺害作用的佐劑。
意外發現，rlipo-D1E3之脂質部份含有佐劑活性。甚至更意外地，rlipo-D1E3之經純化N-端可與有潛能的疫苗候選劑組合，而增強T或B細胞免疫反應。因此，本發明特徵在於提供一種含有重組脂蛋白或其N-端脂質部份的佐劑。
關於製造本發明之脂蛋白/多肽，可將宿主細胞於培養基中，於使能表現得由本發明之核酸所編碼的融合蛋白/多肽之條件下進行培養，並將該融合蛋白/多肽從培養細胞或細胞培養基中純化出。或者，將本發明之核酸於活體外進行轉錄及轉譯，例如使用T7啟動子調節序列與T7聚合酶，於得自(例如)大腸桿菌之細胞溶解產物中進行。該脂質化融合蛋白(從N-端至C-端)可包括Ag473之D1功能域，及登革熱病毒外膜蛋白功能域III。可藉由使用胰蛋白酶分解該rlipo-D1E3，然後使用逆相液態層析術(LC)進行純化而獲得N-端脂質部份。經發現LC方法能夠分離得，使用線上質量分析時差異14原子質量單位(Atomic mass unit;amu)的脂肽。
此前述之脂質化蛋白/肽可與醫藥上可接受之載體，例如磷酸鹽緩衝食鹽水、碳酸氫鹽溶液混合而製得佐劑組成物。用於本文，“佐劑”意指添加於致免性組成物或疫苗中以增加該致免性組成物或疫苗之免疫生成性的物質。術語“疫苗”意指任何欲投藥予個體，以在該個體內產生或以人工方式增加對特定疾病之免疫反應。疫苗之實例包括下述記載者。
本發明之佐劑可用於增強對於疫苗調配物中某一抗原之免疫反應。本發明之佐劑可與衍生自任何細菌或任何病毒之抗原合用，條件為該抗原不會被破壞或變性。佐劑亦可用於其含有如美國專利5,616,328及5,084,269所述之抗原的疫苗組成物。其可用於與任何會引起體液與/或細胞介導之免疫反應的物質結合，例如可與活病毒、細菌或寄生蟲抗原；經去活化之病毒、由腫瘤衍生的、原生生物的、由生物體衍生的、真菌的或細菌的抗原、類毒素、毒素；自身抗原；多醣類；蛋白質；醣蛋白；肽類；細胞疫苗；DNA疫苗；重組蛋白質等；用於與(例如)BCG、霍亂、鼠疫、傷寒、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、A型流感、B型流感、副流感、小兒痲痹、狂犬病、痲疹、耳下腺炎、德國痲疹、黃熱病、破傷風、白喉、嗜血型流感b、結核病、與肺炎球菌疫苗、腺病毒、HIV、雞痘病毒、細胞巨大病毒、登革熱病毒、貓白血病、禽類瘟疫、HSV-1與HSV-2、豬霍亂、日本腦炎、呼吸道融合病毒、輪狀病毒、乳突狀瘤病毒、黃熱病毒及阿滋海默氏症連結。特別地，諸如不會引起強烈免疫反應之重組蛋白質、醣蛋白與肽類可用於與本發明之佐劑結合。
於某些具體態樣，抗原可為癌症抗原或腫瘤抗原。術語癌症抗原及腫瘤抗原可相互交換，且意指由癌細胞差異性表現之抗原。因此，癌症抗原可利用於差異性靶定對抗癌細胞之免疫反應。癌症抗原可因此有效刺激腫瘤-專一性免疫反應。某些癌症抗原可能係由正常細胞編碼(雖然實際上並不表現出來)。此等抗原中有些可經確定為在正常細胞中是正常緘默型(亦即不被表現)，有些只在某些分化階段被表現，而有些則暫時性表現(例如胚胎與胎兒抗原)。其他癌症抗原可由諸如致癌基因(例如經活化之ras致癌基因)、抑制因子基因(例如突變型p53)等突變型細胞基因編碼，或為由於內部缺失或染色體易位造成之融合蛋白質。又有些其他癌症抗原可由病毒基因，例如該等由RNA及DNA腫瘤病毒攜帶之基因編碼。
腫瘤抗原之實例包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽醯基肽酶IV(DPPUV)、腺苷脫胺酶-結合蛋白(ADAbp)、親環素(cyclophilin) b、結直腸相關抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其抗原決定肽CAP-1與CAP-2、etv6、aml1、前列腺專一性抗原(PSA)及其抗原決定肽PSA-1、PSA-2與PSA-3、前列腺專一性膜抗原(PSMA)、T-細胞受體/CD3-仄他鏈、腫瘤抗原之MAGE-家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGEA12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3,MAGE-C4、MAGE-C5)、腫瘤抗原之GAGE-家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪胺酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-鈣黏附素(cadherin)、α-連環素(catenin)、β-連環素、γ-連環素、p120ctn、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性瘜肉(Adenomatous polyposis coli)蛋白(APC)、胞襯蛋白、連接蛋白(Connexin)37、Ig-個體遺傳型、p15、gp75、GM2與GD2神經節苷、病毒產物例如人類乳頭狀瘤病毒蛋白、腫瘤抗原之Smad家族、Imp-1、P1A、EBV-編碼之核抗原(EBNA)-1、腦肝醣磷酸酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-1與CT-7及c-erbB-2。
癌症或腫瘤及專一性腫瘤相關抗原包括(但不限定於)急性淋巴生成性白血病(etv6、aml1、親環素b)、B細胞淋巴瘤(Ig-個體遺傳型)、神經膠瘤(E-鈣黏附素、α-連環素、β-連環素、γ-連環素、p120ctn)、膀胱癌(p21ras)、膽囊癌(p21ras)、乳癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、子宮頸癌(p53、p21ras)、結腸癌(p21ras、HER2/neu、cerbB-2、MUC家族)、結直腸癌(結直腸相關抗原CRC)-CO17-1A/GA733、APC)、絨毛膜癌(CEA)、上皮細胞癌(親環素b)、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733醣蛋白)、肝細胞癌(α-胎蛋白)、哈金氏淋巴癌(Imp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ESO-1)、淋巴細胞衍生之白血病(親環素b)、黑色素瘤(p5蛋白、gp75、癌胚胎抗原、GM2與GD2神經節苷、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gp100)、骨髓瘤(M UC家族、p21ras)、非小細胞肺癌(HER2/neu、cerbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(M UC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌(前列腺專一性抗原(PSA)及其抗原決定肽PSA-1、PSA-2與PSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733醣蛋白)、腎癌(HER2/neu、c-erbB-2)、頸與食道之鱗狀細胞癌(病毒產物例如人類乳突狀瘤病毒蛋白)、睪丸癌(NY-ESO-1)及T細胞白血病(HTLV-1抗原表位)。
本發明之佐劑可用於欲免疫動物之疫苗調配物中。因此，本發明之範圍包含一種含有抗原劑與佐劑之免疫生成性或疫苗組成物。該佐劑含有前述的脂蛋白/肽，且一旦經投藥至個體後，可增強該個體對於該抗原劑之免疫反應。術語“免疫生成性”意指可在宿主動物中產生對抗一或多種抗原之能力。此免疫反應形成由對抗特定感染性生物體之疫苗引起的保護性免疫作用之基礎。“免疫反應”意指一種於動物體內引發之反應，其可指細胞性免疫作用(CMI)；體液免疫作用或該二者。“抗原劑”、“抗原”或“免疫原”意指於宿主動物體內誘發特異性免疫反應之物質。抗原可含有完整生物體(已殺死、經減弱或活的)；生物體之一次單位或部分；含有一免疫生成特性插入物的重組載體；能夠在展示於宿主動物時誘導免疫反應之DNA片段；蛋白質、多肽、半抗原或其任意組合。另供選擇地，該免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。術語“動物”包括所有脊椎動物(包含人類)。尤其，術語“脊椎動物”包括(但不限定於)人類、犬類(例如狗)、貓類(例如貓)、馬類(例如馬)、牛類(例如牛)、豬類(例如豬)以及鳥類。術語“鳥類”意指任何在分類學上歸屬於鳥綱之各種或次種，例如(但不限定於)雞類(繁殖雞、嫩雞與蛋雞)、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、鸚鵡、雀類、鷹及走禽類包括鴕鳥、食火鳥與食火雞。
於一項具體態樣，疫苗調配物含有本發明之佐劑與一抗原。疫苗調配物中所含各組成之最適比例可由技術師決定，且為習於該項技藝者已熟知者。
疫苗調配物可自身，或可呈醫藥或治療組成物之形式投藥予個體。包含本發明佐劑與抗原之醫藥組成物可藉由習知混合、溶解、粒化、包覆糖衣、磨光、乳化、膠封、固陷或凍乾等方法製得。醫藥組成物可以習知方法，使用一或多種有助於將本發明之抗原加工成，可於製藥上使用的製劑之生理學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或輔助劑。依所選擇之投藥途徑而決定適合的調配物。
為本發明申請案之目的，“生理學上可接受之載體”包含其對於人類或動物用途是可接受，而不會產生相對上有害之副作用(相對於受治療之病況)的載體，以及同樣是可接受之稀釋劑、賦形劑或輔助劑。載體必須為“可接受的”亦意指，其可與組合物中之活性成份相容，且較佳地，能夠使活性成份安定，而不會對受治療個體產生有害影響。載體係以投藥模式與途徑，以及標準製藥操作為基礎而進行選擇。適宜之醫藥載體與稀釋劑，及供彼等使用之必需品，係經描述於雷明頓氏製藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)中。於一項實例，係將融合蛋白質與佐劑混合而形成可用於免疫調節之組成物。此組成物可製備呈可注射液，呈液態溶液或乳液。參見，美國專利案4,601,903；4,599,231；4,599,230及4,596,792。
全身性調配物包括該等經設計用於經由注射(例如，皮下、真皮內、肌肉內或腹膜內注射)投藥者。用於注射，可將疫苗製劑可調配於水溶液，較佳地於生理學上可相容之緩衝液，例如漢克氏(Hanks's)溶液、林格氏(Ringer's)溶液、磷酸鹽緩衝食鹽水或任何其他生理食鹽水緩衝液中。溶液可含有調配劑例如懸浮劑、安定劑及/或分散劑。或者，蛋白質可呈用以於使用前與適合載劑(例如滅菌無熱原水)建構之粉末形式。
決定疫苗調配物用於投藥之有效量，係屬習於該項技藝者的能力範圍內，特別是按照本說明書所載之詳細揭露。有效劑量最初可由活體外分析進行評估。例如，可於動物模式中調配劑量，以達到使用該項技藝已熟知之技術來誘發免疫反應。該項技藝中具有通常知識者可基於本文所述之結果，容易地決定最適用於所有物種的投藥方式。可個別判斷使用劑量與間隔時間。例如，當使用做為疫苗時，本發明之疫苗調配物可以1至3次劑量投藥達1-36週。較佳地，投藥1或2次劑量，間隔約3週至約4個月，之後可定期施予追加疫苗注射。交替投藥方式可適用於個別動物。疫苗調配物之適宜劑量為當如前述方式投藥時，能夠在受免疫動物體內引發足以保護該動物不受感染達至少4至12個月之免疫反應的量。一般而言，一劑型中所存在之抗原量係介於約1pg至約100mg每公斤宿主，代表性地係從約10pg至約1mg，且較佳地係從約100pg至約1μg。適宜之劑量範圍將隨著注射途徑及患者大小而改變，但是代表性地係介於約0.1mL至約5mL。
該佐劑組成物中亦可包括其他佐劑。佐劑之實例包括(但不限定於)霍亂毒素、大腸桿菌熱不安定性內毒素、脂質體、免疫刺激複合體(ISCOM)、免疫刺激性序列寡去氧核苷酸及氫氧化鋁。組成物亦可包括有助於活體內遞送之聚合物。參見Audran R.等人，疫苗 21:1250-5,2003；及Denis-Mize等人Cell Immunol. 225:12-20,2003。
前述之任一醫藥組成物可非經腸道地，例如藉由皮下注射或肌肉內注射進行投藥。或者，可希望其他投藥形式包括栓劑與口服調配物。對於栓劑，可包括黏著劑與載體，例如聚烷二醇類或三酸甘油酯類。口服調配物可包括正常使用之賦形劑，例如製藥級糖精、纖維素、碳酸鎂等類。此等組成物採取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或粉末之形式。
前述之融合蛋白可用於免疫生成性組成物(例如疫苗)，以供在個體中產生對抗某一抗原之抗體與免疫反應。疫苗可以與該劑量調配物相容的方式，及以治療上有效、具保護性且可產生免疫作用之量進行投藥。所投藥的量取決於欲受治療之個體，例如包括該個體之免疫系統合成抗體，及(若需要)產生細胞介導之免疫反應的能力。活性成份所需投藥之確切量係視專業醫師的判斷而定。然而，適宜之劑量範圍可由習於該項技藝者容易地，且可依照本發明多肽之微生物決定。適用於最初投藥及追加劑量之療程亦為可變，但可包括最初投藥與接著之後續投藥。疫苗之劑量亦可視投藥途徑而定，且根據宿主的大小而變化。
組合物之劑量係(例如)取決於特定多肽/蛋白質、是否有共投藥額外的佐劑、共投藥佐劑之類型、投藥型式與頻率，誠如習於該項技藝者可決定的。若需要可由習於該項技藝者決定是否重複投藥。可自該個體採集血清或T-細胞，以供測試由對抗所興趣抗原之組成物引發的免疫反應。對抗某一蛋白質或感染之抗體或細胞毒性T細胞的分析方法為該項技藝已熟知者。若需要可給予額外追加劑量。藉由改變多肽/蛋白質含量、組成物劑量及投藥頻數，可將免疫程序最適化以引發最大免疫反應。於大規模投藥之前，可希望測試其有效性。於有效性測試中，可藉由口服或非經腸道途徑將本發明組成物投藥予非人類個體(例如，小鼠、大鼠、兔子、馬、豬、牛或猴子)。經過最初投藥或視需要的追加投藥後，可將測試個體與對照組個體(接受偽裝投藥)以所興趣抗原進行挑戰，來測試該組成物之效能。
以下之特別實施例僅為例舉說明，並非意欲以任何方式限制本發明揭示之其餘部份。無需進一步詳細描述，據相信習於該項技藝人士可基於本文中之描述，利用本發明至其最完全程度。所有於本文中引用之公開文獻，皆以其完整性以引用方式納入。而且，下述所提出之機轉不應以任何方式限制本發明的範圍。
實施例1
於本實施例，係使用TLR2剔除(TLR2-/-)小鼠與TLR4-缺陷小鼠，研究具有本質佐劑特性之原型登革熱疫苗脂質-免疫原(rlipo-D1E3)的效應物機轉與傳訊途徑。吾等之結果顯示，rlipo-D1E3係經由TLR2(而非經由TLR4)活化抗原展示細胞，且由rlipo-D1E3介導之傳訊途徑啟動亦與其他二種TLR2促動劑(Pam3及MALP-2衍生物雙醯氧基丙半胱胺酸(BPPcysPEG))的類似(Basinski等人(2007) Int Arch Allergy Immunol 142,91-8)。令人感興趣地，吾等發現經刺激之抗原展示細胞會較Pam3及BPPcysPEG誘發更高的細胞激素與趨化激素之基因表現。此等數據指出，促動劑之不同脂質部份可能誘發不同的細胞激素或趨化激素表現以調節免疫反應。
材料與方法 試劑
所有化學品皆購自(聖路易市,MO)或(Darmstadt,德國)化學公司。限制酶與接合酶係購自新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs,Inc.)(Beverly,MA)。用於選殖之引子得自Mission生物科技公司(台北，台灣)。胰蛋白酶係購自Promega公司(Madison,WI)，而用於質譜分析之基材亦購自Promega公司(Madison,WI)。合成肽S-[2,3-雙十六醯氧基-[2R]-丙基-[R]-半胱胺醯基-醯胺基聚乙二醇(BPPcysPEGdef1375;BPPcysPEG)係由M. Klein博士(AmVac,瑞士)慷慨贈與，而Pam3CSK4(N-十六醯基-S-[2,3-雙十六醯氧基丙基]半胱胺醯基-SKKKK)(Pam3)係購自InvivoGen(San Diego,CA)。NF-κB-依賴性啟動子螢火蟲螢光素酶係由S.-F.黃博士(國家衛生研究院(NHRI),台灣)慷慨贈與。pRL-TK(固有性地表現Renilla螢光素酶之質體)係購自Promega公司(Madison,WI)，而質體phTLR2flag係購自Addgene(Cambridge,MA)。
細胞株與小鼠
HEK293細胞(一種人類胚胎腎細胞株)係培養於補充以10% FBS、1% PS之DMEM培養基。TLR4-缺陷小鼠(C3H/HeJ)與TLR2剔除小鼠係購自Jackson實驗室，並豢養於NHRI之動物中心。C57BL/6與C3H/HeN係購自台灣國家動物中心。所有研究皆經過NHRI之學院動物照護與使用委員會准許。
重組脂質-免疫原及非脂質化免疫原之製造
以登革熱病毒外膜蛋白(E3)之一致功能域III為基礎，如陳等人(2009)Vaccine 27,1400-1409及Leng等人(2009)Microbes and Infection 11,288-295所述之方法，製備得重組脂質化E3免疫原(rlipo-D1E3)及其非脂質化E3(rE3)對應物。簡言之，將E3基因(單獨或已與編碼SEQ ID NO: 1中胺基酸殘基1-40之脂質化訊號DNA序列(SEQ ID NO: 6)融合)選殖入載體pET-22b(+)中，並將其於大腸桿菌C43(DE3)或BL21(DE3)中進行表現。藉由固定化金屬親和性層析術(IMAC)將rlipo-D1E3及rE3純化出，而於所得二製劑中的脂多醣(LPS)殘餘量皆可忽略(<3EU/mg)。
質譜分析
對於Pam3樣本之分析，係取1μl與等體積之溶於乙腈(ACN)/0.1%三氟乙酸(TFA) 1:3(vol/vol)中之α-氰基-4-羥基肉桂酸標準溶液(Sigma,St. Louis,MO)混合。將一微升混合物置於標的平盤上以供進一步分析。將經純化之rE3與rlipo-D1E3對25mM碳酸氫銨(pH 8.5)進行透析。將經透析之樣本與胰蛋白酶(Promega Co.,Madison,WI)以50:1(wt/wt)之比例混合於25mM碳酸氫銨(pH 8.5)中。令反應於室溫下持續進行2分鐘，然後藉由添加甲酸(終濃度為1.2%)而終止反應。將經胰蛋白酶分解之肽裝入已經過100% ACN洗滌並以0.1% TFA預先平衡之ziptip吸管尖中。將ziptip吸管尖經由吸管吸取數次逐滴以0.1% TFA、70% ACN/0.1% TFA、100% ACN/0.1% TFA及100% ACN沖洗。然後使用5ul 100%異丙醇將經胰蛋白酶分解之片段溶析出，並於溶析後調整濃度至50%異丙醇。將一微升溶析出之片段與CHCA基質混合，並使用MALDI-TOF-TOF質譜儀(Bruker AutoFlex III smartbeam TOF/TOF200,Bruker Daltonics公司,Billerica,MA)
脾細胞增生分析
將取自C57BL6、TLR4-缺陷3H/HeJ或TLR2剔除(TLR2-/-)小鼠之脾細胞以2 x105/孔之濃度懸浮於96-孔平盤中，並於37℃,5% CO2下於增濕培養箱中以脂肽或脂蛋白刺激48小時。於最後24小時培養期間，將1 μCi之[3H]-胸嘧啶加至各孔以測量DNA合成，再用FilterMate自動細胞收集器(Packard,Meriden,CT)收取細胞。於TopCount微量平盤閃爍計讀機(Packard,Meriden,CT,USA).中測定併入的放射活度。該項分析納入LPS(0.01μg/ml)做為陽性對照組。所有結果皆以平均cpm±標準偏差(SD)值表示。
骨髓-衍生之樹突細胞(BM-DCs)之製備
BM-DCs之收取方法如Lutz等人(1999)免疫學方法月刊Journal of Immunological Methods 223,77-92所述。簡言之，將6-8週齡雌性小鼠之股骨與脛股取出，並將骨髓細胞藉由吸管劇烈吸放而分散。待以溶解緩衝液去除紅血球後，將分離之骨髓細胞以補充青霉素(100U/mL,Sigma,St Louis,MO)、鏈霉素(100μg/ml,Sigma)、L-谷胺酸(2mM,Sigma)、巰基乙醇(50μM,Sigma)及10%熱去活化FBS之RPMI-10: RPMI-1640(GIBCO BRL,Grand Island,NY)再懸浮使密度達2－5×105 細胞/ml。於第0、3及6天，將骨髓細胞加至含有200U/mL(20ng/ml)溶於RPMI-10之重組粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(MoGM-CSF,Peprotech,Rocky Hill,NJ)的培養皿中。於第6天，將所指定濃度之LPS、rE3、rlipo-D1E3或CpG加入。通常，不成熟的樹突細胞至多佔總細胞族群之70%。使用流式細胞計量術於FACSCalibur(BD生物科學,Franklin Lakes,NJ)針對經閘控的CDllc+ 細胞族群分析其細胞表面標記之增量調節。
細胞激素ELISA分析
使用ELISA測定由BM-DC進行之細胞激素製造。將BM-DCs培養於單獨培養基，或補充有LPS(100nM)、rlipo-D1E3(100nM)、Pam3(100nM)或CpG(10μg/mL)之培養基中。經過24-hr培育後，收取上清液並使用ELISA分析(a) TNF-α、(b) IL-6及(c) IL-12(p40)。簡述之，係將100μL抗-細胞激素(10μg/ml之IL-6、IL-12p40、TNF-α)抗體(R&D system Inc. Minneapolis,MN)與0.1M碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)覆蓋於96-孔微量平盤上，隨後於4℃下培育過夜。將經覆蓋之平盤以0.05% Tween 20之PBS溶液清洗兩次，然後以存於PBS之5%脫脂牛奶於室溫下進行封阻2小時。將得自經刺激之BM-DC的稀釋懸浮液加至有覆蓋之孔中，於室溫下靜置2小時。接著添加生物素-共軛之抗-細胞激素抗體(R&D system Inc. Minneapolis,MN)後，將該分析以3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)進行顯色，並藉由於每孔中添加100μl 1M H2 SO4 終止反應。將平盤於450nm下使用ELISA計讀機中(Molecular Devices,CA)讀取吸光值。將所得之值與未經刺激組所得之值相減，而計算出細胞激素的製造量。
NF-kB螢光素酶報告蛋白分析
將HEK293細胞平佈於24-孔平盤上(2 x 105細胞/孔)，並以0.1μg之pFLAG-TLR2、0.01μg之pNF-kB-luc及0.01μg之pRL-TK內在對照組質體(Promega,Madison,WI)使用脂轉染胺lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)進行共轉感染。經24小時後，將細胞溶解以使能利用雙-螢光素酶報告蛋白分析系統(Promega Co.,Madison,WI)測量螢光素酶活性。為達正常化之目的，將螢火蟲-螢光素酶活性與Renilla螢光素酶活性相關連。螢火蟲與螢光素酶活性皆使用Berthold Orion II發光計(Pforzheim,德國)進行監測。
西方轉漬分析
將BM-DC於不含FBS之DMEM或RPMI培養基中生長16-18小時，然後以100nM所指定的脂肽或脂蛋白於37℃下刺激10、20、40、60、90或120分鐘。然後將此等經處理之BM-DC於25mM HEPES、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、10%甘油、1% Triton X-100、10mM焦磷酸鈉、20mM b-甘油磷酸酯、Na3 VO4 、10mM NaF、10mg/ml亮抑蛋白酶肽及1mM PMSF中進行溶解。使用BCA蛋白質分析套組(Pierce,Rockford,IL)測定溶解產物之蛋白質濃度。以10% SDS-PAGE凝膠之每行加樣五十微克溶解產物進行電泳分析。將於凝膠中經解析之溶解產物轉移至PVDF膜後，將該膜以5%牛奶及0.05% Tween-20進行封阻。將膜與對抗p38、pp38、pERK 1/2或pJNK 1/2之抗體於5% w/v BSA(溶於1 x PBS與0.1% Tween-20)中進行培育。抗-p38抗體係用做為各行蛋白質加樣量之對照組。將膜使用LumiGLO化學發光受質系統(Millipore,Billerica,MA)顯色。以(pp38之密度/p38之密度)計算相對磷酸化作用。
基因表現之即時定量PCR(qPCR)分析
使用Dynabeads小鼠DC富集套組(Invitrogen Dynal AS,Oslo,Norway)根據製造商之指示，將BM-DCs純化至純度達60至90%。將經純化之BM-DCs使用單獨培養基，或含有100nM之Pam3、BPPcysPEG或rlipo-D1E3的培養基於37℃下進行刺激2或4小時。使用RNeasy小量套組(Qiagen,Valencia,CA)依照製造商之指示，從分離之細胞萃取出總體RNA。使用寡-dT引子於20μl體積及SuperScript III RT(Invitrogen,Caflsbad,CA)中將RNA(0.5-1μg)反轉錄成cDNA。使用小鼠通用探針庫(UPL)組(Roche,Mannheim,德國)進行即時qPCR分析，以檢測分離細胞族群中之基因表現(劉等人(2007) J Leukoc Biol 82,354-360)。所使用之特定引子與UPL數係列示於下表。
表1.　用於藉由即時PCR進行之RNA分析的UPL數與引子序列。所列序列為用於由即時PCR偵測所指定基因產物而設計之序列。
反應混合物含有5ng cDNA、0.2μM引子與LightCycler 480 Probe Master(Roche)，且試劑係於LightCycler 480系統(Roche)中進行反應。所有皆係使用於95℃進行10分鐘之最初變性步驟，接著45次含於95℃進行10秒、於60℃進行20秒及於72℃進行2秒之循環而完成。將標靶基因表現對HPRT基因表現正常化。藉由將經過各種刺激處理後之表現量與單獨使用培養基處理所得之表現量進行比較，而計算出相對基因表現程度。對於比較各種刺激間的基因表現，係將對照組(單獨培養基)之基因表現程度設定為1。
統計學分析
使用Student之t-試驗測定各實驗組間的統計學上差異顯著性。若p值＜0.05，則被認為在統計學具有顯著差異。
結果 rlipo-D1E3與Pam3之脂質部份不相同
藉由質譜分析鑑定出rlipo-D1E3的三個主要脂質修飾(陳等人(2009) Vaccine 27,1400-1409)。為能獲得更多有關該等脂質修飾之資訊，遂進一步將rlipo-D1E3之胰蛋白酶分解片段純化出，並以MS/MS光度計進行分析。計算Pam3及rlipo-D1E3純化片段中脂質部份之質量，以分析彼等脂質部份間的差異。Pam3之分子量為1509.6，且經MS/MS分析後可鑑定出y-離子(參見圖2a)。因此，Pam3之脂質-半胱胺醯基殘基的質量為892.2原子質量單位(amu)，確定Pam3之脂質部份係十六醯基-3-半胱胺醯基(SNO6C54H102)。另一方面，從經純化之rlipo-D1E3胰蛋白酶分解片段鑑定出五個具有m/z值為1452.1、1466.1、1480.1、1494.1及1502.1之主要高峰(參見圖2b)。除了具有值為1502.1之高峰以外，經MS/MS分析後均測定得y-離子(參見圖2c-2f)。於m/z 1452.1、1466.1、1480.1及1494.1高峰中之脂質-半胱胺醯基殘基的質量分別為890、904、918及932amu。對於m/z 1452.1高峰，脂質-半胱胺醯基殘基之質量分別為890amu，較Pam3的少2amu。此暗示，其脂質部份中存在有一雙鍵。而且，rlipo-D1E3之其餘高峰增加14amu，表示雖然有數個脂質修飾，彼等皆在其脂質部份中含有一雙鍵。此等數據明顯證明，rlipo-D1E3的脂質部份可能具有各種與Pam3不同之脂質修飾。
rlipo-D1E3經由TLR2刺激脾臟細胞增生
使用TLR2-/-與TLR4-缺陷小鼠來研究rlipo-D1E3之效應物機轉。因為脂肽已顯示可刺激脾臟細胞增生，吾等遂從野生型、TLR2-/-及TLR4-缺陷小鼠分離出脾臟細胞，並將其以LPS(一種TLR4促動劑)、Pam3(一種TLR2促動劑)、rlipo-D1E3及非脂質化E3(rE3)刺激。吾等發現，LPS、Pam3與rlipo-D1E3能刺激由野生型小鼠衍生之脾臟細胞增生，但是rE3無法誘導增生作用(圖3a)。得自TLR2-/-小鼠之脾臟細胞在以Pam3及rlipo-D1E3刺激時並不增生(圖3b)。反之，得自TLR4-缺陷小鼠之脾臟細胞仍然對Pam3及rlipo-D1E3刺激產生反應(圖3c)。此等結果指出，負責脾臟細胞由rlipo-D1E3-誘發之增生作用的主要受體可能是TLR2。
rlipo-D1E3誘發從BM-DCs製造細胞激素係由TLR2介導
使用衍生自野生型、TLR2-/-及TLR4-缺陷小鼠之BM-DCs來研究抗原展示細胞的活化作用。如圖4所示，能刺激TNF-α(圖4a)、IL-6(圖4b)與IL-12p40(圖4c)從野生型及TLR4-缺陷小鼠之BM-DCs製造，但是不能從TLR2-/-小鼠之BM-DCs製造出。經發現rlipo-D1E3之刺激圖譜與由TLR2促動劑Pam3測得的相似。相反地，LPS之刺激作用在TLR4-缺陷小鼠中喪失，但仍可在TLR2-/-及野生型小鼠中維持。亦使用未甲基化CpGs(一種TLR9促動劑)做為比較例。CpG能刺激來自野生型、TLR2-/-及TLR4-缺陷小鼠之BM-DC分泌細胞激素(圖4)。此等數據明顯確定，BM-DCs受rlipo-D1E3之活化是由於TLR2活化功能所致，而非由於TLR4之活化作用。
rlipo-D1E3免疫原經由TLR2活化NF-κB傳訊途徑
已顯示，Pam3係經由人類TLR2引發NF-κB傳訊途徑(Morr等人(2002)歐洲免疫學月刊32,3337-3347)。於本研究中，吾等檢驗rlipo-D1E3是否能經由TLR2引發NF-κB級聯。HEK293細胞已知其表現TLR2之能力差或者不會表現。因此HEK293細胞能被用來在以TLR2受體與NF-κB報告基因共轉染時，進行TLR2-依賴型傳訊分析。使用胸苷激酶(TK)-衍生之Renilla螢光素酶基因將轉感染效率正常化。如圖5a所示，經TLR2-轉染之HEK293細胞受Pam3或rlipo-D1E3(分別使用1及10nM)之刺激作用，可引發NF-κB傳訊途徑。反之，以LPS及重組E3(分別使用1及10nM)刺激則無此功效(圖5a)。因為曾暗示三醯基化脂肽Pam3及二醯基化脂肽BPPcysPEG(一種MALP-2衍生物)分別被不同的TLR2異元二聚體，即TLR2/TLR1(Takeuchi等人(2002) J Immunol 169,10-4)與TLR2/TLR6(Basinski等人(2007) Int Arch Allergy Immunol 142,91-8)辨識，吾等於是進行劑量-反應研究以釐清，TLR2-依賴性反應之傳訊途徑是否會依所使用的TLR2配體而有所差異。結果證明，rlipo-D1E3與Pam3之劑量反應在1pM至100nM的範圍內類似。相反地，BPPcysPEG呈現較強的TLR2活化作用(圖5b之*)。
rlipo-D1E3以與Pam3及BPPcysPEG相同的方式活化TLR下游傳訊途徑，但是具有不同的動力學
為研究抗原展示細胞經Pam3、rlipO-D1E3或BPPcysPEG刺激後之細胞內傳訊途徑，遂於不同時間間隔(0、10、20、40、60、90及120分鐘)使用磷酸基專一性抗體測量BM-DCs中p38、ERK 1/2及JNK 1/2的磷酸化作用。BPPcysPEG會誘發較Pam3及rlipo-D1E3更高程度的p38、ERK 1/2、JNK 1/2磷酸化。此結果與NF-κB活性分析之結果一致，顯示BPPcysPEG可以較低劑量活化NF-κB(圖5及6a)。於BM-DCs中由Pam3所誘發最高程度之p38、ERK 1/2及JNK 1/2磷酸化，係在40分鐘與120分鐘觀察到(圖6a)。由BPPcysPEG所誘發最高程度之p38、ERK 1/2及JNK 1/2磷酸化係在10分鐘觀察到，但是在60分鐘後即下降至基線值。相反地，由rlipo-D1E3誘發之磷酸化程度在120分鐘時仍舊維持不變。抗原展示細胞(BM-DCs)受rlipo-D1E3之刺激，可誘發與Pam3(一種TLR2/1促動劑)及BPPcysPEG(一種TLR2/6促動劑)相同的MAPK磷酸化作用，但是由此等促動劑誘導之動力學圖形並不相同。由rlipo-D1E3誘發之磷酸化作用較由Pam3誘發的早發生，且較由BPPcysPEG誘發的持續更久。
rlipo-D1E3於 BM-DC中誘導的細胞激素與趨化激素基因表現
為探究是否引起與Pam3及BPPcysPEG不同的下游基因表現吾等遂檢測經過Pam3、BPPcysPEG或rlipo-D1E3刺激後於BM-DCs中細胞激素與趨化激素之基因表現情形。當正常化刺激後之基因表現時，將對照組(單獨培養基)之基因表現設定為1。誘導較高的IL-1α、IL-23、IL-27、MCP-1與MIP-1α之表現程度。rlipo-D1E3及BPPcysPEG相較於Pam3可誘導較高的IL-13表現程度。相反地，經過Pam3、BPPcysPEG或rlipo-D1E3刺激後IL-10、TGFβ與CXCL1表現程度彼此相似(圖7)。此結果暗示，雖然rlipo-D1E3、Pam 3及BPPcysPEG皆經由相同受體(TLR2)及相似的傳訊途徑活化BM-DCs。然而，彼等可能誘導不同基因表現程度。
大多數天然細菌脂蛋白係經由展現於抗原展示細胞上之TLR2/1或TLR2/6異元雙聚體受體活化先天性免疫反應。然而，源自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )之重組脂蛋白OprI當表現於大腸桿菌時，顯示係經由TLR2/4接合刺激樹突細胞。此等引發爭議的結果促使吾等分析重組登革熱病毒疫苗(rlipo-D1E3，其呈現固有的佐劑特性)之脂質結構及效應物機轉，特別是因為關於細菌衍生之脂蛋白中脂質部份結構的資訊非常有限。最近，已藉由串接質譜分析(MS/MS)鑑定出一種經由TLR2刺激細胞，衍生自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )之30-35kDa脂蛋白的脂質部份為二醯基化蛋白質。脂蛋白中轉譯後之脂質修飾在細菌間有所差異。本發明用於建造rlipo-D1E3免疫原之脂質化訊號序列係衍生自腦膜炎雙球菌(Neisseria meningiditis )，且該脂蛋白於大腸桿菌中被過度表現。該脂質免疫原顯示具有強的固有佐劑活性。吾等因此對確立TLRs之專一性，以及負責rlipo-D1E3之免疫調節活性的基本細胞內傳訊機轉感興趣。吾等已顯示rlipo-D1E3係經不飽和脂肪酸三醯化。在rlipo-D1E3經液相胰蛋白酶分解後，使用MS/MS可觀察到三個蛋白酶分解肽高峰。然而，將該等片段純化後觀察到五種脂質修飾，且各修飾彼此之原子質量差異相當於14amu(圖2c、d、e及f)。此等數據暗示rlipo-D1E3之脂肪酸係以含有不同數目亞甲基(CH2 )基團之脂質部份存在。由吾等之結果預估，來自rlipo-D1E3之一脂肪酸可能為不飽和(含一個雙鍵)。此類型脂質修飾可造成不同用以活化先天免疫之效應物機轉。
為了解效應物刺激機轉，吾等已研究rlipo-D1E3之受體及胞內訊號傳遞的專一性。結果發現，rlipo-D1E3對TLR2-缺陷小鼠不具任何影響，而對得自野生型與TLR4-缺陷小鼠仍有刺激活性(圖3及圖4)。此等數據證明，rlipo-D1E3所使用之主要受體為TLR2，而非TLR4。此等結果與先前在重組OprI進行之研究所得的不同，其係使用TLR2/4。此可能是因為這兩種脂蛋白之脂質組成不同，或是由於製造方法不同所致。因此，重組脂蛋白活化TLR2可能具有與APC上其他TLR2促動劑不同的作用。雖然經發現TLR2與TLR1或TLR6所成之異元雙聚體不會造成差異性胞內訊號傳遞，吾等亦有興趣研究重組脂蛋白rlipo-D1E3是否顯現不同的胞內訊號傳遞。於NF-κB受體分析中，Pam3、rlipo-D1E3及BPPcysPEG會經由NF-kB途徑誘發訊號傳遞。然而，在0.1或1nM濃度下，BPPcysPEG誘發最高的NF-κB傳訊活性(圖5b)。而且，本實驗結果發現，將BM-DCs以rlipo-D1E3、Pam3或BPPcysPEG刺激，會在BM-DCs中誘發對p38、ERK 1/2及JNK 1/2相似的磷酸化作用(圖6a)，但是由所誘發之p38、ERK 1/2及JNK 1/2磷酸化程度較強，且較Pam3或rlipo-D1E3所誘發的更早發生。有趣地，似乎具有長時間p38磷酸化傳訊作用(圖6b)。吾等尚無法知曉該長時間傳訊作用對於抗原展示細胞是否具有任何衝擊。因此，本發明使用等量Pam3、rlipo-D1E3及BPPcysPEG刺激BMDCs，結果發現rlipo-D1E3誘發較高量的發炎性細胞激素與趨化激素轉錄產物(IL-1α、IL-23、IL-27、MCP-1、MIP-1α)(圖7)。細胞激素與趨化激素於經rlipo-D1E3刺激後的增量調節表示，該重組脂蛋白相較於其他兩種TLR 2促動劑(Pam3或BPPcysPEG)可能具有不同的效應物功能。再者，Farhat等人曾使用FSL-1(TLR1-依賴性)、Pam2C-SK4(TLR1-及TLR6-依賴性)或PamOct2C0(VPGVG)-4VPGKG(TLR6-依賴性)刺激鼠類樹突細胞，並分析MAPK磷酸化作用及基因表現情形。彼等結論，存在不同病原菌之脂蛋白可能活化不同TLR雙聚體，但是使用相同基因活化傳訊級聯(J Leukoc Biol 83,692-701)。吾等懷疑rlipo-D1E3之脂質部份或D1E3功能域的獨特雙鍵是否為促成誘導較高量細胞激素與趨化激素基因表現的原因。最近，吾等正嘗試分離及純化出rlipo-D1E3之N-端脂質部份以供進一步研究。綜合前述，細胞激素與趨化激素之表現量增高意味著，的效應物機轉與Pam3或BPPcysPEG的不同。其N-端脂質部份可供未來疫苗研發，做為用以調節免疫反應之新穎佐劑。
實施例2
於本實施例，進行關於rlipo-D1E3分解及N-端脂質化片段(lipo-Nter)純化之分析。簡述之，係將100mg經純化之rlipo-D1E3以胰蛋白酶(比例為50:1)於室溫下進行分解4小時。然後，藉由將100%甲酸加至混合物中使比例達100:3而終止反應。接著將7.2克C18矽膠(Fluka(Buchs,瑞士)，逆相矽膠100 C18)溶解於200ml 100%乙腈(CAN)中，並以80ml 0.1%三氟乙酸(TFA)預平衡。之後，將100mg經分解的rlipo-D1E3加樣至C18管柱。將管柱以200ml之0.1% TFA沖洗，再進一步以400ml之70% ACN/0.1%TFA沖洗。使用120ml之100% ACN完成最後沖洗。然後使用40ml異丙醇將脂質化N-端片段溶析出，並進行MALDI-TOF質譜分析。
結果列示於圖1及2。如圖所示，MALDI-TOF質譜結果指出，分子離子質量(m/z)與預測N-醯基-S-二醯基甘油基-CSQEAK的相符。分子離子質量1452、1466、1480及1494意味著A)位於R1(或R2)位置之脂肪酸具有相同碳數(C16:0)，或相同(C16:1)、(C17:1)與(C18:1)之混合，以及不飽和脂肪酸之中性喪失係來自相同的R1或R2位置。
如圖2a所示，Pam3之分子質量為1509.6道耳頓，且其序列為脂質-Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys。已鑑定出y1-y5之y-離子，且彼等確認該序列不具有其他修飾。源自Pam3之N-醯基-S-二醯基甘油基-半胱胺醯基的質量為892.2，其與所預期之組成：SNO6C54H102一致。如圖2b所示，存在有五個可於rlipo-D1E3之質譜中被確定的主要高峰。如圖2c所示，已鑑定出y1-y5之y-離子，且彼等確認該序列不具有其他修飾。高峰1452.2之N-醯基-S-二醯基甘油基-半胱胺醯基的質量為890.0。如圖2d所示，已鑑定出y1-y5之y-離子，且彼等確認該序列不具有其他修飾。高峰1466.2之N-醯基-S-二醯基甘油基-半胱胺醯基的質量為904.0。如圖2e所示，已鑑定出y1-y5之y-離子，確認該序列不具有其他修飾。高峰1480.2之N-醯基-S-二醯基甘油基-半胱胺醯基的質量為918.0。如圖2f所示，已鑑定出y1-y5之y-離子，確認該序列不具有其他修飾。高峰1494.2之N-醯基-S-二醯基甘油基-半胱胺醯基的質量為932.0。
實施例3
本實施例係描述脂質化N-端片段(lipo-Nter)之分離。首先將前述經胰蛋白酶分解之rlipo-D1E3加入50uL已預先以乙腈(100%)溼潤之POROS樹脂(Applied Biosystems,CA)中，將其混合並靜置培育至少2小時。將POROS樹脂混合物裝載於其底部具有以22規格針刺穿所形成的小開口之0.6mL微量離心管，再將其置於1.5mL微量離心管的頂端。將廢液過濾並使用桌上型離心機以快速離心收集。將POROS樹脂以0.1% TFA水溶液沖洗(0.2mL，3至5次)，然後先以0.05mL 100%乙腈接著以0.05mL 100%異丙醇進行溶析。具有與預測N-醯基-S-二醯基甘油基-CSQEAK相符之分子離子質量(m/z)的lipo-Nter經發現存在於後續100%異丙醇溶析液中。
結果列示於圖3。如圖所示，確實已根據質量於不同時間分離及溶析出lipo-Nter，彼此差異相當於14amu。
實施例4
本實施例係檢視lipo-Nter是否能刺激骨髓-衍生之樹突細胞分泌TNF-α與IL-12p40。
如先前所述(Lutz等人,1999)收取BM-DCs。簡述之，將6-8週齡雌性小鼠之股骨與脛股取出，並將骨髓細胞藉由吸管劇烈吸放而分散。待以溶解緩衝液去除紅血球後，將分離之骨髓細胞以補充青霉素(100U/mL,Sigma,St Louis,MO)、鏈霉素(100μg/ml,Sigma)、L-谷胺酸(2mM,Sigma)、巰基乙醇(50μM,Sigma)及10%熱去活化FBS之RPMI-10: RPMI-1640(GIBCO BRL,Grand Island,NY)再懸浮，至密度為2－5×105 細胞/ml。於第0、3及6天，將骨髓細胞加至含有200U/mL(20ng/ml)溶於RPMI-10之重組粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(MoGM-CSF,Peprotech,Rocky Hill,NJ)的培養皿中。於第6天，將LPS(0.01μg/ml)、lipo-Nter(100nM)加入。一般而言，不成熟的樹突細胞至多佔總細胞族群之70%。
使用ELISA測定由BM-DC進行之細胞激素製造。簡述之，係將100μL抗-細胞激素(10μg/ml之IL-12p40、TNF-α)抗體(R&D system Inc. Minneapolis,MN)與0.1M碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)覆蓋於孔微量平盤上，隨後於4℃下培育過夜。將經覆蓋之平盤以0.05% Tween 20之PBS溶液清洗兩次，然後以存於PBS之5%脫脂牛奶於室溫下進行封阻2小時。將得自經刺激之BM-DC的稀釋懸浮液加至經覆蓋之孔中，於室溫下靜置2小時。接著添加生物素-共軛之抗-細胞激素抗體(R&D system Inc. Minneapolis,MN)後，將該分析以3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)進行顯色，並藉由於每孔中添加100μl 1M H2 SO4 終止反應。將平盤於450nm下使用ELISA計讀機中(Molecular Devices,CA)讀取吸光值。將所得之值與未經刺激組所得之值相減，而計算出細胞激素的製造量。
如圖4所示，結果指出lipo-Nter可刺激由骨髓衍生之樹突細胞分泌TNF-α與IL-12p40。
實施例5
本實施例係檢視與重組突變型E7(rE7m)組合之lipo-Nter是否能增強抗-E7抗體。
將五隻小鼠(6-8週齡)以皮下注射20μg rE7m(有或無與lipo-Nter一起)進行免疫。以兩周為間隔給予小鼠兩次免疫注射。在所指示之不同時間點，從每隻小鼠收集血液。製備血清並儲放於-80℃下備用。藉由將樣本於覆蓋以經純化rE7m之96-孔平盤中進行滴定，而測定出血清樣本中所含抗-E7m IgG的濃度。以山辣根過氧化酶-共軛之山羊抗-小鼠IgG Fc偵測已結合之IgG Fc。於添加TMB後，於450nm下以ELISA計讀機中測量吸光值。如圖5所示，結果指出與重組突變型E7(rE7m)組合之lipo-Nter可增強抗-E7抗體。
實施例6
於本實施例，係檢視與重組突變型E7(rE7m)組合之lipo-Nter是否能增加腫瘤生長抑制活性。將六隻小鼠(6-8週齡)於第0天接種2 x 105 TC-1細胞(表現HPVE7細胞)。7天後，將小鼠以20μg rE7m(有或無與lipo-Nter一起)進行免疫一次。每2-3天監測腫瘤大小，直到腫瘤體積大於3000mm3 。以公式(長x寬x寬/2)計算腫瘤體積。如圖6所示，結果指出rE7m在有lipo-Nter存在下能誘導抗腫瘤效應。換言之，rE7m與lipo-Nter組合意外地具有較單獨rE7m更強的抗腫瘤活性。
實施例6
於本實施例，係檢視E7衍生的抗原表位肽RAH(RAHYNIVTF)與lipo-Nter之組合是否能增加腫瘤生長抑制能力，而與合成型脂肽Pam3組合則否。
將六隻小鼠(6-8週齡)於第0天接種2 x 105 TC-1細胞(表現HPVE7細胞)。7天後，將小鼠以20μg E7衍生的肽，於有三棕櫚醯基化肽Pam3或lipo-Nter存在下進行免疫一次。每2-3天監測腫瘤大小，直到腫瘤體積大於3000mm3 。以公式(長x寬x寬/2)計算腫瘤體積。結果指出lipo-Nter可增加以合成肽為底之免疫療法的抗腫瘤功效。
而且，發現E7衍生的肽RAH與lipo-Nter組合能抑制小鼠中之腫瘤生長。相反地，RAH與合成型脂肽Pam3之組合無法抑制腫瘤生長。參見圖7。
其他具體態樣
本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。
前述之說明已描述本發明之許多較佳實施例。習於該項技藝人士應了解，在未偏離本發明之精神及範圍下可進行各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。
圖1a與1b顯示衍生自rlipo-D1E3之lipo-Nter(Lipo-CSQEAK,SEQ ID NO: 11)使用質譜進行鑑定(a)及分離(b)的結果。
圖2a-f顯示合成型脂肽與經純化之rlipo-D1E3 N-端片段的鑑定結果。
圖3a-3c顯示經以rlipo-D1E3刺激後於取自TLR2-/-、TLR4-缺陷型及野生型小鼠之脾臟細胞中的DNA合成。
圖4a-4c顯示rlipo-D1E3對於衍生自野生型、TLR2-缺陷型及TLR4-缺陷型小鼠之樹突細胞的影響。數據以得自三次獨立實驗之平均值±SD表示。□，野生型；□，TLR4-缺陷型小鼠；■，TLR2-缺陷型小鼠。
圖5a與5b顯示經由TLR2誘發NF-kB傳訊作用。數據代表得自三重複樣本之平均值±SD。
圖6a與6b顯示於鼠類骨髓-衍生之樹突細胞(BM-DCs)中對p38、ERK 1/2、JNK 1/2之活化作用。
圖7為一組圖顯示於鼠類BM-DCs中細胞激素或趨化激素之基因表現情形。所示之數據為兩次獨立實驗之代表值。
圖8為一組圖顯示lipo-Nter能夠刺激骨髓-衍生之樹突細胞分泌TNF-α與IL-12p40。
圖9顯示lipo-Nter與重組突變型E7(rE7m)組合能夠增強抗-E7抗體。
圖10顯示lipo-Nter與rE7m組合能夠增加腫瘤生長抑制能力。
圖11顯示lipo-Nter與RAH(來自E7的胜肽)組合能夠增加腫瘤生長抑制能力，但是RAH與合成型脂肽Pam3則不能抑制腫瘤生長。
<110> 財團法人國家衛生研究院
<120> 佐劑
<150> 12702567
<151> 2010-02-09
<160> 12
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 腦膜炎雙球菌Neisseria Meningitides
<400> 1
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 腦膜炎雙球菌Neisseria Meningitides
<400> 2
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 腦膜炎雙球菌Neisseria Meningitides
<400> 3
<210> 4
<211> PRT
<212> 31
<213> 腦膜炎雙球菌Neisseria Meningitides
<400> 4
<210> 5
<211> 50
<212> PRT
<213> 腦膜炎雙球菌Neisseria Meningitides
<400> 5
<210> 6
<211> 40
<212> PRT
<213> 腦膜炎雙球菌Neisseria Meningitides
<400> 6
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<212> PRT
<213> 人造序列
<400> 7
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<212> PRT
<213> 人造序列
<400> 8
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 腦膜炎雙球菌Neisseria Meningitides
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<213> 人造序列
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<221> 脂肽
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<221> 脂肽
<400> 12

Claims (5)

  1. 一種佐劑組成物，其包含一單離脂肽，其中該脂肽為N-醯基-S-二醯基甘油基-半胱胺醯基-X，其中X具有SEQ ID NO：7或8之序列。
  2. 一種免疫生成性組成物，其包含一抗原及一單離脂肽，其中該脂肽為N-醯基-S-二醯基甘油基-半胱胺醯基-X，其中X具有SEQ ID NO：7或8之序列。
  3. 一種製備如申請專利第1項所述之N-醯基-S-二醯基甘油基-半胱胺醯基-X脂肽的方法，其包含：提供一宿主大腸桿菌細胞，其含有編碼具有脂質化序列之第一片段的蛋白質之核酸，該脂質化序列包括SEQ ID NO：6；將大腸桿菌宿主細胞於培養基中，於可使該蛋白質表現呈脂質化形式之條件下進行培養；及將該蛋白質之脂質化形式從該細胞或該培養基中分離出；及將該蛋白之脂質化形式以蛋白酶分解而產生脂肽。
  4. 如申請專利第3項所述之方法，其中該核酸對於該細胞可為異源性的。
  5. 如申請專利第3項所述之方法，其中該脂肽序列包括SEQ ID NO：7或8之序列。
TW099114518A 2010-02-09 2010-05-06 佐劑 TWI483735B (zh)

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