TWI481707B

TWI481707B - 使用氧化酶之測定方法

Info

Publication number: TWI481707B
Application number: TW100138195A
Authority: TW
Inventors: Hisashi Kaneda
Original assignee: Arkray Inc
Priority date: 2010-10-22
Filing date: 2011-10-21
Publication date: 2015-04-21
Also published as: KR20120042668A; KR101597147B1; US9702844B2; CN102565160B; US9260736B2; US20120100567A1; EP2444500A3; JP2012108111A; JP5753758B2; CN102565160A; US8722355B2; TW201219566A; EP2444500B1; US20160091452A1; EP2444500A2; US20140202854A1

Description

使用氧化酶之測定方法

本發明係關於一種使用氧化酶之測定方法、及該方法所使用之生物感測器及測定裝置。

於生物感測器中，酶感測器之實用化不斷發展，例如測定葡萄糖、乳酸、膽固醇、乳糖、尿酸、尿素、胺基酸之酶感測器被實際應用於醫療測量或食品工業中。酶感測器係利用藉由使於液體即試樣液中所含有之測定對象(基質)與酶之反應所生成之電子而使電子受體(媒介物)還原，藉由以電氣化學方式測量該電子受體之氧化還原量而進行檢體之定量分析。然而，於試樣液為血液之情形時，使用氧化還原酶之生物感測器存在因溶氧之影響而無法獲得精確之檢測之問題。尤其是利用GOD(Glucose oxidase，葡萄糖氧化酶)之酶感測器大多情況下用於飲食前胰島素注射時之測定或低血糖之評價中。若因溶氧之影響而過高地顯示葡萄糖濃度，則有導致胰島素過剩給藥或忽視低血糖之虞。因此，即便為血液之類的可含有溶氧之試樣，亦期待不受溶氧之影響之生物感測器。

避免溶氧影響之技術，開發有利用第3電極之方法(專利文獻1及2)或使用GDH(Glucose dehydrogenase，葡萄糖脫氫酶)之酶感測器(專利文獻3)。另一方面，於使用第3電極之方法中需要新的設備投資，又，使用GDH之方法亦被指出GDH與GOD相比酶成本較高且易受由麥芽糖等糖類引起之測定抑制之影響。

[專利文獻1]日本特開平10-282038號公報

[專利文獻2]日本特開2000-065778號公報

[專利文獻3]日本特開2007-163499號公報

即，期望一種測定方法，其係使用氧化還原酶生物感測器之測定方法，可減少設備投資並可降低酶成本。因此，本發明係提供一種測定方法，其係使用氧化酶測定試樣中之測定對象物之方法，且可修正試樣中之溶氧之影響。

本發明係關於一種測定方法，係使用氧化酶測定試樣中之測定對象物，含有：藉由於2種以上之不同條件下使試樣中之測定對象物與氧化酶反應而獲得測定值，及根據2種以上之測定值之結果、與為了修正試樣中溶氧之影響而預先設定之修正方法來進行修正。

本發明於另一樣態中，係關於一種生物感測器，具備：配置於基板上之具有作用電極及相對電極之2個以上的獨立電極系；及配置於上述電極系之至少2個電極系上之可於不同條件下測定同一試樣中之同一測定對象物的含氧化酶試劑。又，本發明於另一樣態中，係關於一種測定裝置，其進行測定對象物之測定，具備：感測部，用以取得藉由使試樣中之測定對象物與氧化酶於2種以上之不同條件下反應所獲得的2種以上之測定結果之資訊；記憶部，用以記憶修正方法；演算部，用以根據感測部中所獲得之資訊選擇記憶部所記憶之修正方法並藉由上述修正方法算出上述資訊之修正值；及顯示部，用以顯示上述修正值。

根據本發明之測定方法，即便於溶氧存在下，亦可求出使用氧化酶而修正了溶氧之影響的測定對象濃度。又，本發明較佳為可於不使用氧化酶以外之酶、例如GDH之情況下修正溶氧之影響。進而，本發明較佳為可於不使用第3電極之情況下修正溶氧之影響。

本發明係基於如下見解：於使用氧化酶電極系之測定中，藉由基於改變反應條件(例如酶量或媒介物之種類)之2種反應系之結果的修正，而變得可進行降低溶氧影響之測定。

即，本發明係關於一種測定方法，其使用氧化酶測定試樣中之測定對象物，含有：藉由於該2種以上之不同條件下使試樣中之測定對象物與氧化酶反應而獲得測定值；及根據2種以上之測定值結果、與為了修正試樣中溶氧之影響而預先設定之修正方法而進行修正(以下亦稱為「本發明之測定方法」)。根據本發明之測定方法，變得可進行可修正試樣中溶氧之影響之測定。

關於可根據在2種以上之不同條件下所測得之測定值而預測溶氧量之機制，可以如下方式考慮。即，若使用氧化酶酵素，則於酶、媒介物反應中溶氧濃度會對反應造成影響(參照下述流程)。其影響程度根據反應條件之不同而變化，藉此可推測所輸出之經時過程不同。然而，本發明亦可不限定該機制而解釋。

於本說明書中，所謂「測定對象物」，係指為本發明之測定方法之測定對象且成為氧化酶之基質者。例如可列舉：葡萄糖、乳酸、膽紅素、膽固醇、及抗壞血酸等。因此，與測定對象物反應之氧化酶，只要為以測定對象物作為基質者，則均可用於本發明，例如可列舉：葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、膽紅素氧化酶、膽固醇氧化酶、及抗壞血酸氧化酶等。又，本發明之測定方法中所使用之氧化酶，可列舉：尿酸氧化酶、過氧化酶、亞硫酸氧化酶、胺氧化酶、賴胺醯氧化酶、賴胺酸氧化酶、胺基酸氧化酶、二胺氧化酶、磷酸吡哆醇氧化酶、蛋白質-賴胺酸-6-氧化酶、醯基-CoA氧化酶、乙醇氧化酶、膽鹼氧化酶、丙酮酸氧化酶、肌胺酸氧化酶、酪胺氧化酶、甘油磷酸氧化酶等，亦可將該等之基質設為測定對象物。

於本說明書中，所謂「試樣」，於無特別說明之情況下係指本發明之測定方法中所使用者，係指存在測定對象物或有存在測定對象物之可能性之組合物或混合物。試樣可列舉含有測定對象物之液體或可產生測定對象物之液體，例如血液、血漿、血清、尿、體液等生物試樣。

於本說明書中，所謂「使試樣中之測定對象物與氧化酶反應」，係指使試樣與氧化酶接觸而使測定對象物與氧化酶反應。含有氧化酶之試劑可為乾系亦可為濕系，就簡便性方面而言，較佳為於生物感測器上使試樣與氧化酶接觸。作為「測定值」，於使用電極系之情形時，可列舉電流值，於進行光學式檢測之情形時，可列舉吸光度或透過率，只要為檢測測定對象物與氧化酶之反應所獲得之測定值，則並無特別限定。就簡便性方面而言，「使試樣中之測定對象物與氧化酶反應」較佳為利用具備電極系之生物感測器來進行。又，於採用電極系之情形時，較佳為於反應系中含有媒介物。

於本說明書中，所謂「2種以上之不同條件」，係指於測定對象物與氧化酶之反應條件中之至少1個條件不同的至少2種條件下進行反應而獲得至少2種測定值。不同反應條件並無特別限定，可列舉：氧化酶之種類及或量、反應溫度、反應時間、媒介物之種類及或量、親水性高分子之種類及或量、界面活性劑之種類及或量、糖類之種類及或量等。

於本說明書中，所謂「測定值」，包含檢測測定對象物與氧化酶之反應而獲得之結果，具體而言包含電流值、電阻值、吸光度、透光度、及由該等所獲得之值(例如使用差分、面積、校準曲線所算出之濃度等)。

[修正方法]

於2種以上之特定反應條件下，利用溶氧濃度不同之複數試樣預先獲得測定值，藉此可預先設定修正方法。例如可考慮，使不同反應系A及B之測定值A與測定值B之商或差與溶氧濃度產生關聯而預先設定修正方法。再者，於本說明書中，將藉由本發明之測定方法而修正之測定值稱為修正值。

修正方法之一實施形態，可列舉使用由反應系A及B所獲得之測定值A及B之商(B/A或A/B)之修正。作為一例，可列舉使由測定值A所獲得之濃度A乘以測定值之商B/A而獲得修正後之濃度之方法。再者，由測定值A獲得濃度A之方法，可如先前般使用校準曲線等來進行。該修正方法係基於如下見解：溶氧對氧化酶反應系造成之影響依存於反應系中之氧化酶等試劑之量。並且，亦基於如下見解：於含有氧化酶試劑之反應條件不同之反應系A及B中，可藉由乘以其測定值A及B之商(B/A或A/B)來進行修正。再者，於本實施形態中，就進一步提高修正精度之方面而言，較佳為除測定值之商以外進而乘以修正係數c。該常數依存於特定之反應條件，可藉由預先於該特定反應條件下進行實驗而容易地設定。因此，作為本實施形態之較佳修正形態，係使由測定值A所獲得之濃度A乘以測定值之商B/A及修正係數c的修正。常數c亦可為1。

修正方法之其他實施形態，可考慮，根據預先所獲得之資料使測定值A與測定值B之商或差與溶氧濃度(或其範圍)產生關聯，從而預先設定該溶氧濃度或對應於其範圍的修正之有無及修正之內容(例如修正量或修正係數等)。

[生物感測器]

於本發明之測定方法中，測定對象物與氧化酶之反應可利用含有具有作用電極及相對電極之電極系、及配置於上述電極系上之含有氧化酶之藥劑層的生物感測器而進行。再者，上述藥劑層通常包含媒介物。

生物感測器中之媒介物，例如可使用鐵氰化鉀、鐵氰化鈉、對苯醌及其衍生物、吩硫酸甲酯及其衍生物、靛酚及其衍生物、β-萘醌-4-磺酸鉀、2,6-二氯酚靛酚、亞甲基藍、硝基四唑藍、二茂鐵及其衍生物、鋨錯合物、釕錯合物、NAD⁺ 、NADP⁺ 、吡咯喹啉醌(PQQ)等。

於生物感測器藥劑層中，亦可進而含有親水性高分子、界面活性劑、及糖類。關於該等進一步之成分，可使用先前之氧化酶電極系之生物感測器中所使用者。

本發明之測定方法中所使用之生物感測器較佳為具備2個以上之獨立之電極系。若為此種生物感測器，則變得可進行利用1次測定修正溶氧之影響之測定。

因此，本發明於另一樣態中，係關於一種生物感測器，其係於本發明之測定方法中使用，具備：配置於基板上之具有作用電極及相對電極之2個以上獨立之電極系；配置於上述電極系之至少2個電極系上之氧化酶；及視需要之媒介物。如上所述，於獨立之2個以上之電極系中較佳為形成有條件不同之試劑層。即，較佳為氧化酶之種類及或量、媒介物之種類及或量、親水性高分子之種類及或量、界面活性劑之種類及或量、糖類之種類及或量等之至少1者不同之試劑層。因此，本發明於另一樣態，係關於一種生物感測器，具備：配置於基板上之具有作用電極及相對電極之2個以上之獨立電極系；及配置上述電極系之至少2個電極系上之可於不同條件下測定同一試樣中之同一測定對象物的含氧化酶之試劑。

利用圖1對本發明之測定方法中所使用之生物感測器之一實施形態進行說明。圖1係表示本發明之生物感測器之一實施形態之構成的概略圖之一例。本實施形態之生物感測器具備配置於基板1上之具有作用電極2及相對電極3之2個獨立電極系、配置於各電極系上之具備氧化酶及媒介物之試劑層4、流路5、及空氣孔6。然而，本發明之生物感測器並不限定於該實施形態。於圖1之生物感測器中，導入至流路5之試樣朝空氣孔6流動，於分枝點分枝而與配置電極2及3上之2個試劑層4接觸並進行反應，根據電極2及3而測定其結果。

[測定裝置]

進而，本發明之另一樣態係關於一種測定裝置，其具備：感測部，用以取得藉由使試樣中之測定對象物與氧化酶於2種以上之不同條件下反應所獲得的2種以上之測定結果之資訊；記憶部，用以記憶修正方法；演算部，用以根據感測部中所獲得之資訊選擇記憶部所記憶之修正方法並藉由上述修正方法算出上述資訊之修正值；及顯示部，用以顯示上述修正值。本發明之測定裝置可用於本發明之測定方法。

利用圖2對本發明之測定裝置之一實施形態進行說明。圖2係表示本發明之測定裝置之一實施形態之構成的方塊圖之一例。於圖2中，本實施形態之測定裝置具備控制部21、顯示部22、感測部23、演算部24、記憶部25、及電源部26。本發明之測定裝置可為該等控制部、顯示部、感測部、演算部及記憶部之一部分或全部成為一體之構成，亦可為各自獨立之構成。

感測部23可連接生物感測器，於連接(裝著)生物感測器後成為例如用以取得電流值等資訊者。因此，感測部例如亦可具備電壓施加部、電流值測定部等。記憶部25用以記憶例如修正方法、修正係數、或用於修正方法之選擇之資料等。

演算部24用以根據感測部23所獲得之資訊設定及或選擇記憶部25所記憶之修正方法並藉由該修正方法而算出上述資訊之修正值。修正方法之選擇例如可藉由如下方式進行：將使記憶部25所記憶之測定值與溶氧濃度產生關聯之資料、及/或使測定值與修正係數等修正之內容產生關聯之資料，與感測部23所獲得之資訊進行比較。於本發明中，「感測部23所獲得之資訊」包含利用感測部之生物感測器所檢測出之測定值，亦可包含基於上述測定值之資料(例如平均值或分散等統計值、或2個測定值之差等)。修正值之計算可根據所選擇之修正方法而適當決定，例如可藉由使測定值乘以修正係數來進行。又，於修正值為電流值等之情形時，演算部24可使用校準曲線等而算出測定對象物之濃度等。

顯示部22係用以顯示藉由演算部24演算之結果，例如經修正之濃度等、試樣中之溶氧預測值、修正係數等。顯示部22係例如藉由液晶顯示裝置來構成。

電源部26用以對控制部21、顯示部22、感測部23、演算部24及記憶部25供給電力。又，於該測定裝置為具備電極之生物感測器用測定裝置之情形時，電源部26係於對生物感測器之作用電極與相對電極之間施加電壓、或測定作用電極與媒介物之間之電子授受量之情況下使用。又，控制部21用以控制顯示部22、感測部23、演算部24、記憶部25及電源部26。

以下，以測定對象物為葡萄糖且生物感測器為具備電極系之生物感測器之情況為例，利用圖3之流程圖對使用圖2所示之測定裝置的測定對象物之測定方法進行說明。然而，以下之說明僅為一例，本發明當然並不限於此。

首先，於測定裝置之感測部23安裝生物感測器。繼而，於生物感測器內導入血液等試樣，使試樣中之測定對象物與氧化酶進行反應。並且，於感測部23中對生物感測器之作用電極與相對電極施加電壓，測定此時之應答電流值，取得測定值(資料)(S31)。於控制部21中，判斷是否取得藉由2種以上之不同條件所獲得之測定值(資料)(S32)。於判斷為未取得藉由2種以上之不同條件所獲得之測定值之情形時，再次嘗試資料之取得(S31)。於判斷為取得了藉由2種以上之不同條件所獲得之測定值之情形時，於演算部24中進行修正方法之辨別處理(S33)。修正方法之辨別處理例如可根據所取得之資料與預先記憶於記憶部25中之修正方法來決定並設定。並且，利用所設定之修正方法進行資料之修正(S34)，將修正值或根據修正值所算出之濃度等顯示於顯示部22(S35)。

[實施例]

[2個GOD電極系(A及B)中之葡萄糖之測定]

使用具備2個GOD電極系(A及B)之生物感測器測定試樣1～3。電極系A及B之試劑層中所含有之試劑如下述表1所示。再者，下述表1之單位(U)係定義為可於最佳條件下(溫度為30℃，最有利於進行化學反應之酸性度)以每分鐘1微莫耳(μmol)改變基質之酶量。又，各試樣中之葡萄糖及溶氧之濃度如下述表2所示。試樣1～3係使用靜脈血來製備。葡萄糖濃度係添加葡萄糖而調整，溶氧濃度係藉由振動裝有上述靜脈血之管來調整。再者，葡萄糖及氧濃度之測定方法如下所述。

[藉由生物感測器之測定]

使用具備上述試劑層(A系及B系)之生物感測器測定試樣1～3(n=8)。再者，測定裝置係使用商品名為GA-1150(ARKRAY公司製造)者作為葡萄糖濃度測定器，使用商品名為ABL5(Radiometer公司製造)者作為溶氧濃度測定器。將其結果示於下述表3。

[測定值與溶氧濃度之關聯、及修正方法之決定]

根據上述表3之資料而使A系及B系之測定值與試樣中之溶氧濃度產生關聯，決定如下之修正方法。再者，於本實施例中，下述修正係數為1.04。

修正值=(由A系資料所獲得之試樣濃度)×(B系之測定值/A系之測定值)×修正係數

將藉由上述修正方法而修正之結果示於下述表4及圖4。下述表4表示未修正值(僅參照A系之測定值並對比校準曲線所獲得之濃度)之平均值、標準偏差、變動係數、與基準值(336mg/dL)之背離(%)、及修正後所對應之值。圖4係表示試樣中之溶氧濃度與自修正前後之基準值之背離(%)的關係之圖表。

如上述表4及圖4所示，藉由上述修正方法，可獲得溶氧之影響被降低之測定結果。

[產業上之可利用性]

本發明於醫療領域、生命科學領域、生物研究領域中有用。

1．．．基板

2．．．作用電極

3．．．相對電極

4．．．試劑層

5‧‧‧流路

6‧‧‧空氣孔

21‧‧‧控制部

22‧‧‧顯示部

23‧‧‧感測部

24‧‧‧演算部

25‧‧‧記憶部

26‧‧‧電源部

圖1係表示本發明之生物感測器之一實施形態之構成的概略圖。

圖2係表示本發明之測定裝置之一實施形態之構成的方塊圖。

圖3係表示本發明之測定裝置之一實施形態之動作的流程圖。

圖4係表示實施例之結果之圖表。

Claims

一種提供試樣中之測定對象物之修正測定方法，其中試樣含有溶氧，該方法含有：於含有2個獨立電極系之生物感測器中，藉由於2種以上之不同條件下使測定對象物與氧化酶反應來獲得試樣中之測定對象之個別測定值A、B；及根據2種以上之不同條件所得測定值A、B，以下述修正式進行修正，來修正試樣中溶氧對測定對象之測定值精確之影響；修正式：修正值=(由A系資料所獲得之試樣濃度)×(B系之測定值/A系之測定值)×修正係數；又，該2種以上之不同條件係選自氧化酶之種類及/或量、反應溫度、反應時間、媒介物之種類及/或量、親水性高分子之種類及/或量、界面活性劑之種類及/或量、糖類之種類及/或量。
如申請專利範圍第1項之方法，其中，該生物感測器進一步含有藥劑層，該藥劑層含有配置於該二個獨立電極系之每一個電極系之上的氧化酶，該二個獨立電極系之每個電極系含有作用電極及相對電極。
如申請專利範圍第2項之方法，其中，該藥劑層進一步含有媒介物。
如申請專利範圍第1項之方法，其中，該試樣係選自血液、血漿、血清與尿組成之群組。
如申請專利範圍第4項之方法，其中，該試樣係血液。
如申請專利範圍第1項之方法，其中，該測定對象係選自葡萄糖、乳酸、膽紅素、膽固醇及抗壞血酸組成之群組。
如申請專利範圍第6項之方法，其中，該測定對象係葡萄糖。
如申請專利範圍第1項之方法，其中，該氧化酶係選自葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、膽紅素氧化酶、膽固醇氧化酶、抗壞血酸氧化酶、尿酸氧化酶、過氧化酶、亞硫酸氧化酶、胺氧化酶、賴胺醯氧化酶、賴胺酸氧化酶、胺基酸氧化酶、二胺氧化酶、磷酸吡哆醇氧化酶、蛋白質-賴胺酸-6-氧化酶、醯基-CoA氧化酶、乙醇氧化酶、膽鹼氧化酶、丙酮酸氧化酶、肌胺酸氧化酶、酪胺氧化酶以及甘油磷酸氧化酶組成之群組。
如申請專利範圍第8項之方法，其中，該氧化酶係葡萄糖氧化酶。
如申請專利範圍第3項之方法，其中，該媒介物係選自鐵氰化鉀、鐵氰化鈉、對苯醌、吩硫酸甲酯、靛酚、β-萘醌-4-磺酸鉀、2,6-二氯酚靛酚、亞甲基藍、硝基四唑藍、二茂鐵、鋨錯合物、釕錯合物、NAD⁺ 、NADP⁺ 以及吡咯喹啉醌(PQQ)組成之群組。
如申請專利範圍第10項之方法，其中，該媒介物係釕錯合物。
如申請專利範圍第3項之方法，其中，該藥劑層進一步含有親水性高分子、界面活性劑以及糖類類組成之群組中之至少一者。