CN102565160A

CN102565160A - 使用氧化酶的测定方法

Info

Publication number: CN102565160A
Application number: CN2011103299844A
Authority: CN
Inventors: 兼田悠
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2010-10-22
Filing date: 2011-10-24
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2031-10-24
Also published as: KR20120042668A; TWI481707B; KR101597147B1; US9702844B2; CN102565160B; US9260736B2; US20120100567A1; EP2444500A3; JP2012108111A; JP5753758B2; US8722355B2; TW201219566A; EP2444500B1; US20160091452A1; EP2444500A2; US20140202854A1

Abstract

本发明公开了使用氧化酶的测定方法。本发明提供了一种测定方法，所述测定方法使用氧化酶对样品中的测定对象物进行测定，并能够对样品中的溶解氧的影响进行修正。所述使用氧化酶对样品中的测定对象物进行测定的测定方法包括：通过使样品中的测定对象物在两种以上的不同条件下与氧化酶发生反应来获得测定值，以及，基于2个以上的测定值的结果、和为了对样品中的溶解氧的影响进行修正而事先设定的修正方法来进行修正。

Description

使用氧化酶的测定方法

技术领域

本发明涉及使用氧化酶的测定方法、以及用于所述测定方法的生物传感器及测定装置。

背景技术

在生物传感器中，酶传感器的实用化也得到了发展，例如，对葡萄糖、乳酸、胆固醇、乳糖、尿酸、尿素、氨基酸进行测定的酶传感器被实际应用于医疗测量或食品工业。酶传感器通过下述方式来进行对检验物的定量分析：利用作为液体的样品液包含的测定对象(底物)与酶之间的反应生成的电子对电子受体(介质)进行还原，并对所述电子受体的氧化还原量进行电化学测量。但是，使用氧化还原酶的生物传感器存在以下问题：当样品液为血液时，由于溶解氧的影响而不能够得到正确的检查结果。特别地，利用GOD(葡萄糖氧化酶)的酶传感器经常应用于在餐前注射胰岛素时的测定及对低血糖的评估。当由于溶解氧的影响葡萄糖浓度被显示得高时，有可能导致过量施用胰岛素和察觉不到低血糖。因此，希望获得即使使用含有血液那样的溶解氧的样品，也不会受到溶解氧的影响的生物传感器。

作为避开溶解氧的影响的技术，开发了利用第3电极的方法(专利文献1及专利文献2)和使用GDH(葡萄糖脱氢酶)的酶传感器(专利文献3)。然而一方面，使用第3电极的方法需要新的设备投资，另外，在使用GDH的方法中，GDH比GOH的酶成本高，并且还被指出容易受到麦芽糖等糖类导致的测定阻碍的影响。

在先技术文献

专利文献

(专利文献1)日本特开平10-282038号公报

(专利文献2)日本特开2000-065778号公报

(专利文献3)日本特开2007-163499号公报

发明内容

发明所要解决的问题

即，希望获得下述测定方法，所述测定方法使用氧化还原酶生物传感器，并能够减少设备投资并降低酶成本。因此，本发明提供了能够对样品中溶解氧的影响进行修正的测定方法，所述测定方法使用氧化酶对样品中的测定对象物进行测定。

用于解决问题的手段

本发明涉及下述测定方法，所述测定方法使用氧化酶对样品中的测定对象物进行测定，所述测定方法包括：通过使样品中的测定对象物在两种以上的不同条件下与氧化酶发生反应来获得测定值、以及基于两种以上的测定值的结果和为了对样品中的溶解氧的影响进行修正而事先设定的修正方法来进行修正。

在其它方面，本发明涉及下述生物传感器，所述生物传感器包括两个以上的独立的电极系统以及含有氧化酶的试剂，其中，所述电极系统包括配置在基板上的工作电极及对电极，所述含有氧化酶的试剂被配置在所述电极系统中的至少两个电极系统上，并能够在不同的条件下对同一样品中的同一测定对象物进行测定。另外，还在其它方面中，本发明涉及下述测定装置，所述测定装置对测定对象物进行测定，所述测定装置包括：传感器部，所述传感器部取得通过使样品中的测定对象物在两种以上的不同条件下与氧化酶发生反应而获得的两种以上的测定结果的信息；存储部，所述存储部存储修正方法；计算部，所述计算部基于利用传感器部获得的信息选择被存储于存储部的修正方法，并利用所述修正方法计算出所述信息的修正值；以及显示部，所述显示部显示所述修正值。

发明的效果

根据本发明的测定方法，即使在存在溶解氧的情况下，也能够求出使用氧化酶对溶解氧的影响进行了修正的测定对象浓度。另外，本发明优选能够在不使用氧化酶以外的酶(例如GDH)的情况下对溶解氧的影响进行修正。此外，本发明优选能够在不使用第3电极的情况下对溶解氧的影响进行修正。

附图说明

图1是示出本发明的生物传感器的一个实施方式的构成的概略图。

图2是示出本发明的测定装置的一个实施方式的构成的框图。

图3是示出本发明的测定装置的一个实施方式的工作的流程图。

图4是示出实施例的结果的图表。

具体实施方式

本发明基于以下知识：在使用氧化酶电极系统的测定中，通过基于改变了反应条件(例如，酶量或介质的种类)的两种反应系的结果进行修正，能够在降低了溶解氧的影响的情况下进行测定。

即，本发明是使用氧化酶对样品中的测定对象物进行测定的方法，本发明涉及的测定方法(下文中也称作“本发明的测定方法”。)包括：通过使样品中的测定对象物在两种以上的不同条件下与氧化酶发生反应来获得测定值、以及基于两个以上的测定值的结果和为了对样品中的溶解氧的影响进行修正而事先设定的修正方法来进行修正。根据本发明的测定方法，能够进行能对样品中的溶解氧的影响进行修正的测定。

能够通过在两种以上的不同条件下测定的测定值对溶解氧量进行预测的装置被如下考虑。即，当使用氧化酶时，酶-介质反应中的溶解氧浓度对反应产生影响(参照下述图解)。推定：所述影响的程度根据反应条件的不同而变化，由此输出的时程不同。但是，也可以在不受所述装置的限定的情况下理解本发明。

化学1

在本说明书中，“测定对象物”是指作为本发明的测定方法的测定对象的氧化酶的底物。例如，举例有葡萄糖、乳酸、胆红素、胆固醇以及抗坏血酸等。因此，作为与测定对象物发生反应的氧化酶，只要是以测定对象物为底物的物质即可以使用于本发明，例如，举例有葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、胆红素氧化酶、胆固醇氧化酶以及抗坏血酸氧化酶等。另外，作为在本发明的测定方法中使用的氧化酶，举例有：尿酸氧化酶、过氧化物酶、亚硫酸氧化酶、胺氧化酶、赖氨酰氧化酶、赖氨酸氧化酶、氨基酸氧化酶、二胺氧化酶、磷酸吡哆醇氧化酶、蛋白赖氨酸-6-氧化酶、酰基辅酶A氧化酶、醇氧化酶、胆碱氧化酶、丙酮酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、酪胺氧化酶以及磷酸甘油氧化酶等，也可以将这些的底物作为测定对象物。

在没有特别说明的情况下，本说明书中的“样品”是指用于本发明的测定方法的组合物或混合物，在所述组合物或混合物中，可能存在测定对象物，也可能不存在测定对象物。作为样品，举例有包含测定对象物的液体或能够产出测定对象物的液体，例如，举例有血液、血浆、血清、尿、以及体液等生物体样品。

本说明书中的“使样品中的测定对象物与氧化酶发生反应”是指使样品与氧化酶接触从而使测定对象物与氧化酶发生反应。包含氧化酶的试剂可以是干的体系也可以是湿的体系，从简便性的角度出发，优选在生物传感器上使样品与氧化酶接触。作为“测定值”，在使用电极系统时举例有电流值，在进行光学式检测时举例有吸光率或透光率，只要是对测定对象物与氧化酶的反应进行检测而获得的测定值，则没有特别的限定。从简便性的角度出发，“使样品中的测定对象物与氧化酶发生反应”优选利用包括电极系统的生物传感器进行。另外，当采用电极系统时，优选使反应系中包含介质。

本说明书中的“两种以上的不同条件”是指使在测定对象物与氧化酶的反应条件至少有一处不同的至少两种条件下进行反应，从而获得至少两种测定值。作为不同的反应条件，并没有特别的限定，但举例有氧化酶的种类和/或量、反应温度、反应时间、介质的种类和/或量、亲水性高分子的种类和/或量、表面活性剂的种类和/或量、以及糖类的种类和/或量等。

本说明书中的“测定值”包括对测定对象物与氧化酶的反应进行检测的结果，具体地说，包括电流值、电阻值、吸光率、透光率、以及从这些获得的值(例如使用差分、面积、校正曲线计算出的浓度等)。

修正方法

在两种以上的预定的反应条件下，通过利用溶解氧浓度不同的多个样品事先获得测定值，能够事先对修正方法进行设定。例如，考虑有：使不同的反应系A及反应系B的测定值A和测定值B的商或差与溶解氧浓度相关联，从而对修正方法进行设定的方法。此外，在本说明书中，将通过本发明的测定方法修正了的测定值称作修正值。

作为修正方法的一个实施方式，举例有使用从反应系A及反应系B获得的测定值A及测定值B的商(B/A或A/B)来修正。作为一个例子，举例有将从测定值A获得的浓度A乘以测定值的商B/A从而获得修正后的浓度的方法。此外，作为从测定值A获得浓度A的方法，可以如以往那样、使用校正曲线等进行。所述修正方法基于以下知识：溶解氧对氧化酶反应系施加的影响依存于反应系中的氧化酶等试剂的量。并且，基于以下知识：在包含氧化酶的试剂的反应条件不同的反应系A及反应系B中，能够通过乘以测定值A及测定值B的商(B/A或A/B)进行修正。此外，在本实施方式中，从进一步提高修正精度的角度出发，优选在测定值的商的基础上再乘以修正系数c。所述常数依存于预定的反应条件，并可以通过在所述预定的反应条件下事先进行实验而容易地设定。因此，作为本实施方式优选的修正方式是如下修正：将从测定值A获得的浓度A乘以测定值的商B/A及修正系数c。常数c也可以为1。

作为修正方法的其他实施方式，考虑有下述实施方式：基于事先获得的数据使测定值A和测定值B的商或差与溶解氧浓度(或其范围)相关联，从而根据所述溶解氧浓度或所述范围，对是否进行修正及修正的内容(例如，修正量或修正系数等)进行设定。

生物传感器

在本发明的测定方法中，测定对象物与氧化酶的反应也可以在包含电极系统以及试剂层的生物传感器中进行，其中，所述电极系统具有工作电极及对电极，所述试剂层包含氧化酶，并且所述试剂层被配置在所述电极系统上。此外，所述试剂层一般包含介质。

作为生物传感器中的介质，例如，可以使用铁氰化钾、铁氰化钠、对苯醌及其衍生物、吩嗪二甲酯硫酸盐及其衍生物、靛酚及其衍生物、β-萘醌-4-磺酸钾、2，6-二氯靛酚、亚甲蓝、硝基四氮唑蓝、二茂铁及其衍生物、锇络合物、钌络合物、NAD⁺、NADP⁺以及吡咯喹啉醌(PQQ)等。

在生物传感器的试剂层中，也可以还含有亲水性高分子、表面活性剂以及糖类。这些进一步含有的成分可以使用在以往的氧化酶电极系统的生物传感器中使用的物质。

用于本发明的测定方法的生物传感器优选是包括两个以上的独立的电极系统的生物传感器。当是这样的生物传感器时，能够进行利用一次测定来对溶解氧的影响进行修正的测定。

因此，本发明在其他方式中涉及一种生物传感器，所述生物传感器是在本发明的测定方法中使用的生物传感器，其包括：具有配置在基板上的工作电极以及对电极的两个或两个以上的独立的电极系统、以及配置在所述电极系统中的至少两个电极系统上的氧化酶。在必要时，所述电极系统中的至少两个电极系统上还配置有介质。如上所述，优选在独立的两个以上的电极系统中形成有条件不同的试剂层。即，氧化酶的种类和/或量、介质的种类和/或量、亲水性高分子的种类和/或量、表面活性剂的种类和/或量、糖类的种类和/或量等中至少一个不同的试剂层是优选的。因此，本发明在其他方式中涉及一种生物传感器，其包括：具有配置在基板上的工作电极以及对电极的两个以上的独立的电极系统，以及配置在所述电极系统中的至少两个电极系统上的、能够在不同的条件下对同一样品中的同一测定对象物进行测定的含有氧化酶的试剂。

使用图1对用于本发明的测定方法的生物传感器的一个实施方式进行说明。图1是示出本发明的生物传感器的一个实施方式的构成的概略图的一个例子。本实施方式的生物传感器是如下的生物传感器：其包括具有配置在基板1上的工作电极2及对电极3的两个独立的电极系统、包括配置在各电极系统上的氧化酶及介质的试剂层4、流路5以及气孔6。但是，本发明的生物传感器并不仅限于所述实施方式。在图1的生物传感器中，被导入流路5的样品朝向气孔6流动，并在分支点分开从而与配置在电极2及电极3上的两个试剂层4接触并进行反应，其结果通过电极2及电极3被测定。

测定装置

本发明在另一个其他方式中涉及一种测定装置，所述测定装置包括：传感器部，所述传感器部取得通过样品中的测定对象物在两种以上的不同条件下与氧化酶发生反应而获得的两种或两种以上的测定结果的信息；存储部，所述存储部存储修正方法；计算部，所述计算部基于利用传感器部获得的信息选择被存储于存储部的修正方法并利用所述修正方法计算出所述信息的修正值；以及显示部，所述显示部显示所述修正值。本发明的测定装置可以在本发明的测定方法中使用。

使用图2对本发明的测定装置的一个实施方式进行说明。图2是示出本发明的测定装置的一个实施方式的构成的框图的一个例子。在图1中，本实施方式的测定装置包括控制部21、显示部22、传感器部23、计算部24、存储部25以及电源部26。本发明的测定装置可以是这些控制部、显示部、传感器部、计算部以及存储部中的一部分或全部成为一体的构成，也可以是这些装置分别独立的构成。

传感器部23是能够与生物传感器连接、并用于在连接(安装)有生物传感器后，例如取得电流值等信息的装置。因此，传感器部也可以包括例如电压施加部、电流值测定部等。存储部25是例如用于存储修正方法、修正系数，或存储用于选择修正方法的数据等的装置。

计算部24是用于基于利用传感器部23获得的信息来设定和/或选择存储于存储部25的修正方法、并利用所述修正方法对所述信息的修正值进行计算的装置。修正方法的选择例如可以通过比较存储于存储部25的数据和利用传感器部23获得的信息来进行，其中，所述数据是指将测定值和溶解氧浓度关联起来的数据和/或将测定值和修正系数等修正内容关联起来的数据。本发明中的“利用传感器部23获得的信息”可以包含利用传感器部的生物传感器检测出的测定值和基于所述测定值的数据(例如，平均值和方差等统计值或两个测定值的差等)。修正值的计算可以通过选择的修正方法恰当地确定，例如，可以通过将测定值与修正系数相乘进行。另外，当修正值为电流值等时，计算部24能够使用校正曲线等对测定对象物的浓度等进行计算。

显示部22是用于显示利用计算部24进行的计算的结果的装置，所述计算的结果包括例如经修正的浓度等、以及样品中的溶解氧的预测值、修正系数等。显示部22例如由液晶显示装置构成。

电源部26是用于向控制部21、显示部22、传感器部23、计算部24以及存储部25供应电力的装置。另外，当所述测定装置是包括电极的生物传感器用测定装置时，电源部26用于在生物传感器的工作电极与对电极之间施加电压，并对在工作电极与介质之间转移的电子的量进行测定。另外，控制部21是用于对显示部22、传感器部23、计算部24、存储部25以及电源部26进行控制的装置。

以下，以测定对象物为葡萄糖、生物传感器为包括电极系统的生物传感器的情况为例，使用图3的流程图对图2所示的使用了测定装置的测定对象物的测定方法进行说明。但是，当然地，以下的说明只是一个例子，本发明并非仅仅限定于此。

首先，将生物传感器安装于测定装置的传感器部23。然后，向生物传感器中导入血液等样品，并使样品中的测定对象物与氧化酶发生反应。然后，在传感器部23中，对生物传感器的工作电极及对电极施加电压，测定此时的响应电流值，并取得测定值(数据)(S31)。然后，进行如下判断：在控制部21中，是否取得了两种以上的不同条件下的测定值(数据)(S32)。当判断为未取得两种以上的不同条件下的测定值时，再次尝试取得数据(S31)。当判断为取得了两种以上的不同条件下的测定值时，在计算部24中进行修正方法的辨别处理(S33)。例如可以如下设定修正方法的辨别处理：所述修正方法的辨别处理由取得的数据和事先存储于存储部24的修正方法决定。然后，利用设定的修正方法进行数据的修正(S34)，并将修正值或基于修正值计算出的浓度等显示于显示部22(S35)。

实施例

两个GOD电极系统(电极系统A及电极系统B)中的葡萄糖的测定

使用包括两个GOD电极系统(电极系统A及电极系统B)的生物传感器对样品1至3进行测定。电极系统A及电极系统B中的试剂层包含的试剂如下述表1所示。此外，下述表1的单元(U)被定义为：能够在最适条件下(30℃的温度、最适于使化学反应进行的酸碱度)以1微摩(μmol)/分钟的速率使底物变化的酶量。另外，各样品中的葡萄糖及溶解氧的浓度如下述表2所示。样品1至3为使用静脉血制备。葡萄糖浓度通过添加葡萄糖来调整，溶解氧浓度通过振动包含所述静胍血的管来调整。此外，葡萄糖及氧浓度的测定方法如下所述。

表1

表2

利用生物传感器进行的测定

使用包括所述试剂层(A系统及B系统)的生物传感器对样品1至3进行测定(n＝8)。此外，对于测定装置，使用商品名为GA-1150(ARKRAY公司生产)的装置作为葡萄糖浓度测定器，使用商品名为ABL5(雷度米特公司生产)的装置作为溶解氧浓度测定器。其结果如下述表3所示。

表3

单位：μA

测定值与溶解氧浓度的关联和修正方法的决定

基于所述表3的数据，使A系统及B系统的测定值与样品中的溶解氧浓度相关联，并决定有以下的修正方法。此外，在本实施例中，下述修正系数为1.04。

修正值＝(从A系统数据获得的样品浓度)×(B系统的测定值/A系统的测定值)×修正系数

通过所述修正方法进行了修正的结果如下述表4及图4所示。下述表4示出了未修正值(仅参照A系统的测定值并将其应用于校正曲线获得的浓度)的平均值、标准偏差、变动系数、相对于基准值(336mg/dL)的偏差(％)，以及修正后的对应值。图4是示出了样品中的溶解氧浓度与修正前后的相对于基准值的偏差(％)的关系的图表。

表4

如所述表4及图4所示，能够获得利用所述修正方法降低了溶解氧的影响后的测定结果。

产业上的可利用性

本发明可以应用于医疗领域、生命科学领域以及生物研究领域。

标号说明

1：基板；

2：工作电极；

3：对电极；

4：试剂层；

5：流路；

6：气孔；

21：控制部；

22：显示部；

23：传感器部；

24：计算部；

25：存储部；

26：电源部。

Claims

1.一种测定方法，所述测定方法使用氧化酶对样品中的测定对象物进行测定，所述测定方法包括：

通过使样品中的测定对象物在两种以上的不同条件下与氧化酶发生反应来获得测定值；以及，

基于两个以上的测定值的结果和为了对样品中的溶解氧的影响进行修正而事先设定的修正方法来进行修正。

2.如权利要求1所述的测定方法，其中，

测定对象物与氧化酶的反应在包含电极系统以及配置在所述电极系统上的试剂层的生物传感器中进行，其中，所述电极系统具有工作电极及对电极，所述试剂层含有氧化酶。

3.如权利要求2所述的测定方法，其中，

所述试剂层还含有介质。

4.如权利要求2或3所述的测定方法，其中，

所述生物传感器是包括两个以上独立的电极系统的生物传感器。

5.一种生物传感器，所述生物传感器包括：

两个以上独立的电极系统，以及

含有氧化酶的试剂，其中，所述电极系统具有配置在基板上的工作电极及对电极，所述含有氧化酶的试剂被配置在所述电极系统中的至少两个电极系统上，并能够在不同的条件下对同一样品中的同一测定对象物进行测定。

6.如权利要求5所述的生物传感器，其中，

所述生物传感器用于权利要求1至4中任一项所述的测定方法。

7.一种测定装置，包括：

传感器部，所述传感器部取得通过样品中的测定对象物在两种以上的不同条件下与氧化酶发生反应而获得的两种以上的测定结果的信息；

存储部，所述存储部存储修正方法；

计算部，所述计算部基于利用传感器部获得的信息选择被存储于存储部的修正方法，并通过所述修正方法来计算所述信息的修正值；以及

显示部，所述显示部显示所述修正值。

8.如权利要求7所述的测定装置，其中，

所述测定装置用于权利要求1至4中任一项所述的测定方法。