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TWI468174B - 針對人類ｎｋｇ２ｄ的抗體及其用途 - Google Patents

針對人類ｎｋｇ２ｄ的抗體及其用途

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TWI468174B
TWI468174B TW097148871A TW97148871A TWI468174B TW I468174 B TWI468174 B TW I468174B TW 097148871 A TW097148871 A TW 097148871A TW 97148871 A TW97148871 A TW 97148871A TW I468174 B TWI468174 B TW I468174B
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TW
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hnkg2d
nkg2d
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seq
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TW097148871A
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Peter Andreas Nicolai Reumert Wagtmann
Inger Lund Pedersen
Anders Svensson
Original Assignee
Novo Nordisk As
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Publication date
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Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of TW200940089A publication Critical patent/TW200940089A/zh
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Description

針對人類NRG2D的抗體及其用途
本發明係關於對抗人類NKG2D(hNKG2D)的抗體，及其在人類患者中治療或預防疾病和病症上的用途。
免疫受體NKG2D正常係在人類CD8+ T細胞和NK細胞上表現。在預先-經活化之CD8+ 細胞上，人類NKG2D(hNKG2D)同二聚體受體經由其之DAP10聯合具有發送TCR和CD28+TCR信號的共同-刺激子之功能，但在NK細胞中，它具有直接活化子的功能。已經鑑認hNKG2D之各種配位體並定出其等的特徵，包括MHC第I類-關連配位體MICA和MICB、UL16-結合蛋白(ULBP)家族，以及視黃酸早期轉錄本-1(retinoic acid early transcript-1，RAET1)家族。
在慢性自體免疫疾病，如類風濕性關節炎中，hNKG2D表現在CD4+ CD28- T細胞的亞-組上，並涉及刺激其等增殖和IFNγ產生，且MIC表現被向上調節(Groh等人,PNAS 2003;100:9452)。亦已經顯示在克隆氏症(Crohn’s disease)中表現CD4+hNKG2D的T細胞經由MICA交互作用介導發炎和細胞毒反應(Allez等人,Gastroenterology 2007;132:2346-2358)。NKG2D在自體免疫發炎反應中為必要之驅動者的最初暗示，來自在糖尿病之鼠類模式中(NOD小鼠)，藉著單株抗體(mAb)與鼠類NKG2D(CX5)的結合及阻斷預防並治療發炎會引起糖尿病(Ogasawara等人,Immunity 2004;20:757-767)，暗示抗-NKG2D抗體的治療應用。已經在例如US 20050158307、WO 2005097160、WO 2005115517和WO 2006024367中描述這類應用。
雖然對抗人類NKG2D的鼠類mAb已被描述過(參見，例如Pende等人,Eur J Immunol 2001;31:1076-86，WO 02068615；Bauer等人,Science 1999;285:727-9；Castriconi等人,PNAS 2003;100:4120-25；和等人,Eur J Immunol 2004;34:1-11)或為市售的(例如得自R＆D Systems,MN,USA的抗體149810和得自Beckman Coulter Inc.的ON72)，這些是免疫性的。在文獻中描述的唯一完全人類抗-NKG2D mAb，據說對發送NKG2D-信號具有激動劑和拮抗劑兩種影響(Kwong等人,J Mol Biol 2008;384:1143-1156)，使其較不適合成為發炎性及/或自體免疫病症的治療劑。
因此，需要具有最適合治療發炎性及/或自體免疫疾病和病症用途之特性的抗-hNKG2D mAb。本發明解決這些及其他需要，並提供數個會在本文件其餘部分中描述的額外益處。
本發明提供適用於人類之治療應用的經分離之抗-hNKG2D單株抗體。典型地，該抗體為完全人類或經人類化的，以便在投予患者時使對抗該抗體之免疫反應的風險減至最少。如同在本文中描述的，可從這類抗體中設計或衍生其他的抗原-結合分子，像是例如抗原-結合抗體片段、抗體衍生物和多-專一性分子。
一方面，抗體的特徵在一或多個功能特性，或功能特性的組合。例示性的特性包括，例如預防hNKG2D-介導之表現hNKG2D之NK或T細胞的活化；與至少一個天然hNKG2D配位體或與數個配位體競爭對hNKG2D的結合；降低在表現hNKG2D之NK或T細胞的表面上hNKG2D的量；亦與食蟹獼猴及/或恆河猴NKG2D結合；每個hNKG2D二聚體僅與一個抗體分子結合；當加至表現hNKG2D之NK及/或T細胞時，與不超過2個hNKG2D二聚體交聯；在結合後對發送hNKG2D信號有不重要的激動劑影響；及/或以1nM或更低之解離常數(dissociation constant，KD)與hNKG2D結合。本發明的某些抗-hNKG2D抗體亦可或選擇性地與在本文中描述之一或多種特殊人類抗-hNKG2D抗體(包括抗體MS和21F2)競爭、基本上和該等抗體與相同抗原決定基結合，或以和該等抗體相同或較高的親和力結合。例如，在一具體事實中，該抗體亦或可選擇地比已知的鼠類抗-hNKG2D抗體(例如上述的抗體)更能夠競爭或阻斷MS及/或21F2的hNKG2D-結合。在一具體事實中，該抗體與MS及/或21F2結合相同的hNKG2D抗原決定基。在另一具體事實中，該抗體亦或可選擇地與MS結合相同的抗原決定基。在另一具體事實中，該抗體亦或可選擇地與21F2結合相同的抗原決定基。熟諳此藝者會瞭解由本發明之具體事實提供及/或在其中使用的抗體，可能展現出三、四或更多個上文-提及之特徵。
另一方面，該抗體亦或可選擇地包括一或多個抗原互補位(paratopes)及/或抗原-結合序列，其為與在本文中描述之MS或21F2抗原互補位及/或抗原-結合序列相同或類似的。
其他方面，本發明提供編碼本發明之抗體的核酸、包括這類核酸的表現載體、包括這類核酸的宿主細胞、產生本發明之抗體的宿主細胞，以及藉著在適當條件下培養這類宿主細胞產生抗-hNKG2D抗體的方法。
亦提供這類抗體的抗體-結合片段，以及包括這類抗原-結合片段的分子，包括經設計之抗體片段、抗體衍生物、雙專一性抗體和其他多專一性分子。
亦提供包括這類抗體或其他分子的醫藥組合物和套組或其他物件。
更提供使用這類抗體、分子和組合物，降低或抑制hNKG2D活化、發送hNKG2D信號、或表現hNKG2D之NK或T細胞之活化的方法、降低發炎反應之方法，以及治療或預防自體免疫及/或發炎性疾病或病症的方法，該疾病或病症包括但不限於類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、發炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)，包括克隆氏症(Crohn’s disease)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、全身性紅斑性狼瘡(systemic erythromatosis lupus，SLE)、牛皮癬(psoriasis)、牛皮癬性關節炎(psoriatic arthritis)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、乳糜瀉(celiac disease)、病毒疾病(像是例如病毒性肝炎(viral hepatitis))，以及各種器官和組織(包括但不限於心臟和骨髓)的移植排斥。
定義
當在本文中使用“hNKG2D”時，除非另行陳述或由前後文牴觸，名詞“NKG2D”，亦已知為“NKG2-D”、“CD314”、“D12S2489E”、“KLRK1”、“類殺手細胞凝集素受體亞家族K(killer cell lectin-like rceptor subfamily K)，成員1”和“KLRK1”意指人類殺手細胞活化受體基因，其mRNA(例如NCBI RefSeq NM_007360；SEQ ID NO:1)，及其基因產物(NCBI RefSeq NP_031386；SEQ ID NO:2)，或其天然存在的變體。在NK或T細胞中，hNKG2D受體的配位體-結合形式為同二聚體(Li等人,Nat Immunol 2001;2:443-451)。hNKG2D受體典型地以帶有DAP10的複合體出現在表面(Wu等人,J Exp Med 2000;192:1059及以下；NCBI登錄編號AAG29425，AAD50293)，並已經暗示亦形成更高級的複合體。任何在本文中被認為屬於hNKG2D的活性，例如細胞活化、抗體認知等等，亦可被認為屬於具有DAP10及/或另一個組份之複合體或更高級複合體之形式的hNKG2D。
在本文中以最廣義使用“抗體”一詞，且特別包括全長的單株抗體、多株抗體，除非另行陳述或由前後文牴觸，還有其抗原-結合片段、抗體變體和其多專一性分子，只要其等顯示想要的生物活性即可。通常，全長的抗體是糖蛋白，包括至少兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈，之間藉雙硫鍵連接，或其抗原結合部分。每個重鏈均包括重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個功能部位CH1、CH2和CH3。每個輕鏈均包括輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個功能部位，CL。可進一步將VH和VL細分成高變區，稱為互補性決定區(complementarily determining regions，CDR)，其間點綴著更經保留的區域，稱為架構區(framework regions，FR)。每個VH和VL均由三個CDRs和四個FRs構成，從胺基-端到羧基-端以下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重和輕鏈的可變區含有結合功能部位，其與抗原交互作用。在例如Harlow和Lane,抗體：實驗室手冊(ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)中提供抗體分子結構的一般原理和關於生產抗體的各種技術。
抗體的“抗原-結合片段”是包括全長抗體中能夠以可偵測方式與抗原結合之部分的分子，典型地包括至少VH區的一或多個部分。抗原-結合片段包括多價分子(其包括抗體的一、二、三或更多個抗原-結合部分)和單-鏈構築體(其中VL和VH區或其所選擇之部分，藉著合成連接子或藉著重組方法接合，形成有功能的抗原結合分子)。雖然可藉著較大抗體分子的實際碎裂(例如酵素切開)獲得抗體的一些抗原-結合片段，但大部分典型地是藉著重組技術產生。
在本文中可交替使用名詞“抗體衍生物”和“免疫共軛物”，代表包括全長抗體或其抗原-結合片段的分子，其中以化學方式修飾一或多個胺基酸，例如藉著烷基化、PEG化、醯基化、酯形成或醯胺形成，或類似者，例如為了將抗體連接至第二個分子。典型的修飾包括PEG化(例如半胱胺酸-PEG化)、生物素基化、放射性標示和與第二劑(如細胞毒劑)共軛。
“多專一性分子”包括抗體或其抗原-結合片段，其與至少一個其他功能的分子(例如另一個肽或蛋白質，如另一個抗體或受體之配位體)結合或連接，藉此形成與至少兩個不同結合位置或目標分子結合的分子。典型的多專一性分子包括雙-專一性抗體和與可溶性受體片段或配位體連接的抗體。
當在本文中使用“人類抗體”一詞時，想要包括具有其中架構和CDR區兩者均衍生自人類生殖種系免疫球蛋白序列(即與其相同或基本上與其相同)之可變區的抗體。此外，若該抗體含有恆定區，該恆定區亦衍生自人類生殖種系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包含不是由人類生殖種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如在試管內藉著隨機或指定位置突變生成，或在活體內藉著體細胞突變導入的突變)。然而，當在本文中使用“人類抗體”一詞時，不打算納入其中已經將衍生自其他哺乳動物物種，如小鼠，之生殖種系的CDR序列移植到人類架構序列上的抗體。
“經人類化的”抗體是人類/非-人類嵌合型抗體，其含有最少的序列衍生自非-人類免疫球蛋白。經人類化的抗體，大部分是人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中藉著得自非-人類物種，如小鼠、大鼠、兔子，或具有想要專一性、親和力及能力的非-人類靈長類之高變區(捐贈者抗體)的殘基，置換來自接受者之高變區的殘基。在某些情況下，藉著相對應的非-人類殘基置換人類免疫球蛋白的FR殘基。此外，經人類化的抗體可包括不是在接受者抗體中或在捐贈者抗體中找到的殘基。進行這些修改，以進一步精練抗體效能。通常，經人類化的抗體會包括實質上全部的至少一個，和典型地兩個可變功能部位，其中全部或實質上全部的高變環相當於非-人類免疫球蛋白者，且全部或實質上全部的FR殘基是人類免疫球蛋白序列者。經人類化的抗體亦可視需要包括至少一部分的免疫球蛋白恆定區(Fc)，典型地是人類免疫球蛋白的恆定區。關於更多細節，參見，例如Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)、WO 92/02190、美國專利申請案20060073137和美國專利第6750325號、6632927號、6639055號、6548640號、6407213號、6180370號、6054297號、5929212號、5895205號、5886152號、5877293號、5869619號、5821337號、5821123號、5770196號、5777085號、5766886號、5714350號、5693762號、5693761號、5530101號、5585089號和5225539號。
當在本文中使用“高變區”一詞時，意指為抗原結合的抗體胺基酸殘基。高變區通常包括得自“互補性決定區”或“CDR”的胺基酸殘基(在輕鏈可變功能部位中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和在重鏈可變功能部位中的31-35(H1)、50-65(L2)和95-102(H3)；Kabat等人(1991)免疫學感興趣的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5版,美國健康與人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services),NIH出版品第91-3242號)，及/或得自“高變環”的那些殘基(在輕鏈可變功能部位中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和在重鏈可變功能部位中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,J. Mol. Biol 1987;196:901-917)。典型地，藉著在Kabat等人，在前中描述的方法，將在該區域中的胺基酸殘基編號。在本文中，“Kabat位置”、“如同在Kabat中編號的可變功能部位殘基”和“根據Kabat”之類的片語，意指這種對重鏈可變功能部位或輕鍵可變功能部位編號的系統。使用Kabat編號系統，肽的實際線狀胺基酸序列可能含有較少或額外的胺基酸，相當於縮短或插入可變功能部位之FR或CDR內。例如，重鏈可變功能部位可在CDR H2的殘基52之後包含單一的胺基酸插入(殘基52a-根據Kabat)，以及在重鏈FR殘基82之後插入殘基(例如殘基82a、82b和82c等等-根據Kabat)。可藉著使抗體之序列的同種性區域與經“標準”Kabat編號的序列排成一直線，決定特定抗體的殘基之Kabat編號。
“架構區”或“FR”殘基是如本文定義之CDR以外的那些VH或VL殘基。
“抗原決定基”或”結合位置”為在抗原上，抗原-結合肽(如抗體)與其專一結合的領域或區域。蛋白質抗原決定基可包括直接涉及結合的胺基酸殘基(亦稱為抗原決定基之免疫優勢組份)，及其他並未直接涉及結合的胺基酸殘基，如藉著專一性抗原結合肽有效阻斷的胺基酸殘基(換句話說，該胺基酸殘基是在專一性抗原結合肽的”溶劑-排除表面(solvent-excluded surface)”及/或”足跡”內)。抗原決定基一詞在本文中包括在hNKG2D之任何特定區域中的兩型胺基酸結合位置，其專一地結合抗-hNKG2D抗體，或根據本發明之其他hNKG2D-專一性製劑，除非另行陳述(例如在某些前後文中，本發明係關於直接與特殊胺基酸殘基結合的抗體)。NKG2Ds可包括若干不同的抗原決定基，其可包括但不限於(1)直鏈肽抗原決定族，(2)構形抗原決定族，其由一或多個不連續，但在成熟NKG2D構形中彼此位置接近的胺基酸構成；和(3)轉譯後抗原決定族，其全部或一部分由與NKG2D共價附接之分子結構，如碳水化合物基團構成。除非另行指定或由前後文抵觸，構形抗原決定族包括與抗原-結合肽之原子距離在大約4內的NKG2D胺基酸殘基。
“溶劑-排除表面”為在電腦計算中，分子中不能由任何水分子到達的區域，例如因為該分子與配位體之結合(Lee和Richards,J Mol Biol 1971;55:379-400，以引用方式納入本文中)。
片語”與基本上與感興趣之抗體(例如MS或21F2)相同的抗原決定基或決定族結合”，意指該抗體與感興趣之抗體”競爭”對NKG2D分子(該感興趣之抗體對其專一地結合)的結合。
“抗原互補位”為在抗體之抗原-結合部分中與抗原專一結合的領域或區域。除非另行陳述或明顯地由前後文牴觸，抗原互補位可包括直接涉及抗原決定基結合的胺基酸殘基，其中數個典型地在CDRs中，及其他並未直接涉及結合的胺基酸殘基，如藉著經專一結合之抗原有效阻斷的胺基酸殘基(換句話說，該胺基酸殘基是在經專一結合之抗原的”溶劑-排除表面”及/或”足跡”內)。
抗-NKG2D抗體”阻斷”NKG2D分子與天然NKG2D-配位體(例如MICA)之結合的能力，意指在使用可溶性或細胞-表面所結合之NKG2D和配位體分子的測定中，可偵測到該抗體以劑量-依賴性之方式，降低了NKG2D-分子與配位體的結合，其中該NKG2D分子在沒有抗體下，以可偵測之方式與配位體結合。在實施例3中提供了判定抗-NKG2D是否能夠阻斷MICA-結合的典型測定。可使用相同的測定，測試抗體-介導之其他NKG2D配位體的阻斷。
多肽的“變體”意指具有實質上與參考多肽-典型地為天然或“親代”多肽相同之胺基酸序列的多肽。多肽變體可在天然胺基酸序列內的某些位置具有一或多個胺基酸取代、刪除及/或插入，及/或在一或兩端的添加。
在兩個胺基酸序列之前後文中“實質上相同的”一詞，意指當最適切地排成一直線-如藉著程式GAP或BEST-FIT，使用預設間隙權重時，該序列共享至少大約50百分比的序列同一性。典型地，實質上相同的序列會展現至少大約60、至少大約70、至少大約80、至少大約90、至少大約95、至少大約98或至少大約99百分比的序列同一性。
在兩個實質上相同之胺基酸序列中的“相對應”胺基酸位置，是藉著任何在本文中提及之蛋白質分析軟體排列者。
當以功能關係將核酸序列(或元件)放在其他核酸序列內時，其為“以可操作之方式與其他核酸序列(或元件)連接的”。例如，將前-序列或分泌前導子的DNA以可操作之方式與多肽(即編碼其等表現)的DNA連接(若其以參與該多肽分泌的前-蛋白質之形式表現)；將啟動子或促進子以可操作之方式與編碼性序列連接(若其影響該序列之轉錄)；或將核糖體結合位置以可操作之方式與編碼性序列連接(若將其放置於此得以促成轉譯)。通常，“以可操作之方式連接”意指正在連接的DNA序列是連續的，且在分泌前導子的情況下，是連續並可讀的碼。然而，有些元件-如促進子卻不一定與編碼性序列是連續的，並因此以可操作之方式連接。藉著在便利的限制位置連接而典型地完成連接。若沒有這類位置，便可根據傳統慣例使用合成的寡核苷酸接合子或連接子。
“經分離之”分子是關於其所屬之分子種類，在其中發現它之組合物中為主要物種的分子(即其構成組合物中至少大約50%的分子類型，且典型地會構成組合物中至少大約70%、至少大約80%、至少大約85%、至少大約90%、至少大約95%或更多的分子物種，例如肽)。通常，就所有出現在組合物中之肽物種的情況而言，或在提出用途的情況下至少關於在實質上有活性之肽物種，抗體分子的組合物會顯示出98%、98%或99%的抗體分子均一性。
在本發明之前後文中，“治療”或“治療”意指預防、減輕、管理、治癒或減少一或多個疾病或病症的症狀或臨床相關之徵候，除非由前後文牴觸。例如，已經鑑認無疾病或病症之症狀或臨床相關徵候之患者的“治療”是預防性或預防治療，而已經鑑認出疾病或病症之症狀或臨床相關徵候之患者的臨床、治病或減輕“治療”通常不構成預防性或預防治療。可將每種治療形式視為本發明的個別觀點。
本發明一部分基於抗-NKG2D抗體，其具有適用於治療患有NKG2D-相關疾病(像是自體免疫和發炎性疾病和病症)之人類患者的特性。本發明之抗體典型地是完全人類或經人類化的，以便使由患者自己的免疫系統對抗該抗體之免疫反應的風險減至最少，並以其活性形式-即在細胞表面上與DAP10結合之同二聚體，與hNKG2D結合。
本發明之抗體典型地可用來治療應降低NKG2D活性的疾病。這類抗體可藉著，例如與一或多個內源的NKG2D-配位體競爭或阻斷其等對NKG2D的結合、在結合後向下調節或另行降低細胞-表面NKG2D的量，及/或誘發對抗該細胞的ADCC或CDC反應，降低或抑制表現NKG2D之NK及/或T細胞的活化。
本發明之抗體一方面是拮抗劑，並與一或多個天然配位體(如MICA)競爭對人類NKG2D的結合，藉此降低配位體-誘導之NKG2D活化。MICA分子已經明顯涉及發炎性疾病，且如在實施例3中所示，數個人類抗體有效地阻斷了MICA與細胞-表面NKG2D的結合，特別是MS和21F2，而抗原決定基判定顯示MSFab阻礙了MICA結合(實施例11，圖20)。MS和21F2兩者在阻斷NK-細胞介導之細胞毒性(實施例6)方面，亦是極為有效的。因此，這些結果證實了本發明提供具有這類特性的抗體。
在更特殊的觀點中，本發明之抗體是有效的拮抗劑，但亦對發送hNKG2D信號有不重要的激動劑影響，因此不會促成NKG2D-推動的發炎反應。例如，如在圖19中所示，沒有偵測到經固定MS對CD3-誘發之PBMCs增殖有任何的共同-刺激，而經固定ON72結果產生少許但顯著的共同-刺激。無意受理論限制，該差異至少一部分可歸因於在抗原決定基上的差異，在圖20-22中所示。二價MS抗體之抗原-結合部分，與在hNKG2D二聚體複合體中的一個單體強有力地結合，但阻斷第二個MS抗體(或相同抗體之第二個抗原-結合部分)與第二個單體的結合。相對之下，當二價hzON72抗體之抗原-結合部分與在hNKG2D二聚體中的第一個單體結合時，其並未阻斷第二個hzON72抗體(或相同抗體之第二個抗原-結合部分)與第二個單體的結合。
在一具體事實中，本發明提供人類或經人類化之抗-NKG2D抗體，當將其加至表現NKG2D之NK或T細胞時，與不超過2個hNKG2D單體交-聯。較佳的是，這類抗體是二價的。對二價抗體(像是例如MS)來說，抗原-結合部分與NKG2D單體單元的結合，阻斷了對第二個NKG2D單體單元的更多結合，最多僅可交聯2個hNKG2D單體。相對之下，可與在hNKG2D二聚體中之NKG2D單體單元結合，不會阻斷與在hNKG2D二聚體中之第二個NKG2D單體單元結合的二價抗體，結果可與任何數目的hNKG2D二聚體交聯。表面受體的群聚經常發生在受體活化時。
在一具體事實中，本發明提供人類或經人類化之抗-NKG2D抗體，當將其加至表現NKG2D之NK或T細胞時，僅與在hNKG2D二聚體複合體中的一個單體強有力地結合。無意受理論限制，與二聚體之兩個單體的強有力結合，可能是NKG2D-受體活化的先決條件。MICA和hzON72均與在hNKG2D二聚體中的兩個單體單元強有力地結合。然而，MS對hNKG2D二聚體之結合受到與單體單元之一結合的支配，而與第二個單體單元的結合則是較弱且非專一的，且在第二個hNKG2D單體上有較小的溶劑-排除表面積(實施例11)。在不同且特佳的具體事實中，藉著本發明之抗體的結合，得自第一和第二個NKG2D單體單元的溶劑-排除表面積的比例，超過大約1:1，至少大約2:1或至少大約3:1。
在一具體事實中，本發明提供人類或經人類化之抗-NKG2D抗體，其與基本上與MS相同的抗原決定基結合。無意受理論限制，配位體與在hNKG2D二聚體上之特殊殘基或殘基組合的交互作用，可避免或將激動劑活性減至最少。在不同且特定的具體事實中，本發明之抗體的抗原決定基包括至少一個、至少3個、至少5個、至少8個、至少10個、至少12個，或全部選自由hNKG2D(SEQ ID NO:2)之Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208所組成之群組的殘基。
本發明一方面提供完整的人類抗體，或其抗原-結合片段，其有效地阻止NKG2D-介導的表現hNKG2D之NK或T細胞的細胞毒性，與至少MICA競爭對hNKG2D的結合；在結合後經由，例如刺激hNKG2D的向下調節、hNKG2D的內化及/或防止hNKG2D的再現，降低細胞-表面hNKG2D的量；對hNKG2D具有10nM或更低的親和力，與食蟹獼猴及/或恆河猴NKG2D交叉-反應；並為非-耗盡性的，例如藉著擁有IgG4同型物。在特殊的具體事實中，該抗體為IgG4同型物的非-耗盡性完整人類抗體，對hNKG2D具有1nM或更低的親和力，較佳的是300pM或更低，其阻斷至少50%、至少70%或至少90%的內源hNKG2D-配位體結合，並降低細胞-表面hNKG2D的量至少10%、至少30%或至少50%。在另一特殊的具體事實中，該抗體是IgG4同型物的二價非-耗盡性完整人類抗體，具有低於100pM的親和力，其對於阻斷全飽和劑量之MICA-Fc對細胞-表面所結合之NKG2D的結合具有低於0.01毫微克/毫升的EC50濃度，能夠在結合後降低細胞-表面NKG2D的量至少75%，並可視需要具有降低配位體-誘導之NK細胞細胞毒性的EC50濃度，該EC50濃度比與細胞-表面所結合之NKG2D結合所需的EC50濃度更低。該抗體更可能在使用表現NKG2D之細胞的測定中，在比獲得hNKG2D受體飽和所需之濃度(即飽和劑量)更低之濃度下，有能力達到其之hNKG2D向下調節的最大水平。
在以下的章節-包括實施例中，更詳細地描述了抗體(其專一地結合hNKG2D並具有一些或所有的這些特性)的生產、訂定特徵及用途。
抗-NKG2D抗體
藉著特殊功能及/或結構特徵或特性定出本發明之抗體的特徵。在實施例中詳細描述了評估抗-hNKG2D抗體之功能活性的測定，並在下文描述其結構特性，像是例如胺基酸序列。
功能特性
本發明之抗體與hNKG2D結合。在一具體事實中，本發明之抗體以高親和力與hNKG2D結合，例如以10-7 M或更低之KD、10-8 M或更低之KD、1nM或更低之KD、0.3nM或更低之KD、0.2nM或更低、0.1nM或更低、0.5nM或更低，或0.01nM或更低之KD。在特殊的具體事實中，該抗體以0.1nM或更低之親和力與hNKG2D結合。
本發明一方面提供亦與一或多個在猴子(如食蟹獼猴(長尾獼猴(Macaca fascicularis)，NCBI登錄編號AJ426429)和恆河猴(恆河猴(Macaca mulatto)，NCBI登錄編號AJ554302))中之NKG2D直系同源物(orthologs)，及/或與hNKG2D同二聚體、正確摺疊的單體全長hNKG2D、包括hNKG2D之細胞外部分的hNKG2D片段、經變性之hNKG2D，或與上述NKG2D形式之任何組合結合的抗體。例如，如同在實施例5中證實的，每個相對應EC50(即一半最大有效濃度)值，人類抗體21F2和MS與特定食蟹獼猴細胞類型的結合，分別為其等與相同人類細胞類型之結合的大約65%和大約75%以上。因此，在一具體事實中，本發明之抗體以類似其與hNKG2D結合的親和力或效力與食蟹獼猴及/或恆河猴NKG2D結合。例如，該抗體可以與表現NKG2D之人類NK或T細胞的相對應族群之相對應EC50的大約50%或更多、大約65%或更多，或大約75%或更多的EC50，與表現NKG2D之食蟹獼猴或恆河猴NK或T細胞結合。此外或另外，該抗體亦可以對hNKG2D之親和力的大約30%或更多、大約50%或更多、大約65%或更多，或大約75%或更多、大約80%或更多、大約85%或更多，或大約90%或更多的親和力，與食蟹獼猴或恆河猴NKG2D結合。這類抗體具有在用於人類之前，允許在最適合之動物模式中測試毒性的優點。
在一特殊的觀點中，本發明之抗體亦結合一種NKG2D形式，已知其不與鼠類抗-hNKG2D抗體，如ON72結合。明確地說，如同在實施例3中描述的，與ON72之預-培養僅阻斷大約85%後續加入之人類16F16抗體與hNKG2D的結合，但與16F16之預-培養卻阻斷了大約95%後續加入之ON72與hNKG2D的結合。
而且，本發明之抗體可降低或抑制hNKG2D-介導之NK或T細胞的活化，即拮抗hNKG2D受體。這可在例如在本文中描述或在技術領域中已知的一或多個細胞毒性測定中測試。例如，與在缺少任何抗-hNKG2D抗體下或在非-專一性之對照組抗體存在下殺死的目標細胞相比較，若抗體抑制NK-或T細胞-介導之殺死表現NKG2D-配位體之目標細胞至少10%，更佳的是至少30%，再更佳的是至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%，則該抗體抑制了hNKG2D-介導之NK或T細胞的活化。
為hNKG2D拮抗劑的本發明之抗體，可能沒有或有低激動劑活性。較佳的是，這類抗體是人類或經人類化的。可在本文描述的測定之一，或在技術領域中已知的測定中測試激動劑活性。例如，一型測定為共同-刺激測定，測量在有或無經固定抗-NKG2D抗體之下，以低水平CD3刺激周圍血液淋巴細胞(PBMCs)的增殖(參見實施例10)。在這類測定中，在有本發明之抗體下的增殖，比沒有抗體時高不超過30%、不超過20%、不超過10%、不超過5%或沒有明顯更高。較佳的是，在有本發明之抗體下的增殖，並沒有明顯地比沒有抗體時高。在額外或供選擇的具體事實中，本發明之抗體在激動劑測定中的hNKG2D激動劑活性，比對照組值高不超過30%、不超過20%、不超過10%、不超過5%或沒有明顯更高。對照組較佳的是陰性對照組，像是例如在沒有抗體、沒有細胞或其他試劑，及/或有無關之抗體時。較佳的是，本發明之抗體的激動劑活性並沒有明顯地比對照組值更高。
另一方面，本發明提供抗體，其對於阻斷配位體-誘導之細胞毒性具有比與NK或T細胞之細胞-表面NKG2D結合的EC50濃度更低的，較佳的是實質上更低的EC50濃度。例如，對於ON72，與在BaF/3細胞上表現之細胞表面NKG2D結合的EC50濃度(0.062微克/毫升)，與阻斷NK-細胞介導的殺死表現-配位體(ULBP3-)之目標細胞的EC50濃度(0.065微克/毫升)類似，但21F2卻具有比與細胞-表面NKG2D結合之EC50(21F2：0.033微克/毫升；MS：0.032微克/毫升)更低，而MS具有實質上更低的阻斷細胞毒性之EC50(21F2：0.021微克/毫升；MS：0.012微克/毫升)(參見實施例6和9)，而且，MS在比21F2和16F16(其具有相當於飽和濃度或更高的濃度，圖3)更低的濃度下(僅相當於細胞-所結合NKG2D-受體之大約80%飽和的濃度)，達到最大細胞毒性的阻斷。因此，在一具體事實中，本發明提供抗體，較佳的是人類或經人類化之抗體，其對於阻斷配位體-誘導之細胞毒性具有比與NK或T細胞之細胞-表面NKG2D結合的EC50更低的EC50濃度。阻斷細胞株或其他適當製劑之NK或T細胞之細胞毒性的EC50，可能是與相同細胞株或製劑之細胞-表面NKG2D結合之EC50的例如大約95%或更低、大約90%或更低、大約85%或更低、大約80%或更低、大約70%或更低、大約50%或更低或大約40%或更低。測試用的典型細胞株包括NK-92和NKL細胞。
在另一具體事實中，本發明提供抗體，其在比飽和可利用hNKG2D-受體所需之濃度更低的濃度下，達到最大NK細胞之細胞毒性的阻斷。在特定的具體事實中，該抗體亦與MS競爭對hNKG2D的結合。在另一特定的具體事實中，這類抗體與基本上與MS相同的hNKG2D抗原決定基結合。
抗體可藉著例如干擾一或多個內源hNKG2D-配位體的hNKG2D-結合，降低或抑制NKG2D-介導的活化。例如，抗體可降低或抑制MICA；MICB；ULBP1；ULBP2；ULBP4；及/或RAET1-家族成員的hNKG2D-結合；例如藉著降低或抑制MICA的；或MICA和MICB的；或MICA和ULBP3的；或MICA、MICB和ULBP3的；或MICA、MICB和所有ULBP1、-2、-3和4的；或MICA、MICB和一或多個RAET1家族成員的hNKG2D-結合。可使用在本文中描述的結合或競爭測定，評估抗體抑制內源NKG2D-配位體之hNKG2D-結合的能力。在一具體事實中，本發明之抗體能夠抑制至少30%的配位體結合或至少50%的配位體結合，或至少70%的配位體結合，或至少80%，或至少90%的配位體結合。在另一具體事實中，本發明之抗體抑制1微克MICA-mFc之hNKG2D-結合的IC50為1nM或更低、0.5nM或更低、0.2nM或更低、0.1nM或更低、0.05nM或更低，或0.02nM或更低、0.01nM或更低、0.005或更低或0.002或更低。在另一具體事實中，在5nM或更低、1nM或更低、0.7nM或更低、0.5nM或更低或0.2nM或更低、0.1nM或更低、0.05nM或更低，或大約0.02nM或更低的抗體濃度下，達到1微克MICA-mFc結合的完全阻斷。在一具體事實中，本發明提供抗體，尤其是人類抗體，其在降低或抑制配位體hNKG2D-結合上，像是例如MICA與hNKG2D結合，與任何ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217和149810一樣或比彼等更有效。
此外或另外，本發明之抗-hNKG2D抗體能夠在結合後(即之後)降低細胞-表面hNKG2D的量。在抗體結合後，降低細胞-表面所結合之hNKG2D，可能是一有利特徵，因為其降低了可用於配位體結合和後續活化之hNKG2D受體的量。無意受理論限制，該降低可能是由NKG2D的向下調節、內化或其他機制引起。如同在本文中所示，具有人類Fc-區的抗-hNKG2D抗體，如人類抗體，能夠有效地降低細胞-表面hNKG2D的量。例如，人類抗-hNKG2D抗體16F16、MS和21F2在沒有血清的隔夜培養之後，都降低了細胞-表面hNKG2D的量大約75%或更多，其中以MS最有效，在低濃度下達到75-90%的向下調節(圖15-17)。再者，在血清的存在下，在表現hNKG2D之BaF/3細胞上，相當於低於飽和濃度的MS濃度，達到最大的向下調節(圖16B)。因此，在一具體事實中，本發明提供與hNKG2D結合的抗體，其能夠在低於飽和濃度之下，達到最大hNKG2D的向下-調節。在另一具體事實中，這類抗體亦與MS競爭對hNKG2D的結合。在另一具體事實中，這類抗體亦與基本上與MS相同的hNKG2D抗原決定基結合。與在沒有抗-hNKG2D抗體之下或在非-專一性對照組抗體的存在下之細胞-表面hNKG2D相比較，本發明之抗體亦能夠降低細胞表面hNKG2D至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少70%或至少90%。較佳的是，該抗體達成細胞-表面NKG2D的降低，同時不引起或引起最少的發送NKG2D-受體信號之活化，即沒有或最少的激動劑活性。在本文中描述了評估細胞表面hNKG2D和抗-hNKG2D抗體之激動劑活性的典型測定。在一具體事實中，本發明提供抗體，特別是人類抗體，其能夠比選自ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217和149810之對照組抗體有更高程度的向下調節。在另一具體事實中，本發明之抗-hNKG2D抗體能夠在比飽和濃度更低的濃度下，達到藉著細胞或細胞株表現之細胞-表面NKG2D的最大向下調節。
在另一具體事實中，本發明提供抗體，其與在hNKG2D上，與16F16、16D31、MS及/或21F2，更佳的是MS及/或21F2相同的抗原決定基競爭及/或結合。可基於在本文中描述之標準hNKG2D結合測定中，其等與16F16、16F31、MS或21F2交叉-競爭的能力，來鑑認這類抗體。受試抗體抑制16F16、16F31、MS或21F2與hNKG2D結合的能力，證實該受試抗體可與16F16、16F31、MS或21F2競爭對hNKG2D的結合，並因此可與在hNKG2D上與16F16、16F31、MS或21F2相同的抗原決定基結合。在較佳的具體事實中，與在hNKG2D上與16F16、16F31、MS或21F2相同之抗原決定基結合的抗體是人類單株抗體。可按照在實施例中的描述製備並分離這類人類單株抗體。
在另一較佳的具體事實中，該抗體與不同於任何小鼠單株抗體ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217和149810的抗原決定基結合，並與16F16、16F31、MS或21F2有比對任一所列舉之小鼠單株抗體更多的交叉-競爭。
在一具體事實中，本發明之抗體的抗原決定基包括一或多個選自hNKG2D(SEQ ID NO:2)之Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208的殘基。在一具體事實中，本發明之抗體的抗原決定基包括5或多個選自hNKG2D(SEQ ID NO:2)之Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208的殘基。在一具體事實中，本發明之抗體的抗原決定基包括8、10、12或更多個選自hNKG2D(SEQ ID NO:2)之Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208的殘基。在一具體事實中，本發明之抗體的抗原決定基包括hNKG2D(SEQ ID NO:2)的殘基Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208。在一具體事實中，本發明之抗體的抗原決定基基本上由hNKG2D(SEQ ID NO:2)的殘基Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208構成。在一具體事實中，本發明之抗體的抗原決定基由一或多個選自hNKG2D(SEQ ID NO:2)之Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208的殘基構成。在一具體事實中，本發明之抗體的抗原決定基由hNKG2D(SEQ ID NO:2)的殘基Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208構成。
在一具體事實中，本發明之抗體的抗原決定基包括一或多個涉及氫-鍵結合的殘基，選自hNKG2D(SEQ ID NO:2)之Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Ile 181、Met 184、Gln 185、Lys 197、Thr 205和Asn 207。在一具體事實中，本發明之抗體的抗原決定基包括5或多個涉及氫-鍵結合的殘基，選自hNKG2D(SEQ ID NO:2)之Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Ile 181、Met 184、Gln 185、Lys 197、Thr 205和Asn 207。在一具體事實中，本發明之抗體的抗原決定基包括hNKG2D(SEQ ID NO:2)之Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Ile 181、Met 184、Gln 185、Lys 197、Thr 205和Asn 207。
本發明的較佳抗體展現出至少一個，更佳的是二、三、四、五個或更多的下列特性：(a)阻止NKG2D-介導的表現NKG2D之NK或T細胞的活化，可視需要有比與該細胞結合之EC50更低的降低配位體-誘導之細胞毒性的EC50；(b)與至少一個NKG2D配位體競爭對NKG2D的結合，較佳的是與至少MICA和ULBP3競爭；(c)降低在表現NKG2D之NK或T細胞表面上之NKG2D的量，較佳的是至少75%；(d)與食蟹獼猴及/或恆河猴NKG2D結合，較佳的是以不低於其與hNKG2D結合之親和力的50%；(e)與一種以上NKG2D的形式或構象結合；(f)以1nM或更低，較佳的是0.1nM或更低之Kd，與NKG2D結合；(g)與一或多個16F16、16F31、MS或21F2競爭對hNKG2D的結合；(h)比起與ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217和149810中任一個，更與16F16、16F31、MS或21F2競爭對NKG2D的結合；(i)阻斷超過90%之對細胞-表面hNKG2D的16F16、MS或21F2；(j)具有不重要的激動劑活性，且(k)與基本上與任何16F16、16F31、MS及/或21F2相同的抗原決定基結合。上述功能特徵的任何組合，及/或如同在實施例中描述的功能特徵，均可由本發明之抗體展現。
結構特性
本發明的較佳抗體是按照在實施例中之描述來生產、分離並定出結構和功能特徵的人類單株抗體16F16、16F31、MS和21F2。在表1中陳述這些抗體的全長、可變和CDR序列。
因此，本發明之一典型觀點本發明的某些抗-NKG2D抗體，具有與MS相同或類似的抗原互補位。在一具體事實中，該抗體具有包括相當於一或多個MSL鏈(SEQ ID NO:41)之Tyr 33和Trp 97，及/或一或多個MS H鏈(SEQ ID NO:40)之Glu 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98和Asp 99之殘基的抗原互補位。在一具體事實中，該抗體具有包括相當於MSL鏈(SEQ ID NO:41)之Tyr 33和Trp 97，及/或3、5、7、10或更多個MS H鏈(SEQ ID NO:40)之Glu 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98和Asp 99之殘基的抗原互補位。在一具體事實中，該抗體具有包括相當於MSL鏈(SEQ ID NO:41)之Tyr 33和Trp 97，及MS H鏈(SEQ ID NO:40)之Glu 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98和Asp 99之殘基的抗原互補位。在一具體事實中，該抗體具有基本上由相當於MSL鏈(SEQ ID NO:41)之Tyr 33和Trp 97，及MS H鏈(SEQ ID NO:40)之Glu 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98和Asp 99之殘基構成的抗原互補位。在一具體事實中，該抗體具有由相當於MS L鏈(SEQ ID NO:41)之Tyr 33和Trp 97，及MS H鏈(SEQ ID NO:40)之Glu 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98和Asp 99之殘基構成的抗原互補位。
假使所有的16F16、16F31、21F2和MS都與hNKG2D結合，便有可能”混合並配對”這些抗體各自的VH和VL序列，以創造本發明其他的抗-hNKG2D結合分子。可使用在本文中描述的結合測定(例如流動式細胞測量術、Biacore、ELISAs)，及/或使用如在本文中描述的細胞毒性測定，測試這類”經混合並配對”之抗體的hNKG2D-結合。較佳的是，當混合並配對VH和VL鏈時，以結構類似的VH序列代替得自特殊VH/VL對的VH序列。同樣地，較佳的是以結構類似的VL序列代替得自特殊VH/VL對的VL序列。
因此，本發明一方面提供經分離之單株抗體，或其抗原結合部分，包括：(a)包括選自由SEQ ID NO：11、13、44和46所組成之群組的胺基酸序列的VH區，以及(b)包括選自由SEQ ID NO：12、14、45和47所組成之群組的胺基酸序列的VL區；其中該抗體與hNKG2D結合。較佳的重和輕鏈組合包括：(a)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VH區；和(b)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列的輕鏈可變區；(a)包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列的重鏈可變區；和(b)包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列的輕鏈可變區；(a)包括SEQ ID NO：44之胺基酸序列的VH區；和(b)包括SEQ ID NO：45之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(a)包括SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區；和(b)包括SEQ ID NO：47之胺基酸序列的輕鏈可變區。
另一方面，本發明提供抗體，其包括16F16、16F31、MS或21F2之重鏈和輕鏈CDR1s、CDR2s及/或CDR3s，或其組合。使用Kabat系統記述CDR區(Kabat等人(1991)免疫學感興趣之蛋白質的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，美國健康與人類服務部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH出版品第91-3242號)。參見，例如圖4和5。假如這些抗體均可與hNKG2D結合，且主要是由CDR1、2和3區提供抗原-結合專一性，VH CDR1、2和3序列與VL CDR1、2和3序列可“被混合並配對”(即可將得自不同抗體的CDRs混合並配對，雖然每個抗體可含有VH CDR1、2和3及VL CDR1、2和3)，以創造本發明其他的抗-hNKG2D結合分子。可使用上文和在實施例中描述的結合測定(例如流動式細胞測量術、Biacore或ELISAs)，測試這類“經混合並配對之”抗體的hNKG2D-結合。較佳的是，當混合並配對VH CDR序列時，以結構類似的CDR序列(們)代替得自特殊VH序列的CDR1、CDR2及/或CDR3序列。同樣地，當混合並配對VL CDR序列時，以結構類似的CDR序列(們)代替得自特殊VL序列的CDR1、CDR2及/或CDR3序列。例如，16F16、16F31、MS和21F2的VL CDR1s和CDR3s與MS和21F2的VL CDR2序列共享一些結構類似性，並因此可接受混合和配對。熟諳此藝者會迅速知道可藉著以得自在本文中對於單株抗體16F16、16F31、MS和21F2揭示之CDR序列的結構類似之序列，取代一或多個VH及/或VL CDR區序列，創造新穎的VH和VL序列。
因此，另一方面，本發明提供經分離之單株抗體，或其抗原結合部分，包括：(a)包括選自由SEQ ID NO:15、21、48和54所組成之群組的胺基酸序列的VH CDR1；和(b)包括選自由SEQ ID NO:16、22、49和55所組成之群組的胺基酸序列的VH CDR2；(c)包括選自由SEQ ID NO:17、23、50和56所組成之群組的胺基酸序列的VH CDR3；(d)包括選自由SEQ ID NO:18、24、51和57所組成之群組的胺基酸序列的VL CDR1；(e)包括選自由SEQ ID NO:19、25、52和57所組成之群組的胺基酸序列的VL CDR2；以及(f)包括選自由SEQ ID NO:20、26、53和59所組成之群組的胺基酸序列的VL CDR3；其中該抗體與hNKG2D結合。
在較佳的具體事實中，該抗體包括；(a)包括SEQ ID NO:15之VH CDR1；(b)包括SEQ ID NO:16之VH CDR2；(c)包括SEQ ID NO:17之VH CDR3；(d)包括SEQ ID NO:18之VL CDR1；(e)包括SEQ ID NO:19之VL CDR2；和(f)包括SEQ ID NO:20之VL CDR3。
在另一較佳的具體事實中，該抗體包括：(a)包括SEQ ID NO:21之VH CDR1；(b)包括SEQ ID NO:22之VH CDR2；(c)包括SEQ ID NO:23之VH CDR3；(d)包括SEQ ID NO:24之VL區CDR1；(e)包括SEQ ID NO:25之VL CDR2；和(f)包括SEQ ID NO:26之VL CDR3。
在另一較佳的具體事實中，該抗體包括：(a)包括SEQ ID NO:48之VH CDR1；(b)包括SEQ ID NO:49之VH CDR2；(c)包括SEQ ID NO:50之VH CDR3；(d)包括SEQ ID NO:51之VL區CDR1；(e)包括SEQ ID NO:52之VL CDR2；和(f)包括SEQ ID NO:53之VL CDR3。
在另一較佳的具體事實中，該抗體包括：(a)包括SEQ ID NO:54之VH CDR1；(b)包括SEQ ID NO:55之VH CDR2；(c)包括SEQ ID NO:56之VH CDR3；(d)包括SEQ ID NO:57之VL區CDR1；(e)包括SEQ ID NO:58之VL CDR2；和(f)包括SEQ ID NO:59之VL CDR3。
在另一較佳的具體事實中，該抗體包括:(a)由SEQ ID NO:15組成的VH CDR1；(b)由SEQ ID NO:16組成的VH CDR2；(c)由SEQ ID NO:17組成的VH CDR3；(d)由SEQ ID NO:18組成的VL CDR1；(e)由SEQ ID NO:19組成的VL CDR2；和(f)由SEQ ID NO:20組成的VL CDR3。
在另一較佳的具體事實中，該抗體包括:(a)由SEQ ID NO:21組成的VH CDR1；(b)由SEQ ID NO:22組成的VH CDR2；(c)由SEQ ID NO:23組成的VH CDR3；(d)由SEQ ID NO:24組成的VL區CDR1；(e)由SEQ ID NO:25組成的VL CDR2；和(f)由SEQ ID NO:26組成的VL CDR3。
在另一較佳的具體事實中，該抗體包括:(a)由SEQ ID NO:48組成的VH CDR1；(b)由SEQ ID NO:49組成的VH CDR2；(c)由SEQ ID NO:50組成的VH CDR3；(d)由SEQ ID NO:51組成的VL區CDR1；(e)由SEQ ID NO:52組成的VL CDR2；和(f)由SEQ ID NO:53組成的VL CDR3。
在另一較佳的具體事實中，該抗體包括：(a)由SEQ ID NO:48組成的VH CDR1；(b)由SEQ ID NO:49組成的VH CDR2；(c)由SEQ ID NO:50組成的VH CDR3；(d)由SEQ ID NO:51組成的VL區CDR1；(e)由SEQ ID NO:52組成的VL CDR2；和(f)由SEQ ID NO:53組成的VL CDR3，以及相當於一、二個或所有在MSH鏈(SEQ ID NO:40)中之Gln 1、Asp 26和Asp 27的殘基。
在另一較佳的具體事實中，該抗體包括：(a)由SEQ ID NO:54組成的VH CDR1；(b)由SEQ ID NO:55組成的VH CDR2；(c)由SEQ ID NO:56組成的VH CDR3；(d)由SEQ ID NO:57組成的VL區CDR1；(e)由SEQ ID NO:58組成的VL CDR2；和(f)由SEQ ID NO:59組成的VL CDR3。
在某些具體事實中，本發明之抗體包括得自特殊生殖種系H鏈免疫球蛋白基因的VH區，或特殊生殖種系H鏈免疫球蛋白基因的組合，及/或得自特殊生殖種系L鏈免疫球蛋白基因的VL區，或特殊生殖種系L鏈免疫球蛋白基因的組合。例如，可在活體內經由在B細胞中的體細胞重組，獲得這類組合。
例如，在一具體事實中，本發明提供經分離之抗-hNKG2D抗體，或其抗原-結合片段，其中該抗體:(a)包括得自以人類D3-9、D3-10或D3_10_R3基因和JH3、JH4或JH6基因重組之人類VH3_21、VH3_20、VH4_59或VH5_51基因的VH區，(b)包括衍生自以人類JK1、JK2或JK3基因重組之人類VKⅠ_L15或VKⅢ_A27或VKⅢ_L6基因的VL區，且(c)該抗體與hNKG2D結合。
在另一具體事實中，本發明提供經分離之抗-hNKG2D抗體，或其抗原-結合片段，包括藉著人類VH3_21、D3-9和JH4基因之重組而獲得的VH區和藉著人類VKⅠ_L15和JK2基因之重組而獲得的VL區。
在另一具體事實中，本發明提供經分離之抗-hNKG2D抗體，或其抗原-結合片段，包括藉著人類VH3_20、D3-10和JH6基因之重組而獲得的VH區和藉著人類VKⅢ_A27和JK3基因之重組而獲得的VL區。
在另一具體事實中，本發明提供經分離之抗-hNKG2D抗體，或其抗原_結合片段，包括藉著人類VH4_59、D基因和JH3基因之重組而獲得的VH區和藉著人類VKⅢ_A27和JK1基因之重組而獲得的VL區。
在另一具體事實中，本發明提供經分離之抗-hNKG2D抗體，或其抗原-結合片段，包括藉著人類VH5_51、D3_10_R3和JH4基因之重組而獲得的VH區和藉著人類VKⅢ_L6和JK1基因之重組而獲得的VL區。
在不同且特殊的具體事實中，本發明提供藉著在上述抗-hNKG2D抗體之VH及/或VL區，導入一、二、三、四或更多個胺基酸取代及/或體細胞超突變(hypermutation)而獲得的經分離之抗-NKG2D抗體。
當在本文中使用時，人類抗體包括“屬於”或“衍生自”特殊生殖種系序列，或為其“之產物”的重或輕鏈可變區，若該抗體之可變區係獲自使用人類生殖種系免疫球蛋白基因的系統(如下述)。這類”系統”包括以感興趣之抗原免疫帶有人類免疫球蛋白基因的基因轉殖小鼠，或利用感興趣之抗原篩選展現在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫。可藉著比較人類抗體的胺基酸序列與人類生殖種系免疫球蛋白的胺基酸序列，並選擇在序列中與人類抗體之序列最接近(即最大%同一性)的人類生殖種系免疫球蛋白序列，來鑑認“屬於”或“衍生自”人類生殖種系免疫球蛋白序列或為其“之產物”的人類抗體。與生殖種系序列相比較，“屬於”或“衍生自”特殊人類生殖種系免疫球蛋白序列或為其“之產物”的人類抗體，可含有胺基酸差異，歸因於例如天然存在的體突變或故意導入的指定位置突變(們)(其可能是經選擇之取代)。
然而，人類抗體在胺基酸序列中，典型地與由經重組生殖種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸序列為至少90%相同的，並經常可在與其他物種之生殖種系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類生殖種系序列)相比較時，鑑認其正是人類。在某些情況下，人類抗體在胺基酸序列中可能與由經重組之生殖種系免疫球蛋白基因編碼的胺基酸序列是至少95%，或甚至至少96%、97%、98%或99%相同的。
典型地，衍生自特殊人類生殖種系序列的人類抗體，會顯現與由該人類生殖種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列有不超過10個胺基酸差異。在某些情況下，該人類抗體可顯現與由經重組之生殖種系免疫球蛋白基因編碼的胺基酸序列有不超過8個、不超過5個或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異，或沒有胺基酸差異。
在另一具體事實中，本發明之抗體包括重和輕鏈可變區，該可變區包括與在本文中描述之較佳抗體的胺基酸序列同種的胺基酸序列，且其中該抗體仍保留本發明之抗-hNKG2D抗體的想要功能特性。例如，本發明提供經分離之抗體，或其抗原結合部分，其包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：(a)VH區包括與選自由SEQ ID NO:11、13、44和46所組成之群組的胺基酸序列至少有80%相同的胺基酸序列；(b)VL區包括與選自由SEQ ID NO:12、14、45和47所組成之群組的胺基酸序列至少有80%相同的胺基酸序列；(c)該抗體與hNKG2D結合，並顯示出至少一個在本文中描述的功能特性，較佳的是數個在本文中描述的功能特性。
在其他的具體事實中，VH及/或VL胺基酸序列可能與上述序列是85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的。可藉著編碼SEQ ID NO:11-14或44-47之核酸分子的突變誘發(例如指定位置或PCR-介導之突變生成作用)，獲得具有與上述序列之VH和VL區有高(即80%或更高)同一性的VH和VL區的抗體，接著使用在本文中描述的功能測定，針對經保留之功能(例如hNKG2D結合親和力、hNKG2D-配位體阻斷、hNKG2D向下調節或降低NKG2D-介導之NK或T細胞的活化)來測試經編碼改變的抗體。
在兩個序列之間的同一性百分比是由序列共享之相同位置數目的函數(即同一性%=相同位置的數目/位置之總數X100)，考慮為了兩個序列之最佳排列而需要導入的間隙數目和每個間隙的長度。可使用在序列分析軟體中的數學演算法，完成序列的比較並決定在兩個序列之間的同一性百分比。用來測量類似性的蛋白質分析軟體配對類似的序列，指派各種取代、刪除和其他的修飾，包括保留性胺基酸置換。
例如，可使用Needleman和Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453(1970))演算法，決定在兩個胺基酸序列之間的同一性百分比，已經將該演算法併入在GCG套裝軟體中的GAP程式內(可在http://www.gcg.com 獲得)，其使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，間隙權重為16、14、12、10、8、6或4，且長度權重為1、2、3、4、5或6。
亦可使用FASTA比較多肽序列，其應用預設或經建議之參數。在GCG 6.1版中的程式，FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供在問題和搜尋序列之間最佳重疊區域的排列和序列同一性百分比(Pearson,Methods Enzymol. 1990;183:63-98;Pearson,Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219)。
亦可使用E. Meyers和W. Miller的演算法(Comput. Appl. Biosci.,1988;11-17)決定在兩個胺基酸序列之間的同一性百分比，已經將該演算法併入ALIGN程式(2.0版)內，其使用PAM250重量殘基表、12之間隙長度罰點和4之間隙罰點。
其他比較一序列與在資料庫中所含之其他序列的演算法是電腦程式BLAST，尤其是blastp，其使用預設參數。參見，例如Altschul等人,J. Mol. Biol. 1990;215:403-410；Altschul等人,Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402(1997)；分別以引用方式納入本文中。在其可使用本發明之蛋白質序列當作“問題序列”，對公開的資料庫進行搜尋，例如，以鑑認相關的序列。可使用Altschul等人1990(在前)的XBLAST程式(2.0版)進行這類搜尋。可利用XBLAST程式進行BLAST蛋白質搜尋，分數=50，字長=3，獲得與本發明之抗體分子同種的胺基酸序列。為了比較而欲獲得經添加間隙的排列，可使用如同在Altschul等人,1997(在前)中描述之Gapped BLAST。當使用BLAST和Gapped BLAST程式時，可使用個別程式(例如XBLAST和NBLAST)的預設參數。參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov 。
在某些具體事實中，本發明之抗體包括VH區(其包括CDR1、CDR2和CDR3序列)和VL區(其包括CDR1、CDR2和CDR3序列)，其中這些CDR序列之一或多個包括基於在本文中描述的較佳抗體之經指定的胺基酸序列；16F16、16F31、MS或21F2，其中一或多個CDRs可視需要含有一或多個保留性胺基酸修飾，且其中該抗體仍保留本發明之抗-hNKG2D抗體的想要功能特性。因此，本發明提供經分離之抗體，或其抗原-結合片段，其包括重鏈可變區(其包括CDR1、CDR2和CDR3序列)和輕鏈可變區(其包括CDR1、CDR2和CDR3)，其中：(a)VH區CDR3序列，其包括選自由SEQ ID NO:17、23、50和56之胺基酸序列所組成之群組的胺基酸序列；(b)VL區CDR3序列，其包括選自由SEQID NO:20、26、53和59之胺基酸序列所組成之群組的胺基酸序列；(c)一或多個CDRs可視需要含有一或多個保留性胺基酸修飾，且(d)該抗體與hNKG2D結合，並表現出至少一個在本文中描述的功能特性，更佳的是數個在本文中描述的功能特性。
在更進一步的具體事實中，該VH區CDR2序列包括選自由SEQ ID NO:16、22、49和55之胺基酸序列所組成之群組的胺基酸序列；且該VL區CDR2序列包括選自由SEQ ID NO:19、25、52和58之胺基酸序列所組成之群組的胺基酸序列，其中一或多個CDRs可視需要含有一或多個保留性胺基酸修飾。
在仍然更進一步的具體事實中，該VH區CDR1序列包括選自由SEQ ID NO:15、21、48和54之胺基酸序列所組成之群組的胺基酸序列，及其保留性修飾；且該VL區CDR1序列包括選自由SEQ ID NO:18、24、51和57之胺基酸序列所組成之群組的胺基酸序列，其中一或多個CDRs可視需要含有一或多個保留性胺基酸修飾。
當在本文中使用時，“保留性胺基酸修飾”一詞打算意指沒有明顯影響或改變含有該胺基酸序列之抗體的結合特徵的胺基酸修飾。這類保留性修飾包含胺基酸取代、添加和刪除。可藉著在技術領域中已知的標準技術，像是例如指定位置之突變誘發和PCR-介導之突變誘發，將該修飾導入本發明之抗體內。包括胺基酸修飾的抗體序列，當與親代抗體相比較時，典型地與在親代中之相對應胺基酸序列是至少90%，較佳的是至少95%、98%或99%相同的，及/或當與親代抗體序列相比較時，包括最多10，較佳的是最多5、4、3、2個胺基酸修飾。
“保留性”胺基酸置換，典型地為其中以具有帶有類似物化特性之側鏈的胺基酸殘基置換一胺基酸殘基者。在技術領域中已經定義具有類似側鏈之胺基酸殘基的家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈的胺基酸(例如天冬胺酸、穀胺酸)、具有不帶電極性側鏈的胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈的胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β-分支側鏈的胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)和具有芳香族側鏈的胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。
因此，在本發明抗體之CDR區內的一或多個胺基酸殘基，可以另一個來自相同側鏈家族的胺基酸殘基置換，並可使用在本文中描述的功能測定，針對經保留之功能(即在上文(c)、(d)和(e)中陳述的功能)測試經改變之抗體。
抗原-結合片段
本發明之抗-hNKG2D抗體，可製備成全長抗體或其抗原-結合片段。抗原-結合片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)3、Fv(典型地是抗體之單臂的VL和VH功能部位)、單-鏈Fv(scFv；參見例如Bird等人,Science 1988;242:423-426；和Huston等人PNAS 1988;85:5879-5883)、dsFv、Fd(典型地是VH和CH1功能部位)，以及dAb(典型地是VH功能部位)片段；VH、VL、VhH和V-NAR功能部位；包括單一VH和單一VL鏈的單價分子；微型抗體(minibodies)、微型雙功能抗體(diabodies)、微型三功能抗體(tribodies)、微型四功能抗體(tetrabodies)和κ體(參見，例如I11等人,Protein Eng 1997;10:949-57)；駱駝IgG；IgNAR；以及一或多個經分離之CDRs或有功能的補位(paratope)，在此處經分離之CDRs或抗原-結合殘基或多肽可結合或連接在一起，以便形成有功能的抗體片段。已經在例如Holliger和Hudson,Nat Biotechnol 2005;23:1126-1136；WO2005040219和經公開的美國專利申請案20050238646和20020161201中描述或回顧了各種類型的抗體片段。
可使用傳統的重組或蛋白質設計技術，獲得抗體片段，並可就抗原-結合或其他功能，以與完整抗體相同的方式篩選該片段。
已經發展出各種產生抗體片段的技術。在傳統上，這些片段係經由全長抗體的蛋白水解消化(proteolytic digestion)衍生(參見，例如Morimoto等人,Journal of Biochemical and Biophysical Methods,24:107-117(1992)；和Brennan等人,Science,229:81(1985))。然而，現在可藉著重組宿主細胞直接產生這些片段。或者，可從大腸桿菌中直接回收Fab’-SH片段，並以化學方式偶聯，形成F(ab’)2片段(Carter等人,Bio/Technology,10:163-167(1992))。根據其他的方法，可直接從重組的宿主細胞培養物中分離F(ab’)2片段。在其他的具體事實中，選擇的抗體為單-鏈Fv片段(scFv)。參見WO1993/16185；美國專利第5,571,894號；和美國專利第5,587,458號。抗體片段也可以是“直線抗體”，例如，如在美國專利第5,641,870號中描述的，舉例而言。這類直線抗體片段可以是單專一或雙專一性的。
多專一性分子
另一方面，本發明之特徵為多專一性分子，其包括本發明之抗-hNKG2D抗體或其抗原-結合片段。這類多專一性分子包括雙專一性分子，其包括至少一個對hNKG2D的第一個結合專一性，和對第二個目標抗原決定基的第二個結合專一性。
雙專一性分子之一類型為雙專一性抗體。雙專一性抗體是對至少兩個不同抗原決定基具有結合專一性的抗體。製造雙專一性抗體的方法為在技術領域中已知的，且全長雙專一性抗體的傳統產製，經常是基於兩個免疫球蛋白重-鏈-輕-鏈對的共同表現，在此處這兩個鏈具有不同的專一性(Millstein等人,Nature,305:537-539(1983))。可以全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙專一性抗體)或任何在本文中描述的其他抗原-結合片段之形式製備雙專一性抗體。
在根據本發明之雙專一性抗體中，至少一個結合性抗原決定基是在hNKG2D蛋白質上。可將該抗-NKG2D-結合性部分與第二個結合部分混合，該第二個結合部分與在前-發炎性白血球上的分子-例如T-細胞受體分子(例如CD2、CD3、CD4或CD8)結合，以致於使細胞的防禦機制集中在表現前-發炎性hNKG2D的細胞上。在該具體事實中，可使用雙專一性抗體，例如指揮細胞毒劑於，或ADCC/CDC攻擊於，表現NKG2D的前-發炎性細胞。該細胞毒劑可以是例如肥皂草毒素(saporin)、抗-干擾素-α劑、長春花生物鹼(vinca alkaloid)、蓖麻毒素(ricin)A鏈、胺甲碟呤或放射性同位素。
在另一具體事實中，第二個部分與細胞-結合目標結合，該目標出現在與疾病狀態(其正常由效應物白血球調節，如癌症、病毒感染或類似者)有關的細胞上或由該細胞表現。因此，例如，典型的目標可能是與細胞壓力結合的分子，如MIC分子(例如MIC-A或MIC-B)或ULBP(例如Rae-1、H-60、ULBP2、ULBP3、HCMV UL18或Rae-1β)或與病原體-結合之分子，如病毒的血球凝集素。
其他多專一性分子包括由hNKG2D-結合抗體部分與一或多個其他非-抗體蛋白質之融合而產生者。已經在技術領域中描述了這類多專一性蛋白質及如何建構其等。參見，例如Dreier等人(Bioconjug. Chem. 9(4):482-489(1998))；美國專利第6,046,310號；美國專利公開案第20030103984號；歐洲專利申請案1 413 316；美國專利公開案第20040038339號；von Strandmann等人,Blood(2006；107:1955-1962)，以及WO2004056873。根據本發明，非-抗體蛋白質可以是，例如，在先前段落中描述之“第二個部分”之任何抗原的適當配位體；例如T-細胞或Fc受體的配位體，或細胞-壓力分子，如MIC-A、MIC-B、ULBP或與病原體-結合之分子，如病毒的血球凝集素。
亦考慮具有兩價以上的多專一性分子。例如，可製備三專一性抗體。Tutt等人,J. Immunol,147:60(1991)。
可藉著使用在技術領域中已知的方法，使組成的結合專一性共軛，來製備本發明之多專一性分子。例如可分別產製多專一性分子的每個結合專一性，然後彼此共軛。當結合專一性為蛋白質或肽時，可使用各種偶聯或交聯劑進行共價共軛。交聯劑的實例包括蛋白質A、碳二醯亞胺、N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰-苯二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(參見，例如Karpovsky等人(1984)J. Exp. Med. 160:1686；Liu,MA等人(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其他方法包括在Paulus(1985)Behring Ins. Mitt.第78期，118-132；Brennan等人(1985)Science 229:81-83)和Glennie等人(1987)J. Immunol. 139:2367-2375)中描述者。較佳的共軛劑為SATA和磺基-SMCC，兩者皆可獲自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。
當結合專一性為抗體時，可經由兩個重鏈之C-端絞鏈區的硫氫基鍵結將其共軛。在特佳的具體事實中，在共軛之前先修飾絞鏈區，以使其含有奇數的硫氫基殘基，較佳的是一個。
或者，可在相同的載體內編碼兩個結合專一性，並在相同的宿主細胞中表現並組裝。該方法在該雙專一性分子為mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2或配位體×Fab融合蛋白之處是特別有用的。本發明之雙專一性分子可以是包括一單鏈抗體和一結合決定位的單鏈分子，或包括兩個結合決定位的單鏈雙專一性分子。雙專一性分子可包括至少兩個單鏈分子。在例如美國專利第5,260,203號；美國專利第5,455,030號；美國專利第4,881,175號；美國專利第5,132,405號；美國專利第5,091,513號；美國專利第5,476,786號；美國專利第5,013,653號；美國專利第5,258,498號；美國專利第5,482,858號；美國專利申請公開案20030078385、Kontermann等人,(2005)Acta Pharmacological Sinica 26(1):1-9；Kostelny等人,(1992)J. Immunol. 148(5):1547-1553；Hollinger等人,(1993)PNAS(USA)90:6444-6448；和Gruber等人(1994)J. Immunol.152:5368中描述或回顧了製備雙專一性分子的方法。
抗體變體
更可以使用具有一或多個在本文中揭示之VH及/或VL序列的抗體作為起始材料來製備本發明之抗體，以設計經修飾之抗體或抗體“變體”，該經修飾之抗體可具有與親代抗體不同的特性。可藉著修飾在一或兩個可變區(即VH即/或VL)內-例如在一或多個CDR區內，及/或在一或多個架構區內，的一或多個殘基，來設計抗體。此外或另外，可藉著修飾在恆定區(們)內的殘基設計抗體，例如改變抗體的效應物功能(們)。此外，可從抗體的抗原-結合部分來製備其他的構築體，如抗原-結合片段、抗體衍生物、免疫共軛物和多專一性分子。
可使用標準分子生物學技術以製備並表現經改變的抗體序列。
雖然抗體變體或衍生物與“親代抗體”相比較，典型地具有至少一個經改變的特性，但該抗體變體或衍生物仍可保留一個、一些或大多數在本文中描述之抗-hNKG2D抗體的功能特性，該功能特性包括，但不限於：(a)阻止NKG2D-介導之表現NKG2D之NK或T細胞的活化，可視需要具有比與該細胞結合之EC50更低的降低配位體-誘導之細胞毒性的EC50；(b)與至少一個NKG2D配位體競爭對NKG2D的結合，較佳的是至少與MICA和ULBP3競爭；(c)降低在表現NKG2D之NK或T細胞表面上NKG2D的量，較佳的是至少75%；(d)與食蟹獼猴及/或恆河猴NKG2D結合，較佳的是以實質上類似的效力或親和力；(e)與一種以上NKG2D之形式或構象結合；(f)以1nM或更低，較佳的是0.1nM或更低之Kd與NKG2D結合；(g)與一或多個16F16、16F31、MS或21F2競爭；(h)比起與ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217和149810中任一個，更與16F16、16F31、MS或21F2競爭對NKG2D的結合；(i)阻斷超過90%之對細胞-表面hNKG2D的16F16、MS或21F2結合；(j)對hNKG2D有比任何ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217和149810更低的激動劑活性。上述功能特徵的任何組合，及/或如在實施例中描述的功能特徵，均可由本發明之抗體展現。
可使用在技術領域中可利用及/或在本文中描述的標準測定，評估抗體變體和衍生物的功能特性。例如，可使用標準結合測定，如在實施例中陳述者(例如Biacore、流動式細胞測量術或ELISAs)，判定該抗體與hNKG2D結合的能力。
可變區修飾
可進行的可變區設計之一類型為CDR移植。抗體主要經由位在六個重和輕鏈互補性決定區(complementarily determining regions，CDRs)的胺基酸殘基，與目標抗原產生交互作用。由於這個緣故，在CDRs內的胺基酸序列在個別抗體之間比在CDRs外面的序列更為分歧。因為CDR序列成為大多數抗體-抗原交互作用的原因，有可能藉著建構表現載體(其包括將得自特定之天然存在抗體的CDR序列，移植到得自具有不同特性之不同抗體的架構序列上)，來表現模仿特定天然存在之抗體特性的重組抗體(參見，例如Riechmann,L.等人(1998)Nature 332:323-327；Jones,P.等人(1986)Nature 321:522-525；Queen,C.等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033；Winter的美國專利第5,225,539號，以及Queen等人的美國專利第5,530,101號；5,585,089號；5,693,762號和6,180,370號)。因此，本發明的其他具體事實係關於經分離之抗體，或其抗原結合部分，包括:包括CDR1、CDR2和CDR3序列(其分別包括選自由SEQ ID NO:15、21、48和54、SEQ ID NO:16、22、49和55，以及SEQ ID NO:17、23、50和56所組成之群組的胺基酸序列)的VH區，和包括CDR1、CDR2和CDR3序列(其分別包括選自由SEQ ID NO:18、24、51和57、SEQ ID NO:19、25、52和58，以及SEQ ID NO:20、26、53和59所組成之群組的胺基酸序列)的VL區。因此，這類抗體含有抗體16F16、16F31、MS或21F2的VH和VL CDR序列，還可能含有與這些抗體不同的架構序列。
本發明亦提供鼠類抗-hNKG2D單株抗體或其抗原-結合片段的嵌合型或經人類化的版本，其與hNKG2D結合，以及這類抗體的用途(例如在哺乳動物宿主中調節hNKG2D-介導之生理學過程)。在一具體事實中，該鼠類抗體是ON72、BAT221、5C6、1D11、149810和ECM217中之一。在另一具體事實中，該鼠類抗體不是ON72、BAT221、5C6、1D11、149810和ECM217中之一。因此，這類抗體含有ON72、BAT221、5C6、1D11、149810或ECM217，或與ON72、BAT221、5C6、1D11、149810、ECM217不同之鼠類單株抗體的VH和VL CDR序列，與這些抗體不同的架構序列。在一具體事實中，該經人類化抗體是ON72的經人類化版本，分別包括例如SEQ ID NO:70和71重-和輕鏈之胺基酸序列。
這類架構序列可獲自公共的DNA資料庫或包括生殖種系抗體基因序列的經發表之參考文獻。例如，可在“dBase”人類生殖種系序列資料庫(可在網際網路上在www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase 獲得)中，以及在Kabat,E.A.,等人(1991)免疫學感興趣的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5版,美國健康與人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services),NIH出版品第91-3242號；Tom1inson,I.M.,等人(1992)“人類生殖種系VH序列的節目透露了大約50群具有不同高變環的VH斷片(The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops)”J. Mol. Biol. 227:776-798；以及Cox,J.P.L.等人(1994)“人類生殖種系VH斷片的名錄透露了在其用途上的強烈偏好(A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in Their Usage)”Eur. J. Immunol. 24:827-836中，找到人類重和輕鏈可變區基因的生殖種系DNA序列，其等每一者之內容專程以引用方式納入本文中。
用在本發明之抗體中的較佳架構序列是在結構上類似本發明之經選擇抗體所使用的架構序列者，例如類似由16F16、16F31、MS和21F2抗體所使用的VH3_21、D3-9、JH4、VK Ⅰ_L15和JK2，或VH3_20、D3-10、JH6、VK Ⅲ_A27和JK3，或VH4_59、JH3、VK Ⅲ_A27和JK1，或VH5_51、D3_10_R3、JH4、VK Ⅲ_L6和JK1架構序列。可將16F16、16F31、MS或21F2的VH CDR1、2和3序列，以及16F16、16F31、MS或21F2的VL CDR1、2和3序列移植到具有與在生殖種系免疫球蛋白基因(從其中衍生該架構序列)中發現之相同序列的架構區上，或可將CDR序列移植到與該生殖種系序列相比較，含有一或多個突變的架構區上。例如，已經發現在某些情況下，使在架構區內的殘基突變，有利於維持或促進抗體之抗原結合能力(參見，例如Queen等人的美國專利第5,530,101號；5,585,089號；5,693,762號和6,180,370號)。
在本發明的另一觀點中，使用本發明之抗-hNKG2D抗體-例如16F16和16F31的結構特徵，創造結構相關的抗-hNKG2D抗體，其保留本發明之抗體的至少一個功能特性，如與hNKG2D結合。例如，可將16F16或16F31的一或多個CDR區，或其變體，以重組方式與已知的架構區及/或其他CDRs組合，創造額外的、經重組設計的本發明之抗-hNKG2D抗體。設計性方法的起始材料是一或多個在本文中提供的VH及/或VL序列，或其一或多個CDR區。欲創造經設計的抗體，不一定實際上製備(即以蛋白質表現)具有一或多個在本文中提供之VH及/或VL序列，或其一或多個CDR區的抗體。寧可使用序列(們)中含有的資訊作為起始材料，以創造衍生自原始序列(們)的“第二代”序列(們)，然後製備“第二代”序列(們)並以蛋白質表現。
因此，在另一具體事實中，本發明提供製備抗-hNKG2D抗體的方法，其包括：(a)提供：(i)重鏈可變區抗體序列，其包括選自SEQ ID NO:15、21、48和54之CDR1序列、選自SEQ ID NO:16、22、49和55之CDR2序列，及/或選自SEQ ID NO:17、23、50和56之CDR3序列；以及(ii)輕鏈可變區抗體序列，其包括選自SEQ ID NO:18、24、51和57之CDR1序列、選自SEQ ID NO:19、25、52和58之CDR2序列，及/或選自SEQ ID NO:20、26、53和59之CDR3序列；(b)改變在第一個抗體序列及/或第二個抗體序列內的至少一個胺基酸殘基，以創造至少一個經改變的抗體序列；(c)製備該經改變的抗體序列；並(d)以蛋白質表現該經改變的抗體序列。
另一類型的可變區修飾是使在VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內的胺基酸殘基突變，藉此改良感興趣之抗體的一或多個結合特性(例如親和力)。可進行指定位置之突變誘發或PCR-介導之突變誘發，以導入突變(們)，並可在如本文中描述且在實施例中提供的試管內或活體內測定中，評估其對抗體結合或其他感興趣之功能特性的影響。較佳的是導入保留性修飾(如上文討論的)。該突變可以是胺基酸取代、添加或刪除。而且，在單一CDR區內典型地改變不超過8，更典型地是不超過5個殘基。
因此，在另一具體事實中，本發明提供經分離之抗-hNKG2D抗體，其包括重鏈可變區，包括：(a)VH CDR1區，其包括選自SEQ ID NO:15、21、48和54之胺基酸序列，或與選自SEQ ID NO:15、21、48和54之胺基酸序列相比較，具有一、二、三、四、五、六、七或八個胺基酸取代、刪除或添加的胺基酸序列；(b)VH CDR2區，其包括選自SEQ ID NO:16、22、49和55，或與選自SEQ ID NO:16、22、49和55之胺基酸序列相比較，具有一、二、三、四、五、六、七或八個胺基酸取代、刪除或添加的胺基酸序列；(c)VH CDR3區，其包括選自SEQ ID NO:17、23、50和56之胺基酸序列，或與選自SEQ ID NO:17、23、50和56之胺基酸序列相比較，具有一、二、三、四、五、六、七或八個胺基酸取代、刪除或添加的胺基酸序列；(d)VL CDR1區，其包括選自SEQ ID NO:18、24、51和57之胺基酸序列，或與選自SEQ ID NO:18、24、51和57之胺基酸序列相比較，具有一、二、三、四、五、六、七或八個胺基酸取代、刪除或添加的胺基酸序列；(e)VL CDR2區，其包括選自由SEQ ID NO:19、25、52和58所組成之群組的胺基酸序列，或與選自由SEQ ID NO:19、25、52和58所組成之群組的胺基酸序列相比較，具有一、二、三、四、五、六、七或八個胺基酸取代、刪除或添加的胺基酸序列；以及(f)VL CDR3區，其包括選自由SEQ ID NO:20、26、53和59所組成之群組的胺基酸序列，或與選自由SEQ ID NO:20、26、53和59所組成之群組的胺基酸序列相比較，具有一、二、三、四、五、六、七或八個胺基酸取代、刪除或添加的胺基酸序列。
本發明之經設計抗體包括已經在VH及/或VL內對架構殘基進行修飾者，例如改善該抗體之特性。典型地進行這類架構修飾，以減少該抗體的免疫原性。例如，一種方法是使一或多個架構殘基對相對應之生殖種系序列“返突變”。更明確地說，具有經歷過體細胞突變的抗體可能含有與從其中衍生該抗體之生殖種系序列不同的架構殘基。可藉著比較抗體架構序列與從其中衍生該抗體之生殖種系序列，來鑑認這類殘基。
例如，對16F16而言，VH之胺基酸殘基R111(Kabat殘基103；在FR4內)是精胺酸，而在相對應生殖種系序列內的該殘基是色胺酸(參見圖5A)。欲使架構區序列恢復成其生殖種系構象，可藉著例如指定位置之突變誘發或PCR-介導之突變誘發，將一些或全部的體細胞突變“返突變”成生殖種系序列(例如可將16F16之VH的殘基111從蘇胺酸“返突變”成丙胺酸)。舉另一例來說，對16F31而言，VH區之胺基酸殘基Y95(在FR3內)是酪胺酸，而在相對應生殖種系序列內的該殘基是組胺酸(參見圖5C)。欲使架構區序列恢復成其生殖種系構象，可將體細胞突變從酪胺酸“返突變”成組胺酸。舉另一例來說，對MS而言，VH區的Kabat殘基3、6和7分別是組胺酸(H)、天冬胺酸(D)和D，而在相對應生殖種系序列內的這些殘基分別是穀胺醯胺(Q)、甘胺酸(G)和G(參見圖5E)。對21F2而言，Kabat殘基13、24、76和93分別是穀胺酸(E)、天冬醯胺(N)、N和G，而在相對應生殖種系序列內的這些殘基分別是離胺酸(K)、G、絲胺酸(S)和丙胺酸(A)。欲使架構區序列恢復成其生殖種系構象，可同樣地將體細胞突變“返突變”。亦打算將這類“經返突變之”抗體納入本發明中。
其他類型的架構修飾涉及使一或多個在架構區內，或甚至在一或多個CDR區內的殘基突變，以移除T細胞抗原決定基，藉此降低該抗體可能的免疫原性。亦將該方法稱為“去免疫化”，並在Carr等人的美國專利公開案第20030153043號中更詳細地描述。
Fc修飾
除了在架構或CDR區內進行修飾之外，或可供選擇，可設計本發明之抗體，以納入在Fc區內的修飾，典型地改變該抗體的一或多個功能特性，如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合、蛋白質穩定性及/或其抗原-依賴性細胞之細胞毒性，或其之缺乏。此外，本發明之抗體亦可以化學方式修飾(例如可將一或多個化學部分附接至該抗體)，或修飾以改變其醣化，再次改變該抗體的一或多個功能特性。在下文中更詳細地描述每一個這些具體事實。在Fc區中的殘基係根據Kabat來編號。
若需要，可藉著已知的技術“轉變”抗體的種類。這類技術包括，例如使用直接重組技術(參見，例如美國專利第4816397號)和細胞-細胞融合技術(參見，例如美國專利第5916771號)。例如，可將最初以IgM分子之形式產生的抗體種類轉變成IgG抗體。亦可使用種類轉變技術將一IgG亞類轉變成另一亞類，例如從IgG1變成IgG2。因此，可藉著同型物轉變，將本發明之抗體的效應物功能變成例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗體，以供各種治療用途。可經由例如GenBank(可經由NCBI及其他公開網站進入)獲得恆定區的典型cDNA序列，將其內容以引用方式納入本文中，如下：人類IgG1恆定重鏈區：GenBank登錄編號：J00228；人類IgG2恆定重鏈區：GenBank登錄編號：J00230；人類IgG3恆定重鏈區：GenBank登錄編號：X04646；人類IgG4恆定重鏈區：GenBank登錄編號：K01316；和人類κ輕鏈恆定區：GenBank登錄編號：J00241。
在一具體事實中，修飾CH1之絞鏈區，而得以改變在該絞鏈區中半胱胺酸殘基的數目，例如增加或減少。在Bodmer等人的美國專利第5677425號中進一步描述了該方法。改變在CH1之絞鏈區中半胱胺酸殘基的數目，例如有助於組裝輕和重鏈，或增加或減少該抗體的穩定性。
在另一具體事實中，使抗體的Fc絞鏈區突變，以降低該抗體的生物學半衰期。更明確地說，將一或多個胺基酸突變導入Fc-絞鏈片段的CH2-CH3功能部位介面區內，使得該抗體相對於天然Fc-絞鏈功能部位SpA結合，具有受損的葡萄球菌蛋白質A(Staphylococcyl proteinA，SpA)結合。在Ward等人的美國專利第6165745號中進一步描述了該方法。在另一具體事實中，修飾抗體以增加其生物學半衰期。各種方法都是可能的。例如，可導入一或多個下列突變：T252L、T254S和T256F，如同在Ward之美國專利第6277375號中的描述。或者，欲增加生物學半衰期，可在CH1或CL區內改變該抗體，使其含有取自IgG之Fc區的CH2功能部位之兩環的補救受體結合抗原決定基，如同在Presta等人之美國專利第5869046號和6121022號中的描述。在其他的具體事實中，藉著以不同的胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變Fc區，以改變該抗體之效應物功能(們)。例如，可利用不同的胺基酸殘基置換一或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320和322的胺基酸，使得該抗體對效應物配位體具有經改變的親和力，但仍保留親代抗體的抗原-結合能力。改變對其之親和力的效應物配位體，可以是例如Fc受體或補體的Cl組份。在Winter等人的美國專利第5624821號和5648260號中更詳細地描述了該方法。在另一實例中，可利用不同的胺基酸殘基置換一或多個選自胺基酸殘基329、331和332的胺基酸，使得該抗體具有經改變的Clq結合及/或經降低或廢除的補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)。在Idusogie等人的美國專利第6194551號中更詳細地描述了該方法。在另一實例中，改變在胺基酸位置231和239內的一或多個胺基酸殘基，藉此改變該抗體固定補體的能力。在Bodmer等人的PCT公開案WO 94/29351中進一布描述了該方法。在另一實例中，藉著修飾一或多個在下列位置的胺基酸：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，修飾Fc區以增加該抗體介導抗體依賴性細胞之細胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)的能力，及/或增加該抗體對Fcy受體的親和力。在Presta的PCT公開案WO 00/42072中進一步描述了該方法。而且，已經繪製在人類IgG1上對FcyRI、FcyRⅡ、FcyRⅢ和FcRn之結合位置的圖，並已經描述具有改良結合的變體(參見Shields,R.L.等人(2001)J. Biol. Chem.276:6591-6604)。顯示在位置256、290、298、333、334和339處的特定突變，改善了對FcRⅢ的結合。此外，亦顯示下列的混合突變種以改善FcyRⅢ結合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
可進一步修飾恆定區，以穩定該抗體，例如降低二價抗體分離成兩個單價VH-VL片段的風險。例如，在IgG4恆定區中，可使殘基S241突變成脯胺酸(P)殘基，以允許在絞鏈處形成完整的二硫橋(參見，例如Angal等人,Mol.Immunol. 1993;30:105-8)。
醣化修飾
在仍然另一具體事實中，修飾抗體的醣化。例如，可製造未經醣化的抗體(即該抗體缺少醣化)。可改變醣化，例如增加抗體對抗原之親和力。可藉著例如，改變在抗體序列內的一或多個醣化位置，完成這類碳水化合物修飾。例如，可進行一或多個胺基酸取代，結果排除一或多個可變區架構的醣化位置，以藉此排除該位置的醣化。這類無醣化可增加抗體對抗原之親和力。在Co等人的美國專利第5714350號和6350861號中更詳細地描述了這類方法。此外或另外，可製造具有經改變類型之醣化的抗體，如低岩藻醣化的抗體，其具有減少數目的岩藻醣殘基，或具有增加之截開型GlcNac結構的抗體。已經證實這類經改變的醣化特徵，增加了抗體的ADCC.能力。可藉著例如在具有經改變之醣化”機制”的宿主細胞中表現該抗體，完成這類碳水化合物修飾。已經在技術領域中描述了具有這類改變的細胞，且其可用來作為表現本發明之重組抗體的宿主細胞，藉此產生具有經改變之醣化的抗體。例如，Hanai等人的歐洲專利1176195描述一具有功能被瓦解之FUT8基因的細胞株，該基因編碼岩藻醣轉移酶，使得在這類細胞株中表現的抗體展現出低岩藻醣化。Presta的PCT公開案WO 03/035835描述一變種CHO細胞株，Lec13細胞，降低了將岩藻醣附接至Asn(297)-連接之碳水化合物上的能力，結果亦導致在該宿主細胞中表現之抗體的低岩藻醣化(亦參見Shields,R.L.等人(2002)J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。Umana等人的PCT公開案WO 99/54342描述經設計以表現醣蛋白-修飾性醣轉移酶(例如β(1,4)-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶Ⅲ(GnTⅢ))的細胞株，使得在該經設計之細胞株中表現的抗體展現出增加的截開型GlcNac結構，其結果增加了該抗體的ADCC活性(亦參見Umana等人(1999)Nat. Biotech. 7:176-180)。
在設計本發明抗體之方法的某些具體事實中，可將突變隨機或選擇性地沿著全部或一部分的抗-hNKG2D抗體密碼序列(例如16F16、16F31、MS或21F2密碼序列)導入，並按照在本文中的描述就結合活性及/或其他功能特性來篩選所得的經修飾抗體。已經在技術領域中描述了突變方法。例如Short的PCT公開案WO 02/092780描述了使用飽和突變誘發、合成連接組裝或其組合，創造並篩選抗體突變的方法。
另外，Lazar等人的PCT公開案WO 03/074679描述了使用電腦篩選方法，針對抗體之物化特性最適化的方法。
抗體衍生物
在本發明範圍內的抗體衍生物(或免疫共軛物)包括與第二劑共軛或共價結合的抗-hNKG2D抗體。
例如，本發明一方面提供免疫共軛物，其包括與細胞毒劑共軛或共價結合的抗體。當在本文中使用時，“細胞毒劑”一詞為能夠殺死在其細胞表面上帶有hNKG2D受體之細胞的分子。任何類型之具有細胞毒或細胞抑制效力的部分均可與本發明之抗體共軛，以形成本發明之細胞毒共軛物，並抑制或殺死特定的表現NK受體之細胞，該部分包括治療用的放射性同位素、有毒的蛋白質、有毒的小分子，如藥物、毒素、免疫調節劑、荷爾蒙、荷爾蒙拮抗劑、酵素、寡核苷酸、酵素抑制劑、治療用的放射性核種、血管生成抑制劑、化療藥物、長春花生物鹼(vinca alkaloids)、氨茴環黴素(anthracyclines)、表鬼臼毒素(epidophyllotoxins)、紫杉烷(taxanes)、抗代謝產物、烷基化劑、抗生素、COX-2抑制劑、SN-38、抗有絲分裂物質、抗血管生成和細胞凋亡劑，特別是阿黴素(doxotubicin)、胺甲碟呤、紫杉醇(taxol)、CPT-11、喜樹鹼(camptothecans)、氮芥(nitrogen mustards)、吉西他濱(gemcitabine)、磺酸烷基酯、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉑配位複合物(platinum coordination complexes)、假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、蓖麻毒素(ricin)、雞母珠毒蛋白(abrin)、5-氟尿嘧啶、核糖酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A(Staphylococcal enterotoxin-A)、美洲商陸抗病毒蛋白質(pokeweed antiviral protein)、截短型細胞毒素(gelonin)、白喉毒素(diphtherin toxin)、假單胞菌外毒素和假單胞菌內毒素(Pseudomonas endotoxin)及其他(參見，例如雷明頓氏製藥科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences),第19版(Mack Publishing Co. 1995)；Goodman和 Gilman’s治療的藥學基礎(The Pharmaceutical Basis of Therapeutics)(McGraw Hill,2001)；Pastan等人(1986)Cell 47:641；Goldenberg(1994)Cancer Journal for Clinicians 44:43；美國專利第6,077,499號；其等完整揭示內容係以引用方式納入本文中)。會瞭解毒素可以是動物、植物、真菌或微生物來源的，或可藉著化學合成重新創造。
在另一具體事實中，利用放射性同位素-如治療用之放射性核種或適合偵測目的之放射性核種來衍生抗體。可使用任何數目的適當放射性同位素，包括但不限於I-131、銦-111、鎦-171、鉍-212、鉍-213、砈-211、銅-62、銅-64、銅-67、釔-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、鈧-47、銀-111、鎵-67、鐠-142、釤-153、鋱-161、鏑-166、鈥-166、錸-186、錸-188、錸-189、鉛-212、鐳-223、錒-225、鐵-59、硒-75、砷-77、鍶-89、鉬-99、銠-105、鈀-109、鐠-143、鉕-149、鉺-169、銥-194、金-198、金-199和鉛-211。通常放射性核種較佳的是具有範圍在20到6,000千電子伏特內的衰變能，較佳的是關於俄歇射極(Auger emitter)在60到200千電子伏特之範圍內，關於β射極在100-2,500千電子伏特內，而關於α射極在4,000-6,000千電子伏特內。較佳的亦是實質上衰變產生α-粒子的放射性核種。
可使用本發明之抗體共軛物，以修飾特定的生物學反應，在此處不應將藥物部分解釋為限於典型的化學治療劑。例如，該藥物部分可以是具有想要之生物活性的蛋白質或多肽。這類蛋白質可包括，例如具有酵素活性的毒素，或其活性片段，如雞母珠毒蛋白、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質，如腫瘤壞死因子或干擾素-y；或生物反應改性劑，像是例如淋巴細胞活素、介白素-1(“IL-1”)、介白素-2(“IL-2”)、介白素-6(“IL-6”)、粒性細胞巨噬細胞菌落刺激因子(“GM-CSF”)、粒性細胞菌落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長因子。
可將第二劑與抗體直接或間接連接，使用很多可利用之方法的任一種。例如，可經由形成二硫鍵，使用交聯劑，如N-琥珀醯基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，或經由在抗體之Fc區的碳水化合物部分，將該劑附接在經還原之抗體組份的絞鏈區(參見，例如Yu等人(1994)Int. J. Cancer 56:244；Wong,蛋白質共軛和交聯的化學方法(Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking)(CRC Press 1991)；Upeslacis等人,“藉著化學方法修飾抗體(Modification of Antibodies by Chemical Methods)”,在單株抗體：原理與應用(Monoclonal antibodies:principle and applications),Birch等人(編輯)，第187-230頁(Wiley-Liss,Inc. 1995)中；Price,“合成肽-所衍生之抗體的生產和訂定特徵(Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies)”,在單株抗體：生產、設計和臨床應用(Monoclonal Antibodies:Production,engineering and clinical application),Ritter等人(編輯)，第60-84頁(Cambridge University Press 1995)中，Cattel等人(1989)Chemistry today 7:51-58，Delprino等人(1993)J. Pharm. Sci 82:699-704；Arpicco等人(1997)Bioconjugate Chemistry 8:3；Reisfeld等人(1989)Antibody,Immunicon,Radiopharm. 2:217；其等完整揭示內容係以引用方式納入本文中)。亦參見，例如Arnon等人,“在癌症治療中，用於藥物之免疫靶定的單株抗體(Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)”,在單株抗體和癌症治療(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy),Reisfeld等人(編輯)，第243-56頁(Alan R. Liss,Inc. 1985)中；Hellstrom等人,“藥物遞送用的抗體(Antibodies For Drug Delivery)”,在經控制之藥物遞送(Controlled Drug Delivery)(第二版),Robinson等人(編輯)，第623-53頁(Marcel Dekker,Inc. 1987)中；Thorpe,“在癌症治療中細胞毒劑的抗體載劑：回顧(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review)”,在單株抗體’84：生物學和臨床應用(Monoclonal Antibodies ’84:Biological And Clinical Applications),Pinchera等人(編輯)，第475-506頁(1985)中；“在癌症治療中，經放射性標示抗體之治療用途的分析、結果和未來展望(Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabelled Antibody In Cancer Therapy)”，在癌症偵測和治療用的單株抗體(Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy)，Baldwin等人(編輯)，第303-16頁(Academic Press 1985)中，以及Thorpe等人，“抗體-毒素共軛物的製備和細胞毒特性(The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates)”. Immunol. Rev.,62:119-58(1982)。
關於細胞毒素的類型、連接子和使治療劑與抗體共軛之方法的進一步討論，亦參見Saito,G.等人(2003)Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:199-215；Trail,P.A.等人(2003)Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337；Payne,G.(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen,T.M.(2002)Nat. Rev. Cancer 2:750-763；Pastan,I.和Kreitman,R.J.(2002)Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091；Senter,P.D.和Springer,C.J.(2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264。
在其他的具體事實中，該第二劑為可偵測部分，其可以是任何可定量或定性觀察或測量的分子。可用於本發明之經共軛之抗體中的可偵測標記之實例為放射性同位素、螢光染料，或互補結合對的成員，如下列任一的成員：抗原/抗體(對NKG2D之抗體以外的)、凝集素/碳水化合物；抗生物素蛋白/生物素；受體/配位體；或分子銘印的聚合物/打印分子系統。
第二劑亦可以是或供選擇地是聚合物，打算例如增加該抗體的循環半衰期。在例如美國專利第4766106號；4179337號；4495285號；和4609546號中解釋了典型聚合物和附接這類聚合物至肽的方法。額外作為例證的聚合物包括經聚氧乙烯化的多元醇和聚乙二醇(PEG)部分。當在本文中使用時，“聚乙二醇”一詞打算包括已經用來衍生其他蛋白質的任何形式之PEG，如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。例如，可將全長抗體或抗體片段與一或多個PEG分子共軛，該PEG分子具有在大約1,000到大約40,000之間的分子量，如在大約2000到大約20,000之間，例如大約3,000-12,000。欲PEG化抗體或其片段，典型地使該抗體或片段與聚乙二醇(PEG)-如PEG的反應性酯或醛衍生物，在其中一或多個PEG基團變成與該抗體或抗體片段附接的條件下反應。較佳的是，經由醯化反應或烷基化反應，利用反應性PEG分子(或類似的反應性水溶性聚合物)進行PEG化。在某些具體事實中，欲被PEG化的抗體是未經醣化的抗體。PEG化蛋白質的方法為技術領域中已知的，並可應用在本發明之抗體上。參見，例如Nishimura等人的歐洲專利154316、國際專利申請案PCT/US04/11494和Ishikawa等人的歐洲專利401384。
核酸
本發明之另一方面係關於編碼本發明之抗體的核酸分子。該核酸可出現在完整細胞中、細胞溶胞產物中，或以經部分純化或實質上純的形式。當藉著標準技術，包括鹼性/SDS處理、CsCl顯帶、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳和其他在技術領域中已知的其他技術，純化遠離其他細胞組份或其他污染-例如其他細胞的核酸或蛋白質時，該核酸為“經分離的”或“成為實質上純的”。參見F. Ausubel,等人,編輯(1987)分子生物學的現行草案(Current Protocolsin Molecular Biology),Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本發明之核酸可以是，例如，DNA或RNA，並可以或可不含插入序列。在較佳的具體事實中，該核酸為cDNA分子。雖然下列段落提到DNA序列或其用途，但相同的方法或原理通常可適用於mRNA序列。
可使用標準分子生物學技術獲得本發明之核酸。為了由融合瘤(例如從帶有人類免疫球蛋白基因之基因轉殖鼠類製備的融合瘤，如下文進一步描述)表現抗體，可藉著標準PCR擴大或cDNA選殖技術，獲得編碼由融合瘤製造之抗體之輕和重鏈的cDNAs。至於從免疫球蛋白基因庫中獲得的抗體(例如使用噬菌體展示技術)，可從庫中回收編碼該抗體的核酸們。
本發明的較佳核酸分子是編碼(或包括編碼相同物之核酸序列)IgG4同型物之16F16、16F31、MS或21F2抗體之H和L鏈序列者。分別在SEQ ID NO:3和4中出示編碼16F16 VH和VL序列的DNA序列。分別在SEQ ID NO:5和6中出示編碼16F31 VH和VL序列的DNA序列。編碼MS VH和VL序列的DNA序列，分別為SEQ ID NO:44和45編碼者。編碼21F2 VH和VL序列的DNA序列，分別為SEQ ID NO:46和47編碼者。
一旦獲得編碼VH和VL斷片的DNA片段，便可藉著標準重組DNA技術，進一步操縱這些DNA片段，例如將可變區基因轉變為全長的抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操縱中，以可操作之方式將編碼VL或VH之DNA片段與編碼其他蛋白質的其他DNA片段連接，如抗體恆定區或易彎曲的連接子。當在此內容中使用“以可操作之方式連接”一詞時，企圖意指接合兩個DNA片段，使得由這兩個DNA片段編碼的胺基酸序列仍在架構內。
可藉著以可操作之方式將編碼VH之DNA與另一個編碼重鏈恆定區(CH1、CH2和CH3)的DNA分子連接，將編碼VH區的經分離之DNA轉變成全長的重鏈基因。人類重鏈恆定區基因的序列為在技術領域中已知的(參見，例如Kabat,E.A.等人(1991)免疫學感興趣的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5版，美國健康與人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services),NIH出版品第91-3242號)，並可藉著標準PCR擴大獲得包含這些區的DNA片段。重鏈恆定區可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳的是IgG4恆定區。關於Fab片段重鏈基因，可將編碼VH之DNA以可操作之方式與僅編碼重鏈CH1恆定區的其他DNA分子連接。
可藉著以可操作之方式將編碼VL之DNA與另一個編碼輕鏈恆定區CL的DNA分子連接，將編碼VL區的經分離之DNA轉變成全長的輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因的序列為在技術領域中已知的(參見，例如Kabat,E.A.等人(1991)免疫學感興趣的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5版,美國健康與人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services),NIH出版品第91-3242號)，並可藉著標準PCR擴大獲得包含這些區的DNA片段。輕鏈恆定區可以是κ或λ恆定區，但最佳的是κ恆定區。
欲創造scFv基因，以可操作之方式將編碼VH和VL之DNA片段與另一個編碼易彎曲連接子-例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3的片段連接，使得該VH和VL序列能夠以相鄰之單鏈蛋白質來表現，並藉著該易彎曲連接子接合該VL和VH區(參見，例如Bird等人(1988)Science 242:423-426；Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty等人(1990)Nature 348:552-554)。
抗體生產
可藉著各種技術，包括傳統的單株抗體方法，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495的標準體細胞雜交技術，產生本發明之單株抗體(mAb)。雖然體細胞雜交程序是較佳的，但原則上亦可使用其他產生單株抗體的技術，例如B淋巴細胞的病毒或致癌基因轉型。
一種製備融合瘤的較佳動物系統為鼠類系統。分離融合用的經免疫脾臟細胞之免疫草案和技術為技術領域中已知的，像是融合夥伴(例如鼠類骨髓瘤細胞)和融合程序。本發明之嵌合型或經人類化的抗體亦可基於鼠類單株抗體之序列，使用經確立的技術來製備。例如，可從感興趣之鼠類融合瘤獲得編碼重和輕鏈免疫球蛋白的DNA，並使用標準分子生物學技術將其設計以含有非-鼠類(例如人類)的免疫球蛋白序列。例如，欲創造嵌合型抗體，可使用在技術領域中已知的方法(參見，例如Cabilly等人的美國專利第4816567號)，將鼠類可變區與人類恆定區連接。欲創造經人類化之抗體，可使用在技術領域中已知的方法(參見，例如Winter的美國專利第5225539號和Queen等人的美國專利第5530101號；5585089號；5693762號和6180370號)，將鼠類CDR區插入人類架構內。
在較佳的具體事實中，本發明之抗體是人類單株抗體。寧願使用帶有部分人類免疫系統，而非小鼠系統的基因轉殖或染色體轉殖之小鼠，來產製這類針對hNKG2D的人類單株抗體。這些基因轉殖和染色體轉殖的小鼠，分別包括在本文中稱為HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，並在本文中集體地稱為“人類Ig小鼠”。HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)含有人類免疫球蛋白基因小位點(miniloci)，其編碼未經重排的人類重(p和y)和K輕鏈免疫球蛋白序列，與經靶定之突變一起，使內源的u和K鏈位點失活(參見，例如Lonberg等人(1994)Nature 368:856-859)。因此，該小鼠展現出降低的小鼠IgM或K表現，而經導入之人類重和輕鏈轉殖基因反應免疫作用而經歷種類轉變和體細胞突變，產生高親和力的人類IgGK單株(Lonberg,N.等人(1994),在前；在Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101;Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern. Rev.Immunol. 13:65-93；以及Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546中回顧)。在Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等人(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J. 12:821-830；Tuaillon等人(1994)J. Immunol.152:2912-2920；Taylor,L. 等人(1994)International Immunology 6:579-591；以及Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851中進一步描述了HuMab小鼠的製備和用途，以及由這類小鼠攜帶的基因組修飾，其等所有內容係以引用方式明確地納入本文中。進一步參見美國專利第5545806號；5569825號；5625126號；5633425號；5789650號；5877397號；5661016號；5814318號；5874299號和5770429號，全都是Lonberg和Kay的；Surani等人的美國專利第5545807號；PCT公開案第WO 92/03918；WO 93/12227；WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962，全都是Lonberg和Kay的；以及Korman等人的PCT公開案第WO 01/14424號。在另一具體事實中，可使用在轉殖基因或轉殖染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列的小鼠，例如攜帶人類重鏈轉殖基因和人類輕鏈轉殖染色體的小鼠，使本發明之抗體升高。在Ishida等人的PCT公開案WO 02/43478中詳細描述了在本文中稱為“KM小鼠”的這類小鼠。更進一步，在技術領域中可獲得表現人類免疫球蛋白基因之供選擇的基因轉殖動物系統，並可用以升高本發明之抗-hNKG2D抗體。例如，可使用供選擇的基因轉殖系統，稱為異種移植小鼠(Xenomouse)(Abgenix,Inc.)；在例如Kucherlapati等人的美國專利第5939598號；6075181號；6114598號；6150584號和6162963號中描述了這類小鼠。此外，在技術領域中可獲得表現人類免疫球蛋白基因之供選擇的染色體轉殖動物系統，並可用以升高本發明之抗-hNKG2D抗體。例如，可使用攜帶人類重鏈轉殖染色體和人類輕鏈轉殖染色體兩者的小鼠，稱為“TC小鼠”；在Tomizuka　等人(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727中描述了這類小鼠。而且，已經在技術領域中描述了攜帶人類重和輕鏈轉殖染色體的牛(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20:889-894)，並可用以升高本發明之抗-hNKG2D抗體。
亦可使用噬菌體展示方法，篩選人類免疫球蛋白基因庫，來製備本發明之人類單株抗體。在技術領域中已確立分離人類抗體的這類噬菌體展示方法。參見例如Lander等人的美國專利第5223409號；5403484號；和5571698號；Dower等人的美國專利第5427908號和5580717號；McCafferty等人的美國專利第5969108號和6172197號；以及Griffiths等人的美國專利第5885793號；6521404號；6544731號；6555313號；6582915號和6593081號。亦可使用已經在其內重建人類免疫細胞，而得以在免疫後產生人類抗體反應的SCID小鼠，製備本發明之人類單株抗體。在例如Wilson等人的美國專利第5476996號和5698767號中描述了這類小鼠。
當使用人類Ig小鼠以升高本發明之人類抗體時，可利用hNKG2D抗原及/或表現hNKG2D之細胞的經純化或經增強製劑來免疫這些小鼠，如同由Lonberg,N.等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851；和PCT公開案WO 98/24884和WO 01/14424描述的。較佳的是，在第一次輸液之後，小鼠會是6-16週大。例如，可使用hNKG2D抗原的經純化或經增強製劑(5-50微克)，以腹腔內免疫人類Ig小鼠。倘若使用hNKG2D抗原之經純化或經增強製劑的免疫結果沒有產生抗體，亦可利用表現hNKG2D的細胞，例如人類NK或T-細胞株，或表現重組hNKG2D，有或無DAP10的哺乳動物細胞免疫小鼠，以促進免疫反應。
在下文實施例1中描述產製對hNKG2D之完整人類單株抗體的詳細過程。根據在技術領域中所確立的方法，針對每個抗原-小鼠系統，典型地最優化所投予之抗原的形式和量(例如hNKG2D多肽或表現hNKG2D的細胞)，以及投予計畫和可能使用的佐劑，像是例如完全的福瑞德氏(Freund’s)佐劑或不完全福瑞德氏佐劑。
可在免疫草案的過程中，利用藉著眼眶後採血而獲得的血漿試樣來監視免疫反應，並可藉著ELISA篩選血漿或血清(如下述)，並可為了融合使用具有足夠力價的抗-hNKG2D人類免疫球蛋白的小鼠。在犧牲並移出脾臟之前3天，以抗原靜脈內補強小鼠。預期每次免疫可能需要進行2-3次融合。
欲產製產生本發明之人類單株抗體的融合瘤，可分離來自經免疫小鼠的脾臟細胞及/或淋巴結細胞，並與適當的經永存不死化之細胞株-如小鼠骨髓瘤細胞株融合。可針對抗原-專一性抗體的產生篩選所得的融合瘤。例如，可利用50%PEG，將得自經免疫小鼠之脾臟淋巴細胞的單細胞懸浮液與六分之一量的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤細胞(ATCC,CRL 1580)融合。或者，可藉著電融合融合細胞。以大約2x105 將細胞平舖在平底微量滴定盤上，接著在含有20%胎兒純種系血清、18%“653”經調節之培養基、5%奧瑞根(origen)(IGEN)、4mM L-穀胺醯胺、1mM丙酮酸鈉、5mM HEPES、0.055mM 2-硫氫乙醇、50單位/毫升青黴素、50毫克/毫升鏈黴菌、50毫克/毫升健大黴素(gentamycin)和1X HAT(Sigma；在融合之後24小時加入HAT)的選擇性培養基中培養2週。在大約兩週之後，可在其中以HT代替HAT的培養基中培養細胞。然後可藉著ELISA針對人類單株IgM和IgG抗體，篩選個別的孔。一旦出現大規模的融合瘤生長，經常就在10-14天之後可觀察培養基。可將抗體分泌性融合瘤再平舖，再度篩選，且若對人類IgG仍是陽性的，便可藉著限制稀釋繼代選殖(subclone)該單株抗體至少兩次。然後可在試管內培養穩定的繼代純種系，以便在組織培養基中產生少量的抗體，用以訂定特徵。欲純化人類單株抗體，可使所選擇的融合瘤生長在2-公升轉瓶中，以供單株抗體純化用。可過濾並濃縮上清液，然後是利用蛋白質A-瓊脂糖(Pharmacia,Piscataway,N.J.)的親和力層析。可藉著凝膠電泳和高效液相層析法檢查經沖提的IgG，以確保純度。可將緩衝溶液交換成PBS，並藉著光譜分析判定該濃度。可將單株抗體等分並儲存在-80°下。
亦可使用例如重組DNA技術和基因轉染方法的組合，如在技術領域中已熟知的(例如，Morrison,S.(1985)Science229:1202)，在宿主細胞轉染瘤(transfectoma)中生產本發明之單株抗體。
例如，欲表現該抗體，可藉著標準分子生物學技術(例如PCT擴大或cDNA選殖，使用表現感興趣之抗體的融合瘤)，獲得編碼部分或全長輕和重鏈的DNAs，並可將該DNAs插入表現載體內，使得該基因以可操作之方式與轉錄和轉譯控制序列連接，並可達到其等打算調節該抗體基因之轉錄和轉譯的功能。
選擇能夠與所使用之表現宿主細胞相容的表現載體和表現控制序列。可將抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因插入分開的載體內，或更典型地將這兩個基因插入相同的表現載體內。藉著標準方法將抗體基因插入表現載體內(例如連接在抗體基因片段和載體上的互補限制位置，或若無限制位置便以鈍端連接)。可使用在本文中描述之抗體的輕和重鏈可變區，藉著將其等插入業已編碼想要之同型物的重鏈恆定和輕鏈恆定區之表現載體內，使得VH斷片以可操作之方式與在載體內的CH斷片(們)連接，並使VL斷片以可操作之方式與在載體內的CL斷片連接，創造任何抗體同型物的全長抗體基因。此外或或者，重組表現載體可編碼信號肽，其有助於從宿主細胞中分泌抗體鏈。可將抗體鏈基因選殖到載體內，使信號肽得以在架構中與該抗體鏈基因的胺基端連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異種信號肽(即得自非-免疫球蛋白蛋白質的信號肽)。
除了抗體鏈基因之外，本發明之重組表現載體帶有調節序列，其在宿主細胞中控制該抗體鏈基因的表現。“調節序列”一詞，打算包括啟動子、促進子和其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號)，其控制該抗體鏈基因的轉錄或轉譯。在例如Goeddel(基因表現技術。酵素學的方法(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology)185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中描述了這類調節序列。
熟諳此藝者會瞭解表現載體的設計，包括選擇調節序列，可視諸如欲轉型之宿主細胞的選擇、想要的蛋白質表現程度等等的因素而定。對哺乳動物宿主細胞表現而言，較佳的調節序列包括病毒元件，其在哺乳動物細胞中指揮高量的蛋白質表現，如衍生自細胞巨大病毒(cytomegalovirus，CMV)、猴病毒(Simian Virus 40，SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(adenovirus major late promoter，AdMLP)和多瘤病毒的啟動子及/或促進子。或者，亦可使用非病毒的調節序列，如泛素啟動子或p-血球蛋白啟動子。此外，由得自不同來源之序列構成的調節元件，如SRa啟動子系統，其含有得自SV40早期啟動子的序列和人類T細胞白血病病毒第1型的長端重複段(Takebe,Y.等人(1988)Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
除了抗體鏈基因和調節序列，本發明之重組表現載體可攜帶額外的序列，如調節載體在宿主細胞中之複製的序列(例如複製起點)和可選擇標記基因。可選擇標記基因有助於選擇已經將該載體導入其中的宿主細胞(參見，例如Axel等人的美國專利第4399216號、4634665號和5179017號)。例如，可選擇標記基因在已經將該載體導入其中的宿主細胞上，典型地賦予對藥物的抗藥性，如G418、潮黴素或胺甲碟呤。較佳的可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)基因(用於dhfr-宿主細胞，利用胺甲碟呤選擇/擴大)和neo基因(供G418選擇)。
為了表現輕和重鏈，藉著標準技術將編碼重和輕鏈的表現載體(們)轉染至宿主細胞內。名詞“轉染”的各種形式，企圖包含各式各樣經常用以將外源之DNA導入原核生物或真核生物宿主細胞內的技術，例如電穿透、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉染以及類似者。雖然在理論上有可能在原核生物或真核生物宿主細胞中表現本發明之抗體，但在真核生物細胞，且最好是哺乳動物宿主細胞中表現抗體，是最佳的，因為這類真核生物細胞，且特別是在哺乳動物細胞中，比原核生物細胞更有可能組裝並分泌經適當摺疊且具有免疫活性的抗體。已經報告了抗體基因的原核生物表現，對於活性抗體的高產量生產是無效的(Boss,M.A.和Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6:12-13)。
表現本發明之重組抗體的較佳哺乳動物宿主細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(包括dhfr-CHO細胞，在Urlaub和Chasin,(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中描述，使用DHFR可選擇標記，例如，如同在R.J. Kaufman 和P.A. Sharp(1982)Mol. Biol. 159:601-621中描述的)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。特別是使用NSO骨髓瘤細胞，其他較佳的表現系統是在WO87/04462、WO89/01036和歐洲專利338,841中揭示的GS基因表現系統。當將編碼抗體基因的重組表現載體導入哺乳動物宿主細胞內時，藉著培養該宿主細胞一段足以允許該抗體在宿主細胞中表現，或更佳的是使該抗體分泌至宿主細胞在其中生長之培養基內的時間，產生該抗體。可使用標準蛋白質純化方法，從培養基中回收該抗體。
抗體定性
在生產或純化之後，或作為篩選或選擇過程的一部分，可調查本發明之抗-hNKG2D抗體的功能特徵。感興趣的功能特性包括，例如對hNKG2D的抗體結合專一性、抗體與hNKG2D-配位體的競爭、抗體對參考抗體(像是例如16F16、16F31、MS或21F2)的競爭、抗體將與之結合的抗原決定基、抗體-抗原交互作用的親和力，以及抗體的拮抗/激動特性。
以下是抗體定性之典型測定的簡單說明。一部分係進一步描述於後續的段落中，並/或描述於實施例中。
(1)可藉著證明單株抗體(或含有多株抗體之血清，作為動物篩選程序的一部分)與表現NKG2D之細胞結合，而不與NKG2D陰性細胞結合，評估對hNKG2D的抗體專一性。將有或無NKG2D之細胞株與該抗體一起培養，接著與經直接標示並藉著，例如流動式細胞測量術使其顯色的二級抗體一起培養。
(2)可藉著在有或無抗體或融合瘤上清液之下培養表現NKG2D的細胞，接著與配位體-mFc蛋白質和對該配位體專一的二級抗體一起培養，並藉著流動式細胞測量術判定其配位體結合及阻斷的程度，來評估配位體結合的阻斷。可根據與沒有預-培養相比較之有預-培養的配位體結合%來計算阻斷，此時在預-培養後看到較低的結合。
(3)對於由一或多個參考抗-NKG2D抗體使用之結合位置的競爭之評估，可以類似之方式，除了可利用本發明之抗體或參考抗體(例如ON72或149810)來進行預-培養，接著與隨後加入的抗體一起培養並偵測彼等。
(4)可在Biacore機器上判定親和力參數，包括抗體的結合-和解離-率。例如，可將hNKG2D-Fc蛋白質固定在晶片上，使該抗體通過晶片上方，判定結合-和解離-率並計算KD。
(5)可藉著在有或無抗體之下，培養表現hNKG2D的細胞隔夜，接著再度-加入該抗體，並在流動式細胞測量儀中偵測NKG2D的量(即經結合之抗體的量)，測量由該抗體誘導的NKG2D內化。
(6)可使用例如NK細胞株NK92或NKL作為殺死表現NKG2D配位體(MICA、MICB或ULBP1-4任一)之裝載51 Cr的靶定細胞的效應物細胞，評估該抗體阻斷hNKG2D-配位體介導之致死的能力。
(7)可在將猴子和人類PBMC’s與hNKG2D抗體和二級抗體，連同在PBMCs中之不同細胞類型的標記一起培養，並分析各種亞組的NKG2D染色之後，藉著流動式細胞測量術證實人類抗-NKG2D抗體與猴子NK和CD8+T細胞，但不與CD4+T細胞(如在人類中)的交叉反應性。
(8)可根據在經由T-細胞受體CD28及或NKG2D刺激之後，有或無前-刺激(例如經由TCR、CD28和IL-2或IL-15)，在PBMC族群中誘導CD8+細胞的細胞增殖，來測量在抗體結合後的NKG2D之活化。
結合測定
本發明提供與hNKG2D結合的抗體，及其抗原-結合片段和免疫共軛物。可使用任何的各種測定以評估抗體對hNKG2D的結合。基於ELISAs、放射性免疫測定、西方墨點法、BIACORE和其他競爭測定的草案，是特別適用的，並為在技術領域中已熟知的。此外，在實施例中描述了數個結合測定，包括競爭測定。
例如，可使用簡單的結合測定，其中在目標蛋白質或抗原決定基(例如NKG2D或其一部分)的存在下培養受試抗體，洗掉未經結合的抗體，並使用例如放射性標示、物理方法如質譜測定法，或使用例如細胞螢光分析(cytofluorometric analysis，例如FACScan)偵測的直接或間接螢光標示，評估經結合之抗體的存在。這類方法為熟諳此藝者已熟知的。任何超過利用對照組(非-專一性抗體)所見之量的結合量，表示該抗體專一地與目標結合。
在這類測定中，可將受試抗體對目標細胞或人類NKG2D結合的能力與(陰性)對照組蛋白質(例如對結構無關之抗原升高的抗體，或非-Ig肽或蛋白質)對相同目標結合的能力做比較。使用任何適當測定，將與該目標細胞或NKG2D結合，相對於對照組蛋白質，有增加25%、50%、100%、200%、1000%或更高親和力的抗體或片段稱為是與該目標“專一地結合”或“專一地交互作用”，並較適合用在下述的治療方法中。亦可評估受試抗體影響(陽性)對照組抗體對NKG2D結合的能力，例如16F16、16F31、MS或21F2。
本發明一方面提供與16F16、16F31、MS或21F2共享生物學特徵及/或實質VH及/或VL序列同一性的抗-hNKG2D抗體。一典型的生物學特徵是對16F16、16F31、MS或21F2抗原決定基的結合，即在hNKG2D之細胞外功能部位中16F16、16F31、MS或21F2抗體與之結合的個別區域。欲篩選與16F16、16F31、MS或21F2抗原決定基結合的抗體，可進行例行的交叉-阻斷測定，如在抗體，實驗室手冊(Antibodies,A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory,編輯Harlow和David Lane(1988)中描述的。
在典型的交叉-阻斷或競爭測定中，混合(或預先-吸附)16F16、16F31、MS或21F2(對照組)抗體和受試抗體，並施用在含有NKG2D的試樣上。在某些具體事實中，在施用於含有NKG2D的試樣上之前，會預先-混合對照組抗體與各種含量的受試抗體(例如1:10或1:100)一段時間。在其他的具體事實中，在與抗原/目標試樣接觸期間，可簡單地混合對照組和各種含量的受試抗體。只要能區別經結合和自由的抗體(例如藉著使用分離或沖洗技術，以排除未經結合的抗體)，並區別對照組抗體與受試抗體(例如藉著使用物種-或同型物-專一的二級抗體，藉著以可偵測標記專一地標示對照組抗體，或藉著使用物理方法，如質譜測定法，以區別不同的化合物)，便能夠判定受試抗體是否能降低對照組抗體與該抗原之結合，代表該受試抗體實質上辨認與對照組相同的抗原決定基。在該測定中，(經標示之)對照組抗體在完全無關之抗體存在時的結合，為對照組高值。藉著將經標示之(陽性)對照組抗體與未經標示之對照組抗體一起培養，獲得對照組低值，其會發生競爭並降低經標示抗體的結合。
在測試測定中，在受試抗體的存在下，明顯降低了經標示抗體之反應性，表示該受試抗體辨認相同的抗原決定基，即與該經標示之對照組抗體“交叉-反應”的抗原決定基。認為在大約1:10到大約1:100之間任何比例的對照組：受試抗體或化合物下，降低該經標示對照組與抗原/目標之結合至少50%，或較佳的是70%的任何受試抗體或化合物，是實質上與對照組相同之抗原決定基或決定子結合的抗體或化合物。較佳的是，這類受試抗體或化合物會降低對照組與抗原/目標的結合至少90%。儘管如此，在本發明中可使用任何降低對照組抗體或化合物之結合至任何可測量之程度的化合物或抗體。
在一具體事實中，可藉著流動式細胞測量術測試評估競爭。首先將帶有hNKG2D之細胞與已知與受體(例如表現hNKG2D的T或NK細胞或重組表現hNKG2D的BaF/3細胞，和16F16、16F31、MS或21F2抗體)專一結合的對照組抗體一起培養，然後與利用例如螢光染料或生物素標示的受試抗體一起培養。若與飽和量之對照組抗體預培養時獲得的結合為該抗體沒有與對照組預培養時之結合(螢光的平均值)的80%，較佳的是50%、40%或更低，便說該受試抗體與對照組競爭。或者，若使在細胞上之經標示對照組(藉著螢光染料或生物素)與飽和量之受試抗體一起預培養時獲得之結合，為沒有與該抗體一起預培養時獲得之結合的80%，較佳的是50%、40%或更低，便說該受試抗體與對照組競爭。關於典型的抗體競爭測定，參見實施例5。
亦可使用類似的交叉-阻斷測定來評估受試(經人類化)抗體是否影響人類NKG2D之天然配位體(如MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4或RAET1家族之成員)的結合，簡單地藉著以適當形式的hNKG2D-配位體交換16F16、16F31、MS或21F2。在實施例中描述的一種適當形式，為配位體(例如MICA)與抗體之Fc部分的融合蛋白。使配位體與Fc-區共軛，允許藉著對從其中衍生該Fc-區之動物物種專一的抗體來偵測該融合蛋白，例如使用山羊-抗-小鼠抗體來偵測鼠類Fc-區。
在一具體事實中，使用細胞測定，其中將表現hNKG2D之細胞，例如得自類風濕性關節炎患者的CD4+ CD28- 細胞(或來自其他自體免疫或發炎性病症的均等細胞)與NKG2D配位體(如MICA、MICB或ULBP蛋白質，例如呈Fc-融合蛋白之形式)，或表現任何這些配位體的細胞一起培養，並評估抗-NKG2D抗體或其他分子阻斷該細胞之活化的能力。在供選擇的測定中，在沒有配位體之下獲得NKG2D受體活性的基準線水準，並偵測抗體或化合物引起基準線活性水準降低的能力。在一類型的具體事實中，使用高-通量篩選方法，以鑑認能夠阻斷受體之活化，或以其他方式向下調節它的化合物。關於典型的配位體競爭測定，參見實施例3。
較佳的是，辨認NKG2D抗原決定基的單株抗體會與在患者(如類風濕性關節炎患者)中比例很大之CD4+T細胞，特別是CD4+CD28-T細胞上出現的抗原決定基反應，但不會與其他不表現NKG2D的細胞(即免疫或非-免疫細胞)產生明顯的反應。因此，一旦抗體專一地辨認在NK或T細胞上的hNKG2D，便可測試其與取自患有自體免疫或發炎性病症(如類風濕性關節炎)之患者的T細胞結合的能力。應瞭解可使用本發明來治療其中NKG2D活性與病症之病理學有關的任何病症，不考慮表現該受體之細胞類型(例如CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞等等)，並可就其等與在任何與該特定病症有關之細胞類型上的受體結合的能力來測試該抗體。例如，若觀察到一特定病症與表現NKG2D之NK細胞的過量活性或增殖有關，此時便可使用表現相同受體之NK細胞來發展並測試該抗體。
在一具體事實中，在免疫測定中確認抗體，以測試其與表現NKG2D之細胞(例如取自患有類風濕性關節炎之患者的CD4+CD28-T細胞)結合的能力。例如，從眾多患者中取得的周圍血液淋巴球(peripheral blood lymphocytes，PBLs)，並從PBLs中增強CD4+，較佳的是CD4+CD28-細胞，例如藉著使用相關抗體的流動式細胞測量術。然後使用熟諳此藝者已熟知的標準方法，評估特定抗體與該細胞結合的能力。可能認為從有意義百分比之患者中(例如5%、10%、20%、30%、40%、50%或更多)，發現與大部分(例如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多)已知表現NKG2D之細胞(例如得自RA患者之NK細胞、CD8T細胞、CD4T細胞，等等)結合的抗體適用在本發明中，用於診斷目的以判定在患者細胞中NKG2D受體的表現，或用在本文描述之治療方法上，例如用來作為適合人類之阻斷性，或者細胞毒性抗體。欲評估抗體對細胞的結合，可直接或間接標示該抗體。當經間接標示時，典型地加入二級、經標示抗體。然後可使用，例如細胞螢光分析(例如FACS)，偵測該抗體對細胞的結合。這類方法為在技術領域中已熟知的。
在本發明的一些觀點中，例如在不想殺死表現NKG2D的細胞之處，本發明之抗體較佳的是不表露對Fc受體的實質專一性結合。這類抗體可包括各種已知不結合Fc受體之重鏈的恆定區。一個這類的實例為IgG4恆定區。或者，可使用不包括恆定區的抗體片段，如Fab或F(ab’)2片段，以避免Fc受體結合。可根據在技術領域中已知的方法，評估Fc受體結合，包括例如在BIACORE測定中測試抗體對Fc受體蛋白質的結合。再者，可使用任何其他的抗體類型，其中修飾該Fc部分，以便將對Fc受體的結合減至最少或排除(參見，例如WO03101485，將其揭示內容以引用方式納入本文中)。評估Fc受體結合的測定，像是例如基於細胞的測定，為技術領域中已熟知的，並在例如WO03101485中描述。
功能測定
可使用任何反映NKG2D活性的適當生理學改變來評估受試化合物或抗體的利用性。例如，可在例如基於細胞之測定中，測量各種影響，如在基因表現、細胞介素產生、發送信號性分子的磷酸化、細胞生長、細胞增殖、pH、細胞內第二信使(例如Ca2+ 、IP3、cGMP或cAMP)上的改變，或諸如細胞毒活性或活化其他T細胞之能力的活性。例如，可藉著偵測NKG2D-反應性基因，例如CD25、IFN-γ或TNF-α的表現來評估受體的活性(參見，例如Groh等人(2003)PNAS 100:9452-9457；Andre等人(2004)Eur. J. Immunol 34:1-11)。或者，可藉著在配位體或活化性抗-NKG2D抗體，以及抗-CD3抗體的存在下培養CD4+CD28-NKG2D+細胞，並評估該化合物或受試抗體抑制T細胞釋放TNF-α或IFN-γ的能力，來評估NKG2D活性。或者，可在配位體(例如MICA、MICB、ULBP-1、ULBP-2、ULBP-3等等)，或產生配位體之細胞(例如自體的MIC+RA滑膜細胞)的存在下培養CD4+CD28-NKG2D+T細胞，並評估該受試抗體或化合物抑制細胞介素產生(例如IFN-γ或TNF-α)或T細胞增殖的能力。
在試管內的測定可視需要使用取自患有自體免疫或發炎性病症(如RA)之患者的細胞，例如取自RA之患者的表現NKG2D之CD4+CD28-細胞(或從其中衍生的細胞株)，但通常可使用任何表現NKG2D的細胞。例如，可利用編碼NKG2D之轉殖基因轉染非-RA免疫細胞株，例如T細胞株，並用於本測定中，只要該受體的表現以可測定之方式改變該細胞的活性即可，例如使其等成為可被NKG2D配位體活化的。可使用得自RA患者的CD4+CD28-NKG2D+細胞建立細胞株，例如從滑膜組織中分離的PBLs或T細胞。可在IL-15的存在下培養這類細胞，以確保NKG2D的持續表現(參見，例如Groh等人(2003)PNAS 100:9452-9457，將其完整內容以引用方式納入本文中)。
若抗-hNKG2D抗體降低或阻斷NKG2D與一或多個其配位體的交互作用，或與已知阻斷hNKG2D配位體交互作用之抗體競爭，則可用它來使NKG2D-介導之NK或T細胞的活化受挫。這可藉著典型的細胞毒性測定來評估。實施例6描述典型的細胞毒性測定，NKG2D-配位體介導之目標細胞的致死。在這裡，藉著測量目標細胞釋放的51Cr，來評估抗-hNKG2D抗體降低或抑制NK細胞-介導之殺死經MICA-轉染之BaF/3的能力。
在其他方面，確保本發明之抗體缺乏實際的激動劑活性可能係令人滿意。為了該目的可使用數種測定，包括下列者。
一測定可評估在利用抗體(可溶性或培養盤-結合的)活BD化之後，增殖及產生細胞介素，與得自健康志願者或I患者之PBMCs的抗-CD3及/或抗-CD28抗體聯合。在該方法中，藉著傳統方法從健康個體或發炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)患者中純化PBMCs。以CFSE(得自Molecular probes，目錄#C34554)將細胞染色。在107 個細胞(在0.5毫升帶有2% FCS的PBS中)中加入1微升CFSE(0.5mM)，並在37℃下培養該細胞10分鐘。然後加入2毫升FCS，並將混合物留在室溫下1分鐘。然後藉著與RPMI-1640培養基(12毫升)一起離心，沖洗該細胞三次。在沖洗之後，將該細胞再懸浮於1毫升帶有2%FCS之培養基(例如RPMI-1640)中。
在室溫下以30微升抗-小鼠Fc(Jackson-Immuno Research 115-006-008)塗覆96孔培養盤2小時，然後以PBS沖洗。根據以下的計畫加入抗體(抗-CD3 Bioscience目錄#14-0037-82，抗-CD28目錄#348046 Becton Dickison)，並留在孔中：
只有細胞
CD3 0.1或0.3毫微克/毫升
CD3 0.1或0.3毫微克/毫升+CD28 0.2微克/毫升
CD3 0.1或0.3毫微克/毫升+CD28 0.2微克/毫升+抗-NKG2D 0.2微克/毫升
CD3 0.1或0.3毫微克/毫升+抗-NKG2D 0.2微克/毫升
接下來，加入經100.000CFSE標示之PBMCs，並維持3天。然後為了細胞介素的分析收集上清液，並為了增殖藉著流動式細胞測量術，利用抗-CD56、抗-CD4、抗-CD8和CFSE標示，對PBMCs分析關於淋巴細胞的類型。
在另一測定中，測試CD8+T細胞朝向缺乏NKG2D配位體之目標細胞的細胞毒可能性的影響。若結合提高該細胞的細胞毒可能性，則存在激動劑活性。簡言之，將經IL-2刺激之得自健康個體的PBMC與表現MICA的p815細胞一起培養，或與未經轉染的p815細胞和抗-CD3抗體(其藉著在p815細胞上結合Fc受體而會導致再指揮(redirected)致死性)，以及CD8細胞毒T細胞一起培養。然後分析是否抗-NKG2D抗體不與p815細胞結合(例如人類IgG4同型物的抗體)阻斷MICA-NKG2D-指揮之結合，及/或是否該抗體提高CD3-p815再指揮的結合。以此方式，能顯示藉著將p815細胞與抗-CD3抗體和額外的抗-NKG2D抗體一起培養，不能提高CD8+ T細胞的活性，同時可藉著證實其在相同的PBMC族群中阻斷對p815-誘導之致死性的NK-MICA交互作用，顯示相同的抗-NKG2D抗體是有功能的。
在另一測定中，可探究是否可藉著加入一或多個抗-NKG2D抗體，活化NKG2D-發送信號路徑和分子。可使用NK細胞株(像是例如NKL細胞或NK-92細胞)或分離自周圍血液的人類NK或CD8+ T細胞。例如，可將NKL細胞與人類抗-NKG2D抗體一起培養於溶液或培養盤結合之形式，利用例如Fc-MICA或經照射之表現MICA的細胞作為對照組。在培養適當的時間之後(例如5、10、30分鐘)，在蛋白酶和磷酸酶抑制劑的存在下在冰上溶解該細胞，並藉著標準西方墨點技術分析一或多個已知為NKG2D刺激的下游(例如Pi3K、Akt和vav)經磷酸化之信號分子的含量。
在基於動物的測定中，可使用任何在動物內細胞中之NKG2D活化的生理學或病理學後果，來評估抗體或受試化合物活性。
例如，可將CD4+CD28-NKG2D+細胞導入動物模式的關節內，有或無產生配位體之細胞-如產生MICA之滑膜細胞的共同投予，並評估發炎反應或組織傷害。然後可導入受試化合物或抗體，並偵測其等抑制、減緩、逆轉或以任何方式影響該發炎反應或組織傷害的能力。
亦可進行利用類風濕性關節炎(RA)滑膜移植物的實驗，以研究阻斷NKG2D對前-發炎細胞介素之自然釋放的影響(參見，例如Brennan等人,Lancet 1989;2(8657);244-247)。在這類測定中，在RA滑膜培養物上測試人類或經人類化之抗-hNKG2D抗體，並在顯示可用來阻斷NKG2D之配位體結合和功能的濃度下，與例如鼠類抗-hNKG2D抗體做比較。在無或有抗-NKG2D抗體或同型物對照組抗體之下培養RA滑膜細胞48小時。可使用已知的消炎藥作為陽性對照組。一開始以高達30微克/毫升的濃度，在6個RA滑膜上測試抗-NKG2D抗體的效果。在染色活細胞的測定(例如MTT測定)中分析細胞的存活，以決定所加之試劑是否具有任何細胞毒性。然後使用ELISA以偵測在培養物上清液中的細胞介素，像是例如TNFα、IL-1β和IL-6之含量。
或者，可在例如牛皮癬或潰瘍性結腸炎的實驗模式中，測試本發明之抗體。可將經牛皮癬侵襲之皮膚試樣，連同患者自己的PBMC’s移植到SCID小鼠上，並可偵測導入受試化合物的影響，及其等對抑制、減緩、逆轉或以任何方式影響發炎反應或組織傷害的能力。Kjellev等人(Eur J Immuno1 2008;37:1397-1406)和Ito等人(Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008;294:G199-G207)描述了評估使用抗-鼠類NKG2D抗體治療潰瘍性結腸炎的實驗模式。
藥學調配物
在一具體事實中，本發明提供醫藥組合物或調配物，其包括在本文中描述之抗-hNKG2D抗體，連同一或多個載劑。
是包括這類抗體的藥學調配物，其以從1毫克/毫升到500毫克/毫升之濃度存在，且其中該調配物具有從2.0到10.0之pH值。該調配物更可包括緩衝系統、防腐劑(們)、張力劑(們)、螯合劑(們)、穩定劑及/或表面活性劑。在一具體事實中，該藥學調配物是水性調配物，即包括水的調配物。這類調配物典型地是溶液或懸浮液。在更進一步的具體事實中，該藥學調配物是水溶液。將“水性調配物”一詞定義為包括至少50%w/w水的調配物。同樣地，將“水溶液”一詞定義為包括至少50%w/w水的溶液，並將“水性懸浮液”一詞定義為包括至少50%w/w水的懸浮液。
在另一具體事實中，該藥學調配物是經冷凍乾燥的調配物，在投藥之前，醫生或患者可在其中加入溶劑及/或稀釋劑。
在另一具體事實中，該藥學調配物是馬上可使用的經乾燥調配物(例如經冷凍乾燥或噴霧乾燥)，不需要任何事先溶解。
在更進一步的觀點中，該藥學調配物包括這類抗體的水溶液和緩衝溶液，其中該抗體以從1毫克/毫升或以上的濃度存在，且其中該調配物具有從大約2.0到大約10.0之pH值。
在另一具體事實中，該調配物之pH值是在選自由大約2.0到大約10.0、大約3.0到大約9.0、大約4.0到大約8.5、大約5.0到大約8.0和大約5.5到大約7.5所組成之列表的範圍中。
在更進一步的具體事實中，該調配物包含緩衝溶液，其係選自由醋酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘胺醯甘胺酸、組胺酸、甘胺酸、離胺酸、精胺酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基)-胺基甲烷、N-二(羥乙基)甘胺酸、N-三(羥甲基)甲基甘胺酸(tricine)、蘋果酸、琥珀酸鹽、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、天冬胺酸或其混合物所組成之群組。這些特定緩衝溶液中的每一個均構成本發明供選擇的具體事實。
在更進一步的具體事實中，該調配物亦或包括在藥學上可接受的防腐劑。該防腐劑可選自，例如由酚、鄰-甲酚、間-甲酚、對-甲酚、對-羥基苯甲酸甲酯、對-羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、對-羥基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯丁醇和乙基汞硫代水楊酸鈉、溴硝醇(bronopol)、苯甲酸、咪唑烷基脲(imidurea)、氯己啶(chlorohexidine)、脫氫乙酸鈉、氯甲酚、對-羥基苯甲酸乙酯、苄索氯銨(benzethonium chloride)、氯苯甘醚(chlorphenesine)(3對-氯苯氧基丙烷-1,2-二醇)或其混合物所組成之群組。該防腐劑可，例如以從0.1毫克/毫升到20毫克/毫升、從0.1毫克/毫升到5毫克/毫升、從5毫克/毫升到10毫克/毫升，或從10毫克/毫升到20毫克/毫升的濃度存在。這些特定防腐劑中的每一個均構成本發明供選擇的具體事實。防腐劑在醫藥組合物中的用途為熟諳此藝者所熟知的。為了方便，參考雷明頓：藥學的科學和實行(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，第19版，1995。
在更進一步的具體事實中，該調配物亦或包括等張劑。等張劑可以是，例如選自由鹽(例如氯化鈉)、糖或糖醇、胺基酸(例如L-甘胺酸、L-組胺酸、精胺酸、離胺酸、異亮胺酸、天冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸)、多羥糖醇(alditol)(例如甘油(甘油)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物所組成之群組。可使用任何糖，如單-、二-或多醣類，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支鏈澱粉、糊精、環糊精、可溶性澱粉、羥乙基澱粉和羧甲基纖維素-Na。在一具體事實中，該糖衍生物為蔗糖。將糖醇定義為具有至少一個--OH基團的C4-C8碳氫化合物，並包含例如甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、衛矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一具體事實中，該糖醇衍生物為甘露糖醇。可分開或倂用上文提及的糖或糖醇。並沒有固定限制所使用的量，只要該糖或糖醇可溶於液體製劑中，並對使用本發明之方法達到的穩定化效果沒有不利的影響即可。該糖或糖醇濃度可以在，例如大約1毫克/毫升到大約150毫克/毫升之間。該等張劑可以從，例如1毫克/毫升到50毫克/毫升、從1毫克/毫升到7毫克/毫升、從8毫克/毫升到24毫克/毫升，或從25毫克/毫升到50毫克/毫升的濃度存在。這些特定等張劑中的每一個均構成本發明供選擇的具體事實。等張劑在醫藥組合物中的用途為熟諳此藝者所熟知的。為了方便，參考雷明頓：藥學的科學和實行(Remington:The Science and Practice of Pharmacy),第19版,1995。
在更進一步的具體事實中，該調配物亦或包括螯合劑。螯合劑可以是，例如選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸和天冬胺酸的鹽類及其混合物。螯合劑可以例如從0.1毫克/毫升到5毫克/毫升、從0.1毫克/毫升到2毫克/毫升，或從2毫克/毫升到5毫克/毫升的濃度存在。這些特定螯合劑中的每一個均構成本發明供選擇的具體事實。螯合劑在醫藥組合物中的用途為熟諳此藝者所熟知的。為了方便，參考雷明頓：藥學的科學和實行(Remington:The Science and Practice of Pharmacy),第19版,1995。
在本發明更進一步的具體事實中，該調配物亦或選擇性地包括穩定劑。穩定劑在醫藥組合物中的用途為熟諳此藝者所熟知的。為了方便，參考雷明頓：藥學的科學和實行(Remington:The Science and Practice of Pharmacy),第19版,1995。更特定而言，本發明之組合物可能是經穩定化的液體醫藥組合物，其治療活性組份包括多肽，其可能在以液體藥學調配物之形式儲存期間出現聚集體形成。“聚集體形成”意指在多肽分子之間的物理交互作用，結果導致低聚物的形成，其可能仍是可溶的，或從該溶液中沉澱出大型可見的聚集體。“在儲存期間”意指一經製備的液體醫藥組合物或調配物，沒有立刻投予個體。而是，在製備之後，為了儲存將它包裝好，以液體形式、以冷凍狀態，或以經乾燥之形式，為了稍後再重建成液體形式或其他適合投予個體的形式。“經乾燥之形式”係企圖藉著冷凍乾燥(即冷凍乾燥；參見，例如Williams和Polli(1984)J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59)、噴霧乾燥(參見Masters(1991)噴霧乾燥手冊(Spray-Drying Handbook)(第5版；Longman Scientific and Technical,Essez,U.K.),第491-676頁中；Broadhead等人(1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206；和Mumenthaler等人(1994)Pharm. Res. 11:12-20)，或風乾(Carpenter和CroWe(1988)Cryobiology 25:459-470；和Roser(1991)Biopharm. 4:47-53)，使液體醫藥組合物或調配物乾燥。在液體醫藥組合物的儲存期間，由多肽形成聚集體，可能對該多肽之生物活性有不利的影響，結果喪失了該醫藥組合物的治療效力。此外，聚集體形成可能引起其他問題，如在使用輸液系統投予含多肽之醫藥組合物時，阻塞管子、膜或幫浦。
本發明之醫藥組合物可選擇性地或更包括足以降低在儲存組合物期間由多肽形成聚集體之含量的胺基酸鹼。“胺基酸鹼”意指胺基酸或胺基酸的組合，在這裡任何特定的胺基酸係以其自由鹼形式或以其鹽類形式存在。在使用胺基酸組合之處，所有的胺基酸均可以其自由鹼形式存在，全部以其鹽形式存在，或一些可以其自由鹼形式而其他的則以其鹽形式存在。在一具體事實中，用來製備本發明之組合物的胺基酸是具有帶電荷側鏈者，如精胺酸、離胺酸、天冬胺酸和穀胺酸。特殊胺基酸的(例如甲硫胺酸、組胺酸、咪唑、精胺酸、離胺酸、異亮胺酸、天冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸及其混合物)的任何立體異構體(即L、D或其混合物)，或這些立體異構體之組合，均可出現在本發明之醫藥組合物中，只要該特殊胺基酸是以其自由鹼形式或其鹽形式存在即可。在一具體事實中，使用L-立體異構體。亦可利用這些胺基酸的類似物來調配本發明之組合物。“胺基酸類似物”意指天然存在之胺基酸的衍生物，其在儲存本發明之液體醫藥組合物期間，產生降低由多肽形成聚集體的想要效果。適當的精胺酸類似物包括，例如胺基胍、鳥胺酸和N-單乙基L-精胺酸，適當的甲硫胺酸類似物包括乙硫胺酸和丁硫胺酸，而適當的半胱胺酸類似物包括S-甲基-L-半胱胺酸。如利用其他的胺基酸，以其自由鹼形式或其鹽形式，將該胺基酸類似物倂入組合物內。在本發明更進一步的具體事實中，以足以阻止或延遲蛋白質聚集的濃度，使用胺基酸或胺基酸類似物。
在本發明更進一步的具體事實中，當作為治療劑之多肽為包括至少一個易感受這類氧化作用之甲硫胺酸殘基的多肽時，可加入甲硫胺酸(或其他含硫胺基酸或胺基酸類似物)，以抑制甲硫胺酸殘基氧化成甲硫胺酸亞碸的作用。關於此點，“抑制”一詞企圖意指在經過時間內有最少甲硫胺酸經氧化之物種的堆積。抑制甲硫胺酸氧化，結果使大部分的多肽保持在其適當的分子形式下。可使用甲硫胺酸(L或D)或其組合的任何立體異構體。欲加入的量應該是足以抑制甲硫胺酸殘基氧化的量，使得甲硫胺酸亞碸的量為管理機構可接受的。典型地，這意味著該組合物含有不超過大約10%到大約30%甲硫胺酸亞碸。通常，這可藉著加入甲硫胺酸，使得所加入之甲硫胺酸對甲硫胺酸殘基的比例在從大約1:1到大約1000:1，如10:1到大約100:1而達成。
在更進一步的具體事實中，該調配物更或另外包括選自由高分子量聚合物或低分子化合物所組成之群組的穩定劑。在本發明更進一步的具體事實中，該穩定劑係選自聚乙二醇(例如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基-/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、環糊精、含硫物質，如單硫代甘油、巰基乙酸和2-甲硫基乙醇，以及不同的鹽類(例如氯化鈉)。這些特定穩定劑中的每一個均構成本發明供選擇的具體事實。
醫藥組合物可亦或選擇性地包括額外的穩定劑，其進一步提高其中具有治療活性之多肽的穩定性。本發明特別感興趣的穩定劑包括，但不限於甲硫胺酸和EDTA，其保護多肽對抗甲硫胺酸氧化，以及非離子表面活性劑，其保護多肽對抗與冷凍-融化或機械剪切有關的聚集。
在更進一步的具體事實中，該調配物更或選擇性地包括表面活性劑。表面活性劑可例如，選自除垢劑、經乙氧基化之蓖麻油、經聚乙二醇化之甘油酯、經乙醯基化之單甘油酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛沙姆(poloxamer)，如普魯尼克F68、泊洛沙姆188和407、三通(Triton)X-100)、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚乙烯衍生物，如經烷基化和經烷氧基化之衍生物(吐溫，例如吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80和布里傑(Brij)-35)、單甘油酯或其經乙氧基化之衍生物、二甘油酯或其聚氧乙烯衍生物、醇、甘油、凝集素和磷脂(例如磷脂醯絲胺酸、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯肌醇、二磷脂醯甘油和神經鞘磷脂)、磷脂之衍生物(例如二棕櫚醯基磷脂酸)和溶血磷脂酸之衍生物(例如棕櫚醯基溶血磷脂醯-L-絲胺酸，以及乙醇胺、膽汁素、絲胺酸或蘇胺酸的1-醯基-sn-甘油-3-磷酸酯)，以及溶血磷脂醯基和磷脂醯膽鹼的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)-衍生物，例如溶血磷脂醯膽鹼的月桂醯基和肉荳蔻醯基衍生物、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼，以及極性首基的修飾，即膽汁素、乙醇胺、磷脂酸、絲胺酸、蘇胺酸、甘油、肌醇和帶正電的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、溶血磷脂醯絲胺酸和溶血磷脂醯蘇胺酸，以及甘油磷脂(例如腦磷脂)、甘油基糖脂(例如吡喃半乳糖苷)、神經鞘糖脂(例如神經醯胺、神經節苷脂)、十二烷基磷酸膽鹼、雞蛋溶血卵磷脂、梭鏈孢酸衍生物-(例如牛磺二氫梭鏈孢酸鈉等等)、長鏈脂肪酸及其C6-C12鹽類(例如，油酸和辛酸)、醯基肉鹼及衍生物、離胺酸、精胺酸或組胺酸的Nα -經醯基化衍生物、或離胺酸或精胺酸的側鏈經醯基化衍生物、包括離胺酸、精胺酸或組胺酸與中性或酸性胺基酸之任何組合的二肽之Nα -經醯基化衍生物、包括中性胺基酸與兩個帶電荷胺基酸之任何組合的三肽之Nα -經醯基化衍生物、DSS(多庫酯(docusate)鈉，CAS登記編號[577-11-7]、多庫酯鈣，CAS登記編號[128-49-4]、多庫酯鉀，CAS登記編號[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)、辛酸鈉、膽酸或其衍生物、膽汁酸及其鹽類和甘胺酸或牛磺酸共軛物、烏索脫氧膽鹼(ursodeoxycholic acid)、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘膽酸鈉、N-十六烷基-N,N-二甲基-3-氨-1-丙烷磺酸酯、陰離子的(烷基-芳基-磺酸酯)單價表面活性劑、兩性離子表面活性劑(例如N-烷基-N,N-二甲基氨-1-丙烷磺酸酯、3-膽胺-1-丙基二甲基氨-1-丙烷磺酸酯)、陽離子表面活性劑(四級銨鹼)(例如十六烷基-三甲基溴化銨、十六烷基氯化吡錠)、非-離子之表面活性劑(例如十二烷基β-D-吡喃葡糖苷、泊洛沙邁(poloxamines)(例如特左尼克(Tetronic’s))-其為衍生自連續添加環氧丙烷和環氧乙烷的四功能嵌段共聚物，或可選自由咪唑啉衍生物或其混合物所組成之群組的表面活性劑。這些特定表面活性劑中的每一個均構成本發明供選擇的具體事實。
表面活性劑在醫藥組合物中的用途為熟諳此藝者所熟知的。為了方便，參考雷明頓：藥學的科學和實行(Remington:The Science and Practice of Pharmacy),第19版,1995。
在更進一步的具體事實中，該調配物更或另外包括蛋白酶抑制劑，如EDTA(乙二胺四乙酸)和苯甲脒HCl，但亦可使用其他市售的蛋白酶抑制劑。在醫藥組合物中特別有用的蛋白酶抑制劑包括蛋白酶的酶原，以便抑制自動催化。
在本發明之肽藥學調配物中，可能亦或出現其他的成分。這類額外的成分可包括濕潤劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張力改性劑、螯合劑、金屬離子、含油媒劑、蛋白質(例如人類血清白蛋白、明膠或蛋白質)和兩性離子(例如胺基酸，如甜菜鹼、牛磺酸、精胺酸、甘胺酸、離胺酸和組胺酸)。這類額外的成分，當然不應對本發明之藥學調配物的整體穩定性有不利的影響。
可在數個位置，將含有根據本發明之抗體的醫藥組合物投予需要這類治療的患者，例如在局部位置，例如皮膚和黏膜位置，在繞過吸收之處，例如在動脈、靜脈、心臟中投藥，以及在涉及吸收之處，例如在皮膚、皮膚下、黏膜中或腹腔中投藥。
根據本發明之醫藥組合物的投藥，可經由數個投藥路徑，例如舌的、舌下、頰部、在口中、經口、在胃和小腸中、經鼻、肺臟，例如經由支氣管和肺泡或其組合，表皮、真皮、經皮、經陰道、經直腸、經眼，例如經由結膜、經輸尿管，以及非經腸，投予至需要這類治療的患者。
可以數種劑型投予本發明之組合物，例如以溶液、懸浮液、乳劑、微滴乳劑、多重乳劑、泡沫、藥膏、軟膏、硬膏劑、油膏、錠劑、塗膜錠劑、漂洗劑、膠囊，例如硬明膠膠囊和軟明膠膠囊、栓劑、直腸膠囊、滴劑、凝膠、噴霧劑、散劑、氣溶膠、吸入劑、眼藥水、眼藥膏、洗眼劑、陰道栓劑、陰道環、陰道油膏、注射溶液、就地轉型性溶液，例如就地膠凝、就地凝固、就地沉澱、就地結晶、輸液溶液和植入物。
可進一步將本發明之組合物，例如經由共價、忌水和靜電之交互作用，在藥物載劑、藥物遞送系統和先進的藥物遞送系統中調製或與其附接，以便進一步提高該抗體之穩定性、增加生物利用性、增加溶解度、降低不利的影響、達到熟諳此藝者已熟知的時間治療，並增加患者順從性或其任何組合。載劑、藥物遞送系統和先進的藥物遞送系統之實例包括，但不限於聚合物，例如纖維素和衍生物、多醣類，例如葡聚糖和衍生物、澱粉和衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、載劑蛋白質，例如白蛋白、凝膠，例如熱膠凝系統，例如熟諳此藝者已熟知的嵌段共聚物系統，膠束、脂質體、微球體、奈米顆粒、液晶及其分散體，L2相及其分散體，熟諳此藝者已熟知在脂質-水系統中的相狀態、聚合物膠束、多重乳劑、自我-乳化、自我-微乳化、環糊精及其衍生物和樹狀分子。
本發明之組合物可用來調配固體、半固體、散劑和溶液，以供抗體的肺臟投藥，使用例如計量給藥的吸入器、乾粉吸入器和霧化器，全都是熟諳此藝者已知的裝置。
本發明之組合物在調配經控制、持續的、延長型、經延遲並緩慢釋放之藥物遞送系統上是特別有用的。更明確地說，該組合物可用來(但不限於)調配非經腸之經控制釋放和持續釋放的系統(兩種系統均導致投藥次數的多倍減少)，為熟諳此藝者已熟知的。再更佳的，是經控制釋放和持續釋放的皮下投藥系統。無意限制本發明之範圍，有用的經控制釋放系統和組合物之實例為水凝膠、含油凝膠、液晶、聚合物膠束、微球體、奈米顆粒。
產生可供本發明之組合物使用的經控制釋放系統的方法，包括但不限於結晶、縮合、共同-結晶、沉澱、共同-沉澱、乳化、分散、高壓均質化、包膠、噴霧乾燥、微包膠、凝聚、相分離、溶劑蒸發以產生微球體、擠壓和超臨界流體萃取加工。通常參考藥物控制釋放手冊(Handbook of Pharmaceutical Controlled Release)(Wise, D.L.,編輯Marcel Dekker,New York,2000)和藥物和製藥科學(Drug and the Pharmaceutical Science)第99冊：蛋白質調配和遞送(Protein Formulation and Delivery)(MacNally,E.J.,編輯Marcel Dekker,New York,2000)。
可藉著皮下、肌肉內、腹腔內或靜脈內注射，藉著注射筒，可視需要為像筆的注射筒，進行非經腸投藥。或者，亦可藉著輸液幫浦進行非經腸投藥。更多的選擇為可能是溶液或懸浮液的組合物，以經鼻或肺臟噴霧之形式投予抗體化合物。作為另一選擇，亦可將包含本發明之抗體的醫藥組合物改造成經皮投藥的，例如藉著無針頭注射或來自貼片，可視需要為離子電滲貼片，或經黏膜的，例如頰部投藥。
可經由肺臟路徑投予在媒劑中的抗體，如溶液、懸浮液或乾粉，使用任何已知類型之適合肺臟藥物遞送的裝置。這些的實例包括但不限於三種普通類型之用於肺臟藥物遞送的氣溶膠生成，並可包括噴射或超音波霧化器、計量給藥的吸入器或乾粉吸入器(參照Tu J,Chien YW.肺臟藥物遞送：生理學和機械觀點(Pulmonary drug delivery:Physiologic and mechanistic aspects). Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4)(1997)395-453)。
基於經標準化的測試方法，將顆粒的空氣動力學直徑(da )定義為單位密度(1克/立方公分)之參考標準球狀顆粒的幾何等價直徑。在最簡單的情況下，對球狀顆粒而言，da 與參考直徑(d)有關，為如下描述之密度比的平方根之函數：
對於非-球狀顆粒，修改該關係(參照Edwards DA,Ben-Jebria A,Langer R.在使用大型多孔經吸入顆粒之肺臟藥物遞送上的最新進步(Recent advancesin pulmonary drug delivery using large,porous inhaled particles). J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。名詞“MMAD”和“MMEAD”為經充分描述並為技術領域中已知的(參照Edwards DA,Ben-Jebria A,Langer R.，並代表空氣動力學顆粒尺寸分布之中間值的測量值。在使用大型多孔經吸入顆粒之肺臟藥物遞送上的最新進步(Recent advances in pulmonary drug delivery using large,porous inhaled particles). J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。質量中值直徑(mass medianaerodynamic diameter，MMAD)和質量中值有效直徑(mass median effective aerodynamic diameter，MMEAD)可交替使用，其為統計學參數，並憑經驗描述氣溶膠顆粒的大小與其可能沉降在肺中的關係，與實際的形狀、尺寸或密度無關(參照Edwards DA,Ben-Jebria A,Langer R.在使用大型多孔經吸入顆粒之肺臟藥物遞送上的最新進步(Recent advances in pulmonary drug delivery using large,porous inhaled particles). J Appl Physiol 84(2) (1998)379-385)。通常從利用撞擊器(一種測量顆粒在空氣中之慣性行為的儀器)進行的測量來計算MMAD。
在更進一步的具體事實中，可藉著任何已知的氣溶膠化技術，如霧化，將該調配物氣溶膠化，達到低於10微米，更佳的是在1-5微米之間，且最佳的是在1-3微米之間的氣溶膠顆粒之MMAD。較佳的顆粒大小是基於遞送藥物至肺深處的最有效大小，在那裡最適合吸收蛋白質(參照Edwards DA,Ben-Jebria A,Langer R.在使用大型多孔經吸入顆粒之肺臟藥物遞送上的最新進步(Recent advances in pulmonary drug delivery using large,porous inhaled particles). J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。
使包括抗體的肺臟調配物沉降至肺深處，可視需要藉著使用吸入技術的修飾進一步最適化，例如但不限於：減緩吸入流(例如30公升/分鐘)、屏住呼吸並計時吐氣。
“穩定化之調配物”意指具有增加物理穩定性、增加化學穩定性或增加物理和化學穩定性的調配物。
當在本文中使用蛋白質調配物的“物理穩定性”一詞時，意指由於抗體暴露在熱-機械壓力下及/或與經去穩定化之界面和表面(如疏水性表面和界面)作用的結果，而使該抗體形成無生物活性及/或不可溶之聚集體的傾向。藉著在不同的溫度下，使裝滿適當容器(例如藥筒或小瓶)的調配物暴露在機械/物理壓力(例如攪拌)之下持續各種時間之後，目視檢查及/或測量混濁度，來評估水性抗體調配物的物理穩定性。利用暗背景以尖銳集中的光，進行調配物的目視檢查。例如，藉著按從0到3之刻度排列混濁度的程度，進行目視計分(顯示無混濁度之調配物等於目視計分0分，而在日光下顯示可見混濁度之調配物等於目視計分3分)，定出調配物之混濁度的特徵。被分類為物理不穩定的調配物與抗體聚集有關，此時它在日光下顯示可見的混濁度。或者，可藉著熟諳此藝者已熟知的簡單混濁度測量，評估調配物的混濁度。亦可藉著使用抗體之構象狀態的分光劑(spectroscopic agent)或探針，評估水性抗體調配物的物理穩定性。該探針較佳的是優先與該抗體之非-天然構象子結合的小分子。蛋白質結構之小分子分光探針的實例之一為硫黃素(Thioflavin)T。硫黃素T是螢光染料，其已經被廣泛地使用在類澱粉原纖維的偵測上。在出現原纖維時，或許還有其他的蛋白質構型，硫黃素T在與原纖維蛋白質形式結合時，在大約450奈米處引起新的最大激發，並在大約482奈米處提高了發射。未經結合的硫黃素T基本上在該波長下是沒有螢光的。
可使用其他的小分子作為蛋白質結構從天然變成非-天然狀態的探針。例如，“疏水性補片”探針優先與蛋白質的經暴露之疏水性補片結合。疏水性補片經常被隱藏在呈其天然狀態之蛋白質的三級結構內，但當蛋白質開始展開或變性時就會露出。這些小分子之分光探針的實例為芳香族的疏水性染料，如蒽(antrhacene)、吖啶、菲咯啉(phenanthroline)或類似物。其他的分光探針為金屬-胺基酸複合物，如疏水性胺基酸(如苯丙胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、甲硫胺酸和纈胺酸)的鈷金屬複合物，或類似物。
當在本文中使用抗體調配物的“化學穩定性”一詞時，意指在抗體結構中的化學共價改變，導致化學降解產物的形成，其與天然的抗體結構相比較，可能有較低之生物效能並/或可能增加免疫性特性。依據天然抗體的類型和性質以及該抗體所暴露之環境，可能形成各種化學降解產物。化學降解的排除，或許極可能無法完全避免，並經常在儲存和使用該抗體調配物的期間看到逐漸增加含量的化學降解產物，如同熟諳此藝者已熟知的。大多數蛋白質有脫醯胺基的傾向，為其中在穀胺醯胺醯基或天冬醯胺醯基殘基中之側鏈醯胺基團被水解形成自由羧酸的過程。其他的降解路徑涉及高分子量轉型產物的形成，在這裡經由轉醯胺作用及/或二硫交互作用，將二或多個蛋白質分子彼此共價結合，導致經共價結合之二聚體、低聚物和聚合物降解產物的形成(蛋白質藥物的穩定性(Stability of Protein Pharmaceuticals),Ahern. T.J. & Manning M.C.,Plenum Press,New York 1992)。可說(例如甲硫胺酸殘基的)氧化是化學降解的另一變體。可藉著在暴露於不同的環境條件(經常可藉著例如漸增之溫度，加速降解產物的形成)之後，在各種時間點測量化學降解產物的量，來評估抗體調配物的化學穩定性。經常藉著依據分子大小及/或電荷，使用各種層析技術(例如SEC-HPLC及/或RP-HPLC)分離降解產物，判定每個個別降解產物的量。
因此，如同上文概述的，“經穩定化之調配物”意指具有增加之物理穩定性、增加之化學穩定性或增加之物理和化學穩定性的調配物。通常，調配物在使用和儲存期間(依從建議的使用和儲存條件)必須是穩定的，直到到達屆滿期為止。
在本發明之一具體事實中，該藥學調配物包括在持續使用超過6週和儲存超過3年仍是穩定的抗體。
在本發明另一具體事實中，該藥學調配物包括抗體在使用超過4週和儲存超過3年仍是穩定的。
在本發明更進一步的具體事實中，該藥學調配物包括抗體在使用超過4週和儲存超過2年仍是穩定的。
在本發明再更進一步的具體事實中，該藥學調配物包括抗體在持續使用超過2週和儲存超過2年仍是穩定的。
亦可藉著另一個業已發展出之治療性單株抗體的審查經驗，判定適當的抗體調配物。已經有數個單株抗體顯示在臨床狀況中是有效的，如美羅華(Rituxan)(利妥昔單抗(Rituximab))、賀癌平(Herceptin)(曲妥珠單抗(Trastuzumab))、索雷爾(Xolair)(奧馬利單抗(Omalizumab))、百克沙(Bexxar)(托西莫單抗(Tositumomab))、康派司(Campath)(阿崙單抗(Alemtuzumab))、澤娃靈(Zevalin)、昂可萊(Oncolym)、修美樂(Humira)和類似的調配物，其可與本發明之抗體一起使用。例如，可以10毫克/毫升之濃度，在100毫克(10毫升)或500毫克(50毫升)單次使用的小瓶中供應單株抗體，以9.0毫克/毫升氯化鈉、7.35毫克/毫升檸檬酸鈉二水合物、0.7毫克/毫升聚山梨醇酯80和注射用滅菌水調配，以供IV投藥。將pH值調整到6.5。或者，可在包括組胺酸、蔗糖和聚山梨醇酯80的溶液中調配該抗體。
診斷應用
本發明之hNKG2D-抗體亦具有非-治療應用。例如，抗-hNKG2D抗體可能在NKG2D蛋白質之診斷測定中也是有用的，例如偵測其在特定細胞、組織或血清中的表現。例如，可在選擇適合抗-hNKG2D治療之患者的測定中使用抗-hNKG2D抗體。為了這類目的，可使用抗-hNKG2D抗體來分析在血清或組織樣本中hNKG2D的存在、測試表現NKG2D之CD4+T細胞的存在，或使表現NKG2D之細胞(例如NK或CD4+或CD8+T細胞)升高之疾病的存在。可將這類分析與測試(例如可溶性MICA在血液中之程度)的分析結合(參見，例如Spies等人的WO2003089616)。
關於診斷應用，典型地會以可偵測部分標示抗體。通常可將許多可利用的標示分成下列類別：
(a)放射性同位素，如35 S、14 C、125 I、3 H和131 I。可利用放射性同位素標示抗體，例如使用在免疫學之最新草案(Current Protocols in Immunology)，第1和2冊，Coligen 等人編輯Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs. (1991)中描述的技術，並可使用閃爍計數測量放射性。
(b)可利用螢光標示，如稀土螯合物(銪螯合物)或螢光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹磺醯基、酸性直接染料(Lissamine)、藻紅素和德克薩斯紅(Texas Red)。可將螢光標示與抗體共軛，例如使用在免疫學之最新草案(Current Protocols in Immunology)，在前中揭示的技術。可使用螢光計定量螢光。
(c)可應用各種酵素-受質標示，而美國專利第4,275,149號提供了其中一些的回顧。酵素通常催化顯色受質的化學改變，其可使用各種技術測量。例如，酵素可催化受質中的顏色改變，其可以分光光度測定測量。或者，酵素可改變受質的螢光或化學發光。上文描述了定量螢光改變的技術。藉著化學反應使化學發光受質變成經電子激發的，然後可發出可測量的光(例如使用化學發光計)或把能量捐給螢光接受者。酵素標示的實例包括蟲螢光素酶(例如螢火蟲蟲螢光素酶和細菌蟲螢光素酶；美國專利第4,737,456號)、蟲螢光素、2,3-二氫呔二酮、蘋果酸脫氫酶、脲酵素、過氧化酶，如辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRPO)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、醣氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化酶、微過氧化酶以及類似物。在O’Sullivan等人,“製備用於酵素免疫測定中之酵素-抗體共軛物的方法(Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Im munoassay)”,在Methods in Enzym.(編輯J.Langone&H. Van Vunakis)中,Academic Press,New York,73:147-166(1981)中描述了將酵素與抗體共軛的技術。
酵素-受質組合之實例包括，例如：
(i)辣根過氧化酶(HRPO)以過氧化氫酶作為受質，其中該過氧化氫酶氧化染料前驅物(例如鄰苯二胺(OPD)或3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽(TMB))；
(ii)鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)以對-硝苯基磷酸酯作為顯色受體；以及
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Ga1)利用顯色受質(例如對-硝苯基-β-D-半乳糖苷酶)或螢光受質4-甲基繖形基(umbelliferyl)-對-β-半乳糖苷酶。
熟諳此藝者可利用許多其他的酵素-受質組合。關於這些的全面回顧，參見美國專利第4,275,149號和4,318,980號。
有時，將標示間接地與抗體共軛。熟諳此藝者會明白達成該作業的各種技術。例如，可將抗體與生物素共軛，並可將上文提及之三大類標示的任一種與抗生物素蛋白共軛，反之亦然。生物素選擇性地與抗生物素蛋白結合，並因此可以該間接方式將標示與抗體共軛。或者，欲達成標示與抗體的間接共軛，亦可將抗體與小型附著素(例如地谷新(digoxin))共軛，並將一個上文提及之不同類型的標示與抗-附著素抗體(例如抗-地谷新抗體)共軛。因此，可達成標示與抗體的間接共軛。
在本發明之另一具體事實中，不需要標示抗-NKG2D抗體，而可使用經標示之與該NKG2D抗體結合的二級抗體偵測它的存在。
可在任何已知的測定方法中使用本發明之抗體，如競爭性-結合測定、直接和間接三明治測定，以及免疫沉澱測定。Zola,單株抗體：技術手冊(Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques),第147-158頁(CRC Press,Inc.1987)。
關於免疫組織化學法，組織試樣可以是新鮮或冷凍的，或可以是包埋在石蠟中，並以防腐劑-如福馬林固定的。
亦可在活體內的診斷測定中使用該抗體。通常，以放射性核種或非-放射性的指示劑標示該抗體，該指示劑可藉著例如核磁共振或其他在技術領域中已知的方法偵測。較佳的是，該標示為放射性標記，像是例如125 I、131 I、67 Cu、99m Tc或111 In。將經標示之抗體投予宿主，較佳的是經由血流，並測定在宿主中該經標示抗體的存在和位置。該顯影技術適用於贅瘤的偵測、判定階段和治療。藉著任何方法將放射性同位素與蛋白質共軛，包括金屬-螯合的化合物或乳過氧化酶，或用於碘化的艾多根(iodogen)技術。
為了方便，可以套組之形式提供本發明之抗體，即為預定量之試劑與進行該診斷測定用之說明書的包裝組合。在以酵素標示抗體之處，該套組會含有酵素所需之受質和輔因子(例如受質前驅物，其提供可偵測的發色團或螢光團)。此外，亦可納入其他添加物，如穩定劑、緩衝溶液(例如阻斷緩衝溶液或溶解緩衝溶液)，以及類似物。可廣泛地改變各種試劑的相對含量，以提供使該測定之敏感性實質上最優化的試劑溶液之濃度。特定而言，可以乾燥粉劑之形式(通常是經冷凍乾燥的)提供試劑，包括賦形劑，其在溶解時會提供具有適當濃度的試劑溶液。
治療應用
亦由本發明提供使用在本文中描述之人類或經人類化之抗-hNKG2D抗體，來治療患者的方法。在一具體事實中，本發明提供如本文描述之人類或經人類化之抗體，在製備投予人類患者之醫藥組合物上的用途。典型地，該患者罹患或有自體免疫或發炎性疾病或病症的風險。
例如，本發明一方面在需要其之患者中提供降低或抑制hNKG2D-介導之NK或T細胞之活化的方法，包括對該患者投予人類或經人類化之抗-NKG2D抗體的步驟，該抗體降低或阻止了NKG2D受體的配位體-介導之活化。在一具體事實中，該方法針對在患者中減少這類淋巴細胞的活性，其患者患有之疾病中增加NK或T細胞活性是有害的,涉及、影響或由易被NK或T細胞溶解之細胞引起，或由增加之NK及/或T細胞活性引起或具該特徵的疾病，如自體免疫疾病或病症，或發炎性疾病。本發明一方面提供在患者中降低慢性發炎反應的方法。
欲利用本發明之多肽、抗體及其他化合物治療之典型疾病或病症，包括但不限於全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosis)、類風濕性關節炎、幼年型慢性關節炎(juvenile chronic arthritis)、牛皮癬性關節炎(psoriatic arthritis)、骨關節炎(osteoarthritis)、脊椎關節病(spondyloarthropathies)(強直性脊椎炎(ankylosing spondylitis))、全身性硬化症(systemic sclerosis)(硬皮病(scleroderma))、特發性發炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies)(皮肌炎(dermatomyositis)、多肌炎(polymyositis))、薛格連氏徵候群(Sjogren’s syndrome)、脈管炎(vasculitis)、全身性脈管炎(systemicvasculitis)、顳動脈炎(temporal arteritis)、粥樣硬化(atherosclerosis)、類肉瘤病(sarcoidosis)、重症肌無力(myasthenia gravis)、自體免疫溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)(免疫全血細胞減少(immune pancytopenia)、陣發性夜間血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria))、惡性貧血(pernicious anemia)、自體免疫血小板減少症(autoimmune thrombocytopenia)(特發性血小板減少性紫斑(idiopathic thrombocytopenic purpura)、免疫-介導之血小板減少症(immune-mediated thrombocytopenia))、甲狀腺炎(thyroiditis)(葛瑞夫茲病(Grave’s disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、幼年型淋巴細胞性甲狀腺炎(juvenile lymphocytic thyroiditis)、萎縮性甲狀腺炎(atrophic thyroiditis))、糖尿病(diabetes mellitus)、免疫-介導之腎病(immune-mediated renal disease)(腎小球性腎炎(glomerulonephritis)、腎小管間質性腎炎(tubulointerstitial)、自體免疫卵巢炎(autoimmune oophiritis))、自體免疫睪丸炎(autoimmune orchitis)、自體免疫葡萄膜炎(autoimmune uveitis)、抗-磷脂徵候群(anti-phospholipid syndrome)、中樞和周圍神經系統的脫髓鞘疾病(demyelinating diseases)，如多發性硬化症(multiple sclerosis)、特發性脫髓鞘性多神經病(idiopathic demyelinating polyneuropathy)或基林巴瑞徵候群(Guillain-Barre syndrome)，以及慢性發炎性脫髓鞘性多神經病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)、肝膽疾病，如傳染性肝炎(A、B、C、D、E型肝炎和其他非-親肝性病毒)、自體免疫慢性主動性肝炎(autoimmune chronic active hepatitis)、病毒性肝炎(viral hepatitis)、原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、肉芽腫性肝炎(granulomatous hepatitis)、韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)、貝西氏病(Behcet’s disease)和硬化性膽管炎(sclerosing cholangitis)、發炎性腸病，如潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)或克隆氏症(Crohn’s disease)、乳糜瀉(celiac disease)、麩質-敏感性腸病(gluten-sensitive enteropathy)和惠普爾病(Whipple’s disease)、自體免疫或免疫-介導的皮膚病，包括大疱性皮膚病(bullous skin diseases)、多形紅斑(erythema multiforme)和接觸性皮膚炎、疱疹樣皮膚炎(dermitis herpetiformis)、牛皮癬(psoriasis)、尋常性天疱瘡(pemphigus vulgaris)、白瘢風(vitiligo)(白斑(leukoderma))、過敏性疾病，如氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、食物過敏和蕁麻疹、肺的免疫學疾病，如嗜曙紅細胞性肺炎(eosinophilic pneumonias)、特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis)和過敏性肺炎、慢性阻塞性肺病，以及與移植有關的疾病，包括移植排斥和移植-對-宿主-疾病。
例如，一方面將抗-hNKG2D抗體與一或多個其他的消炎劑併用，包括但不限於止痛劑、免疫抑制劑(例如B-或T-細胞拮抗劑，如B-細胞耗盡劑和T細胞抑制劑；補體抑制劑)、皮質類固醇，以及抗-TNFα劑或其他的抗-細胞介素或抗-細胞介素受體劑，以及抗-血管生成劑。特殊實例包括胺甲碟呤、TSG-6、美羅華或其他B-細胞療法、抗-IL12(p40)抗體、CTLA4-Fc融合蛋白、IL-1-受體拮抗劑、IL-1抗體、IL-15抗體、IL-18抗體和抗-IL6R抗體。在下文中提供組合治療的更多實例。
當與本療法併用一或多個其他製劑或方法時，混合結果不需要是分開進行每種治療時所觀察到之效果的相加。雖然至少一種附加效果通常是想要的，但任何超過一種單一療法之NKG2D活性降低或其他有利影響都會是有利的。再者，對於展現出協同效果的混合治療並無特殊需求，雖然這確實是有可能且有利的。基於NKG2D的治療可在另一治療之前或之後，例如以範圍從數分鐘到數週和數個月之間隔。亦可想像會使用抗-NKG2D組合物或其他製劑的一次以上投藥。可交替投予製劑，每隔一日或一週；或可在其他製劑療法的循環之後，給予抗-NKG2D治療的循環。無論如何，全都需要以有效發揮治療有利之效果的混合量遞送兩種製劑，不論投藥的時間為何。
以下描述一些經選擇的發炎性及/或自體免疫疾病或病症，可使用本發明之抗-hNKG2D抗體作為其等之治療劑。較佳的是，該抗-hNKG2D抗體是全長二價的MS或21F2，或其抗原-結合片段、變體或衍生物。
類風濕性關節炎
類風濕性關節炎(RA)是慢性全身性自體免疫發炎性疾病，其主要涉及多個關節的滑膜，結果傷害關節軟骨。發病原理為T淋巴細胞依賴性的，並與風濕樣因子的產生有關，自身抗體對抗自己的IgG，結果形成免疫複合體，其在關節液和血液中達到高量。這些複合體在關節中可能誘導淋巴細胞和單核細胞明顯浸潤至滑膜內，以及後續的明顯滑膜改變；關節空間被類似的細胞浸潤，還有許多嗜中性白血球。病理學T細胞產生細胞介素及其他可溶性因子，增加了其他細胞的吸引和活化，亦增加組織的破壞。受影響的組織主要是關節，通常以對稱之方式。然而，關節外的疾病亦以兩種主要形式出現。一種形式為關節外病灶隨著進行中的漸進性關節疾病發展，而典型的病灶為肺纖維化、脈管炎和皮膚潰瘍。第二型的關節外疾病是所謂的弗耳提(Felty’s)徵候群，在RA疾病過程中其較晚出現，有時在關節疾病變成靜止的之後，並涉及嗜中性白血球減少症、血小板減少症和脾臟腫大的出現。這可能伴隨著多重器官中的脈管炎，形成梗塞、皮膚潰瘍和壞疽。患者亦經常在覆於受影響關節上的皮下組織中發展出風濕樣結節；該結節晚期具有壞死的中心，周圍被混合的發炎細胞浸潤。其他可能出現在RA中的徵候包括：心包炎(pericarditis)、胸膜炎(pleuritis)、冠狀動脈炎(coronary arteritis)、間質性肺炎(intestitial pneumonitis)帶有肺纖維化、乾性角膜結膜炎(keratoconjunctivitis sicca)和風濕樣結節(rhematoid nodules)。
因此，本發明一方面提供治療及/或預防類風濕性關節炎(RA)的方法。該方法包括對患有RA或正被鑑認/診斷有發展出RA之實際風險的患者，遞送有效量的抗-hNKG2D抗體，而得以治療或預防RA。一方面，在可接受的RA模式中-如在美國專利第6414218號和美國專利公開案第20030005469號中描述的(在例如Wooley,P.H.,關節炎的動物模式(Animal Models of Arthritis),編輯J.H. Klippel和P.A. Dieppe,Mosby Publishers(London),1998；Erning等人,Arthritis Res,4附錄3:S 133-40,2002；Holmdahl等人,Ageing Res Rev,1(1):135-47,2002；Anthony等人,Clin Exp Rheumatol,17(2):240-4,1999；Durie等人,Clin Immunol Immunopatho1,73(1):11-8,1994；以及Muller-Ladner等人,Drugs Today(Bare),35(4-5):379-88,1999中描述了相關的原理和模式)，證實該抗-NKG2D抗體在改善RA上是有效的。另一方面，該抗體能夠以可偵測之方式降低配位體-誘導之表現NKG2D之白血球的NKG2D活化，及/或損害NKG2D+T細胞或NK細胞的擴展(例如損害自動反應性CD8+T細胞的擴展及/或功能)(與例如至少一些在美國專利公開案第20040115198號中描述的抗體相反)，不會明顯地耗盡這類細胞(例如與適當的對照組相比較，引起這類細胞大約10%或更少的降低)。一方面，該方法結果以與治療或預防(按照合適的)RA一致的方式，調整一或多個生物標記(例如血清IL-6、TNF-α、IL-1、VEGF、TIFF R、IL-2R、脫落的CD4、脫落的CD8及/或C反應性蛋白)。另一方面，實行該方法結果在患者/宿主的周圍關節中，可偵測地減少了滑膜發炎。一方面，該方法結果在患者或宿主中阻止了在放射線照片上的惡化並改善物理功能，如藉著例如降低在患者或宿主中在放射線照片上的進行、降低關節的腫脹和觸痛(藉著可接受之分析基準來判定)，及/或明顯地改善生命品質(例如藉著在RA健康評估量表上降低障礙分數來判定)所示。該抗體可單獨或與一或多個其他的抗-RA劑倂用，如非類固醇消炎藥(NSAID)、COX-2抑制劑、止痛劑、皮質類固醇(例如脫氫可的松(predinisone)、氫化可的松(hydrocortisone))、金、免疫抑制劑(例如胺甲碟呤)、B-細胞耗盡劑(例如美羅華(Rituxan))、B-細胞激動劑(例如淋巴靜(LymphoStat-B))和抗-TNFα劑(例如恩博(Embrel)、修美樂(Humira)和瑞米凱德(Remicade))、抗-IL1受體拮抗劑(例如金那瑞(Kineret))、抗-IL-15抗體或疾病修飾性抗風濕藥物(DMARD)。
脫髓鞘疾病
咸相信中樞和周圍神經系統的脫髓鞘疾病，包括多發性硬化症(Multiple Sclerosis，MS)；特發性脫髓鞘性多神經病或基林巴瑞徵候群；以及慢性發炎性脫髓鞘性多神經病(Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy)具有自體免疫基礎，並由於對寡樹突膠質細胞或直接對髓磷脂引起傷害之結果而導致神經脫髓鞘。在MS中，有證據暗示該疾病的誘導和進行依賴T淋巴細胞。MS為T淋巴細胞依賴性的脫髓鞘疾病，並具有復發-緩解之過程或慢性進行性過程。病因學是未知的；然而，病毒感染、遺傳傾向、環境和自體免疫力都有所貢獻。病灶含有主要是由T淋巴細胞介導之小神經膠質細胞(microglial cells)和浸潤性巨噬細胞的浸潤；CD4+T淋巴細胞是在病灶中最具優勢的細胞類型。
因此，在另一方面，本發明提供治療及/或預防MS的方法。該方法包括對患有MS或正被鑑認/診斷有發展出MS之實際風險的人類患者，遞送有效量的抗-hNKG2D抗體，而得以在該患者或宿主中治療或預防MS。在特定的觀點中，該抗-NKG2D單株抗體能夠以可偵測之方式降低配位體-誘導之表現NKG2D之白血球的NKG2D活化，及/或損害NKG2D+T細胞或NK細胞的擴展，不會明顯地耗盡這類細胞。該抗體可單獨或與其他的抗-MS劑倂用，如台薩普(Tyzabri)。
發炎性腸病
在小腸中的CD8+ T細胞中，NKG2D之作用為CD28- 細胞的共同-刺激子(Roberts等人,J Immunol 2001;167:5527-30)。此外，在小腸的發炎反應(乳糜瀉)中，NKG2D被向上調節，並經由NKG2D殺死而刺激腸上皮的淋巴細胞，並產生細胞介素(Hue等人,Immunity 2004;21:367-77;Meresse等人,Immunity 2004;21:357-66)。另外，IL-15(經常在腸發炎反應期間被發現)，在腸上皮淋巴細胞上向上調節NKG2D(Roberts等人,J Immunology 2001;167:5527-30)。而且，在腸發炎反應期間，MICA(NKG2D之配位體)亦被向上調節(Meresse等人，在前，Hue等人，在前)。NKG2D在患有克隆氏症之患者的前-發炎淋巴細胞上亦被向上調節(Allez等人,在第16屆歐洲免疫學會議中提出(ECI2006),2006年9月6-9日;Paris,Frence)。
因此，在另一方面，本發明提供治療及/或預防發炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)-如克隆氏症或潰瘍性結腸炎的方法。如同由Kjellev等人(Eur J Immuno 12008;37:1397-1406)所示，藉著早期抗體治療抑制NKG2D-受體功能，在SCID小鼠-結腸炎之動物模式中減少了轉移-誘導的結腸炎。
治療發炎性腸病的方法包括對患有IBD或正被鑑認/診斷有發展出IBD之實際風險的人類患者，遞送有效量的抗-hNKG2D抗體，而得以在該患者中治療或預防IBD。在特定的觀點中，藉著使用抗-NKG2D單株抗體來實行本發明之IBD治療/預防方法，該單株抗體能夠以可偵測之方式降低配位體-誘導之表現NKG2D之白血球的NKG2D活化，及/或損害NKG2D+T細胞或NK細胞的擴展，不會明顯地耗盡這類細胞。該抗體可單獨或與其他的抗-IBD劑倂用，如含有美沙拉嗪(mesalamine)的藥物(包括柳氮磺吡啶和其他含有5-胺基水楊酸(5-ASA)的製劑，如奧沙拉嗪(olsalazine)和巴柳氮(balsalazide))、非-類固醇消炎藥(NSAIDs)、止痛劑、皮質類固醇(例如脫氫可的松、氫化可的松)、TNF-抑制劑(包括安德利單抗(adilimumab)(修美樂)、依那西普(etanercept)(恩博)和因福利美(infliximab)(瑞米凱德))、抗-IL12抗體、免疫抑制劑(如6-巰基嘌呤、硝基咪唑硫嘌呤和環孢靈A(cyclosporine A))，以及抗生素。
牛皮癬
牛皮癬是T淋巴細胞-介導的發炎性疾病。病灶包含T淋巴細胞、巨噬細胞和加工抗原之細胞，以及一些嗜中性白血球的浸潤。
因此，在另一方面，本發明提供治療及/或預防牛皮癬的方法。該方法包括對患有牛皮癬或正被鑑認/診斷有發展出牛皮癬之實際風險的人類患者，遞送有效量的抗-hNKG2D抗體，而得以在該患者中治療或預防牛皮癬。在更特定的觀點中，該製劑為抗-NKG2D單株抗體，其能夠以可偵測之方式降低配位體-誘導之表現NKG2D之白血球的NKG2D活化，及/或損害NKG2D+T細胞或NK細胞的擴展，不會明顯地耗盡這類細胞。該抗體可單獨或與一或多個其他的抗-牛皮癬治療倂用，如光療法、局部療法(例如焦油、局部的醣類皮質激素)或全身性療法(例如胺甲碟呤、合成的類視色素、環孢靈(cyclosporine))、抗-TNFα劑(例如恩博、修美樂、瑞米凱德)、T-細胞抑制劑(例如雷提瓦(Raptiva))、維生素D類似物、p38促細胞分裂劑-活化的蛋白質激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)抑制劑，以及生物學製劑，如美羅華(Rituxan)。
牛皮癬性關節炎
牛皮癬性關節炎是影響皮膚、關節、肌腱、韌帶和肌膜之插入位置的慢性發炎性關節疾病，且經常與牛皮癬有關。(大約7%患有牛皮癬的患者發展出牛皮癬性關節炎)。許多證據暗示T-細胞-介導的過程驅動牛皮癬性關節炎的病理生理學。單核細胞亦在牛皮癬性關節炎中扮演一角色，並成為產生基質金屬蛋白酶的原因，該酵素可能在患有牛皮癬性關節炎之患者的關節中介導破壞性的改變。此外，亦在受影響的關節中發現NK細胞，暗示其在疾病病理學中的角色。
因此，在另一方面，本發明提供治療及/或預防牛皮癬性關節炎的方法。該方法包括對患有牛皮癬性關節炎或正被鑑認/診斷有發展出牛皮癬性關節炎之實際風險的人類患者，遞送有效量的抗-hNKG2D抗體，而得以在該患者中治療或預防牛皮癬性關節炎。在更特定的觀點中，該製劑為抗-NKG2D單株抗體，其能夠以可偵測之方式降低配位體-誘導之表現NKG2D之白血球的NKG2D活化，及/或損害NKG2D+T細胞或NK細胞的擴展，不會明顯地耗盡這類細胞。該抗體可單獨或與一或多個其他的抗-牛皮癬性關節炎治療併用，如非類固醇消炎藥(阿斯匹靈、布洛芬(ibuprofen))、胺甲碟呤、合成的類視色素、環孢靈、皮質類固醇、抗-TNFα劑(例如恩博、修美樂、瑞米凱德)。
全身性紅斑性狼瘡
在全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)中，疾病的主要介體是對自己的蛋白質/組織產生自身-反應性抗體，並隨後產生免疫-介導的發炎反應。抗體直接或間接介導組織傷害。雖然並未顯示T淋巴細胞直接涉及組織損傷，但T淋巴細胞為發展自身-反應性抗體所必要的。因此，疾病的發生為T淋巴細胞依賴性的。在臨床上受到影響的多個器官和系統包括腎臟、肺、肌肉骨骼系統、黏膜皮膚、眼睛、中樞神經系統、心血管系統、胃腸道、骨髓和血液。
因此，在另一方面，本發明提供治療及/或預防SLE的方法。該方法包括對患有SLE或正被鑑認/診斷有發展出SLE之實際風險的人類患者，遞送有效量的抗-hNKG2D抗體，而得以在該患者中治療或預防SLE。在更特定的觀點中，該製劑為抗-NKG2D單株抗體，其能夠以可偵測之方式降低配位體-誘導之表現NKG2D之白血球的NKG2D活化，及/或損害NKG2D+T細胞或NK細胞的擴展，不會明顯地耗盡這類細胞。該抗體可單獨或與其他的抗-SLE劑倂用，如非類固醇消炎藥(NSAIDs)、止痛劑、皮質類固醇(例如脫氫可的松(predinisone)、氫化可的松(hydrocortisone))、免疫抑制劑(例如環磷醯胺、硝基咪唑硫嘌呤(azathioprine)和胺甲碟呤(methotrexate))、抗瘧藥(如羥氯喹(hydroxychloroquine))，以及抑制dsDNA抗體產生的生物學藥物(例如LIP 394)。
糖尿病
第I型糖尿病或胰島素-依賴性糖尿病是胰島B細胞的自體免疫破壞；該破壞係由自身-抗體和自身-反應性T細胞介導。對胰島素或胰島素受體的抗體亦可能產生胰島素-無-反應的表現型。
因此，在另一方面，對患有或有發展出第I型糖尿病之實際風險的患者，以足以在該患者中治療或預防該疾病的量和條件下遞送抗-NKG2D抗體。該抗體可單獨或與其他的抗-糖尿病劑倂用，如胰島素，或β細胞生長或存活因子，或免疫調節抗體，如抗-CD3抗體。
移植
與移植有關的疾病，包括移植排斥和移植-對-宿主- 疾病(Graft-Versus-Host-Disease，GVHD)，是T淋巴細胞依賴性的；抑制T淋巴細胞功能是有改善的。
因此，在另一方面，本發明提供降低移植排斥之可能性(或降低嚴重性或延長移植排斥-相關狀況開始的時間，即延長同種移植物的存活)的方法。該方法包括對正要做，或最近是組織/器官移植之接受者的人類患者，遞送有效量的抗-hNKG2D抗體，而得以以可偵測之方式降低排斥的可能性(例如與對照組相比較)。在特定的觀點中，該抗-NKG2D抗體能夠以可偵測之方式降低配位體-誘導之表現NKG2D之白血球的NKG2D活化，及/或損害NKG2D+T細胞或NK細胞的擴展，不會明顯地耗盡這類細胞。可處理之組織移植的實例包括，但不限於肝臟、肺、腎臟、心臟、小腸和胰島細胞，還有在骨髓-移植中，以及在移植對宿主疾病(GVHD)的治療上。該抗體可單獨或與其他抑制移植排斥之製劑倂用，如免疫抑制劑(例如環孢靈、硝基咪唑硫嘌呤、甲基脫氫皮甾醇(methylprednisolone)、脫氫皮甾醇(prednisolone)、脫氫可的松(prednisone)、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)、西樂里莫(sirilimus)、雷帕黴素(rapamycin)、他克羅林(tacrolimus))、抗-感染劑(例如阿昔洛韋(acyclovir)、克黴唑(clotrimazole)、更昔洛韋(ganciclovir)、制黴菌素(nystatin)、甲氧苄啶磺胺甲唑(trimethoprim sulfamethoxazole))、利尿劑(例如布美他尼(bumetanide)、呋塞米furosemide)、美扎拉宗(metolazone))和潰瘍藥(例如西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁(famotidine)、蘭索拉唑(lansoprazole)、奧美拉唑(omepreazole)、雷尼替丁(ranitidine)、硫糖鋁(sucralfate))。至於造血移植，可投予造血生長因子(們)(例如紅血球生成素、G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-11、血小板生成素等等)，或抗微生物劑(們)(例如抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑)作為輔助療法。
其他的自體免疫或發炎性疾病
在其他不同的觀點中，本發明提供治療及/或預防其他自體免疫或發炎性疾病或病症的方法，包括對患有該疾病或病症或正被鑑認/診斷有發展出該疾病或病症之實際風險的人類患者，遞送有效量的抗-hNKG2D抗體，而得以在該患者中治療或預防它，其中該疾病或病症為下述之一。在更特定的觀點中，該製劑為抗-NKG2D單株抗體，其能夠以可偵測之方式降低配位體-誘導之表現NKG2D之白血球的NKG2D活化，及/或損害NKG2D+ T細胞或NK細胞的擴展，不會明顯地耗盡這類細胞。該抗體可單獨或與一或多個其他用以治療該疾病或病症之治療劑併用。
幼年型慢性關節炎是慢性特發性發炎性疾病，其經常在小於16歲時發病。其表現型與RA有些類似；將一些類風濕因子陽性的患者分類為幼年型類風濕性關節炎。亦將該疾病細分成三大類：少關節的、多關節的和全身性的。關節炎可能是嚴重的，且典型地是破壞性的，並導致關節黏連和遲滯性生長。其他的症狀可包括慢性前葡萄膜炎和全身性澱粉樣變性。
脊椎關節病是一群具有一些共同臨床特徵並與表現HLA-B27基因產物有共同關聯的病症。該病症包括：強直性脊椎炎(ankylosing sponylitis)、瑞特氏徵候群(Reiter’s syndrome)(反應性關節炎)、與發炎性腸病有關之關節炎、與牛皮癬有關之脊椎炎、幼年開始的脊椎關節病和未分型的脊椎關節病。區別特徵包括骶骼關節炎，有或無脊椎炎；發炎性不對稱的關節炎；與HLA-B27(經血清學定義的第I類MHC之HLA-B位點的對偶基因)有關；眼睛的發炎反應，但缺少與其他類風濕疾病有關之自身抗體。涉及作為誘導該疾病之關鍵的細胞主要是CD8+ T淋巴細胞，一種靶定由第I類MHC分子提交之抗原的細胞。CD8+ T細胞可對第I類MHC對偶基因HLA B27起反應，彷彿它是由MHC第I類分子表現的外來肽。已經假設HLA-B27之抗原決定基可模仿細菌或其他微生物抗原的抗原決定基，並因此誘導CD8+ T細胞反應。
全身性硬化症(systemic sclerosis)(硬皮病(scleroderma))有未知的病因學。該疾病的特徵是皮膚的硬化；這可能是由活躍的發炎過程所引起。硬皮病可能是經局限化或全身性的；脈管病灶是共有的，而在微脈管系統中的內皮細胞傷害則是在全身性硬化症發展中的早期和重要事件；脈管傷害可能是經免疫介導的。藉著在皮膚病灶中出現單核細胞浸潤，並在許多患者中出現抗-核抗體，暗示免疫學基礎。在皮膚病灶中，在纖維母細胞之細胞表面上的ICAM-1經常未經調節，暗示T細胞與這些細胞交互作用，可能在該疾病之發病原理上有某種角色。其他涉及之器官包括：胃腸道：平滑肌萎縮和纖維化，導致異常的蠕動/運動性；腎臟：同心的內皮下血管內膜增殖，影響小弓狀和小葉間動脈，結果降低了腎皮質血流，導致蛋白尿、氮血症和高血壓；骨骼肌：萎縮、間質性纖維化；發炎反應；肺：間質性肺炎和間質性纖維化；以及心臟：收縮帶壞死、結痂/纖維化。
特發性發炎性肌病包括皮肌炎(dermatomyositis)、多肌炎(polymyositis)及其他，是未知病因的慢性肌肉發炎反應之病症，結果導致肌肉衰弱。肌肉傷害/發炎反應經常是對稱和進行性的。自身抗體與大多數類型有關。這些肌炎-專一的自身抗體針對並抑制涉及蛋白質合成之補體、蛋白質和RNA’s的功能。
薛格連氏徵候群係歸因於免疫-介導的發炎反應，且後續有淚腺和唾液腺的功能破壞。該疾病可能結合或伴隨有發炎性結締組織疾病。該疾病與產生對抗Ro和La抗原之自身抗體有關，這兩種抗原均為小型RNA-蛋白質複合體。病灶結果導致乾性角膜結膜炎(keratoconjunctivitis sicca)、口乾症(xerostomia)，其他症狀或關聯包括膽汁性肝硬化(bilary cirrhosis)、周圍或感覺神經病，以及可觸診的紫斑。
全身性脈管炎是其中主要病灶為發炎反應，而後續傷害到血管的疾病，其結果導致由受影響血管供應之組織的局部缺血/壞死/變性，並在一些情況下，結果是末端-器官功能障礙。亦可能出現全身性脈管炎，為其他免疫-發炎性介導疾病，如類風濕性關節炎、全身性硬化症等等的繼發性病灶或結局，特別是在亦與形成免疫複合體有關的疾病中。在原發性全身性脈管炎族群中的疾病，包括：全身性壞死性脈管炎(systemic necrotizing vasculitis)：結節性多動脈炎(polyarteritis nodosa)、過敏性血管炎(allergic angiitis)和肉芽腫病(granulomatosis)、多血管炎(polyangiitis)；韋格納氏肉芽腫病(Wegener’s granulomatosis)；淋巴瘤樣肉芽腫病(lymphomatoid granulomatosis)；和巨細胞動脈炎(giant cell arteritis)。混雜型脈管炎包括：黏膜皮膚淋巴結徵候群(mucocutaneous lymph node syndrome，MLNS或川崎氏症(Kawasaki’s disease))、孤立性CNS脈管炎(isolated CNS vasculitis)、貝西氏病(Behet’s disease)、血栓閉塞性血管炎(thromboangiitis obliterans)(伯格氏病(Buerger’s disease))和皮膚壞死性細膽管炎(cutaneous necrotizing venulitis)。咸相信大多數所列舉之脈管炎類型的致病機轉主要是因為免疫球蛋白複合體沉積在血管壁中，隨後經由ADCC、補體活化或兩者而引起發炎反應。
類肉瘤是未知病因學的病症，其特徵在於在身體幾乎任何組織中出現上皮樣肉芽腫；涉及肺臟的是最常見的。發病原理涉及經活化之巨噬細胞和淋巴樣細胞久存於疾病位置，而後續的慢性結局是由於這些細胞類型釋放出具有局部或系統活性之產物的結果。
自體免疫溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)包括自體免疫溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)、免疫全血細胞減少(immune pancytopenia)和陣發性夜間血紅蛋白尿(paroxysmal noctural hemoglobinuria)，是產生與在紅血球(而在一些情況下，還有其他的血液細胞，包括血小板)之表面上表現的抗原反應之抗體的結果，並為經由補體介導之溶解及/或ADCC/Fc-受體-介導之機制移除這些抗體包覆之細胞的反映。
在自體免疫血小板減少症(autoimmune thrombocytopenia)中，包括血小板減少性紫斑(thrombocytopenic purpura)，以及在其他臨床背景中的免疫-介導之血小板減少症，因為抗體或補體附著於血小板上，隨後藉著補體溶解、ADCC或Fc-受體介導之機制將其移除，結果出現血小板的破壞/移除。
甲狀腺炎包括葛瑞夫茲病(Grave’s disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、幼年型淋巴細胞性甲狀腺炎(juvenile lymphocytic thyroiditis)和萎縮性甲狀腺炎(atrophic thyroiditis)，是自體免疫反應利用產生與出現在甲狀腺上之蛋白質反應且經常對其專一的抗體，對抗甲狀腺抗原的結果。現存的實驗模式包括：自發的模式：大鼠(BUF和BB大鼠)和雞(肥胖雞品系)；可誘導模式：以甲狀腺球蛋白、甲狀腺微粒體抗原(甲狀腺過氧化酶)免疫動物。
免疫介導之腎病，包括腎小球性腎炎(glomerulonephritis)和腎小管間質性腎炎(thbulointerstitial nephritis)，是抗體或T淋巴細胞介導之傷害腎組織的結果，直接由於產生對抗腎臟抗原的自身反應性抗體或T細胞，或間接由於對其他、非腎臟抗原有反應性之抗體及/或免疫複合體沉降在腎臟中的結果。因此，其他導致形成免疫-複合體的免疫-介導疾病，亦可引起免疫介導之腎病，成為間接的結局。直接或間接的免疫機制結果產生發炎反應，其產生/誘導病灶在腎臟組織中發展，結果損害器官功能，且在某些情況下，進行至腎衰竭。體液和細胞免疫機制均可能涉及該病灶的致病原理。
發炎性和纖維化肺病，包括嗜曙紅細胞性肺炎(Eosinophilic Pneumonias)、特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis)和過敏性肺炎(hypersensitivity pneumonitis)，可能涉及免疫-發炎性反應的調節障礙。抑制該反應會具有治療益處。
自體免疫或免疫-介導之皮膚病，包括大疱性皮膚病(bullous skin diseases)、多形紅斑(erythema multiforme)和接觸性皮膚炎(contact dermatitis)，是由自身抗體介導的，其發生是T淋巴細胞依賴性的。
過敏性疾病，包括氣喘；過敏性鼻炎；異位性皮膚炎；食物過敏；以及蕁麻疹，是T淋巴細胞依賴性的。主要是由T淋巴細胞誘導之發炎反應、IgE介導之-發炎反應或兩者之組合介導這些疾病。
其他適合利用人類抗-NKG2D抗體來治療之疾病為病毒性肝炎，如在WO2007130642中和由Chen等人(Hepatology,第46(3)冊第706-715頁(2007))中所示。
應瞭解有效量的NKG2D調節子，以及全面給藥攝生法，可視疾病和患者的臨床狀態而改變，其轉而可被反映在一或多個臨床參數上，如在臨床上可接受的疾病分數。例如，關於類風濕性關節炎，可藉著監視腫脹關節的數目；疼痛；移動性；及/或正式疾病分數ACR20/50或70，評估疾病的嚴重性及/或治療的成果。對於第1型糖尿病，可藉著測量血糖值或其變異、HbIC值、所需之胰島素的量，以及類似者，評估疾病的嚴重性及/或治療的成果。關於多發性硬化症，可經由掃描腦部評估腦的發炎反應。關於造血移植排斥，可藉著在已經經歷清髓性調理之患者中延長嗜中性白血球減少、血小板減少和紅血球輸血依賴性的證據，並藉著在已經經歷非清髓性調理之患者中無法觀察到嵌合現象，評估疾病的嚴重性(移植失敗)及/或治療的成果。通常，使用本發明之方法和組合物，對治療成果的可偵測影響包括降低對其他治療的需求(包括，例如減少其他藥物或治療的量及/或期間)、降低住院的次數及/或期間、降低因為生病而喪失的工作天數，以及類似者。會更瞭解該有效量可由熟諳此藝者，藉著例行的實驗、藉著建立數值的矩陣，並測試在矩陣中不同的點來決定。
劑量
關於抗體的投藥，劑量範圍從大約0.0001到100毫克/公斤，且更常是0.01到5毫克/公斤之宿主體重。例如，劑量可以是大約0.3毫克/公斤體重、大約1毫克/公斤體重、大約3毫克/公斤體重、大約5毫克/公斤體重或大約10毫克/公斤體重，或在1-10毫克/公斤的範圍內。典型的治療攝生法需要每週投藥兩次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每個月一次、每3個月一次，或每3到6個月一次。對本發明之抗-hNKG2D抗體而言，較佳的給藥攝生法包括大約1、3或10毫克/公斤體重，經由靜脈內投藥或皮下注射，使用以下的給藥計畫之一來給予該抗體：(i)每1-3週裝載劑量，2-4次給藥，然後每隔2個月；(ii)每隔4週；(iii)每週，或任何其他適當的給藥。在某些方法中，同時投予二或多個具有不同結合專一性的單株抗體，其中每個抗體投藥的劑量均落在指定之範圍內。通常多次投予抗體。在單一劑量之間的間隔，可以是例如每週、每月、每三個月或每年。間隔也可以是不規則的，並根據藉著測量在患者中對目標抗原之抗體的血液含量來指示。在某些方法中，調整劑量以達到大約1-1000微克/毫升的血漿抗體濃度，而在某些方法中，大約25-300微克/毫升。或者，可以持續釋放調配物之形式投予抗體，其中需要較低頻率的投藥。可視抗體在患者中的半衰期改變劑量和頻率。通常，人類抗體顯示出最長的半衰期，接著是經人類化的抗體、嵌合型抗體和非人類抗體。可視該治療是否為預防性或非-預防性(例如減輕的或治病的)，來改變投藥的劑量和頻率。在預防性應用中，在一段長時間內以相對較稀少的間隔投予相對較低的劑量。有些患者在其剩餘的生命中持續接受治療。在減輕或治病應用中，有時需要以相對較短之間隔投予相對較高的劑量，直到使疾病之進行減低或終止為止，且較佳的是直到患者顯示疾病症狀的部分或全部改善為止。然後，可對患者投予預防性攝生法。
消炎藥的適當劑量會接近在臨床療法中業已使用者，其中單獨或與其他製劑混合投予該消炎藥。可能會視待治療之疾病出現劑量上的改變。投予治療的醫師能夠決定不同個體的適當劑量。
製造物件
在本發明另一具體事實中，提供含有用以治療上述病症之材料的製造物件。例如，製造物件可包括含有如本文描述之人類或經人類化之抗-hNKG2D抗體的容器，連同指導使用者的說明書，以便以有效量的抗體治療人類之病症，如自體免疫或發炎性疾病或病症。製造物件典型地包括容器和插在容器上或與其結合的標示或包裝。適當的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射筒等等。可由各種材料形成該容器，如玻璃或塑料。容器裝有對治療疾病是有效的組合物，並可能有無菌的進出孔(例如該容器可以是靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿之塞子的小瓶)。在該組合物中至少有一個活性劑是本文之人類或經人類化的抗-hNKG2D抗體，或這類抗體所包括之抗原-結合片段或抗體衍生物(例如免疫共軛物)。標示或包裝插入物指示該組合物係用以治療選擇的疾病，像是例如類風濕性關節炎。
此外，製造物件可包括(a)其中含有組合物的第一個容器，其中該組合物包括本文之人類或經人類化的抗體，和(b)其中含有組合物的第二個容器，其中該組合物包括該人類或經人類化之抗體以外的治療劑。在本發明之具體事實中，製造物件更可包括包裝插入物，其指示可混合使用第一和第二個組合物，以治療自體免疫或發炎性疾病或病症。這類治療劑可以是任何在先前段落中描述的輔助療法。選擇性地或另外，製造物件更可包括第二(或第三)個容器，其包括在藥學上可接受之緩衝溶液，如抑菌的注射用水(BWFI)、磷酸-緩衝之生理鹽水、林格氏液和右旋糖溶液。其更可包含其他就商業和使用者觀點想要的材料，包括其他的緩衝溶液、稀釋劑、濾紙、針頭和注射筒。
實施例
藉著以下非限制性實施例解釋本發明的更多細節。
實施例1：對抗hNKG2D之人類單株抗體的產製和初步篩選
材料和方法
抗原。使用在細胞(NK、BAF或CHO)表面上表現可溶性NKG2D-hFc融合蛋白(R&D,目錄：1299-NK)或NKG2D者，作為免疫用的抗原。以全長NKG2D和DAP10共同轉染BAF細胞。以NKG2D點突變種(其運送至細胞表面，沒有DAP10)轉染CHO細胞(Wu等人,Science 1999;385:730-2)。NK細胞是天然表現NKG2D的原始NK細胞。
小鼠。在表現人類抗體基因之基因轉殖小鼠的KM小鼠TM 品系(Ishida等人的PCT公開案WO02/43478)中生產對抗NKG2D的完整人類單株抗體。在該小鼠品系中，按照在Chen等人(1993)EMBO J. 12:811-820中的描述，已經以同種接合子之方式瓦解內源的κ輕鏈基因，並按照在PCT公開案WO01/09187之實施例1中關於Humab小鼠的描述，已經以同種接合子之方式瓦解內源的小鼠重鏈。該小鼠品系帶有人類κ輕鏈轉殖基因KC05，如同在Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851中的描述。該小鼠品系亦帶有人類重鏈轉殖染色體SC20，如同在WO0243478中的描述。
免疫。在第一組免疫中，以腹腔內交替注射經NKG2D轉染之BAF細胞和經NKG2D轉染之CHO細胞，或有或無任何佐劑之原始人類NK細胞來免疫動物。每週或每隔一週(總共6次)，以5x106 個細胞IP免疫每隻小鼠。在犧牲並移出脾臟之前3和2天，以5x106 個經NKG2D轉染之BAF細胞靜脈內補強鼠類。所有的動物實驗均根據Danish National Research Council指導方針進行。
在第二組免疫中，以具有不同佐劑之NKG2D-hFc，腹腔內或以足部路徑免疫動物。以7x25微克NKG2D-hFc/Ribi/腹腔內/皮下、1x25微克NKG2D-hFc/CFA/腹腔內/皮下、1x25微克NKG2D-hFc/IFA/腹腔內/皮下、1x30微克抗-CTLA4+40微克NKG2D-hFc/IFA/腹腔內/皮下、1x25微克NKG2D-hFc/Ribi/腹腔內/皮下免疫每隻小鼠，並在犧牲和移出脾臟之前3和2天以2x30微克/PBS/腹腔內/靜脈內補強。所有的動物實驗均根據American National Research Council指導方針進行。
小鼠血清的篩選。藉著流動式細胞測量術分析，針對NKG2D-專一性篩選得自經免疫鼠類的血清，亦測試經選出之血清其等中和MICA配位體結合的能力，如同在實施例3中的描述。選出已經產生高力價抗體(其專一地結合NKG2D並中和MICA結合)的小鼠，進行融合瘤產生。
融合瘤的產製。將得自每隻所選出之經免疫小鼠的脾臟均質化，並使用脾臟細胞之單細胞懸浮液與X61 Ag8653骨髓瘤細胞(ATCC,CRL1580)融合。按照先前的描述，使用聚乙二醇(PEG)1500進行融合(Harlow和Lane,抗體：實驗室手冊(ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988))，並使用The Cyto PulseTM CEEF-50電融合系統(Cyto Pulse Sciences,Inc.)進行電融合。
一開始將經融合之細胞播種在96-孔組織培養盤中，補充10% FBS和5%起點(融合瘤選殖因子，BioVeris)之選擇性DMEM HAT培養基中。在收穫和篩選上清液之前，培養該盤10-14天，以補充5% FBS和0.7%起點之DMEM HT培養基分別更換1-2次培養基。擴大測試為陽性的純種系，並藉著限制稀釋繼代選殖，直到已經產製出穩定的純種系為止。藉著FACS分析針對抗-NKG2D專一性抗體的存在，並就其等中和MICA結合的能力，持續篩選所選擇的純種系。
融合瘤上清液的篩選。使用直接ELISA或流動式細胞測量術分析(FACS)進行得自第一組免疫之融合瘤上清液的初步篩選，以測試抗-NKG2D專一性抗體的存在。簡言之，藉著在4℃下在PBS中，以50微升0.4微克/毫升mFc-NKG2D(包括與鼠類Fc融合並在CHO細胞中表現的NKG2D之細胞外部分)塗覆最大吸收(maxisorp)培養盤隔夜，接著在室溫下以PBS、0.05%吐溫20阻斷15分鐘，進行ELISA。隨後將該盤與50微升融合瘤上清液一起培養，並使用山羊-抗-人類IgG-HRP Fcγ片段專一的(Jackson,109-036-098)偵測NKG2D-專一性抗體。在室溫下進行這些培養1小時，並在每個步驟之間以PBS、0.05%吐溫20沖洗培養盤。使用100微升TMB受質(Kem-En-Tec)使經結合之抗體顯色，並以4M H3 PO4 中止。在450和620奈米處讀取培養盤。關於FACS，藉著在4℃下，將在10微升中的50000個細胞與90微升融合瘤上清液一起培養30分鐘，接著以帶有2% FCS的PBS沖洗，隨後與二級山羊-抗-人類IgG-HRP Fcγ片段專一的(Jackson,109-036-098)一起培養，分析與表現NKG2D之BaF/3細胞和不表現NKG2D之對照組BaF/3細胞的結合。然後在B&D FACSArray(BD Biosciences)上分析細胞。認為僅染色表現NKG2D之BaF/3細胞，但不染色對照組細胞的抗體是NKG2D-專一的。
對第二組免疫的初步篩選是直接ELISA，以測試抗-NKG2D專一性抗體的存在。簡言之，藉著在4℃下在PBS中，以1-2毫克/毫升hFc-NKG2D(R&D Systems)塗覆最大吸收(maxisorp)培養盤隔夜，接著在室溫下以PBS、0.05%吐溫20、5%雞血清阻斷30-60分鐘，進行ELISA。隨後將該盤與50微升融合瘤上清液和50微升阻斷緩衝溶液一起培養，並使用在阻斷緩衝溶液中之抗-人類IgG-HRP(Bethyl,A80-115P)偵測NKG2D-專一性抗體。在室溫下進行這些培養1小時，並在每個步驟之間以PBS、0.05%吐溫20沖洗培養盤。使用ABTS受質(Moss Inc.產品：ABTS-1000)使經結合之抗體顯色。利用Molecular Devices軟體在415奈米處讀取培養盤。
使從ELISA初步篩選中選出的融合瘤接受二次篩選，使用FACS，按照上述。
使用市售的鼠類抗體(149810和ON72)作為對照組。
結果
藉著NKG2D-結合和配位體阻斷能力(在圖1A和1B中出示典型結果)，鑑認得自經免疫小鼠的高選擇性血清，並使用所選出之小鼠來進行融合和融合瘤產製。藉著ELISA和流動式細胞測量術篩選大約2500個融合瘤，並鑑認NKG2D-專一的純種系。圖2顯示在融合瘤上清液中，與表現NKG2D之細胞結合但不與NKG2D-陰性細胞結合的人類抗體，與市售抗體(149810)做比較。選擇得自三個融合瘤-來自第一組免疫的抗體(16F16、16F31和21F2)，以及數個得自第二組免疫的抗體(包括MS)，進行重組生產並進一步測試。
實施例2：重組生產和定序
從不同回合的免疫(們)中，獲得第二批得自表現人類抗體之融合小鼠脾臟的數百個融合瘤。使用FACS，以與在實施例1中之描述相同的方式，就NKG2D-專一性篩選這些融合瘤。選擇得自一融合瘤的抗體，MS，進行重組生產並進一步測試。
藉著PCR鑑認抗體之重和輕鏈的可變區，並隨後定序得自融合瘤之mRNA的經分離產物。
材料和方法
RNA純化。使用得自Qiagen的RNeasy，根據製造者的說明，除了從程序中省略β-硫氫乙醇之外，純化總RNA。藉著光譜分析(260/280奈米，1.8<比例<2.0)檢查RNA的質，並偶爾使用生物分析器評估RNA降解。
RT-PCR。藉著SMART-RACE(得自Clonetech的套組)合成全長cDNA。
PCR。利用得自Clonetech的HFII聚合酶進行PCR。在SMART-RACE期間導入與經保留序列黏接的5’引子(利用EcoRI)。設計兩個3’引子，分別與IgG(VH)和κ鏈(VL)的經保留區黏接。在3’引子中亦出現限制位置(BsiWI(VL)和NheI(VH))。對於所有的VH和VL擴大，以一式兩份進行PCR(以檢查PCR導入的突變)。若PCT反應失敗，便使用得自Novagen的簡倂5’引子混合物擴大VL和VH。
PCR產物純化。在1%瓊脂糖凝膠上分離PCR產物(約550個鹼基對)，切開，在GFX管柱(得自Amersham)上純化，並以不含DNA酶的水沖提。
連接。利用適當的限制酵素(VH，EcoRI+NheI和VL，EcoRI+BsiWI)切開PCR產物和表現載體(氨苄青黴素抗藥性)。藉著T4-連接酶(Roche)催化，將可變功能部位連接到指定同型物之載體(NKG2D為IgG4)內。所使用之質體為pTT5(Durocher等人,Nucleic Acids Res 2002;30(2):e9；Pham等人,Biotechnol Bioeng 2003;84(3):332-42)。
檢查在表現載體中的插入(菌落PCR)。以連接混合物轉型勝任的大腸桿菌(Top10)，並隔夜選擇氨苄青黴素抗藥性的純種系。總共替VH和VL挑選出8個陽性菌落。經由菌落PCR和凝膠電泳(1%瓊脂糖)，針對符合預期大小之插入物，檢查所有的菌落。
定序/迷你製備。為了定序，製備來自所有陽性菌落PCRs的等份(使用ExoSAPit)。總計對每個純種系定序32個PCR產物((8*VH+8*VL)*2(PCR一式兩份))。分析序列(使用VectorNTI)，並按比例擴大符合經選殖VH和VL的陽性細菌純種系(迷你/最大製備)，並為了HEK293/6E轉染純化DNA(GFX管柱)。若鑑認一個以上的VH和VL序列，則在HEK293/6E細胞中表現所有可能的VH和VL組合。
重組生產。將經鑑認之重和輕鏈的可變區分別插入重和輕鏈人類IgG4架構內，並以高水準從兩個在HEK293細胞中的載體中表現。在蛋白質A管柱上純化該抗體。
在HEK293/6E細胞中表現抗體。在得自Gibco的自由型(Free-style)293培養基中繼代H EK293細胞。在轉染那天，將細胞稀釋成1百萬個細胞/毫升之濃度。關於30毫升轉染，將15微克重-鏈載體和15微克輕鏈載體與2毫升Opti-MEM和40微升293轉染劑(fectin)混合(此時自由型293培養基之總體積為30毫升)。在培養6天之後，藉著離心使細胞成為小球(1000rpm，10分鐘)，並收穫上清液以進行蛋白質A純化。
純化。在MabSelectTM SuRe蛋白質-A管柱上純化經重組表現的人類抗體之IgG4變體。在將抗體施用在管柱上之後，以10倍管柱體積之PBS緩衝溶液沖洗該管柱，並以100mM甘胺酸、100mM NaCl緩衝溶液，pH3.0沖提該抗體，接著將緩衝溶液換成PBS緩衝溶液，使用HighTrapTM 脫鹽管柱。藉著得自GE Healthcare Amersham Biosciences AB的Aktaxpress系統控制所有的操作。
經純化之抗體的典型濃度範圍是從10-130毫克/公升(0.3-3.3毫克/30毫升)。
結果
分別在SEQ ID NO:3-6中陳述編碼16F16(IgG4)H鏈、16F16L鏈、16F31(IgG4)H鏈和16F31L鏈的cDNA序列，並在表1中陳述16F16(IgG4)、16F31(IgG4)、MS(IgG4)和21F2(IgG4)之全長、可變和CDR胺基酸序列的個別序列鑑認子(identifier)。圖4顯示16F16、16F31、MS和21F2IgG4同型物的胺基酸序列，強調可變的(粗體)和CDR(粗體下標線)區。
使用適合IgH接合組合物的JointMLc演算法，和在Ohm-Laursen等人(Immunology 2006;119:265-77)中描述的D-分類法，替16F16和16F31鑑認出下列的可變區之生殖種系序列：
16F16VH：VH3_21/D3-9/JH4(分別為SEQ ID NO:31/32/33)
16F16VL：VKI_L15/JK2(分別為SEQ ID NO:34/35)
16F31 VH:VH3_20/D3-10/JH6(分別為 SEQ ID NO:36/(EL)/37)
16F31VL：VKⅢ_A27/JK3(分別為SEQ ID NO:38/39)
MS VH:VH4_59/D3_27_R3/JH3(分別為SEQ ID NO:64/(NWG)/65)
MS VL:VKⅢ_A27/JK1(分別為SEQ ID NO:38/66)
21F2 VH：VH5_51/D3_10_R3/JH4(分別為SEQ ID NO:67/68/33)
21F2 VL：VKⅢ_L6/JK1(分別為SEQ ID NO:69/66)
將VH和VL序列與相對應之經重組生殖種系序列(SEQ ID NO:27-30分別相當於經重組的VH3_21/D3-9/JH4、VK I_L15/JK2、VH3_20/D3_10/JH6和VKⅢ_A27/JK3，而SEQ ID NO:60-63分別相當於經重組的VH4_59/D7_27_3/JH3、VKⅢ_A27/JK1、VH5_51/D3_10_R3/JH4和VKⅢ_L6/JK1)排成一直線，指出體細胞的高度突變，在圖5A_5H中出示。
實施例3:MICA阻斷性實驗
材料和方法
流動式細胞測量術測定-MICA阻斷。為了分析配位體結合的阻斷，在16℃下以100微升總量(帶有2%FBS之PBS，pH 7.4)，將50000個表現NKG2D/DAP10的BaF/3細胞與各種含量的融合瘤上清液或經純化之抗體一起培養1小時，接著在4℃下與mFc_MICA(適合人類抗體)或hFc_MICA(適合ON72)(1微克)一起培養30分鐘。隨後沖洗細胞，並加入二級山羊-抗-小鼠IgG-HRP Fcγ片段專一的，Jackson(109-036-151)，來偵測MICA-mFc結合。然後在B&D FACSArray流式細胞儀上分析該細胞。按照有預-培養之結合的MFI(平均螢光強度)佔無預-培養之MICA結合的%，來分析藉著預培養降低MICA結合的程度。
亦可完成更詳細的劑量-反應曲線，分析50%抑制(IC50)和完全阻斷1微克MICA-mFc結合所需之經重組表現並純化之抗體的濃度。
結果
就其等阻斷配位體結合的能力來分析抗體。圖6證實與融合瘤上清液的預-培養，實際上阻斷了配位體MICA的所有結合。使用經重組表現之抗體完成劑量-反應曲線，證實MICA-mFc(1微克)結合的IC50和完全阻斷NKG2D之飽和劑量，在0.017和0.2nM 16F16和在0.16和0.7nM 16F31(圖7)。ON72的相對應結果，1微克MICA-Fc的IC50和完全阻斷分別是0.02和0.24nM。在下文表2中出示詳細的結果。MS和21F2的IC50是最低的，分別為0.0016nM和0.0048nM。
實施例4：與鼠類抗體競爭
材料和方法
流動式細胞測量術測定-與鼠類抗體競爭。為了分析市售之鼠類抗-hNKG2D抗體的阻斷，在16℃下以100微升終體積(帶有2%FBS之PBS，pH7.4)，將50000個表現NKG2D之細胞與融合瘤上清液或經純化並重組表現之抗體(以0.3微克或按照指示)一起培養1小時，接著在4℃下與鼠類抗-hNKG2D抗體(ON72、149810、1D11或5C6(關於1D11和5C6，參見，例如Bauer等人,Science 1999;285:727-9和WO02068615)；以0.3微克或按照指示)一起培養30分鐘。隨後沖洗細胞，並加入二級山羊-抗-小鼠IgG-HRP Fcγ片段專一的，Jackson(109-036-151)，來偵測鼠類抗體的結合。在B&D FACSArray上分析細胞。亦藉著與鼠類抗體預-培養，接著是融合瘤上清液或經純化之人類抗體來執行該方案，使用二級山羊-抗-人類IgG-HRP Fcγ片段專一的，Jackson(109-036-098)以進行偵測。按照有預-培養之結合的MFI佔無預-培養之結合的%，來分析藉著預培養降低結合的程度。
結果
細胞與融合瘤上清液的預-培養，接著與ON72培養，證實阻斷了95%的ON72-結合(圖8)。利用經重組表現之16F16抗體進行相同類型的測定，證實16F16阻斷了95%的ON72結合，而利用ON72的預-培養僅阻斷了62%後續的16F16結合(圖9A)。同樣的，對於149810和16F16，藉任一抗體僅觀察到大約50%阻斷，不管培養的順序或相對抗體濃度(圖9A)。至於其他可利用的鼠類抗-hNKG2D抗體，在表2中出現交叉抑制，證實藉著1D11和5C6幾乎完全阻斷ON72，而149810則大約為85%。以經重組表現之MS進行相同類型的測定，證實利用MS的預-培養抑制了98%的ON72-結合、88%的1D11-結合和96.5%的149810-結合(圖9B)。
實施例5：利用猴子NKG2D的血液細胞結合和交叉-反應性
材料和方法
流動式細胞測量術測定-人類和猴子PBMC。從人類或從食蟹獼猴或恆河猴中分離周圍血液單核細胞(PBMCs)。所有的動物研究均根據Danish National Research Council指導方針進行。以針對不同細胞亞組(NK、CD8+、CD4+和γδT細胞)以及NKG2D的標記，利用ON72或經重組表現和純化的16F16標示每個PBMC試樣。沖洗細胞，並在BDFACSDiva(BD Biosource)上分析以兩個抗體對細胞亞組之NKG2D的染色。替每個抗體計算染色的MFI。
在分開的實驗中，藉著將全劑量範圍的MS或21F2加入，接著以抗-人類IgG4抗體偵測，來測試MS和21F2對得自健康志願者或食蟹獼猴之PBMC製劑和全血兩者的結合，並計算EC50值。簡言之，在4℃下與抗體一起培養30分鐘，接著沖洗，然後加入經直接標示之二級抗-hIgG4抗體，並在4℃下連同對各種感興趣之細胞族群(CD8、CD4、NK和γδ-T細胞)專一的抗體一起培養30分鐘，然後以帶有2%FCS的PBS沖洗細胞兩次，並溶解紅血球。然後藉著流動式細胞測量術分析細胞，並評估對不同細胞族群的結合。
結果
在圖10A-10D中出示16F16和ON72的結果。在食蟹獼猴或恆河猴PBMC’s中，所有的NK和CD8+T細胞均為NKG2D染色陽性的，而沒有CD4+T細胞為染色陽性的。對平行進行的人類PBMC’s觀察到相同的結果。這與文獻符合，即在人類中，NKG2D正常在NK細胞和CD8+T細胞上表現，而沒有在CD4+T細胞上表現。
以ON72或16F16染色得自食蟹獼猴和恆河猴的PBMC’s，證實兩個抗體對NK細胞和CD8+T細胞有類似的結合，但不與CD4+T細胞結合。這些結果核准這兩種猴子品系為毒性研究的適當物種。
利用任一市售的抗體，或任何的16F16或16F31，觀察到對小鼠、大鼠、狗或豬NKG2D沒有交叉-反應性。
在圖11A和11B中分別出示MS對人類和食蟹獼猴CD8 T細胞結合的結果，並在表4中出示MS和21F2對PBMC製劑之結合的EC50值，連同食蟹獼猴對人類細胞的相對EC50值(%)。這證實MS和21F2兩者皆對人類和食蟹獼猴NKG2D具有非常類似的親和力。
實施例6：生物測定
欲測試完整人類抗體實際阻斷NKG2D之活性，發展出NKG2D-配位體-駕馭的細胞毒性測定。使用51Cr-釋放測定，在這裡以放射性染料裝滿目標細胞，並測量它的釋放作為NK殺死細胞的結果。
材料和方法
NKG2D-MICA交互作用介導之致死測定。測量NKG2D-配位體介導之殺死目標細胞的生物學測定適用於測試抗-NKG2D抗體。NK細胞株NK92或NKL(ATCC編號CRL-2407；Robertson等人,Exp Hematol 1996;24:406-15)兩者以NKG2D-依賴性之方式殺死經MICA轉染的BaF/3細胞，並可用來作為效應物細胞，殺死裝載51Cr並表現NKG2D-配位體(MICA、MICB或ULBP1-4)之目標細胞。
在第一個測定中，在有或無1或5微克ON72或經重組表現之16F16的IgG4同型物之下，以10:1之比例將NKL細胞與裝載51Cr並表現MICA之BaF/3細胞一起培養4小時。在培養之後，將上清液移至微量滴定盤，加入閃爍劑，並在Top計數器(Wallach)上測量因為殺死目標細胞而導致51Cr的釋放。在51Cr釋放上的降低，是藉著加入抗體而抑制致死的測量值，並計算被殺死之細胞的百分比。
在第二個測定中，將NK-92細胞與經51 Cr-標示之表現MICA-或ULBP3的BaF/3細胞一起培養，並藉著加入漸增濃度之經重組表現和純化的16F16、16F31、MS或21F2的IgG4同型物而降低致死。以致死的抑制%提交結果。
結果
配位體阻斷性抗體的加入，使用ON72或16F16，以劑量-依賴性之方式阻斷了帶有MICA之細胞被NKL細胞殺死，以致死的抑制%來表示(參見圖12)。不表現MICA的對照組細胞不會被NKL細胞殺死。
16F16亦以劑量依賴性之方式，抑制帶有MICA-和ULBP之BaF/3目標細胞被NK-92細胞殺死(圖12A和12B)，以致死的抑制%來表示，並在0.8微克/毫升之MICA-和ULBP-NKG2D兩者誘導的致死上，有接近完全的阻斷。16F31(IgG4)在最高的受試劑量(20微克/毫升；圖13A和13B)，阻斷了大約75%的致死。
如同在圖14A中所示，MS和21F2兩者在51Cr-釋放測定中，皆抑制了攜帶ULBP3之細胞被NK-92細胞殺死。在圖14A中，以抑制%表示細胞毒性的抑制，0是一起培養兩種細胞，不添加抗體，其中MS是較有效的。如同在圖14B中所示，在51Cr-釋放測定中，在極低濃度之MS處(0.01微克/毫升)，觀察到攜帶配位體(MICA)之細胞被NKL細胞殺死的最大抑制，而最高受試濃度的16F16(0.1微克/毫升)僅導致大約40%的抑制。在表5中提供IC50數據的摘要。
實施例7：抗體誘導之NKG2D的向下調節
當將表現hNKG2D之細胞與抗體一起培養時，顯示以類似先前在老鼠模式中對於某些抗-mNKG2D抗體證實之方式，發生NKG2D的向下-調節，例如經由內化作用。這會導致不同的作用模式，並可能導致較長的抗體作用時間。在這裡，藉著測量在與抗體隔夜培養之後，降低了多少NKG2D含量，來分析向下-調節。
材料和方法
流動式細胞測量術測定-向下-調節。藉著與ON72、16F16、16F31、MS或21F2一起培養隔夜，在不同類型之表現NKG2D的細胞上分析抗體-介導之NKG2D的向下-調節。無意受理論限制，在向下-調節上的差異，可反映在抗原-交互作用，例如抗原決定基上的差異。該人類抗體是以IgG4同型物形式經重組表現的，該同型物以低親和力與Fc-受體結合。
在第一個實驗中，將1毫升(含有1微克ON72或16F16；3微克16F31；0.1微克MS，或0.3或1微克21F2)加至表現NKG2D-和DAP10的細胞中。
在第二個實驗中，在10%人類血清的存在下(模仿全血的狀態，其中存有對Fc受體有較高親和力的IgGs)，將新近製備的NK細胞與不同量的MS(0；0.003；0.01；0.03；0.1；0.3；1微克)或21F2(0.1微克)一起培養。
在第三個實驗中，將0.1微克/毫升MS、ON72或21F2加至含有NK、CD8+和γδT細胞的全血中。在培養之後，以抗-CD8、抗-CD56(NK細胞)、抗-γδ和抗-人類抗體染色，鑑認對各種亞型的結合。
將細胞保持不處理在37℃下隔夜，作為在以上實驗中的對照組。第二天，將未經處理和經抗體處理的細胞與0.1微克預先處理的抗體一起培養，接著是山羊-抗-小鼠IgG-HRP Fcγ片段專一的，Jackson(109-036-151)，以偵測ON72，或山羊-抗-人類IgG-HRP Fcγ片段專一的，Jackson(109-036-098)，以偵測人類抗體。然後沖洗細胞，並在B&D FACSArray上分析。分析在未經處理和經抗體處理之染色程度之間的染色差異，作為NKG2D向下-調節之測量值，並根據與未經處理之細胞的染色相比較，在預先-處理之後的染色%，來計算剩下的細胞表面NKG2D的%。
結果
如同在圖15中所示，ON72、16F16和16F31在表現NKG2D的BAF/3細胞中，均誘導NKG2D向下-調節。與使用16F16之大約75%的向下調節相比較，關於ON72和16F31，觀察到大約55%的向下調節。這暗示16F16更有效地誘導向下-調節，因其具有類似ON72之Kd值。無意限制理論，這可能是因為不同的結合抗原決定基。在與MS一起培養之後，在表面NKG2D方面有大約95%的降低(圖16A)。在新近分離的NK細胞中，僅相當於大約60%飽和(0.03微克/毫升)的MS濃度，在血清的存在下，誘導細胞-表面NKG2D的最大內化，但在該情況下，在與抗體隔夜培養之後僅有大約35%NKG2D可用於結合(圖16B)。至於21F2，在缺乏血清之下，1微克/毫升之濃度便誘導78%(圖17)的NKG2D向下調節。
在全血中之3個不同的NKG2D+淋巴細胞族群中，在24小時對MS和21F2觀察到大約80%內化，而ON72誘導之內化卻接近100%(圖18)。此外，ON72誘導之內化比MS和21F2(圖18)更快，在1小時中達到50-75%。
實施例8：人類抗體之非-耗盡性IgG4版本
在血液中與抗體交叉-連接的細胞可誘導與抗體結合之細胞的耗盡。然而，IgG4抗體對活化性Fc-受體的親和力與IgG1相比較是如此之低，故IgG4抗體不會導致耗盡。
材料和方法
全血細胞耗盡測定。欲證實表現NKG2D細胞的未-耗盡，將人類全血與1微克人類抗體之IgG4版本一起培養4小時，並分析NKG2D-陽性和NKG2D-陰性細胞的相對分布，並與在缺少抗體時培養之人類全血做比較。然後使用在實施例4中描述的分析來進行評估。
實施例9：親和力判定
在25℃下，在Biacore 1000升級裝置(Biacore GE Healthcare;Biacore Upgrade CA0396)上進行表面等離子體共振測量。在所有Biacore實驗中，HBS-EP緩衝溶液(Biacore GE Healthcare;BR-1001-88)係作為執行緩衝溶液，並利用Biaevaluation 4.1軟體分析感應曲線圖。
蛋白質固定。從R&D Systems獲得或以重組方式產生重組的MICA-Fc蛋白質。從R&D Systems購得重組的ULBP-1、2、3、MICB和NKG2D-Fc。將重組的NKG2D-Fc蛋白質共價固定在感應晶片CM5(Biacore GE Healthcare;BR-1000-14)之葡聚糖層中的羧基基團上。以EDC/NHS(N-乙基-N’-(3-二甲基胺丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀醯亞胺(Biacore GE Healthcare;BR-1000-50))活化該感應晶片表面。以偶聯緩衝溶液(10mM醋酸鹽，pH5.2)稀釋該蛋白質至10微克/毫升，並注入直到達到適當的固定程度為止(即500至1000RU)。使用100mM乙醇胺pH8(Biacore GE Healthcare；BR-1000-50)，進行殘餘經活化之基團的失活。
親和力測量。將人類抗體16F16、16F31、MS和21F2，兩者都是以IgG4同型物之形式經重組表現的，與鼠類抗體ON72做比較。關於動力學實驗，以40微升/分鐘的不變流速，將連續稀釋的可溶性抗體(從0.3到30nM)注射在含有經固定之NKG2D-Fc蛋白質的葡聚糖層上2分鐘(500至1000RU)，並在藉著注射8秒500mM NaCl和10mM NaOH緩衝溶液再生之前，允許解離3分鐘。藉著使用Langmuir模式的整體吻合，分析所得的感應曲線圖。按KD=kd/ka來計算解離常數(KD)。
對位在細胞膜之NKG2D的親和力。完成抗體對表現NKG2D細胞之結合的全劑量-反應曲線，以分析對天然存在之受體的結合親和力。
結果
在表6A中出示16F16的親和力判定結果，在Biacore中，在晶片上兩個不同的NKG2D-密度下，證實高親和力(KD 1.72E-10M)和慢解離率(kd 3.7E-5/秒)。ON72是類似的，具有ka=9.6E5/(M*秒)；kd=1.1E-4/秒；和KD=1.7E-10M。然而，MS和21F2兩者都有較高的親和力(分別為KD 2.52E-12M和7.79E-11M)，且MS有較慢的解離率(kd 1.45E-05/秒)(表6B)。
圖3證實經重組產生並純化之人類抗體16F16、16F31、MS和21F2對表現NKG2D-和DAP10之BaF/3細胞的劑量-依賴性NKG2D結合，與市售之鼠類抗體(ON72和149810)相比較，使用流動式細胞測量術。結合的EC50值如下：
16F16：0.051微克/毫升(0.034nM)
16F31：0.31微克/毫升(0.21nM)
MS：0.032微克/毫升(0.021nM)
21F2：0.033微克/毫升(0.023nM)
ON72：0.062微克/毫升(0.048nM)
149810：0.063微克/毫升(0.042nM)
實施例10：經固定之抗-NKG2D抗體的激動劑活性
欲分析抗體之激動劑活性，在有或無經固定抗-NKG2D抗體下，評估以低水平CD3刺激之周圍血液淋巴細胞(PBMCs)的增殖，使用CD28作為對照組。在其中已經顯示NKG2D之作用為共同-刺激分子的情況下進行該刺激(Mashoo等人Immunol. 2005;174:4480-4484)，咸相信其反映在前-發炎細胞介素的存在下-如同在慢性發炎性疾病下，NKG2D的誘發。在本測定中，以經表面結合之抗體刺激PBMCs三天，接著是IL-2刺激4天，並藉著CFSE稀釋，在所有的淋巴細胞、CD8+或CD4+ T細胞中評估增殖。
材料和方法
PBMC增殖測定。藉著梯度離心純化PBMCs。以抗-Fc抗體(Jackson-Immuno Resarch 115-006-008)塗覆96-孔最大吸收培養盤，然後沖洗並接著加入抗-CD3(0.1或0.3毫微克/毫升，Bioscience目錄#14-0037-82)、抗-NKG2D(MS或ON72，0.2微克/毫升)及/或抗-CD28抗體(0.2微克/毫升，Becton Dickison目錄#348040)。在每孔中加入15萬個PBMCs，並在37℃下培養該細胞3天。隨後以CFSE(分子探針目錄#C34554)標示細胞。在37℃下在0.5毫升1uM CFSE中培養一千萬個細胞10分鐘，接著沖洗，並將在60-孔培養盤中的每孔150,000個PBMCs與IL-2(10單位/毫升)一起培養4天。最後，以抗-CD8和抗-CD4抗體染色細胞，並藉著CFSE稀釋，在所有的淋巴細胞(全都在圖19中提交)或CD8+或CD4+ T細胞(獲得類似的結果)中測量增殖。
結果
如同在圖19中所示，MS在0.1或0.3毫微克/毫升CD3刺激下，並未顯著地共同-刺激淋巴細胞的增殖，而ON72在兩種CD3濃度下，結果產生少許但顯著的共同-刺激。參見表7。在兩種情況下，對照組抗-CD28皆獲得強有力的共同-刺激，而抗-NKG2D則未顯著增加該現象。這顯示在兩種抗體的結合模式上有差異，經固定之ON72具有可偵測的激動劑活性，而MS則是較純的拮抗劑。
實施例11-可溶性hNKG2D在帶有MS-Fab之複合體中的結晶結構
利用X-射線結晶術，解釋在帶有人類單株抗體MS之Fab片段的複合體中之hNKG2D可溶性片段的結晶結構，並精準化至1.7解析度。結果證實該抗體，當與hNKG2D結合時，阻斷了MICA分子的結合(圖20-22)。亦顯示每個hNKG2D二聚體僅與一個MS Fab片段結合。MS Fab部分主要與兩個hNKG2D單體之一(“NKG2D單體單元1”)結合，但雖然其僅微弱地與另一單體(“NKG2D單體單元2”)交互作用，卻阻斷任何更多MS Fab與單體單元2的結合。
在實施例12中提供了在本實施例中提到的文獻一覽表。
材料和方法
以稍微莫耳過量的hNKG2D，混合可溶性hNKG2D(SEQ ID NO:2之殘基89-216)和MS Fab(包括相當於SEQ ID NO:41之輕鏈和相當於SEQ ID NO:40之殘基1-213的重鏈片段)，並在凝膠-過濾管柱上純化複合體。然後濃縮該複合體至大約9.5毫克/毫升。利用懸滴-技術，使結晶在17%PEG3350、200mM丙二酸鈉和100mM雙-三-丙烷緩衝溶液(具有7.5之pH值)中生長。將結晶移至含有75%沉澱溶液和25%甘油的冷凍-溶液中。允許該結晶浸泡大約15秒。然後在液態N2 中急速冷凍該結晶，並在數據收集期間，藉著低溫N2 氣流，將其保持在100K。一開始在Rigaku 007HF旋轉式陽極來源下收集對2.4解析度的結晶術數據，隨後使用新結晶，在MAX-1ab,Lund,Sweden的光束線BL911-3(2)下，收集對1.7解析度的數據。在XDS套裝軟體(3)中進行數據的空間群判定、積分和定標。決定同步加速器數據的晶格參數分別為82.1、54.2、169.4，90°，102.62°和90°。分子置換，使用CCP4程式套(7)的MOLREP(4)和PHASER軟體程式(5;6)，而為了結構判定，使用得自PDB-存放(8)之結構1L71(9)的Fab分子，和得自經存放之1MPU結構(10)的hNKG2D分子。在分子置換計算中，將Fab分子分成兩個功能部位-可變和恆定功能部位，對於NKG2D則使用一單體作為搜索模式。結晶術精準化-使用REFMAC5軟體程式(11)，接著是電子密度圖的電腦圖學檢查、模型校正，並使用Coot軟體程式(12)建立。循環該程序，直到對模型不能再進行更重大的改良為止。一開始以C2空間群解釋該結構，使用旋轉陽極數據。雖然同步加速器數據XDS(3)指出非-中心的單斜空間群，並將數據統合於空間群P2中，稍後更改為P21 。C-中心正斜方晶格亦得到高分。在測試同步加速器數據時，POINTLESS軟體(13)亦提出P21 為正確的空間群。新一輪的分子置換使用PHASER軟體程式，使用在第一輪分子置換中，以C2空間群製備的預備模型。順利地執行分子置換，但在精準化期間，如預期(R-和R游離 值為0.35和0.43)並未減少R-和R游離 值(將得自模型的觀察實驗數據與計算數據做比較)，不管合理的電子密度圖，故開始進一步調查數據和精準化。測試不同的空間群，包括P1，但沒有改善精準化。為了使之成對檢查代替數據，並將數據移至SHELXL精準化軟體程式(14)。分別對所有落在從0.34和0.40到0.30和0.34內的數據，使用(h,k,1)→(h,k,-h-1)R-和R游離 值的成對關係，並利用0.25之經精準化成對因數-BASF。以COOT製圖學軟體程式，進行模型的手工修改。在SHELXL電腦程式中完成精準化。所有數據最終的R-和R游離 值，沒有截止點，在14回合手工介入和後續的精準化之後，分別為0.277和0.320，且該模型顯示得自0.008之理想鍵長的均方根偏差(RMSD)(表8)。藉著SHELXL計算出經精準化之成對因數為0.26。
結果
如同在圖20A、20B、21A和21C中所示，MS-Fab有效地阻斷MICA對hNKG2D二聚體之兩個單體的結合。然而，雖然MICA分子與NKG2D二聚體的兩個單體結合(1)，但MS Fab主要與兩個單體之一結合，在本文中意指”NKG2D單體單元1”(圖21A和21C)。發現在MS和NKG2D單體單元2之間的交互作用，是較不專一的(例如不含或包含較少的氫-鍵)，且對於保持MS Fab/NKG2D複合體在一起是較不重要的。
藉著CCP4程式套(7)的軟體程式AREAIMOL計算在逐對交互作用中排除的平均面積，對於具有經判定結晶結構之兩個獨立的可溶性hNKG2D/MS-Fab分子複合體，分別得到總計909和876 2 。針對兩個獨立的複合體，計算在NKG2D單體單元1和MS Fab之間，在逐對交互作用中排除的平均面積分別為710和736 2 。另一單體(“NKG2D單體單元2”)的排除面積實質上較小，分別為227和158 2 。
藉著執行CCP4程式套(7)之CONTACTS軟體，使用在MS-Fab與hNKG2D分子之間4.0的截止距離，鑑認在hNKG2D與MS Fab之間的直接接觸。在表9-12中出示兩個獨立的可溶性hNKG2D/MS-Fab複合體分子之結晶結構的結果。發現所得的MS之hNKG2D抗原決定基包括下列的hNKG2D(SEQ ID NO:2)殘基：Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208(圖21A)。在NKG2D單體單元2中，僅發現5個交互作用，且僅有一個殘基(Tyr 152)出現在兩個在結晶術上無關的複合體中。此外，Lys 150側鏈原子Nζ僅涉及在複合體之一中的氫-鍵結合，而剩下的交互作用都是較弱極性和疏水性類型。
MS hNKG2D抗原決定基包括位在環中，正好在β-股β3’(1)之前和起點的殘基，Lys 150-Tyr 152；在β5’中和環後，Thr 180-Gln 185；在β5中，Leu 191；在β6中，Lys 197、Tyr 199和Glu 201；以及在環中在β7股之前和之中，Thr 205-Thr 208。這些接觸區域與已經報告為在hNKG2D上MICA之結合位置的那些完全一致(1)。MICA不對稱地與NKG2D的對稱同二聚體結合(10)。這也是MS Fab與hNKG2D結合的情況。因此，相對於MICA，MS Fab對於NKG2D會有兩種可能的結合取向。在圖20A、B和圖22中出示該取向，其中清楚地看到MS Fab阻斷了兩個可能的MICA相對結合取向。
MS對hNKG2D的抗原互補位包括MS輕(L)鏈(SEQ ID NO:41，表9-12)之殘基Tyr 33和Trp 97，以及重(H)鏈(SEQ ID NO:40，表9-12)之殘基Gln 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98和Asp 99。亦在圖21A中，在hNKG2D之胺基酸序列中，指出hNKG2D抗原決定基，以及涉及氫-鍵結合的殘基。
實施例12-可溶性hNKG2D在帶有hzON72-Fab之複合體中的結晶結構
使用X-射線結晶術，解釋在帶有ON72 Fab片段之人類化版本(hzON72)的複合體中之可溶性hNKG2D的結晶結構，並精準化至3.15解析度。結果證實該抗體，當與hNKG2D結合時，能夠阻斷MICA分子對hNKG2D的結合(圖20-22)。亦顯示每個hNKG2D二聚體可與兩個hzON72 Fab部分同時結合。
在實施例結束時提供在本實施例中提到的文獻一覽表。
材料和方法
以稍微莫耳過量的hNKG2D，混合可溶性hNKG2D片段(相當於SEQ ID NO:2之殘基81-216)和hzON72 Fab(SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71，分別為重鏈片段和輕鏈)，並在凝膠-過濾管柱上純化複合體。然後濃縮該複合體至大約7.5毫克/毫升。利用懸滴-技術，使結晶在1M LiSO4 和100mM MES緩衝溶液pH6.5中生長。將結晶移至含有75%沉澱溶液和25%甘油的冷凍-溶液中。允許該結晶浸泡大約15秒。然後在液態N2 中急速冷凍該結晶，並在數據收集期間，藉著低溫N2 氣流，將其保持在100K。使用在MAX-lab,Lund,Sweden的光束線BL911-5(2)收集對解析度的結晶術數據。在XDS套裝軟體(3)中進行數據的空間群判定、積分和定標。決定晶格參數分別為65.7、93.3、，90°，93.83°和90°。關於在不對稱單元中之一個NKG2D二聚體和兩個hzON72 Fab分子的空間，判定空間群為P21 。分子置換，使用CCP4程式套(7)的MOLREP(4)，而為了結構判定，使用PDB-存放(8)之結構1UJ3(15)的Fab分子，和經存放之1MPU結構(10)的hNKG2D二聚體。首先在旋轉功能行程中，以不同的肘角測試Fab分子，從其中挑選最高分的Fab。在分子置換計算中，搜尋為二聚體之NKG2D。在CCP4程式套(7)之REFMAC5軟體程式(11)中，進行結晶術精準化(其使用在兩個hNKG2D單體之間，以及在兩個Fab分子之間的非-結晶術限制)。在結晶術精準化之後，是電子密度圖的電腦圖學檢查、模型校正，並使用Coot軟體程式(12)建立。循環該程序，直到對模型不能再進行更重大的改良為止。所有數據最終的R-和R游離 值，分別為0.216和0.268，且該模型顯示得自之理想鍵長的均方根偏差(RMSD)(表13)。
結果
MICA分子強有力地與NKG2D的兩個單體結合(1)，但兩個hzON72-Fab分子改而獨立地與每一個hNKG2D單體結合，有效地阻斷了MICA對NKG2D二聚體的結合(圖20C、21B、C和22)。藉著CCP4程式套(7)的軟體程式AREAIMOL計算在逐對交互作用中排除的平均面積，對於在經判定之結晶結構中兩個在結晶術上無關的可溶性hNKG2D/hzON72-Fab分子複合體(一個hzON72 Fab分子與一個hNKG2D單體複合)，分別得到總計791和801。針對兩個在結晶術上無關的複合體，計算在可溶性hNKG2D單體與hzON72-Fab的重鏈之間，在逐對交互作用中排除的平均面積分別為642和631，而對輕鏈則分別為208和242。
藉著執行CCP4程式套之CONTACTS軟體，使用在hzON72-Fab與hNKG2D分子之間4.0的截止距離，鑑認在hNKG2D對hzON72-Fab之間的直接接觸。在表14-15中出示兩個獨立的可溶性hNKG2D/hzON72-Fab分子之結晶結構的結果。發現所得的hzON72之hNKG2D抗原決定基包括下列的hNKG2D(SEQ ID NO:2)殘基：Ser 165、Trp 166、Leu 174、Ser 175、Pro 176、Asn 177、Leu 179、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Lys 186、Ala 193、Ser 194、Ser 195、Lys 197和Tyr 199。hzON72對hNKG2D的抗原互補位包括包括hzON72輕(L)鏈(SEQ ID NO:71，表14-15)之殘基Tyr 1、Lys 92、Thr 93和Leu 94，以及hzON72重(H)鏈(SEQ ID NO:70)之殘基Trp 33、Asp 52、Asp 55、Tyr 57、Asn 59、Tyr 60、Tyr 101、Asp 102、Gly 103、Tyr 104、Tyr 105和Val 106。在圖21B中，在hNKG2D之胺基酸序列中，指出hNKG2D對hzON72之抗原決定基，以及涉及氫-鍵結合的殘基。
hNKG2D抗原決定基包括位在β-股β4(1)起點中的殘基，Ser 165-Trp 166；在環中在β5’之前，Leu 174-Asn 177；在β5’股中和環之後，Leu 179-Lys 186；在環上在β6之前，Ala 193-Ser 195；以及在β6股中，Lys 197和Tyr 199。這些接觸區域與已經報告為在hNKG2D上MICA之結合位置的那些完全一致(1)，並明瞭hzON72抗體可阻斷MICA結合。在圖20C、21B、C和22中出示這個。
表9
hNKG2D單體”N”(SEQ ID NO:2)與”H”，MS-Fab重鏈(SEQ ID NO:40)和”L”，MS-Fab輕鏈(SEQ ID NO:41)交互作用。這在結晶中是第一個在結晶術上無關的hNKG2D/MS-Fab複合體分子。使用4.0之截止點。藉著CCP程式套(7)的CONTACT電腦程式鑑認接觸。在最後一欄中，“***”代表根據CONTACT計算，在該接觸點有氫鍵的強烈可能性(距離<3.3)，“*”代表弱可能性(距離>3.3)。空白代表該程式認為沒有氫鍵的可能性。氫鍵在捐贈者和接受者之間是專一的，典型為強有力的，而可輕易鑑認出。
表10
hNKG2D單體”C”(SEQ ID NO:2)與”B”，MS-Fab重鏈(SEQ ID NO:40)和”A”，MS-Fab輕鏈(SEQ ID NO:41)交互作用。這在結晶中是第二個在結晶術上無關的hNKG2D/MS-Fab複合體分子。使用4.0之截止點。藉著CCP程式套(7)的CONTACT電腦程式鑑認接觸。在最後一欄中，”***”代表根據CONTACT計算，在該接觸點有氫鍵的強烈可能性(距離<3.3)，”*”代表弱可能性(距離>3.3)。空白代表該程式認為沒有氫鍵的可能性。
表11
hNKG2D單體”M”(SEQ ID NO:2)與”H”，MS-Fab重鏈(SEQ ID NO:40)和”L”，MS-Fab輕鏈(SEQ ID NO:41)交互作用。這在結晶中是第一個在結晶術上無關的hNKG2D/MS-Fab複合體分子。使用4.0之截止點。藉著CCP程式套(7)的CONTACT電腦程式鑑認接觸。在最後一欄中，”***”代表根據CONTACT計算，在該接觸點有氫鍵的強烈可能性(距離<3.3)，”*”代表弱可能性(距離>3.3)。空白代表該程式認為沒有氫鍵的可能性。
表12
hNKG2D單體”D”(SEQ ID NO:2)與”B”，MS-Fab重鏈(SEQ ID NO:40)和”A”，MS-Fab輕鏈(SEQ ID NO:41)交互作用。這在結晶中是第二個在結晶術上無關的hNKG2D/MS-Fab複合體分子。使用4.0之截止點。藉著CCP程式套(7)的CONTACT電腦程式鑑認接觸。在最後一欄中，”***”代表根據CONTACT計算，在該接觸點有氫鍵的強烈可能性(距離<3.3)，”*”代表弱可能性(距離>3.3)。空白代表該程式認為沒有氫鍵的可能性。
表14
hNKG2D單體”N”(SEQ ID NO:2)與”H”，hzON72-Fab重鏈(SEQ ID NO:70)和”L”，hzON72-Fab輕鏈(SEQ ID NO:71)交互作用。這在結晶中是第一個在結晶術上無關的hNKG2D/hzON72-Fab複合體分子。使用4.0之截止點。藉著CCP程式套(7)的CONTACT電腦程式鑑認接觸。在最後一欄中，”***”代表根據CONTACT計算，在該接觸點有氫鍵的強烈可能性(距離<3.3)，”*”代表弱可能性(距離>3.3)。空白代表該程式認為沒有氫鍵的可能性。
表15
hNKG2D單體”C”(SEQ ID NO:2)與”B”，hzON72-Fab重鏈(SEQ ID NO:70)和”A”，hzON72-Fab輕鏈(SEQ ID NO:71)交互作用。這在結晶中是第二個在結晶術上無關的hNKG2D/hzON72-Fab複合體分子。使用4.0之截止點。藉著CCP程式套(7)的CONTACT電腦程式鑑認接觸。在最後一欄中，”***”代表根據CONTACT計算，在該接觸點有氫鍵的強烈可能性(距離<3.3)，”*”代表弱可能性(距離>3.3)。空白代表該程式認為沒有氫鍵的可能性。
 參考文獻表
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例示性具體事實
以下的是本發明的例示性具體事實。
1.一種經分離的人類或經人類化單株抗體，或其抗原-結合片段，其與人類NKG2D(hNKG2D)結合。
2.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其降低hNKG2D-介導之表現hNKG2D之NK或T細胞的活化。
3.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其與至少一個hNKG2D配位體競爭對hNKG2D的結合。
4.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其中該配位體為MICA。
5.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其降低在表現NKG2D之NK或T細胞的表面上NKG2D的量。
6.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，當將其固定時，不會顯著地共同-刺激CD3-誘發之周圍血液單核細胞(PBMCs)的增殖。
7.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，當將其固定時，對hNKG2D-介導之表現hNKG2D之NK或T細胞的活化，沒有明顯的激動劑影響。
8.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其與食蟹獼猴和恆河猴NKG2D結合。
9.如先前之具體事實中任一項之抗體，其以1nM或更低之KD與hNKG2D結合。
10.如先前之具體事實中任一項之抗體，其以0.1nM或更低之KD與hNKG2D結合。
11.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，當將其加至表現NKG2D之NK或T細胞時，與不超過兩個hNKG2D二聚體交聯。
12.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其僅與在hNKG2D二聚體中的第一個hNKG2D單體強烈地結合。
13.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，當其與該第一個hNKG2D單體結合時，阻斷了該抗體或抗原-結合片段與第二個hNKG2D單體的結合。
14.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其在hNKG2D二聚體中之第一和第二個hNKG2D單體上的溶劑-排除面積之比例為大約2:1或更高。
15.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其等之該比例為大約3:1或更高。
16.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其與參考抗體競爭對NKG2D的結合，其中該參考抗體係選自由下列所組成之群組：
(a)包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:11之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:12之序列)的抗體；
(b)包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:13之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:14之序列)的抗體；
(c)包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:44之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:45之序列)的抗體；和
(d)包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:46之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:47之序列)的抗體。
17.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其與與參考抗體相同之NKG2D的抗原決定基結合，其中該參考抗體係選自由下列所組成之群組：
(a)包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:11之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:12之序列)的抗體；
(b)包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:13之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:14之序列)的抗體；
(c)包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:44之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:45之序列)的抗體；和
(d)包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:46之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:47之序列)的抗體。
18.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其以實質上與參考抗體相同的KD與NKG2D結合，其中該參考抗體係選自由下列所組成之群組：
(a)包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:11之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:12之序列)的抗體；
(b)包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:13之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:14之序列)的抗體；
(c)包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:44之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:45之序列)的抗體；和
(d)包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:46之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:47之序列)的抗體。
19.如具體事實第16-18項中任一項之抗體或抗原-結合片段，其中該參考抗體包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:44之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:45之序列)。
20.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其與包括SEQ ID NO:2之Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207及/或Thr 208的抗原決定基結合。
21.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其與包括5或多個選自SEQ ID NO:2之Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208之殘基的抗原決定基結合。
22.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其與包括SEQ ID NO:2之Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208之抗原決定基結合。
23.如具體事實第16-18項中任一項之抗體或抗原-結合片段，其中該參考抗體包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:46之序列)和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:47之序列)。
24.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其包括重鏈可變區，該重鏈可變區為一組人類基因之產物或從其中衍生，包括：
(a)VH3_21、D3-9和JH4基因；
(b)VH3_20、D3-10和JH9基因；
(c)VH4_59、D7_27_R3和JH3基因；或
(d)VH5_51、D3_10_R3和JH4基因。
25.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其包括輕鏈可變區，該輕鏈可變區為一組人類基因之產物或從其衍生，其包括：
(a)VKI_L15和JK2基因；
(b)VKⅢ_A27和JK3基因；
(c)VKⅢ_A27和JK1基因；或
(d)VKⅢ_L6和JK1基因。
26.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其包括重鏈可變區(其為一組包括VH_4_59、D7_27_R3和JH3基因之人類基因的產物或從其中衍生)，和輕鏈可變區(其為一組包括VKⅢ_A27和JK1基因之人類基因的產物或從其中衍生)。
27.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其包括抗原互補位(paratope)，該抗原互補位包括相當於SEQ ID NO:44之Gln 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98或Asp 99或SEQ ID NO:45之Tyr 33或Trp 97，或其任何組合之殘基。
28.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括抗原互補位，該抗原互補位包括至少5個殘基，選自相當於SEQ ID NO:44之Gln 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98或Asp 99或SEQ ID NO:45之Tyr 33或Trp 97，或其任何組合之殘基。
29.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括抗原互補位，該抗原互補位包括相當於SEQ ID NO:44之Gln 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98和Asp 99，以及SEQ ID NO:45之Tyr 33和Trp 97之殘基。
30.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:48之序列的重鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:49之序列的重鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:50之序列的重鏈可變區CDR3。
31.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:51之序列的輕鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:52之序列的輕鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:53之序列的輕鏈可變區CDR3。
32.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:44之序列)，和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:45之序列)。
33.如具體事實第1至25項中任一項之抗體或抗原-結合片段，其包括重鏈可變區(其為一組包括VH5_51、D3_10_R3和JH4基因之人類基因的產物或從其中衍生)，和輕鏈可變區(其為一組包括VKⅢ_L6和JK1基因之人類基因的產物或從其中衍生)。
34.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:54之序列的重鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:55之序列的重鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:56之序列的重鏈可變區CDR3。
35.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括:
(a)包括SEQ ID NO:57之序列的輕鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:58之序列的輕鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:59之序列的輕鏈可變區CDR3。
36.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:46之序列)，和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:47之序列)。
37.如具體事實第1項之抗體或抗原-結合片段，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:15之序列的重鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:16之序列的重鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:17之序列的重鏈可變區CDR3。
38.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:18之序列的輕鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:19之序列的輕鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:20之序列的輕鏈可變區CDR3。
39.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:11之序列)，和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:12之序列)。
40.如具體事實第1項之抗體或抗原-結合片段，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:21之序列的重鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:22之序列的重鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:23之序列的重鏈可變區CDR3。
41.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:24之序列的輕鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:25之序列的輕鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:26之序列的輕鏈可變區CDR3。
42.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:13之序列)，和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:14之序列)。
43.如具體事實第1項之抗體或抗原-結合片段，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:48之序列的重鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:49之序列的重鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:50之序列的重鏈可變區CDR3。
44.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:51之序列的輕鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:52之序列的輕鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:53之序列的輕鏈可變區CDR3。
45.如具體事實第1項之抗體或抗原-結合片段，其包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:44之序列)，和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:45之序列)。
46.如具體事實第1項之抗體或抗原-結合片段，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:54之序列的重鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:55之序列的重鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:56之序列的重鏈可變區CDR3。
47.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:57之序列的輕鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:58之序列的輕鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:59之序列的輕鏈可變區CDR3。
48.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括重鏈可變區(其包括SEQ ID NO:46之序列)，和輕鏈可變區(其包括SEQ ID NO:47之序列)。
49.如具體事實第1項之抗體或抗原-結合片段，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:15、21、48或54之序列的重鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:16、22、49或55之序列的重鏈可變區CDR2；
(c)包括SEQ ID NO:17、23、50或56之序列的重鏈可變區CDR3；
(d)包括SEQ ID NO:18、24、51或57之序列的輕鏈可變區CDR1；
(e)包括SEQ ID NO:19、25、52或58之序列的輕鏈可變區CDR2；和
(f)包括SEQ ID NO:20、26、53或59之序列的輕鏈可變區CDR3；
帶有不超過8個保留性胺基酸置換。
50.如先前之具體事實之抗體或抗原-結合片段，其包括不超過5個胺基酸置換。
51.如先前之具體事實中任一項之抗體，其為人類的。
52.如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段，其為二價的。
53.如先前之具體事實之抗體，其為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。
54.如先前之具體事實之抗體，其為IgG4抗體。
55.如先前之具體事實中任一項之抗體，其在VH鏈中包括S241P突變。
56.一種經分離之抗體，其包括重鏈序列(其包括SEQ ID NO:7之序列)和輕鏈序列(其包括SEQ ID NO:8之序列)。
57.一種經分離之抗體，其包括重鏈序列(其包括SEQ ID NO:9之序列)和輕鏈序列(其包括SEQ ID NO:10之序列)。
58.一種經分離之抗體，其包括重鏈序列(其包括SEQ ID NO:40之序列)和輕鏈序列(其包括SEQ ID NO:41之序列)。
59.一種經分離之抗體，其包括重鏈序列(其包括SEQ ID NO:42之序列)和輕鏈序列(其包括SEQ ID NO:43之序列)。
60.一種經分離之抗體，其比起與ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217或149810中任一個，更與16F16、16F31、MS或21F2競爭對hNKG2D的結合，並阻止NKG2D-介導之表現NKG2D之NK或T細胞的活化。
61.如先前之具體事實之經分離之抗體，其比起與ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217或149810更與MS競爭。
62.如具體事實第60項之經分離之抗體，其比起與ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217或149810更與21F2競爭。
63.一種經分離之抗體，其以第一個一半最大有效濃度(EC50)與在NK-細胞製劑上的細胞表面-所結合之hNKG2D結合，並以第二個EC50降低由該NK細胞製劑介導之殺死表現NKG2D-配位體之目標細胞的作用，其中該第二個EC50實質上比該第一個EC50更低。
64.如先前之具體事實之抗體，其中該NK-細胞製劑為NK-92或NKL細胞。
65.如先前之具體事實之抗體，其中該配位體為ULBP-3或MICA。
66.如先前之具體事實之抗體，其中該第二個EC50不超過該第一個EC50的80%。
67.如先前之具體事實之抗體，其中該第二個EC50不超過該第一個EC50的50%。
68.一種與hNKG2D結合的經分離之抗體，該抗體以低於實質上使細胞-表面所結合之NKG2D飽和之濃度的濃度，達到其對NK-細胞介導之殺死表現配位體之目標細胞的最大降低。
69.一種經分離之抗體，其與hNKG2D結合、阻止NKG2D-介導之表現NKG2D之NK或T細胞的活化，並能夠向下調節超過70%的細胞-表面-所結合之NKG2D。
70.如先前之具體事實之抗體，其能夠向下調節少於90%的NK細胞之細胞-表面-所結合之NKG2D。
71.一種經分離之抗體，其與hNKG2D結合，且其以類似的親和力與表現人類和食蟹獼猴NKG2D之細胞結合。
72.如先前之具體事實之抗體，其具有與在PBMC製劑中之食蟹獼猴CD8+T細胞結合的EC50，為其與在PBMC製劑中之人類CD8+T細胞結合的EC50的至少50%。
73.如先前之具體事實之抗體，其具有與在PBMC製劑中之食蟹獼猴CD8+T細胞結合的EC50，為其與在PBMC製劑中之人類CD8+T細胞結合的EC50的至少65%。
74.如先前之具體事實中任一項之經分離之抗體，其具有不超過0.1nM之對人類NKG2D的親和力。
75.如先前之具體事實中任一項之抗體，其具有不超過10pM之對人類NKG2D的親和力。
76.如具體事實第60至75項中任一項之抗體，其包括
(a)包括SEQ ID NO:48或54之序列的重鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:49或55之序列的重鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:50或56之序列的重鏈可變區CDR3。
77.如先前之具體事實之抗體，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:51或57之序列的輕鏈可變區CDR1；
(b)包括SEQ ID NO:52或58之序列的輕鏈可變區CDR2；和
(c)包括SEQ ID NO:53或59之序列的輕鏈可變區CDR3。
78.如具體事實第60至77項中任一項之抗體，其為人類的。
79.如具體事實第60至78項中任一項之抗體的抗原-結合片段。
80.一種核酸，其編碼如先前之具體事實中任一項之抗體或抗原-結合片段的可變-重或可變-輕鏈。
81.一種表現載體，其包括如先前之具體事實之核酸。
82.一種宿主細胞，其包括如先前之具體事實之表現載體。
83.一種宿主細胞，其產生如具體事實第1至79項中任一項之抗體或抗原-結合片段。
84.如具體事實第82和83項中任一項之宿主細胞，其為CHO細胞。
85.一種產生抗-NKG2D抗體或抗原-結合片段的方法，其包括在適合的條件下培養如具體事實第82至84項中任一項之宿主細胞，並回收該抗體或其抗原-結合片段。
86.一種產生變體抗-NKG2D抗體或其抗原-結合片段的方法，其包括
(a)提供包括選自SEQ ID NO:15、21、48和54之CDR1序列、選自SEQ ID NO:16、22、49和55之CDR2序列，和選自SEQ ID NO:17、23、50和56之CDR3序列的重鏈可變區；
(b)提供包括選自SEQ ID NO:18、24、51和57之CDR1序列、選自SEQ ID NO:19、25、52和58之CDR2序列，和選自SEQ ID NO:20、26、53和59之CDR3序列的輕鏈可變區；
(c)在每個重-和輕-鏈可變區中改變最多8個胺基酸殘基，以產生經改變的重-和輕-鏈可變區；並
(d)在宿主細胞中表現包括該經改變之重-和輕-鏈可變區的變體抗-NKG2D抗體。
87.一種免疫共軛物，其包括與治療劑連接的如具體事實第1至79項中任一項之抗體或抗原-結合片段。
88.一種多專一性分子，其包括與第二部分連接的如具體事實第1至79項中任一項之抗體或抗原-結合片段，該第二部分具有與該抗體不同的結合專一性。
89.如先前之具體事實之多專一性分子，其中該第二部分是二級抗體，或其抗原-結合片段。
90.一種組合物，其包括如具體事實第1至79項中任一項之抗體或抗原-結合片段，以及在藥學上可接受之載劑。
91.一種阻止NKG2D-介導之表現NKG2D之NK或T細胞活化的方法，其包括使該NK或T細胞與如具體事實第1至79項中任一項之抗體或抗原-結合片段接觸，其中該抗體或抗原-結合片段與至少一個NKG2D配位體競爭對NKG2D的結合。
92.如先前之具體事實之方法，其中該NKG2D配位體為MICA。
93.一種在表現NKG2D之NK或T細胞的表面上降低NKG2D含量的方法，其包括使該NK或T細胞與如具體事實第1至79項中任一項之抗體或抗原-結合片段接觸，其中該抗體或抗原-結合片段與至少一個NKG2D配位體競爭對人類NKG2D的結合。
94.一種治療發炎性或自體免疫病症的方法，其包括對患有或處於該發炎性或自體免疫疾病風險下的人類個體投予如具體事實第90項之組合物。
95.如先前之具體事實之方法，其中該患者患有或處於自體免疫病症風險下。
96.如先前之具體事實之方法，其中該自體免疫病症為類風濕性關節炎。
97.如具體事實第95項之方法，其中該病症為多發性硬化症。
98.如具體事實第95項之方法，其中該病症為全身性紅斑性狼瘡(SLE)。
99.如具體事實第95項之方法，其中該病症為牛皮癬。
100.如具體事實第95項之方法，其中該病症為乳糜瀉。
101.如具體事實第95項之方法，其中該病症為發炎性腸病。
102.如先前之具體事實之方法，其中該發炎性腸病為潰瘍性結腸炎。
103.如具體事實第101項之方法，其中該發炎性腸病為克隆氏症。
104.如具體事實第94項之方法，其中該人類個體係受移植排斥或移植-對-宿主疾病所苦或處於該病症風險下。
105.如先前之具體事實之方法，其中該移植為心臟移植或骨髓移植。
106.如具體事實第94至105項中任一項之方法，更包括投予第二種消炎藥。
107.如先前之具體事實之方法，其中該第二種消炎藥係選自免疫抑制劑、止痛劑、抗-血管生成劑、皮質類固醇、B-細胞耗盡劑、B-細胞拮抗劑、T-細胞拮抗劑、補體-抑制劑、抗-細胞介素劑和抗-細胞介素受體劑，及其組合。
108.如具體事實第106和107項中任一項之方法，其中該第二種消炎藥是TNFα活性的拮抗劑。
109.一種治療發炎性或自體免疫病症的方法，其包括將如具體事實第90項之組合物投予處於該發炎性或自體免疫病症風險下的人類個體。
110.如先前之具體事實之方法，其中該人類個體是處於移植排斥或移植-對-宿主-疾病風險下。
111.一種如具體事實第1至79項中任一項之抗體或抗原-結合片段的用途，其係用以製備在人類個體中治療發炎性或自體免疫病症之醫藥品。
112.如具體事實第1至79項中任一項之抗體或抗原-結合片段，其係用以在人類個體中治療發炎性或自體免疫病症。
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圖1顯示得自來自KM小鼠TM 品系之經hNKG2D-免疫的小鼠的典型血清分析。在各種時間點對表現NKG2D之BAF/3細胞或對照組細胞(BAF/3細胞)的流動式細胞測量術分析顯示在1微克血清中，逐漸增加與NKG2D-選擇性結合之抗體的力價(A)。在第6次免疫之後取得之血清(1微升)的預-培養含有抗體，能夠阻止對NKG2D的MICA-Fc-結合(B)。
圖2顯示呈融合瘤上清液形式之人類抗體的實例，其專一地與表現NKG2D之細胞結合(A)，但不與不表現NKG2D之相同細胞株結合(B)。以融合瘤上清液之形式，將該抗體加至細胞中。亦顯示經直接標示之陽性對照組，鼠類抗-NKG2D抗體149810對表現NKG2D之細胞(C)和不表現細胞(D)的結合。黑色輪廓代表背景染色，而實心高峰代表專一的染色。
圖3證實與市售之鼠類抗體(ON72和149810)相比較，經重組表現並純化之完整人類IgG4抗體(16F16、16F31、MS和21F2)對表現NKG2D之細胞的NKG2D-結合之劑量-反應。
圖4顯示人類抗-hNKG2D抗體16F16和16F31(A)，以及MS和21F2(B)之IgG4同型物的重(H)和輕(L)鏈之胺基酸序列，強調可變區(粗體)和CDR區(加下標線)。在表1中提供胺基酸序列和各種經強調部分的相對應序列鑑認子。
圖5顯示將VH和VL序列與相對應之經重組的生殖種系序列排成一直線。藉著粗體Kabat編號指出CDR區，並藉著粗體加下標線之正文指出體細胞的高度突變。(A)16F16 IgG4 H鏈；(B)16F16 IgG4 L鏈；(C)16F31 IgG4 H鏈；(D)16F31 IgG4 L鏈；(E)MS IgG4 H鏈；(F)MS IgG4 L鏈；(G)21F2 IgG4 H鏈；(H)21F2 IgG4 L鏈。SEQ ID NO:27-30分別相當於經重組之VH3_21/D3-9/JH4、VK Ⅰ_L15/JK2、VH3_20/D3-10/JH6和VKⅢ_A27/JK3，且SEQ ID NO:60-63分別相當於經重組之VH4_59//JH3、VK Ⅲ_A27/JK1、VH5_51/D3_10_R3/JH4和VKⅢ_L6/JK1。
圖6顯示配位體-(MICA-)結合被典型的人類抗-NKG2D抗體阻斷，藉著與在融合瘤上清液中之抗體預培養阻斷配位體結合而證實。輪廓代表背景，灰色代表沒有預-培養的配位體結合，而黑色虛線代表有預-培養的配位體結合。
圖7顯示在分析各種濃度之經重組表現並純化之完整人類抗-hNKG2D抗體(16F16、16F31、MS和21F2；IgG4同型物)時獲得的劑量-反應曲線，得到IC50和完全阻斷1微克MICA-mFc結合所需的劑量。
圖8顯示藉著與含有16F16之融合瘤上清液的預-培養，完全阻止了ON72對NKG2D的NKG2D-結合。輪廓代表背景，灰色代表沒有預-培養的ON72-結合，且黑色虛線代表有預-培養的ON72-結合。
圖9顯示完整人類抗-hNKG2D抗體阻斷後續之鼠類抗-hNKG2D抗體對NKG2D結合的能力，或反之亦然。(A)16F16：與經重組表現並純化之16F16(0.3微克；IgG4同型物)預-培養，阻止ON72(0.3微克)與NKG2D結合。逆轉培養順序，顯示與ON72(0.3微克)預-培養，僅阻止了85%經重組表現並純化之16F16的IgG4同型物(0.3微克)的結合，顯示NKG2D的一些部分仍可用以與完整人類抗體結合，暗示至少有部分與被ON72結合之抗原決定基不同的抗原決定基。抗體149810僅證實對經重組表現並純化之16F16(IgG4同型物)有大約50%的交叉-抑制，當分別以1:1(0.3微克，0.3微克)和3:1(1微克，0.3微克)抗體濃度的149810對16F16測試時，再度可能顯示與在NKG2D上之抗原決定基結合的差異。使用下列的培養和偵測組合：偵測沒有(a)或有(b)16F16預-培養的ON72；偵測沒有(c)或有(d)ON72預-培養的16F16；偵測沒有(e)或有(f)16F16(0.3微克)預-培養的149810(0.3微克)；偵測沒有(g)或有(h)149810預-培養(0.3微克)的16F16；偵測沒有(i)或有(j)16F16預-培養(0.3微克)的149810(1微克)；偵測沒有(k)或有(1)149810預-培養(1微克)的16F16(0.3微克)；16F16偵測(0.3微克)。(B)MS：培養0.1微克鼠類抗-hNKG2D抗體，有或無與0.1微克MS抗體預-培養，接著以抗-小鼠抗體偵測，使用流動式細胞測量術。將沒有與MS預-培養的0.1微克ON72、1D11或149810之培養標準化成100%，並分別在(a)、(c)和(e)中出示。分別在(b)、(d)和(f)中出示與0.1微克MS培養30分鐘，接著是ON72、1D11或149810的培養和偵測。與MS之預-培養分別抑制了98%、88%和96.5%的ON72、1D11和149810之NKG2D結合，暗示至少有一些抗體具有類似的抗原決定基。(C)21F2：偵測有(a)或沒有(b)與21F2預-培養的ON72結合；偵測有(c)或沒有(d)與21F2預-培養的1D11結合；以及偵測有(e)或沒有(f)21F2的149810結合(所有抗體均為0.1微克)。
圖10顯示以ON72和從原始融合瘤中純化之16F16抗體染色恆河猴或食蟹獼猴(cyno)細胞。(A)cyno NK細胞，(B)cyno CD8+T細胞，(C)恆河猴NK細胞，和(D)恆河猴CD8+T細胞。該值代表結合的平均螢光強度(mean fluorescent intensity，MFI)，在這裡已經扣除了二級抗體單獨結合的MFI。在任一物種中均未觀察到任何對CD4+T細胞的結合。
圖11顯示在不同的抗體濃度下，人類抗體MS對在周圍血液單核細胞(perifieral blood mononuclear cells，PBMCs)中之人類或食蟹獼猴CD8-陽性細胞的結合，證實對人類和食蟹獼猴NKG2D的親和力是類似的。
圖12顯示添加配位體-阻斷性抗體，(ON72或經重組表現並純化之16F16(IgG4同型物))，在51 Cr-釋放測定中，以劑量-依賴性之方式阻斷了NK-誘導之殺死表現MICA之目標細胞的作用。
圖13顯示經重組表現並純化之16F16和16F31(兩者皆為IgG4同型物)能夠以劑量-依賴性之方式，抑制攜帶MICA(A)和ULBP3(B)兩者之目標細胞(BaF/3)被NK-92細胞殺死的作用，對在0.8微克/毫升下的兩種配位體而言，被16F16幾乎完全阻斷，並在兩種配位體20微克/毫升的最高測試劑量下，被16F31部分阻斷。
圖14顯示經重組表現並純化之MS、21F2和16F16(全都是IgG4同型物)能夠抑制NK-介導之殺死表現配位體之目標細胞的作用。(A)藉著MS或21F2抑制NK-92細胞殺死ULBP3-BaF/3細胞。(B)藉著MS或16F16抑制NKL細胞殺死BaF/3-MICA細胞。
圖15顯示抗體-誘導之細胞-表面NKG2D的降低，使用以NKG2D和DAP10轉染的BaF/3細胞。該圖顯示與對照組(在沒有抗-NKG2D抗體隔夜培養之後的細胞表面NKG2D受體=100%)相比較，在與ON72(1微克)或經重組表現並純化之人類抗體16F16(1微克；IgG4同型物)或16F31(3微克；IgG4同型物)隔夜培養之後，仍維持在細胞表面之NKG2D受體的百分比。
圖16顯示MS抗體-誘導之細胞-表面NKG2D的降低，使用以NKG2D和DAP10(根據圖15執行)(A)或新近從周圍血液製備之人類NK細胞(B)轉染的BaF/3細胞。在(B)中，在人類血清的存在下培養人類NK細胞隔夜，以模仿在血液中出現IgGs的狀態，並改變MS抗體的濃度。甚至在最低濃度下，相當於大約60%的在類似條件下在NKG2D+NK細胞上，在結合測定中測量到之受體飽和，達到最大的向下調節。
圖17顯示以所指定之21F2抗體濃度，在隔夜培養之後，在人類NK細胞上細胞-表面NKG2D的降低百分比。
圖18顯示在所指定之時間點，ON72、MS和21F2在人類血液試樣中之不同類型的細胞中，對表面-提交之NKG2D的影響。每個抗體的濃度均為0.1微克/毫升。雖然無意受理論限制，但在實驗中降低表面-提交之NKG2D可能代表NKG2D的內化。圖(A)到(C)分別顯示表現NKG2D之NK細胞、CD8+T細胞和δγT細胞的抗體-誘導之NKG2D內化。MS和21F2結果比ON72更少地降低表面所結合之NKG2D。
圖19顯示測試經固定MS和ON72對T細胞增殖之激動劑影響的測定之結果，使用兩種不同次優劑量的CD3，以允許共同-刺激。(A)[CD3]=0.1毫微克/毫升；(B)[CD3]=0.3毫微克/毫升。藉著CFSE稀釋，在按照指示以經固定抗體刺激3天，接著是IL-2刺激四天的PBMC族群中，評估T細胞增殖。納入CD28刺激作為共同-刺激的陽性對照組。對於MS，沒有偵測到任何明顯的激動劑影響，而ON72卻在T細胞增殖方面有低但顯著的影響。
圖20敘述與抗-NKG2D抗體(MS或hzON72)之Fab片段或與MICA配位體複合的hNKG2D二聚體之3-維重疊表示法。以表面表示法出示hNKG2D同二聚體(‘NKG2D’)，其中一個單體具有比另一個更黑的顏色。以黑色管狀表示Fab片段(分別為‘MS’和’hzON72’)，並以淺色圖解二級結構表示法之形式來表示MICA(‘MICA’)。(A)、(B)hNKG2D/MS Fab和hNKG2D/MICA結晶複合體結構的疊加(Li等人Nat Immunol 2001;2:443-451；PDB-碼1HYR，使用共同hNKG2D分子的C-α-原子作為模板)。MICA和MS兩者均以不對稱之方式與NKG2D二聚體結合，(A)和(B)顯示當與NKG2D-二聚體結合時，兩個配位體分子之兩種可能的相對結合取向。在重疊計算hNKG2D的兩種取向時，在MICA和MS Fab之間有相當大的部分重疊，證實MS Fab阻斷MICA與hNKG2D受體結合的能力。參見實施例11。(C)hNKG2D/hzON72 Fab和hNKG2D/MICA複合體結晶結構的疊加。hNKG2D的每個單體分別被hzON72 Fab結合。在hNKG2D的重疊計算中，hzON72抗體亦與MICA結合位置有相當大的部分重疊，顯示hzON72可阻斷MICA與hNKG2D的結合。參見實施例12。
圖21顯示針對在兩個hNKG2D單體單元之序列(SEQ ID NO:2)中的MS Fab(A)、hzON72 Fab(B)和MICA分子(C)，在hNKG2D二聚體的每個NKG2D單體單元之序列(SEQ ID NO:2)中的抗原決定基殘基。認為與結晶結構配位體原子之距離在4.0內的NKG2D殘基是結合性抗原決定基的一部分，並加下標線。加雙重下標線的殘基涉及與配位體的氫-鍵結合。(A)在hNKG2D二聚體中之hNKG2D單體單元1和2上，與單一MS Fab結合的抗原決定基。將結晶術之單體N和C混入NKG2D單體單元1中，並將結晶術的單體M和D混入NKG2D單體單元2中。在單體單元2中，Lys 150側鏈原子Nζ僅涉及在兩個在結晶術上無關的複合體之一中的氫-鍵結合。亦參見表9-12。(B)與2個同時與hNKG2D單體單元1和2結合之hzON72 Fab個別結合的抗原決定基。Trp 166涉及在一個在結晶術上無關之分子複合體中的氫-鍵結合(在複合體中一個hzON72 Fab分子與一個hNKG2D單體結合)，但距離太遠而不能與另一個以氫-鍵結合。參見表14-15。(C)在hNKG2D單體單元1和2上與MICA結合的抗原決定基。MICA顯示與hNKG2D二聚體不對稱地結合，並因此可能以相對於MS-Fab的兩種取向結合。可簡單地藉著2單體單元表示法的互換，獲得MICA的第二個取向。
圖22以表面表示法出示hNKG2D分子，其中一個單體具有比另一個更黑一點的顏色。與其等各自之結晶結構MS/hzON72/MICA Fab原子距離在4.0以內的NKG2D原子為黑色，並以MS Fab(A)、兩個hzON72 Fab(B)和MICA(C)和(D)表示。因為MICA和MS Fab兩者均以不對稱之方式與NKG2D二聚體結合，故對NKG2D之相對結合取向可能有所不同。在圖中指出此事，在(C)和(D)中顯示相對於MS，MICA之兩種可能的相對結合取向。亦參見表9-12和14-15。

Claims (11)

  1. 一種經分離之單株抗體或其抗原-結合片段，其與人類NKG2D(hNKG2D)結合，且當將其加至表現NKG2D之NK或T細胞時，與不超過兩個hNKG2D二聚體交聯，其中該抗體或抗原-結合片段包括：a.包括SEQ ID NO：48之序列的重鏈可變區CDR1；b.包括SEQ ID NO：49之序列的重鏈可變區CDR2；和c.包括SEQ ID NO：50之序列的重鏈可變區CDR3；及，d.包括SEQ ID NO：51之序列的輕鏈可變區CDR1；e.包括SEQ ID NO：52之序列的輕鏈可變區CDR2；和f.包括SEQ ID NO：53之序列的輕鏈可變區CDR3。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原-結合片段，其當與在hNKG2D二聚體中的第一個hNKG2D單體結合時，會阻斷該抗體或抗原-結合片段與第二個hNKG2D單體的結合。
  3. 如申請專利範圍第2項之抗體或抗原-結合片段，其在hNKG2D二聚體中之第一和第二個hNKG2D單體上的溶劑-排除面積之比例為大約2：1或更高。
  4. 如申請專利範圍第1或3項之抗體，其為人類或經人類化的。
  5. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原-結合片段，其與參考抗體競爭對hNKG2D的結合，其中該參考抗體包括：包括SEQ ID NO：44之序列的重鏈可變區和包括SEQ ID NO：45之序列的輕鏈可變區。
  6. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原-結合片段，其與包括SEQ ID NO：2之Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207或Thr 208、或其任何組合之抗原決定基結合。
  7. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原-結合片段，其包括抗原互補位(paratope)，該抗原互補位包括相當於SEQ ID NO：44之Gln 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98或Asp 99，或SEQ ID NO：45之Tyr 33或Trp 97、或其任何組合之殘基。
  8. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原-結合片段，其包括：包括SEQ ID NO：44之序列的重鏈可變區和包括SEQ ID NO：45之序列的輕鏈可變區。
  9. 一種產生抗-NKG2D抗體或其抗原-結合片段的方法，其包括在適當的條件下培養宿主細胞(其包括編碼如申請專利範圍第1或8項之抗體或抗原-結合片段的核酸)，並回收該抗體或其抗原-結合片段。
  10. 一種如申請專利範圍第1或8項之抗體或抗原-結合片段之用途，其係用來製備藉由降低或抑制hNKG2D-介導的NK或T細胞活化以治療發炎性或自體免疫病症的醫藥品，其中該醫藥品係投予至患有發炎性或自體免疫病症的人類個體或處於發炎性或自體免疫病症的風險下之人類個 體，且其中該發炎性或自體免疫病症係由增加的NK及/或T細胞活性引起或以增加的NK及/或T細胞活性為特徵。
  11. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該發炎性或自體免疫病症為類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythomatosus，SLE)、牛皮癬(psoriasis)、乳糜瀉(celiac disease)、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、克隆氏症(Crohn’s disease)、移植排斥或移植-對-宿主-疾病(graft-versus-host-Disease)。
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