TWI467015B

TWI467015B - 用於多醣膠泥形式物之標的基因之剔除

Info

Publication number: TWI467015B
Application number: TW95103912A
Authority: TW
Inventors: Nancy E Harding; Yamini Patel
Original assignee: Cp Kelco Us Inc
Priority date: 2005-02-04
Filing date: 2006-02-06
Publication date: 2015-01-01
Also published as: US9422567B2; CN103087970B; WO2006096269A2; AR052111A1; CN103087940B; CN103087970A; CN101501213A; US8716003B2; TW200641124A; CN103087941B; US20110281334A1; CN101501213B; US10351858B2; WO2006096269A3; US7888333B2; US9845476B2; US20130203153A1; AR103092A2; CN103087941A; US20170002367A1

Description

用於多醣膠泥形式物之標的基因之剔除

[相關申请案之交叉參考]

本申請案主張於2005年2月4日提出申請之美國臨時申請案第60/649,559號之權利。

本發明係關於鞘多醣生產領域。具體而言，其係關於用於改進產鞘胺醇膠菌株之定點基因方法。

鞘胺醇單胞菌菌株(例如ATCC 53159及ATCC 31461)可產生大量莢膜多醣。雖然在某些情形下多醣可自細胞釋放[5、6]，但在具有豐富碳源的生長期間(例如在發酵中)多醣會牢固地附著至細胞表面。人們試圖提高代坦膠及結蘭膠之發酵生產能力的嘗試可能會受限於多醣之莢膜特性，從而會影響營養物質之吸收。此外，若多醣生物合成位點之數量受到限制，則可由各個細胞產生的多醣就可能會存在一最大量。經觀察，多醣結蘭膠參與細胞聚集，因為不產生任何多醣之突變體可在懸浮液中均勻生長[3]。該等細胞聚集可能會妨礙某些技術，例如藉由光密度來測定細胞數量，離心細胞以(例如)分離DNA或蛋白質及分離或溶解細胞以純化多醣。

在鞘胺醇單胞菌中，多醣至細胞表面之附著機理及將多醣附著至細胞表面所涉及之基因先前均未確定。已分離出可產生膠泥形式多醣的鞘胺醇單胞菌菌株之誘導突變體ATCC 31461、ATCC 31555、ATCC 31554及ATCC 21423，但尚未確定突變基因，且未揭示誘導及選擇該等突變體之方法[10]。業已分離出用於生物合成結蘭膠[3、8]、代坦膠[1]及鞘胺醇膠S－88[9]之基因。該等基因之很多功能係藉由生化試驗或藉由與數據庫(例如基因庫(GenBank))中已知功能之基因之同源性來確定。舉例而言，已鑑別出參與裝配四糖重複單元之基因[7、8]及參與合成前體dTDP－L－鼠李糖之基因[3、9]。人們預期僅影響多醣附著至細胞表面之基因仍將具有多醣產生表現型(即在固體培養基及黏性肉湯上之黏液狀菌落)。

Harding N.E.,Y.N.Patel及R.Coleman(2004.Organization of genes required for gellan polysaccharide biosynthesis inSphingomonas elodea ATCC 31461.J Ind Microbiol Biotech 31：70－82,參考文獻3)闡述了一用於結蘭膠生物合成的含18個基因且跨越21 kb之簇以及4個不在該簇中的用於結蘭膠合成之基因。該等DNA序列於2003年6月保存於基因庫中(登錄編號係AY217008)。在該簇中的基因中包括gelM 、gelN 及gelI 。構建一含有大部分相鄰基因gelM 及gelN 之剔除。基因gelI 藉由插入失活。gelM －gelN 剔除菌株及gelI 突變體顯示可產生數量稍微降低的結蘭膠及更具流動性之肉湯，且產生的結蘭膠顯示具有與來自野生型菌株之結蘭膠相同的組成。未報導多醣對細胞之附著。

伊樂藻鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas elodea)gelR 、gelS 及gelG 基因似乎在一操縱子中與在S－88 sps基因簇中呈同樣順序，但並不與該18個基因之簇中之基因相鄰(參考文獻3)。GelR 蛋白質稍微小於其具有49%同一性的S－88同係物(659對670個胺基酸)，且與表層蛋白質及其他膜蛋白具有同源性。GelR 、gelS 及gelG 基因之DNA序列於2003年6月保存於基因庫中(登錄編號係AY220099)。在該報導中未構建gelR 突變(參考文獻3)。Yamazaki等人報導在基因spsR中具有突變的菌株仍係黏液樣，此表明其產生多醣但該多醣不具有流變性或附著至細胞之特徵([9]及T.J.Pollock等人，DNA segments and methods for increasing polysaccharide production.美國專利第5,854,034號)。

Yamazaki闡述四株可產生膠泥狀而不是附著至細胞形式之多醣之鞘胺醇單胞菌菌株經典突變體(美國專利第6,605,461號)。Yamazaki未闡述怎樣篩選膠泥表現型的誘變培養物。Yamazaki未鑑別哪一個基因或哪一些基因發生了突變。

Sa－Correia綜述了在分離用於結蘭膠合成之基因方面所作的工作(Sa－Correia I.,A.M.Fialho,P.Videira,L.M.Moreira,A.R.Marques及H.Albano.2002.Gellan gum biosynthesis in Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461:Genes,enzymes and exopolysaccharide production engineering.J Ind Microbiol Biotechnol.29:170－176)。Sa－Correia闡述了包括urf32 及urf26 (＝上述參考文獻3中之gelM 及gelN )在內的某些基因之部分定序。該等基因之完整序列於2003年4月保存於基因庫中(基因庫登錄編號係AY242074)。未報導該等基因之功能。在基因庫呈遞中，僅分別將基因urf32 及urf26 命名為推定的膜蛋白及推定的運輸蛋白質。未保存gelI 或gelR 之序列。

Coleman闡述用於代坦膠生物合成之基因之分離及某些基因功能之研究(R.Coleman,2001,Cloning and analysis of Sphingomonas sp.ATCC 53159 polysaccharide genes.Master's Thesis,San Diego State University)。其中闡述了由Coleman命名為orf3 及orf4 的dpsM 及dpsN 基因，但未指出其功能。

Yamazaki M.、L.Thorne、M.Mikolajczak、R.W.Armentrout及T.J.Pollock(1996.Linkage of genes essential for synthesis of a polysaccharide capsule in Sphingomonas strain S88.J Bacteriol 178：2676－2687及美國專利第5,854,034號)闡述了用於生物合成來自鞘胺醇單胞菌菌株ATCC 31554之S－88多醣之基因簇。未闡述基因urf32 和urf26(dpsM 、gelM 及dpsN 、gelN 之同係物)及spsI(gelI 、dpsI 之同係物)之功能。基因spsR(gelR 、dpsR 之同係物)被描述為可編碼一與細菌及真菌多醣裂解酶絕少相似的蛋白質。該等DNA序列保存於基因庫中(登錄編號係U51197)。

在此項技術中仍需要改進製造工業上有用之鞘胺醇膠之方法及該等鞘胺醇膠之性質。

本發明之一實施例提供一種製造一細菌之方法。該細菌係鞘胺醇單胞菌屬，且在一或更多選自由鞘多醣生物合成基因簇之基因M、N、I或R組成之群之基因中包含一突變。在某些出版物(例如參考文獻8及9)中亦將M及N基因分別稱為基因urf32 、urf26 (對於未知閱讀框)。已分離出鞘胺醇單胞菌屬之一第一細菌之基因組DNA片段。該片段包含鞘多醣生物合成基因簇之所有或部分基因M及/或N或I或R。於該片段中誘導突變，以形成經突變片段。將該經突變片段引入鞘胺醇單胞菌屬之第二細菌中。該第二細菌包含鞘多醣生物合成基因簇之野生型基因M 及/或N 或I或R。分離出該第二細菌之後代，其中該經突變片段已併入基因組中且取代該第二細菌之鞘多醣生物合成基因簇之野生型基因M 及/或N 或I或R。該鞘胺醇單胞菌細菌可係或可不係伊樂藻鞘胺醇單胞菌。

本發明之另一實施例提供了另一種製造鞘胺醇單胞菌屬細菌之方法，該細菌在一或更多選自由該鞘多醣生物合成基因簇之基因M 、N 、I 或R 組成之群之基因中包含一突變。已分離出鞘胺醇單胞菌屬之一第一細菌之兩個非鄰接基因組DNA片段。該等片段位於鞘多醣生物合成基因簇之基因M 及N 之側面或包括該等基因M 及N 。相似地，可分離出基因I或基因R之側翼片段。將此兩個非鄰接的片段連接在一起。將該等經連接的非鄰接片段引入鞘胺醇單胞菌屬之第二細菌中。該第二細菌包含鞘多醣生物合成基因簇之野生型基因M 及/或N 或I或R。分離出該第二細菌之後代，其中該經連接片段已整合於基因組中且取代該第二細菌之鞘多醣生物合成基因簇之野生型基因M 及/或N 或I或R。該鞘胺醇單胞菌細菌可係或可不係伊樂藻鞘胺醇單胞菌。

本發明之再一實施例提供了一種組合物。該組合物包含一天然結蘭膠多醣，其凝膠強度較同等重量的來自莢膜菌株之天然結蘭膠為高。

本發明之又一實施例提供了一種組合物。該組合物包含一代坦膠多醣，其與菌株ATCC 53159產生的同等重量代坦膠相比可賦予流體更高之黏性。

本發明之另一實施例提供了一種經分離及純化的鞘胺醇單胞菌屬細菌。該細菌在一或更多選自由鞘多醣生物合成基因簇之基因M 、N 、I 及R組成之群之基因中包含一剔除。該細菌可在適於產生鞘多醣之條件下於一培養基中進行培養以在該培養基中產生鞘多醣。該細菌之肉湯培養物可直接或用乙醇沉澱後用作增黏劑或膠凝劑。或者，該肉湯培養物在作為增黏劑或膠凝劑或自該肉湯回收之前先經受一自該肉湯培養物除去細菌之程序。該鞘胺醇單胞菌細菌可係或可不係伊樂藻鞘胺醇單胞菌。

彼等熟習此項技術者可在閱讀該說明書後明瞭該等及其他可為此項技術提供新穎方法、菌株及用於製作增黏劑及膠凝劑之組合物的實施例。

在兩株鞘胺醇單胞菌菌株中鑑別了可控制多醣至細菌細胞之附著之基因。剔除基因gelM(dpsM) 及gelN(dpsN) 中之一或兩者或使基因gelI 失活將導致多醣呈膠泥狀釋放至培養基中而不是作為莢膜多醣附著至細胞表面。形成膠泥形式之多醣可容易地處理細菌培養物、改進發酵期間之混合、可提高產量並在某些情形下改進多醣之流變性。定點誘變由於許多原因(包括速度及可避免無關突變)而優於隨機誘變且有利於篩選膠泥形成突變體。人們發現，基因gelR 之失活可改進膠泥形式結蘭膠多醣之流變性(凝膠強度)。

在任一鞘胺醇單胞菌菌株中皆可使dpsM 、dpsN 、gelM 、gelN 及gelI 之同源物失活以得到膠泥形成表現型。可使gelR 同源物失活以防止多醣降解，從而改進流變性。適宜的鞘胺醇單胞菌包括但不限於彼等製造鼠李糖膠(ATCC 31961)、韋蘭膠(welan )(ATCC 31555)、結蘭膠(ATCC 31461)及代坦膠(ATCC 53159)者及製造多醣S7(ATCC 21423)、S88(ATCC 31554)、S198(ATCC 31853)及NW11(ATCC 53272)之菌株。該等ATCC號係指菌株於American Type Culture Collection之保存號。該等之實例係伊樂藻鞘胺醇單胞菌ATCC 31461及鞘胺醇單胞菌屬ATCC 53159，但亦可使用其他菌株。可使用的適宜鞘胺醇單胞菌包括Sphingomonas adhaesiva 、Sphingomonas aerolata 、Sphingomonas alaskensis 、水生鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas aquatilis) 、溶芳烴鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas aromaticivorans) 、不解糖鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas asaccharolytica) 、橙色鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas aurantiaca) 、莢膜紅鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas capsulata) 、五氯酚分解鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas chlorophenolica) 、Sphingomonas chungbukensis 、陰溝鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas cloacae) 、蝟形鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas echinoides) 、伊樂藻鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas elodea) 、乾草鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas faeni) 、Sphingomonas herbicidovorans 、朝鮮鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas koreensis) 、Sphingomonas macrogoltabidus 、馬里鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas mali) 、甜瓜鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas melonis) 、游泳池鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas natatoria) 、Sphingomonas parapaucimobilis 、少動鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis) 、Sphingomonas pituitosa 、桃李鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas pruni)、玫瑰鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas rosa) 、血鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas sanguinis) 、鞘胺醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.) 、Sphingomonas stygia 、Sphingomonas subarctica 、Sphingomonas suberifaciens 、Sphingomonas subterranea 、Sphingomonas taejonensis 、土地鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas terrae) 、楚氏鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas trueperi) 、Sphingomonas ursincola 、Sphingomonas wittichii 、Sphingomonas xenophaga 、Sphingomonas yabuuchiae 及Sphingomonas yanoikuyae 。同源物可在一鞘胺醇膠生物合成基因簇之基因定位及組織基礎上、在總同源性基礎上及/或在區域同源性基礎上來鑒定。通常，與dpsM 、dpsN 、gelM 、gelN 、gelI 或gelR 基因之一之間的總同源性水平將大於44%，經常大於55%、66%、77%、88%或98%。較佳地，一同源物與該等四個基因至少之一之間具有大於80%之同源性。

定點誘變可用於在一期望的已知標的基因或基因組區域產生突變。此可消除隨機誘導的誘變或自發誘變之反覆試驗特性。剔除之形成可確保突變不會回復，舉例而言，如點(置換)突變及插入突變可能會出現的那樣。剔除亦具有不使用外源DNA(例如抗藥性標記物或其他環境不期望之標記物)之益處。

包含鞘胺醇膠生物合成基因簇之M 及/或N 、I 或R 或側翼DNA之經分離基因組DNA片段係未連接至其通常所連接的基因組DNA之DNA。經分離DNA可藉由例如但不限於自天然來源純化、藉由合成或藉由擴增得到。經分離DNA通常位於體外DNA之一片段上，但經分離DNA亦可位於一載體上，例如一質粒或轉導噬菌體，其含有鞘胺醇單胞菌基因組之期望部分。側翼DNA通常來自緊鄰M 及/或N 、I 或R 且位於該等基因之約500 bp之內或該等基因之約1－2 kb之內的基因組區域。

可使用任何在此項技術中習知之方法將一突變引入至一包含鞘胺醇膠生物合成基因簇之所有或部分基因M 及/或N 、I 或R 之經分離片段。舉例而言，可使用限制性核酸內切酶並再連接前面的非鄰接核苷酸來引入一剔除。藉由擴增及連接該等基因之兩個非鄰接片段或標的基因側翼DNA的兩個非鄰接片段可形成一剔除。使用核酸內切酶消化及連接可於一經分離片段中導入一插入。在一經分離基因組DNA片段上可使用化學誘變。可根據具體情形選擇及使用任何誘變方法。

在誘導突變後，可將該基因組DNA片段重新引入至一受體細菌中。通常(但並非必定)該受體與該片段供體係同一種屬。可使用任何在此項技術中習知之方法將外源DNA引入至一細菌中。適宜的方法包括但不限於電穿孔、接合、原生質體形成、氯化鈣沉澱及轉化、脂質體及病毒轉導。可根據具體情形選擇及使用任何核酸引入方法。

若引入至該受體細菌的突變基因組DNA片段不能複製自身，則其為了得到維持必須整合於該受體細菌之一複製子中。通常此一整合事件將整合整個引入的質粒。吾人可檢測所引入DNA上之一標記物以鑒定該DNA已整合。為了檢測該整合物之分離，吾人可篩選或選擇在所引入DNA上失去一標記物。可達成該目的適宜標記物在此項技術中眾所周知，且若實際情況允許則可使用任何一種標記物。舉例而言，為測定其中鞘胺醇膠基因之引入型式取代受體中野生型型式之分離物，可藉由PCR測定該DNA之大小或序列。

如下文所證明，藉由(舉例而言)一鞘胺醇膠生物合成基因簇之基因M 及/或N 突變體產生的膠泥形式鞘胺醇膠與其附著至細菌細胞之形式相比具有改良之流變性質。此等改良流變性質反映在相同重量的物質能夠提供更高黏力。此改良之程度可較低，例如至少5%、10%、15%、20%或25%，或其可更加顯著，與可形成莢膜的親代產生的鞘胺醇膠相比具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%之改良。流變性質可使用任何在此項技術中已知之技術來量測。適宜的技術包括但不限於在自來水溶液中量測低剪切率黏性("LSRV")及在高鹽溶液中量測海水黏性("SWV")。

藉由(例如)一gelN 突變體產生的膠泥形式之結蘭膠與一推定的裂解酶基因gelR 中之突變之組合可形成高凝膠強度結蘭膠。該凝膠強度通常大於1000，而莢膜菌株通常產生一具有700至900但小於1000之凝膠強度之結蘭膠。

本發明之經純化細菌係彼等使用(例如)液體稀釋技術或在固體培養基上劃線形成單菌落而經微生物學純化者。在微生物學技術中眾所周知之標準技術皆可用於該目的。

本發明之突變體可用與親代菌株相同或相似之技術來培養及生長。可改進該等突變體之液態培養物性質，從而允許增強通氣及混合。突變體之肉湯培養物亦可提供較附著形式多醣更為高效的回收。另外，該等突變體亦可提供相對於附著形式多醣具有改良澄清度之產物。視需要可藉由過濾、離心或藉由沉降將細菌自突變體所產生的多醣中除去。若希望，可在除去細菌之前或之後對該肉湯培養物進行化學、酶法或熱法(熱或冷)處理。

來自與結蘭膠附著至細胞表面有關之伊樂藻鞘胺醇單胞菌ATCC 31461的基因係gelM 及gelN (圖1；SEQ ID NO：13)及gelI (圖1；SEQ ID NO：25)。具有大部分基因gelM 及gelN 之剔除之菌株業經建構，由此獲得膠泥形成表現型。gelN 之特定剔除及基因gelI 之插入業經建構。該等兩個突變可產生膠泥形成表現型。gelM 及gelN 之編碼序列係分別位於SEQ ID NO：13之501至1382及1366至2064位之核苷酸。所編碼胺基酸序列分別示於SEQ ID No：16及15。GelI 之編碼序列係位於SEQ ID NO：25中之501至1403位之核苷酸。所編碼胺基酸序列示於SEQ ID NO：26。已發現，基因gelR 之剔除可使膠泥形式結蘭膠之凝膠強度增加。gelR 之編碼序列係位於SEQ ID NO：27中之478至2457位之核苷酸。所編碼胺基酸序列示於SEQ ID NO：28。來自鞘胺醇單胞菌屬ATCC 53159與代坦膠附著至細胞表面有關之基因係dpsM 及dpsN (圖1；SEQ ID NO：14)，且基於與gelI 相似性推定為dpsI 。各基因dpsM 及dpsN 之剔除業經建構，且兩者皆可產生膠泥形成表現型。dpsM 及dpsN 之編碼序列係分別位於SEQ ID NO：14中之456至1337位及1321至2019位之核苷酸。所編碼胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：18及17中。

彼等熟習此項技術者將明瞭用於結蘭膠合成之相同或相似方法亦可用於代坦膠合成。因此，可易於構建基因dpsI 及dpsR 中之突變。dpsI 之編碼序列係分別位於SEQ ID NO：29中之501至1472位之核苷酸。所編碼胺基酸序列示於SEQ ID NO：30中。dpsR 之編碼序列係位於SEQ ID NO：31中之501至2498位之核苷酸。所編碼胺基酸序列示於SEQ ID NO：32中。

上述揭示內容概述了本發明。本文揭示的所有參考文獻皆明確地以引用方式併入本文中。藉由參考下述具體實例可得到更加完整的理解，本文提供的該等實例僅用於闡釋目的而非意欲限制本發明之範圍。

實例1－產生結蘭膠膠泥形成突變體

為構建伊樂藻鞘胺醇單胞菌之突變體，使用一命名為S60wtc¹ 的ATCC 31461衍生菌株，其具有改良之DNA吸收。熟習此項技術者易於製得該菌株。使用PCR擴增來擴增gelM －gelN 基因之側翼區域。見參考文獻3。將該等擴增片段選殖至pLO2載體並藉由結合引入至S60wtc以藉由雙交叉同源重組取代基因組上含有剔除的gelM 及gelN 基因。載體pLO2不能於S60wtc中複製，因此對卡那黴素抗性之初始選擇係選擇彼等其中質粒已藉由同源重組整合至染色體中之菌落。該載體亦含有基因sacB 。該基因可賦予蔗糖敏感性。因此，對蔗糖之選擇可用於檢測已失去該質粒且保留剔除或野生型基因之一個拷貝之分離株。

將含有gelM －gelN 剔除區域之質粒藉由三親本結合配對引入S60wtc，使用pRK2013以提供傳遞功能，且在YM－鏈黴素(25微克/毫升)－卡那黴素(7.5微克/毫升)培養基中選擇轉化結合子。鏈黴素阻止大腸桿菌(E.coli)菌株生長。分離出抗卡那黴素質粒整合體。蔗糖敏感性用於選擇排除該載體之第二重組事件。使5株分離株在非選擇條件(即無抗生素)下傳代2次。然後將等份試樣在8%蔗糖培養基上劃平板。分離出抗蔗糖菌落且測試卡那黴素敏感性。分離出基因組DNA且用PCR測定保留有該剔除之Km^s 分離株。由來自4個菌株之基因組DNA產生一預期大小剔除的擴增片段。在YM培養基上純化該等4個剔除菌株。與野生型相比4株皆表現出較少黏液、更軟、更扁平及更深的黃色。

¹ 伊樂藻鞘胺醇單胞菌ATCC 31461對DNA具有較低的吸收效率，尤其係對大質粒(約10^－ ⁷ )。已分離出具有較高DNA吸收效率之ATCC 31461自發突變體。認為彼等少數可作為質粒(例如廣宿主範圍質粒pLAFR3)之良好受體之細胞係對該質粒DNA具有較高吸收能力的受體群體中之突變體。為允許該質粒之失去，使三株含有pLAFR3之轉化結合子在非選擇條件(即無四環素抗生素)下連續傳代約30代生長。測試三株獨立的經質粒處理之菌株(即來自各初始轉化結合子之四環素敏感衍生菌株)，且三株全體皆表現出結合頻率增加(4.2 X 10^－ ³ 、0.6 X 10^－ ² 及1.5 X 10^－ ² )，其與該野生型菌株相比呈現出105倍之增加。該增加的結合頻率係穩定的且可重現。該等菌株之一被命名為S60wtc。見參考文獻3。

實例2－鑒定gelM －gelN 剔除菌株

在搖瓶發酵中評估gelM －gelN 剔除分離株。△gelM －gelN 肉湯培養物與更為固態黏稠之S60wtc肉湯相比係流態且光滑的。用異丙醇沉澱可自突變體菌株產生比S60wtc纖維更長、更粗之纖維。然而，該等剔除突變體之可沉澱總物質產量減少22%且僅具有野生型肉湯黏性之30%。所產生的結蘭膠具有普通的糖類及甘油基及乙醯基取代基組成。

使用若干種技術(包括顯微鏡評估、細胞聚集、細胞沉澱形成及熱沉降測試)評估該等突變體之膠泥形成特性，如圖2所示。

熱沉降測試由下述組成：在高壓釜中加熱結蘭膠肉湯10分鐘以融化結蘭膠，然後將該熱肉湯轉移至一較大試管中且在95℃(以使肉湯保持液態)溫育過夜。對於一莢膜菌株來說，該等細胞附著至多醣上且保持懸浮。對於膠泥形式物而言，該等細胞無附著且在過夜溫育過程中沉降。藉由該測試可顯示gelM －gelN 剔除菌株係膠泥形式物。

實施離心測試時，使該等菌株在含有1%葡萄糖的DM2培養基中過夜生長，且在Eppendorf離心機中以最大速度離心。gelM －N 基因之失活使多醣完全失去對細胞表面之附著從而該等細胞可藉由離心沉澱。

藉由顯微鏡評估可知，大部分S60wtc△gelM －N 細胞係游離的且能活動，而S60wtc卻係在膠狀基質中。在細胞培養物中，S60wtc△gelM －N 細胞懸浮生長而S60wtc細胞形成聚集體。

² 伊樂藻鞘胺醇單胞菌ATCC 31461對DNA具有較低的吸收效率，尤其係對大質粒(約10^－ ⁷ )。已分離出具有較高DNA吸收效率之ATCC 31461自發突變體。認為彼等少數可作為質粒(例如廣宿主範圍質粒pLAFR3)之良好受體之細胞系對該質粒DNA具有較高吸收能力的受體群體中之突變體。為允許該質粒之失去，使三株含有pLAFR3之轉化結合子在非選擇條件(即無四環素抗生素)下連續傳代約30代生長。測試三株獨立的經質粒處理之菌株(即來自各初始轉化結合子之四環素敏感衍生菌株)，且三株全體皆表現出結合頻率增加(4.2 X 10^－ ³ 、0.6 X 10^－ ² 及1.5 X 10^－ ² )，其與該野生型菌株相比呈現出10⁵ 倍之增加。該增加的結合頻率係穩定的且可重現。該等菌株之一被命名為S60wtc。見參考文獻3。

實例3－構建結蘭膠膠泥形成突變體

為結蘭膠生物合成構建一gelN 剔除。PCR引物經設計以擴增gelN 基因上游(500 bp)及下游(401 bp)之DNA片段[3]。所用引物示於表1中。

引物SacI－GelN引物1及XbaI－GelN引物2用於擴增一來自gelM基因的500 bp片段作為一SacI －XbaI 片段(共516 bp)。引物XbaI－GelN引物3及SphI－GelN引物4用於擴增一來自atrD 基因的401 bp片段作為一Xbal －SphI 片段(共418 bp)。因為gelM 基因末端覆蓋了gelN 基因起始端17 bp，因而保留了gelM 之終止密碼子及gelN 之起始密碼子以及gelN 之天然終止密碼子。隨後將PCR片段依序連接至質粒載體pLO2之多位點接頭中[4]，得到帶有gelN 剔除之純係pLO2－gelN deln#1。

然後藉由結合及同源重組使用質粒pLO2－gelN deln#1將該剔除轉入菌株S60wtc³ 中。菌株S60wtc係一衍生自ATCC 31461之菌株，其係具有增加的質粒DNA吸收能力之自發突變體[2]。藉由卡那黴素抗性選擇一染色體整合體。隨後在缺乏抗生素情況下生長大約30代以切除質粒。由於失去編碼質粒之sacB 基因，因此可藉由蔗糖(8%)耐受性選擇失去該質粒之重組體，然後篩選出卡那黴素敏感菌落。sacB 基因編碼一種用於自蔗糖合成果聚糖之酵素果聚糖蔗糖酶。果聚糖對細胞有毒性。失去sacB 基因之細胞可在蔗糖中生長。蔗糖耐受分離株可係野生型或剔除。自幾株分離株製備基因組DNA以鑒定與野生型基因相比彼等保留gelN 剔除之分離株，如藉由PCR所測定。帶有gelN 剔除之分離株與野生型gelN ＋分離株之堅硬菌落相比具有較柔軟更稀薄之菌落。

³ 關於具有增加之DNA吸收能力之突變體之用途，見腳註1。

實例4－鑒定gelN 剔除突變體

gelN 剔除突變體具有與gelM －gelN 剔除突變體相似之性質。細胞易於離心沉澱。在細胞培養物中，gelN 剔除突變體懸浮生長，而野生型細胞形成聚集體。因此，gelN 基因之失活可產生膠泥表現型，如圖3所示。

在搖瓶發酵中評估5株單獨的gelN 剔除突變體分離株。gelN 突變體之平均產量(可沉澱總物質，TPM)(1.10克/100毫升)與S60wtc對照之產量(1.08克/100毫升)相當。使用含有有機及無機氮、鹽及玉米漿之培養基在20公升Applikon發酵罐中評估選擇出的gelN 突變體。用異丙醇沉澱結蘭膠多醣、乾燥並稱重。突變體之可沉澱總物質之平均產量係野生型對照的94%，然而，肉湯黏性降低約40%。該肉湯黏性之降低可有利於發酵罐中之混合。

在Brookfield LVF黏度計中使用4號轉予以60 rpm量測黏度。

實例5－構建產生具有改進品質之結蘭膠膠泥之突變體

結蘭膠膠泥突變體具有較低肉湯黏性，如實例4所闡述，此有利於發酵罐中之混合。結蘭膠多醣在加熱及冷卻後形成一凝膠，且由於結蘭膠具有獨特構造及流變性質而用於各種食品應用中。因此，評估了由膠泥突變體產生的結蘭膠之凝膠強度。該凝膠強度係使用一柱塞測試一已製備凝膠表面之斷裂來測定。

將結蘭膠發酵肉湯調節至pH 4.6(以防止脫醯作用)，且藉由加熱至約100℃幾分鐘進行巴斯德滅菌。藉由加入3倍體積的異丙醇來沉澱結蘭膠產物，且將該等纖維在60℃乾燥2小時並磨碎。

藉由於一去皮重的600毫升不銹鋼燒杯中將2毫升0.3 M CaCl₂ ．2H₂ O母液加入至295毫升去離子水中來製備鈣溶液。邊以700 rpm攪拌該溶液邊加入3.0克結蘭膠產物，且使其分散1至2分鐘。將該燒杯置於一預熱至94至95℃之水浴中保持4分鐘，蓋上蓋子並加熱15分鐘，然後攪拌3分鐘。用加熱的去離子水將溶液重量調節至300克，混合後於94至95℃靜置。將溶液轉移至6個環形模(高0.5英吋，外徑1.375英吋，壁厚0.125英吋)中且用一塑料蓋板蓋上，並使其在室溫(20至21℃)下冷卻20至24小時。將圓盤自該模移至一有機玻璃板上。於一帶有一Kobe柱塞的TA－TX2結構分析儀(TA－19)中以1.0毫米/秒測定凝膠強度或斷裂力(以克/平方公分記錄)。

來自膠泥突變體之結蘭膠具有較來自野生型莢膜菌株之結蘭膠為低之凝膠強度，如表4所示。該結果與產生膠泥形式代坦膠之突變體ATCC 53159相反，膠泥形式代坦膠具有改進的流變性，如實例11所述。人們認為很可能膠泥形式之結蘭膠可藉由結蘭膠裂解酶(其由伊樂藻鞘胺醇單胞菌產生)降解。因此，構建了具有基因gelR 之剔除之菌株，其產生一與多醣降解蛋白質(例如裂解酶)具有同源性之蛋白質。

在伊樂藻鞘胺醇單胞菌菌株S60wtc及菌株GBAD－1中構建了gelR 剔除(美國專利申請案第20060003051號[11])。PCR引物經設計以擴增gelR 基因上游(502 bp)及下游(435 bp)之DNA片段。所用PCR引物示於表3中。

引物SacI－GelR引物1及XbaI－GelR引物2用於擴增一gelR 上游之498 bp片段作為一SacI －XbaI 片段(共502 bp)。引物XbaI－GelR引物3及SphI－GelR引物4用於擴增一gelR 下游之419 bp片段作為一XbaI －SphI 片段(共435 bp)。用限制性酶消化該等PCR片段並隨後連接至質粒載體pLO2之多位點接頭中[4]，得到帶有gelR 剔除之純係pLO2－gelR deln#1。

然後使用提供轉移功能之輔助質粒pRK2013藉由結合將不能於鞘胺醇單胞菌中複製之質粒pLO2－gelR deln#1自大腸桿菌DH5α轉入伊樂藻鞘胺醇單胞菌菌株S60wtc及GBAD－1中[2]。藉由卡那黴素抗性於含卡那黴素及鏈黴素之YM培養基上選擇染色體整合體(以反選擇大腸桿菌)。隨後在缺乏抗生素情況下讓該等鞘胺醇單胞菌整合體生長大約30代以切除該質粒。由於已失去編碼質粒之sacB 基因，因此可藉助蔗糖耐受性選擇失去該質粒之重組體，並篩選卡那黴素敏感菌落。使用PCR檢測保留該gelR 剔除之分離株。

然後將gelN 剔除轉入至GBAD－1菌株之gelR 剔除突變體中，如上述實例3所述。質粒pLO2－gelN deln#1用於藉由結合及同源重組將該gelN 剔除轉入至GBADgelR中。藉由卡那黴素抗性於含卡那黴素(20微克/毫升)及鏈黴素(25微克/毫升)之YM瓊脂上選擇一染色體整合體。隨後在缺乏抗生素情況下生長以切除該質粒。由於已失去編碼質粒之sacB基因，因此可藉助蔗糖耐受性選擇失去該質粒之重組體，然後篩選卡那黴素敏感菌落。

該等gelR 剔除突變體展現不同於野生型菌株之菌落形態。該等gelR 剔除菌株與S60wtc或GBAD－1之gelR ＋的具有透明邊緣的較大光滑黏性菌落相比具有較小的粗糙黏性菌落。該等gelN －gelR 剔除突變體具有與gelN 膠泥突變體相似之菌落形態。

實例6－鑒定gelN －gelR 突變體

使用含有有機及無機氮、鹽及玉米漿之培養基在20公升Applikon發酵罐中評估該等菌株。用異丙醇沉澱結蘭膠多醣、乾燥並稱重。凝膠強度藉由實例5所述方法測定。GBAD－1gelNgelR 菌株產生出凝膠強度較產自gelN 膠泥突變體或野生型莢膜菌株之結蘭膠為高之結蘭膠。

實例7－構建gelI 突變體

在基因gelI 中構建一插入突變。PCR引物經設計用以擴增該gelI 基因之一內部片段(見參考文獻3)。將該擴增片段選殖至pLO2質粒載體中，並藉由結合引入至S60wtc中，在YM－鏈黴素(25微克/毫升)－卡那黴素(7.5微克/毫升)培養基上實施選擇。用卡那黴素抗性選擇來選擇彼等已藉由同源重組將該質粒插入gelI 基因由此使該基因失活之轉化結合子。該gelI 突變體具有經改變之菌落形態，其與gelM －gelN 及gelN 剔除菌株之菌落形態相似，即黏液樣但較軟之菌落。

實例8－鑑定gelI 突變體菌株

在搖瓶發酵中評估gelI 突變體。該突變體與野生型菌株相比具有較少肉湯黏性，且減少約20%之可沉澱總物質產量。產生的結蘭膠具有普通的糖類及甘油基及乙醯基取代基組成(參考文獻3)。

如上所述，使用幾種技術(包括顯微鏡評估、細胞聚集、細胞沉澱形成及熱沉降測試)來評估該gelI 突變體之膠泥形成特徵。gelI 插入突變體具有與gelM －gelN 及gelN 剔除突變體相似之特徵。顯微鏡評估顯示該等細胞係游離的且能活動。在細胞培養物中，gelI 突變體懸浮生長而不會形成聚集體。細胞容易藉由離心從DM2培養基沉澱。細胞在熱沉降測試中亦能很好沉降。因此，gelI 基因中之突變亦可產生膠泥表現型，如圖3所示。

實例9－製造代坦膠泥形成突變體

鞘胺醇單胞菌屬ATCC 53159(S－657)可產生一種具有與結蘭膠結構相似之結構之多醣(代坦膠)(即其具有葡萄糖－葡糖醛酸－葡萄糖－鼠李糖重複單元)，但其具有由兩個鼠李糖殘基連接至一個葡萄糖殘基形成之側鏈。代坦膠具兩個乙醯基取代基，且缺乏甘油基。代坦膠在油田及水泥應用中係作為增黏劑。鞘胺醇單胞菌菌株可在莢膜牢固附著至細胞表面時產生多醣。附著之確切機理尚不清楚。莢膜可藉由減少氧氣吸收來限制生產率。多醣之功能性可因其附著至細胞而不是游離於溶液中而受到阻礙。

菌株構建：

吾人構建了鞘胺醇單胞菌屬ATCC 53159之相應基因dpsM 及dpsN 之剔除，該菌屬可產生代坦膠(S－657)。每一基因皆經獨立剔除且測定其對莢膜至膠泥之影響。簡言之，使用PCR擴增兩個與標的基因側翼DNA同源之片段。將該等片段選殖於一不能在鞘胺醇單胞菌中複製且含有兩個選擇性標記物kan ^R 及sacB 的窄宿主範圍質粒pLO2中。用卡那黴素抗性選擇來選擇其中質粒已整合於一個同源區域之染色體中之細胞。然後讓該抗卡那黴素菌株在非選擇條件下生長以藉由第二次重組使該質粒失去。藉由蔗糖耐受來選擇質粒失去。sacB 基因編碼一種用於自蔗糖合成果聚糖之酵素果聚糖蔗糖酶。果聚糖對細胞具有毒性。因此，失去sacB 基因之細胞可在蔗糖中生長。該等蔗糖耐受分離株可係野生型或剔除。剔除之存在可藉由PCR來證實。測試突變體是產膠泥還是產莢膜。在最終菌株中不存在外源DNA、質粒或抗生素抗性基因。

dpsN 及dpsM 剔除菌株之詳細構建

在一質粒中構建dpsM 及dpsN 之剔除，且使用與闡述用於伊樂藻鞘胺醇單胞菌剔除突變體相似之基因取代策略將其轉入ATCC 53159基因組中[3]。使用PCR擴增標的基因側翼的DNA區域，然後將該等片段選殖於質粒pLO2中[4]，其隨後用於將該剔除與染色體中之標的基因交換。所用PCR引物示於表5中。將用於選殖的限制性位點(以斜體表示)加入至引物末端。

剔除構建經設計以使其餘用於代坦膠合成之基因保持完好。對於dpsN 剔除而言，引物SacI－DpsN引物1及XbaI－DpsN引物2用於擴增一來自dpsM 基因之497 bp片段作為一SacI －XbaI 片段(共513 bp)。引物XbaI －DpsN 引物3及SphI－DpsN引物4用於擴增一來自atrD 基因之396 bp片段作為一XbaI －SphI 片段(共413 bp)。因為該dpsM 基因末端覆蓋了dpsN 基因之起始端17 bp，故保留了dpsM 之終止密碼子及dpsN 之起始密碼子以及dpsN 之自然終止密碼子。因此，該構建可形成一含13個胺基酸的小肽，如圖2所示。隨後將該等PCR片段依序連接至質粒載體pLO2之多位點接頭中[4]，得到帶有dpsN 剔除的純係pLO2－dpsNdeln#3。

使用一提供轉移功能之輔助質粒pRK2013藉由結合將不能於鞘胺醇單胞菌中複製之質粒pLO2－dpsNdeln#3自大腸桿菌DH5α轉入鞘胺醇單胞菌菌株ATCC 53159中[2]。藉由卡那黴素抗性於含7.5微克/毫升卡那黴素及25微克/毫升鏈黴素之YM培養基上選擇染色體整合體(以反選擇大腸桿菌)。隨後在缺乏抗生素情況下讓該等鞘胺醇單胞菌菌株生長大約30代以切除該質粒。由於已失去編碼該質粒之sacB 基因，故可藉助蔗糖(8%)耐受性選擇失去該質粒之重組體，然後篩選卡那黴素敏感菌落。自幾種分離株製備基因組DNA以鑑別彼等與野生型基因相比保留有dpsN 剔除之分離株，如藉由PCR所測定。

同樣地，構建一dpsM 之剔除。引物SacI－DpsM引物1及XbaI－DpsM 引物2用於擴增來自dpsE 基因之474 bp片段作為一SacI －XbaI 片段(共490 bp)。引物XbaI－DpsM引物3及SphI－DpsM引物4用於擴增來自dpsN 基因之509 bp片段作為一XbaI －SphI 片段(共525 bp)。因為該dpsM 基因末端覆蓋了dpsN 基因之起始端17 bp，故可保留dpsM 之終止密碼子及dpsN 之起始密碼子。將一終止密碼子納入XbaI選殖位點。可自該dpsM 起始位點形成一7胺基酸肽。隨後將該等PCR片段依序連接至質粒載體pLO2之多位點接頭中[4]，得到帶有dpsM 剔除的純係pLO2－dpsMdeln#1。藉由結合將該質粒轉入至ATCC 53159以選擇抗卡那黴素整合體，接著在缺乏抗生素時生長並檢測具有蔗糖耐受性的卡那黴素敏感重組體。自選擇的重組體分離出基因組DNA且藉由PCR篩選剔除之存在。

實例10－鑒定代坦膠泥形成突變體

幾種測試結果表明dpsM 及dpsN 剔除二者皆可產生一自莢膜形式物至膠泥形式物之變化，如圖3及4所示。

1.在高碳發酵培養基中生長約16小時的兩株dpsN 剔除突變體(#3及#5)及兩株dpsM 剔除突變體(#1及#5)之顯微鏡評估表明，來自該等突變體之細胞不會形成可表徵鞘胺醇單胞菌莢膜菌株S－657之特性的較大細胞聚集物(圖3A及圖4A)。

2.於含1%葡萄糖的確定培養基(DM2)中生長24小時且經稀釋10倍的野生型ATCC 53159細胞形成可見之聚集體，而dpsM 及dpsN 膠泥突變體形成類似於非黏液菌株DPS1的均勻懸浮液(圖3C針對dpsN )。

3.在含1%葡萄糖的DM2培養基中生長24小時的培養物之離心表明，來自dpsM 及dpsN 膠泥突變體之細胞可沉澱，而彼等來自野生型ATCC 53159(S－657)之細胞保持附著至多醣且因此並不沉澱(圖3B及圖4B)。

在搖瓶發酵中，6株獨立的dpsN 剔除突變體分離株與野生型對照相比表現出可沉澱總物質平均增加5.4%。使用含有有機及無機氮、鹽及不同碳濃度(3至5%)之培養基在20公升Applikon發酵罐中評估所選的dpsN 及dpsM 突變體。用異丙醇沉澱多醣、乾燥並稱重。該等dpsN 突變體與該野生型莢膜對照菌株相比一致表現出可沉澱總物質稍有增加。該等dpsM 突變體產生更為多變且通常更低之生產率，如表6所示。

實例11－鑒定代坦膠泥形式多醣

測定藉由異丙醇沉澱自該等發酵液回收的代坦膠之流變性質，如表7所示。dpsM 及dpsN 膠泥突變二者可改良代坦膠之黏性。

亦可觀察到膠泥突變體之纖維品質(例如長度)得到改進。因為該等多醣分子游離於溶液中而不是附著至細胞表面，因此可有利於沉澱該等分子。

低剪切率黏性量測

低剪切率黏性係在3 rpm時0.25%代坦膠溶液之黏性。藉由將10克NaCl及1.47克CaCl₂ ．2H₂ O溶於10公升去離子水中來製備標準或合成自來水。直接於一400毫升高筒燒杯中稱量4.5克聚乙二醇(PEG)200。稱量一0.75克等份試樣代坦膠產物，且使其分散於該PEG 200中形成一勻一漿液。將299毫升合成自來水加入至該燒杯且以800±20 rpm攪拌該混合物大約4小時。自攪拌臺上移走該燒杯且置於25℃水浴中，並使其靜置30分鐘。使用一配有2號轉子之Brookfield LV黏度計中以3 rpm量測該黏度。

海水黏性量測

用下面的程序測定海水黏性。藉由在每980克去離子水中溶解41.95克海鹽(ASTM D－1141－52,來自Lake Products公司，Maryland Heights,Missouri)並根據需要用HCl或NaOH將pH調節至8.2來製備海水溶液。將307克海水溶液轉移至一混合杯中；經15至30秒將0.86克代坦膠產物緩慢加入至該混合杯中，且使其以11,500 rpm於9B5型Fann多混合器(Fann Instruments公司，Houston TX)中混合45分鐘。加入三滴Bara消泡劑(NL Baroid/NL Industries公司，Houston,TX)且繼續攪拌額外30秒。從混合器上移走該混合杯，且將其浸入冷凍水以降低該流體之溫度，然後置於25℃恒溫浴中。將該溶液轉移至一400毫升高筒燒杯中。

在低速(3 rpm)混合的同時量測Fann黏度(Fann黏度計，35A型)。自刻度盤讀出剪切應力值並記錄為3 rpm時之SWV值。

亦在Brookfield LV D V－II或DV－II黏度計中用LV－2C轉子測定黏度。以0.3 rpm量測0.06/秒之讀數。

實例12－材料及方法

培養基每公升YM含有3克酵母抽提物、5克蛋白腖、3克麥芽抽提物及10克葡萄糖。每公升DM2培養基含有2.68克K₂ HPO₄ 、1.31克KH₂ PO₄ 、2.0克NH₄ SO₄ 、0.1克MgSO₄ ．7H₂ O、15毫克CaCl₂ .2H₂ O、8.34毫克FeSO₄ ．7H₂ O、0.05毫克MnCl₂ .4H₂ O、0.03毫克CoC1₂ ．6H₂ O、0.8毫克CuSO₄ ．5H₂ O、0.02毫克Na₂ MoO₄ ．2H₂ O、1.0毫克ZnSO₄ ．7H₂ O、0.2毫克H₃ BO₃ 及10克葡萄糖。每公升結蘭膠搖瓶發酵培養基含有0.23克NaCl、0.165克CaCl₂ ．2H₂ O、2.8克K₂ HPO₄ 、1.2克KH₂ PO₄ 、1.9克NaNO₃ 、1.0克N－Z－胺型EKC(Sheffield Products)、36.46克Star－Dri玉米漿、2.5毫克FeSO₄ ．7H₂ O、24微克CoCl₂ ．6H₂ O及0.1克MgSO₄ ．7H₂ O。

膠泥之離心測試。菌株在30℃下於含有1%葡萄糖的DM2培養基中以350 rpm振搖生長大約24小時，然後在Eppendorf離心機中以最大速度(10,000 rpm)離心5分鐘。

熱沉降測試。菌株在結蘭膠搖瓶發酵培養基中生長。將發酵肉湯在高壓釜中加熱10分鐘以液化結蘭膠。然後將該熱肉湯轉移至一較大試管中且使其在95℃(以使肉湯保持液態)沉降過夜。對於一莢膜菌株來說，細胞將附著至多醣且保持懸浮。對於膠泥形式物而言，細胞無附著且在過夜溫育過程中沉澱。

PCR擴增。吾人使用來自Stratagene(LaJolla，CA)之高保真PCR酵素「PfuUltra熱啟動DNA聚合酶」。

圖1鞘胺醇單胞菌菌株ATCC 31554、ATCC 31461及ATCC 53159中用於多醣生物合成之基因簇之比較。

圖2 S60WTCgelM －gelN 突變體之膠泥形成特徵。

圖3 S60WTCgelN 及gelI 突變體之膠泥形成特徵。

圖4dpsN 剔除位點處之DNA序列(SEQ ID NO：19)及該融合肽之胺基酸序列(SEQ ID NO：20)。

圖5A－5CdpsN 突變體之膠泥形成特徵。

圖6A－6BdpsM 突變體之膠泥形成特徵。

【參考文獻】

所引用的每一參考文獻之揭示內容皆明確地以引用方式併入本文中。

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Claims

一種製造包含失活突變(inactivating mutation)之鞘胺醇單胞菌屬(Sphingomonas) 細菌之方法，該突變係於一或多個選自由來自伊樂藻鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas elodea )菌株ATCC 31461之基因gelM-gelN 、gelM 、gelN 、gelN-gelR 或gelI 或來自鞘胺醇單胞菌屬菌株ATCC 53159之基因dspM-dspN 、dspM 或dspN 組成之群之基因中，該方法包括：分離鞘胺醇單胞菌屬之第一細菌之基因組DNA片段，其中該片段包含一或多個選自由基因gelM-gelN 、gelM 、gelN 、gelN-gelR 、gelI 、dspM-dspN 、dspM 或dspN 之基因之全部或一部分；在該片段中誘導失活突變作用，以形成經突變片段；將該經突變片段引入至該鞘胺醇單胞菌屬之第二細菌中，其中該第二細菌包含一或多個選自由基因gelM-gelN 、gelM 、gelN 、gelN-gelR 、gelI 、dspM-dspN 、dspM 或dspN 組成之群之野生基因；分離該第二細菌之後代，其中該經突變片段已併入該基因組中，且已取代一或多個選自由基因gelM-gelN 、gelM 、gelN 、gelN-gelR 、gelI 、dspM-dspN 、dspM 或dspN 組成之群之野生基因；且其中該突變有助於膠泥形式(slime form)多醣之生產。
如請求項1之方法，其中該基因組DNA片段係藉由擴增作用分離之。
如請求項1之方法，其中該基因組DNA片段係藉由合成作用分離之。
如請求項1之方法，其中該基因組DNA片段係藉由自基因組DNA純化而分離。
一種製造包含失活突變之鞘胺醇單胞菌屬細菌之方法，該突變係於一或多個選自由來自伊樂藻鞘胺醇單胞菌菌株ATCC 31461之基因gelM-gelN 、gelM 、gelN 、gelN-gelR 或gelI 或來自鞘胺醇單胞菌屬菌株ATCC 53159之基因dspM-dspN 、dspM 或dspN 組成之群之基因中，該方法包括：分離該鞘胺醇單胞菌屬之第一細菌之基因組DNA的兩個非鄰接片段，其中該等片段位於該一或多個選自由基因gelM-gelN 、gelM 、gelN 、gelN-gelR 、gelI 、dspM-dspN 、dspM 或dspN 組成之群之基因之兩側或包括該一或多個選自由基因gelM-gelN 、gelM 、gelN 、gelN-gelR 、gelI 、dspM-dspN 、dspM 或dspN 組成之群之基因；將此兩個非鄰接片段連接在一起；將該等經連接的非鄰接片段引入至該鞘胺醇單胞菌屬之第二細菌中，其中該第二細菌包含該一或多個選自由基因gelM-gelN 、gelM 、gelN 、gelN-gelR 、gelI 、dspM-dspN 、dspM 或dspN 組成之群之野生基因；分離該第二細菌之後代，其中該經連接片段已併入該基因組中，且已取代該第二細菌之該一或多個選自由基因gelM-gelN 、gelM 、gelN 、gelN-gelR 、gelI 、dspM- dspN 、dspM 或dspN 組成之群之野生基因；且其中該突變有助於膠泥形式多醣之生產。
如請求項5之方法，其中該等基因組DNA片段係藉由擴增作用分離之。
如請求項5之方法，其中該等基因組DNA片段係藉由合成作用分離之。
如請求項5之方法，其中該等基因組DNA片段係藉由自基因組DNA純化而分離。
一種包含代坦膠(diutan)多醣之組合物，該代坦膠多醣相對於菌株ATCC 53159產生的等量代坦膠能賦予流體增強之黏性，其中該代坦膠係來自突變鞘胺醇單胞菌株ATCC 53159，該突變鞘胺醇單胞菌株於dpsN及dpsM基因之任一或兩者上有剔除突變。
如請求項9之組合物，其中該增強之黏性較菌株ATCC 53159至少高30%至90%。
如請求項9之組合物，其中該突變鞘胺醇單胞菌株所生產之代坦膠包含比野生型鞘胺醇單胞菌株ATCC 53159所自然生產之代坦膠更長之纖維。
如請求項9之組合物，其中代坦膠由鞘胺醇單胞菌株ATCC 53159之變異株所生產，其中該變異株已經基因工程剔除dpsN基因之表現。
如請求項9之組合物，其中代坦膠由鞘胺醇單胞菌株ATCC 53159之變異株所生產，其中該變異株已經基因工程剔除dpsM基因之表現。
如請求項9之組合物，其中代坦膠由鞘胺醇單胞菌株ATCC 53159之變異株所生產，其中該變異株已經基因工程剔除dpsM及dpsN兩個基因之表現。
一種包含剔除之經分離及經純化之鞘胺醇單胞菌屬細菌，該剔除係於一或兩個選自由來自伊樂藻鞘胺醇單胞菌菌株ATCC 31461之基因gelM-gelN 、gelM 、gelN 、gelN-gelR 或gelI 或來自伊樂藻鞘胺醇單胞菌菌株ATCC 53159之基因dspM-dspN 、dspM 或dspN 組成之群之基因中，其中該剔除有助於膠泥形式多醣之生產。
如請求項15之細菌，其中該膠泥形式多醣係代坦膠。
如請求項15之細菌，其中該膠泥形式多醣係結蘭膠(gellan)。
如請求項15之細菌，其中該細菌不含外源性DNA。
一種產生膠泥形式多醣之方法，其包括：在適於產生鞘多醣之條件下，於培養基中培養如請求項15之細菌，藉此在該培養基中產生鞘多醣。
如請求項19之方法，其進一步包括以下步驟：將該膠泥形式多醣與培養基中之細菌分離。
如請求項20之方法，其中該分離步驟係藉由離心作用實施。
如請求項20之方法，其中該分離步驟係藉由沉降作用實施。
如請求項20之方法，其中該分離步驟包括用鹼處理該培養基。
如請求項20之方法，其中該分離步驟為包括用酵素處理該培養基之物理分離。
如請求項19之方法，其中該膠泥形式多醣係代坦膠。
如請求項19之方法，其中該膠泥形式多醣係結蘭膠。
一種肉湯培養物(culture broth)，包含如請求項15之細菌。
如請求項27之肉湯培養物，其中該肉湯培養物已經行自該肉湯培養物除去細菌之程序。
一種製造包含失活突變之鞘胺醇單胞菌屬細菌之方法，該突變係於鞘多醣生物合成基因簇之基因gelR 或dpsR 中，該方法包括：分離該鞘胺醇單胞菌屬之第一細菌之基因組DNA片段，其中該片段包含該鞘多醣生物合成基因簇之基因gelR 或基因dpsR 之全部或一部分；在該片段中誘導失活突變，以形成經突變片段；將該經突變片段引入至該鞘胺醇單胞菌屬之第二細菌中，其中該第二細菌包含該鞘多醣生物合成基因簇之野生型基因gelR 或dpsR ；分離該第二細菌之後代，其中該經突變片段已併入該基因組中，且已取代該第二細菌之該鞘多醣生物合成基因簇之野生型基因gelR 或dpsR 。
一種製造包含失活突變之鞘胺醇單胞菌屬細菌之方法，該突變係於鞘多醣生物合成基因簇之基因gelR 或dpsR 中，該方法包括：分離該鞘胺醇單胞菌屬之第一細菌之基因組DNA片段，其中該片段位於該鞘多醣生物合成基因簇之基因gelR 或基因dpsR 之兩側或包括該鞘多醣生物合成基因簇之基因R ；將該片段引入至該鞘胺醇單胞菌屬之第二細菌中，其中該第二細菌包含該鞘多醣生物合成基因簇之野生型基因gelR 或dpsR ；分離該第二細菌之後代，其中該片段已併入該基因組中，且已取代該第二細菌之該鞘多醣生物合成基因簇之野生型基因gelR 或dpsR 。
如請求項29或30之方法，其中該等基因組DNA片段係藉由擴增作用分離。
如請求項29或30之方法，其中該等基因組DNA片段係藉由合成作用分離。
如請求項29或30之方法，其中該等基因組DNA片段係藉由純化自基因組DNA分離。
一種經分離及純化之鞘胺醇單胞菌屬細菌，其包含基因gelR 或dspR 之剔除。
一種產生鞘多醣之方法，其包括：在適於產生鞘多醣之條件下，於培養基中培養如請求項34之細菌，藉此在該培養基中產生鞘多醣。
如請求項35之方法，其中該鞘多醣係結蘭膠。
如請求項36之方法，其中該結蘭膠相對於野生型鞘胺醇單胞菌株ATCC 31461所天然產生之結蘭膠具有增強之膠強度。
如請求項35之方法，其中該鞘多醣係代坦膠。
如請求項38之方法，其中該代坦膠係膠泥形式多醣。
如請求項38之方法，其中該代坦膠相對於野生型鞘胺醇單胞菌株ATCC 53159所天然產生之代坦膠具有改良之流變性質。
如請求項29或30之方法，進一步包括將莢膜形成菌株轉變為膠泥形成突變株之第二基因突變、插入或剔除。
如請求項41之方法，其中該莢膜形成菌株轉變為膠泥形成突變株之第二基因突變、插入或剔除係位於基因gelN 或dpsN 。
一種肉湯培養物(culture broth)，包含如請求項34之細菌。