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TWI454261B - 作為治療劑之色酮類 - Google Patents

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TWI454261B
TWI454261B TW097100698A TW97100698A TWI454261B TW I454261 B TWI454261 B TW I454261B TW 097100698 A TW097100698 A TW 097100698A TW 97100698 A TW97100698 A TW 97100698A TW I454261 B TWI454261 B TW I454261B
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Description

作為治療劑之色酮類
本發明大致上關於色酮類及新穎之色酮組成物的鑑定及分離，該色酮及色酮組成物可有效地增加由脂肪細胞所製造之脂締素及調節涉及脂肪酸生物合成作用、粒腺體脂肪酸β －氧化作用、類固醇生物合成作用、糖質新生作用、脂肪轉運、PPARα /RXRα 肝臟訊號傳導及異質物之代謝作用的基因。本發明包括用於預防及治療抗胰島素症、葡萄糖不耐症、高血糖症、代謝症候群、血脂異常及高三酸甘油脂血症之方法。
肥胖、糖尿病及代謝症候群已快速成為全球之流行病。根據世界衛生組織(WHO)之文獻，2005年約有40億成人為肥胖族，預計在2015年前有超過70億成人將成為肥胖族。肥胖為許多慢性病(包括心血管疾病及糖尿病)之主要風險因子。
代謝症候群首先由Reaven於1988(Reaven(1988)Diabetes 37：1595一1607)中說明其為一連串交互關連之常見的臨床疾病，包括肥胖、抗胰島素症、葡萄糖不耐症、高血壓及血脂異常(高三酸甘油脂血症及低HDL膽固醇量)。國家膽固醇教育計劃之成人治療小組Ⅲ(ATP Ⅲ)於2001年建立診斷代謝症候群之標準(JAMA(2001)285：2486－249797)。由ATP Ⅲ選擇5種標準以鑑定患有代謝症 候群(包括：腹部肥胖、空腹葡萄糖損傷、高三酸甘油脂(TG)、低HDL膽固醇(HDL－C)濃度及血壓增加)之個體。若個體中出現上述構成要素中之任三種則診斷其具有代謝症候群。代謝症候群盛行於全世界並較任何其個別構成要素與動脈粥狀硬化心血管疾病之高風險更具相關性。
第三國家健康及營養檢查評估(the Third National Health and Nutrition Examination Survey)(1988-1994)對8814位超過20歲的男性及女性進行的數據分析揭露代謝症候群之未調整及年齡經過調整的代謝症候群盛行率分別為21.8%及23.7%。利用2000個人口普查數據查出約有4700萬名美國住民患有代謝症候群(Ford et al.(2002)JAMA 16：359)。在肥胖之兒童及青少年中，隨著肥胖之嚴重性增加，代謝症候群之盛行率很高且在嚴重肥胖之年輕人中達到50%(Weiss et al.(2004)”Obesity and the metabolic syndrome in children and adolescents.”N Eng J Med 350：2362－2374)。這些年輕人早已出現有害之心血管結果風險增加的生物標誌。代謝症候群及其個別之構成要素不僅只在肥胖族群中找到，亦可在正常體重及稍微過重之個體中找到。
明顯的證據暗示抗胰島素症為代謝症候群之問題根源(Reaven GM.(1998)Diabetes 37：1595－1607)。在調整種族或種族特點及肥胖程度後，代謝症候群之盛行率隨著抗胰島素症增加而顯著增加(趨勢，P <0.001)(Weiss et al.(2004)"Obesity and the metabolic syndrome in children and adolescents." N Eng J Med 350：2362－2374。抗胰島素症為一種對胰島素之正常循環濃度反應性降低的形態(Saltiel AR(2000)J Clin.Invest.106：163－164)及第2型糖尿病之抗胰島素症的主要病原。抗胰島素症與肥胖、生活型態因子及遺傳因子有關(Kadowaki T(2000)J Clin.Invest.106：459-465；Stern M(2000)J Clin.Invest.106：323－327)。動物研究清楚證明胰島素受體及胰島素訊號傳導通路之遺傳缺陷涉及第2型糖尿病之病因。例如：在胰島素受體被剔除之小鼠的肌肉、肝臟和脂肪組織中明顯見到胰島素作用不足。這些小鼠亦顯示高胰島素血症及嚴重之糖尿病。具有增加之PI3激醣(PI3K)活性(其為胰島素信號轉導串聯反應之關鍵訊號傳導酶)的小鼠顯示出由於骨骼肌肉及脂肪細胞中之葡萄糖轉運增加而增加胰島素敏感性及低血糖(Kadowaki T(2000)J Clin.Invest.106：459－465)。類似地，缺乏Akt2(PI3K之激酶下游)之小鼠顯示出抗胰島素症減輕及肌肉葡萄糖轉運增加(Cho et al.2001 Science 292：1728)。
最近有很多關於抗胰島素症及糖尿病之遺傳基礎和生理學的人體研究。在PPAR γ2－特異性(specofoc)B外顯子中帶有部分“功能喪失”Pro12Ala突變之個體具有低BMI、高胰島素敏感性及改良之脂質變化形廓的組合(Deeb et al.(1998)Nat Genet 20：284-287；Alhuler et al.(2000)Nat Genet 26：76－80)。Pro12Ala多形性之生理學結果主要取決於混雜之遺傳和環境因子。帶有 Pro115Gln功能增加突變之個體為極端肥胖及胰島素敏感(Ristow et al.(1998)N Engl J Med 339：953－959)，此在刺激脂肪細胞分化中與PPARγ之作用一致。另一方面，顯性負突變(dominant－negative mutations)(諸如Pro495Leu、Val318Met、Phe388Leu及Arg425Cys)係與部分皮下脂肪萎縮、嚴重抗胰島素症、糖尿病及高血壓有關(Savage et al.(2003)Diabetes 52：910－917：Agawal and Garg(2002)J Clin Endocrinol Metab 87：408－411)。
人類遺傳疾病，年青人成年型糖尿病(MODY)之特徵為25歲前出現糖尿病臨床首發症狀(其為體染色體顯性之遺傳模式)且主要缺陷在胰臟β細胞之功能中。現已鑑定出六種MODY基因：MODY1，肝細胞核因子－4α(HNF－4α)；MODY2，葡萄糖激酶；MODY3，HNF－1α ；MODY4，胰島素啟動子因子－1(IPF－1)；MODY5，HNF－1β；及MODY6，β－細胞E－匣反式激活蛋白(E－box transactivator)或NeuroD1(Fajans et al.(2001)N Engl J Med 345：971)。MODY1基因涉及胰臟β細胞中導致β細胞功能障礙之異常基因表現及葡萄糖代謝作用。
第2型糖尿病為複雜而異質之多因子疾病。稀少之MODY單基因型雖然可提供關於糖尿病病理生理學之資訊，但無法掌握人類糖尿病病原學之範圍。許多基因體研究團體係使用人類全基因組掃描，在不同之易感種族中利用遺傳多形性來研究糖尿病及抗胰島素症之基因位點(McIntyre and Walker(2002)Clin Endocrinol 57：303)。染 色體15上之鈣蛋白酶－10基因為首先在德州之墨裔美人族群中利用人類全基因組掃描252組手足配對所鑑定出之基因。臨床研究暗示鈣蛋白酶－10為影響胰島素對肌肉組織之作用及自胰臟β 細胞分泌胰島素的因子之一。在缺乏鈣蛋白酶－10之小鼠中進行之研究暗示鈣蛋白酶－10在分泌胰島素之胰臟β 細胞中傳介由脂肪酸誘導之細胞凋亡(Horikawa et al(2000)Nat Genet 26：163；Weedon et al.(2003)Am J Hum Genet 73：1208)。對人類糖尿病基因之研究還有很長的路，而在染色體16上之FTO為最近之發現。具未知功能之FTO與BMI有關且在共39,000位之多種不同的糖尿病研究群體中獲得確認(Kaiser(2007)Science 316：185)。另外，藉由候選基因之相關研究亦發現KCNJ11(β 細胞ATP敏感性鉀道之內向整流次單位)及HNF－4α基因為NIDDM基因(Taylor(2007)Diabetes 56：2844)。
游離脂肪酸(FFA)可能為抗胰島素症之病理生理學中最重要的因子。耶魯大學之Shulman團隊在臨床研究中使用非侵入性核磁共振光譜分析，利用13 C、31 P及1 H同位素來追蹤肌肉肝醣之合成、葡萄糖之攝取及葡萄糖－6－磷酸鹽濃度。在接受高胰島素－正常血糖夾鉗技術，利用脂質注入以維持高血液FFA量之健康人類個體中逐漸發展出抗胰島素症，其在注入脂質後4－6小時可減少50%之胰島素刺激的肌肉葡萄糖攝取、減少50%之肌肉肝醣合成及葡萄糖氧化，並減少>90%之經胰島素刺激之IRS－1－相關 的PI3K活性(Roden et al.(1996)J Clin Invest 97：2859；Dresner et al.(1999)J Clin Invest 103：253)。
過氧化體增生劑－活化受體(PPARs)為核受體超族之子類別。PPARs為配體倚賴性轉錄因子，其係與視黃素X受體(retinoid X receptor)形成異二聚體之形式結合至特殊之DNA反應要素。此配體結合導致優先補充染色體去凝縮輔助活化子複合物並傾向使輔助遏制子複合物解散(Glass(2006)J.Clin Invest.116：556－560 doi：10.1172/JCI129713)。另外，PPARs可能透過與其他轉錄因子競爭而間接影響基因表現(通常為負面)(Gervois et al.(2001).J.Biol.Chem.276：33471－33477)。PPAR族中有三種成員:PPARα、PPARδ(或PPARβ)及PPARγ。大量實驗證據指明此三種核受體與脂質和碳水化合物之代謝作用的調節和協調有關。此三種蛋白質與不同疾病(包括糖尿病、肥胖、血脂異常及發炎)之間的關聯已完善建立。該三種PPARs係在不同組織中差別表現(Semple et al.(2006).J.Clin.Invest.116：556－560 doi：10.1172/JCI128003)。PPARα 在肝臟、腎臟及心臟中之表現最多。PPARγ優先表現於脂肪組織及巨噬細胞中。PPARδ之表現廣泛分佈，但在脂肪組織、皮膚及腦中之表現最多。該三種核受體涉及多種不同之細胞過程。PPARα 或PPARδ 活化將導致脂肪酸β 氧化作用增加。PPARα 涉及脂蛋白之合成及胺基酸之分解代謝。PPARγ 在脂肪細胞之分化中具關鍵性。該蛋白質具有不同之生理功能。PPARα 協調組織對肌餓之代謝反應，然而，餐後PPARγ 之表現增加且其活化將可向上調節該傳介脂肪細胞中脂肪酸之攝取的基因。PPARγ 為協調脂肪細胞分化之關鍵轉錄因子。PPARδ 之生理功能並未被完全了解。然而，最近的證據指出其可能為肌肉纖維類型之調節子且該蛋白質活化將造成對肥胖之抗性並改良代謝變化形廓(Wang et al.(2004).PloS Biology 2：e294)。
數種通路可能涉及抗胰島素症。脂肪組織中之PPARγ 活化將可向上調節該涉及脂肪酸捕捉之基因的轉錄作用(Semple et al.(2006)J.Clin.Invest.116：556－560 doi：10.1172/JCI128003)。PPARγ 活化內皮脂蛋白脂解釅(LPL)及脂肪酸轉運蛋白，FATP及CD36(其分別促進脂蛋白三酸甘油脂水解並攝取FFA進入脂肪細胞)。此過程藉由減少循環中之脂質及脂質直接接近胰島素敏感性組織(諸如肌肉及肝臟)來增加胰島素敏感性(Semple et al.(2006)J.Clin.Invest.116：556－560 doi：10.1172/JCI128003)。PPARγ 之特徵已被完善定出。PPARγ 之必要角色可在缺乏純合性PPARγ 之小鼠的胚胎致命性中獲得證實(Tsuchida et a.(2005)J Pharmacol.Sci.97：164－170)。在野生型小鼠中，可藉由高脂肪飲食誘導出肥胖或抗胰島素症。然而，雜合性PPARγ 缺失之小鼠中無法藉由高脂肪飲食誘導出肥胖或抗胰島素症(Tsuchida et al.(2005)J pharmacol.Sci.97：164－170)。例如：以高脂肪飲食餵食雜合性PPARγ (＋/－)小鼠時，與野生型小鼠相較下，該小 鼠之抗胰島素症較輕微且具有較小之脂肪細胞。該小鼠之血漿中亦具有較低量之脂肪酸及增加之瘦體素量(Kubota et al.(1999)Mol Cell 4：597－609；Tsuchida et al.(2005)J Pharmacol.Sci.97：164－170)。然而，雜合性PPARγ 缺失之保護效果可經由以PPARγ 激動劑治療小鼠而降低。噻唑烷二酮(TZD)類之胰島素致敏化藥物(Lehmann et al.(1995).J.Biol.Chem.270：12953－12956)悖離常理地降低地PPARγ (＋/－)小鼠之胰島素敏感性。這些結果暗示PPARγ 可傳介因高脂肪飲食所誘導之肥胖及抗胰島素症，而抑制PPARγ 時可使動物或人類對抗胰島素症之內生性及外生性原因較不易感。另一方面，在餵食高脂肪飲食之野生型小鼠中，藉由TZD進行之PPARγ 超生理活化作用可同樣改良胰島素敏感性，但卻同時誘導脂肪細胞分化。實驗證據指出向下調節及向上調節PPARγ 活性均可改良胰島素敏感性。
PPARα 為內生性脂肪酸及其衍生物之分子感測器。其在肝臟和骨骼肌肉中之葡萄糖內平衡及脂質代謝作用中扮演關鍵角色。PPARα 激動劑(諸如纖維酸)已被證實可有效降低脂質(Lefebvre et al.(2006).J.Clin.Invest.116：571－580.doi：10.1172/JCI27989)。在齧齒動物中，PPARα 激動劑，Wy14643，可改良KKAy小鼠中之胰島素敏感性並增強PPARγ 激動劑羅格列酮(rosiglitazone)之抗糖尿病效果(Tsuchida et al.(2005)Diabetes 54：3358－3370)。藉由Wy14643可防止脂肪細胞肥大(Tsuchida et al.(2005) Diabetes.54：3358－3370)。
最近，PPARδ 以作為不同組織(包括脂肪、骨骼肌肉及心臟)中之代謝調節劑而受到注意(Barish et al.(2006)J.Clin.Invest.116：590－597)。其增強脂肪酸之分解代謝和能量去偶合，此將減少三酸甘油脂之儲存並改良耐久力。活化型PPARδ 在小鼠骨骼肌肉中之瞄準表現可提供具有改良之代謝變化形廓的對抗肥胖的抗性(Wang et al.(2004).PloS Biology 2：1532－1539)。
調整體內之PPAR活性對於回應飲食及其他環境之影響時能維持正常之胰島素敏感性而言很重要。老鼠之遺傳研究提供很好的機會來了解核受體與環境因子之複雜的交互作用。PPAR活性可藉不同的調整劑調節。PPARs與不同配體交互作用時可使不同組之靶的基因活化。結果，由於調整劑對PPARs有不同之親和力和效果，因而產生不同之轉錄活性及藥學變化形廓。PPARs之調整劑可分成幾組，包括完全激動劑、部分激動劑、激動劑和輔助激動劑(Knouff and Auwerx(2004)Endocrine Review 25：899－918)。
現已研發出多種PPAR完全激動劑。羅格列酮及皮格列酮(piogliteazone)為二種臨床上用於治療第2型糖尿病之TZD(Lehmann et al.(1995)J Biol.Chem 270：12953－12956)。雖然這些PPARγ 激動劑減輕抗胰島素症並降低血漿葡萄糖量，但完全激動劑具有嚴重之副作用，包括：因脂肪量增加及水腫、液體滯留、血液稀釋而造成之體重 增加，且在至多15%之患者中會出現心臟衰竭(Mudaliar et al.(2003).Endocr.Pract.9：406－416)。某些TZD亦與顯著之肝臟毒性有關。雖然吾人一直主動尋求新穎之分子藥物靶的，但預防或治療多面向之代謝症候群的藥物療法仍侷限於選項及成功率。
其他胰島素致敏化通路涉及修改脂肪細胞所製造之脂肪因子(包括TNFα、IL－6、CRP、PAI－1、血管緊張素原、抵抗素(resistin)、瘦體素及脂締素)的變化形廓(Lau et al.(2004).Am.J.Physiol Heart Cir.Physiol 288：H2031－H2041)。這些脂肪因子對抗胰島素症及血管恆定具有深遠影響。在這些蛋白質中，脂締素為來自脂肪細胞，傳介胰島素致敏化之激素中特性被描寫得最詳細者。TZDs刺激脂締素之基因表現並增加肥胖小鼠及患有抗胰島素症之肥胖人類中的循環之脂締素濃度(Maeda et al.(2001)Diabetes 50：2094－2099)。由於脂締素藉由增加胰島素敏感性來改良葡萄糖耐受性，TZDs對脂締素分泌之作用可用來解釋(至少部分)TZDs在第2型糖尿病患者中之低血糖效果。
其他通路涉及人體中之胰島素致敏化。例如：瘦體素亦顯示出可改良齧齒動物中之胰島素敏感性。在脂萎縮性小鼠中，投服脂締素及瘦體素之生理劑量組合可使胰島素敏感性完全回復，但藉由個別之脂締素或瘦體素治療僅可觀察到部分之胰島素致敏化(Yamauchi et al.(2001).Nat Med 7：941－946)。瘦體素減少產脂酶之表現，因此而活化肝臟、棕色脂肪組織及骨骼肌肉中之PPARα 通路，導 致UCP－2及涉及β 氧化作用之酶的表現增加。人體中，具改良之胰島素敏感性的個體中的血漿脂締素濃度並不會因體重喪失而改變(Abbasi et al.(2004)Metabolism 53：280－283)。於另一研究中證實藉由運動訓練改良胰島素敏感性並非人體中脂締素量改變的結果(Marcell et al.(2005),Metabolism 54：533－41)。該數據暗示胰島素致敏化另有其他通路且不同機制涉及在體重減少及以TZD化合物治療後改良胰島素敏感性。
色酮類為具有苯並吡喃－4－酮之特殊類型的芳香化合物，其主要骨架結構可藉下列一般構造說明：
其中R1 、R2 、R3 及R4 係獨立地選自下列：－H、－OH、－CH3 、－SH、烷基、烯基、側氧基烷基、側氧基烯基、羥烷基、羥烯基、－OCH3 、－SCH3 、－OR、－SR、－NH2 、－NRH、－NR2 、－NR3 ＋ X－ 、選自下列之酯：沒食子酸酯、醋酸酯、肉桂醯及羥基－肉桂醯酯、三羥基苄醯酯及咖啡醯酯；及己糖或戊糖，其中該己糖或戊糖係藉由碳、氮、硫或氧連接色酮且其中該己糖或戊糖係選自：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、酮己糖及彼等之化學衍生物；包括二聚 體、三聚體及其他聚合之色酮類；其中該烷基及/或烯基為具有1－20個碳原子且在不同位置處帶有及/或不帶有雙鍵之直鏈及/或支鏈；X係選自藥學上可接受之抗衡陰離子，其包括羥基、氯化物、碘化物、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、氟化物及碳酸鹽；且R為具有1－20個碳原子之院基。
目前為止，自天然來源中分離出之色酮僅有183種(The Combined Chemical Dictionary,Chapman & Hall/CRC,Version 5：1 June 2001)。
據報導，色酮類顯示出一元胺氧化酶抑制活性(Fujimoto et al.(2002)Chem.Pharm.Bull.50：330－336)、酪胺酸酶抑制活性(Oiao et al.(2002)Chem.pharm.Bull.50：309－311)、抗血小板作用(Leoncini et al.(1991)Pharmacol.Res.23：139－148)、對抗口腔病原之生長抑制活性(Cai(1996)J.Nat.prod.59：987－990)、前列腺素H合成酶抑制活性(Jurenka et al.(1989)Comp.Biochem.93：253－255)。色酮類亦擁有對抗小鼠中由第Ⅱ型膠原蛋白誘導之關節炎的治療效力(Inaba et al.(2000)Chem.Pharm.Bull.48：131－139)及降血脂活性(Witiak et al.(1975)J.Med.Chem.18：935－942；Tetko et al.(1995)Bioorg Khim.21：809－815)。亦有報導指出色酮類可作為選擇性δ受體配體(Erickson et al.(1992)J.Med.Chem.35：1526－1535)。根據動物研究，色酮類容易被吸收及代謝(Crew et al.(1976)Xenobiotica 6：89－100)且蘆薈苦素(aloesin)之c－葡糖基鍵可被人類腸道細菌裂解(Che et al.(1991)Chem.Pharm.Bull 39：704－708)。
蘆薈為一種複雜的植物，其含有多種生物活性物質(Cohen et al.in Wound Healing/Biochemical and Clinical Aspects,1st ed.WB Saunders,philadelphia(1992)。已知之蘆薈品種超過300種，大部分為非洲土產。研究顯示生物活性物質係位在蘆薈葉之三種分別部分－位於葉片中央之透明凝膠葉肉、葉的外皮或厚皮及包含在脈管束之周皮層細胞中的黃色液體(位於葉的外皮及內部凝膠葉肉間，稱為乳汁)內。過去，蘆薈產品已用於皮膚敷藥中以治療灼燒、潰瘍及其他傷口。這些用途已激盪出非常多之研究以鑑定來自蘆薈植物之具有臨床活性(尤其是抗發炎活性)的化合物。(見，如：Grindlay and Reynolds(1986)J.of Ethnopharmacology 16：117－151；Hart et al.(1988)J.of Ethnopharmacology 23：61－71)。這些研究之結果有許多蘆薈化合物具有不同之生物活性的報告，包括抗腫瘤活性、抗胃潰瘍、抗糖尿病、抗酪胺酸酶活性(見，如：Yagi et al.(1977)Z.Naturforsch 32c：731－734)及抗氧化劑活性(Yu and Lee,U.S.Patent No.5,939,395)。
據報導，自不同蘆薈品種分離之色酮類具有不同之生物活性。蘆薈苦素(第2圖)據報導可抑制酪胺酸活性(Jones et al. Journal of Pigment Cell Research,Acceptance,Feb.10th .2002)並向上調節週期素E－倚賴性激酶之活性 (Lee et al.(1997)Biochem.Mol.Biol.Int.41：285－292)。根據大鼠腦部均質液模型，自洋蘆薈(Aloe barbadensis )分離出之c－葡糖基色酮顯示出抗發炎活性(Hutter et al.(1996)J.Nat.Prod.59：541－543)及類似於α－生育酚之抗氧化劑活性(Lee et al.Free Radic Biol.Med.28：261－265)。
洋蘆薈葉及其苦素在正常及四氧嘧啶糖尿病小鼠中顯示出可影響血液葡萄糖量(Ajabnoor(1990)J.Ethnopharmacol.28：215－220)而多種不同蘆薈品種之乾燥汁液在臨床研究中顯示出抗糖尿病活性(Ghannam,(1986)Horm Res.24：288－294)。蘆薈凝膠或萃取物之抗糖尿病效果已在由低劑量鏈脲佐菌素誘導之糖尿病動物模型中獲得證實(Beppu(2006)J Ethnopharmaeol.103(3)：468－77；Rajasekaran(2006)Clin Exp Pharmacol Physiol.33(3)：232－7)。據報導，這類抗糖尿病效果係藉由酚及其他分子量小於10KDa之化合物來保護胰島B細胞對抗由低劑量鏈脲佐菌素誘導之選擇性毒性(Rajasekaran(2006)Clin Exp Pharmacol Physiol.33(3)232－7)。來自吉拉索蘆薈(Aloe Vera )之其他化合物(諸如無機礦物質)(Rajasekaran(2005)Biol.Trace Elem.Res.108(1－3)：185－195)和抗氧化劑據報導與抗糖尿病效果有關(Rajasekaran(2005)Pharmacol.Rep.57(1)：90－96)。
最近，五種來自吉拉索蘆薈凝膠之植物固醇被鑑定為抗糖尿病成分(Tanaka(2006)Biol.pharm.Bull.29(7)： 1418－1422)。2007年中，開普蘆薈(Aloe ferox )葉凝膠之化學成分被經過徹底分析後據報導為具有強抗氧化性質且可能用於緩和症狀及/或預防懷疑之糖尿病(Loots(2007)J Agric.Food Chem.55(17)：6891－6896)。
美國專利案第6,780,440號揭示含有用於糖尿病及體重管理之蘆薈的草本組成物。然而，主要之活性成分及作用機制並未被鑑定出。美國專利案第5,88,984號中係主張來自蘆薈之複合碳水化合物為用於治療糖尿病的組成物之一。美國專利案第4,598,069號中亦主張蘆薈多醣可用於治療低血糖症。美國專利案第5,627,204號中揭示作為醛糖還原酶抑制劑，以用於預防及治療糖尿病之具不同取代模式之合成的色酮衍生物。美國專利案第6,133,305號中主張具有色酮骨架之用於治療與蛋白質激酶相關之病症(包括糖尿病)的合成化合物之專利權。
Yagi等人揭示一組自蘆薈分離出之化合物(尤其是蘆薈苦素)及一種其衍生物，2"－O－阿魏醯蘆薈苦素(feruloylaloesin)，其為有效之酪胺酸酶抑制劑(Yagi et al.(1987)Plant Medica 515－517)。蘆薈苦素為C－葡萄糖基化之5－甲基色酮(Holdsworth(1972)Chromones in Aloe Species,Part 1－Aloesin PM 19(4)：322－325)。活體外，蘆薈苦素為一種強酪胺酸酶活性抑制劑(Yagi et al.(1987)planta Medica 515－517)。標題“包含用於皮膚脫色之活性成分的水性組成物”之美國專利案第6,123,959號中描述包含磷脂質之微脂體及至少一種合成 黑色素之酶的競爭性抑制劑與至少一種合成黑色素之酶的非競爭性抑制劑之水性組成物。美國專利案第6,884,783號中揭示7－羥基色酮類(包括蘆薈苦素及蘆薈苦醇(aloesinol))，其係作為強抗氧化劑，以用於預防及治療與活性氧(ROS)傷害及其他氧化壓力有關之疾病和病況。
目前為止，已知之用於純化蘆薈苦素及其他色酮類的方法涉及使用色層分析法(見，如：Rauwald and Beil (1993)J.of Chromatography 639：359－362；Rauwald and Beil(1993)Z.Naturforsch 48c：1－4；Conner et al.(1990)Phytochemistry 29：941；Holdsworth(1972)Chromones in Aloe Species,Part I－Aloesin PM 19(4)：322－325；Mebe (1987)Phytochemistry 26：2646；Haynes et al.(1970) J.Chem.Soc.(C)2581；McCarthy and Haynes(1967)The Distribution of Aloesin in Some South African Aloe Species ；Heft 3 342)。這些程序之研發係用於化學分析，但對於蘆薈苦素之製備級製造法並不實用。標題為“純化蘆薈苦素之方法”的美國專利第6,451,357號中揭示一種利用結晶化作用來純化蘆薈苦素之方法。
 發明摘要
本發明描述源自植物來源之色酮類及新穎之色酮組成物的鑑定及分離，該色酮類及色酮組成物顯現可向上調節由脂肪細胞製造之脂締素並使近數百種與葡萄糖和脂肪酸 代謝及訊號傳導途徑相關之基因正常化。該色酮組成物可有效地增加由脂肪細胞所製造之脂締素及調節涉及脂肪酸生物合成作用、粒腺體脂肪酸β －氧化作用、類固醇生物合成作用、糖質新生作用、脂肪轉運、PPARα /RXRα 肝臟訊號傳導及異質物之代謝作用的基因。色酮組成物可用於在哺乳動物體內增加胰島素敏感性、改良葡萄糖耐受性、降低三酸甘油脂量及平衡葡萄糖量。本發明包括用於預防及治療多種不同疾病和病況之方法，此等疾病和病況包括但不限於抗胰島素症、葡萄糖不耐症、高血糖症、代謝症候群、血脂異常及高三酸甘油脂血症。
本發明包括用於預防及治療哺乳動物之代謝症候群及由抗胰島素症傳介之疾病和病況的方法。該方法包含給予有此需要之個體有效量之包含一或多種色酮類的藥學或營養藥劑組成物。色酮或色酮類混合物可自單一來源或多種來源分離出，包括，但不限於經合成取得、天然產生或任何其組合。
於一較佳體系中，本發明描述用於增加自脂肪細胞製造脂締素之方法，其包含給予有此需要之個體有效量之色酮或色酮類混合物。於另一較佳體系中，本發明描述用於將因高脂肪飲食所誘導之脂肪酸生物合成作用、粒腺體脂肪酸β －氧化作用、類固醇生物合成作用、糖質新生作用、脂肪轉運、PPARα /RXRα 肝臟訊號傳導及異質物之代謝作用的基因表現改變正常化的方法，該方法包含給予有此需要之個體有效量之包含色酮或色酮類混合物的組成 物。於另一較佳體系中，本發明包括用於預防及治療抗胰島素症、葡萄糖不耐症、高血糖症、代謝症候群、血脂異常及高三酸甘油脂血症之方法，該方法包含給予有此需要之個體有效量之包含色酮或色酮類混合物的組成物。
可根據下述使用之色酮類包括藉下列一般構造說明之化合物：
其中R1 、R2 、R3 及R4 係獨立地選自下列：－H、－OH、－CH3 、－SH、烷基、烯基、側氧基烷基、側氧基烯基、羥烷基、羥烯基、－OCH3 、－SCH3 、－OR、－SR、－NH2 、－NRH、－NR2 、－NR3 ＋ X－ 、選自下列之酯：沒食子酸酯、醋酸酯、肉桂醯及羥基－肉桂醯酯、三羥基苄醯酯及咖啡醯酯；及己糖或戊糖，其中該己糖或戊糖係藉由碳、氮、硫或氧連接色酮且其中該己糖或戊糖係選自：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、酮己糖及彼等之化學衍生物；包括二聚體、三聚體及其他聚合之色酮類；其中該烷基及/或烯基為具有1－20個碳原子且在不同位置處帶有及/或不帶有雙鍵之直鏈及/或支鏈；X係選自藥學上可接受之抗衡陰離子，其包括羥基、 氯化物、碘化物、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、氟化物及碳酸鹽；且R為具有1－20個碳原子之烷基及藥學上可接受之載體。
於一本發明之較佳體系中，該色酮係選自具有如下構造之蘆薈苦素及/或蘆薈苦醇。
本發明之色酮類可藉合成方法取得或可自多種植物屬分離出，這些植物屬包括，但不限於金合歡屬(Acacia )、水團花屬(Adina )、蘆薈屬(Aloe )、鏈格孢屬(Alternaria )、崖摩屬(Amoora )、五月茶屬(Antidesma )、艾草屬(Artemisia )、崗松屬(Baeckia )、決明子屬(Cassia )、Clusea 、芎藭屬(Cnidium )、旋花屬(Convolvulus )、淫羊藿屬(Epimedium )、豬仔笠屬(Eriosema )、老鸛草屬(Eriostemon )、蒲桃屬(Eugenia )、藤黃屬(Garcinia )、金絲桃屬(Hypericum )、鐘萼草屬(Lindenbergia )、全能花屬(Pancratium )、青黴菌屬(Penicillium )、蓼屬 (Polygonum )、噴嚏樹屬(Ptaeroxylon )、大黃屬(Rheum )、槐屬(Sophora )、冠網椿屬(Stephanitis )、蒲桃屬(Syzygium )、踝節菌屬(Talaromyces )及圈扇藻屬(Zonaria )。於較佳之體系中，該植物係選自如下群體，包括，但不限於兒茶(Acacia catechu )、藤金合歡(Acacia concinna )、木立蘆薈(Aloe arborescens )、洋蘆薈(Aloe barbadensis )、克立諾非蘆薈(Aloe cremnophila )、開普蘆薈(Aloe ferox )、廣葉蘆薈(Aloe saponaria )、吉拉索蘆薈(Aloe vera )、有華蘆薈(Aloe vera var.chinensis )、膜葉五月茶(Antidesma membranaceum )、茵陳蒿(Artemisia eapillaries )、崗松(Baeckia frutescens )、箭葉淫羊藿(Epimedium sagittatum )、爪哇鳳果(Garcinia dulcis )、田基黃(Hypericum japonicum )、虎杖(Polygonum cuspidatum )、毛苦參(Sophora tomentosa )及杜鵑網椿(Stephanitis rhododendri )。於一較佳體系中，該色酮類係自開普蘆薈、吉拉索蘆薈或洋蘆薈之全葉分離出。
色酮類可在多種不同之植物部分中找到，這些植物部分包括，但不限於莖、莖皮、樹幹、樹幹皮、細枝、塊莖、根、根皮、嫩枝、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉及其他氣生部分。
本發明描述自含有色酮類之植物分離及純化這些化合物之方法。本發明之方法包含：a)萃取含有色酮(尤其是選自蘆薈苦素或蘆薈苦醇之色銅)之植物的研磨生物質；b)中和並濃縮該萃取物；及c)利用色層分析法純化該中和及 濃縮之萃取物，這些方法包括，但不限於聚醯胺、LH－20、XAD樹脂、CG－161樹脂、矽膠或逆相色層分析法。於本發明之一較佳體系中，該萃取物係利用選自下列之方法純化：再結晶化、沈澱、溶劑分佈及/或色層分析分離法。本發明提供用於分離及純化具所需之生理活性之色酮類的商業上可用的方法。
用於在藥學製劑中投服之產品的製備方法可藉由多種本技藝之技術熟習人士所熟知的方法進行。色酮類可調製成下列形式：為其天然存在之形式之草藥粉；為不同濃度之溶劑及/或超臨界流體萃取物；為透過再結晶、管柱分離、溶劑分佈、沈澱及其他方法所形成之增濃及純化的化合物；為含有藉由合成方法製備之實質上純化的色酮類的純物質及/或混合物。
本發明者利用可接受之動物模型證實投服自多種不同植物來源分離出之色酮或其混合物(諸如蘆薈苦素及/或蘆薈苦醇)或包含色酮類混合物之萃取物(例如：開普蘆薈葉分泌液；加上吉拉索蘆薈凝膠或吉拉索蘆薈全葉凝膠粉末及萃取物)時可減輕抗胰島素症並同時降低胰島素量、維持低空腹葡萄糖量並顯著降低三酸甘油脂量，而不會影響食物之攝取和體重。自含有色酮類之植物(諸如吉拉索蘆薈及開普蘆薈和其他植物品種)分離出之一或多種色酮及/或色酮之標準化萃取物於緩和抗胰島素症及降低空腹葡萄糖量上的新穎用途過去並無相關描述。此處所揭示之色酮類可作為預防及治療哺乳動物(包括，但不限於人類)之代 謝病症(包括，但不限於抗胰島素症、葡萄糖不耐症、代謝症候群、第2型糖尿病、超重、肥胖、高血壓、血脂異常、高三酸甘油脂血症、低HDL膽固醇量、動脈粥狀硬化症及其他心血管疾病)的胰島素致敏劑和預防劑。
本發明之組成物可藉由本技藝之一般技術人士所已知之任何方法投服。投服模式包括，但不限於腸道(口)投服、非經腸胃道(靜脈內、皮下及肌肉內)投服和局部施予。根據本發明之治療方法包含經由內部或局部途徑給予有此需要之患者治療上有效量之自單一來源或數種來源(包括，但不限於經由合成取得、天然產生或其任何組合)分離出的個別色酮及/或色酮類混合物。根據所使用之取得該化合物的方法，個別色酮及/或色酮類混合物之純度範圍係在0.01%至100%。在口服、注射投服、局部投服、霧狀滴、栓劑、皮內投服中之色酮組成物的濃度可為該合適製劑之總量的0.001重量%至99.99重量%。色酮類可藉由任何選自下列之投服途徑使用：口服、局部、霧狀滴、栓劑、皮內、肌肉內及靜脈內途徑，哺乳動物(尤其是人類)之每日投服劑量範圍為每公斤體重投服0.01毫克至500毫克。
較佳體系之詳細說明
本發明描述源自植物來源之色酮類及新穎之色酮組成物的鑑定及分離方法，該色酮類及色酮組成物顯現可向上調節由脂肪細胞製造之脂締素並使近數百種之與葡萄糖和 脂肪酸代謝及訊號傳導途徑相關之基因正常化。色酮組成物可有效地增加由脂肪細胞所製造之脂締素及調節涉及脂肪酸生物合成作用、粒腺體脂肪酸β －氧化作用、類固醇生物合成作用、糖質新生作用、脂肪轉運、PPARα /RXRα 肝臟訊號傳導及異質物之代謝作用的基因。色酮組成物可用於在哺乳動物體內增加胰島素敏感性、改良葡萄糖耐受性、降低三酸甘油脂量及平衡葡萄糖量。本發明包括用於預防及治療多種不同疾病和病況之方法，這些疾病和病況包括，但不限於抗胰島素症、葡萄糖不耐症、高血糖症、代謝症候群、血脂異常及高三酸甘油脂血症。本發明亦包括含有一或多種色酮類與吉拉索蘆薈凝膠或吉拉索蘆薈全葉蘆薈凝膠粉末之混合物的新穎組成物。這些新穎組成物在降低葡萄糖量及增加胰島素敏感性上非常有效。
此處使用多種不同名詞來論及本發明之觀點。為了協助澄清對本發明之組成的描述，提供下列定義。
除非另外定義，此處所使用之所有技術及科學名詞具有本發明所屬技藝之一般技術人士所共通了解的意義。
需注意，此處所使用之“一”種實體一詞係指一或多種該實體；例如：色酮係指一或多種色酮類。因此，此文中“一”、“一或多種”及“至少一種”可交換使用。
“色酮類”為一類具有藉由下列一般構造說明之苯並吡喃－4－酮作為其主要構造性骨架的天然產品：
其中R1 、R2 、R3 及R4 係獨立地選自下列：－H、－OH、－CH3 、－SH、烷基、烯基、側氧基烷基、側氧基烯基、羥烷基、羥烯基、－OCH3 、－SCH3 、－OR、－SR、－NH2 、－NRH、－NR2 、－NR3 ＋ X－ 選自下列之酯：沒食子酸酯、醋酸酯、肉桂醯及羥基－肉桂醯酯、三羥基苄醯酯及咖啡醯酯；及己糖或戊糖，其中該己糖或戊糖係藉由碳、氮、硫或氧連接色酮且其中該己糖或戊糖係選自：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、酮己糖及彼等之化學衍生物；包括二聚體、三聚體及其他聚合之色酮類；其中該烷基及/或烯基為具有1－20個碳原子且在不同位置處帶有及/或不帶有雙鍵之直鏈及/或支鏈；X係選自藥學上可接受之抗衡陰離子，其包括羥基、氯化物、碘化物、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、氟化物及碳酸鹽；且R為具有1－20個碳原子之烷基。
於本發明之一較佳體系中，該色酮係選自蘆薈苦素或蘆薈苦醇。
本發明之色酮類可藉由合成方法取得或可自多種植物屬分離，這些植物族群包括，但不限於金合歡屬、水團花屬、蘆薈屬、鏈格孢屬、崖摩屬、五月茶屬、艾草屬、崗 松屬、決明子屬、Clusea 、芎藭屬、旋花屬、淫羊藿屬、豬仔笠屬、老鸛草屬、蒲桃屬、藤黃屬、金絲桃屬、鐘萼草屬、全能花屬、青黴菌屬、蓼屬、噴嚏樹屬、大黃屬、槐屬、冠網椿屬、蒲桃屬、踝節菌屬及圈扇藻屬。於較佳之體系中，該植物係選自下列群體，包括，但不限於兒茶、藤金合歡、木立蘆薈、洋蘆薈、克立諾非蘆薈、開普蘆薈、廣葉蘆薈、吉拉索蘆薈、有華蘆薈、膜葉五月茶、茵陳蒿、崗松、箭葉淫羊藿、爪哇鳳果、田基黃、虎杖、毛苦參及杜鵑網椿。於一較佳體系中，色酮類係開普蘆薈、吉拉索蘆薈或洋蘆薈之全葉分離。
色酮類可在多種不同之植物部分找到，包括，但不限於莖、莖皮、樹幹、樹幹皮、細枝、塊莖、根、根皮、嫩枝、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉及其他氣生部分。
“蘆薈”一詞係指吉拉索蘆薈或開普蘆薈所屬之南非洲百合科植物的屬名。蘆薈色酮類主要存於許多不同之蘆薈品種的葉皮中。
“蘆薈萃取物”之定義為不同蘆薈植物品種之全葉片的乾燥汁液。本發明實例中所使用之“蘆薈萃取物”包括，但不限於新鮮而濃縮之蘆薈凝膠、全葉凝膠、葉片分泌液及萃取物，其係藉由“全葉處理”不同蘆薈品種之全葉來製備。於一實例中，將自洋蘆薈植物取得之全葉研磨、過濾，以纖維素酶(選擇性的)及活性碳處理再凍乾之。使用前，以色層分析溶劑將凍乾粉末重構成。於另一 實例中，將來自開普蘆薈葉之分泌液懸浮在水中，使用前再與適當之色層分析溶劑接觸。
此處所使用之“治療性”包括治療及/或預防。使用時，“治療性”係指人類以及哺乳動物。
“藥學上或治療上有效之劑量或量”係指足夠誘導所需之生物結果的劑量水準。其結果可為緩和疾病徵兆、症狀或原因或任何其他有需要之生物系統的改換。確實劑量將根據多種因子而變，這些因子包括，但不限於個體之年齡和大小，疾病和欲作用之治療。
“宿主”或“患者”或“個體”為需要治療之存活的哺乳動物、人類或動物。“宿主”、“患者”或“個體”一般係指該欲根據本發明方法實行之療法的接受者。需注意，此處所描述之本發明可用於獸醫及人類之應用中且“宿主”一詞不應狹隘解釋。在獸醫應用中，劑量範圍可依下述，考量動物之體重來測定。
此處所使用之“藥學上可接受之載體”係指任何不會干擾活性成分之生物活性的有效性且對投服之宿主無毒性的載體。“藥學上可接受之載體”的實例包括，但不限於任何標準之藥學載體，諸如生理食鹽水溶液，即：林格氏液(Ringer's solution)、緩衝之生理食鹽水溶液、水、右旋糖溶液、血清白蛋白及其他用於將配方製成錠劑及膠囊的賦形劑及防腐劑。
注意，本申請案之全文中提供不同的引證。各引證之全部內容特別併為此文之參考資料。
本發明包括用於預防及治療哺乳動物之代謝症候群及由抗胰島素症傳介之疾病和病況。該方法包含給予有此需要之個體有效量之包含一或多種色酮類的藥學或營養藥劑組成物。色酮或色酮類混合物可自單一來源或多種來源分離出，其包括，但不限於經合成取得、天然產生或任何其組合。
於一較佳體系中，本發明描述用於增加自脂肪細胞製造脂締素之方法，其包含給予有此需要之個體有效量之色酮或色酮類混合物。於另一較佳體系中，本發明描述用於將由高脂肪飲食所誘導之脂肪酸生物合成作用、粒腺體脂肪酸β －氧化作用、類固醇生物合成作用、糖質新生作用、脂肪轉運、PPARα /RXRα 肝臟訊號傳導及異質物之代謝作用的基因表現改變正常化的方法，該方法包含給予有此需要之個體有效量之包含色酮或色酮類混合物的組成物。於另一較佳體系中，本發明包括用於預防及治療抗胰島素症、葡萄糖不耐症、高血糖症、代謝症候群、血脂異常及高三酸甘油脂血症之方法，該方法包含給予有此需要之個體有效量之包含色酮或色酮類混合物的組成物。
可根據下述使用之色酮類包括藉下述一般結構說明之化合物：
其中R1 、R2 、R3 及R4 係獨立地選自下列：－H、－OH、－CH3 、－SH、烷基、烯基、側氧基烷基、側氧基烯基、羥烷基、羥烯基、－OCH3 、－SCH3 、－OR、－SR、－NH2 、－NRH、－NR2 、－NR3 ＋ X－ 、選自下列之酯：沒食子酸酯、醋酸酯、肉桂醯及羥基－肉桂醯酯、三羥基苄醯酯及咖啡醯酯；及己糖或戊糖，其中該己糖或戊糖係藉由碳、氮、硫或氧連接色酮且其中該己糖或戊糖係選自：戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、酮己糖及彼等之化學衍生物；包括二聚體、三聚體及其他聚合之色酮類；其中該烷基及/或烯基為具有1－20個碳原子且在不同位置處帶有及/或不帶有雙鍵之直鏈及/或支鏈；X係選自藥學上可接受之抗衡陰離子，其包括羥基、氯化物、碘化物、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、氟化物及碳酸鹽；且R為具有1－20個碳原子之烷基及藥學上可接受之載體。
於本發明之一較佳體系中，該色酮係選自具有如下構造之蘆薈苦素及/或蘆薈苦醇。
本發明之色酮類可藉合成方法取得或可自多種植物屬分離出，這些植物屬包括，但不限於金合歡屬、水團花屬、蘆薈屬、鏈格孢屬、崖摩屬、五月茶屬、艾草屬、崗松屬、決明子屬、Clusea 、芎藭屬、旋花屬、淫羊藿屬、豬仔笠屬、老鸛草屬、蒲桃屬、藤黃屬、金絲桃屬、鐘萼草屬、全能花屬、青黴菌屬、蓼屬、噴嚏樹屬、大黃屬、槐屬、冠網椿屬、蒲桃屬、踝節菌屬及圈扇藻屬。
於較佳之體系中，該植物係選自下列：兒茶、藤金合歡、木立蘆薈、洋蘆薈、克立諾非蘆薈、開普蘆薈、廣葉蘆薈、吉拉索蘆薈、有華蘆薈、膜葉五月茶、茵陳蒿、崗松、箭葉淫羊藿、爪哇鳳果、田基黃、虎杖、毛苦參及杜鵑網椿。於一較佳體系中，該色酮類係自開普蘆薈、吉拉索蘆薈或洋蘆薈之全葉分離出。
色酮類可在多種不同之植物部分中找到，這些植物部分包括，但不限於莖、莖皮、樹幹、樹幹皮、細枝、塊莖、根、根皮、嫩枝、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉及其他氣生部分。
本發明之色酮化合物和組成物，以及其生化及生物活 性係依下述自任意篩選之2059種植物萃取物鑑定。初步篩選係根據植物萃取物或化合物增強自培養之脂肪細胞製造脂締素的能力來設計。脂肪細胞係自老鼠纖維母細胞(3T3 L1)分化。咸信，測量脂肪細胞培養介質中之關鍵脂肪因子標記蛋白質－脂締素之量可用於鑑定該可作為PPAR泛調節劑，或可調整其他用於預防及治療哺乳動物(尤其是人類)之代謝疾病(包括，但不限於抗胰島素症、葡萄糖不耐症、高血糖症、代謝症候群、血脂異常及高三酸甘油脂血症)的葡萄糖和脂肪酸關鍵代謝途徑之天然化合物。
為了創造植物萃取物集合庫，將乾燥之植物物質研磨成細粉並依實例1中之描述利用ASE300自動萃取機，以甲醇：二氯甲烷(1：1)萃取之。藉由旋轉蒸發及快速真空將萃取物乾燥。將各植物萃取物(約75毫克)溶解在1.5毫升DMSO(1.5毫升)中以製造濃度為50毫克/毫升之溶液。
3T3－L1細胞顯示出可回應PPARγ活化劑而製造及分泌脂締素入介質中。然而，文獻中，回應PPARγ 活化劑之處理所增加之脂締素分泌僅2倍。當重複此實驗時，該分析中所取得之最佳的信號對背景比為在發表之實驗條件下，以介於0.1－300μM濃度之吲哚美辛(indomethacin)所取得之1.6(第1A圖)。吾人經由改變誘導及培養條件來大幅改良信號對雜訊之比。首先，誘導3T3－L1細胞分化2天再以吲哚美辛處理2天。以100μM吲哚美辛處理所增加之脂締素的最高平均倍數為52倍(第1B圖)。使用此分析系統來篩選2059種有機萃取物。
當使用與參考化合物吲哚美辛(10μM)所提供者相等之誘導脂締素的截止閾值(cutoff threshold)時初次篩選可產生139種陽性選項。由接下去之驗證分析及第二次篩選之結果可知一種來自開普蘆薈葉分泌液的活性萃取物(稱為P0017)顯示出持續向上調節介質中之脂締素量(第2圖)。
接著，將此活性植物萃取物進行由活性引導之HTP分餾和化合物純化作用。如第3圖所示，利用正相快速柱將P0017之有機萃取物進行分餾。將具類似之UV吸收和持留時間的分餾物合併成次分餾物並在低度真空下乾燥及離心且命名為P0017－OE－HTPF1－8(第4圖)。使用DMSO溶解各次分餾物(50微克/微升)並取一部分(2微升)用於脂締素分析中。在生物分析中，P0017－OE－HTPF3顯示出為該7種次分餾物中具最大活性者。
利用LC－MS/PDA進行該活性次分餾物之去冗餘作用(de－roplication)。鑑定該對應於最強之脂締素增強活性的獨特化合物峰。P0017－OE－HTPF3中最活躍之化合物蘆薈苦醇(mw＝396)及蘆薈苦素(mw＝394)經驗明為色酮類化合物並將蘆薈苦素編碼為UP394(第5圖)，蘆薈苦醇編碼為UP396(第6圖)。具體地說，分離出蘆薈苦素及蘆薈苦醇並驗明為可增加自脂肪細胞分泌脂締素之色酮組成物。將純化之UP394及UP396進行測試，結果如第7圖所示，此二種色酮化合物在活體外分析中均具有增強自脂肪細胞製造脂締素的活性。
由於據報導，脂締素可改良抗胰島素症(此被視為代 謝症候群之根本原因)，因此，可假設：藉由色酮UP394及UP396減輕抗胰島素症時應可改良多種不同之代謝疾病。為了試驗此理論，餵食C57BL/6J小鼠高脂肪飲食8週以在其體中誘導不良之胰島素敏感性、葡萄糖耐受性及似第2型糖尿病症狀(Surwit et al.(1988)Diabetes 37：1163－1167：Laakso et al.(2004).Diabetes Care 27：2253－2259；Kahn et al.(2004)Diabetes 53：3274－3285；Scheurink et al.(1998)European J Endo.139：461－467)。然後，以色酮UP394、UP396及參考化合物GW1929(N－(2－苄醯苯基)－O－[2－(甲基－2－吡啶胺基)乙基]－L－酪胺酸)治療(注射或口服)小鼠4週。
利用二種試驗證實所揭示之色酮在高脂肪飲食小鼠中對抗胰島素症之療效：葡萄糖耐受性試驗及胰島素耐受性試驗。在以揭示之色酮蘆薈苦素(UP394)及蘆薈苦醇(UP396)治療之第18天進行腹膜內葡萄糖耐受性試驗。在給予葡萄糖(2克/公斤)前先令動物空腹3小時。投給葡萄糖後，在0、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。如實例14及第8A圖所示，與該以載劑治療之動物相較下，以UP396治療之動物顯示出顯著改良之自循環中清除葡萄糖的作用。與該以載劑治療之動物相較下，以UP394治療之動物顯示出清楚之改良趨勢(第8A圖)。
腹膜內胰島素耐受性試驗係在治療之第24天進行。注射胰島素前先令動物空腹3小時。在給予胰島素(0.5單位/公斤)後之0、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖 量。如第8B圖及實例14所示，與該以載劑治療之動物相較下，以UP394及UP396治療之動物均顯示出顯著之葡萄糖清除，p<0.05(第8B圖)。
藉由該化合物降低受治療動物之血漿胰島素量的能力來進一步證實所揭示之色酮的胰島素致敏活性。利用ELISA套組測定小鼠中之血漿胰島素量(第9圖)。參考化合物GW1929(其為一種選擇性PPARγ 激動劑)一如預期地可顯著降低胰島素量。類似地，與該以載劑治療之小鼠相較下，UP394及UP396亦顯著降低胰島素量(第9圖)，此表示所揭示之色酮化合物可在因高脂肪飲食所誘導之代謝病症小鼠中增加胰島素敏感性。
色酮僅貯存在蘆薈植物之外皮或葉的外層中。在取得蘆薈凝膠產物之過程中，通常係移除蘆薈葉之外皮並僅將透明凝膠過瀘及濃縮。即使在製造蘆薈全葉凝膠時，其中係將該蘆薈植物之全葉壓碎，收集凝膠並過瀘後，再以利用活性碳之非定殖(decolonization)方法及其他非定殖方法來移除色酮。因此，經由HPLC證實在標準之蘆薈凝膠產物中並未發現明顯量之色酮(Dell’Agli(2007)J.Agric.Food Che.55(9)：3363－3367；Zonta(1995)Journal of Chromatography A 718(1)：99－106)。即使某些植物品種(諸如開普蘆薈)含有多出很多之色酮量，通常，該來自分泌液或粗萃取物之色酮組成物通常含有其他引起明顯副作用(諸如引起腹瀉和遺傳毒性)之不受歡迎的組成分(諸如蔥醌)，因此將阻止直接使用粗色酮。
本發明者推論在標準化之植物萃取物中增加色酮將可提供在增強胰島素敏感性、改良葡萄糖耐受性及降低三酸甘油脂量上具有改良及更一致之活性的組成物。為了測試此假說，經由將自開普蘆薈葉分泌液分離出之色酮蘆薈苦素(UP394)與自吉拉索蘆薈製備之全葉凝膠粉末合併來製造一種獨特之色酮組成物。來自二種品種之蘆薈的標準化色酮組成物含有不少於1.4%之色酮－即，蘆薈苦素(UP394)。蘆薈苦素(UP394)係自開普蘆薈之葉分泌液萃取出，藉由製備性層析管柱分離後再依美國專利案第6,451,357號，標題“Method of Purification of Aloesin”(其全部內容併為此文之參考資料)中之描述經由再結晶進一步純化。此獨特之標準化色酮組成物係編碼為N931，在不同之抗胰島素症模型(db/db老鼠模型)上測試其對血液葡萄糖量、抗胰島素症及脂肪代謝之效果。
糖尿病自發性突變(Lepr db )的老鼠純合子在約3至4週大時將長成可辨認出之肥胖。血漿胰島素量在10至14天開始升高而血糖量在4至8週升高。純合性突變種小鼠為貪食、劇渴及多尿。疾病之進程明顯受遺傳背景影響。在db/db小鼠中可觀察到許多特性，包括血糖不受控制地上升、製造胰島素之胰島β細胞嚴重耗盡並在10個月大前死亡。以GW1929(5毫克/公斤)、N931(375毫克/公)及載劑治療(注射或口服)雄db/db 小鼠(每組8隻)10週並每週測量小鼠之空腹葡萄糖量。結果，N931對降低db/db 小鼠之血液葡萄糖量非常有效。如第10圖所示，在10週 之治療期間內以載劑治療之小鼠中的葡萄糖量增加。GW1929(參考化合物)一如預期可將葡萄糖維持在基線量。類似於GW1929，自治療之第5週開始，N931可實質上降低葡萄糖量。與載劑治療組相較下，在第6、7、9及10週時N－931治療組之空腹血液葡萄糖量顯著降低，P<0.05。治療10週後，以N931治療之動物中的葡萄糖量為以載劑治療之動物的54%。
在口服葡萄糖耐受性試驗中證明N931對抗胰島素症之效果。以GW1929(5毫克/公斤)、N931(375毫克/公斤)及載劑治療db/db小鼠(每組8隻小鼠)10週。給予葡萄糖前令動物空腹一整夜。在投服葡萄糖後之0、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。與載劑相較下，以GW1929或N931治療之小鼠可在0及120分鐘觀察到葡萄糖明顯從循環系統中清除，P <0.05(第11A圖)。此結果指出：N931具有增加葡萄糖耐受性之能力，因此，可改良db/db 小鼠之胰島素敏感性。
在腹膜內胰島素耐受試驗中進一步證明N931對抗胰島素症之效果。以GW1929(5毫克/公斤)、N931(375毫克/公斤)及載劑治療db/db小鼠6週(每組8隻小鼠)。在注射胰島素後之0、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。同樣地，以GW1929及N931治療之小鼠中胰島素敏感性明顯改良。與載劑相較下，GW1929及N931治療組可在0、30及60分鐘觀察到顯著之葡萄糖清除，P<0.05(第11B圖)。
另外，與載劑相較下，治療10週後，N931顯著降低三酸甘油脂量(P <0.05)。每週測量以GW1929、N931及載劑治療之雄db/db 小鼠的空腹三酸甘油脂量。除了空腹時間外，任意給予動物T2018齧齒動物飲食。治療10週後，以N931治療之動物中可觀察到三酸甘油脂降低34%(P<0.05)，在參考化合物組中可觀察到三酸甘油脂降低43%(P<0.05)(第12圖)。
為了證明富含色酮之組成物的優異及令人意外的療效，將自開普蘆薈葉分泌液分離出之色酮蘆薈苦素(UP394)與自吉拉索蘆薈製備之葉凝膠粉末(Qmatrix編碼為QM400)合併以製造第二種獨特之色酮組成物。來自二種品種之蘆薈的標準化色酮組成物(UP780)含有不少於2%之色酮－即，蘆薈苦素(UP394)。色酮蘆薈苦素(UP394)係自開普蘆薈之葉分泌液萃取出，藉製備性層析管柱分離後再依美國專利案第6,451,357號，標題“Method of Purification of Aloesin”(其全部內容併為此文之參考資料)中之描述經由再結晶進一步純化。此新穎之標準化色酮組成物編碼為UP780並在劑量範圍尋求研究中經口投給餵食高脂肪飲食之C57BL/6J小鼠。在此研究中，將UP780之胰島素致敏活性與藥物－GW1929及原始之吉拉索蘆薈凝膠粉末(Qmatrix QM400，其不含大量色酮)相比較。
在每日口服治療三週後，以200毫克/公斤UP780及GW1929治療之動物可在經由腹膜內途徑投服葡萄糖後之 30、60及90分鐘發現統計上有意義之葡萄糖清除。類似地，30分鐘後，以400毫克/公斤UP780治療之動物顯示出顯著之葡萄糖利用，P ≦0.05(＊ )(第13A－F圖)。同樣地，與載劑相較下，以400毫克/公斤UP780治療之動物在IP投服葡萄糖後之30、60、90及120分鐘顯示出在葡萄糖利用上具有統計上有意義之差異，P ≦0.05(＊ )。以100毫克/公斤UP780治療之動物在T30時顯示出顯著差異。陽性對照組，GW1929在分析之各時間點具有小於0.05之P －值。然而，在口服三週不含大量色酮之原始吉拉索蘆薈凝膠粉末(Qmatrix QM400)後顯示出並無效力(第14A－E圖)。此實驗清楚證實：與不含色酮之組成物相較下，富含色酮之組成物具有令人意外且優異之胰島素致敏化效力。
再者，在每日口服治療10週後，在胰島素耐受性試驗中證實UP780之胰島素致敏化效果。與葡萄糖耐受數據相一致，以400毫克/公斤UP780治療之動物可在所有考量之時點觀察到統計上有意義之胰島素致敏化，P ≦0.05(＊ )(第15D圖)。相較下，在口服10週後，不含色酮之吉拉索蘆薈凝膠粉末(Qmatrix QM400)僅顯示出中度改良且僅有單一時點之顯著性(第15A圖)。
含有蘆薈苦素之增濃的吉拉索蘆薈凝膠粉末亦可持續維持低水準之空腹血液葡萄糖量。在治療之第2、5和7週分別監測空腹葡萄糖量。如第16圖所示，與未治療之載劑組相較下，在二週(第5和7週)中，以200毫克/公斤 UP780和GW1929治療之動物均顯示出統計上有意義之較低的空腹葡萄糖量。以Qmatrix和UP780(400毫克/公斤)治療之小鼠在第5週顯示出類似之較低的空腹血液葡萄糖量。另一方面，與未治療之載劑組相較下，以100毫克/公斤UP780治療之組在所有監測之數週確實維持相當高之空腹血液葡萄糖量，P ≦0.05(＊ )。類似之數據分析顯示與載劑組相較下，以200毫克/公斤UP780治療之動物在治療之第2、5和7週分別顯示出空腹葡萄糖量降低18%、20%及17%(第17圖)。
在此劑量範圍尋求研究中觀察以UP780及GW1929治療之動物接下去的低空腹三酸甘油脂量。相對於載劑組，以200、400及100毫克/公斤UP780和GW1929治療之動物在每日治療後7週所取得之空腹三酸甘油脂量的降低百分比分別為22.1%、22%、21.7%及22.7%(第18圖)。然而，以不含大量色酮之吉拉索蘆薈凝膠粉末(Qmatrix QM400)治療二週後顯示出僅改良2%之三酸甘油脂量，另外，此效果在接下去之二次測量中消失。此實驗清楚證實：富含色酮之植物萃取物在降低三酸甘油脂量上具有令人意外且優異之效力。
如第19圖所示，與載劑組相較下，所有治療組之膽固醇量均未觀察到有顯著變化。再者，在所有觀察之時間點，所有以GW1929、Qmatrix、UP780(100、200及400毫克/公斤)和載劑治療之小鼠的各組間均無明顯之體重增加或飼料消耗差異。即使各治療組(包括載劑和正常之齧 齒動物飲食組)中之動物在整個研究期間持續增加體重，各治療組間所注意到之體重增加差異並非統計上有意義，P ≦0.05(第20圖)。與體重數據相一致，所有組均有類似形態之飼料消耗(第21圖)。
從定義可知，基因組研究為大規模之基因組研究，其通常係利用含有涵蓋所有表現之基因的探針組的DNA微陣列晶片進行。咸信，哺乳動物系統中有25,000種基因具有功能及表現。將微陣列晶片與自mRNA製備之cRNA/cDNA雜合後，自微陣列晶片偵測到之信號應反應mRNA之組織/細胞來源的基因表現譜。藉由基因組資料庫來分析具表現變化之基因(通常為數千個)參與生物通路的情況。
吾人依實例20中之描述進行UP780之微陣列研究。所使用之微陣列晶片為來自Affymotrix之老鼠基因組4302.0，其中含有45,000組探針組。為了驗證基因表現變化，藉由強有力之ANOVA統計方法分析基因表現變化的微陣列資料。依實例21中之描述，進一步藉由定量逆向轉錄－PCR(QPCR)確定具表現變化之關鍵基因。以Ingenuity pathway Analysis軟體及資料(IPA5)分析該藉由影響代謝及訊號傳導通路之基因表現變化所偵側之療效。
高血液葡萄糖量使胰臟β細胞分泌胰島素，以令肝臟及肌肉中之葡萄糖轉運子轉位至漿膜以攝取葡萄糖並將葡萄糖以肝醣形式貯存。胰島素亦可增加肝臟及脂肪組織中之脂肪酸和三酸甘油脂合成以及脂肪組織中脂肪之儲存。 抗胰島素症係由錯誤之胰島素受體訊號傳導串聯反應產生，其造成葡萄糖轉運子減少轉位至漿膜、減少脂肪貯存、增加血液葡萄糖及游離脂肪酸。高血液游離脂肪酸將胰島素受體受質(IRS)去活化並且為誘導抗胰島素症之因子。
用於UP780效力分析之C57BL6前糖尿病老鼠模型為用於微陣列之老鼠組織的來源。自無脂肪對照組、高脂肪飲食(亦稱為載劑)組及高脂肪飲食加UP780(200毫克/公斤)之治療組取得老鼠組織進行RNA萃取，各複製三份。對能量吸收、代謝、抗胰島素症、肥胖及糖尿病而言重要之組織為肝臟、肌肉和脂肪。完成一組肝臟微陣列資料組。一般而言，與無脂肪對照組(LC)相較下，高脂肪飲食(LV)增加基因表現，但藉由高脂肪飲食＋UP780(LUP，第23圖)可降低許多基因表現量。
微陣列和QPCR研究中最重要的發現為實例20及21中所說明之藉由UP780降低脂肪酸合成。與高脂肪飲食相較下，UP780可分別減少速度限制酶，乙醯基－CoA羧基酶(ACC2)及脂肪酸合成酶(FASN)轉錄子3倍及3.5倍(表1和第24及25圖)。高脂肪飲食使來自葡萄糖之過多能量轉化成脂肪，以致於不可避免地增加血漿游離脂肪酸因而引起肌肉中之抗胰島素症。如在動物模型中所觀察到者，UP780減少生物合成脂肪酸的直接結果應為增加之胰島素敏感性及葡萄糖耐受性。
另外，缺乏硬脂醯－CoA去飽和酶(SCD1)(其為合成多不飽和脂肪酸之執行酶)之小鼠在攝取高脂肪飲食時仍保持纖瘦。與高脂肪飲食組相較下，UP780減少SCD1轉錄子4.44倍。
與無脂肪對照組及高脂肪飲食組相較下，微陣列分析亦顯示出UP780降低涉入粒腺體脂肪酸β氧化作用之酶的轉錄子量(表1)。減少之β－氧化作用可在攝取高能量時將粒腺體氧化作用之總量正常化，結果可能使粒腺體氧自由基之產生正常化。
已知高類固醇量可反饋及減少類固醇之生物合成，這種情況可在高脂肪飲食及UP780治療組中觀察到，尤其是速度限制酶HMG－CoA(表1)。與高脂肪飲食組相較下，UP780增加CYP7A1，如此可能具有增加生物合成膽酸的優點。
在糖解/糖質新生通路中之總體基因表現變化指出總體變化少，因為所涉及之大部分酶為雙向。肝臟糖質新生之速度限制酶為丙酮酸代謝通路中之磷酸烯醇氏丙酮羧酸激酶(PEPCK)(表1)。與無脂肪對照組相較下，微陣列及QPCR顯示出UP780增加PEPCK轉錄子之傾向，但與高脂肪飲食組則相等(第26圖)。此點會增加血液葡萄糖，而在抗肥胖抗糖尿病治療中避免之。然而，如上述之動物研究所示，若肌肉顯示出UP780提高葡萄糖之攝入及利用，則該淨效果可為總體平衡。
藉由微陣列及QPCR，與高脂肪飲食組相較下， UP780可使肝臟中脂肪酸結合蛋白FABP5之轉錄子增加1.74倍(表1及第27圖)。增加之FABP5可促進脂肪酸轉運並減少引起抗胰島素症之游離血漿脂肪酸。UP780減少漿膜LDL受體，此可減少自血液攝入LDL並減少肝臟三酸甘油脂含量。再者，與高脂肪飲食組相較下，UP780亦可減少用於攝入漿膜HDL、氧化之LDL及脂肪酸之CD36，此可進一步減少肝臟之脂肪含量(表1)。
高脂肪飲食增加涉及PPARα/RXRα肝臟訊號傳導通路之基因轉錄子，而此可藉由UP780減少，尤其是PPARα 、CD36及c－Jun。肝臟中之PPARα 活化時可藉由提高HDL及降低LDL來將血漿脂質之變化形廓正常化。然而，高脂肪飲食或UP780均不會明顯改變ApoA1及ApoA2(二種均為HDL之載脂蛋白)之轉錄子量。UP780對PPARα 之作用值得進一步注意。
UP780減少許多涉及藥物代謝及解毒之酶(包括CYP7B1、CYP2B9、CYP2C18、麩胱甘肽－S－轉移酶和SOD3)的轉錄子，此作用亦值得進一步研究(表1)。
AMPK被視為能量平衡之細胞感應子。健康細胞總是維持高ATP濃度。當AMP/ATP比增加時AMPK會被活化，此為一種能量壓力之徵兆(Hardie(2004)J Cell Sei 117：5479)。AMPK活化可抑制葡萄糖及脂肪酸合成、增加攝入葡萄糖及脂肪、增加糖解及脂肪酸β－氧化作用並減少蛋白質合成及細胞生長(Hardie(2004)Rev Endoerine & Metabolie oisorders 5：119)。UP780逆轉由高脂肪飲 食引起之AMPK轉錄子量降低(第28圖)。
在CD－1小鼠中測定富含色酮之植物萃取物UP780的安全性變化形廓，而此組成物經測出為耐受性良好。如實例22中所示，在整個研究期間，每日給予CD－1小鼠2克/公斤之UP780共14天不會引起生病或死亡。在整個研究期間，系統性每日檢查小鼠之生理狀況及幸福感，結果並無與測試化合物相關之毒性或異常的徵兆。在此急性毒性研究中，整個研究過程中所有小鼠持續增加體重(第22A及B圖)。在此14天之毒性研究中，所有主要之血液生化讀值均在正常範圍內(除了電解質之讀值稍微偏離參考範圍外)。與載劑組相較下，以UP780治療之雌性動物的天門冬胺酸胺基轉移酶(AST)、鈉、鉀及平均紅血球血紅素濃度(MCHC)和雄性動物的總蛋白質及血液尿素氮(BUN)並無統計上有意義之差異，P ≦0.05(數據未顯示)。所觀察到之MCHC、總蛋白質及BUN的平均值仍在正常之參考範圍內；然而，AST、鈉及鉀之平均值係在正常範圍外。
在載劑對照組及以UP780治療之動物中，所有老鼠在屍體解剖後之肉眼檢查結果一般來說均為正常(數據未顯示)。在任何特別用於顯微鏡檢查之組織中，投服UP780共14天之小鼠中並未觀察到與測試物相關之顯微鏡變化。在檢查之器官及組織中所觀察到之一些各式各樣的顯微鏡變化類型為那些經常在此年齡及品種之實驗室老鼠中所觀察到之自發性改變。所觀察到之電解質不平衡可 由許多情況引起，包括腎臟及腎上腺病症，以及任何造成嘔吐及/或腹瀉的疾病。低AST值並無臨床上的意義。由於缺少臨床觀察、血液學數值及組織病理學中之對應事證，吾人相信這些與正常值的誤差可能係由居家及實驗室條件造成。另外，來自心理壓力之溶血及脾臟收縮所造成之影響(如：細胞漏損)可能造成分析物讀值之錯誤增加或降低。因此，根據血液學、血液化學及組織病理學中之臨床發現及實驗室報告可歸結出：本研究中之任何小鼠在此劑量下並無任何系統性毒性之跡象。載劑或測試物對這些偶然發現之類型、發生率或嚴重性並無影響。
本發明化合物以及含該化合物之植物可以調配成錠劑、膠囊、軟膠囊，以飲食補充品的形式遞送，亦可調配在例常飲食及/或機能性食物、動力營養棒(power bar)、果汁飲料及碳酸飲料或一般用於預防及治療高血糖、高膽固醇、高三酸甘油脂、過重之飲料；及用於維持哺乳動物(包括，但不限於人類)之健康的脂質變化形廓、正常化之血糖量、體重喪失和預防心血管疾病之飲料中。
用於在藥學組成物中投服之化合物可藉由本技藝之技術熟習人士所熟知之多種方法進行。色酮類可配製成下列形式：其天然存在形式之草本植物粉末；不同濃度之溶劑及/或超臨界流體萃取物；透過再結晶、管柱分離、溶劑分佈、沈澱及其他方式增濃及純化之化合物；含有經由合成方法製備之實質上純化的色酮之純物質及/或混合物。
本技藝已知多種不同之遞送系統且其可用於投服本發 明之治療組成物，包括：用於口服之粉末、膠囊、錠劑、酊劑、舌下遞送系統、食品棒及多種不同之溶液，包括水、果汁及碳酸軟性飲料、乳脂及乳劑。該組成物可以水溶液、包囊在微脂粒、微粒及微膠囊之形式遞送。本發明之治療組成物可藉由注射經由腸胃道外途徑投服，但亦可發展其他有效之投服形式，諸如關節內注射、吸入劑噴霧、口服及局部活性之製劑、透皮離子穿透或栓劑。生理食鹽水溶液為一種較佳載體，但亦可考慮使用其他藥學上可接受之載體。於一較佳體系中，可發展由該載體及色酮構成之生理上相容、緩慢釋出之製劑。在這類載體中之初始溶劑本質上可為水性或非水性。另外，該載體可含有其他用於修改或維持製劑之pH、滲透壓、黏性、透明度、顏色、無菌性、穩定性、分解速率或味道之藥學上可接受的賦形劑。類似地，該載體仍可含有其他用於修改或維持配體之穩定性、分解速率、釋出或吸收之藥學上可接受的賦形劑。這類賦形劑為那些經常及慣常用於調配用於腸胃道外途徑投藥之藥劑(為單位或複數劑型)的物質。
一旦配製好治療組成物可將其以溶液、懸浮液、乳膏、凝膠、乳劑、固體或脫水或凍乾之粉末形式貯存在無菌小玻璃瓶中。這類製劑可以即時可用之形式或需在投服前即時重構成之形式貯存。含有用於系統遞送之組成物的製劑之投服方法可為經由口、皮下、肌肉內、靜脈內、局部、鼻內或陰道內途徑或以直腸栓劑進行。
可在治療特殊疾病或病況時生效之組成物的量係根據 該疾病或病況之性質而定，而此可藉由標準臨床技術測定。另外，可選擇性地使用活體外或活體內分析來協助鑑定理想之劑量範圍。欲用於製劑中之精確劑量亦將根據投服路徑及該疾病或病況之嚴重性或進展而定，且應根據各開業醫及各患者之環境決定。有效劑量可從自玻管中或動物模型測試系統衍生之劑量－反應曲線外推。例如：本發明組成物之有效量可經由投服分級之組成物劑量並觀察所需效果而輕易地決定。
根據本發明之治療方法包含經由內部或局部途徑給予有此需要之哺乳動物(包括人類)治療上有效量之一或多種來自單一來源或多種來源之色酮。根據用來取得該化合物之方法，色酮或其混合物之純度可在0.01%至100%的範圍內。在口服、注射投服、局部投服、霧狀滴、栓劑、皮內投服製劑之色酮組成物的濃度可為該合適製劑之總量的0.001%至99.99重量%。色酮類可藉由選自下列之標準途徑使用：口服、局部、霧狀滴、栓劑、皮內、肌肉內及靜脈內投服，哺乳動物(尤其是人類)之每日劑量係在每公斤體重0.01毫克至500毫克之範圍內。
下列實例僅用於說明而非用於限制本發明之範圍。
實例1. 自乾燥植物製備有機及水性萃取物之方法
將乾燥植物物質研磨成不大於2毫米之顆粒大小並利用ASE 300自動萃取儀，以100毫升之甲醇：二氯甲烷 (1：1)萃取其中20克部分三次。利用旋轉蒸發器和高速真空乾燥來移除溶劑，以取得有機萃取物(OE)。為各植物萃取物稱重(約75毫克)並將其溶解在1.5毫升DMSO中，以製成濃度為50毫克/毫升之溶液。
實例2. 老鼠3T3－L1細胞株及培養條件
3T3－L1(一種胚胎老鼠細胞株(美國型培養收集處(American Type Culture Collection)，維吉尼亞州莫納沙市(Manassas)))為可自前脂肪細胞分化成脂肪細胞狀態之3T3瑞士白色株的亞株。將這些前脂肪細胞培養在含有10%胎牛血清(FBS)(Mediatech公司，維吉尼亞州赫頓市(Herndon))之杜白可氏(Dulbecco)修正的伊果氏(Eagle)介質(DMEM)中。
實例3. 脂締素ELISA分析
為了建立分化變化形廓，將3T3－L1細胞接種在96槽盤中並培養一整夜至細胞融合。在細胞融合後2天誘導融合之細胞分化。以補充有0.5mM異丁基甲基黃嘌呤、1.0μM地塞米松及1.7μM胰島素(Sigma－Aldrieh，密蘇里州聖路易市)之培養介質進行誘導。在第7天，以對照組化合物或植物萃取物處理脂肪細胞24小時。將對照組及植物萃取物溶解在DMSO中並以總體積之1%加入培養介質中。收集細胞介質並根據製造者(R&D系統，明尼蘇達州明里亞波里市)之擬訂計劃藉酶－連接之免疫吸附分析 (ELISA)測量脂締素之量及分析。分析敏感性之範圍係在31.25－2000微微克/毫升。陽性對照組之測試範圍係在0.01－300μM(第1圖)。脂締素量之最大增加倍數可在1μM之吲哚美辛及曲格列酮(troglitazone)觀察到，其脂締素量分別增加1.6－及1.7倍。
由於分析之不良的信號對背景比例(小於2)，先前提及之議定計劃需要加以改良。依前述接種脂肪細胞並使其分化。使細胞在加有或不加有胰島素之分化介質中分化48小時。然後，分化後，以對照化合物或植物萃取物處理細胞48小時。所有其他參數與先前所提及者相同。吲哚美辛(第1圖)及曲格列酮(其數據未顯示)對照組之測試範圍分別為10－100μM及3－30μM。脂締素量增加最多者為以100μM吲哚美辛(第1B圖)處理所取得之高於基線信號52倍。以曲格列酮處理時，增加最多之脂締素量為在30μM處所觀察到之49倍，而增加最少之脂締素量為在3μM處所觀察到之24倍(其數據未顯示)。此二種化合物均顯示出所增加之脂締素量實質高於已發表之數據。
實例4. 可增加脂肪細胞中脂締素之製造的植物萃取物之篩選方法
利用實例3中描述之脂締素ELISA分析對植物萃取物庫進行篩選。利用吲哚美辛及曲格列酮作為對照組，篩選該依實例1中之描述所分離出之有機萃取物，操作時複製三份。在2059種粗萃取物中有14.9%可誘導出較對照 組之產量為高之脂締素產量。在陽性萃取物中有37種萃取物(全部之1.8%)較曲格列酮對照組之最低濃度更活躍。藉系列稀釋液重新測試此37種粗萃取物。來自開普蘆薈葉分泌液之有機萃取物，P0017－OE，顯示出具良好之脂締素誘導作用的劑量反應曲線(第2圖)，並被選擇用於進一步之評估中。
實例5. 來自開普蘆薈之活性有機萃取物的高通量純化方法(HTP)
選擇P0017－OE進行由生物分析引導之活性化合物分餾法。將P0017－OE(400毫克)填至預先裝填之正相快速柱(2公分IDx8.2公分，10克矽膠)上。利用日立高通量純化(HTP)系統，以(A)50：50 EtOAc：己烷及(B)甲醇之梯度流動相，在30分鐘內，從100%A至100%B，以5毫升/分鐘之流速洗提管柱。利用寬頻波長UV偵測器監測分離過程並利用Gilson分餾物收集器將分餾物收集在96－深槽盤中，每槽1.9毫升。將具類似之UV吸收及持留時間的分餾物合併成8種次分餾物並在低度真空及離心下乾燥，命名為P0017－OE－NP－F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7及F8(第3圖)。使用DMSO溶解各次分餾物(50微克/微升)並取出一部分(2微升)以用於脂締素分析中。P0017－OE－NP－F3為8種次分餾物中最活躍者。
實例6. P0017－OE－NP－次分餾物之LC－MS/PDA去冗餘 方法
由於P0017－OE－NP－F3被證明為脂締素分析中最活躍之次分餾物，使用LC－MS/PDA分析自HTP－分餾中取得之各P0017－OE－NP－次分餾物並將其彼此比較以找尋P0017－OE－NP－F3中之獨特的化合物峰。根據分子量及文獻搜尋來推論P0017－OE－NP－F3中最可能之具分子量394(蘆薈苦素)及396(蘆薈苦醇)的活性化合物。
實例7. 來自開普蘆薈之蘆薈苦素及蘆薈苦醇的萃取和純化方法
以甲醇(3x)萃取開普蘆薈葉分泌液(P0017)(200克)。將合併之甲醇溶液在低度真空下蒸發以產生甲醇萃取物。利用實例6中所描述之方法分餾來自P0017－OE－NP－F3之甲醇萃取物(5克)。將活性分餾物(等於實例6中之P0017－OE－NP－F3分餾物)(150毫克)填至Phenomenex Luna C18 管柱(250x30毫米10μ)上並在日立高通量純化(HTP)系統上，以水(A)及(B)甲醇之梯度流動相，在40分鐘內從90%A至100%B，以5毫升/分鐘之流速洗提管柱，再以100%甲醇清洗10分鐘。利用寬頻波長UV偵測器監測分離過程並利用Gilson分餾物收集器將分餾物收集在管中。以手工方式自4次C18 －柱之運作中收集10種主要化合物峰液。將10種分餾物乾燥並藉再結晶作用純化之，再分別命名為P0017－AC1、P0017－AC2、P0017－AC3、P0017－AC4、P0017－AC5、P0017－AC6、P0017－AC7、 P0017－AC8、P0017－AC9及P0017－AC 10(第4圖)。P0017－AC1及P0017－AC2在脂締素分析中顯示出具活性並分別被鑑定為蘆薈苦素及蘆薈苦醇。剩餘之8種化合物無活性或較不活躍。
實例8. 蘆薈苦素之詳細鑑定方法
蘆薈苦素(UP394)：產量，2.4%來自P0017－OE－NP－F3(純度>98%，HPLC)；UV(Max)：248.4及295.9 nm；MS(ESI，陰離子偵測)：m/z395(M－1,100%)。樣本中攙入蘆薈苦素標準(其在HPLC層析圖上顯示相同之持留時間)(第5圖)。
實例9. 蘆薈苦醇之詳細鑑定方法
蘆薈苦醇(UP396)：產量，1.4%來自P0017－OE－NP－F3(純度>97%，HPLC)；UV(Max)：248.4及295.9 nm；MS(ESI，陰離子偵測)：m/z395(M－1,100%)。樣本中攙入蘆薈苦醇標準(其在HPLC層析圖上顯示相同之持留時間)(第6圖)。
實例10. 藉蘆薈苦素(UP394)及蘆薈苦醇(UP396)增加脂締素之製造
依實例3中之描述測試濃度為30μM之二種純色酮，UP394(蘆薈苦素)及UP396(蘆薈苦醇)增加自脂肪細胞製造脂締素之效果。蘆薈苦素及蘆薈苦醇分別顯示出可增加 自脂肪細胞製造脂締素2及3.2倍(第7圖)。
實例11. N931(批號D1205－01)之詳細製備方法
將自開普蘆薈葉分泌液分離出之純色酮蘆薈苦素(UP394)與自吉拉索蘆薈製備之全葉凝膠粉末合併以製造此獨特之物質組成物(N931)。來自二種品種之蘆薈的標準化色酮組成物含有不少於1.4%之色酮－即，蘆薈苦素(UP394)。蘆薈苦素(UP394)係自開普蘆薈葉之全葉分泌液萃取出，藉製備性層析管柱分離再依美國專利案第6,451,357號，標題“Method of purification of Aloesin”(其全部內容併為此文之參考資料)中之描述經由再結晶進一步純化。此獨特之標準化色酮組成物經鑑定為N931。
然後，將0.811公斤之蘆薈苦素(批號A－2705，其具93%之純度及5%濕度含量)加至50公斤之吉拉索蘆薈全葉噴霧乾燥凝膠粉末(Aloecorp零件編號：5020，批號RM－040805－02及RM－040805－05)中，再以V－攪拌器攪拌此混合物。啟動增強棒(intensifier bar)並使增強棒和殼運作不少於5分鐘且攪拌時間不超過7分鐘。僅關閉增強棒並持續攪拌不少於5分鐘且不超過10分鐘。再度打開增強棒並攪拌不少於5分鐘且不超過7分鐘。停止攪拌，收集攪拌好之物質，藉由HPLC方法定量出之UP780中的蘆薈苦素含量為1.5%。
實例12. 由高脂肪飲食誘導之前糖尿病模型
發展一由高脂肪飲食誘導之動物模型並用來評估色酮萃取物之可能療效。C57BL/6J為一種可用於研究第2型糖尿病、不良之葡萄糖耐受性及研發新穎治療劑之臨床相關的動物模型(Ahren et al.(2004)Diabetes 53(Supplement 3)：S215－S219；Laakso et al.(2004)Diabetes Care 27：2253－2259；Kahn et al.(2004)Diabetes 53：3274－3285；Scheurink et al.(1998)European J Endo.139：461－467；Yuan et al.(2002)Diabetes 51：1851－1858；Reitman et al(2005)Endocrinology 145：3258－3264；Vlassara et al.(2005)Diabetes 54：2314－2319；Cawthorne et al.(2002)Molecular and Cellular Proteomics 1：509－516)。模型誘導之方法首先由Surwit等人於1988年提出解釋(Diabetes,37：1163－1167)。簡單地說，餵食高脂肪飲食8週後可在C57BL/6J小鼠中成功引起不良之葡萄糖耐受性及似第2型糖尿病症狀。自傑克森(Jackson)實驗室(Bar Harbor，ME)購得6週大之雄C57BL/6J小鼠。經過1週之適應期後將動物分成數組(n＝5或6)並提供可任意取得之高脂肪(45%千卡)齧齒動物小丸飲食(Research diets,Inc.,New Brunswick,NJ)及水12週(除了進行葡萄糖及胰島素耐受性試驗時停止供應3小時)。將動物維持在控制溫度(22.2℃)，明－暗週期為12小時之房間內。依前述每週監控血液葡萄糖、膽固醇及三酸甘油脂共12週。每週量一次體重，共12週。
一旦經由每週監測選定之參數(葡萄糖、三酸甘油脂 及膽固醇)而確認誘導出疾病後(即，第8週)，開始每日經由腹膜內途徑進行治療並維持4週。在研究之每一天，將測試化合物及陽性對照組GW1929(Tocris Bioscience,Ellisville MO,批號2A/58705)溶解在0.5%甲基纖維素(Sigma,St.Louise MO,批號116H0857)中，並分別經由腹膜內途徑遞送100及5毫克/公斤之劑量。由於GW1929無法完全溶解在甲基纖維素中，因此先將其溶解在DMSO(Sigma,St.Louise MO,批號064K0067)中。然後，在投藥前將各化合物(包括載劑)之最終濃度調整為含有5%DMSO。經載劑治療之動物僅接受0.5%甲基纖維素。在投服各化合物或載劑後未觀察到可偵測之刺激徵兆。
所使用之陽性對照組，GW1929，N－(2－苄醯苯基)－O－[2－(甲基－2－吡啶胺基)乙基]－L－酪胺酸，為一種具整批分子量為504.59之黃色固體粉末(Tocris Bioscience,Ellisville MO,批號2A/58705)。此化合物為選擇性、口服活性PPARγ激動劑。經由口服時，其可在糖尿病動物模型中降低葡萄糖、脂肪酸及三酸甘油脂量(Brown et al.(1999)Diabetes 48：1415；Way et al.(2001)J.Biol.Chem.276：25651－25653)。提供動物高脂肪飲食12週。第8週開始治療並持續4週。
實例13. UP394及UP396對抗胰島素症之效果
經由腹膜內途徑投服GW1929(5毫克/公斤)、UP394(100毫克/公斤)、UP396(100毫克/公斤)及載劑治療 C57BL/6J小鼠後第18天，依實例13中之描述，以2克/公斤之劑量進行腹膜內葡萄糖耐受性試驗。在投給葡萄糖前先令動物空腹3小時。在0、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。數據係以平均值±SD，n＝6表示。與載劑組相較下，GW1929及UP396組在60、90及120分鐘時可觀察到顯著之葡萄糖利用，p<0.05。與載劑組相較下，T0時GW1929、UP394及UP396組之P－值分別為0.00、0.87及0.43：T30時分別為0.07、0.16及0.23。與載劑組相較下，T60時UP394組之P－值為0.15；T90時為0.10而T120時為0.17(第8A圖)。
UP394及UP396在葡萄糖耐受性試驗中均顯示出胰島素致敏化效果。經口投服GW1929(5毫克/公斤)、UP394(100毫克/公斤)、UP396(100毫克/公斤)及載劑治療C57BL/6J小鼠後第24天，以0.5單位/公斤之劑量依實例13中之描述進行腹膜內胰島素耐受試驗。在注射胰島素前先令動物空腹3小時。在0、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。數據係以平均值±SD，n＝6表示。與載劑相較下，UP394和UP396以及GW1929在T30、T60及T90之時間點可觀察到顯著之葡萄糖清除，p<0.05。與載劑相較下，T0時GW1929、UP394及UP396之P－值分別為0.00、0.14及0.67：T120時分別為0.08、0.00及0.04(第8圖)。
實例14. UP394及UP396於由高脂肪飲食誘導之抗 胰島素症模型中對胰島素敏感性之效果
在以化合物UP394及UP396治療之動物中進一步證實口服UP394(100毫克/公斤)及UP396(100毫克/公斤)對抗胰島素症之效果。在那些動物中胰島素量顯著降低。以用於胰島素之ELISA套組(Crystal Chem－伊利諾州芝加哥市)測量血漿胰島素量。給予高脂肪飲食後8週(第9圖)，以GW1929、UP394及UP396和載劑治療動物2週。自尾部靜脈收集血液並加以離心以收集血漿。與載劑組相較下，第14天時可在GW1929、UP394及UP396之治療組中觀察到血漿胰島素量顯著降低，P<0.05。
實例15. N931於由高脂肪飲食誘導之抗胰島素症模型中對胰島素敏感性之效果
N931對降低db/db小鼠之血液葡萄糖量非常有效。每週測量以GW1929(5毫克/公斤)、N931(375毫克/公斤)及載劑治療之雄db/db小鼠(每組8隻小鼠)的空腹葡萄糖量。除了空腹時間外，任意給予動物T2018齧齒動物飲食。測量前令動物空腹一整夜。如第10圖所示，在10週之治療期間內以載劑治療之小鼠中的葡萄糖量增加。如預期者，GW1929(參考化合物)可將葡萄糖量維持在基線量。類似於GW1929，自治療之第5週開始，N931可實質上降低葡萄糖量。與載劑相較下，N931可在第6、7、9及10週時顯著降低空腹血液葡萄糖量，P<0.05。在治療之第10週，以N931治療之組中可觀察到葡萄糖量降低 46%。
實例16. N931在db/db老鼠模型中對抗胰島素症之效果
於治療10週後以3克/公斤之劑量在db/db小鼠上進行口服葡萄糖耐受性試驗。除了空腹時間外，任意給予動物T2018齧齒動物飲食。在投給葡萄糖前先令動物空腹一整夜。以GW1929(5毫克/公斤)、N931(375毫克/公斤)及載劑治療小鼠10週(每組8隻小鼠)。給予葡萄糖後0、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。與載劑相較下，以GW1929或N931治療之小鼠中可在0及120分鐘觀察到葡萄糖明顯從循環系統清除，P <0.05(第11A圖)。結果指出，N931具有增加葡萄糖耐受性之能力，因此，可改良db/db小鼠之胰島素敏感性。
於治療6週後以0.5單位/公斤之劑量在db/db小鼠上進行腹膜內胰島素耐受性試驗。在注射胰島素前先令動物空腹一整夜。以GW1929(5毫克/公斤)、N931(375毫克/公斤)及載劑治療db/db小鼠6週(每組8隻小鼠)。在注射胰島素後之0、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。同樣地，以GW1929及N931治療之小鼠中胰島素敏感性明顯改良。與載劑相較下，以GW1929及N931治療時可在0、30及60分鐘觀察到明顯之葡萄糖清除，p<0.05(第11B圖)。
實例17. 在N931db/db 老鼠模型中對三酸甘油脂量之效果
每週採取以GW1929(5毫克/公斤)、N931(375毫克/公斤)及載劑治療之雄db/db小鼠之空腹三酸甘油脂量10週。除了空腹時間外，任意給予動物T2018齧齒動物飲食。測量前令動物空腹一整夜。所指出之數值為載劑組之三酸甘油脂量的百分比，n＝8。與載劑相較下，以GW1929及N931治療10週後，動物之三酸甘油脂量明顯降低，P<0.05(第12圖)。
實例18. 富含色酮之組成物(UP780)的製備及投服方法
將自開普蘆薈葉分泌液分離出之純色酮蘆薈苦素(UP394)與自吉拉索蘆薈製備之葉凝膠粉末合併以製造此獨特之物質組成物(UP780)。來自二種品種之蘆薈的標準化色酮組成物含有不少於1.8%之色酮－即，蘆薈苦素(UP394)。色酮，蘆薈苦素(UP394)係自開普蘆薈之全葉分泌液萃取出，藉製備性層析管柱分離再依美國專利案第6,451,357號，標題“Method of Purification of Aloesin”(其全部內容併為此文之參考資料)中之描述經由再結晶進一步純化。此獨特之標準化色酮組成物經鑑定為UP780。
下述說明用於製備一批5公斤之富含蘆薈色酮的吉拉索蘆薈凝膠粉末，UP780的程序。此為一種在吉拉索蘆薈凝膠粉末中含有不少於2%蘆薈苦素之標準化蘆薈凝膠組 成物。將自開普蘆薈全葉分泌液純化之0.11克蘆薈苦素(批號11506AW，純度為100.6%)加至4.90公斤之吉拉索蘆薈凝膠(Qmatrix，脫水的)粉末(Aloecorp零件編號：AA8010XQ80，批號RM－120806－01)中。攪拌混合物以產生蘆薈色酮標準化組成物UP780(批號L1806QMAW－01)。藉由HPLC確認組成物(UP780)中之蘆薈苦素(UP394)的含量為2.2%。
餵食8週之高脂肪飲食後，一旦經由監測所選定之參數而確認已在動物中誘導出疾病後即開始每日之口服治療。每一天，將測試化合物及陽性對照組GW1929(Tocris Bioscience,Ellisville,MO,批號2A/58705)溶解在0.5%甲基纖維素(Sigma,St.Louise MO,批號116H0857)中，並遞送口服劑量為100、200及400毫克/公斤之UP780(批號L1806QMAW－01)：400毫克/公斤之Qmatrix吉拉索蘆薈凝膠粉末(QM400，批號G6319103－L3)及5毫克/公斤之GW1929。由於GW1929無法完全溶解在甲基纖維素中，因此先將其溶解在DMSO(Sigma,St.Louis,MO,批號064K0067)中。然後，在投藥前將各測試化合物(包括載劑)之最終濃度調整為含有5%DMSO。以載劑治療之動物僅接受0.5%甲基纖維素。在投服各藥物或載劑後未觀察到可偵測之刺激徵兆。
實例19. UP780在由高脂肪飲食誘導之C57BL/6J小鼠中的效力和劑量範圍之研究
依實例12中之描述，自傑克森實驗室(Bar Harbor，ME)購得6週大之雄C57BL/6J小鼠。經過1週之適應期後將動物分成6組(n＝7)並提供可任意取得之高脂肪(45%千卡)齧齒動物小丸飲食(Research Diets,Inc.,NewBrunswick,NJ)及水，除了進行葡萄糖及胰島素耐受性試驗時停止供應3小時。將動物維持在控制溫度(22.2℃)，明－暗週期為12小時之房間內。
將3或4隻雄C57BL/6J小鼠飼養在具有飼料及水區之老鼠籠內。經由測量先前稱重之高脂肪小丸值與該供應日所剩餘者間之差異來決定每日攝入之飼料。在整個研究過程中每週量一次體重。
利用自尾端靜脈取得之15－20微升之血液來測量空腹血液葡萄糖、總膽固醇及三酸甘油脂量。使用用於血液葡萄糖之具prestige試片(Walgreen,Home Diagnostics,Inc.,Ft.Lauderdale,FL)之IQ血液葡萄糖監測系統及用於膽固醇及三酸甘油脂之具PTS組試片(polymer Technology System,Inc,Indianapolis,IN)的CardioChek分析儀來測定膽固醇及三酸甘油脂之全血數值。
治療開始後之第0天(基線)、第3及9週進行腹膜內葡萄糖耐受性試驗。試驗當天，令動物空腹3小時並經由腹膜內途徑投服劑量為2毫克/克之葡萄糖。在遞送葡萄糖後之0(注射葡萄糖前)、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。自尾端靜脈取得血液。在第10週進行腹膜內葡萄糖耐受性試驗。令動物空腹3小時並經由腹膜內途 徑投服劑量為0.51U/公斤之胰島素(表現在酵母菌中之人類重組株，史格馬(Sigma)公司，密蘇里州聖路易市，批號055K1321)。在投服胰島素後之0(注射胰島素前)、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。自尾端靜脈取得血液。
實例20. DNA微陣列物質及方法
將小鼠分成7組治療組，每組中選擇3隻動物以供收集組織。治療10週後，以CO2 氣體麻醉小鼠並在安樂死後5分鐘內收集肝臟、體壁肌肉及脂肪。將組織切成小於5毫米之小塊並在組織收集期間浸沒在RNALater溶液(Ambion)中以保存之，稍後再移至－80℃冷凍庫中以供長期保存。為了分離RNA，將老鼠組織解凍並自RNALater貯存溶液中移出。使用RNEasy總RNA分離套組以萃取肝臟之總RNA，並使用RNEasy纖維組織套組(Qiagen)來萃取肌肉之總RNA。以玻璃Dunce均化器將組織在由RNEasy套組所提供之含RLT溶液的硫代氰酸肌及β－巰基乙醇中均化。藉由在260/280nm波長之UV吸收定量萃取出之RNAs。利用變性之乙二醛瓊脂糖凝膠(1%)電泳測定RNA之性質，以決定28S及18S rRNA帶之完整性並測定是否不存有基因組DNA。當自凝膠觀察基因組DNA時，以用於特殊RNA樣本之RNEasy套組進行第二輪萃取。
選擇Affymetrix老鼠基因組430 2.0陣列進行DNA微陣列研究。各陣列含有用於雜合之34,000種老鼠基因 之45,000組探針組及對照組序列、poly－A、100組正常化之探針組和管家基因。自12種Affymotrix授權之服務提供者的列表中選出CoGenics來進行cRNA合成方法、雜合/清洗、掃描並利用Affymetrix GCOS軟體分析資料。當接受RNA樣本時，CoGenics利用NanoDroP分光光度計及Agilont 2100生物分析儀進行其本身之內部RNA品質控制。在微陣列處理期間，Cogonics亦進行cRNAs及微陣列資料集之品質管制。在老鼠肝臟部分，選擇無脂肪對照組(LC)、高脂肪飲食(LV)及高脂肪飲食＋200毫克/公斤之UP780(LUP)進行微陣列實驗，共9種陣列。所有RNAs、cRNAs及最終之微陣列資料集均通過品質管制。
Affymetrix老鼠基因組430 2.0陣列係依循標準之Affymetrix陣列設計：每一探針組有11對探針對，各探針對含有一完美配合(PM)及一錯誤配合(MM)之25－mer寡核苷酸。藉GCOS進行之資料分析係使用11PM及11MM強度值(減去背景值)。然後，根據平均強度值及用於陣列－對－陣列比較之靶的強度值將陣列之資料集整體性分級。亦利用Affymetrix軟體“表現操縱臺(Expression Console)”進行獨立之微陣列資料分析。除了GOCs中所使用之用於強度總結的MAS5算法外，RMA及PLIER算法可用於“表現操縱臺”中，亦可用於強度總結。
MM探針之用途已為一種爭論的主題。因此，吾人僅利用PM值、背景校正，以Bioconductor軟體進行額外之微陣列資料分析。各治療組具3組陣列。使用MA繪圖來 診斷治療組間之陣列一致性。利用Bioconductor中之R統計包的loess函數將不一致性正常化。在各治療組之探針組方面，將33PM值整合入一強度值(轉換成以2為底之對數)。進一步為各探針組(利用33對33PM值)進行各治療組間之ANOVA統計試驗。在LUP對LV、LUP對LC及LV對LC治療組間共進行3x45,000 ANOVA試驗。藉由錯誤發現率(FDR)及Holm之系列Bonferroni校正方法測試基因表現變化之顯著性(顯著性水準α＝0.05)。
微陣列資料組(通常在數千種具表現變化之基因的範圍內)需要通路分析軟體之協助來使該生物學意義合理。藉由智巧通路(Ingenuity pathway)分析軟體(IPA5)及相關基因組資料分析自PM值摘要之3組各LC、LV及LUP陣列之老鼠肝臟資料組。應用ANOVA p≦0.0001、log2強度≧2.5及log2比≧0.9之三種截止標準。IPA5產生40種經典通路及70種功能，其三種資料組中各有至少一組通過0.05之閾p－值。(經典通路係取自熟悉之訊號傳導和代謝通路資料，諸如Science STKE及KEGG。功能係根據基因本體論(GO)資料)。詳細分析該完善建立之經典通路，尤其是該顯示出清楚之UP780對營養代謝之影響的重要代謝通路。
實例21. 由UP780調節之基因表現的QPCR分析方法
自老鼠組織萃取出之總RNA通常較微陣列實驗中所 需者為多。因此，保留用於微陣列之相同的總RNA樣本以供藉由QPCR驗證微陣列之結果，此通常係在數個月後進行。總RNAs例行貯存於－80℃冷凍庫中且在長期貯存後並未觀察到降解。為了從總RNA逆轉錄合成cDNA，吾人使用由因維特金公司(InvitrogEn)供應之修正過之逆轉錄酶，SuperscriptⅢ與作為用於SuperscriptⅢ之試劑的緩衝劑、核苷酸、寡(dT)7 引物及不含RNAse之DNAseI。在各反應中，在50微升反應體積中使用5微克之總RNA。以水將第一股cDNA稀釋2.5x體積，每50微升之QPCR反應妙使用2微升之cDNA。使用前藉由DNA序列分析確認用於各基因之TagMan基因表現分析的ABI引物及探針組。所有探針均為以FAM－染料標示之MGB探針。使用來自ABI之2X TagMan Universal PCR Master Mix進行QPCR反應。藉ABI 7700序列偵測器進行熱循環測試及偵測，並透過ABI SDS軟體進行儀器控制及取得QPCR數據。使用△△Dt之相關定量方法且各QPCR 96－槽盤中含有對照組cDNA(LC)及對照組引物和管家基因GAPDH之探針組。
實例22. UP780之安全性的評估
自USDA核准之實驗室動物販售處Charles River實驗室(麻州威明頓市(Wilmington))購買目的－飼育CD－1小鼠。在動物到來時令其適應一週並在8週大時用來研究。將老鼠圈養在控制溫度(22.2℃)，明－暗週期為12小時之 房間內，並任意提供食物及水。
治療之第一天，在給藥前先測量基線體重，然後每週測量二次直到解剖屍體之日。經口給予治療組中之所有小鼠(n＝10，5隻雄性及5隻雌性)劑量為2.0克/公斤之UP780(批號：L1806QMAW－01)，連續14天，此UP780係包含在作為載劑之200微升水中，利用注射筒及18號球形尖端餵食針來給予小鼠。對照組(n＝10，5隻雄性及5隻雌性)僅接受200微升之水。
在測試前及研究期間每日進行系統性臨床觀察。監測動物毒性徵兆，包括：外皮顏色、毛皮、眼睛、黏膜、移動、呼吸、姿勢及其他奇怪之徵兆。臨床觀察任何藥學毒性徵兆，包括：顫抖、抽搐、腹瀉、昏睡、不健全、局部肌纖維抽動、排糞、唾液分泌、排出及脫水。在研究之最後一天以2%異氟烷，在2升/分鐘之氧氣流速下將所有動物麻醉，收集其血液並運送至Antech Diagnostics公司(奧勒岡州，波特蘭市)以供進行廣泛之變化形廓描繪。使用全血樣本(在紫帽微量採樣管中)進行血液學評估，而使用血漿(在含有分離劑凝膠之綠帽微量採樣管中)進行臨床化學評估。將所有動物放血以供肉眼檢查病理學。一旦打開腹腔後，以肉眼檢查器官並收集食道、胃、十二指腸、空腸、迴腸、盲腸、結腸、肝臟、直腸、腦(數種部分)、腦垂體、周圍神經與肌肉(坐骨的)、脊柱(3層)、眼睛、腎上腺、甲狀腺/副甲狀腺、胰臟、肺及氣管、喉嚨、主動脈(胸部的)、心臟、淋巴結(頸&腸系膜)、脾臟、胸腺、 腎臟、膀胱、睪丸、附睪、精囊、前列腺、子宮頸、卵巢、子宮、膽囊、股骨加關節、皮膚、唾液腺及舌頭之樣本組織，以10%緩衝之中性福馬林固定並送至研究病理學服務公司(Reserch pathology Services Inc)(賓州，新布里班)供組織病理學之準備及顯微鏡評估。
將所有來自臨床化學、血液學、體重及食物消耗之非分立資料與平均值和標準差一起列表。結果係根據病理學發現、異常生理徵兆及數據之統計估算來解釋。
第1圖係以圖形描述使用先前發表之實驗計劃(第1A圖)及改良之實驗計劃(第1B圖)時吲哚美辛(indomethacin)對分泌入介質中之脂締素量的效果。第1A圖誘導3T3－L1細胞分化7天並以吲哚美辛處理24小時。使用1μM之吲哚美辛所增加之脂締素量的最高平均倍數為1.6倍。第1B圖誘導3T3－L1細胞分化2天並以吲哚美辛處理2天。使用100μM之吲哚美辛所增加之脂締素量的最高平均倍數為52倍，而10μM之最低增加倍數為7倍。
第2圖係以圖形說明開普蘆薈植物萃取物(P0017－OE)對分泌入分化之3T3－L1細胞的介質中之脂締素量的效果。簡單地說，誘導3T3－L1細胞分化，再以濃度為0.5、0.166及0.055毫克/毫升之粗有機萃取物P0017－OE處理48小時。將粗有機萃取物先以1：3稀釋，再以1：9稀釋，以測試劑量－反應。
第3圖描述P0017－OE之HTP－UV變化形廓及分餾物組合。將所有96種分餾物合併成8種次分餾物。P0017－OE－NP－F3為脂締素分析中，8種次分餾物中最活躍者。
第4圖說明係以圖形說明P0017－OE－NP－F3之C18分餾管柱。P0017－AC1及P0017－AC2在脂締素分所中顯示活性並分別被鑑定為蘆薈苦素及蘆薈苦醇。
第5圖描述經由UV波譜解析及與真實標準比較HPLC持留時間來鑑定蘆薈苦素(UP394)。
第6圖描述經由UV波譜解析及與真實標準比較HPLC持留時間來鑑定蘆薈苦醇(UP396)。
第7圖係以圖形說明UP394(蘆薈苦素)及UP396(蘆薈苦醇)對分泌入分化之3T3－L1細胞的介質中之脂締素量的效果。簡單地說，誘導3T3－L1細胞分化，再以濃度為30μM之UP394(蘆薈苦素)及UP396(蘆薈苦醇)處理48小時。以用於脂締素之ELISA套組測定培養介質中之脂締素濃度。
第8A圖說明於治療後第18天，以2克/公斤之劑量在C57BL/6J小鼠中進行的腹膜內葡萄糖耐受性試驗之結果。簡單地說，在投給葡萄糖前先令動物空腹3小時。以GW1929(5毫克/公斤)(■)、UP394(100毫克/公斤)(▲)、UP396(100毫克/公斤)(x)及載劑(◆)經由腹膜內途徑治療小鼠。在0、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。給予動物高脂肪飲食12週。第8週開始治療。數值係以平均值±SD，n＝6表示。與載劑組相較下，GW1929及 UP396組在60、90及120分鐘時可觀察到顯著之葡萄糖利用，p<0.05(＊ )。與載劑組相較下，T0時GW1929、UP394及UP396組之P－值分別為0.00、0.87及0.43；T30時分別為0.07、0.16及0.23。與載劑組相較下，T60時UP394組之P－值為0.15；T90時為0.10而T120時為0.17。
第8B圖說明於積極治療後第24天，以0.5單位/公斤之劑量在C57BL/6J小鼠中進行的腹膜內胰島素耐受性試驗之結果。簡單地說，在注射胰島素前先令動物空腹3小時。以GW1929(■)、UP394(▲)、UP396(x)及載劑(◆)經由腹膜內途徑治療小鼠24天。在0、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。給予動物高脂肪飲食12週。第8週開始治療。數值係以平均值±SD，n＝6表示。與載劑組相較下，UP394和UP396以及GW1929組在T30、T60及T90之時間點可觀察到顯著之葡萄糖清除，p<0.05(＊ )。與載劑組相較下，T0時GW1929、UP394及UP396組之P－值分別為0.00、0.14及0.67；T120時分別為0.08、0.00及0.04。
第9圖係以圖形說明使用因高脂肪飲食所誘導之糖尿病模型時，UP394和UP396對胰島素量的效果。給予動物高脂肪飲食來誘導代謝疾病8週後，以GW1929(5毫克/公斤)、UP394(100毫克/公斤)、UP396(100毫克/公斤)及載劑經由腹膜內途徑治療動物。自尾部靜脈收集血液並加以離心，以收集血漿。以用於胰島素之ELISA套組 (Crystal Chem－伊利諾州芝加哥市)測量血漿胰島素量。
第10圖係以圖形說明以GW1929(■)、N931(▲)及載劑(◆)治療10週後，雄db/db小鼠之每週的空腹葡萄糖量。除了空腹時間外，任意給予動物T2018齧齒動物飲食。測量前令動物空腹一整夜。數值係以平均值±SD，n＝8表示，與載劑組相較下，GW1929及N－931組在第6、7、9及10週時空腹血液葡萄糖量顯著降低，P<0.05(＊ )。
第11A圖描述於治療10週後，以3克/公斤之劑量在db/db小鼠上進行的口服葡萄糖耐受性試驗之結果。在投給葡萄糖前先令動物空腹一整夜。以GW1929(■)、N931(▲)及載劑(◆)治療小鼠10週。在0、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。除了空腹時間外，任意給予動物T2018齧齒動物飲食。數值係以平均值±SD，n＝8表示。與載劑組相較下，GW1929及N931組可在0及120分鐘之時間點觀察到顯著之葡萄糖利用，P<0.05(＊ )。與載劑相較下，T30時GW1929及N931組之P－值分別為0.15及0.05；T60時分別為0.33及0.02；T90時分別為0.002及0.083。
第11B圖描述於治療6週後，以0.5單位/公斤之劑量在db/db小鼠上進行的腹膜內胰島素耐受性試驗之結果。在注射胰島素前先令動物空腹一整夜。以GW1929(■)、N931(▲)及載劑(◆)治療小鼠10週。在0、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。除了空腹 時間外，任意給予動物T2018齧齒動物飲食。數值係以平均值±SD，n＝8表示。與載劑組相較下，GW1929及N931組在0、30及60分鐘均可觀察到顯著之葡萄糖清除，p<0.05(＊ )。與載劑組相較下，T90時GW1929及N931組之P－值分別為0.00及0.14；T120時分別為0.00及0.09。
第12圖係以圖形說明以GW1929、N931及載劑治療10週後，雄db/db小鼠之每週空腹三酸甘油脂量。除了空腹時間外，任意給予動物T2018齧齒動物飲食。測量前令動物空腹一整夜。數值係以載劑組之三酸甘油脂量的百分比表示，n＝8。與載劑組相較下，以GW1929及N931治療10週後，動物之三酸甘油脂量顯著降低，P<0.05(＊ )。
第13A－13F圖說明開始治療後第3週進行之腹膜內葡萄糖耐受性試驗之結果。試驗當天，令動物空腹3小時，再經由腹膜內途徑投服劑量為2毫克/克之葡萄糖。在遞送葡萄糖後之0(注射葡萄糖前)、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。自尾端靜脈取得血液。數值係以平均值±SD，n＝7表示。A.載劑(◆)對400毫克/公斤Qmatrix，B.載劑(◆)對GW1929(■)，C.載劑(◆)對UP780(100毫克/公斤)(■)，D.載劑(◆)對UP780(200毫克/公斤)(■)，E.載劑(◆)對UP780(400毫克/公斤)(■)及F.載劑(◆)對以一般齧齒動物飲食餵食之動物，P <0.05(＊ )。最早在治療3週時可偵測UP780之效力。每日口服治療3週後，經腹膜內途徑給予葡萄糖後30、60 及90分鐘，可在以200毫克/公斤UP780及GW1929治療之動物中觀察到統計上有意義之葡萄糖清除。類似地，30分鐘時，以400毫克/公斤UP780治療之動物顯示出顯著之葡萄糖利用，P ≦0.05(＊ )。
第14A－14E圖說明開始治療後第9週進行之腹膜內葡萄糖耐受性試驗之結果。試驗當天，令動物空腹3小時，再經由腹膜內途徑投服劑量為2毫克/克之葡萄糖。在遞送葡萄糖後之0(注射葡萄糖前)、30、60、90及120分鐘測量血液葡萄糖量。自尾端靜脈取得血液。數值係以平均值±SD，n＝7表示。A.載劑(◆)對GW1929(■)，B.載劑(◆)對Qmatrix(400毫克/公斤)(■)，C.載劑(◆)對UP780(100毫克/公斤)(■)，D.載劑(◆)對UP780(200毫克/公斤)(■)，E.載劑(◆)對UP780(400毫克/公斤)(■)，P <0.05(＊ )。在每日口服治療9週後，與載劑對照組相較下，以400毫克/公斤UP780和Qmatrix治療之動物在IP投服葡萄糖後30、60、90及120分鐘顯示出在葡萄糖利用上有統計上有意義之差異，P ≦0.05(＊ )。以100毫克/公斤UP780治療之動物僅在T30時顯示出顯著差異。陽性對照組，GW1929在分析之各時間點均具有小於0.05之P－值。
第15A－15E圖說明開始治療後第3週進行之腹膜內胰島素耐受性試驗之結果。試驗當天，令動物空腹3小時，再經由腹膜內途徑投服劑量為0.5單位/公斤之胰島素。在遞送葡萄糖後之0(注射葡萄糖前)、30、60、90及120 分鐘測量血液葡萄糖量。自尾端靜脈取得血液。數值係以平均值±SD，n＝7表示。A.載劑(◆)對Qrnatrix(400毫克/公斤)(■)，B.載劑(◆)對UP780(100毫克/公斤)(■)，C.載劑(◆)對UP780(200毫克/公斤)(■)，D.載劑(◆)對UP780(400毫克/公斤)(■)，E.載劑(◆)對GW1929，P <0.05(＊ )。在每日口服治療10週後，在胰島素耐受性試驗中驗證胰島素致敏化效果。以400毫克/公斤UP780治療之動物可在所有考量之時間點觀察到統計上有意義之胰島素致敏化作用，P ≦0.05(＊ )。在注射胰島素後1小時，除了GW1929外，剩餘之治療組中並未觀察到其他顯著差異，P ≦0.05。
第16圖係以圖形說明投服劑量為200毫克/公斤之UP780的持續葡萄糖降低效果。在治療開始後利用自尾端靜脈取得15－20微升血液以測量基線及第2、5和7週之空腹葡萄糖量。以GW1929(50毫克/公斤)、Qmatrix(400毫克/公斤)、UP780(100、200及400毫克/公斤)和載劑對照組治療動物。最早可在治療後第2週可發現統計上有意義之降低的空腹血液葡萄糖量，P ≦0.05(＊ )()。數據係以平均值±SD，n＝7表示。與載劑組相較下，在二週(第5和7週)中，以200毫克/公斤UP780和GW1929治療之動物均顯示出統計上有意義之較低的空腹葡萄糖量。以Qmatrix和UP780(400毫克/公斤)治療之小鼠在第5週顯示出類似之較低的空腹血液葡萄糖量。另一方面，與未治療之載劑組相較下，100毫克/公斤UP780治療組在所有 測試之數週中確實維持相當高之空腹血液葡萄糖量，P ≦0.05(＊ )。
第17圖係以圖形說明在治療開始後第2、5和7週所測量之相對於載劑對照組的空腹血液葡萄糖量之降低百分比。以GW1929(5毫克/公斤)、Qmatrix(400毫克/公斤)、UP780(100、200及400毫克/公斤)和載劑對照組治療動物。200毫克/公斤UP780治療組最早可在治療後第2週發現持續低量之空腹血液葡萄糖量。數據係以平均值±SD，n＝7表示。與載劑組相較下，以200毫克/公斤UP780治療之動物在第2、5及7週所測得之空腹葡萄糖量的降低百分比分別為18%、20%及17%。
第18圖係以圖形說明GW1929、Qmatrix、UP780(100、200及400毫克/公斤)和載劑對雄C57BL/6J小鼠之空腹三酸甘油脂量的作用。在治療開始後第2、5和7週測量載劑對照組中空腹三酸甘油脂量的降低百分比。以GW1929(5毫克/公斤)、Qmatrix(400毫克/公斤)、UP780(100、200及400毫克/公斤)和載劑對照組治療動物。最早可在第2週，在200毫克/公斤UP780治療組中發現持續低量之空腹三酸甘油脂量。數值係以平均值±SD，n＝7表示。以400毫克/公斤Qmatrix、200、400及100毫克/公斤UP780和GW1929治療之動物在每日治療7週後所取得之空腹三酸甘油脂量的降低百分比分別為2%、22.1%、22%、21.7%及22.7%。
第19圖係以圖形說明GW1929、Qmatrix、UP780 (100、200及400毫克/公斤)和載劑對膽固醇量的作用。在治療開始後利用自尾端靜脈取得之15－20微升血液測量基線及第2、5和7週之空腹總膽固醇量。以GW1929(5毫克/公斤)、Qmatrix(400毫克/公斤)、UP780(100、200及400毫克/公斤)和載劑對照組治療動物。與載劑對照組相較下，所有治療組均未觀察到總膽固醇量有所變化。數值係以平均值±SD，n＝7表示。與載劑組相較下，所有治療組之膽固醇量均無顯著變化，P ≦0.05。
第20圖說明GW1929、Qmatrix、UU780(100、200及400毫克/公斤)和載劑對雄C57BL/6J小鼠體重之作用。將3或4隻雄C57BL/6J小鼠飼養在具有飼料及水區的老鼠籠中。在誘導期和治療之數週期間每週測量一次體重。以GW1929(5毫克/公斤)、Qmatrix(400毫克/公斤)、UP780(100、200及400毫克/公斤)和載劑對照組治療動物。以GW1929、Qmatrix、UP780(100、200和400毫克/公斤)及載劑治療之小鼠間並未發現統計上有意義之體重增加差異。數值係以平均值±SD，n＝7表示。如第20圖中之描述，在各治療組中之動物(包括載劑和正常之齧齒動物飲食)在整個研究期間持續增加體重。第I組(Qmatrix400毫克/公斤及200毫克/公斤UP780)和第Ⅱ組(GW1929、載劑、100、400毫克/公斤UP780)間並未注意到統計上有意義之體重增加差異，P ≦0.05。
第21圖說明GW1929、Qmatrix(400毫克/公斤)、UP780(100、200及400毫克/公斤)和載劑對雄C57BL/6J 小鼠飼料消耗之作用。將3或4隻雄C57BL/6J小鼠飼養在具有飼料及水區的老鼠籠中。在誘導期和治療之數週期間每週測量一次飼料攝取量。顯示治療之數週間飼料消耗的數據。以GW1929(5毫克/公斤)、Qmatrix(400毫克/公斤)、UP780(100、200及400毫克/公斤)和載劑對照組治療動物。各組間在飼料攝取中並無統計上有意義之差異。數據係以平均值±SD，n＝7表示。與體重數據一致，所有組均有類似之飼料消耗形態。
第22A及B圖描述測量雄性(第22A圖)及雌性(第22B圖)之平均體重的急性毒性研究結果。在整個研究期間，對照組和治療組間之體重增加速度一致。以2克/公斤UP780及載劑對照組治療小鼠14天。以UP780治療之動物及載劑對照組在解剖日和基線間的體重增加差異的統計分析顯示出雄性及雌性組之體重增加並無顯著差異。類似地，在比較之各數據點處，以UP780治療之動物及載劑對照組動物之雄性及雌性組的平均增加體重並無顯著差異。數據係以平均值±SD，n＝5表示。
第23圖係以圖形說明從視覺觀點看，LV對LC之基因表現的一般向上調節及LUP對LC之基因表現的向下調節。圖形係藉SigmaPlot軟體繪製。在正常化之微陣列資料上使用ANOVA來偵測治療組間差別表現之基因(LV對LC及LUP對LC)。在各項比較中，自ANOVA模型及多重比較校正之結果取得明顯差別表現的基因。用於經由Holm之序貫Bonferroni程序進行比較的統計上有意義之 探針組數目摘要於LV對LC(第23A圖)及LUP對LC(第23B圖)之圖形中。
第24A及B圖描述以QPCR驗證ACC2轉錄子量之微陣列分析。上方嵌表為來自微陣列資料之定量結果。下方嵌表為QPCR定量結果，其係根據GAPDH之表現量繪製成正常化的表現量。累積三種無脂肪對照組RNA樣本作為LC，高脂肪飲食(LV)及高脂肪飲食＋UP780(LUP)治療組RNA樣本個別用於QPCR中。微陣列及QPCR二者使用相同之RNA製品。由於PM＋MM及單獨之PM強度值係獨立用於微陣列數據分析(見實例20)，繪製此二者之圖形以供比較(左方嵌表)，且當適用時，用於比較動物及動物變種。
第25A及B圖描述以QPCR驗證FASN轉錄子量之微陣列分析，其編排方式與第24圖中之描述相同。
第26A及B圖描述以QPCR驗證PEPCK1轉錄子量之微陣列分析，其編排方式與第24圖中之描述相同。
第27A及B圖描述以QPCR驗證FABP5轉錄子量之微陣列分析，其編排方式與第24圖中之描述相同。
第28A及B圖描述以QPCR驗證AMPKα2轉錄子量之微陣列分析，其編排方式與第24圖中之描述相同。

Claims (20)

  1. 一種組成物於製備用於治療糖尿病前期個體之代謝症候群的藥物之用途，其中該組成物包含不少於1.4重量%之蘆薈苦素或蘆薈苦醇與洋蘆薈(Aloe barbadensis (即吉拉索蘆薈(Aloe vera ))葉凝膠或葉凝膠粉末之組合。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該組成物本質上不含有蒽醌。
  3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該蘆薈苦素或蘆薈苦醇係分離或富含自開普蘆薈(Aloe ferox )。
  4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該組成物之投服劑量係選自0.01至500毫克/公斤體重。
  5. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該組成物係於適當之藥學配方中經選自口服、局部、栓劑、靜脈內、皮內、胃內、肌內、腹膜內或靜脈內之給藥途徑給藥。
  6. 一種組成物於製備用於糖尿病前期個體以促進並維持健康血糖濃度、支持血糖代謝及/或使升高之血糖濃度下降的藥物之用途，其中該組成物包含不少於1.4重量%之蘆薈苦素或蘆薈苦醇與洋蘆薈(Aloe barbadensis (即吉拉索蘆薈(Aloe vera ))葉凝膠或葉凝膠粉末之組合。
  7. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該組成物本質上不含有蒽醌。
  8. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該蘆薈苦素或蘆薈苦醇係分離或富含自開普蘆薈(Aloe ferox )。
  9. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該組成物之 投服劑量係選自0.01至500毫克/公斤體重。
  10. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該組成物係於適當之藥學配方中經選自口服、局部、栓劑、靜脈內、皮內、胃內、肌內、腹膜內或靜脈內之給藥途徑給藥。
  11. 一種組成物於製備用於糖尿病前期個體以使升高之血液葡萄糖濃度下降、降低飢餓下血液葡萄糖濃度及/或改善葡萄糖耐受性的藥物之用途，其中該組成物包含不少於1.4重量%之蘆薈苦素或蘆薈苦醇與洋蘆薈(Aloe barbadensis (即吉拉索蘆薈(Aloe vera ))葉凝膠或葉凝膠粉末之組合。
  12. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該組成物本質上不含有蒽醌。
  13. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該蘆薈苦素或蘆薈苦醇係分離或富含自開普蘆薈(Aloe ferox )。
  14. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該組成物之投服劑量係選自0.01至500毫克/公斤體重。
  15. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該組成物係於適當之藥學配方中經選自口服、局部、栓劑、靜脈內、皮內、胃內、肌內、腹膜內或靜脈內之給藥途徑給藥。
  16. 一種組成物於製備用於糖尿病前期個體以調節健康胰島素濃度、降低胰島素抗性之風險及/或改善胰島素敏感性的藥物之用途，其中該組成物包含不少於1.4重量%之蘆薈苦素或蘆薈苦醇與洋蘆薈(Aloe barbadensis (即 吉拉索蘆薈(Aloe vera ))葉凝膠或葉凝膠粉末之組合。
  17. 如申請專利範圍第16項之用途，其中該組成物本質上不含有蒽醌。
  18. 如申請專利範圍第16項之用途，其中該蘆薈苦素或蘆薈苦醇係分離或富含自開普蘆薈(Aloe ferox )。
  19. 如申請專利範圍第16項之用途，其中該組成物之投服劑量係選自0.01至500毫克/公斤體重。
  20. 如申請專利範圍第16項之用途，其中該組成物係於適當之藥學配方中經選自口服、局部、栓劑、靜脈內、皮內、胃內、肌內、腹膜內或靜脈內之給藥途徑給藥。
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