TWI308148B

TWI308148B - Novel compound of 6-methyl-3-phenethyl-3,4-dihydro-1h-quinazoline-2-thione, its preparation and a depigmentation composition containing the same as an effective component

Info

Publication number: TWI308148B
Application number: TW092133158A
Authority: TW
Inventors: Youngsoo Kim; Sang Hun Jung; Kyung Rak Min; Jun Kyu Park; Jee Hyun Lee
Original assignee: Solgent Co Ltd; Nat Univ Chungbuk Ind Acad
Priority date: 2003-08-19
Filing date: 2003-11-26
Publication date: 2009-04-01
Also published as: KR20050019401A; TW200508208A; AU2003282429A1; KR100747042B1; WO2005016895A1

Description

1308148 玖、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種結構式1所示之新穎之6-甲基-3-苯乙基 -3,4-二氫林-2-硫酮化合物；其製造方法；一種包含以前述化合物作為有效成分之用於預防及治療色素過度沈著症的醫藥組合物；及一種包含以前述化合物作為有效成分之皮膚美白化妝品組合物。

【先前技術】皮膚會變黑及暗沉的原因，是由於黑色素細胞在紫外線照射、賀爾蒙不平衡或心理壓力等情況下合成了過多的黑色素（一種天然色素）(Nordlund，J. J. et al.，The Pigmentation System: Physiology and Pathophysiology. New York, Oxford Univ. Press, pp. 1-1025, 1998)。因此，控制黑色素合成的技術成為發產美白產品的核心技術，美白產品是用來預防皮膚中產生過量的黑色素或淡化已累積於皮膚中的黑色素以抑制色素過度沈著症如脫色或雀斑。（Hori，W.，Drug Discovery Approaches for Developing Cosmeceuticals. Advanced Skin Care and Cosmetic Products. Southborough, IBC Library Series, pp. 3.1.1-3.1.21, 1997) ° 按照黑色素生物合成程序，起始材料酪胺酸(tyrosine)由酪胺酸酵素轉變為多巴（DOPA)及多巴醌(DOPAquinone);多巴在5,6- 1308148 二羥吲哚2-羧酸及5,6-二羥吲哚的參與下產生兩種真黑色素 (eumelanins);多巴酿與半胱氨酸(cysteine)反應產生苯黑色素。從 5,6-二羥吲哚2-羧酸衍生出的真黑色素是一種棕色色素，從5,6-二羥"5丨哚衍生的真黑色素是一種黑色色素及嗜鉻黑色素是一種黃 -紅色色素。（Hearing, V. J.，FASEB J·, 5:2902-9, 1991; Hearing，V. J·，J. Invest· Dermatol.，4:24-8，1999)。根據基因剔除研究，缺乏酪胺酸酵素會造成白子（白老鼠），而缺乏酪胺酸酵素相關蛋白質2(TRP-2)則會造成灰子。並且，目前已知酪胺酸酵素相關蛋白質l(TRP-l)在棕色發展中扮演重要的角色（Rieder, S.，et al·，Mamm· Genome, 12:450-5，2001; Tanita， M., et al., J. Hum. Genet., 47:1-6, 2002; Kameyama, K., et al., Pigment Cell Res·, 8:97-104，1995)。酪胺酸酵素相關蛋白質1在人體内沒有表現出任何酵素活性，但其在老鼠體内則表現出5,6-二氫61# 2-羧酸氧化酵素的酵素活性，並且已知與穩定酪胺酸酵素有關（Kobayashi，T.，et al.，J. Biol. Chem.，272:31801-5, 1998)。紫外線在皮膚的黑色素合成中扮演著重要角色。當黑色素細胞暴露於紫外線下時，其能藉由二醯基甘油活化蛋白質酵素C，進而促進黑色素的合成（Gilchrest，B. A.，et al., Photochem. Photobiol., 93:1-10, 1996; Park, Η. Y., et al., J. Biol. Chem., 274:16470-8，1999)。暴露於陽光下時，角質細胞釋放出一氧化氮，α -黑色素細胞刺激贺爾蒙前列腺素E2及内皮素-1。這些釋放因子會轉移給黑色素細胞，其中一氧化氮經由cGMP訊息傳遞及蛋白質酵素G增加黑色素的合成，而停止釋放這些因子則會經由cAMP的訊息傳遞及蛋白質酵素A增加黑色素的合成 (Romero-Graillet, C., et al., J. Biol. Chem., 271:28052-6, 1996; Rasmussen, N., et al., Neuroendocrinol. Lett., 20:265-282, 1999;

Scott, M. C., et al.，J. Cell. Sci. 115:2349-55, 2002)。 1308148 在發展抑制色素過度沉著症的皮膚美白產品中，了解黑色素合成路徑非常重要（discloration，freckles, etc·)。代表性的例子為黑色素生物合成抑制劑’發展到目前為止包含曲酸(k〇jic add)、熊果素（arbutin)、維他命C、桑椹萃取物、甘草萃取物及其他相似的成分。曲酸與一銅離子螯合需要酪胺酸酵素的活化，其能抑制黑色素的合成，具有優越的美白功效。然而，近來曲酸被認為是一種鈣生成試劑（calcinogenic agent)，因而限制了曲酸的用途。維他命C及其衍生物表現出相對較低的美白功效。氫醌則由於對皮膚具有尚刺激性，基於安全考量而限制其應用範圍。此外，目别已知植物卒取物只有在高濃度下才能表現出脫色效果，幾乎沒有任何植物萃取物能在低濃度下表現出脫色能力。因此，為了解決傳統黑色素合成抑制劑的問題，並尋求一種更佳的美白物質，本發明之發明人藉由多次極化活性分析處理篩選後，發現一新穎之6_甲基_3_苯乙基_3,4·二氫_17^奎唑琳_2_硫酮化合物。並且，我們確定以該化合物作為有效成分之醫藥組合物及化妝品組合物具有良好的皮膚美白功效，並根據該項發現完成本發明》本發明提供一新穎之6-甲基-3-苯乙基_3,4_二氫喳唑啉 2石瓜酮化合物及其製造方法，及包含以前述化合物作為有效成分之用於預防及治療色素過度沈著症的醫藥組合物及皮膚美白化妝品組合物。【發明内容】本發明係關於一種結構式i所示之新顆t 6_甲基_3_苯乙基 -、3,4-二氫_1札喳唑啉_2_硫酮化合物；其製造方法；一種包含以前，化=物作為有效成分之用於預防及治療色素過度沈著症的醫樂組合物；及—種包含以前述化合物最為有效成分之皮膚美白化妝品組合物。 9 1308148 h3c

在本發明中，結構式1所示之6_甲基_3_苯乙基3 _ 喳唑啉-2-硫酮化合物係可藉由反應結構式4所示^ 二氫-1H- 乙基-3,4-二氫-1//+坐琳與Lawes_,s ^甲基-3-笨程圖1所示。表備’如流反應流程圖 h3c

⑷

在前述之反應流程圖1中，結構式4之6-甲基-3-苯乙基_3 4 二氫-l/ί-喳唑啉-2-酮之製備係如下面反應流程圖2所示，先將龄構式2之（5-甲基-2-硝基苯）苯乙基胺還原，獲得結構式3之4·甲基-2-(本乙基氣甲基）苯基胺，然後將產物與1,1 ί炭基二咪唾反應，即製備得結構4之化合物。 1308148 反應流程圖2

在前述之反應流程圖中，結構式2之（5-甲基-2-硝基苯）苯乙基胺係可藉由反應5-甲基-2-硝基苯氣與苯乙基胺來製備，如下列反應流程圖3所示。反應流程圖3

製備本發明結構式1所不之6-甲基-3-苯乙基- 3,4 -二鼠-1 // 喳唑啉-2-硫酮化合物的方法係摘要於反應流程圖4中。 11 1308148 反應流程圖4

⑴ (4) 在另一方面，本發明係關於係關於一種包含6_甲基_3_苯乙基-3,4-二氫奎唑啉_2_硫酮化合物之用於預防及治療色素過度沈著症的醫藥組合物。該醫藥組合物較佳係包含含量為醫藥組合物全部重量之0.0001至1%的6_甲基_3_苯乙基_34二氫 -1仏喳唑啉_2_硫酮化合物。該醫藥組合物係用於預防及治療黑色素過度沉著症如脫色、雀斑、高齡色素模糊及其他相似問題，並可利用不同的藥物學上可接受之載體、賦型劑及/或添加劑配製成不同配方。代表性的例子包含皮膚配方如乳霜、軟膏、凝膠、塗劑或貼布。在另一方面’本發明係關於一種包含6_甲基_3_苯乙基_3,4_ 二氫奎唾啉_2-硫酮化合物之美白化妝品組合物。該美白化妝品組合物較佳係包含含量為美白化妝品組合物全部重量之〇.0001至1%的6-甲基-3_苯乙基-3,4-二氫-1//-喳唑啉-2-硫酮化合物。 12 1308148 皮膚美白化妝品組合物係用來治療或預防皮膚色素異常如脫色、雀斑、高齡色素模糊及其他相似問題，其配方並無特殊限制。代表性的配方例子包含調色劑、收斂劑、滋養霜、按摩霜、精華液、面膜、凝膠、化妝水、貼片、喷液或液體粉末。本發明合成之6-甲基-3-苯乙基-3,4 -二氮-1//-奎σ坐σ林-2-硫酮化合物可抑制黑色素經由蛋白質酵素C、cAMP/蛋白質酵素 A、或經由cGMP/蛋白質酵素G而合成，無細胞毒性，並且具有優於本技術領域已知的曲酸及熊果苷幾百倍的美白效果。【實施方式】本發明係藉由下列實施例、配方實施例及實驗實施例進一步詳細說明，然而其並非用於限制本發明。貫施例1 .製備6-甲基-3 -苯乙基-3，4 -二氮-1 邊11坐σ林-2-硫嗣貫施例 1-1 .合成（5 -甲基-2 _石肖基笨）苯乙基胺將苯乙基胺（2 eq. wt·，3.38 ml)及三乙基胺（3 eq. wt.，5.6 ml) 溶解於四氳呋喃，並將溶於四氫呋喃之5-甲基-2-硝基苯氣（2.5 g，0.0135莫耳）加入前述溶液中。該混合物在室溫下攪拌10分鐘，並在60至70°C迴流12小時。將反應冷卻至環境溫度並真空蒸餾。有機層以無水硫酸鈉除水，真空蒸餾，並以管柱分離。 (5-曱基-2-硝基苯）苯乙基胺之特徵係如下所述。橘色油狀物；

Rf=0_26(己烷：乙基醋酸=2 : 1);產率84.8% ; IR(KBr) 3350, 3050, 3020, 2930, 2850，1610，1585，1520, 1455, 1340, 1265, 1120cm'1; lR NMR(CDC13, 89.45MHz) δ 2.40(s, 3H), 2.88(m, 4H), 4.03(s, 2H), 7.13-7.93(m, 8H) 13 1308148 實施例1-2 :合成4-甲基-2-(笨乙基氨甲基）笨基胺 (5-甲基-2-硝基苯）苯乙基胺（3 g)溶解於二氯甲烷與甲醇 (1 : 1)之混合物中。加入碳化鈀（240 mg)於前述溶液中，該混合物在氫壓30 psi下擾拌4小時。透過賽力特塊（celite caket)抽濾反應物，並以二氣甲烷清洗。將濾出液真空蒸餾以獲得4-甲基-2-(苯乙基氨甲基）苯基胺。產物之特徵係如下所述。棕色油狀物；

Rf=0.045(己烷：乙基醋酸=2 : 1);產率89.7% ; IR(KBr) 3550-3200，3025, 2930, 2895，2750, 1620，1500, 1455, 1265cm'1; *H NMR(CDC13, 89.45MHz) δ 2.20(s, 3H), 2.83(m, 2H), 2.91(s, 2H), 3.91(m, 2H), 4.27(br, NH2), 6.41-7.21(m, 8H) 實施力1-3 :合成6-甲基-3-笨乙基-3,4-二氫唑啉-2-酮將4-甲基-2-(苯乙基氨甲基）苯基胺（2 g，0.00832莫耳）溶解於無水四氫α夫喃。加入1,1’ -幾基咪吐（1.1 eq. wt·，1.48 g)。使混合物在50至60°C迴流12小時。移除四氫呋喃，以水合二氯甲烷萃取。有機層以無水硫酸鈉除水，真空蒸餾，並以管柱分離。6-甲基-3-苯乙基-3，4-二氫-1 //-碴唑啉-2-酮之特徵係如下所述。黃色固體；

Rf=〇_34(己烷：乙基醋酸=5 : 1); 產率81.9% ;熔點 174.8-175.8°C ； IR(KBr) 3200，3100-3000, 2920，1650，1610, 1500，1455, 1320, 1270, 1240, 1180cm'1; lU NMR(CDC13, 89.45MHz) δ 2.25(s, 3H), 2.95(t, J=7.5 , 14 1308148 2H), 3.67(t, J=7.5 , 2H), 4.31(s, 2H), 6.57-7.01(m, 3H), 7.26(m, 5H), 7.88(br, NH) 實施例 1-4:合成6-甲基-3-笨乙基-3,4-二氫-1//-喹唑啉-2-硫酮 6-甲基-3-苯乙基-3,4-二氫-1//-喳唑啉-2-酮（880 mg，0.0033 莫耳）溶解於甲苯並加熱。加入Lawesson's反應試劑（0.6 eq. wt.，802 mg)。混合物在100°C迴流8小時。藉由真空蒸餾移除甲苯，然後以水合二氣甲烷萃取。有機層以無水硫酸鈉除水，真空蒸餾，並以管柱分離。6-甲基-3-苯乙基-3,4-二氫-1//-喳唑 φ 啉-2-硫酮之特徵係如下所述。淡黃色固體；Rf=〇.63(己烷：乙基醋酸=2 : 1); 產率 47.2% ;熔點 177.2-177.7°C ; IR(KBr) 3200, 3020, 2920, 1620, 1550-1480, 1450, 1325, 1265, 1240, 1 175, 1150cm·1 ； !H NMR(CDC13, 89.45MHz) δ 2.27(s, 3H), 3.10(t, J=7.7 , 2H), 4.12(t, J=7.7 , 2H), 4.36(s, 2H), 6.60-7.02(m, 3H), 7.28(m, 5H), 8.48(br, NH)；

Anal. Calcd. for C17H18N2S C,72.3; H,6.42; N;9.92; S,11.3 _

Found: C,71.9; H，6.89; N，8.64; S,13.1 15 1308148 組成物配方配方1.包含6-甲基-3-苯乙基-3,4-二氫-1丑-喹唑啉-2-硫酮化合物之用於預防及治療色素過度沈著症的醫藥組合物—藥膏成分含量 6-甲基-3-苯乙基-3,4-二氫 -1 η奎唾琳-2 -硫酮〇.5g 白堪 4.0 g 膽固醇 1.6 g 白色凡士林剩餘部分十六烷醇 1.6 g 總計 100 g 配方2.包含6-甲基-3-苯乙基-3,4-二氮-1_ΒΓ-β奎峻琳-2-硫明化合物之用於預防及治療色素過度沈著症的醫藥組合物_凝膠成分含量 6-曱基-3-苯乙基-3,4-二氫奎哇琳-2-硫酮〇.5g 乙醇 18 g 高嶺土 5 g 1,3-丁二醇 5 g 甘油 8g CMC-鈉 9g 明膠 3 g 甲基酉旨（methylparabene) 0.1 g 丙基醋（propylparabene) 0.2 g 16 1308148 純水其他部分總計 100 g 配方3.包含6-甲基-3-苯乙基-3,4·二氫-1丑-喳唑啉-2-硫酮化合物之美白化妝品組合物-滋養霜成分含量三乙醇胺 0.1 g 甘油 3.0 g 丁浠乙二醇 3.0 g 液態石堪 7.0 g yS-葡萄聚糖 7.0 g 卡波姆（Carbomer) 0.1 g 6-甲基-3-苯乙基-3,4-二氫〇.5g -1开-σ奎σ全u林-2 ·硫酉同辛酸/癸酸三甘油脂 3.0 g 鯊烯 5.0 g 十六硬醋酸葡萄糖昝 1.5 g 硬脂酸山梨糖醇酯 0.4 g 聚山梨醇酐脂肪酸酯60 1.2 g 甲基酉旨（Methylparabene) 0.1 g 丙基 S旨（Propylparabene) 0.1 g 香料 0.1 g 純水其他部分總計 100 g 17 1308148 配方4.包含6-甲基-3-苯乙基-3,4-二氫-1丑-喳唑啉-2-硫酮化合物之美白化妝品組合物-面膜成分含量乙醇 6.0 g 甘油 4.0 g 聚乙烯基醇 15.0 g 玻尿酸萃取物 5.0 g 卢-葡萄聚糖 7.0 g 尿囊素 0.1 g 6-甲基-3-苯乙基-3,4-二氫 0.5g -1 σ坐琳-2-硫酉同壬基苯基醚 0.4 g 聚山梨醇酐脂肪酸酯60 1.2 g 甲基酉旨（Methylparabene) 0.2 g 丙基醋（Propylparabene) 0.1 g 香料 0.1 g 純水其他部分總計 100 g 實驗實施例1:抑制黑色素經由cAMP/蛋白質酵素A產生之功效在黑色素瘤B16細胞株中施與α -黑色素細胞刺激贺爾蒙，使其藉由cAMP/蛋白質酵素Α訊號傳遞產生黑色素(Rasmussen, N., et al., Neuroendocrinol. Lett., 20:265-282, 1999; Scott, M. C., 心/·, 乂 Ce//H 115:2349-55, 2002)。黑色素瘤B16細胞懸浮於 18 1308148 添加10%牛胚胎血清之DMEM中谇 96孔平盤中，在37t、5% c〇、JV，以2,5〇〇/孔之密度種於將細胞分射㈣啦添加㈣°培養24小時後，激賀爾蒙之實驗組、及同時#Λ 資）添加黑色素細胞刺濃度岡和6-甲基·3·= 基^黑色素細胞刺激賀爾蒙（最後劑之實驗組。每'组培養3天，心奎料1硫嗣為作用決定被釋放至培養液中的黑色素含測波長奶⑽吸收值實驗結果顯^制組之黑色素瘤m6 33.2土 l々g/ml之黑色素。沐Λ田“ 臀^天後釋放、’、、σ α •黑色素細胞刺激賀爾蒙培養之實驗組細胞釋放⑷见“心/如之”去门士貝爾冢^養 ..,.. 8 之…、色素。同h添加α -黑色素細胞刺激贺爾蒙（最後濃度丨ηΜΗ〇 6_甲基_3_苯乙美_34二氫-m-峻封_2_硫酮為作關之實驗組細胞，在仙^度，4 : Μ下釋放37.9± 0.8#g/ml之黑色素，在作用劑濃度2謂下釋放44.4土 9.5/zg/ml之黑色素，在作用劑濃度下釋放ι〇ι ι ± 1.0# g /ml之黑色素，在作用劑濃度〇 5 # μ下釋放126.5± $ $ /z g /ml之黑色素。因此，細胞的表現顯示白化效果與劑量相關（第 la圖）。達到50%白化效果(EC%)時，有效劑量濃度為15wM。在相同的實驗模型下，熊果苷及曲酸的白化效果ec50值分別顯示為151//M及261//M。因此，我們注意到6-甲基-3-苯乙基-3,4- 二氫-1 套嗤°林-2-硫酮對黑色素瘤B16細胞株經由CAMP/蛋白質酵素A訊號傳遞產生的黑色素脫色效果，就EC5()而言高於熊果苷100倍且高於曲酸170倍（第lb圖）。實驗實施例2:抑制黑色素經由cGMP/蛋白質酵素G產生之功效黑色素瘤B16細胞株以0比嗔紫質IX (ProtoP〇rphyrin IX )刺激，經由cGMP/蛋白質酵素G利用一氧化氮產生黑色素 1308148 (Romero-Graillet, C., et aL, J. Biol. Chem., 271:28052-6, 1996)〇 m 色素瘤Bl6細胞懸浮於添加1〇%牛胚胎血清之dmem中培養了以2,500/孔之密度種於96孔平盤中，在37。〇、5%c〇2的環境下培養。培養24小時後，將細胞分成對照組（未添加任何化學物質）、添加原1質IX之實驗組、及同時添加吡喀紫質Ιχ (最後濃度 #Μ)和6-曱基苯乙基_3,4_二氫_17/_喳唑啉_2_硫酮為作用^丨之實驗組。每—組培養3天，然後藉由量測波長405mn吸收值決定被釋放至培養液中的黑色素含量。實驗結果顯示，對照組之黑色素瘤B16細胞培養3天後釋放43.4± 0_8/zg/m丨之黑色素。添加吡喀紫質汊培養之實驗組細胞釋放135.2± 1.9#g/ml之黑色素。同時添加吡喀紫質Ιχ(最後濃度30//Μ)和6-甲基-3-苯乙基-3,4-二氫-i/f·喳唑琳_2_硫酮為作用劑之實驗組細胞，在作用劑濃度！ β M下釋放52 5± 5 8#呂之黑色素，在作用劑濃度〇.5βΜ下釋放94 4± 6 〇"g /ml之黑色素，在作用劑濃度〇.25//M下釋放1〇5·2土〇 9#g /ml之黑色素，在作用劑濃度〇.13/zM下釋放118·7± 32/zg/ml之黑色素。因此，細胞的表現顯示白化效果與劑量相關（第以圖）。達到5〇% 白化效果（EC50)時，有效劑量濃度為0.5 #M。在相同的實驗模型下’知果甘及曲酸的白化效果E(：5Q值分別顯示為159#M & 122 因此，實驗結果顯示6_甲基_3_苯乙基_3,4_二氫_ΐ7/_喳唑啉 -2·硫酮對黑色素瘤B16細胞株經由cGMp/蛋白質酵素G訊號傳遞產生的黑色素脫色效果，就EC%而言高於熊果苷31〇倍且高於曲酸240倍（第2b圖）。實驗實施例3:抑制黑色素經由1-油醯-2-乙醯基甘油/蛋白質酵素C產生之功效黑色素瘤B16細胞株以1-油醯_2·乙醯基甘油刺激，經由蛋 20 1308148 白/酵素c產生黑色素（Gilchrest，B. A·，以从，戶^㈣

Photobiol, 93:1-10, 1996; Park, Η. Υ., ^ αί, J. Biol. Chem., 274:16470-8, 1999)。黑色素瘤Βΐ6細胞懸浮於添加1〇%牛胚胎血清之DMEM中培養，以2,500/孔之密度種於96孔平盤中，在37 C、5% C〇2的環境下培養。培養24小時後，將細胞分成對照組（未添加任何化學物質）、添加丨_油醯_2_乙醯基甘油之實驗組、及同時添加1-油醯_2_乙醯基甘油（最後濃度2〇〇/zM)和6_甲基_3_苯乙基-3,4-二氫_1/f_喳唑啉_2_硫酮為作用劑之實驗組。每一組培養3 天’然後藉由量測波長405nm吸收值決定被釋放至培養液中的黑色素含量。實驗結果顯示，對照組之黑色素瘤B16細胞培養3天後釋放49.8± 1.0/mi之黑色素。添加卜油醯_2_乙醯基甘油培養之實驗組細胞釋放1〇9_4± 0_2"§/〇11之黑色素。同時添加卜油醯-2· 乙醯基甘油（最後濃度20G//M)和6-f基冬苯乙基·3,4_二氫魯喳唑啉-2-硫酮為作用劑之實驗組細胞，在作用劑濃度〇·5#μ下釋放57.7± 2.9"g/ml之黑色素，在作用劑濃度〇.25_下釋放 82.2± 6.1#g/ml之黑色素，在作用劑濃度〇下釋放1〇6 3 ± 〇.l#g /ml之黑色素，在作用劑濃度〇·〇6“Μ下釋放ι〇97土〇々g/ml之黑色素。因此，細胞的表現顯示白化效果與劑量相關（第3a圖）。達到50%白化效果(EC5〇)時，有效劑量濃度為〇3 在相同的實驗模型下’熊果芬的白化效果心值顯示為4乃譯。因此’實驗結果顯示6-甲基_3_苯乙基_3,4_二氯_吸如圭啉 -2-硫㈣黑色素瘤B16細胞株經由蛋白質酵素c訊號傳遞產生的黑色素脫色效果，就ec5〇而言高於熊果答157〇倍（第3b圖）。實驗實施例4:白化機制減少路胺酸含量黑色素瘤B16細胞懸浮於添加1〇%牛胚胎血清之讓咖中 21 1308148 培養’以2,500/孔之密度種於96孔平盤令，在37。(：、5% C02的環境下培養24小時。在細胞中同時添加α _黑色素細胞刺激贺爾蒙（最後濃度1 ηΜ)及6-甲基-3-苯乙基-3,4-二氫-1//-喳唑啉_2_巯 _為作用劑。在培養3天後，收集細胞、分散並離心。將懸浮物當作酵素來源。20#g酵素來源以包含SDS之聚丙烯醯胺凝膠電泳分離。然後，該凝膠以100mM之磷酸緩衝液（pH6 8)清洗以移除SDS，再移至包含5 mM D〇pA之磷酸緩衝液(pH 6 8)中，並避光保存於37°C。使用密度測定儀量測染黑之酪胺酸酵素含量。與培養在含10%牛胚胎血清之DMEM培養液3天的黑色素瘤Bi6 細胞株產生的酪胺酸酵素相較，培養在相同培養液但添加α _黑色素細胞刺激贺爾蒙中的黑色素瘤Β16細胞株產生的酪胺酸酵素增加了 6至7倍。由只受到α _黑色素細胞刺激贺爾蒙刺激之黑色素瘤Β16細胞株產生的酪胺酸酵素含量標示為1〇〇% ;由同時受到黑色素細胞刺激賀爾蒙及6_甲基_3_苯乙基_3,‘二氫奎唑琳-2-硫酮為作用劑刺激之黑色素瘤B16細胞株產生的絡胺酸酵素3里，當作用劑濃度為4 " Μ時，酪胺酸酵素含量為丨7% ;作用劑濃度為2譯時，絡胺酸酵素含量為35% ;作用劑濃度為i _時，赂胺酸酵素含量為83% ;作用劑濃度為〇 5_時，酪胺酸酵素含里為92%,此-結果顯示抑制效果與劑量相關（第4 圖）。因此，本發明注意到6-甲基苯乙基_3,4_二氯套唆琳_2_ 硫酮藉由減少酪胺酸酵素含量的機制來達到脫色之效果。實驗實施例S:對黑色素瘤Bl6細胞株之細跑毒性黑色素瘤祕細胞懸浮於添加1〇%牛胚胎金清之丽舰中料，以2,500/孔之密度種於96孔平盤中，在沉、5%叫的衣i兄下養24小b。在細胞中同時添加黑色素細胞刺激贺爾蒙（最後濃度1 _及6rn苯乙基m+M-2-硫 22 1308148 酮為作用劑。每24小時，存活與死亡的細胞素以錐蟲 blue)染色方法計算。與培養在含1()%牛胚胎血清之讓现培養液的黑色素瘤Β16細胞株相較，培養在相同培養液但添加二里色素細胞刺激贺爾蒙中的細胞顯示成長遲緩的現象，但並未表現出殺死細胞的毒性（第5a圖）。在第四天，培養於添加心里色素細曲胞刺激贺_蒙及6_甲基·3_苯乙基_3,4_h_b奎哇琳_2-伽 (濃度0.5至4#M)的細胞顯示出與培養在只添加^•黑色素細胞刺激贺爾蒙細胞相同的存活細胞數，且未顯示出殺死細胞的毒性 (第5b圖）。產業應用性本發明提供一新穎具有優越美白功效之6_曱基_3_笨乙基 -3,4-二氫-1//-喳唑啉_2_硫酮化合物，能用於預防皮膚之黑色素過度沉著症或淡化已累積於皮膚中的黑色素顏色，改善色素過度沉著症如脫色及雀斑；該化合物之製備方法；及包含該化合物之醫藥組合物及化妝品組合物。

23 l3〇8l48 【圖式簡單說明】第la圖係為實驗實施例1之結果，顯示6_甲基笨乙美3 奎嗤琳_2_硫_經由cAMp/蛋白質酵素A 成之功效。刺…、已素生，^係為實驗實施例丨之結果，係比較熊果*、曲酸與土 _3_本乙基·3，4_二氫ϋ °坐琳-2-硫酉同經由cAMp ，素人抑制黑色素生成之功效。（·：本發明之化合物 ^ 甘曲酸） .見、果第2a圖係為實驗實施例2之結果，顯示6_甲基」·苯乙美3斗，财唑啉_2_硫_經由_蛋白質酵“抑制成之功效。 …、οι王

6_甲ί Γ?係為實驗實施例2之結果，係比較熊果#、曲酸與土 --本乙基-3,4-二氫·1/7_口套嗤琳_2_硫調經由cGM

:素黑色素生成之功效。⑽：本發明之化合物〇: J

第3a圖係為實驗實施例3之結果，顯示6_甲基+苯乙& W ^㈣唾啉。姻經由卜油酿_2_乙醯基甘油：白質酵素C抑似色素生成之功效。 ^ f 3b—圖係為實驗實_ 3之絲，係比較熊^、曲酸與 -土-3-本乙基-3,4-二氫_1私邊嗤琳_2_硫酮經&1_油醯_2_乙醯基甘油（〇AG)/蛋白質酵素〇抑制黑色素生成之化合物Ο:'熊果苷.▲:曲酸）（•本七月第4圖係為實驗實施例4之結果，顯示由同時_ =刺激㈣蒙及6_甲基·3·苯乙基_3m奎棒為作用劑刺激並培養於含10%牛胚胎血清之DMEM之黑色素瘤 B16細胞株產生之路胺酸酵素含量，相對於設為⑽之由只受到黑色素細胞刺激贺爾蒙刺激之黑色素瘤B16細胞株產生之酪 24 1308148 月女醆酵素含量結果。株择入圖係為實驗實施例5之結果，顯示黑色素瘤㈣細胞養於相同培養液並添力-黑色素細:刺 H 之細胞增生成長結果H 〇··只添加α 株培:===果，顯示黑色素™ dm賺中、及培接相同培# 素細胞刺«爾蒙之賀爾蒙和6•甲基_3_苯乙基_34二^寺添加α •黑色素細胞刺激 -.M)t 〇·3 25

Claims

拾、申靖專利範圍： —種6-甲其 ^ 卜結構式（”土 Ί、-笨乙基_3,4_二氫_1/^奎唑啉_2_硫酮化合物，係如 h3c

(1)0 種6-甲基-3-苯乙基-3,4-二氫-1//_喹唑啉_2_硫酮化合物之製備方法，包含將結構式（4)所示之6-甲基-3-苯乙基-3,4-二氫_ι好_ °套嗤琳-2-酮與Lawesson's試劑反應。

⑷ 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中6_曱基_3_笨乙基_3,4_ 二氫-1//-喹唑啉·2_酮之製備方法，包含將結構式（2)所示之（5· 甲基-2-硝基苯）苯乙基胺還原，獲得結構式（3)所示之4甲基 -2-(苯乙基氨甲基）笨基胺，然後將產物4甲基_2_(笨乙基氨甲基）苯基胺與1，Γ-羰基二咪唑反應，即製備得6-甲基_3_苯乙基 -3，4-二氮-奎。坐琳-2·嗣。

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