TWI399205B - 茶鹼化合物之抑制骨質疏鬆症活性 - Google Patents
茶鹼化合物之抑制骨質疏鬆症活性 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI399205B TWI399205B TW100101526A TW100101526A TWI399205B TW I399205 B TWI399205 B TW I399205B TW 100101526 A TW100101526 A TW 100101526A TW 100101526 A TW100101526 A TW 100101526A TW I399205 B TWI399205 B TW I399205B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- kmup
- rankl
- cells
- minutes
- theophylline
- Prior art date
Links
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical class O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 35
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 title claims description 8
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 claims description 35
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 claims description 19
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 claims description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 9
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 7
- 125000004194 piperazin-1-yl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])N(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 7
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims 1
- NIDVDYQCGWISJZ-UHFFFAOYSA-N kmup-1 Chemical class C1=2C(=O)N(C)C(=O)N(C)C=2N=CN1CCN(CC1)CCN1C1=CC=CC=C1Cl NIDVDYQCGWISJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 131
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 62
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 59
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 44
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 42
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 42
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 34
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M sodium;2-iodoacetate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CI AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 23
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 108010032050 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 19
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 19
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 102000007591 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 18
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 17
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 description 16
- 101001025337 Homo sapiens High mobility group protein B1 Proteins 0.000 description 16
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 16
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 16
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 15
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 102000001776 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 14
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 14
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 13
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 12
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 12
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 12
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 12
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 12
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 11
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 11
- 108010007457 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Proteins 0.000 description 10
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 description 10
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 10
- 102000000424 Matrix Metalloproteinase 2 Human genes 0.000 description 10
- 108010016165 Matrix Metalloproteinase 2 Proteins 0.000 description 10
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 9
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 9
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 9
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 9
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 9
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 9
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 9
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000003714 TNF receptor-associated factor 6 Human genes 0.000 description 8
- 108090000009 TNF receptor-associated factor 6 Proteins 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 8
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 8
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 8
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- -1 theophylline compound Chemical class 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 108010018242 Transcription Factor AP-1 Proteins 0.000 description 7
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 7
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 7
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 102000004631 Calcineurin Human genes 0.000 description 6
- 108010042955 Calcineurin Proteins 0.000 description 6
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 6
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 6
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 6
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 6
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 6
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 6
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 5
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 5
- 101710116895 DNA-binding protein H-NS Proteins 0.000 description 5
- 101710132617 Protein B1 Proteins 0.000 description 5
- 101710170630 Ribonucleoside-diphosphate reductase 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 5
- 108060006706 SRC Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 108091006084 receptor activators Proteins 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004171 Cathepsin K Human genes 0.000 description 4
- 108090000625 Cathepsin K Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000003817 Fos-related antigen 1 Human genes 0.000 description 4
- 108090000123 Fos-related antigen 1 Proteins 0.000 description 4
- 101150096607 Fosl2 gene Proteins 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 4
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007637 Soluble Guanylyl Cyclase Human genes 0.000 description 4
- 108010007205 Soluble Guanylyl Cyclase Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 4
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 4
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- BNRNXUUZRGQAQC-UHFFFAOYSA-N sildenafil Chemical compound CCCC1=NN(C)C(C(N2)=O)=C1N=C2C(C(=CC=1)OCC)=CC=1S(=O)(=O)N1CCN(C)CC1 BNRNXUUZRGQAQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 4
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010599 BrdU assay Methods 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 3
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 3
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 3
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018745 NF-KappaB Inhibitor alpha Human genes 0.000 description 3
- 108010052419 NF-KappaB Inhibitor alpha Proteins 0.000 description 3
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 102000004257 Potassium Channel Human genes 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 102000001332 SRC Human genes 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000000160 Tumor Necrosis Factor Receptor-Associated Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010080432 Tumor Necrosis Factor Receptor-Associated Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000010222 extracellular calcium influx Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000010 osteolytic effect Effects 0.000 description 3
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 3
- HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001433 sodium tartrate Substances 0.000 description 3
- 229960002167 sodium tartrate Drugs 0.000 description 3
- 235000011004 sodium tartrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 2
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 2
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 229940123932 Phosphodiesterase 4 inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102000012338 Poly(ADP-ribose) Polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108010061844 Poly(ADP-ribose) Polymerases Proteins 0.000 description 2
- 229920000776 Poly(Adenosine diphosphate-ribose) polymerase Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000009460 calcium influx Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 125000000068 chlorophenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 238000007804 gelatin zymography Methods 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 230000010258 osteoblastogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000002587 phosphodiesterase IV inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229960003310 sildenafil Drugs 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 210000005065 subchondral bone plate Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 2
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WZIMSXIXZTUBSO-UHFFFAOYSA-N 2-[[bis(carboxymethyl)amino]methyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O WZIMSXIXZTUBSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005999 2-bromoethyl group Chemical group 0.000 description 1
- LPLLVINFLBSFRP-UHFFFAOYSA-N 2-methylamino-1-phenylpropan-1-one Chemical compound CNC(C)C(=O)C1=CC=CC=C1 LPLLVINFLBSFRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SARKXLKWFKNUMR-UHFFFAOYSA-N 4-benzamido-5-chloro-2-methylbenzenediazonium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=C([N+]#N)C(C)=CC(NC(=O)C=2C=CC=CC=2)=C1Cl SARKXLKWFKNUMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010051728 Bone erosion Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100135867 Caenorhabditis elegans pde-3 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000219321 Caryophyllaceae Species 0.000 description 1
- ZGVHJZASCMUYJS-UHFFFAOYSA-N ClC1=C(C=CC=C1)N1CCNCC1.ClC1=C(C=CC=C1)N1CCNCC1 Chemical compound ClC1=C(C=CC=C1)N1CCNCC1.ClC1=C(C=CC=C1)N1CCNCC1 ZGVHJZASCMUYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000293323 Cosmos caudatus Species 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 235000002845 Dianthus plumarius Nutrition 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060006678 I-kappa-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000001284 I-kappa-B kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101150026829 JUNB gene Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101100046557 Mus musculus Tnfrsf11a gene Proteins 0.000 description 1
- 108010014632 NF-kappa B kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000012828 PI3K inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 229940122924 Src inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 101150014014 Traf6 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- IOMLBTHPCVDRHM-UHFFFAOYSA-N [3-[(2,4-dimethylphenyl)carbamoyl]naphthalen-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound CC1=CC(C)=CC=C1NC(=O)C1=CC2=CC=CC=C2C=C1OP(O)(O)=O IOMLBTHPCVDRHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOWZJZJLXUQHGF-UHFFFAOYSA-M [7-(dimethylamino)phenothiazin-3-ylidene]-dimethylazanium;dimethyl-[7-(methylamino)phenothiazin-3-ylidene]azanium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=CC(=[N+](C)C)C=C2SC3=CC(NC)=CC=C3N=C21.C1=CC(=[N+](C)C)C=C2SC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 YOWZJZJLXUQHGF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012745 brilliant blue FCF Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000005226 corpus cavernosum Anatomy 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000032798 delamination Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- VIYFPAMJCJLZKD-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 VIYFPAMJCJLZKD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LVQSCKUKDKAQGO-UHFFFAOYSA-L disodium;diiodide Chemical compound [Na+].[Na+].[I-].[I-] LVQSCKUKDKAQGO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006846 excision repair Effects 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001721 multinucleated osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 230000019261 negative regulation of glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 230000019808 nuclear migration along microtubule Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N octoxybenzene Chemical compound CCCCCCCCOC1=CC=CC=C1 ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000004072 osteoblast differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940043441 phosphoinositide 3-kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- YYEADNLMHYZIQS-UHFFFAOYSA-M sodium;acetate;hydroiodide Chemical compound [Na+].[I-].CC(O)=O YYEADNLMHYZIQS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 210000005090 tracheal smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009750 upstream signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
- A61K31/52—Purines, e.g. adenine
- A61K31/522—Purines, e.g. adenine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. hypoxanthine, guanine, acyclovir
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
本發明係關於茶鹼化合物運用於骨質疏鬆症之醫療功能。含茶鹼之醫藥組合物可預防及治療骨質流失之過程，減少發炎細胞之浸潤。
骨質疏鬆症(osteoporosis)係蝕骨細胞與造骨母細胞之作用失衡以致骨密度下降、骨頭構型改變，進而產生骨折發生率增高之一種疾病。骨質疏鬆症伴隨骨折之發生不但會對人體造成疼痛，更會增加患者之死亡率並且帶來嚴重之經濟負擔。
造骨母細胞(osteoblasts)和脂肪細胞(adipocytes)、纖維母細胞(fibroblasts)均係由間葉幹細胞(mesenchymal stem cells)分化，而蝕骨細胞(osteoclasts)係由造血幹細胞(hematopoietic cells)之巨噬細胞/單核球細胞系列(macrophage/monocyte lineage)分化。由骨髓細胞(bone marrow stromal cells)及造骨母細胞分泌之兩種屬於腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)族群之細胞激素-巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)以及核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)，為單核球前驅細胞分化形成蝕骨細胞所必須之因子。核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)在造骨幹細胞、骨髓細胞及血管內皮細胞之細胞表面表現，能與單核前驅細胞表面之受體核因子-κB受体活化因子(RANK)結合，進而促使細胞分化成多核之蝕骨細胞，此時分化成熟之蝕骨細胞則分泌耐酒石酸之酸性磷酸酵素(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)而呈現溶蝕骨質之能力。
核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)/RANK
核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)之受體RANK通常表現於蝕骨前驅細胞或分化成熟之蝕骨細胞之細胞膜上，核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)直接透過細胞與細胞間之接觸與RANK進行交互作用，而促使蝕骨細胞分化、增生，呈現溶蝕骨質能力。當核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)與單核球前驅細胞膜上之受體RANK結合後，RANK會與腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor,TRAFs)交互作用，隨即開啟一連串與蝕骨細胞分化及活化之訊息傳遞路徑，包含三條主要之訊息傳遞路徑：(1)核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、(2)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAP kinase,MAPK)和(3) Src/PI3K/Akt訊息傳遞路徑，及重要之轉錄因子c-Fos和活化T细胞核因子(NFATc1)。其中核因子-κB和MAP kinase訊息傳遞路徑調控蝕骨細胞之分化及溶蝕能力，而Wong,BR.等1999年Mol. Cell.第4(6)期第1041-1049頁認為Src/PI3K/Akt係主宰蝕骨細胞存亡之訊息傳遞路徑。
腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAFs)
TRAF家族中包含六種不同之蛋白，皆能與RANK作用，Mizukami,J.等人於2002年Mol. Cell. Biol.第22(4)期第992-1000頁發現只僅僅去除TRAF6基因之老鼠，因嚴重之蝕骨細胞功能缺陷而發生骨石化症，而Armstrong,AP.等人於2002年J. Biol. Chem.第277(46)期第44347-44356頁發現將老鼠RANK基因突變，使RANK上缺乏TFAF6之結合位，令單核球細胞失去形成蝕骨細胞之能力。顯示TRAF6於核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)/RANK之訊息傳遞路徑中扮演最重要之角色。
核因子-κB路徑(Nuclear factor κB,NF-κB)
核因子-κB在未受刺激之狀態下，與其抑制蛋白(inhibitory κB,IκB)結合並保持非活化狀態。當受到核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)刺激後，RANKL與RANK結合，透過TRAF6促使核因子-κB之活化。核因子-κB之活化導致IκB在Ser-32與Ser-36兩處被IκB kinase(IKK)磷酸化，並進行水解與IκB分離，其後核因子-κB便進入細胞核中誘導許多與蝕骨細胞溶蝕活性相關之基因轉錄。
絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAP kinase,MAPK)路徑
絲裂原活化蛋白激酶家族之成員包含細胞外訊息調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38-MAPKs)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)。已知p38之抑制劑SB203580或ERK之抑制劑PD98059均可經由核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)而抑制蝕骨細胞分化及蝕骨細胞生成作用(osteoclastogenesis)之誘發。ERK與JNK之活化將共同影響下游之轉錄因子activator protein-1(AP-1)之作用，ERK會誘導並活化AP-1族群中之c-Fos蛋白之表現；而JNK則透過磷酸化c-Jun進而增強AP-1之轉錄活性，調控RANK誘發之蝕骨細胞生成作用。
Src/PI3K/Akt路徑
Src與TRAF6交互作用於核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)誘發anti-apoptotic絲胺酸/酪胺酸激酶(serine/threonine kinase,Akt)活化中扮演重要之角色，Src接在細胞質端之RANK尾巴上，受到核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)結合上RANK、TRAF-6活化之後之刺激而活化，接著活化下游之Akt。而Src促使Akt活化之過程中需要磷脂醯肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)之媒介。使用c-Src抑制劑、將c-Src基因移除或使用PI3K抑制劑LY294002皆可抑制RNAKL誘發Akt之活化。RNAKL/RANK透過TRAF6經由Src/PI3K/Akt之訊息傳遞路徑，調控蝕骨細胞之生存能力。
轉錄因子(transcription factors)
RANKL/RANK訊息傳遞路徑藉著活化轉錄因子AP-1及核因子-κB而促使許多與蝕骨細胞溶蝕作用相關之基因表現。AP-1家族中c-Jun、JunB、c-Fos、Fra-1和Fra-2參與蝕骨細胞生成作用之調控。而當c-Fos與轉錄因子如活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFATc1)作用後，促使蝕骨細胞溶蝕作用基因TRAP及Cathepsin K之表現。Takayanagi H等人於2007年Ann. NY Acad. Sci.第1116期第227-237頁認為經由上游之鈣/鈣調素(calcium/calmodulin)訊息傳遞：細胞內鈣離子先與鈣離子結合蛋白鈣調素結合後，活化下游之鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶(calcium/calmodulin-activated kinases,CaMKs)以及鈣調磷酸酶(calcineurin)，而使得NFATc1活化。因此，AP-1、NFATc1及核因子-κB為調控蝕骨細胞溶蝕作用之關鍵之轉錄因子。
促炎细胞因子(Pro-inflammatory cytokines)
活化之巨噬細胞所釋放出一些促炎细胞因子(pro-inflammatory cytokines)如：腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1(interleukin-1,IL-1)、白介素-6(IL-6)，能促使發炎反應而誘發蝕骨細胞生成之作用。活化之T細胞及巨噬細胞所釋放之TNF-α，可促使RANK之表現以及增加RANK對核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)之敏感性。IL-6、IL-11及IL-17在發炎反應狀況下促使骨質流失。然而，Wei,S.等人於2008年Pathol. Res. Pract.第204(10)期第695-706頁在體外和體內試驗發現IL-4、IL-10、IL-12、IL-18及干擾素-γ(interferon-γ)，透過抑制蝕骨細胞分化及其溶蝕活性而抑制蝕骨細胞之生成。
高遷移族蛋白B1(High-mobility group box 1,HMGB1)
HMGB1係真核細胞核內之蛋白質，當巨噬細胞被激化或受到促炎细胞因子之影響，HMGB1將從細胞核轉移到細胞質內，藉由胞吐作用或細胞膜之破裂而移出細胞，Zhou,Z.等人於2008年J. Bone. Miner. Res.第23(7)期第1084-1096頁發現在細胞外之HMGB1呈現類似促炎细胞因子，在發炎反應之狀況下促使骨質之流失。
碘乙酸鈉(Monosodium iodoacetate,MIA)
碘乙酸鈉(MIA)為甘油醛3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)之抑制劑，於體外試驗其抑制糖解反應(glycolysis)造成軟骨細胞(chondrocyte cell)死亡。於活體內試驗，膝關節腔注射MIA可誘導膝關節軟骨之軟骨細胞死亡，誘發關節炎(osteoarthritis)，在發炎反應之環境下，淋巴細胞、巨噬細胞及肥大細胞浸潤，細胞釋放出之促炎细胞因子使得蝕骨細胞被活化，促使關節軟骨(articular cartilage)以及軟骨下硬骨(subchondral bone)之骨質流失。
具有茶鹼(theophylline,1)架構，經以氯苯基修飾之KMUP-1其化學名為7-[2-[4-(2-氯苯基)哌嗪]-1-基]-乙基-茶鹼(7-[2-[4-(2-Chlorophenyl)piperazin-1-yl]ethyl]theophylline)。茶鹼之結構如式(1)，KMUP-1之結構係如式(2)所示。
已知KMUP-1具有活化上皮及內皮之eNOS，部分活化平滑肌可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylyl cyclase,sGC)、抑制磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)3、4及5之作用，而增加細胞內cGMP之含量以及具有開啟鉀離子通道之特性；且KMUP-1可透過刺激cGMP和開啟鉀離子通道之機制，引起兔子之陰莖海綿體平滑肌細胞鬆弛。另外，KMUP-1已證實可以影響cAMP/PKA及cGMP/PKG等路徑，而引起氣管上皮細胞NO之生成量增加，進而活化氣管平滑肌細胞內sGC，或係KUMP-1直接活化平滑肌細胞內之sGC，使cGMP量增加激活PKG；KUMP-1亦可直接活化adenylate cyclase引起cAMP量增加而激活PKA，PKA和PKG二者皆引起平滑肌細胞膜鉀離子通道開啟，最後使得氣管平滑肌鬆弛。cAMP及cGMP係細胞內二次訊息傳訊者，同時調節多種生理反應，包括細胞生長及分化、細胞凋亡、醣解作用及酯解作用、免疫及發炎反應等。
Miyamoto,K.等人於1997年Biochem. Pharmacol.第54(5)期第613-617頁發現PDE4抑制劑於Walker256/S-bearing大鼠動物模式當中可以抑制骨質流失；Yoshimura,T.等人於1997年Gen. Pharmacol.第29(4)期第633-638頁亦認為，促使骨質流失之關鍵細胞激素TNF-α、IL-1及IL-6，可被PDE4抑制劑抑制其增生。
發明人鑑於KMUP-1對於骨質之活性尚未被研究，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案「茶鹼化合物之抑制骨質疏鬆症活性」，獲知含茶鹼之醫藥組合物可預防及治療骨質流失之過程，減少發炎細胞之浸潤，以下為本案之簡要說明。
本發明之一目之在於提供具有治療骨質疏鬆症之醫藥組合物。
根據本發明之構想，係提供一種有效量之茶鹼化合物，其係以氯苯基修飾，可運用N-(2-氯苯基)哌嗪(N-(2-chlorophenyl)piperazine)與7-(2-溴乙基)茶鹼(7-(2-bromoethyl)theophylline)合成，化學名為7-[2-[4-(2-氯苯基)哌嗪]-1-基]-乙基-茶鹼(7-[2-[4-(2-Chlorophenyl)piperazin-1-yl]ethyl]theophylline)。
根據上述構想，以核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)誘發巨噬細胞形成類蝕骨細胞的模式，探討磷酸二酯酶(phosphodiesterase)第三、四、五型(PDE3,4,5)抑制劑KMUP-1對類蝕骨細胞增生及分化的影響，並深入探討KMUP-1抑制類蝕骨細胞增生及分化的作用機轉。
根據上述構想，於體外試驗KMUP-1具有抑制類蝕骨細胞增生及分化的作用，於體內試驗可預防及治療發炎性之關節疾病，KMUP-1可成為一個預防及治療骨質流失的新製劑。
經由RANKL刺激KMUP-1影響RAW264.7細胞之增生
核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)可誘使細胞增生，經由藥物毒性試驗(MTT assay)以及細胞增生試驗(BrdU assay)進行雙重確認之KMUP-1是否抑制RAW264.7之細胞增生。無論如第一圖所示之MTT assay或第二圖所示之BrdU assay，KMUP-1以5、7.5、10 μM能抑制RANKL誘發之細胞增生。而theophylline及sidenafil(3)於濃度10 μM對於RANKL誘發之細胞增生無明顯之抑制效果。
經由RANKL刺激RAW264.7細胞分化形成類蝕骨細胞受KMUP-1所影響
單核之RAW264.7細胞受RANKL刺激，分化成多核之類蝕骨細胞，且分泌具有溶蝕活性之標的酵素TRAP。單核之RAW264.7經RANKL刺激5天，以光學顯微鏡每天觀察細胞分化，並於第5天以TRAP染色法及TRAP活性試驗確認類蝕骨細胞之分化以及KMUP-1之影響。染色結果，於光學顯微鏡發現控制組全部為小顆之單核巨噬細胞，因為無TRAP之表現，所以TRAP染色處理後無法呈現桃紅色。而經RANKL以10 ng/ml誘發5天後之RANKL組，可觀察到許多分化成多核大顆類蝕骨細胞之桃紅色，如第三圖至第五圖所示投予KMUP-1之組別明顯地呈現與劑量相關地抑制現象。由TRAP活性試驗之結果顯示，經RANKL以10 ng/ml誘發5天之細胞呈現大量之TRAP活性，而如第六圖所示投與KMUP-1之組別則可有效之抑制，且抑制效果呈劑量相關性。另外，濃度10 μM之茶鹼及Sildenafil對於RANKL誘發之TRAP活性無明顯之抑制效果。
KMUP-1對類蝕骨細胞之溶蝕作用之影響
如第三圖至第六圖所示KMUP-1可有效地抑制類蝕骨細胞之分化，為確認KMUP-1對於分化後之類蝕骨細胞之骨溶蝕作用有影響，將細胞培養於底部已覆蓋類似骨基質之合成磷酸鈣培養皿，同樣給予10 ng/ml之RANKL刺激5天以及不同濃度之KMUP-1。實驗結果發現，單獨給予10 ng/ml核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)刺激5天之組別與控制組比較，類蝕骨細胞有明顯之溶蝕活性，培養皿底部之覆蓋物因溶蝕而呈現空洞，而如第七圖所示投與KMUP-1之組別可抑制類蝕骨細胞之溶蝕作用，如第八圖所示經溶蝕面積計算結果發現KMUP-1之抑制效果呈劑量相關性。顯示KMUP-1不僅能減少類蝕骨細胞之分化、減少TRAP酵素之產生，亦可降低類蝕骨細胞之骨溶蝕作用。
KMUP-1影響經由RANKL刺激RAW264.7細胞分泌促
炎细胞因子
在核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)刺激下，單核球RAW264.7細胞能分泌促炎细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6等，以ELISA之方法測定KMUP-1影響RANKL誘發促炎细胞因子之分泌。如第九圖所示，RANKL誘發巨噬細胞分泌促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6之分泌量，KMUP-1呈現劑量相關性之抑制現象；另外，如第十圖所示KMUP-1劑量相關性之增加抗發炎反應細胞激素IL-10之產量。
KMUP-1對RANKL誘發核因子-κB路徑活化之影響
在細胞質內原本與NF-κB結合抑制其活性之IκBα受RANKL之刺激，而磷酸化，與NF-κB分離後被水解，而自由態之NF-κB便轉移到細胞核內，扮演轉錄因子的角色。實驗結果發現，RANKL誘導30分鐘後與控制組相比，細胞質內IκBα呈現明顯之磷酸化以及水解現象，如第十一圖(A)所示事先投予KMUP-1不同濃度作用24小時之組別可抑制核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)之作用。另外一方面，經RANKL誘導30分鐘後與控制組相比，細胞核內之p65之量明顯增多，而如第十一圖(B)所示事先給予KMUP-1不同濃度作用24小時之組別，對於p65之入核有抑制之效果，核內聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)之表現並無改變。結果顯示，KMUP-1可以抑制核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)誘發核因子-κB路徑之活化。
KMUP-1影響RANKL誘發MAP kinases路徑之活化
MAP kinases包含ERK、JNK和p38，經核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)之刺激，磷酸化此等蛋白質，而影響下游促使蝕骨細胞分化之關鍵轉錄因子c-Fos、NFATc1等。在評估藥物影響之前，於不同時間點利用10 ng/ml核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)誘發ERK、JNK和p38之磷酸化，經西方墨點法發現第15分鐘時最明顯，因此，以15分鐘做為RANKL誘發之時間。如第十二圖至第十四圖所示細胞質內ERK、JNK和p38之磷酸化程度，KMUP-1於7.5及10 μM較高濃度時可有效抑制核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)誘發之ERK、JNK和p38磷酸化。顯示KMUP-1可減低核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)誘發MAP kinases路徑之活化。
KMUP-1影響RANKL活化關鍵轉錄因子c-Fos及NFATc1
已知KMUP-1影響核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)誘發MAP kinases路徑之活化，應評估下游促使蝕骨細胞分化之關鍵轉錄因子c-Fos和NFATc1是否亦受KMUP-1之抑制。如第十五圖所示，經24小時RANKL誘發c-Fos之表現，於較高濃度7.5及10 μM時KMUP-1可有效地抑制；如第十六圖所示經西方墨點法可見，於5、7.5及10 μM濃度KMUP-1之可有效地抑制經24小時RANKL誘發NFATc1之表現。顯示較高濃度之KMUP-1可抑制MAP kinases一連串之訊息傳遞路徑。
KMUP-1影響RANKL誘發細胞鈣離子內流及calcineurin之活化
關鍵性轉錄因子NFATc1受絲裂原活化蛋白激酶(MAP kinases)/c-Fos之影響，亦受鈣離子路徑之影響。經核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)之刺激，令鈣離子由細胞外內流，細胞內鈣離子之增加將活化下游鈣調磷酸酶(calcinuerin)蛋白之表現，而calcinuerin之活化又與轉錄因子NFATc1相關。利用測定細胞內鈣離子濃度之改變以及用西方墨點法評估calcinuerin蛋白之表現。以RANKL刺激RAW264.7巨噬細胞4分鐘經鈣離子螢光探針(fura-2/AM)測定細胞內鈣離子，如第十七圖(A)所示，細胞內鈣離子濃度無明顯之變化。於細胞培養時先給予核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)刺激一週，使巨噬細胞分化成類蝕骨細胞(osteoclast-like cells,OCL)後，再以RANKL刺激類蝕骨細胞，可明顯增加細胞內鈣離子濃度。0.1 μM濃度之KMUP-1無法顯著地抑制RANKL誘發細胞外鈣離子內流之作用，而1及10 μM可抑制RANKL誘發細胞外鈣離子內流之作用(第十七圖、第十八圖)。以核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)刺激24小時，如第十九圖所示西方墨點法之結果，顯示鈣調磷酸酶(calcineurin)之表現與控制組相比較有明顯之增加，而同時給予不同濃度之KMUP-1，發現5、7.5及10 μM能呈現明顯抑制RANKL誘發calcineurin之表現。
KMUP-1影響RANKL誘發Akt之磷酸化
核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)能活化PI3K/Akt之訊息傳遞路徑，以維持類蝕骨細胞之生存及增生，避免細胞凋亡。於不同時間點測試核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)誘發Akt磷酸化之程度。10 ng/ml核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)刺激第30分鐘時，誘發Akt磷酸化最明顯。以30分鐘作為誘發Akt磷酸化之時間點，如第二十圖所示，KMUP-1能有效抑制RANKL誘發Akt磷酸化之現象，且呈現劑量相關性之抑制效果。
KMUP-1影響RANKL誘發MMP-2及MMP-9之活化
KMUP-1影響三條主要與RANK/RANKL相關之上游訊息傳遞路徑，以西方墨點法評估其下游與蝕骨細胞溶蝕作用相關之MMP-2及MMP-9酵素之產量，並且經由基質金屬蛋白酶酵素(matrix metalloproteinase,MMP)電泳分析法(Gelatin Zymography)評估MMP-2和MMP-9之酵素活性。如第二十一圖之西方墨點圖譜所示，KMUP-1可有效地抑制RANKL誘發24小時之MMP-2及MMP-9蛋白質之產量。而如第二十三圖所示10 μM濃度之KMUP-1可減少核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)誘發24小時之MMP-2及MMP-9之酵素活性。
KMUP-1對核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)誘發HMGB1由細胞核位移至細胞外之影響
高遷移族蛋白B1(HMGB1)能影響蝕骨細胞之增生及分化，而原本存在細胞核內之HMGB1，受RANKL之刺激，移行到細胞質中或轉移至細胞外，在細胞外之HMGB1呈現如促炎细胞因子之作用，可經由RANKL/RANK或其他路徑調控蝕骨細胞之增生與分化。以10 ng/ml核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)刺激RAW264.7，分別於0、6、12、18和24小時，分離細胞外培養液、細胞質與細胞核三種地方，經西方墨點法確認HMGB1之表現量。刺激12小時後，HMGB1明顯地從細胞核、細胞質遷移至細胞外；而RANKL刺激第18小時，轉移至細胞質及細胞外培養液之效果最明顯。不同濃度之KMUP-1投與24小時以及10 ng/ml之RANKL刺激18小時，如第二十五圖至第二十八圖所示投與5，7.5和10 μM之KMUP-1均對RANKL刺激HMGB1由細胞核遷移細胞質及細胞外培養液之作用呈現抑制效果，而該抑制效果呈劑量相關性。
KMUP-1影響RANKL誘發與骨溶蝕活性相關之基因mRNA之表現
核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)，可誘發許多與蝕骨細胞溶蝕活性相關基因之表現。運用逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-plymerase chain reaction,RT-PCR)之技術，萃取細胞中之RNA，放大並定量其mRNA，如第二十九圖所示，TRAF6、TRAP、c-Fos、NFATc1、MMP-9、Fra-1、Fra-2、c-Src及Cathepsin K可被10 ng/ml之RANKL所誘發，其中KMUP-1抑制TRAP、c-Fos、NFATc1、MMP-9及Fra-1之mRNA表現，而無顯著抑制TRAF6、Fra-2、c-Src及Cathepsin K之效果。另外經由西方墨點法如第三十圖所示，發現以10 ng/ml核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)誘發TRAF6蛋白質之表現，KMUP-1對於無顯著抑制效果。
KMUP-1影響MIA誘發大鼠模式之膝關節炎預防及治療
於大鼠膝關節腔內注射4 mg/25 μl碘乙酸鈉(MIA)之食鹽水溶液七天可誘發膝關節炎，由於促炎细胞因子之調控，激發蝕骨細胞活性，造成關節軟骨及軟骨下硬骨漸進式之流失。事先口服投予1、2.5和5 mg/kg劑量KMUP-1一週後，於第8天於膝關節腔注射4 mg/25 μl碘乙酸鈉食鹽水溶液，再繼續口服投予1、2.5和5 mg/kg劑量KMUP-1一週，於第15天犧牲動物。
如第三十一圖膝關節骨外觀圖所示，注射碘乙酸鈉食鹽水溶液傷害7天後之關節軟骨有明顯之破損缺陷，與佯作組(Sham)相比較表面顯得非常之不光滑，而給予2.5和5 mg/kg劑量KMUP-1預防及治療之組別可減少碘乙酸鈉所造成之傷害。
如第三十二圖所示蘇木紫和伊紅(Hematoxylin & Eosin stain)切片染色之結果可見，第三十二圖(a)佯作組之軟骨組織完好，而如第三十二圖(b)所示單獨給予碘乙酸鈉食鹽水溶液之傷害組可明顯看到軟骨組織缺陷、傷害後留下之空洞以及大量之發炎細胞浸潤。於1 mg/kg劑量KMUP-1預防及治療組，碘乙酸鈉傷害後之空洞以及軟骨組織之缺陷依然存在，而如第三十二圖(c)所示空洞及軟骨組織之傷害面積比碘乙酸鈉傷害組呈現較小之趨勢，尚有許多發炎細胞之浸潤。碘乙酸鈉傷害後之空洞以及軟骨組織之缺陷，如第三十二圖(d)所示於2.5 mg/kg劑量KMUP-1預防及治療組，較1 mg/kg劑量KMUP-1頗多改善，與碘乙酸鈉傷害組相比較更呈現明顯差異，發炎細胞之浸潤也明顯減少。於5 mg/kg劑量KMUP-1預防及治療組，如第三十二圖(e)所示碘乙酸鈉傷害後之空洞以及軟骨組織之缺陷程度達到接近佯作組之恢復狀態，唯尚有一些發炎細胞之浸潤。由H&E之切片結果，發現KMUP-1可預防及治療碘乙酸鈉所造成之軟骨組織傷害，而其效果呈現劑量相關性。
如第三十三圖所示甲苯胺藍(toluidine blue)之切片染色結果，與佯作組相比較，於碘乙酸鈉傷害組之軟骨組織缺陷和破洞，可看到大量之肥大細胞(深藍色)浸潤，而給予KMUP-1預防及治療之組別，依照劑量之增高，肥大細胞之浸潤呈現遞減趨勢。顯示KMUP-1可減少碘乙酸鈉所誘發之膝關節發炎反應，而效果呈現劑量相關性。
上述賦形劑或稱為『藥學上可接受之載體或賦形劑』、『生物可利用之載體或賦形劑』，係包括溶媒、分散劑、包衣、抗菌或抗真菌劑，保存或延緩吸收劑等任何習知用於製備成劑型之適當化合物。通常此類載體或賦形劑，本身不具備治療疾病之活性，且將本發明所揭示之衍生物，搭配藥學上可接受之載體或賦形劑，製備之各劑型，投與動物或人類不致於造成不良反應、過敏或其它不適當反應。因而本發明所揭示之衍生物，搭配藥學上可接受之載體或賦形劑，係適用於臨床及人類。運用本發明化合物之劑型經由靜脈、口服、吸入或經由鼻、直腸、陰道等局部或舌下等方式投藥，可達到治療效果。對於不同病症之患者，約每日投與0.1 g至100 mg之活性成份。
該載體隨各劑型而不同，無菌注射之組成物可將溶液或懸浮於無毒之靜脈注射稀釋液或溶劑中，此類溶劑如1,3－丁二醇。其間可接受之載體可為甘露醇(Mannitol)或水。此外固定油或以合成之單或雙甘油酯懸浮介質，係一般習用之溶劑。脂肪酸，如油酸(Oleic acid)、橄欖油或蓖麻油等與其甘油酯衍生物，尤其經多氧乙基化之型態皆可作為製備注射劑並為天然醫藥可接受之油類。此等油類溶液或懸浮液可包含長鏈酒精稀釋液或分散劑、羧甲基纖維素或類似之分散劑。其他一般使用之介面活性劑如Tween、Spans或其他相似之乳化劑或係一般醫藥製造業所使用於醫藥可接受之固態、液態或其他可用於劑型開發之生物可利用增強劑。
用於口服投藥之組合物則係採用任何一種口服可接受之劑型，其型式包括膠囊、錠劑、片劑、乳化劑、液狀懸浮液、分散劑、溶劑。口服劑型一般所使用之載體，以錠劑為例可為乳糖、玉米澱粉、潤滑劑，如硬脂酸鎂為基本添加物。而膠囊使用之稀釋液包括乳糖與乾燥玉米澱粉。製成液狀懸浮液或乳化劑劑型，係將活性物質懸浮或溶解於結合乳化劑或懸浮劑之油狀介面，視需要添加適度之甜味劑，風味劑或係色素。
鼻用氣化噴霧劑或吸入劑組成物，可根據已知之製劑技術進行製備。例如，將組成物溶於生理食鹽水中，添加苯甲醇或其他適合之防腐劑，或促吸收劑以增強生物可利用性。本發明化合物之組合物亦可製成栓劑，進行經直腸或陰道之投藥方式。
本發明化合物亦可運用『靜脈投藥』，其係包括經由皮下、腹腔、靜脈、肌肉，或關節腔內、顱內、關節液內、脊髓內注射，主動脈注射，胸腔注射，疾病部位內注射，或其他適合之投藥技術。
本案所提出之「茶鹼化合物之抑制骨質疏鬆症活性」將可由以下之實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例之精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。
活性實驗：
一、細胞培養
(1) 細胞培養液製備
將10%胎牛血清(FBS)、20 ml麩醯胺酸(glutamine)、20 ml抗生素、3 g NaHCO3
與DMEM粉末混合並加二次蒸餾水2公升，調整pH值至7.2。
(2) RAW264.7初代培養
將細胞解凍後，直接加到含有適量培養液之10公分培養盤中，放置於37℃、5% CO2
/air環境之培養箱中靜待細胞貼附。隔天再更換培養液以去除抗凍劑(DMSO)。
(3) RAW264.7繼代培養
將舊之培養液吸除後，用新之培養液沖下細胞，即可用trypan blue計數細胞並分盤培養。
二、藥物毒性試驗(MTT assay)
將103
個細胞接種於96孔培養盤中，經24小時之細胞培養後，投與不同之藥物及其不同濃度，分別於24及48小時後加入MTT(0.05 g/10 ml磷酸鹽緩衝液PBS) 10 μl/well，培養4小時，將培養液吸出，並加入100 μl/well異丙醇(isopropanol)溶解紫色甲瓚(formazan)結晶。快速震盪15分鐘，並靜置15分鐘後，測量540 nm(OD540
)和630 nm(OD630
)之吸光值，將每組數據之(OD540
-OD630
)與控制組值比較後即可計算出細胞存活百分比。
三、細胞增生試驗(BrdU assay)
依照Cell Proliferation ELISA BrdU kit之說明步驟進行實驗。將103
個細胞接種於96孔培養盤中，經24小時之細胞培養後，投與核因子-κB受体活化因子配体(RANKL) 10 ng/ml以及不同濃度之KMUP-1、theophylline和sildenafil，藥物作用24、48、72小時後，加入BrdU labeling reagent 10 μl/well，於培養箱中避光培養4小時，吸出培養液，加入FixDenat solution 200 μl/well於室溫中反應30分鐘，接著移除FixDenat solution，並且加入Anti-BrdU POD 100 μl/well於室溫中反應90分鐘，移除Anti-BrdU POD，用Wash buffer 200 μl/well清洗3次後，移除Wash buffer，加入Substrate reaction 100 μl/well，於室溫中反應30分鐘，此時溶液呈藍色，最後加入Stop solution 25 μl/well(1 M H2
SO4
)，此時溶液呈黃色，震搖5分鐘後，測量450 nm(OD450
)和630 nm(OD630
)之吸光值，將每組數據之(OD450
-OD630
)與控制組織數值比較後即可算出細胞增生百分比。
四、抗酒石酸酸性磷酸酵素染色法(TRAP stain)
將103
個細胞接種於96孔培養盤中，經24小時之細胞培養後，投與核因子-κB受体活化因子配体(RANKL) 10 ng/ml以及不同濃度之KMUP-1，每2天更換一次藥物及培養液，待藥物反應4天後，於第5天進行染色。首先將磷酸鹽緩衝液(PBS)於37℃水浴鍋回溫，緩慢加入磷酸鹽緩衝液(PBS) 100 μl/well，再緩慢吸出100 μl/well之培養液移除，重複磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗之動作3次，直到培養盤中之液體呈透明無色後，勿吸乾，每個孔洞預留約50 μl之液體，接著緩慢加入Fixative solution 200 μl/well於室溫中反應10分鐘，接著以二次水清洗3次，勿吸乾，每個孔洞預留約50 μl之液體，加入Substrate 200 μl/well於室溫中避光反應15分鐘，於光學顯微鏡下觀察染色深淺，待細胞成功吃入紅色染劑後即可以二次水清洗，最後以光學顯微鏡觀察及拍照(40倍及200倍)，再用合圖軟體(Autopano Pro V1.4.2,Kolor,Paris)合成40倍拍下之圖，再以人工計數每個孔洞中細胞核數目大於3之多核蝕骨細胞數目，與控制組做比較。
配方：
(1) 固定液(Fixative solution)
：檸檬酸液(Citrate solution) 25 ml,丙酮(Acetone) 65 ml,37%甲醛(Formaldehyde) 8 ml。避光、4℃儲存備用。
(2) 檸檬酸液(Citrate solution)：18 mM檸檬酸,9 mM檸檬酸鈉,12 mM氯化鈉加水至100 ml，pH 3.6，最後加入0.001%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。
(3) 基質(Substrate)：將萘酚AS-MX磷酸鹽(Naphthol As-Mx-phosphate disodium) 2 mg、耐曬紅紫LB鹽(Fast Red Violet LB) 6 mg溶於1 M酒石酸
鈉(Sodium tartrate)丙酮液(0.1 M,pH 5)與0.1 M醋酸鈉(Sodium acetate) 19 ml。
五、抗酒石酸酸性磷酸酵素活性試驗(TRAP activity assay)
將103
個細胞接種於96孔培養盤中，經24小時之細胞培養後，投與核因子-κB受体活化因子配体(RANKL) 10 ng/ml以及不同濃度之KMUP-1，每2天更換一次藥物及培養液，待藥物反應4天後，於第5天測TRAP活性。首先，用冰之磷酸鹽緩衝液(PBS) 100 μl/well清洗3次，吸乾96孔培養盤中之液體，加入50 μl/well含0.2% TritonX-100之裂解緩衝液(Lysis buffer)於室溫中反應10分鐘：
(1) 吸取上清液5 μl/well，置於已加入150 μl/well基質(Substrate)之另外一個96孔培養盤中，於37℃培養箱中反應30分鐘，待反應液呈黃色後，最後以0.1 M氫氧化鈉100 μl/well終止反應，於37℃下測量405 nm(OD405
)之吸光值。
基質(Substrate)係將0.1 M对硝基苯磷酸二钠盐(4-NPP)和0.2 M酒石酸
鈉加入0.1 M醋酸鈉緩衝液，配置成pH=5。
(2) 吸取上清液3 μl/well，以蛋白質濃度分析試劑組(Bio-Rad DC Protein Assay)測定蛋白質濃度。
六、測定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量(ELISA)
將105
個細胞接種於24孔培養盤中，經24小時之細胞培養後，投與核因子-κB受体活化因子配体(RANKL) 10 ng/ml以及不同濃度之KMUP-1，帶藥物反應24小時後，吸取上清液，以13,000 rpm、4℃、離心20分鐘後，吸取上清液並用酶聯免疫吸附測試試劑(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay;ELISA
kits)(R&D system和eBioscienceTM
)測定TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10之含量，實驗步驟依照kit上之說明。
七、核質分離(Nuclear-cytosol protein separation)
(1) 萃取細胞質蛋白
依照NE-PER kit說明書步驟來抽取核蛋白。將2.5x106
個細胞接種於6公分培養皿中，經24小時之細胞培養後，投與不同濃度之KMUP-1，待藥物作用24小時後，再加入核因子-κB受体活化因子配体(RANKL) 10 ng/ml，培養特定時間。去除培養液，用磷酸鹽緩衝液(PBS)洗兩次，加入1 ml磷酸鹽緩衝液(PBS)刮細胞收集在離心小管中，離心5分鐘、4℃、5,000 rpm。將上清液吸乾丟掉，加入蟲擬蠟菌(CERI)100 μl，震盪15秒將細胞打散，再放冰上10分鐘。加入CERII 5.5 μl，震盪5秒，放冰上1分鐘，再震盪5秒，離心5分鐘、4℃、10,000 rpm，此步驟可將細胞質與細胞核分離，得到上清液為細胞質蛋白，沉澱物為細胞核。將上清液(細胞質蛋白)吸出置於離心小管中，儲存於-80℃待日後使用。
(2) 萃取細胞核蛋白
將剩下之細胞核沉澱物，加入磷酸鹽緩衝液(PBS)500 μl，離心5分鐘、4℃、10,000 rpm，並吸乾上清液丟棄，此步驟可以清洗沉澱物，以避免細胞質液之汙染。加入核甘酸切除修復(NER) 50 μl，震盪15秒再放冰上10分鐘，此步驟重複4次，最後離心10分鐘、4℃、13,000 rpm，得到之上清液為細胞核蛋白，將上清液(細胞核蛋白)吸出置於離心小管中，儲存於-80℃待日後使用。
CERI原液：PI：PMSF=100：5：1
NER原液：PI：PMSF=100：5：1
八、西方墨點法(Western blotting)
(1) 將106
個細胞接種於6公分培養盤中，經24小時之細胞培養後，投與不同濃度之KMUP-1，待藥物作用24小時後，再加入核因子-κB受体活化因子配体(RANKL) 10 ng/ml，培養特定時間。
(2) 將細胞以冰磷酸鹽緩衝液(PBS)洗二次後，並去除殘餘之磷酸鹽緩衝液(PBS)後加入25 μl之Lysis buffer作用15分鐘後，以刮杓刮下蛋白質。再以13,000 rpm、4℃、離心30分鐘後，吸取上清液，檢品可儲存於-80℃待日後使用。
(3) 蛋白質濃度以Bio-Rad DC Protein Assay測量。得知濃度後，以二次蒸餾水稀釋至特定濃度，取稀釋蛋白液約四分之一體積之檢品緩衝液加入後，放置於沸水中5分鐘，再置於冰上5分鐘，短暫離心後即可注入至孔洞中。先以電壓100伏特跑10分鐘，待蛋白質跑至上下膠交界處後，再將電壓轉至200伏特，待40分鐘後即關閉電源。
(4) 將聚偏氟乙烯(PVDF)膜先以甲醇浸泡2分鐘，再用二次蒸餾水潤洗後，再浸泡於轉印緩衝液(transfer buffer)中15分鐘備用。將十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)置於膜上，上下以潤濕之紙墊包夾後，置於半乾轉印(semi-dry transfer)機器上扣好電極和上蓋後，以20伏特轉漬30分鐘。
(5) 修剪膜上得到特定分子量之條紋(band)後，加入適量blocking buffer(5%脫脂奶粉溶於洗滌緩衝液(washing buffer)室溫下搖晃1小時以去除非特異性結合，再以稀釋過之一級抗體均勻覆蓋於band上4℃作用隔夜。之後吸起一級抗體後，以洗滌緩衝液清洗5分鐘六次。在將稀釋後之二級抗體均勻覆蓋於band上室溫作用1小時，之後再以洗滌緩衝液清洗5分鐘六次，即可用ECL壓片。
九、MMP-2和MMP-9基質金屬蛋白酶酵素電泳分析法(Gelatin Zymography)
(1) 將2.5 x 106
個細胞接種於6公分培養盤中，經24小時之細胞培養後，投與核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)10 ng/ml以及不同濃度之KMUP-1，待藥物反應24小時後，吸取上清液，以13,000 rpm、4℃、離心20分鐘後，吸取上清液，冰入-80℃冰箱儲存供日後測定。
(2) 製備10%膠，將10 mg明膠(gelatin)添加1 ml二次水，於55-60℃水浴鍋加熱至澄清溶解新鮮配置1%明膠液。
(3) 蛋白質濃度以Bio-Rad DC Protein Assay測量。得知濃度後，以二次蒸餾水稀釋至特定濃度，取稀釋檢品約四分之一體積之檢品緩衝液加入後，震搖均勻，即可將檢品注入上膠孔洞中，加入一倍之running buffer，以電壓100伏特跑10分鐘，待檢品跑至上下膠交界處後，再將電壓轉至200伏特，待60分鐘後即關閉電源。
(4) 將跑完之膠刮除上膠，小心翼翼之將下膠從玻璃上移至塑膠盒中，以TritonX-100 buffer於室溫中快速震搖清洗30分鐘，2次。接著以三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩衝液(Tris-HCl buffer)於室溫中快速震搖清洗20分鐘，2次。倒乾液體後，加入Developing buffer於37℃水浴鍋作用隔夜。
(5) 倒掉Developing buffer後，到抽風櫥內操作接下來之染色及退染之步驟。加入考馬斯藍(Comassie blue) R-250 stain solution於室溫中慢速震搖40-60分鐘，回收stain solution後，加入destain solution，快速震搖，約5-10分鐘更換一次destain solution，直到白色之band出現為止。
(6)
將洗好之膠，放於透明投影片上，以照相機拍照。
十、凹洞形成分析法(Pit formation assay)
將200 μl/well含核因子-κB受体活化因子配体(RANKL) 10 ng/ml以及不同濃度之KMUP-1之培養液加入BD BioCoatTM
OsteologicTM
Bone Cell Culture System (16-well multitest slides)之16孔培養盤中，接著緩慢且均勻地加入含1,000個細胞之100 μl之培養液於每孔中，使每孔之培養液體積為300 μl，放入培養箱中培養5天，期間每2天更換一次培養液及藥物。待5天後，完全移除培養液，撥開16孔培養盤之外殼，並以滅菌水清洗3次，接著以清潔液(Bleach solution)覆蓋培養盤底部，染色5分鐘，最後再以滅菌水清洗5次，待風乾後即可以光學顯微鏡拍照(40倍及200倍)，再用合圖軟體(Autopano Pro V1.4.2,Kolor,Paris)合成40倍拍下之圖。
十一、逆轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)
(1) 細胞前處理
將2.5 x 106
個細胞接種於6公分培養盤中，經24小時培養後，投與10 ng/ml核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)以及不同濃度之KMUP-1，待藥物反應24小時。
(2) 萃取RNA
於層流(laminar flow)操作台，以無核酸酶(nuclease-free)之器材進行以下步驟。倒掉培養液，用冰磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗2-3次，吸乾液體，加入RNA裂解緩衝液(RNA lysis buffer) 175 μl，立即刮下細胞(每盤細胞使用一隻新之刮勺)，將刮下之細胞液放入1.5 ml小型離心管內，加入藍色RNA稀釋緩衝液(RNA Dilution Buffer) 350 μl，混合均勻，避免分層，將小型離心管放入70℃水浴鍋反應3分鐘(勿超過3分鐘)，於4℃以14,000 rpm離心10分鐘，吸取上清液，置入新之小型離心管。
(3) 以Spin管柱純化RNA
加入200 μl 95%酒精混合均勻，將液體轉移到Spin管柱內，於4℃以14,000 rpm離心1分鐘，倒掉下管柱內液體，將50 μl泡好之DNA酶緩衝液(DNase buffer)散佈在spin管柱之膜上，於室溫中作用15分鐘，加入200 μl DNA酶中止溶液(DNase stop solution)，於4℃以14,000 rpm離心1分鐘，加入RNA洗滌溶液(RNA wash solution) 600 μl，於14,000 rpm、4℃、離心1分鐘，加入RNA洗滌溶液250 μl，於4℃以14,000 rpm離心2分鐘，丟棄下層Spin管柱，將上層Spin管柱蓋子扭掉，放在新之小型離心管上，加入無核酸酶溶液100 μl，於4℃以14,000 rpm離心1分鐘，溶解之RNA取2 μl進行濃度試驗，其餘立即置入-80℃冰箱儲存。
(4) RNA經逆轉錄(Reverse transcription)合成cDNA
分裝RNA(1 μg RNA)，放入聚合酶鏈式反應(PCR)器70℃作用10分鐘，快速將水氣離心下來，將檢品放回冰上，將配好之A溶液加入檢品中。接著跑PCR機器(42℃ 60分鐘，95℃ 5分鐘)，結束後測cDNA濃度，定量後每管檢品加80 μl之水，將檢品放置4℃儲存。
A溶液之製備：混合氯化鎂(25 mM) 4 μl、逆轉錄緩衝液(Reverse Transcription 10x Buffer) 2 μl、10 mM核酸混合液(dNTP Mixture) 2 μl、重組之核酶及核酶抑制劑(Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor) 0.5 μl、AMV逆轉錄緩衝液(AMV Reverse Transcriptase) 0.6 μl及寡聚胸腺嘧啶引物(Oligo(dT) 15 Primer OR Random Primers) 1 μl，最後添加無核酸酶的水至20 μl。
(5) 聚合酶鏈式反應(PCR)擴大反應
依序加入以下試劑，混合均勻後，跑PCR機器。
I.修飾功能指示劑(Taq Master Mix RED)(2X) 10 μl
II. 設計前置引子(Forword primer) 1 μl
III. 反置引子(Reverse primer) 1 μl
IV. 互補DNA(Complementary DNA,cDNA) 2 μl
V. 滅菌二次水6 μl
(6) 跑膠(Running)
A. 製2% agarose gel(1片)：將1.2 g agarose溶於60 ml 0.5x TBE buffer於三角燒杯中，微波(中火2-3 min)至溶解，加入1 μl溴化乙錠(Ethidium Bromide,EtBr)，搖勻後倒入製膠盒中。
B. DNA ladder(marker)配置法：以DNA loading dye：DDW=1:2:7比例配置。
C. Running buffer：0.5x TBE buffer(約300 ml)
D. 以100 V電壓跑30-40分鐘。
十二、細胞內鈣離子濃度測定
利用鈣離子螢光探針fura-2/AM作為細胞內鈣離子變化之指示劑，偵測鈣離子在細胞內濃度之變化。fura-2具有螢光特性且可與鈣離子結合，當fura-2和鈣離子結合後所激發出之波長為340 nm，而非結合型之fura-2所激發出之波長為380 nm，根據此特性可將激發出之螢光強度比例換算成鈣離子濃度。
將RAW264.7小鼠巨噬細胞接種於10公分培養皿，待細胞長至90%匯合狀態後，或將106
個細胞接種於10公分培養皿，24小時後加入10 ng/ml核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)反應7天，待單核細胞分化成多核類蝕骨細胞，倒掉培養液，用磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗三至四次後，用磷酸鹽緩衝液將全部細胞沖下置於離心管內，1,500 rpm、4℃、離心5分鐘，倒掉上清液，加入2 ml細胞培養液及2.5 μl之fura-2/AM(2 μM)，於37℃下作用40分鐘，於室溫下以1,500 rpm離心5分鐘，倒掉上清液，並加入適量生理緩衝液(physiological buffer)清洗並離心，最後加入生理緩衝液將細胞打散，將細胞濃度調為5×105
cells/ml。取1 ml細胞懸浮液置入石英管中，事先加入KMUP-1反應4分鐘後，將石英管放入RF-5310型螢光分光光度計測量340 nm和380 nm兩種波長在510 nm波長所產之螢光強度改變情形。記錄60秒後，加入20 ng/ml核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)後再記錄螢光強度之改變。
生理緩衝液(physiological buffer)之製備：將氯化鈉130 mM、氯化鉀5 mM、葡萄糖10 mM、氯化鎂1 mM、氯化鈣1 mM、HEPES 20 mM溶於1公升二次水中，調整pH值至7.4。
十三、碘乙酸鈉動物實驗模式
以碘乙酸鈉(Monosodium iodoacetate,MIA)作為誘發老鼠膝關節發炎(osteoarthritis)之誘導劑。由國科會購買30隻五週大Wistar品系公鼠，體重大約150-165 g，將老鼠分成五組，分別為佯作組(Sham)、碘乙酸鈉誘導組(MIA)及三組KMUP-1給藥組(1、2.5、5 mg/kg劑量KMUP-1)，每組各6隻老鼠。將老鼠飼養於動物室適應環境一週後，口服餵食KMUP-1(1、2.5、5 mg/kg)一週，於第8天分別於碘乙酸鈉組及KMUP-1治療組之老鼠左側膝關節，用26口徑之0.5 c.c.胰島素針注射4 mg/25 μl碘乙酸鈉食鹽水溶液於膝關節腔內，再餵食KMUP-1(1、2.5、5 mg/kg)一週，於第15天將老鼠犧牲。老鼠犧牲時，打開左側膝蓋，分離股骨(femur)與脛骨(tibia)連結之處，取出股骨接近脛骨之那段關節，修剪乾淨之後，以數位相機拍照。
十四、石蠟切片
將乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)置入燒瓶，添加二次水，加熱至完全溶解成乙二胺四乙酸溶液。將取下之組織，放進包埋盒中，浸泡於10%福馬林三天，接著浸泡於0.5 M乙二胺四乙酸溶液於60℃烘箱作用一週以脫鈣，將脫完鈣之骨頭，以脫水機脫水一天，再進行石蠟包埋及切片，切片厚度為4 μm。
十五、染色
(1) 蘇木紫和伊紅染色(Hematoxylin & Eosin stain,H&E)
首先脫蠟，將切片置於60℃烘箱作用20分鐘，浸泡於二甲苯(xylene)3分鐘二次，接著依序浸泡於100%酒精3分鐘二次，95%酒精1分鐘，80%酒精1分鐘，70%酒精1分鐘，50%酒精1分鐘，二次水1分鐘後，浸泡於蘇木紫(Hematoxylin)染缸5分鐘，取出以流動水清洗5分鐘，浸泡於伊紅(Eosin)染缸1.5分鐘，取出以流動水清洗5分鐘後，再依序浸泡於90%酒精1-2秒，100%酒精泡1-2秒，最後浸泡於二甲苯，即可封片。封好之玻片於光學顯微鏡下拍照。
(2) 甲苯胺藍(Toluidine blue)
甲苯胺藍之製備將1%硼酸鈉(sodium borate)、1%甲苯胺藍、1%天青II(AZUR II)溶於二次水。
首先脫蠟，將切片置於60℃烘箱作用20分鐘，泡於二甲苯3分鐘二次，接著依序浸泡於100%酒精3分鐘二次，95%酒精1分鐘，80%酒精1分鐘，70%酒精1分鐘，50%酒精1分鐘，二次水1分鐘後，浸泡於甲苯胺藍染缸浸泡1分鐘，取出以流動水清洗5分鐘，再依序浸於90%酒精泡1-2秒，100%酒精泡1-2秒，最後浸泡於二甲苯中，即可封片。封好之玻片於光學顯微鏡下拍照。
十六、統計方法
所有實驗數據均以平均值±標準誤(Mean±S.E.M.)及百分率(%)表示。實驗數據之比較，除有特別標示外，均採用Student'st
-Test以及one-way ANOVA評估對照組與給藥組間之差異。當P
值小於0.05時，表示於統計學上有顯著差異。
Armstrong AP,Tometsko ME,Glaccum M,Sutherland CL,Cosman D,Dougall WC: A RANK/TRAF6-dependent signal transduction pathway is essential for osteoclast cytoskeletal organization and resorptive function.J Biol Chem
2002,277(46):44347-44356.
Mizukami J,Takaesu G,Akatsuka H,Sakurai H,Ninomiya-Tsuji J,Matsumoto K,Sakurai N: Receptor activator of NF-kappaB ligand(RANKL) activates TAK1 mitogen-activated protein kinase kinase kinase through a signaling complex containing RANK,TAB2,and TRAF6.Mol Cell Biol
2002,22(4):992-1000.
Miyamoto K,Waki Y,Horita T,Kasugai S,Ohya K: Reduction of bone loss by denbufylline,an inhibitor of phosphodiesterase 4.Biochem Pharmacol
1997,54(5):613-617.
Takayanagi H: The role of NFAT in osteoclast formation.Ann N Y Acad Sci
2007,1116:227-237.
Wei S,Siegal GP: Mechanisms modulating inflammatory osteolysis: a review with insights into therapeutic targets.Pathol Res Pract
2008,204(10):695-706.
Wong BR,Besser D,Kim N,Arron JR,Vologodskaia M,Hanafusa H,Choi Y: TRANCE,a TNF family member,activates Akt/PKB through a signaling complex involving TRAF6 and c-Src.Mol Cell
1999,4(6):1041-1049.
Yoshimura T,Kurita C,Nagao T,Usami E,Nakao T,Watanabe S,Kobayashi J,Yamazaki F,Tanaka H,Nagai H: Effects of cAMP-phosphodiesterase isozyme inhibitor on cytokine production by lipopolysaccharide-stimulated human peripheral blood mononuclear cells.Gen Pharmacol
1997,29(4):633-638.
Zhou Z,Han JY,Xi CX,Xie JX,Feng X,Wang CY,Mei L,Xiong WC: HMGB1 regulates RANKL-induced osteoclastogenesis in a manner dependent on RAGE.J Bone Miner Res
2008,23(7):1084-1096.
第一圖 KMUP-1抑制RANKL誘發細胞之增生(MTT方法)
## P
<0.01與對照組比較(24 hr);
＠＠ P
<0.01與對照組比較(48 hr);
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較(24 hr);
+ P
<0.05,++ P
<0.01與RANKL組比較(48 hr)
第二圖 KMUP-1抑制RANKL誘發細胞之增生(BrdU方法)
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較
第三圖 KMUP-1可抑制RANKL誘發類蝕骨細胞之分化(光學顯微鏡影像全景圖，放大40倍)
第四圖 光學顯微鏡局部放大圖(放大200倍)
a-對照組
b-RANKL 10 ng/ml
c-RANKL+KMUP-1 1 μM
d-RANKL+KMUP-1 2.5 μM
e-RANKL+KMUP-1 5 μM
f-RANKL+KMUP-1 7.5 μM
g-RANKL+KMUP-1 10 μM
第五圖 KMUP-1可抑制分化成多核之類蝕骨細胞
## P
<0.01與對照組比較；
** P
<0.01與RANKL組比較
第六圖 KMUP-1可抑制TRAP活性
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較
第七圖 KMUP-1可抑制類蝕骨細胞之溶蝕作用
(A) 光學顯微鏡影像全景圖(放大40倍)
(B) 光學顯微鏡局部放大圖(放大200倍)
第八圖 KMUP-1可減少溶蝕凹洞面積
## P
<0.01與對照組比較；
** P
<0.01與RANKL組比較
第九圖 KMUP-1影響經由RANKL刺激RAW264.7細胞分泌促炎细胞因子
(A)腫瘤壞死因子α(TNF-α)
(B)白介素-1β(IL-1β)
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較
第十圖 KMUP-1可抑制分泌白介素類促炎细胞因子
(A) 白介素-6(IL-6)
(B) 白介素-10(IL-10)
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較
第十一圖 KMUP-1影響經由RANKL刺激RAW264.7細胞之NF-κB活化路徑
(A) KMUP-1可減少核因子-κB抑制蛋白α(IκBα)之磷酸化量
(B) KMUP-1可減少細胞核內p65之量
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較
第十二圖 KMUP-1可抑制細胞質內細胞外訊息調節激酶(ERK)之磷酸化程度
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較
第十三圖 KMUP-1可抑制細胞質內c-Jun氨基末端激酶(JNK)之磷酸化程度
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較
第十四圖 KMUP-1可抑制細胞質內p38絲裂原活化蛋白激酶之磷酸化程度
## P
<0.01與對照組比較；
** P
<0.01與RANKL組比較
第十五圖 KMUP-1可抑制RANKL活化c-Fos基因蛋白之表現
## P
<0.01與對照組比較；
** P
<0.01與RANKL組比較
第十六圖 KMUP-1可抑制RANKL活化NFATc1之表現
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較
第十七圖 KMUP-1影響RANKL誘發細胞外鈣離子之內流
(A)RANKL無法明顯刺激RAW264.7巨噬細胞之鈣離子內流
(B)KMUP-1可減少RANKL刺激類蝕骨細胞之鈣離子內流
第十八圖 KMUP-1抑制RANKL刺激類蝕骨細胞外鈣離子之內流
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較
第十九圖 KMUP-1可抑制RANKL活化calcineurin之表現
## P
<0.01與對照組比較；
** P
<0.01與RANKL組比較
第二十圖 KMUP-1可抑制細胞質內Akt之磷酸化程度
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較
第二十一圖 KMUP-1影響RANKL誘發誘發基質金屬蛋白酵素-2(MMP-2)之產量
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較
第二十二圖 KMUP-1影響RANKL誘發基質金屬蛋白酵素-9(MMP-9)之產量
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較.
第二十三圖 KMUP-1影響RANKL誘發基質金屬蛋白酵素-2(MMP-2)之活性
## P
<0.01與對照組比較；
** P
<0.01與RANKL組比較.
第二十四圖 KMUP-1影響RANKL誘發基質金屬蛋白酵素-9(MMP-9)之活性
## P
<0.01與對照組比較；
** P
<0.01與RANKL組比較
第二十五圖 KMUP-1影響RANKL刺激HMGB1之遷移
(A) 各時段RANKL 10 ng/ml誘發高遷移族蛋白B1之產量
(B) RANKL 10 ng/ml+KMUP-1(μM)誘發一天之產量
第二十六圖 KMUP-1影響RANKL刺激培養液之HMGB1產量
(A) 各時段RANKL 10 ng/ml誘發高遷移族蛋白B1之產量
(B) RANKL 10 ng/ml+KMUP-1(μM)誘發一天之產量
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較.
第二十七圖 KMUP-1影響RANKL刺激細胞質之HMGB1產量
(A) 各時段RANKL 10 ng/ml誘發高遷移族蛋白B1之產量
(B) RANKL 10 ng/ml+KMUP-1(μM)誘發一天之產量
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較.
第二十八圖 KMUP-1影響RANKL刺激細胞核之HMGB1產量
(A) 各時段RANKL 10 ng/ml誘發高遷移族蛋白B1之產量
(B) RANKL 10 ng/ml+KMUP-1(μM)誘發一天之產量
## P
<0.01與對照組比較；
* P
<0.05,** P
<0.01與RANKL組比較
第二十九圖 KMUP-1影響mRNA基因之表現
1.腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)6
2.耐酒石酸之酸性磷酸酵素(TRAP)
3. c-Fos基因蛋白
4.活化T细胞核因子(NFATc1)
5.基質金屬蛋白酵素-9(MMP-9)
6. 原癌基因(Fra-1)
7. Fra-2基因
8. c-Src基因
9. 蛋白酶K(Cathepsin K)
10. 甘油醛3-磷酸去氫酶(GAPDH)
a P
<0.05與對照組比較,
b P
<0.05與RANKL組比較
第三十圖 KMUP-1影響腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)6蛋白質之表現
## P
<0.01與對照組比較
第三十一圖 KMUP-1影響碘乙酸鈉誘發大鼠之膝關節炎(膝關節外觀圖)
a. 佯作組(Sham)
b. 碘乙酸鈉4 mg/25 μl食鹽水溶液
c. 碘乙酸鈉+KMUP-1 1 mg/kg
d. 碘乙酸鈉+KMUP-1 2.5 mg/kg
e. 碘乙酸鈉+KMUP-1 5 mg/kg
第三十二圖蘇木紫和伊紅(H&E)切片染色(放大×100)
a. 佯作組(Sham)
b. 碘乙酸鈉4 mg/25 μl食鹽水溶液
c. 碘乙酸鈉+KMUP-1 1 mg/kg
d. 碘乙酸鈉+KMUP-1 2.5 mg/kg
e. 碘乙酸鈉+KMUP-1 5 mg/kg
第三十三圖 軟骨組織切片經甲苯胺藍(Toluidine blue)染色圖(放大×100)
a.佯作組(Sham)
b.碘乙酸鈉4 mg/25 μl食鹽水溶液
c.碘乙酸鈉+KMUP-1 1 mg/kg
d.碘乙酸鈉+KMUP-1 2.5 mg/kg
e.碘乙酸鈉+KMUP-1 5 mg/kg
Claims (5)
- 一種KMUP類組合物之用途，其係用於製備治療骨質疏鬆症之藥劑，該組合物包含藥學上可接受之載體；以及一有效量之7-[2-[4-(2-氯苯基)哌嗪]-1-基]-乙基-茶鹼(7-[2-[4-(2-Chlorophenyl)piperazin-1-yl]ethyl]theophylline)化合物。
- 一種KMUP類組合物之用途，其係用於製備治療膝關節軟骨損傷之藥劑，該組合物包含藥學上可接受之載體；以及一有效量之7-[2-[4-(2-氯苯基)哌嗪]-1-基]-乙基-茶鹼(7-[2-[4-(2-Chlorophenyl)piperazin-1-yl]ethyl]theophylline)化合物。
- 一種KMUP類組合物之用途，其係用於製備抑制類蝕骨細胞增生及分化之藥劑，該組合物包含藥學上可接受之載體；以及一有效量之7-[2-[4-(2-氯苯基)哌嗪]-1-基]-乙基-茶鹼(7-[2-[4-(2-Chlorophenyl)piperazin-1-yl]ethyl]theophylline)化合物。
- 一種KMUP類組合物之用途，其係用於製備治療發炎性關節疾患之藥劑，該組合物包含藥學上可接受之載體；以及一有效量之7-[2-[4-(2-氯苯基)哌嗪]-1-基]-乙基-茶鹼(7-[2-[4-(2-Chlorophenyl)piperazin-1-yl]ethyl]theophylline)化合物。
- 一種KMUP類組合物之用途，其係用於製備預防及治療骨質流失疾患之藥劑，該組合物包含藥學上可接受之載體；以及一有效量之7-[2-[4-(2-氯苯基)哌嗪]-1-基]-乙基-茶鹼(7-[2-[4-(2-Chlorophenyl)piperazin-1-yl]ethyl]theophylline)化合物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW100101526A TWI399205B (zh) | 2011-01-14 | 2011-01-14 | 茶鹼化合物之抑制骨質疏鬆症活性 |
| US13/179,111 US8507506B2 (en) | 2011-01-14 | 2011-07-08 | Theophylline derivative inhibits osteoporosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW100101526A TWI399205B (zh) | 2011-01-14 | 2011-01-14 | 茶鹼化合物之抑制骨質疏鬆症活性 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201228663A TW201228663A (en) | 2012-07-16 |
| TWI399205B true TWI399205B (zh) | 2013-06-21 |
Family
ID=46491231
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW100101526A TWI399205B (zh) | 2011-01-14 | 2011-01-14 | 茶鹼化合物之抑制骨質疏鬆症活性 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8507506B2 (zh) |
| TW (1) | TWI399205B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN119818501A (zh) * | 2025-01-14 | 2025-04-15 | 北京大学口腔医学院 | 西地那非的新用途 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW200848044A (en) * | 2007-06-15 | 2008-12-16 | Univ Kaohsiung Medical | KMUP-1 capable of treating hypertension |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW200400034A (en) * | 2002-05-20 | 2004-01-01 | Bristol Myers Squibb Co | Pyrazolo-pyrimidine aniline compounds useful as kinase inhibitors |
-
2011
- 2011-01-14 TW TW100101526A patent/TWI399205B/zh not_active IP Right Cessation
- 2011-07-08 US US13/179,111 patent/US8507506B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW200848044A (en) * | 2007-06-15 | 2008-12-16 | Univ Kaohsiung Medical | KMUP-1 capable of treating hypertension |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201228663A (en) | 2012-07-16 |
| US8507506B2 (en) | 2013-08-13 |
| US20120184570A1 (en) | 2012-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Okamoto et al. | Inhibition of NF-B signaling by fenofibrate, a peroxisome proliferator-activated receptor-ligand, presents a therapeutic strategy for rheumatoid arthritis | |
| Han et al. | Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by sauchinone | |
| Kim et al. | Baicalein inhibits osteoclast differentiation and induces mature osteoclast apoptosis | |
| Xia et al. | Jiawei Yanghe decoction ameliorates cartilage degradation in vitro and vivo via Wnt/β-catenin signaling pathway | |
| KR20150079745A (ko) | Pde4 억제제 및 pi3 델타 또는 이중 pi3 델타-감마 키나아제 억제제를 함유하는 약제학적 조성물 | |
| CN1215333A (zh) | 四氢－β－咔啉衍生物作为抗转移瘤剂的用途 | |
| US20160263131A1 (en) | Treatment of hepatic fibrosis using an inhibitor of cbp/catenin | |
| Diao et al. | Potential therapeutic activity of berberine in thyroid-associated ophthalmopathy: inhibitory effects on tissue remodeling in orbital fibroblasts | |
| Saliba et al. | Transient receptor potential canonical 3 and nuclear factor of activated T cells C3 signaling pathway critically regulates myocardial fibrosis | |
| Cheon et al. | Niclosamide suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis and prevents LPS-induced bone loss | |
| CN117017989B (zh) | 吲哚喹啉酮类化合物在制备预防或/和治疗肺纤维化和肺损伤疾病药物中的应用 | |
| TWI399205B (zh) | 茶鹼化合物之抑制骨質疏鬆症活性 | |
| CN108785677A (zh) | PDE9A抑制剂在制备提升Treg含量的制品、防治炎性肠病的药物及保健品中的应用 | |
| JP2008545696A (ja) | 肥満の処置のためのｐ３８ｍａｒｋの阻害 | |
| CN113491685B (zh) | 一种抑制巨噬细胞活化的组合物及其在制备抗炎制品中的应用 | |
| KR102113099B1 (ko) | 택란 추출물을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물 | |
| CN109152767A (zh) | 用血栓烷-a2受体拮抗剂治疗肌营养不良的组合物和方法 | |
| CN106994145B (zh) | 用于治疗或减缓自体免疫疾病、其并发症和/或肾炎的医药组合物以及其有效成分之用途 | |
| CN112716940A (zh) | 卡格列净在制备治疗与stat6蛋白相关疾病的药物中的应用 | |
| KR20250037531A (ko) | 자가면역 질병의 치료약을 제조하기 위한 나프토퀸 포스페이트의 사용 | |
| CN104902902A (zh) | 使用cbp/连环蛋白的抑制剂治疗硬皮病 | |
| CN115381818A (zh) | 一种促进细胞自噬降解功能的方法及应用 | |
| CN113521062A (zh) | 秦皮素治疗骨关节炎的应用 | |
| JP7696462B2 (ja) | 老化及び老化関連疾患の予防及び治療における［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ｂ］ピリダジン誘導体の使用 | |
| CN111419846A (zh) | 罗通定在制备治疗脂肪肝的药物中的用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees |