TWI390035B - 對人類ｉｌ-６具專一性之抗體分子 - Google Patents

Description

對人類IL-6具專一性之抗體分子

本發明係關於對IL－6之抗原決定位(antigenic determinant)具專一性之抗體分子。本發明亦係關於此抗體分子之治療用途及生產此抗體分子之方法。

IL－6為由各種細胞型式所生產之基因多顯性(pleiotropic)多功能胞激素(cytokine)。原本其被界定為誘導B細胞最終成熟為抗體生產細胞之B細胞分化因子(BSF－2)(Hirano et al.,1986 Nature 324,73－76)。IL－6已顯示於免疫調節、炎症反應、造血及致癌上扮演中樞角色。於免疫系統中，IL－6誘導B細胞抗體生產增加量之多株免疫球蛋白。其亦誘導T細胞上的介白素－2(IL－2)表現(Nomo et al.,1987,Immunol.letters,15,3,249－253)及促進經活化T細胞中IL－2生產因而誘導細胞毒性T細胞之生長及分化(Okada et al.,1988 J Immunol,141,5,1543－1549)。IL－6亦已知會決定單核球分化成巨唑細胞(Chomarat P et al.,2000 Nature Immunol.,6,510－514)。

IL－6之功能並未限於免疫反應，因其作用於造血、血小板生成、破骨細胞形成、肝急性期反應之激發造成C－反應性蛋白質(CRP)及血清類澱粉A(SAA)蛋白質之提升。已知其為一種上皮角質細胞(keratinocyte)、腎小球間細胞(renal mesangial cell)、骨髓瘤及漿細胞瘤(plasmacytoma)細胞之生長因子(Grossman et al.,1989 Prot Natl Acad Sci.,86,(16)6367－6371；Horii et al.,1989,J Immunol,143,12,3949－3955；Kawano et al.,1988,Nature 332,6159,83－85)。IL－6由廣泛範圍之細胞型式所生產，包括單核球/巨噬細胞、纖維母細胞、表皮角質細胞、血管內膜細胞、腎小球間細胞、神經膠質細胞、軟骨細胞、T及B細胞、及一些腫瘤細胞(Akira et al.,1990,FASEB J.,4,11,2860－2867)。除了本質上生產IL－6之腫瘤外，正常細胞不會表現IL－6，除非受特定刺激。

IL－6為一種糖蛋白，依據後轉譯修飾而具有分子量為21至28 kD之184個胺基酸分子。於一些細胞型式中發現替換的拼接變異體(splice variant)(Kishimoto et al.,1995,Blood,86,4,1243－1254)。IL－6受體(IL－6R)複合物包含兩種功能上不同的膜蛋白，80kD IL－6專一性結合鏈(gp80)及130kD訊號傳導鏈(gp130)。儘管IL－6不能直接結合gp130，其可結合至IL－6R以產生IL－6/IL－6R/gp130之高親和性三元複合物。IL－6R以低親和性結合IL－6，然而，IL－6R不具有細胞內訊號傳導功能域(intracellular signal transduction domain)因而此單獨結合不會導致細胞活化。相似地，IL－6R之細胞表面表現並非意指此細胞對IL－6刺激為反應性的。蛋白質分解性裂解導致可溶性IL－6R之釋放(sIL－6R；sgp80)其可結合循環IL－6並增加IL－6半生期。於細胞活化上，IL－6首先結合至細胞結合的IL－6R或sIL－6R任一者；然後異二聚體性IL－6/IL－6R複合物與細胞表面糖蛋白gp130聯合，生成的三聯合異複合物(tripartite heterocomplex)結合另一IL－6/IL－6R/gp130且跟著發生訊號傳導(Bravo and Heath 2000,EMBO J.,19,(11),2399－2411；Boulanger et al.,2003,Science,300,5628,2101－2104)，因此，細胞結合的且可溶性的IL－6R有助於細胞活化。IL－6訊號通過細胞結合的IL－6R已被稱為cis訊號傳遞，於透過可溶性IL－6R之細胞活化已被描述為trans訊號傳遞。表現gp130但不表現IL－6R之細胞可透過sIL－6R經IL－6刺激。

抗人類IL－6之中和鼠科動物抗體已知能夠干擾人類IL－6對IL－6R(第1位)或gp130(第2及3位)之結合(Kalai et al.,1997,Eur.J.Biochem.249,690－700；Brakenhoff et al.,1990,Journal of Immunology,145,561－568；Wendling et al.,1993,Journal of Rheumatology,29,259－262)。

US專利案5,856,135揭示抗人類IL－6之經改造人類抗體，其會阻斷IL－6結合至IL－6R。此等抗體衍生自小鼠單株抗體SK2，其中來自小鼠抗體SK2可變區之互補決定區(CDR’s)被移植至人類抗體可變區。

亦已知者為對IL－6之中和人類自主抗體(Hansen et al,Eur.J.Immunol,1995,25,348－354)。

WO2004039826中描述I位置螯合性大鼠/人類抗IL－6抗體於治療之用途。

人化抗人類IL－6受體單株抗體於第III期臨床試驗中用於治療類風濕關節炎(Kishimoto,2005,Annu Rev Immunol.23：1－21)。其已被報告相同抗體於克隆氏病(Crohn’s disease)第II期研究中為有效的。以抗IL－6及抗IL－6R抗體兩者亦已證實於NZB/W F₁ 小鼠中類狼瘡病之功效(Fink et al.,1994 J.Clin.Invest.94,585；Mihara et al.,1998,Clin.Exp.Immunol.112,397)。對鼠科動物IL－6受體之中和抗體於疾病之過繼轉移(adoptive transfer)模型會壓抑結腸炎(Yamamoto et al.,2000 Journal of Immunology,164,4878；Atreya et al.,2000 Nature Med 6,583)。最近的研究亦証實具抗受體抗體於結腸炎之IL－10剔除小鼠模型及於腸炎症之TNBS模型中的效力。

吾人已鑑定出高親和性中和抗IL－6抗體，其於活體內特別有效，例如，於本文所述活體內模型。

抗體可變功能域的殘基習慣上依據Kabat等人制定的系統編號。此系統陳示於Kabat等人於1987年之Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health and Human Services,NIH,USA(下文稱為“Kabat et al.(supra)”)。本說明書使用此編號系統，除非另有指名。

Kabat殘基設計不總是直接對應胺基酸殘基之直線編號。確實的直線胺基酸序列可含有少於或多於嚴格Kabat編號的胺基酸，對應於鹼性可變功能域結構之縮短、插入、結構性組份、是否有框架或互補決定區(CDR)。殘基之正確Kabat編號可由所給予抗體經與具有“標準“抗體序列同源殘基並排而決定。

重鏈可變區功能域之CDRs位於殘基31－35(CDR－H1)、殘基50－65(CDR－H2)及殘基95－102(CDR－H3)，依據Kabat編號系統。然而，依據Chothia(Chothia,C.and Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901－917(1987))，相等於CDR－H1之圈(loop)由殘基26延伸至殘基32。如此，如本文使用之‘CDR－H1’，包含殘基26至35，如Kabat編號系統及Chothia之拓譜學圈定義(topological loop definition)之組合而描述者。

輕鏈可變功能域之CDR位於殘基24－34(CDR－L1)、殘基50－56(CDR－L2)及殘基89－97(CDR－L3)，依據Kabat編號系統。

如本文中使用者，‘中和抗體’一詞描述一種能夠中和IL－6之生物訊號傳遞活性之抗體，例如經由阻斷IL－6對gp130受體之位置3結合。

本發明中使用的抗體可使用此項技藝中已知的任何適合方法獲得。可使用IL－6多肽或表現此多肽之細胞以生產專一性辨識IL－6之抗體。IL－6多肽可為‘成熟’多肽或生物學活性片段或其衍生物。較佳IL－6多肽為成熟多肽。IL－6多肽可由此項技藝熟知方法由包含表現系統之基因工程宿主細胞製備或由自然生物來源回收。於本申請案中，“多肽”一詞包括胜肽、多肽及蛋白質。此等詞被交互使用除非另有指名。IL－6多肽於某些情形可為諸如融合蛋白質較大蛋白質之一部份，例如融合至親和性標簽(tag)上。可獲得產生抗IL－6多肽之抗體，於動物免疫上為必要，經由投與多肽至動物，較佳為非人類動物，使用熟知及常規步驟，例如參見Handbook of Experimental Immunology,D.M.Weir(ed.),Vol 4,Blackwell Scientific Publishers,Oxford,England,1986)。許多溫血動物，諸如兔子、小鼠、大鼠、綿羊、牛或豬可被免疫，然而，一般以小鼠、兔子、豬及大鼠為較佳。

本發明中使用之抗體包括整個抗體及功能性活性片段或其衍生物，且可為(但不限於)單株、人化、全部為人類或嵌合抗體。

單株抗體可以任何此項技藝已知方法製備，諸如融合瘤技術(Kohler & Milstein,1975,Nature,256：495－497)，trioma技術，人類B細胞融合瘤技術(Kozbor et al.,1983,Immunology Today,4：72)及EBV－融合瘤技術(Cole et al.,Monoclonal Antibody and Cancer Therapy,pp77－96,Alan R Liss,Inc.,1985)。

亦可使用淋巴細胞抗體法經選殖及表現免疫球蛋白可變區cDNAs(產自單獨選自生產專一性抗體的淋巴細胞)生產本發明中使用的抗體，例如Babcook,J.et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15)：7843－78481；WO92/02551；WO2004/051268及國際專利申請案號WO2004/106377所述方法。

人化抗體(其包括CDR－移植抗體)為來自非人類物種之來自具有一或多個互補決定區(CDRs)的非人類物種抗體分子的與來自人類免疫球蛋白分子之框架區(framework區)(參見，例如US 5,585,089；WO91/09967)。應明瞭其可僅需要轉移CDRs之專一性決定殘基而不需整個CDR(參見例如Kashmiri et al.,2005,Methods,36,25－34)。人化抗體可選擇進一步包含一或多個衍生自非人類物種之框架殘基，其衍生CDRs。

嵌合抗體為彼等經已被基因工程處理的免疫球蛋白基因所編碼的抗體，因而輕鏈及重鏈基因由屬於不同物種的免疫球蛋白基因片段所構成。

本發明中使用的抗體亦可使用此項技藝已知的各種唑菌體表現法來生產且包括由彼等Brinkman等人(J.Immunol.Methods,1995,182：41－5o)、Ames等人(J.Immunol.Metoods,1995,184：177－186)、Kettleborough等人(Eur.J.Imunol.1994,24：952－958)、Persic等人(Gene,1997 187 9－18)、Burton等人(Advances in Im munology,1994,57：191－280)及WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；及US 5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743及5,969,108所揭示者。

完全人類抗體為彼等抗體中重鏈及輕鏈兩者之可變區及不變區(於存有時)為所有人類來源，或實質上與人類來源一致者，未必來自相同抗體。完全人類抗體之例包括例如由上述唑菌體表現法所生產的抗體及經小鼠生產的抗體，其中鼠科動物免疫球蛋白可變及不變部分基因抗體已被其人類相對物置換，例如述於EP0546073 B1、US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,661,016、US 5,770,429、EP 0438474 B1及EP0463151 B1。

於一具體例中，本發明提供一種對人類IL－6具專一性之中和抗體，包含重鏈，其中重鏈之可變功能域包含，於CDR－H1時具有SEQ ID NO：5提供的序列之CDR，於CDR－H2時具有SEQ ID NO：6提供的序列之CDR，於CDR－H3時具有SEQ ID NO：7提供的序列之至少一者。

於另一具體例，本發明提供對人類IL－6具專一性之中和抗體，包含重鏈，其中重鏈可變功能域之CDR－H1、CDR－H2及CDR－H3之至少二者選自下列：於CDR－H1上SEQ ID NO：5提供的序列、於CDR－H2上SEQ ID NO：6提供的序列及於CDR－H3上SEQ ID NO：7提供的序列。例如，抗體可包含重鏈，其中CDR－H1具有SEQ ID NO：5提供的序列及CDR－H2具有SEQ ID NO：6提供的序列。或者，抗體可包含重鏈，其中CDR－H1具有SEQ ID NO：5提供的序列且CDR－H3具有SEQ ID NO：7提供的序列，或此抗體可包含重鏈，其中CDR－H2具有SEQ ID NO：6提供的序列及CDR－H3具有SEQ ID NO：7提供的序列。為避免有疑義，應了解其包括所有前突變(permutations)。

於另一具體例中，本發明提供對人類IL－6具專一性之中和抗體，包含重鏈，其中重鏈之可變功能域包含CDR－H1之SEQ ID NO：5提供的序列、CDR－H2之SEQ ID NO：6提供的序列及CDR－H3之SEQ ID NO：7提供的序列。

於一具體例中，本發明提供對人類IL－6具專一性之中和抗體，包含輕鏈，其中輕鏈之可變功能域包含於CDR－L1之具有SEQ ID NO：8提供的序列之CDR、於CDR－L2之具有SEQ ID NO：9提供的序列之CDR、及於CDR－L3之具有SEQ ID NO：10提供的序列之CDR之至少一者。

於另一具體例中，本發明提供對人類IL－6具專一性之中和抗體，包含輕鏈，其中輕鏈可變功能域之CDR－L1、CDR－L2及CDR－L3之至少二者選自下列：於CDR－L1之SEQ ID NO：8提供的序列、於CDR－L2之SEQ ID NO：9提供的序列及於CDR－L3之SEQ ID NO：10提供的序列。例如，抗體可包含輕鏈，其中CDR－L1具有SEQ ID NO：8提供的序列及CDR－L2具有SEQ ID NO：9提供的序列。或者，抗體可包含輕鏈，其中CDR－L1具有SEQ ID NO：8提供的序列且CDR－L3具有SEQ ID NO：10提供的序列，或抗體可包含輕鏈，其中CDR－L2具有SEQ ID NO：9提供的序列且CDR－L3具有SEQ ID NO：10提供的序列。為避免有疑義，應了解其包括所有前突變。

於另一具體例中，本發明提供對人類IL－6具專一性之中和抗體，包含輕鏈，其中可變功能域包含CDR－L1之SEQ ID NO：8提供的序列、CDR－L2之SEQ ID NO：9提供的序列、及CDR－L3之SEQ ID NO：10提供的序列。

應了解對本發明提供之CDRs可進行一或多個胺基酸置換、添加及/或刪除而不顯著改變抗體結合IL－6及中和IL－6活性之能力。任何胺基酸置換、加入及/或刪除之效果可輕易被熟習此項技藝者試驗，例如，經使用實施例所述方法以決定IL－6結合及中和。因此，於一實施例中本發明提供一種具有專一性對人類IL－6之抗體，包含一或多個CDRs選自CDRH－1(SEQ ID NO：5)、CDRH－2(SEQ ID NO：6)、CDRH－3(SEQ ID NO：7)、CDRL－1(SEQ ID NO：8)、CDRL－2(SEQ ID NO：9)、及CDRL－3(SEQ ID NO：10)，其中於一或多個CDR之一或多個胺基酸已被另一胺基酸置換。

本發明之抗體分子較佳包含各別互補輕鏈或互補重鏈。

因此於一具體例中，依據本發明之抗體包含重鏈，其中重鏈之可變功能域包含CDR－H1之SEQ ID NO：5提供的序列、CDR－H2之SEQ ID NO：6提供的序列、及CDR－H3之SEQ ID NO：7提供的序列，及輕鏈，其中輕鏈之可變功能域包含CDR－L1之SEQ ID NO：8提供的序列、CDR－L2之SEQ ID NO：9提供的序列、及CDR－L3之SEQ ID NO：10提供的序列。

於一實施例中，本發明提供一種具有專一性對人類IL－6之抗體，包含重鏈，其中重鏈之可變功能域包含CDR－H1之SEQ ID NO：5提供的序列、CDRH－2之SEQ ID NO：6提供的序列及CDRH－3之SEQ ID NO：7提供的序列，及輕鏈，其中輕鏈可變功能域包含CDR－L1之SEQ ID NO：8提供的序列、CDR－L2之SEQ ID NO：9提供的序列、及CDR－L3之SEQ ID NO：10提供的序列，其中一或多個CDRs中一或多個胺基酸已被另一胺基酸置換。

於一具體例中，本發明之抗體包含重鏈，其中重鏈之可變功能域包含SEQ ID NO：2提供的序列。

於另一具體例中，本發明之抗體包含重鏈，其中重鏈之可變功能域包含具有與SEQ ID NO：2提供的序列至少60%相同性或相似性之序列。於一具體例中，本發明之抗體包含重鏈，其中重鏈之可變功能域包含具有與SEQ ID NO：2提供的序列至少70%、80%、90%、95%或98%相同性或相似性之序列。

本文使用之"相同性"係指於並排序列中任何特定位置，序列間之胺基酸殘基為相同的。本文使用之"相似性"係指於並排序列中任何特定位置，序列間之胺基酸殘基為相似型式，例如，白胺酸可被置換為異白胺酸或纈胺酸。其它胺基酸中可經常被置換為另一者者包括(但未限於)：－苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸(具有芳族側鏈之胺基酸)；－離胺酸、精胺酸及組胺酸(具有鹼基側鏈之胺基酸)；－天冬胺酸及麩胺酸(具有酸性側鏈之胺基酸)；－天冬醯胺及麩醯胺酸(具有醯胺側鏈之胺基酸)；及－半胱胺酸及甲硫胺酸(具有含硫側鏈之胺基酸)。相同性及相似性之程度可容易地算出(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991)。

於一具體例中，本發明之抗體包含輕鏈，其中輕鏈之可變功能域包含SEQ ID NO：4提供的序列。

於另一具體例中，本發明之抗體包含輕鏈，其中輕鏈之可變功能域包含具有與SEQ ID NO：4提供的序列至少60%相同性或相似性。於一具體例中，本發明之抗體包含輕鏈，其中輕鏈之可變功能域包含與SEQ ID NO：4提供的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%相同性或相似性。

於一具體例中，本發明之抗體包含重鏈，其中重鏈之可變功能域包含SEQ ID NO：2提供的序列，及輕鏈，其中輕鏈之可變功能域包含SEQ ID NO：4提供的序列。

於本發明另一具體例中，抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈之可變功能域包含與SEQ ID NO：2提供的序列具有至少60%相同性或相似性及輕鏈之可變功能域包含與SEQ ID NO：4提供的序列具有至少60%相同性或相似性。較佳地，抗體包含重鏈，其中輕鏈之可變功能域包含與SEQ ID NO：2提供的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%相同性或相似性，及輕鏈，其中輕鏈之可變功能域包含與SEQ ID NO：4提供的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%相同性或相似性。

於一具體例中，本發明之抗體為大鼠(rat)抗體，其中重鏈之可變功能域包含SEQ ID NO：2提供的序列，及輕鏈之可變功能域包含SEQ ID NO：4提供的序列。此處之大鼠抗體係指稱為‘132E09’或“供給者”抗體。大鼠抗體132E09之重鏈可變功能域的完整核苷酸及胺基酸序列分別被提供於SEQ ID NOS：1及2。大鼠抗體132E09之輕鏈可變功能域的完整核苷酸及胺基酸序列分別被提供於SEQ ID NOS：3及4。SEQ ID NOS：5、6、7、8、9及10提供的CDRs衍生自大鼠抗體132E09。

於一具體例中，本發明之抗體為CDR－經移植抗體。如本文之使用，‘CDR－經移植抗體’一詞係指一種抗體，其中重鏈及/或輕鏈含有衍生自供給者抗體(例如，大鼠抗體)之一或多個CDRs(包括，若所欲時，一或多個經修飾CDRs)經移植至接受者抗體(例如，人類抗體)之重鏈及/或輕鏈可變區框架。為檢閱可參見Vaughan et al,Nature Biotechnology,16 ,535－539,1998。較佳地，一或多個CDRs已獲自大鼠抗體132E09(SEQ ID NOS：5、6、7、8、9及10)。於一具體例中，非整個CDR被移植，而僅一或多個專一性決定殘基由本文上列所述CDRs任一者被轉移至人類抗體框架(參見例如，Kashmiri et al.,2005,Methods,36,25－34)。於一具體例中，僅專一性決定殘基由本文上列所述一或多個CDRs轉移至人類抗體框架。於另一具體例中，僅專一性決定殘基由本文上列所述每一CDRs轉移至人類抗體框架。

當CDRs或專一性決定殘基被移植，可使用任何適當接受者可變區框架序列，具有對於由衍生CDRs的供給者抗體之群/型為適當者，包括大鼠、小鼠、靈長目動物及人類框架區。較佳地，本發明之CDR－經移植抗體具有至少一個包含人類接受者框架區的可變功能域以及一或多個衍生自供給者抗體之CDRs，如上所述。如此，所提供者為一種中和CDR－經移植抗體，其中可變功能域包含人類接受者框架區域及非人類供給者CDRs，較佳為大鼠。

可用於本發明之人類框架之例為KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY及POM(Kabat et al.,supra)，例如，KOL及NEWM可用於重鏈，REI可用於輕鏈且EU、LAY及POM可用於重鏈及輕鏈兩者。或者，可使用人類生殖種系序列：此等序列可取自：http：//vbase.mrc－cpe.cam.ac.uk/。

於本發明CDR－經移植抗體，接受者重鏈及輕鏈不必然需衍生自相同抗體，且若需要可包含具有衍生自不同鏈的框架區之複合鏈。

本發明CDR－經移植抗體重鏈之較佳框架區衍生自人類亞群VH3序列1－4 3－72與JH4(如第2圖所示；SEQ ID NOS：19及20)。因此，所提供者為一種中和CDR－經移植抗體，其包含至少一種非人類供給者CDR，其中重鏈框架區衍生自人類亞群序列1－4 3－72與JH4。人類JH4序列如下：(YFDY)WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：20)。YFDY模體為CDR－H3之一部份且不為框架4之一部分(Ravetch,JV.et al.,1981,Cell,27,583－591)。供給者序列為示於第2圖中132E09 VH序列(SEQ ID NO：2)且供給者CDRs(SEQ ID NOs：5、6及7)被畫底線。

本發明CDR－經移植抗體輕鏈之較佳框架區衍生自第2圖所示人類生殖種系亞群VK1序列2－1－(1)O12與JK2(SEQ ID NO：21及22)。因此，所提供者為中和CDR－經移植抗體，其包含至少一非人類供給者CDR，其中輕鏈框架區衍生自人類亞群序列VK1 2－1－(1)O12與JK2。JK2序列如下：(YT)FGQGTKLEIKR(SEQ ID NO：22)。YT模體為CDR－L3之一部份且不為框架4之一部份(Hieter,PA.,et al.,1982,J.Biol.Chem.,257,1516－1522)。供給者序列為第2圖所示132E09 VL序列(SEQ ID NO：4)且於供給者CDRs(SEQ ID NOs 8、9及10)劃底線。

又，於本發明CDR－經移植抗體中，框架區不必具有完全相同於彼等接受者抗體之序列。例如，通常殘基可被改變為接受者鏈群或型之更頻繁的出現的殘基。或者，於接受者框架區選擇的殘基可被改變因而其對應於供給者抗體相同位置上發現的殘基(參閱Reichmann et al.,1998,Nature,332,323－324)。此等變化應保持於最小需要以恢復供給者抗體之親和性。選擇接受者框架區中需被改變的殘基之步驟陳列於WO 91/09967。

較佳地，於本發明CDR－經移植抗體分子中，若接受者重鏈具有人類VH3序列1－4 3－72與JH4，則此重鏈之接受者框架區包含，除了一或多個供給者CDRs之外，於至少位置49亦包含供給者殘基(依據Kabat et al.,(supra))。因此，所提供者為CDR－經移植抗體，其中重鏈之可變功能域中至少於位置49殘基為供給者殘基。

較佳地，如本發明之於CDR－經移植抗體分子，若接受者輕鏈具有人類亞群VK1序列2－1－(1)O12與JK2，則於輕鏈接受者框架區上未使用供給者殘基且僅轉移一或多個供給者CDRs。

供給者殘基為來自供給者抗體之殘基，即，來自CDRs原本衍生的抗體，其於本發明之情形為大鼠抗體132E09。

因此，本發明提供一種抗體，其中重鏈可變區包含gH13之序列(第2圖；SEQ ID NO：11)。

於本發明一具體例中，抗體包含重鏈，其中重鏈之可變功能域包含與SEQ ID NO：11提供的序列具有至少60%相同性或相似性之序列。較佳地，此抗體包含重鏈，其中重鏈之可變功能域包含具有與SEQ ID NO：11提供的序列至少70%、80%、90%、95%或98%相同性或相似性之序列。

此外，本發明提供一種抗體，其中輕鏈可變區包含gL10之序列(第2圖；SEQ ID NO：13)。

於本發明一具體例中，抗體包含輕鏈，其中輕鏈之可變功能域包含與SEQ ID NO：13提供的序列具有至少60%相同性或相似性之序列。較佳地，抗體包含輕鏈，其中輕鏈之可變功能域包含與SEQ ID NO：13提供的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%相同性或相似性之序列。

較佳地，依據本發明之CDR－經移植抗體包含重鏈其包含gH13之序列(SEQ ID NO：11)，及輕鏈，其包含gL10之序列(SEQ ID NO：13)。

於本發明一具體例中，抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈之可變功能域包含與SEQ ID NO：11提供的序列具有至少60%相同性或相似性之序列且輕鏈之可變功能域包含與SEQ ID NO：13提供的序列具有至少60%相同性或相似性之序列。較佳地，此抗體包含重鏈，其中輕鏈之可變功能域包含與SEQ ID NO：11提供的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%相同性或相似性之序列，及輕鏈，其中輕鏈之可變功能域包含與SEQ ID NO：13提供的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%相同性或相似性之序列。

本發明之抗體分子可包含具有全長重鏈及輕鏈之完全抗體分子或其片斷，且可為(但不限於)任何上述之Fab、經修飾Fab、Fab’、F(ab’)₂ 、Fv、單功能域抗體、scFv、二、三或四－價抗體、Bis－scFv、二聯體(diabodies)、三聯體(triabodies)、四聯體(tetrabodies)、及抗原決定位(抗原決定位)－結合片段(參見例如，Holliger and Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126－1136；Adair and Lawson,2005,Drug Design Reviews－Online 2(3),209－217)。創造及製造此等抗體片段之方法為此項技藝中廣為人知(參見例如，Verma et al.,1998,Journal of Immunological Methods,216,165－181)。本發明中使用之其它抗體片段包括Fab及Fab’片段述於國際專利申請案WO2005/003169、WO2005/003170及WO2005/003171。多價抗體可包含多個專一性或可為單專一性(參見例如WO92/22853及WO05/113605)。

本發明抗體分子之不變區功能域，若存在時，可選擇具有關於所提議的功能之抗體分子，尤其，可要求效應劑(effector)功能，例如，不變區功能域可為人類IgA、IgD、IgE、IgG或IgM功能域。尤其，可使用人類IgG不變區功能域，尤其IgG1及IgG3異型，當抗體分子被意圖用於治療用途且要求抗體效應劑功能時。或者，可使用IgG2及IgG4異型，當抗體分子被意圖用於治療用途且不要求抗體效應劑功能時，例如，僅阻斷IL－6活性。應明瞭亦可使用此等不變區功能域之序列變異體，例如IgG分子，其中可使用位置241上的絲胺酸已被改變為脯胺酸者，如Angal et al.,Molecular Immunology,1993,30(1),105－108所述。特佳者為包含此改變的IgG4不變功能域。熟習此項技藝者亦應了解抗體可歷經各種後轉譯修飾。此等修飾之型式及範圍經常視使用於表現此抗體的宿主細胞株以及培養條件而定，此等修飾可包括於糖基化作用、甲硫胺酸氧化作用、二酮哌形成作用、天冬胺酸異構化作用及天冬醯胺酸去醯胺化作用上的變異。經常修飾為羧基端鹼性殘基之喪失(諸如離胺酸或精胺酸)，由於羧基胜肽酶之作用(如Harris,RJ.Journal of Chromatography 705：129－134,1995所述)。因此，SEQ ID NO：16抗體重鏈之C－端離胺酸可能不存在。

於一較佳具體例中，本發明提供之抗體為一種對人類IL－6具專一性之中和抗體，其中重鏈不變區包含人類IgG4不變區(其中位置241之絲胺酸已經被脯胺酸置換，如Angal et al.,supra所述)。因此，本發明提供一種抗體，其中重鏈包含或由SEQ ID NO：16提供的序列所構成。較佳之輕鏈不變區為cKappa。

於一具體例中，本發明提供一種抗體，其中重鏈包含或由SEQ ID NO：16提供的序列所構成且輕鏈包含或由SEQ ID NO：18提供的序列所構成。

於本發明之一具體例中，抗體包含重鏈，其中重鏈包含與SEQ ID NO：16提供的序列具有至少60%相同性或相似性之序列。較佳地，此抗體包含重鏈，其中重鏈包含與SEQ ID NO：16提供的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%相同性或相似性之序列。

於本發明一具體例中，此抗體包含輕鏈，其中輕鏈包含與SEQ ID NO：18提供的序列具有至少60%相同性或相似性之序列。較佳地，此抗體包含輕鏈，其中輕鏈包含與SEQ ID NO：18提供的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%相同性或相似性之序列。

於本發明一具體例中，此抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含與SEQ ID NO：16提供的序列具有至少60%相同性或相似性之序列，輕鏈包含與SEQ ID NO：18提供的序列具有至少60%相同性或相似性之序列。較佳地，此抗體包含重鏈，其中重鏈包含與SEQ ID NO：16提供的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%相同性或相似性之序列，及輕鏈，其中輕鏈包含與SEQ ID NO：18提供的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%相同性或相似性之序列。

本發明亦提供者為一種人類IL－6之專一性區或抗原決定位，其經如本發明之抗體結合，特別是一種抗體，包含CDR－H1(SEQ ID NO：5)、CDR－H2(SEQ ID NO：6)、CDR－H3(SEQ ID NO：7)、CDR－L1(SEQ ID NO：8)、CDR－L2(SEQ ID NO：9)或CDR－L3(SEQ ID NO：10)任一者，例如，抗體132E09，或一種抗體，包含重鏈可變區序列gH13(SEQ ID NO：11)及/或輕鏈可變區序列gL10(SEQ ID NO：13)。

人類IL－6多肽的專一性區或抗原決定位可以任何此項技藝已知適合的抗原決定位作圖法合併任何一種本發明提供的抗體來鑑定。此等方法之例包括篩選結合本發明抗體之衍生自IL－6不同長度之胜肽，具可專一性結合此抗體之最小片段，含此抗體辨識的抗原決定位之序列。IL－6胜肽可經合成製造或經IL－6多肽之蛋白質消化而製造。結合此抗體之胜肽可被鑑定，例如以質譜分析。於另一例中，可使用NMR光譜以鑑定本發明抗體結合之抗原決定位，如本文實施例中所述。一旦被鑑定，可使用本發明抗體結合的抗原決定位片段，視需要，作為免疫原以獲得額外中和抗體，其結合相同抗原決定位。

於一例中，經本發明抗體結合的人類IL－6之抗原決定位包含人類IL－6之至少胺基酸殘基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159及S169(殘基編號依據Boulanger et al.,Science,300,2101－2104)。於一例中，經本發明抗體結合的人類IL－6抗原決定位包含胺基酸殘基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159及S169，及一或多個選自C44、S53、A58、V96、Q152、Q154、N155、W157、T163、L165、及E172的殘基。

於一例中，經本發明抗體結合的人類IL－6抗原決定位包含胺基酸殘基C44、S47、C50、S53、A58、E93、V96、R104、F105、E106、T149、K150、Q152、A153、Q154、N155、Q156、W157、Q159、T163、L165、S169及E172。

於一具體例中，本發明提供對人類IL－6具專一性之中和抗體，其結合成熟人類IL－6的抗原決定位，包含胺基酸殘基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159及S169。

於一具體例中，本發明提供對人類IL－6具專一性之中和抗體，其結合成熟人類IL－6的抗原決定位，包含胺基酸殘基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159及S169，及一或多個選自C44、S53、A58、V96、Q152、Q154、N155、W157、T163、L165、及E172的殘基。

於一具體例中，本發明提供對人類IL－6具專一性之中和抗體，其結合成熟人類IL－6的抗原決定位，包含胺基酸殘基C44、S47、C50、S53、A58、E93、V96、R104、F105、E106、T149、K150、Q152、A153、Q154、N155、Q156、W157、Q159、T163、L165、S169及E172。

應了解上列命名殘基亦可基於IL－6之未經處理先驅物之胺基酸編號來編號(Swiss Prot Accession number P05231)，使用此編號，依據Boulanger et al.,supra之上列殘基編號C44、S47、C50、S53、A58、E93、V96、R104、F105、E106、T149、K150、Q152、A153、Q154、N155、Q156、W157、Q159、T163、L165、S169及E172分別變為C72、S75、C78、S81、A86、E121、V124、R132、F133、E134、T177、K178、Q180、A181、Q182、N183、Q184、W185、Q187、T191、L193、S197及E200。

本發明抗體較佳會阻斷gp130受體結合至人類IL－6的位置3。

交叉阻斷本發明抗體對IL－6之結合的抗體可相似地有用於中和IL－6活性。因此，本發明亦提供一種對人類IL－6具專一性之中和抗體，其交叉阻斷上述任一種抗體對人類IL－6之結合及/或以彼等抗體任一種由結合IL－6而被交叉阻斷。於一具體例中，如此抗體結合相同於本文上述抗體之抗原決定位。於另一具體例中，此交叉阻斷中和抗體結合至與本文上述抗體結合的抗原決定位鄰接及/或與重疊之抗原決定位。於另一具體例中，本發明之此態樣之交叉阻斷中和抗體不會結合如本發明抗體之相同抗原決定位或與該抗原決定位鄰接及/或重疊的抗原決定位。

交叉阻斷抗體可使用此項技藝中任何適合的方法鑑定，例如經使用競爭ELISA或BIAcore，此處交叉阻斷抗體至人類IL－6之結合會防止本發明抗體之結合，反之亦然。

於一具體例中，其提供者為一種對人類IL－6具專一性之中和抗體，其交叉阻斷抗體132E09或重鏈包含序列gH13(SEQ ID NO：11)的抗體或輕鏈包含序列gL10(SEQ ID NO：13)的抗體或包含CDR－H1(SEQ ID NO：5)、CDR－H2(SEQ ID NO：6)、CDR－H3(SEQ ID NO：7)、CDR－L1(SEQ ID NO：8)、CDR－L2(SEQ ID NO：9或CDR－L3(SEQ ID NO：10)任一者之抗體對人類IL－6的結合。於一具體例中，本發明提供之交叉阻斷抗體會抑制132E09或重鏈包含序列gH13(SEQ ID NO：11)的抗體或輕鏈包含序列gL10(SEQ ID NO：13)的抗體或包含CDR－H1(SEQ ID NO：5)、CDR－H2(SEQ ID NO：6)、CDR－H3(SEQ ID NO：7)、CDR－L1(SEQ ID NO：8)、CDR－L2(SEQ ID NO：9)或CDR－L3(SEQ ID NO：10)任一者的抗體對人類IL－6之結合為80%或以上、85%或以上、90%或以上、或95%或以上。

除此之外或者，以本發明抗體任一者結合至人類IL－6可交叉阻斷如本發明此態樣之中和抗體。因此其亦提供一種對人類IL－6具專一性之中和抗體分子，其經由抗體132E09結合人類IL－6會被交叉阻斷，或經由重鏈包含序列gH13(SEQ ID NO：11)的抗體或輕鏈包含序列gL10(SEQ ID NO：13)的抗體或包含CDR－H1(SEQ ID NO：5)、CDR－H2(SEQ ID NO：6)、CDR－H3(SEQ ID NO：7)、CDR－L1(SEQ ID NO：8)、CDR－L2(SEQ ID NO：9)或CDR－L3(SEQ ID NO：10)任一者的抗體被交叉阻斷。於一具體例中，本發明此態樣提供之中和抗體經由132E09結合人類IL－6會被抑制或經由重鏈包含序列gH13(SEQ ID NO：11)的抗體或輕鏈包含序列gL10(SEQ ID NO：13)的抗體或包含CDR－H1(SEQ ID NO：5)、CDR－H2(SEQ ID NO：6)、CDR－H3(SEQ ID NO：7)、CDR－L1(SEQ ID NO：8)、CDR－L2(SEQ ID NO：9)或CDR－L3(SEQ ID NO：10)任一者的抗體會被抑制80%或以上、85%或以上、90%或以上、或95%或以上。

本發明抗體分子較佳具有對人類IL－6之高結合親和性，較佳為微微莫耳(picomolar)。使用此項技藝中任何適合的方法可測量親和性，包括如本文實施例所述BIAcore。較佳使用重組人類IL－6測量親和性，如本文實施例所述。如本發明之抗體分子較佳具有對人類IL－6結合親和性少於500pM。如本發明之抗體分子較佳具有對人類IL－6結合親和性少於50pM。因此，於一具體例中，本發明之抗體分子具有約1至約500pM之間的結合親和性。於一具體例中，本發明之抗體分子具有約1至約50pM之間的結合親和性。本發明之抗體分子較佳具有約1至約20pM之間對人類IL－6之結合親和性。於一具體例中，本發明之抗體具有對人類IL－6結合親和性於8至12pM之間。應明瞭本發明提供的抗體之親和性使用任何本項技藝已知的適合方法可被改變。因此本發明亦係關於本發明之抗體分子之變異體，其具有對人類IL－6之經改善的親和性。以數種親和性突變程序可獲得此等變異體，包括使CDRs突變(Yang et al.,J.Mol.Biol.,254 ,392－403,1995)、鏈混合(chain shuffling)(Marks et al.,Bio/Technology,10 ,779－783,1992)、大腸桿菌(E.coli)突變株之使用(Low et al.,J.Mol.Biol.,250 ,359－368,1996)、DNA混合(shuffling)(Patten et al.,Curr.Opin.Biotechnol.,8 ,724－733,1997)、唑菌體表現(Thompson et al.,J.Mol.Biol.,256 ,77－88,1996)及有性PCR(Crameri et al.,Nature,391 ,288－291,1998)。Vaughan et al.(supra)討論此等親和性突變的方法。

本發明之抗體分子較佳中和IL－6活性，例如於實施例中所述活體外及活體內試驗。於一具體例中，此等抗體結合至人類IL－6位置3(site 3)。

於一具體例中，本發明提供一種對人類IL－6具專一性之中和抗體，其可50%抑制0.038nM人類IL－6之活性，於濃度少於100pM，該抑制活性於T1165細胞增殖誘導的IL－6被測量。於一具體例中，50%抑制IL－6抗體之濃度為少於50pM，更佳為少於20pM。此試驗中使用之人類IL－6較佳為人類重組IL－6。於一具體例中，此中和抗體為人化或完全人類抗體。

於另一具體例中，本發明提供一種對人類IL－6具專一性之中和抗體，其能夠50%抑制3.84nM人類IL－6活性，於少於1nM之濃度下，該抑制活性於HUVECs對人類IL－6及sIL－6R反應之MCP－1生產上被測量。此試驗中使用的人類IL－6較佳為人類重組IL－6。於一具體例中，此中和抗體為人化或完全人類抗體。

如本發明視須要抗體可被偶合於一或多個效應劑分子。應明暸於一具體例中，此效應劑分子可包含單一效應劑分子或二或多個此等分子連結而形成可附著於本發明抗體之單一部份(moiety)。於獲得抗體片段連結至效應劑分子為所欲時，此可經由標準化學或重組DNA步驟製備，其中此抗體片段被直接連結或經由偶合劑連結至效應劑分子。偶合用技術如效應劑分子偶合至抗體為此項技藝廣為人知(參見Hellstrom et al.,Controlled Drug Delivery,2nd Ed.,Robinson et al.,eds.,1987,pp.623－53；Thorpe et al.,1982,Immunol.Rev.,62：119－58及Dubowchik et al.,1999,Pharmacology and Therapeutics,83,67－123)。特別的化學程序包括例如彼等述於WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476及WO03031581.。或者，於效應劑分子為蛋白質或多肽時使用重組DNA步驟此連結可被達成，例如，如WO 86/01533及EP0392745所述。

本文使用之效應劑分子一詞包括例如，抗瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白質，例如酵素，其他抗體或抗體片段、合成或自然發生聚合物、核酸及其片段，例如，DNA、RNA及其片段，放射性核種，特別是放射性碘、放射性同位素、螯合金屬、奈米粒子及報告子群諸如螢光化合物或可經NMR或ESR光譜偵測的化合物。

效應劑分子之例可包括細胞毒素或細胞毒性劑，包括任何對細胞有害(例如，殺死細胞)之藥劑，其例包括康姆伯勒斯亭(combrestatins)、海兔毒素(dolastatins)、埃坡黴素(epothilones)、十字孢素(staurosporine)、馬塔斯諾第(maytansinoids)、兒紅海綿素(spongistatins)、力索新(rhizoxin)、軟海綿素(halichondrins)、漆斑菌素(roridins)、賀米斯塔林(hemiasterlins)、紫杉醇(taxol)、細胞鬆地素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、衣脫普賽得(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、二羥基蒽醌(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、米拉黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、去氫睾酮(1－dehydrotestosterone)、糖皮質類固醇、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、及標呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。

效應劑分子亦包括(但不限於)抗代謝物(例如，美索特沙特(methotrexate)、6－巰嘌呤、6－巰基鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5－氟尿嘧啶(fluorouracil)達卡巴嗪(decarbazine)、烷化劑(例如，氮芥(mechlorethamine)、塞派地(thiotepa)苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡氮芥(carmustine)(BSNU)及洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、絲裂黴素(mitomycin)C、及順式－二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑(cisplatin))、安拉環素(anthracyclines)(例如，柔紅比星(daunorubicin)(以前為柔紅黴素(daunomycin))及多柔比星(doxorubicin))、抗生素(例如，更生黴素(dactinomycin)(之前為放線菌素)、博萊黴素(bleomycin)、光輝黴素(mithramycin)、氨茴黴素(anthramycin)(AMC)、刺孢黴素(calicheamicins)或杜卡黴素(duocarmycins))、及抗有絲分裂劑(例如，長春新鹼及長春鹼)。

其他效應劑分子可包括螯合放射性核諸如^{1 1 1} In及^{9 0} Y、Lu^{1 7 7} 、鉍^{2 1 3} 、鉲^{2 5 2} 、銥^{1 9 2} 及鎢^{1 8 8} /錸^{1 8 8} ；或藥物諸如(但未限於)烷基磷膽鹼類(alkylphosphocholines)、拓譜異構酶I(topoisomerase I)抑制劑、類毒素及蘇拉明(suramin)。其它效應劑分子包括蛋白質、胜肽及酵素。有關的酵素包括(但未限於)蛋白質分解酵素、水解酶、分解酶(lyases)、異構酶、轉移酶。有關係的蛋白質、多肽及胜肽包括(但未限於)免疫球蛋白，毒素諸如雞母珠毒蛋白(abrin)、蓖麻毒素(ricin)A、假單胞菌外毒素、或白喉毒素，蛋白質諸如胰島素、腫瘤壞死因子、α－干擾素、β－干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子或組織胞漿素原(plasminogen)活化劑、血栓形成劑或抗血管生成劑，例如，血管生成抑制素(angiostatin)或血管內皮抑素(endostatin)，或生物反應修飾劑，諸如淋巴激素(lymphokine)、介白素－1(IL－1)、介白素－2(IL－2)、介白素－6(IL－6)、顆粒細胞巨唑細胞群落刺激因子(GM－CSF)、顆粒細胞群落刺激因子(G－CSF)、神經生長因子(NGF)或其他生長因子及免疫球蛋白。

其它效應劑分子可包括例如於診斷上有用的可偵測物質。可偵測物質之例包括各種酵素、輔基(prosthetic groups)、螢光物質、冷光物質、放射活性核、正子發射金屬(用於正子發射X光斷層攝影術(positron emission tomography))、及非放射活性順磁性金屬離子。一般參見U.S.專利案No.4,741,900之可被偶合至作為診斷用途之抗體的金屬離子。適合的酵素包括辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶、β－半乳糖苷酸酶、或乙醯基膽鹼酯酶；適合的輔基包括鏈抗生物素蛋白(streptavidin)、抗生物素蛋白(avidin)及生物素(biotin)；適合的螢光物質包括繖形酮(umbelliferone)、螢光素(fluorescein)、螢光素異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate)、羅丹明(rhodamine)、二氯三胺(dichlorotriazinylamine)螢光素、丹磺醯氯(dansyl chloride)及藻紅蛋白(phycoerythrin)；適合的冷光物質包括魯米洛(luminol)；適合的生物冷光物質包括冷光素酶(luciferase)、冷光素(luciferin)、及水母發光蛋白(aequorin)；及適合的放射性活性核包括^{1 2 5} I、^{1 3 1} I、^{1 1 1} In及^{9 9} Tc。

於另外例中效應劑分子可增加抗體於活體中的半生期，及/或減少抗體的免疫原性及/或增進抗體通過上皮障壁至免疫系統的遞送。此型適合的效應劑分子之例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結合蛋白質或白蛋白結合化合物諸如彼等描述於WO05/117984者(於15.12.05公開)。

於效應劑分子為聚合物時其可為，一般為合成或自然產生的聚合物，例如，可選擇經取代直鏈或分支鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚氧伸烷基聚合物或分支或未分支多醣類，例如，均－或異－多醣。

可存於上述合成聚合物之特別可選擇的取代基包括一或多個羥基、甲基或甲氧基。

合成聚合物之特定例包括可選擇經取代直鏈或分支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是可選擇經取代聚(乙二醇)諸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。

特定自然產生的聚合物包括乳糖、糖澱粉(amylose)、葡萄糖(dextran)、肝糖或其衍生物。

本文使用之“衍生物”一詞意欲包括反應性衍生物，例如硫醇－選擇性基團諸如順丁烯二醯亞胺等。此反應性基團可被直接連結或透過連結物片段連結至聚合物。應明瞭如此基團之殘基於一些情形中會形成產物之一部分作為抗體片段及此聚合物之間的連結基。

此聚合物之大小可視需要而變化，但一般平均分子量範圍為500Da至50000Da，較佳為5000至40000Da且更佳為20000至40000Da。聚合物大小可特別基於產物所欲用途而被選擇，例如，定位某些組織諸如腫瘤之能力或延長循環半生期(參見Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews,54,531－545之評論)。如此，例如，於產物被意圖用於提升循環及穿透組織時，例如，用於治療腫瘤，使用小分子量聚合物為有利的，例如，以約5000Da之分子量。於施予時產物維持於循環中，使用較高分子量聚合物為有利的，例如，具有分子量範圍為20000Da至40000Da。

特別較佳的聚合物包括聚伸烷基聚合物，諸如聚(乙二醇)，或者尤其是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其分子量範圍為約15000Da至約40000Da。

於本發明使用之抗體之一例為被附著於聚(乙二醇)(PEG)基團。於一特別例中此抗體為一種抗體片段且PEG分子可透過任何位於抗體片段中可使用的胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基附著，例如，任何游離胺基、亞胺基、硫醇基、羥基或羧基。如此胺基酸可自然發生於抗體片段，或可以工程學導入片段，使用重組DNA法(參見例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971)。於一例中本發明之抗體分子為經修飾Fab片段，其中此修飾為添加至其重鏈之C－未端中一或多個胺基酸使效應劑分子附著，較佳地，此添加的胺基酸形成經修飾含一或多個半胱胺酸殘基的鉸鏈區使效應劑分子可被附著。可使用多個位置以附著二或多個PEG分子。

PEG分子較佳為透過位於抗體片段中至少一個半胱胺酸殘基之硫醇基共價連結，附著於此經修飾抗體片段之每一聚合物分子可被共價連結至位於抗體片段中半胱胺酸殘基之硫原子，此共價連結一般為雙硫鍵或，尤其是硫－碳鍵。於使用硫醇基作為附著點適當活化效應劑分子，例如硫醇基選擇性衍生物，可使用諸如順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸衍生物。於如上述經聚合物修飾抗體片段中可使用活化聚合物作為起始物質，此活化聚合物可為任何含有硫醇反應基之聚合物，諸如α－鹵羧酸或酯，例如，碘乙醯胺、醯亞胺，例如，順丁烯二醯亞胺，乙烯基碸或二硫化物。此等起始物質可由商業上獲得(例如獲自Nektar，之前為Shearwater Polymers Inc.,Huntsville,AL,USA)或可由商業上可取得之起始物質使用習用化學方法製備。特別的PEG分子包括20K甲氧基－PEG－胺(可獲自Nektar,之前為Shearwater；Rapp Polymere；及SunBio)及M－PEG－SPA(可獲自Nektar,之前為Shearwater)。

於一具體例中，此抗體為經修飾Fab片段或diFab，其經PEG基化，即，具有PEG(聚(乙二醇))共價附著於其上，例如，依據EP 0948544或EP1090037所述方法[亦參見"Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and Biomedical Applications",1992,J.Milton Harris(ed),Plenum Press,New York,"Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications",1997,J.Milton Harris and S.Zalipsky(eds),American Chemical Society, Washington DC and"Bioconjugationprotein Coupling techniques for the Biomedical Sciences",1998,M.Aslam and A.Dent,Grove Publishers,New York；Chapman,A.2002,Advanced Drug Delivery Reviews 2002,54：531－545]。於一例中PEG被附著於鉸鏈區之半胱胺酸。於一例中，經PEG修飾Fab片段具有順丁烯二酶亞胺基共價連結至經修飾鉸鏈區中的單一硫醇基。離胺酸殘基共價連結至順丁烯二醯亞胺基及於離胺酸殘基上每一胺基可被附著具有約20,000 Da分子量之甲氧基聚(乙二醇)聚合物，因此附著於Fab片段的PEG總分子量可約40,000 Da。

於一具體例中，本發明提供一種對人類IL－6具專一性之中和抗體分子，其為一種具有包含SEQ ID NO：11提供的序列之重鏈及包含SEQ ID NO：13提供的序列之輕鏈的經修飾Fab片段且其重鏈C－未端具有經修飾鉸鏈區(含效應劑分子附著之至少一個半胱胺酸殘基)。效應劑分子較佳為PEG且使用(WO98/25971及WO2004072116)所述方法附著因而離胺醯基－順丁烯二醯亞胺被附著於重鏈C－末端上之半胱胺酸殘基，且離胺醯殘基之每一胺基已共價連結至其具有分子量約20,000 Da之甲氧基聚(乙二醇)殘基，因此附著於此抗體之PEG總分子量為約40,000Da。

於另一例中效應劑分子可被附著於抗體片段，使用述於國際專利申請案WO2005/003169、WO2005/003170及WO2005/003171所述方法。

本發明亦提供一種編碼本發明抗體分子之重鏈及/或輕鏈之經單離DNA序列，較佳地，此DNA序列編碼本發明抗體分子之重鏈或輕鏈。本發明之DNA序列可包含合成DNA，例如由化學製程、cDNA、基因體DNA或其任何組合製造。

編碼本發明抗體分子之DNA序列可以彼等熟習此項技藝之人士熟知之方法獲得，例如，編碼抗體重鏈及輕鏈之部分或全部的DNA序列可由所欲經定序DNA序列合成或基於其對應胺基酸序列而合成。

編碼接受者框架序列之DNA廣泛於彼等熟習此項技藝者中使用且基於其已知胺基酸序列可被輕易合成。

可使用分子生物學之標準技術以製備編碼本發明抗體分子之DNA序列。使用寡核苷酸合成技術可完全或部分合成所欲DNA序列。可適當使用位置導向突變及聚合酶鏈反應(PCR)技術。

適合的DNA序列之例提供於SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：17。SEQ ID NO 15中的核苷酸1－57及SEQ ID NO 17中的核苷酸1－60編碼小鼠抗體B72.3e之訊號胜肽序列(Whittle et al.,1987,Protein Eng.1(6)499－505.)，其經裂解以得到中和本發明之抗體分子。因此，本發明亦提供經單離DNA序列，其編碼本發明抗體之重鏈，其包含SEQ ID NO：15之核苷酸58－2008。編碼本發明抗體之輕鏈本發明亦提供經單離DNA序列，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸61－705。

本發明亦關於選殖或表現載體，包含本發明一或多個DNA序列。因此，所提供者為選殖或表現載體，包含編碼本發明抗體之一或多個DNA序列。較佳地，選殖或表現載體包含兩個DNA序列，分別編碼本發明抗體分子之輕鏈及重鏈，較佳地，依據本發明之載體包含SEQ ID NOS：15及17所給予的序列。SEQ ID NO 15之核苷酸1－57及SEQ ID NO 17之核苷酸1－60編碼來自小鼠抗體B72.3之訊號胜肽序列，其較佳經裂解得到本發明之中和抗體分子。

以可構築載體之一般方法、轉染方法及培養方法為彼等熟習此項技藝者熟知的方法。於此態樣，參考“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(ed),Wiley Interscience,New York及Cold Spring Harbor出版的Maniatis Manual。

亦提供者為一種宿主細胞，其包含一或多個選殖或表現載體，其包含編碼本發明抗體之一或多個DNA序列。可使用任何適合的宿主細胞/載體系統以表現編碼本發明抗體分子之DNA序列。可使用細菌，例如大腸桿菌其他微生物系統，或亦可使用真核細胞，例如哺乳類之宿主細胞表現系統，參見Verma et al.,1998,Journal of Immunological Methods,216,165－181。適合的哺乳類宿主細胞包括CHO、NS0、骨髓瘤或融合瘤細胞。適合的表現系統之例包括WO87/04462所述麩醯胺酸合成酶表現系統。

本發明亦提供一種製造本發明之抗體分子之方法，其包含於適合導致蛋白質(由編碼本發明抗體分子之DNA)表現的條件下培養含本發明載體之宿主細胞，及單離此抗體分子。

抗體分子可僅包含重鏈或輕鏈多肽，於此時僅須使用重鏈或輕鏈多肽編碼序列以轉染此宿主細胞。為生產包含重鏈及輕鏈兩者之產物，可以兩載體轉染細胞株，第一載體編碼輕鏈多肽及第二載體編碼重鏈多肽。或者，可使用單一載體，此載體包括編碼輕鏈及重鏈多肽之序列。

如本發明之抗體有用於治療及/或預防之病理情況，本發明亦提供一種醫藥或診斷組成物，其包含本發明之抗體分子合併一或多個醫藥上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑。因此，所提供者為本發明抗體於醫藥製造之用途。此組成物通常可被施予作為無菌物之一部分，醫藥組成物通常包括醫藥上可接受的載劑。本發明之醫藥組成物可額外包含醫藥上可接受的佐劑。

本發明亦提供一種製備醫藥或診斷組成物之方法，包含添加及混合本發明之抗體分子與一或多個醫藥上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑。

抗體分子於此醫藥或診斷組成物中可為單一活性成分或可帶有其他活性成分，包括其他抗體成分，例如抗－TNF、抗－IL－1β、抗－T細胞、抗－IFNγ或抗－LPS抗體，或非抗體成分諸如黃嘌呤類。

此醫藥組成物較佳包含治療上有效量之本發明抗體，本文使用之“治療上有效量”一詞係指治療、改善或預防目標疾病或情況所需治療劑之量，或展現可偵測治療或預防效果。於任何抗體，開始可於細胞培養試驗或動物模式中評估治療上有效量，通常於囓齒動物、兔子、狗、豬、或靈長類。亦可使用動物模式以決定適當的濃度範圍及投與路徑。可使用此等資訊以決定投與人類之有用的劑量及路徑。

人類標的之精確的治療上有效量將端視疾病狀態的嚴重性、標的之一般健康情形、標的之年齡、體重及性別、飲食、投與時間及頻率、藥物併用、反應敏感性、及對治療之耐受性/反應。可以常規實驗決定此量且其為臨床醫師判斷之範疇。一般治療上有效量由0.01 mg/kg至50 mg/kg，較佳為0.1 mg/kg至20 mg/kg。醫藥組成物可為習用呈現的單位劑型，其每劑含有預定量之本發明活性劑。

可個別投與組成物於病患或可與其他劑、藥物或賀爾蒙合併投與(例如，同時、連續、或分別投與)。

投與本發明抗體分子的劑量端視欲治療病患性質、存有炎症的程度而定，以及是否正使用抗體分子預防或治療現存病況下。

投劑頻率將視抗體分子半生期及其效果而定。若抗體分子具有短半生期(例如，2至10小時)，其必須每日給予一或多個劑。或者，若抗體分子具有長的半生期(例如，2至15日或2至30日)其每日可僅必須給予一次劑量、每週一次或甚至每月1或2次。

醫藥上可接受的載劑本身不應誘發有害於接受此組成物之個體的抗體生產且不應有毒性。適當的載劑可為大的、緩慢代謝的巨分子，諸如蛋白質、多肽、微脂體、多醣類、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合物胺基酸、胺基酸共聚物、及不活化病毒顆粒。

可使用醫藥上可接受的鹽，例如，無機酸鹽，諸如氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽及硫酸鹽，或有機酸之鹽，諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽及苯甲酸鹽。

於治療組成物中醫藥上可接受的載劑可另含有液體諸如水、鹽水、甘油及乙醇。此外，輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑或pH緩衝物質，可存於此等組成物。此等載劑可使醫藥組成物調配為錠劑、丸劑、糖衣藥丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿劑及懸浮劑，以使病患消化。

投與用的較佳型式包括適合腸胃外投與的型式，例如，經注射或輸注，例如，經團式注射或連續輸注。於注射或輸注的產物時，其可以油性或水性媒劑採取懸浮液、溶液、或乳劑型式，且其可含有調配製劑，諸如懸浮、防腐、安定及/或分散製劑。或者，抗體分子可為乾燥型式，於使用前以適當無菌液體再恢復。

一旦經調配，可直接投與本發明之組成物於標的。此欲治療標的可為動物。然而，適合投與人類標的之組成物為較佳。

可以任何路徑投與本發明之醫藥組成物，包括(但不限於)口服、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、硬膜內、心室內、經皮(transdermal)、經表皮(transcutaneous)(例如，參閱WO 98/20734)、皮下、腹腔內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內或直腸路徑。亦可使用無針注射器(hyposprays)以投與本發明之醫藥組成物。一般而言，可製備治療組成物為可注射物，無論是液體溶液或懸浮液。適合溶液或懸浮液之固體型式中，注射前亦可製備液體媒劑。

此組成物之直接遞送一般經注射完成，以皮下、腹腔內、靜脈內或肌肉內，或經遞送至組織之間質腔。此組成物亦可被投與至損傷處。劑量治療可為單一劑計畫或多劑計畫。

應明瞭組成物中活性成分將為抗體分子。如此，其應為於胃腸道中對降解為易受影響的，因此，若此組成物經使用胃腸道路徑投與時，此組成物將需含有保護此抗體免於降解之製劑，但一旦其由胃腸道吸收及會釋放此抗體。

醫藥上可接受的載劑之完全討論可得自Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)。

亦擬議可經使用基因治療投與之本發明抗體，為了達成此目的，於適當DNA組份之控制下將編碼抗體分子重鏈及輕鏈之DNA序列導入病患中使抗體鏈由此DNA序列表現並於原位組合。

本發明亦提供一種用於控制炎症疾病之抗體分子。較佳地，可使用此抗體分子降低炎症進展或防止炎症進展。

亦所提供者為如本發明之抗體分子用於治療及/或預防經IL－6媒介或與IL－6之量增加有關之病理失調。本發明進一步提供如本發明之抗體分子醫藥製造之用途，此醫藥係用於治療及/或預防經IL－6媒介或與IL－6之量增加有關之病理失調。較佳地，此病理情況選自感染(病毒、細菌、黴菌及寄生蟲)、與感染有關之內毒素休克、關節炎、類風濕關節炎、牛皮癬性關節炎、全身性發作青少年原發性關節炎(JIA)、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、氣喘、骨盆炎症性疾病、阿茲海默氏症、克隆氏症(Crohn’s disease)、潰瘍性腸炎、急躁性腸病、卡斯特爾曼氏病(Castleman’s disease)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、皮肌炎、葡萄膜炎、北洛尼氏病(Peyronie’s Disease)、腹腔疾病(coeliac disease)、膽囊疾病、藏毛病(Pilonidal disease)、腹膜炎、牛皮癬、血管炎、手術黏連、中風、第I型糖尿病、萊姆關節炎(lyme arthritis)、腦膜腦炎、中樞及周圍神經系統之經免疫調節炎症性疾病(諸如多發性硬化症及格雷－巴爾二氏症候群(Guillain－Barr syndrome))、其他自體免疫失調、胰臟炎、創傷(手術)、移植物抗宿主病(graft－versus－host disease)、移植排斥、癌症(固體腫瘤如黑色素瘤、肝母細胞瘤、肉瘤、麟狀細胞癌、過渡細胞癌、卵巢癌及血液性惡性腫瘤兩者，尤其是急性髓性白血病、慢性髓性白血病、胃癌及結腸炎)、心臟病，包括缺血性疾病諸如心肌梗塞以及動脈粥樣硬化症、血管內凝血、骨再吸收、燒傷病患、骨質疏鬆症、牙周炎及胃酸過少症(hypochlorhydia)。

較佳地此病理失調為類風濕關節炎或全身性紅斑性狼瘡(SLE)。

本發明亦提供如本發明之抗體分子用於治療或預防疼痛之用途。

本發明進一步提供如本發明之抗體分子於治療或預防疼痛之醫藥之製造用途。

本發明之抗體分子可用於欲降低IL－6於人類或動物體之影響之任何治療。IL－6可於體內循環或可以不合要求的高量位於體內特定位置而存在，例如於炎症位置。

本發明之抗體分子較佳用於控制炎症疾病。

本發明亦提供一種治療罹患經IL－6媒介之失調或有此風險之人類或動物標的之方法，此方法包含投與此標的有效量之本發明抗體分子。

本發明之抗體分子亦可用於診斷，例如，涉及IL－6之疾病狀態的活體內診斷及照影。

本發明進一步僅以下列實施例說明之方式來描述，其參考伴隨之圖式。

DNA操作及一般方法

使用E.coli株INVαF'(Invitrogen)於轉形及常規培養生長。DNA限制及修飾酵素獲自Roche Diagnostics Ltd.及New England Biolabs。質體製備使用Maxi Plasmid purification kits進行(QIAGEN，目錄編號No.12165)。DNA定序反應使用ABI Prism Big Dye terminator sequencing kit(目錄編號No.4304149)並於ABI 3100自動定序儀上進行(Applied BioSystems)。使用AutoAssembler程式分析此數據(Applied BioSystems)。寡核苷酸則獲自INVITROGEN。合成基因建立於Entelechon。Fab及IgG之濃度使用組合ELISA決定。

實施例1：132E09之單離

於3週間期以皮下注射重組人類IL－6(Peprotech)免疫大鼠開始以費氏完全佐劑(Freund’s Complete Adjuvant)隨後以費氏不完全佐劑(Freund’s Incomplete Adjuvant)，於後免疫後1至2週收取脾臟，並製備單細胞懸浮液。將免疫鼠淋巴細胞培養於96孔微定量盤中於經放射小鼠胸腺瘤EL4細胞及兔子T細胞調控培養基存在下一週。於ELISAs篩選上清液中專一性對人類IL－6之抗體的存在，進一步篩選於DS1細胞試驗中中和人類IL－6之生物效果的能力為陽性者(Bock et a1.,1993,Cytokine,5,480－489)。

分泌具適當結合特徵的抗體之個別B細胞由陽性微定量孔被篩選出，依據選擇的淋巴細胞抗體法(Babcook et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,7843－7848；WO92/02551)，重鏈及輕鏈可變區基因經由反轉錄PCR由單一大鼠B細胞被選殖出。可變區於重組IgG樣式表現以確認結合，且選擇抗體132E09以人化並進一步研究。大鼠可變區序列被登記為CA030_00240。

V－區序列示於SEQ ID NOS：1至4。

實施例2：132E09之CDR－移植

消化一系列人化VL及VH區，其中來自132E09之CDR高可變區加上各種數目之框架殘基被移植於人類V－區接受者框架。

十個經移植VL區(gL1－10)被消化且經寡核苷酸組合及PCR突變建立基因。全部13個經移植VH區亦被建構(gH1－13)，使用兩個不同框架區，VH3 1－4 3－72及VH3 1－3 3－21。輕鏈經移植序列被次選殖至人類輕鏈表現載體pKH10.1，此載體含有編碼人類C－Kappa不變區(Km3 allotype)之DNA。重鏈經移植序列被次選殖至人類gamma－4表現載體pVhg4P FL，其含有編碼人類gamma－4不變區(含有鉸鏈安定化突變S241P(Angal et al.,supra))之DNA。質體被共轉染至CHO細胞且產生的抗體篩選IL－6結合及活體試驗中的活性。使用Lipofectamine^{T M} 2000依據製造商的說明書進行CHO細胞之轉染(InVitrogen，目錄編號No.11668)。

所產生的13個重鏈移植物中，兩個僅含有單一框架供給者殘基(Ala)於位置49且此等使用兩個不同重鏈框架之兩者生產。VH3 1－3 3－21移植物於CHO細胞中表現不良並顯示對IL－6之親和性降低。相反地，使用VH3 1－4 3－72框架表現孔之移植物並保有供給者抗體之親和力。此重鏈移植物，僅包含單一供給者框架殘基，與輕鏈移植物gL10合併被選擇，其中僅CDRs被轉移。

第1圖顯示供給者大鼠序列132E09及接受者人類框架之排列。重鏈接受者框架為人類生殖系序列VH3 1－3 3－72，具來自人類JH－區生殖種系JH4部分之框架4。輕鏈接受者框架為人類生殖系序列VK1 2－1－(1)O12，具來自人類JK－區生殖種系JK2之框架4。gH13及gL10用之移植序列示於第1圖(SEQ ID NOS：11、12、13及14)。

此經移植抗體稱為CA030_00240.g1。此呈完整IgG4生產，其包含如上述於位置241絲胺酸對脯胺酸取代。此完全經轉譯重鏈及輕鏈序列分別示於第2a及2b圖。重鏈之完全的胺基酸序列提供於SEQ ID NO 16及輕鏈於SEQ ID NO 18。編碼重鏈及輕鏈之DNA序列分別提供於SEQ ID Nos 15及17。SEQ ID NO 15及第2a圖中之核苷酸1－57編碼來自小鼠抗體B72.3 VH之訊號胜肽序列且SEQ ID NO 17及第2b圖之核苷酸1－60編碼來自小鼠抗體B72.3 VL之訊號胜肽序列。

小鼠抗體B72.3述於Whittle et al.,1987,Protein Eng.1(6)499－505。

實施例3：結合親和性

CA030_00240.g1結合親和性測量BIAcore技術監測生物分子間即時之結合且不需標示。此相互作用物之一者，稱為配位體，為直接被免液化或捕捉於此免疫化表面，於另一者，稱為分析物，於溶液中流動於捕捉表面上。感應器偵測於感應器表面上質量之變化，當分析物結合至配位體以於此表面上形成複合物。此相當於締合過程。當分析物以緩衝液替換時監測分解過程。於親和性BIAcore試驗，此配位體為CA030_00240.g1，全IgG4及分析物為人類IL－6。

裝置 Biacore3000，Biacore AB，Uppsala，Sweden

感應器晶片 CM5(研究等級)目錄編號：BR－1001－14，Biacore AB，Uppsala，Sweden。晶片儲存於4℃。

BIAnormalising solution 70%(w/w)甘油，部份之BIAmaintenance Kit目錄編號：BR－1002－51，Biacore AB，Uppsala，Sweden。BIAmaintenance kit儲存於4℃。

胺偶合套組 目錄編號：BR－1000－50，Biacore AB，Uppsala，Sweden。

乙基－3－(3－二甲基胺碁丙基)羰二亞醯胺氯化氫(EDC)，製成75 mg/mL於蒸餾水中並以200 μL整數量儲存於－70℃。

N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)。製成11.5 mg/mL於蒸餾水中並以200 μL整數量儲存於－70℃。

1 M乙醇胺氫氯酸－NaOH pH 8.5，以200 μL整數量儲存於－70℃。

緩衝液 流動緩衝液(Running buffer)：HBS－EP(為0.01 M HEPES pH 7.4，0.15 M NaCl，3 mM EDTA，0.005 %界面活性劑P20)，目錄編號：BR－1001－88，Biacore AB，Uppsala，Sweden，緩衝液儲存於4℃。

不動緩衝液(Immobilisation buffer)：乙酸鹽5.0(為10 Mm乙酸鈉pH 5.0)，目錄編號：BR－1003－51，Biacore AB，Uppsala，Sweden，緩衝液儲存於4℃。

配位體捕捉 Affinipure F(ab’)₂ 片段山羊抗－人類IgG、Fc片段專一性，Jackson ImmunoResearch Inc(Pennsylvania,USA)目錄編號：109－006－098，試劑儲存於4℃。

分析物 重組人類IL－6(R&D Systems Europe Ltd，Abingdon，Oxon，目錄編號206－IL－050，貨號A131402A)儲存於－70℃並於每一試驗解凍一次。

經暫時轉染CHO細胞生產重組食蟹猴(cynomologous monkey)IL－6及重組恒河猴IL－6。使用材料作為非純化及未定量細胞培養上清液。

再生溶液 以蒸餾水稀釋11.6 M母液(BDH，Poole，England，目錄編號：101254H)製備40 mM HCl。

由50 mM母液(目錄編號：BR－1003－58，Biacore AB，Uppsala，Sweden.)以蒸餾水稀釋製備5 mM NaOH。

試驗方法 使用BIAcore 3000(BIAcore AB)進行BIA(生物分子交互作用分析)，使用Affinipure F(ab’)2片段山羊抗－人類IgG，Fc片段專一性(Jackson ImmunoResearch)被固定於CM5感應器晶片，經由胺偶合化學至捕捉量5000反應單位(RUs)。使用HBS－EP緩衝液(10mM HEPES pH 7.4，0.15 M NaCl，3 mM EDTA，0.005%界面活性劑P20，BIAcore AB)作為流動緩衝液，以10 μl/min之流速。使用10 μl注射CA030_240.g1，4 μg/mL，以捕捉經固定抗－人類IgG－Fc。定量於經捕捉CA030_240.g1上之人類IL－6，以各種濃度，於30 μL/min之流速。表面經10 μL注射40 mM HCl而再生，隨後為5 μL注射5 mM NaOH，以10μL/min之流速。

使用BIAevaluation軟體(3.2版本)分析背景扣除結合曲線，依標準步驟，由擬合演算(fitting algorithm)決定動力參數。

於此研究中使用一組CA030_240.g1，於或低於20 nM之人類IL－6濃度下測量親和性，決定CA030_240.g1之親和性值於9.02－10.50 pM之範圍，具平均值±s.e.m.為9.76±0.74 pM(表1.1)。當固定IL－6造成天然構形之喪失時，不可能測量固定於BIAcore晶片上人類IL－6之親和性。

因其不可能定量食蟹猴或恆河猴IL－6，其亦不可能決定其與CA030_00240.g1交互作用之動力參數。然而，結合sensorgrams之視覺檢查指出CA030_00240.g1結合此等非人類靈長類IL－6’s，具對人類IL－6之相似親和性。

實施例5：活體外中和試驗

抗體CA030 00240.g1之效力，下文縮寫為240.g1，使用兩個不同試驗決定，第一試驗運用小鼠IL－6依賴細胞株，稱為T1165，其對小鼠、恆河猴、食蟹猴及人類IL－6之反應為增殖。IL－6對細胞表面IL－6受體之直接訊號傳遞，與訊號傳遞受體次單位(稱為gp130)連接，稱為cis－訊號傳遞。第二試驗使用經IL－6刺激的人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)加上可溶性IL－6受體(IL－6R)(以單核球趨化性蛋白質－1(MCP－1)之生產的讀數)。於此試驗，IL－6為外源性添加或可經由以胞激素介白素－17(IL－17)刺激HUVECs而生產。此等兩試驗變異體稱為trans－訊號傳遞，稱為HUVECs，不會表現IL－6R且僅可反應，即，生產MCP－1，當IL－6及可溶性IL－6R兩者由外源性添加時。

使用此等各種試驗，其可能產生對240.g1抗人類(重組及天然)、恆河猴、食蟹猴及小鼠IL－6之ND50(50%中和劑量)值。

材料培養基T1165培養基－RPMI1640，補充10%胎牛血清，盤尼西林(100單位/ml)、鏈黴素(50μg/ml)、麩醯胺酸(2mM)及10ng/ml之人類重組IL－6，R&D Systems UK。

HUVEC培養基－大血管內皮細胞基質培養基(LVECBM)TCS Cellworks，UK，大血管內皮細胞生長補充劑TCS Cellworks，UK及抗生素補充劑TCS Cellworks，UK。

以於PBS中為6.83mg/ml的濃度於實驗室中生產CA 030 00240.g1。

人類IL－6 R&D Systems，UK，人類哺乳動物衍生的IL－6(由轉染人類IL－6 10017108/67之CHO於實驗室得到)、恆河猴IL－6(由轉染恆河猴IL－6 10017108/67之CHO於實驗室得到)、食蟹猴IL－6(由轉染食蟹猴IL－6 10017108/67之CHO於實驗室得到)、小鼠IL－6 R&D Systems，UK。抗－人類MCP－1捕捉抗體(555055)及抗－人類MCP－1偵測抗體(554664)及人類重組MCP－1(890225)，BD Biosciences，CA；鏈抗生物素蛋白－HRP(AMDEX)Amersham bioscience,UK；凝血酶Merck Biosciences,Darmstadt,Germany；sIL－6R R&D Systems,UK；人類IL－17 R&D Systems,UK。

T1165試驗－CellTiter 96AQueous Promega,CA。

TM Blue(Serologicals,GA)。

240.g1活性之測量，使用T1165細胞之IL－6依賴增殖使用前4日解凍T1165細胞並培養於RPMI1640補充以10% FCS、抗生素、麩醯胺酸及10ng/ml之人類IL－6。使用錐蟲藍(trypan blue)排除監測細胞存活性，僅使用被認為至少90%存活的細胞。使用前洗滌細胞兩次，於無人類IL－6之RPMI1640中。然後計數細胞並分散於96孔平底盤，以5x10⁴ 細胞/每孔之密度。於分別盤中一系列稀釋之240.g1於人類重組物、人類哺乳動物衍生物(亦稱為人類CHO IL－6)、恆河猴、食蟹猴或小鼠IL－6存在下，以固定濃度1ng/ml(0.038nM)下培養。然後將240.g1及IL－6之預混合複合物轉移至含T1165細胞之孔，其於濕化5%CO₂ 氛圍下37℃培養48小時。於最後6個小時培養期間加入20ml之CellTiter 96Aqueous以測定增殖的細胞數。以240.gl抑制T1165細胞之IL－6－依賴的增殖表現為僅以IL－6孔之抑制百分比減去函細胞但不含IL－6之對照孔。

240.gl抗人類重組物、人類哺乳動物衍生物、恆河猴、食蟹猴及小鼠IL－6誘導細胞株T1165增殖之活性可見於第3a圖。240.gl有效抑制人類重組物、人類哺乳動物衍生、恆河猴、食蟹猴，但無小鼠IL－6活性。

人類重組IL－6之ND50為1.1±0.5 ng/ml(7.26±3.3 pM)。人類哺乳動物衍生的IL－6之ND50為3.6±2.4 ng/ml(23.76±15.84 pM)。恆河猴IL－6之ND50為2.2±1.1 ng/ml(14.52±7.26 pM)。食蟹猴IL－6之ND50為5.4±1.1 ng/ml(35.64±7.26 pM)。

2401.gl活性之測量，使用IL－6及可溶性IL－6受體於HUVECs中誘導MCP－1生產 將HUVECs(TCS Cellworks,UK)於大血管內皮細胞基質培養基(LVECBM)中生長並繼代培養不超過5次。使用前使細胞生長直到75%匯合。使用胰蛋白酶/EDTA使細胞脫離、再生，並於新鮮LVECBM中洗滌一次。然後計數細胞並分散於96孔平底盤，以2x10⁴ 細胞/每孔之密度。然後於濕化5%CO₂ 氛圍之37℃下培養細胞隔夜，隔日於補充生物素化凝血酶(3U/ml)之新鮮培養基中洗滌細胞，並置於一側。於分別盤中，於人類重組IL－6(50ng/ml；3.84nM)及sIL－6R存在下培育一系列稀釋的240.g1，以500ng/ml(10.15nM)固定濃度。除了240.g1亦培育人類重組IL－17(25ng/m1；1.18nM)，其刺激HUVECs生產IL－6，及sIL－6R於固定濃度500ng/ml(10.15nM)。然後將240.g1及IL－6/sIL－6R或IL－17/sIL－6R之預混合複合物轉移至含有HUVECs之孔，其於濕化5%CO₂ 氛圍之37℃下被培育24小時，此培育期後，收集上清液游離細胞並經三明治ELISA決定人類MCP－1量(步驟如下所示)。經240.g1之IL－6/sIL－6R或IL－17/sIL－6R之抑制誘導MCP－1生產表現為IL－6/sIL－6R或IL－17/sIL－6R處理孔減去含細胞但不無刺激之對照孔之抑制百分比。除了加入對照組指出細胞對添加人類IL－6而未添加sIL－6R之反應。

MCP－1 ELISA以2μg/ml濃度之抗－MCP－1捕捉抗體塗布Nunc Maxisorp盤，將此盤培育於＋4℃隔夜，然後於PBS加上0.1% tween20(洗滌緩衝液)中洗滌。此盤於PBS加上5%牛血清白蛋白阻斷1小時，然後以洗滌緩衝液洗滌4次並加入標準樣品及試驗樣品。於室溫培育此等盤2小時。然後洗滌此等盤並以1mg/m1之濃度加入生物素化抗－MCP－1抗體，另培育此盤2小時然後洗滌4次。然後加入1：5000稀釋之鏈抗生物素蛋白－HRP並培育此盤30分鐘。最後洗滌此等盤4次並加入TMB受質。於630nm取色量讀數並於492nm取背景讀數。於Genesis II軟體上由標準曲線使用4－參數對數曲線擬合(4－parameter logistic curve fit)推演出MCP－1濃度。

240.g1抗人類重組IL－6及sIL－6R之活性誘導於HUVECs中之trans－訊號傳遞可參見第3b圖。240.g1有效抑制人類重組IL－6及sIL－6R誘導HUVECs之MCP－1生產。ND50為64±62 ng/ml(422±409 pM)。

240.g1抗IL－17之活性誘導內源性IL－6及sIL－6R誘導HUVECs中的trans－訊號傳遞可見於第3c圖。240.g1有效抑制IL－17誘導內源性IL－6及sIL－6R誘導HUVECs之MCP－1生產。ND50為93±70 ng/ml(614±462 pM)。

結論240.g1能夠中和人類重組物、人類哺乳動物衍生物、恆河猴及食蟹猴之生物活性，但非小鼠IL－6於IL－6 cis－訊號傳遞試驗之生物活性。添加240.g1可中和經重組或內源性IL－6任一者誘導之IL－6 trans－訊號傳遞。

實施例6：活體內活性

IL－6已知會誘導急性期蛋白質。於小鼠中最顯著的急性期蛋白質為血清類澱粉A(SAA)，人類IL－6能夠作用於鼠受體因而可能注射人類IL－6於小鼠中並測量其血清中SAA生產。

Balb/c小鼠s.c.注射位置3專一性抗－hIL－6抗體，CA030_240.g1全IgG4。24小時後，小鼠以30μg/kg i.p.注射hIL－6(Peprotech目錄編號200－06，貨號0203B16)。20小時後，經心臟穿刺取血並收集血清以ELISA(Tridelta貨號22KT022)評估血清類澱粉A(SAA)。如註明於第4圖者，以hIL－6誘導之SAA經CA030_240.g1抑制，統計上顯著減少SAA，於0.3、0.1及0.03mg/kg劑量上被記錄到。

n＝7－8/組，除了PBS n＝6。以Bonferroni事後檢定經ANOVA之統計分析，與單獨IL－6比較^{＊ ＊} P<0.01。

2個進一步實驗確認經CA030_240.g1顯著抑制IL－6(30ug/kg)誘導的SAA，於0.3及0.1 mg/kg劑量上。

實施例7：CA030 00240.g1抗原決定位作圖

於人類IL－6之CA030_00240.g1辨示的抗原決定位使用NMR技術作圖，使用240.g1作為Fab’片段。此需於E.coli中表現人類IL－6並以^{1 5} N/^{1 3} C/² H安定同位素均一標示。由游離IL－6獲得完全的序列－專一性骨架共振分配且CA030_00240.g1之Fab’片段的結合所誘導之此等訊號的位置中的變化使用3D TROSY HNCO光譜偵測。

重組人類IL－6之表現及純化：人類IL－6製備自含編碼此蛋白質成熟型序列之E.coli表現載體(pET3d)，此蛋白質於Tuner(DE3)pLysS細胞中表現，高產率生成不溶性產物。IL－6之^{1 5} N、^{1 5} N/^{1 3} C及^{1 5} N/^{1 3} C/² H標示的樣品製備自於富含適當經標示物的培養基(Celtone)中生長的細胞。

IL－6純化目轉形E.coli細胞，使用完善建立的步驟。開始時，將由1L培養基收集之細胞再懸浮於40 mL緩衝液A[100 mM KCl,2 mM DTT,10mM Tris－HCl pH 8.5，25%(w/v)蔗糖，溶解於蛋白酶抑制劑(Boehringer)]。加入10 mL緩衝液B[300 mM Tris－HCl pH 8.5,100 mM EDTA,4 mg/ml溶解酶(lysozyme)]，將此懸浮液培育於冰上10－30分鐘並不定時旋轉。然後加入50 ml緩衝液C[1 M LiCl,20 mM EDTA,0.5%(v/v)NP－40]，使此懸浮液於20,000 psi通過French Press兩次。然後於4℃ 16,000g rpm下離心此均質物15分鐘並保留小團塊。將此小團塊再懸浮於40 ml緩衝液D[10 mM Tris－HCl pH 8.5,0.1 mM EDTA,0.5 M LiCl,0.5%(v/v)NP－40,1 mM DTT，溶解的蛋白酶錠]並通過French Press及如先前之離心。重覆此階段。然後將此小團塊再懸浮於40 ml緩衝液E[10 mM Tris－HCl pH 8.5,0.1 mM EDTA,0.5%(v/v)NP－40,1 mM DTT，經溶解蛋白酶錠]並通過French Press及如前述之離心。重覆此階段。將最終小團塊溶解於6 mL 6 M GuHCl,50 mM Tris－HCl pH 8.0並經於4℃ 48,000 g離心30分鐘澄清。保留上清液並光譜計量定量經溶解IL－6。

經溶解IL－6於5 M GuHCl,50 mM NaCl,50 mM Tris－HCl,2 mM GSH,0.2 mM GSSG,1 mM EDTA, pH 8.0被稀釋成2.5 mg/mL並於25℃被培育1小時。然後將此樣品進一步被稀釋,以逐滴方式為250μg/mL於50 mM NaCl,50 mM Tris－HCl,2 mM GSH,0.2 mM GSSG,1 mM EDTA,pH 8.0並於25℃培育3小時。於此階段任何形成之任何沉澱物經由於4℃ 30,000 g下離心30分鐘而儲存。此經澄清物質被透析於50 mM Tris－HCl,10%(v/v)甘油，pH 9.0，於4℃最少16小時並更換2次緩衝液。透析後此溶液經於4℃ 30,000 g離心30而被澄清,保留上清液並負載於8 mL monoQ(Amersham Biosciences)離子交換管柱，以線性梯度之氯化鈉(0－1.0 M)洗析。含再折疊(refolded)IL－6之部份經SDS－PAGE鑑定，然後聚成池並二次過濾於25 mM磷酸鈉，100 mM NaCl，0.01%(w/v)NaN₃ ,pH 6.5。

CA030_00240.g1之Fab’片段被生產、純化及調配於25 mM磷酸鈉，100 mM NaCl,0.01%(w/v)NaN₃ ,pH 6.5。製備IL－6及CA030_00240.g1的Fab’片段間1：1複合物用於NMR分析，於約0.2－0.6 mM濃度下經由混合等莫耳量之蛋白質。

NMR光譜：NMR實驗於0.35 ml樣品之蛋白質中及於25 mM磷酸鈉,100 mM氯化鈉及0.01%(w/v)疊氮化鈉緩衝液(pH 6.5)之複合物於95% H₂ O及5% D₂ O中進行，製備^{1 5} N/^{1 3} C/² H標示的IL－6及CA030_00240.g1之未標示Fab’片段之間的1：1複合物用於NMR分析，經由混合等莫耳量之蛋白質以完成最終濃度0.1 mM。於25℃獲得遊離IL－6及CA030_00240.g1複合物之IL－6：Fab’片段的NMR資料，於裝配有三次共振(^{1 5} N/^{1 3} C/¹ H)冰凍探子之800 MHz Bruker Avance質譜儀。使用標準HNCACB,CBCA(CO)NH及HNCO光譜(Wittekind,M.,and Mueller,L.(1993)J Magn Reson,Series B 101(2),201；Grzesiek,S.,and Bax,A.(1993)J Biomol NMR 3(2),185－204；Muhandiram,D.R.,and Kay,L.E.(1994)J Magn Reson,Series B 103(3),203；Grzesiek,S.,and Bax,A.(1992)J Magn Reson 96(2),432)以製作完整序列－專一性骨架共振分配(^{1 5} N、^{1 3} C及¹ H)於游離IL－6，使用0.9 mM均一性^{1 5} N/^{1 3} C經標示樣品。

使用3D TROSY^－ HNCO光譜(Salzmann,M.et al.,(1998)Proc Natl Acad Sci U S A 95(23),13585－13590)偵測由於CA030_00240.g1的Fab’片段結合誘導之IL－6骨架訊號位置的變化，於所有3D NMR實驗典型取得的參數被提供於表1。

所有光譜使用NMRPipe(Delaglio,F.et al.,(1995)J Biomol NMR 6(3),277－293)處理，以用於延伸3D資料之^{1 5} N空間有效取得時間至約30 ms中使用之線性預測。於所有空間中施予輕度解析增強，使用變換正弦平方函數(shifted sine－squared function)。使用Sparky(Goddard,T.D.,and Kneller,D.G.SPARKY 3.In.,University of California,San Francisco)進行此光譜之分析。

Fab結合資料之分析：使用最小變換途徑(shift approach)(Farmer,B.T.et al.,(1996)Nat Struct Mol Biol 3(12),995；Muskett,F.W.et al.,(1998)J Biol Chem 273(34),21736－21743)以決定由於CA030_00240.g1結合之Fab’片段造成的IL－6 NMR訊號位置的變化。開始時，於游離IL－6之3D HNCO光譜及IL－6結合至g132E09 Fab之3D TROSY^－ HNCO光譜的所有峰值於其中央部分被挑出，骨架共振之^{1 5} N及¹ H化學位移值被校正於複合物及游離蛋白質間的差值(於^{1 5} N為－0.8 ppm且於¹ H為－0.05 ppm)(Baxter,N.J.,and Williamson,M.P.(1997)J Biomol NMR 9(4),359－369)。游離及Fab結合的IL－6間之高峰位置的最小變化經由使用微軟Excel計算合併化學位移差(於游離蛋白質之HNCO光譜中每一分配高峰之^{1 5} N、^{1 3} C及¹ H的差)比較於Fab複合物之TROSY－HNCO光譜所有觀察到的峰值而獲得。合併的醯胺質子、氮及碳化學位移差(△δ)依據下列方程式界定(方程式1)，其中△δ_{H N} 、△δ_N 及△δ_c 對應於與比較的HNCO峰值成對間之差的¹ H、^{1 5} N及^{1 3} C位移，且α_N 及α_C 為計算醯胺質子、醯胺氮及碳化學位移範圍的差所需的定標因子0.2及0.33，於每一各別HNCO峰值，取Fab結合誘導的最小位移作為最低可能的合併位移值(△δ)。

為鑑別IL－6上Fab結合位置(抗原決定位)，使用合併最小位移相對於蛋白質序列之直方圖以顯示含顯著被攪亂訊號之IL－6之區域。若各別胺基酸之合併化學位移變化的大小超過所有胺基酸合併的化學位移變化之平均之閾值加上由此平均之一標準偏差，進一步評估用選擇的此等殘基做為於Fab結合位上可能的接觸殘基。候選結合位殘基之定位最終於IL－6之高解析結構上被檢查(Xu,G.Y.et al.,(1997)J Mol Biol 268(2),468－481)且僅位於此蛋白質表面的殘基被認為是可用於Fab結合。

應用兩不同閾值以鑑別經Fab結合的殘基，平均最小位移＋1SD(0.143)及平均最小位移＋2SD(0.213)。發現抗體之結合位置包含Trp157之關鍵位置3特徵殘基(Boulanger et al.,2003,Science,300,2101－2104)。使用Boulanger et al.,supra於抗體240g.1編號之胺基酸編號發現結合至少下列殘基(平均值＋2SD(0.213))S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159及S169。抗體可結合所有下列殘基(平均值＋1SD(0.143))C44、S47、C50、S53、A58、E93、V96、R104、F105、E106、T149、K150、Q152、A153、Q154、N155、Q156、W157、Q159、T163、L165、S169及E172。

應明瞭相同殘基亦可被編號，基於IL－6未處理先驅物之胺基酸編號(Swiss Prot Accession number P05231)。使用此編號，抗體240g.1結合至少下列殘基S75、C78、E121、R132、F133、E134、T177、K178、A181、Q182、Q187及S197。此抗體可結合所有下列殘基C72、S75、C78、S81、A86、E121、V124、R132、F133、E134、T177、K178、Q180、A181、Q182、N183、Q184、W185、Q187、T191、L193、S197及E200。

以14 ppm掃描寬度及85 ms獲取時間獲得直接¹ H尺度(F3或F2)。

當然應了解以實施例方式描述之本發明，並未以任何方式限定，於下列申請專利範圍所請範疇中可作細節的修飾。本發明每一具體例之較佳特徵可加以必要之變動。本說明書引用之所有刊物，包括(但不限於)專利及專利申請案，以參考文獻併入本文，當每一各別刊物具體且各別指出時以其全文所示作為參考文獻併入。

第1圖顯示240.g1重鏈(亦可參見此處之gH13)及輕鏈(亦可參見此處之gL10)序列之移植設計；符號(|)強調供給者：接受者：經移植框架序列之差異，CDR被劃字單下線，此等經Kabat定義，除了CDR-H1外，CDR-H1包含Kabat及Chothia兩者的定義；字雙下線序列為於此移殖物中保留的供給者框架殘基。

第2a圖顯示240.g1 IgG4重鏈之聚核苷酸序列及轉譯胺基酸序列，顯示內含子/外顯子邊界。該重鏈序列gH13亦於此處揭示如SEQ ID NO：11。

第2b圖240.g1 IgG4輕鏈之聚核苷酸序列及轉譯胺基酸序列，顯示內含子/外顯子邊界。該輕鏈序列gL10亦於此處揭示如SEQ ID NO：13。

第3a圖顯示抗體240.g1對人類重組物、人類哺乳動物衍生物、恒河猴、食蟹猴(Cynomolgus)及小鼠IL-6誘導的T1165增殖之抑制。

第3b圖顯示抗體240.g1於HUVECs中對人類重組物IL-6及sIL-6R誘導的MCP-1生產之抑制。

第3c圖顯示抗體240.g1於HUVECs中對IL-17誘導的內源性IL-6及sIL-6R誘導的MCP-1生產之抑制。

第4圖為hIL-6誘導SAA於小鼠之活體中和作用，經投與CA030_240.g1(位置3抗體)n=7-8/組，除了PBS n=6，以Bonferroni事後檢定之ANOVA的統計分析，** P<0.01相較於IL-6單獨者。

<110> UCB S.A.gelinas,richard popplewell,andrew adams,ralph singhal,mitra zhang,yi <120> 對人類IL－6具專一性之抗體分子<130> A0018 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> 黑家鼠(Rattus rattus) <400> 1<210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> 黑家鼠<400> 2 <210> 3 <211> 321 <212> DNA <213> 黑家鼠<400> 3<210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> 黑家鼠<400> 4 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> 黑家鼠<400> 5<210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> 黑家鼠<400> 6<210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> 黑家鼠<400> 7<210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> 黑家鼠<400> 8<210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> 黑家鼠<400> 9<210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> 黑家鼠<400> 10<210> 11 <211> 120 <212> PRT <213> 人工<220> <223> gH13 <400> 11 <210> 12 <211> 360 <212> DNA <213> 人工<220> <223> gH13 <400> 12<210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> 人工<220> <223> gL10 <400> 13 <210> 14 <211> 324 <212> DNA <213> 人工<220> <223> gL10 <400> 14<210> 15 <211> 2008 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 240g1重鏈<400> 15 <210> 16 <211> 447 <212> PRT <213> 人工<220> <223> 240g1重鏈<400> 16 <210> 17 <211> 705 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 240g1輕鏈<400> 17<210> 18 <211> 214 <212> PRT <213> 人工<220> <223> 240g1輕鏈<400> 18 <210> 19 <211> 100 <212> PRT <213> 人類(Homo sapiens)<400> 19 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> 人類<400> 20<210> 21 <211> 88 <212> PRT <213> 人類<400> 21<210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> 人類<400> 22

Claims (16)

1. 一種對人類IL-6具專一性之中和抗體，其包含重鏈與輕鏈，其中該重鏈之可變功能域包含於CDR-H1之具有SEQ ID NO：5提供的序列、於CDR-H2之SEQ ID NO：6提供的序列、及於CDR-H3之SEQ ID NO：7提供的序列，以及該輕鏈之可變功能域包含於CDR-L1之SEQ ID NO：8提供的序列、於CDR-L2之SEQ ID NO：9提供的序列、及於CDR-L3之SEQ ID NO：10提供的序列。
2. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中重鏈包含序列gH13(SEQ ID NO：11)。
3. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中輕鏈包含序列gL10(SEQ ID NO：13)。
4. 如申請專利範圍第1項之對人類IL-6具專一性之中和抗體，其具有包含序列SEQ ID NO：11之重鏈以及包含序列SEQ ID NO：13之輕鏈。
5. 如申請專利範圍第1項之對人類IL-6具專一性之中和抗體，其具有包含SEQ ID NO：2提供的序列之重鏈以及包含SEQ ID NO：4提供的序列之輕鏈。
6. 如申請專利範圍第1項之對人類IL-6具專一性之中和抗體，其具有包含SEQ ID NO：16提供的序列之重鏈以及包含SEQ ID NO：18提供的序列之輕鏈。
7. 一種經單離DNA序列，其編碼如申請專利範圍第1至6項中任一項之抗體的重鏈及/或輕鏈。
8. 如申請專利範圍第7項之經單離DNA序列，其中編碼重鏈之DNA序列包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：15提供的序列或SEQ ID NO：15之核苷酸58-2008。
9. 如申請專利範圍第8項之經單離DNA序列，其中編碼輕鏈之DNA序列包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：17提供的序列或SEQ ID NO：17之核苷酸61-705。
10. 一種選殖或表現載體，其包含一或多個如申請專利範圍第7至9項中任一項之DNA序列。
11. 如申請專利範圍第10項之載體，其中此載體包含SEQ ID NO：15提供的序列以及SEQ ID NO：17提供的序列。
12. 一種宿主細胞，其包含一或多個如申請專利範圍第10或11項之選殖或表現載體。
13. 一種生產對人類IL-6具專一性結合之抗體之方法，其包含培養申請專利範圍第12項之宿主細胞並單離此抗體。
14. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至6項中任一項之抗體，與一或多個醫藥上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑合併。
15. 如申請專利範圍第14項之醫藥組成物，其進一步包含其他活性成分。
16. 一種如申請專利範圍第1至6項中任一項之抗體或如申請專利範圍第14或15項之醫藥組成物之用途，其用於製備治療經IL-6媒介或與IL-6量增加有關之病理失調的藥劑。