TWI363763B

TWI363763B - The measuring method for human orotate phosphoribosyl transferase protein

Info

Publication number: TWI363763B
Application number: TW095107029A
Authority: TW
Inventors: Kazuki Sakamoto; Yoshikazu Sugimoto
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2006-03-02
Publication date: 2012-05-11
Also published as: US20090208982A1; CN101133085B; WO2006093115A1; EP1854811A1; CA2599669A1; JP2006241070A; KR20070115910A; TW200643030A; KR101225846B1; EP1854811A4; HK1117848A1; JP4856381B2; AU2006219378A1; AU2006219378B2; CN101133085A

Description

1363763 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係有關抗人類乳清酸磷酸核糖轉移酶之新穎抗體及使用該抗體之人類乳清酸磷酸核糖轉移酶蛋白質的測定法。【先前技術】乳清酸填酸核糖轉移酶（orotate phosphoribosyl transferase ; EC 2.4.2.10，以下稱「OPRT」）係一種催化由乳清酸生成尿嘧啶單磷酸（UMP)之反應的酵素，且具有供給核酸合成所需要嘧啶核苷酸的任務，是核酸前驅體供給路徑之主要速率控制酶之一。因此，已知在細胞增殖旺盛之腫瘤組織及消化管上皮其活性極高。另外，5-氟尿嘧啶系的抗癌劑係由於將作為速率控制酶之OPRT活性化以發揮抗腫瘤效果，因此，已知對腫瘤細胞中0PRT含量較多的患者，其效果較大，可看到顯著延長生命的效果，相對於此，0PRT含量較少的患者，其效果較小（參照非專利文獻1)。因此，例如在進行腫瘤患者之治療時，預先測定摘出之腫瘤中的0PRT含量以作為決定治療方法及選定投與之抗癌劑的指標等，其重要性極高。以往，組織中人類0PRT之定量可藉由測定mRNA量或酵素活性而進行。但是，以mRNA含量的測定中，因轉錄後的調節機構等而可能無法完全反映蛋白質含量及酵素活性。此外，藉由酵素活性的測定之定量，由於主要是使用被放射能標識之基質，因此，該操作極為煩雜。將人類 109077-1010120.doc 1363763 OPRT定量法應用於臨床上的診斷及治療，兼顧簡便及正確是極重要的。這種定量法的開發是極為需要的。 [非專利文獻 l]Br. J_ Cancer.，2003, Oct, 20; 89(8):1486-92。【發明内容】 [發明所欲解決的課題] 因此，本發明目的係提供一種人類OPRT的簡便且正確之測定方法。 [用於解決課題的手段] 因而，本發明者製作抗人類OPRT整體的多株抗體及抗人類OPRT之胺基酸序列中之種種寡肽的抗體，並設計組合該等抗體之測定系並檢討，發現以下組合的人類OPRT 免疫測定系：識別存在於從人類OPRT的N端起算第86個〜第108個的胺基酸之結構域的抗原決定部位之抗體及識別存在於從人類OPRT的N端起算第454個〜第474個的胺基酸之結構域的抗原決定部位之抗體，其比用其他抗體的測定系之感度明顯提高，可簡便且正確測定人類OPRT蛋白質，而得以完成本發明。亦即，本發明係提供抗人類OPRT抗體，其係識別存在於從人類OPRT之N端起算第86個〜第108個之胺基酸結構域的抗原決定部位者。另外，本發明係提供抗人類OPRT抗體，其係識別存在於從人類OPRT之N端起算第454個〜第474個之胺基酸結構域的抗原決定部位者。再者，本發明係提供人類OPRT蛋白質測定用套組，其 109077-1010120.doc 1363763 係含有以下抗人類OPRT抗體：識別存在於從人類OPRT之 N端起算第86個〜第108個之胺基酸結構域的抗原決定部位者，及識別存在於從人類OPRT之N端起算第454個〜第474 個之胺基酸結構域的抗原決定部位者。此外，本發明係提供人類OPRT蛋白質測定法，其係使用以下組合抗人類OPRT抗體：識別存在於從人類OPRT之 N端起算第86個〜第108個之胺基酸結構域的抗原決定部位者，及識別存在於從人類OPRT之N端起算第454個〜474個之胺基酸結構域的抗原決定部位者。另外，人類OPRT蛋白質的胺基酸序列係依據Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol· 85，No. 6，1988，1754-1758所記載者。 [發明的效果] 依本發明方法，與用人類OPRT整體作為抗原的抗體時，及用識別存在於從人類OPRT的N端起算第428個〜第 446個之胺基酸結構域的抗原決定部位之抗OPRT抗體時相比較，其可簡便且正確定量人類OPRT蛋白質。另外，利用本發明測定法定量檢體之人類OPRT蛋白質時，不僅可診斷癌症、預測治療效果，還可選定治療方法，決定可否投與抗癌劑。【實施方式】本發明識別存在於從人類OPRT蛋白質的N端起算第86個〜第108個之胺基酸結構域的抗原決定部位的抗人類OPRT 抗體之抗原，可使用具有從人類OPRT蛋白質的N端起算第 109077-1010120.doc 1363763 86個〜第108個胺基酸序列，或具有含該胺基酸序列之連續 80%以上之胺基酸序列的合成肽。以後使用此抗原製得之抗體稱抗OPRT-A抗體。本發明識別存在於從人類OPRT蛋白質的N端起算第454 個〜第474個之胺基酸結構域的抗原決定部位的抗人類 OPRT抗體之抗原，可使用具有從人類OPRT蛋白質的N端起算第454個〜第474個胺基酸序列，或具有含該胺基酸序列之連續80%以上之胺基酸序列的合成肽。以後使用此抗原製得之抗體稱抗OPRT-C抗體。將上述合成肽作為抗原使用時，為了促進免疫應答之目的，可和抗原混合Freund佐劑等的佐劑使用，還可於抗原結合牛曱狀腺球蛋白、BS A (Bovine Serum Albumin :牛血清白蛋白）、KLH (Keyhole limpet hemocyanine :透孔螺的企藍素）等的載劑使用。本發明之抗人類OPRT抗體只要是能識別存在於前記胺基酸序列之結構域的上述抗原決定部位即可，可為多株抗體亦可為單株抗體。使用上述抗原製作抗人類OPRT多株抗體時，可用以下方式製作。含有抗人類OPRT多株抗體之抗血清係依定法將上述抗原於兔子、大鼠、小鼠、山羊等各種動物免疫必要次數，藉由採血而製得。較佳為結合KLH於上述合成肽者作為抗原，以每3週兩次的比例免疫兔子。從抗血清純化抗OPRT抗體時，根據抗體純化的定法，以親合性層析術、硫酸敍鹽析法、離子交換管柱層析術、分子篩管柱層 109077-1010120.doc 1363763 析術（凝膠過濾）、蛋白質A管柱層析術等進行即可。此外，為了提高抗體的純度，可組合該等純化手法，亦可重複進行。進行親和層析術（抗原固定化管柱）時，將上述合成肽固定於管柱’填充抗血清使抗OPRT抗體吸附於管柱後，用溶出液將抗OPRT抗體離出’藉由回收該等而可製得高純度的抗OPRT抗體。用上述抗原製作抗人類OPRT單株抗體時，可藉由以下方式製作產生抗人類OPRT單株抗體之融合瘤。上述融合瘤係例如將上述抗原於小鼠、大鼠等的哺乳動物或鳥類免疫’其脾臟細胞和小鼠、大鼠等哺乳動物的骨髓瘤細胞 (骨髓腫瘤細胞）根據Kolerr及Milstein的基本方法[參照 Nature ’第256卷’ 49 5項（1975年）]進行細胞融合，可藉由於選擇用培養基中培養而製得。此時的免疫方法係例如將所調製之抗原溶解於_酸緩衝液、生理食鹽水等，依需要混合佐劑，其進行係藉由以1〜3週内投與數次至動物的皮下、脾臟内、腹腔、靜脈等，至充分抗體價上升為止。用於細胞融合之骨髓瘤細胞可列舉如小鼠P3-NS-1 /1 Ag4.1、 P3-X63-Ag8.653、Sp2/0Agl4、大鼠 YB2/0 等。細胞融合時，融合促進劑可用聚乙二醇、仙台病毒等，另外，亦可用電脈衝。使用於細胞融合上之骨髓細胞為8-氮鳥嘌呤耐性株，由於活體合成欠缺於核苷酸合成之救助路徑的必要次黃嘌呤-烏嘌呤-磷酸核糖轉移酶，因而於HAT培養基 (含有次黃嘌呤、胺基蝶呤、胸腺嘧啶的培養基）中，無法 109077-1010120.doc -10- 合成核苷酸而不能生存。而在進行細胞融合後，藉由HAT 培養基培養1週〜2週，而可以僅只選擇融合有脾細胞和骨髓瘤之融合瘤。如此所製得之本發明抗人類OPRT抗體能用於人類OPRT 蛋白質的免疫學的測定，例如可適用於如三明治型ELISA 法、競爭法的放射免疫分析法、酵素免疫分析法及免疫層析法等。當中，特別佳為三明治型ELISA法。本發明之人類OPRT蛋白質測定用套組係含有抗OPRT-A 抗體及抗OPRT-C抗體。使用此二抗體進行三明治型ELIS A 法時，係將其中之一抗OPRT抗體固定於支持體（固相化抗體），另一抗OPRT抗體作為標識抗體（檢測抗體）。較佳的組合係將抗OPRT-C抗體作為固相化抗體而抗OPRT-A抗體做為檢測抗體。例如在三明治型ELISA法的情況下之免疫測定係將一抗 OPRT抗體固定於ELISA用反應盤等的支持體，接著，使之與被檢體反應，再與標識抗OPRT抗體反應後，洗淨，測定三明治型免疫反應生成之標識量。用作為本發明之被檢體只要是存在有OPRT而得之人類組織、體液即可，可列舉例如腫瘤組織、消化管組織、血液、淋巴液等，但是特別佳為腫瘤組織。在本發明卡所用之支持體可列舉例如瓊脂膠、纖維素等的不溶性多醣類；聚矽氧樹脂、聚苯乙烯樹脂、聚丙烯醯胺樹脂、耐綸樹脂、聚碳酸酯樹脂等的合成樹脂；及玻璃等的不溶性支持體。該等支持體可以珠狀或盤狀等的形狀 109077-1010120.doc -11- 1363763 使用。採珠狀時，可用填充有該等的管柱等。盤狀時可用多孔盤（96孔多孔盤等）、生物感應晶片等。抗〇pRT抗體和支持體的結合可藉由化學結合或物理吸附等一般用的方法結合。該等支持體可用市售者。抗OPRT抗體和被檢體的反應通常係在缓衝液中進行。緩衝液係使用例如磷酸緩衝液、Tris緩衝液、檸檬酸緩衝液、硼酸鹽缓衝液、碳酸鹽緩衝液等。此外，培育的條件係例如在4°C〜室溫進行！小時〜24小時的培育。培育後的洗淨係只要是不會妨害被檢體中的人類〇pRT蛋白質與抗 OPRT抗體的結合即可，例如，可使用含有丁^如等的界面活性劑之緩衝液等。本發明之人類OPRT蛋白質測定方法中，除了欲檢測人類OPRT蛋白質之被檢體外，亦可設置對照組樣品。對照組樣品係未含有人類0PRT蛋白質的陰性對照組樣品及含有人類OPRT蛋白質的陽性對照組樣品等。此時，藉由比較未含有人類OPRT蛋白質的陰性對照組樣品所得的結果與已含有人類OPRT蛋白質的陽性對照組樣品所得的結果，藉此可檢測被檢體中的人類〇PRT蛋白質。另外，調製對照組樣品使濃度作一系列階段變化，取得相對於各對照組樣品之檢測結果作為數値而做成標準曲線，從被檢體的數値根據標準曲線而可定量檢測含於被檢體中之人類 OPRT蛋白質。抗OPRT抗體的標識可藉一般已知之方法進行。標識物質可用螢光色素、酵素、辅酶、化學發光物質、放射性物 109077-1010120.doc 質等業者所習知之標識物質，具體的例子可列舉如放射性同位素⑽、I4C、1251、3H、1311等）、營光素、若丹明、丹磺醯氯、繳形花内醋、螢光素酶、過氧化酶、鹼性碟酸酶、β-半乳糖酶、β-葡萄糖苦酶、山莫過氧化酶、葡萄糖激粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、微過氧化酶、生物素等。標識物質用生物素時，較佳為於添加生物素標識抗體後，更添加結合有鹼性磷酸酶等酵素的即白素。標識物質與抗OPRT抗體的結合可用戊二醛法、馬來醯胺法、吡啶基二硫化物法、過碘酸法等的習知方法。具體而言，將含有一抗OPRT抗體的溶液加至測定盤等的支持體，將該抗OPRT抗體固定於支持體。洗淨測定盤後，為防止蛋白質非特異的結合，例如以BSA、明膠、白蛋白等進行阻斷。再洗淨，於測定盤添加被檢體。培育後，洗淨，添加另一標識抗〇PRT抗體。適度培育之後，洗淨測疋盤，檢測殘留於測定盤的標識抗抗體。檢測可藉由業者所習知之方法進行，例如以放射性物質標識的If况，可藉由液體閃爍法或RIA檢測。以酵素標識的情兄係添加基質，基質之酵素的變化，可藉由例如吸光光度。十檢測呈色。基質之具體例可列舉如2,2-次偶氮基雙（3·乙基笨并。塞峻琳-6-續酸）二錄鹽（aBTS)、鄰-伸苯基二胺' 3,3，5,5’-四甲基聯苯胺（TME)等。在螢光物質的情況中，可藉榮光光度計檢測。 [實施例] 以下列舉實施例以更詳細說明本發明，本發明並非限定 109077-l0l0i2Q.doc -13- 1363763 於該等者。比較例（藉由使用抗1*11〇?11丁抗體之£1^15八法定量0?111') (1) 抗原作成抗原係利用培養大腸菌所製得之重組人類OPRT (rhOPRT)。其製法為以下方法。以PCR選殖人類OPRT的全長cDNA，將表現麩胱胺酸-S-轉移酶（GST)及rhOPRT的融合蛋白所作成之質體導入大腸菌BL21，於100微克/毫升之安比西林存在下，在1〇〇毫升之LB培養基（和光純藥工業社製）中於37°C震盪培養隔夜。將該1〇毫升培養液移入裝有1公升LB培養基的三角錐瓶，於37°C再培養4小時。藉由離心收集細菌後，將菌體懸浮於1〇〇毫升的集菌緩衝液 (50 mM Tris、8M尿素、1 mM PMSF、5 mM EDTA、5 mM DTT pH7.4)後，在4°C緩慢攪拌30分鐘。在4°C將懸浮液以超音波破碎後，以15000xg、4°C進行30分鐘的離心處理。之後，上清液中的尿素濃度藉由透析處理徐徐降至1M為止，進行重折疊處理，通過填充2毫升麩胱胺酸（GSH)-瓊脂糖（Sigma公司製）之管柱，以10毫升洗淨液（20 mM Tris、1 Μ尿素、5 mM EDTA pH7.4)洗淨。以溶出用緩衝液（50 mM GSH、50 mM Tris、pH9.6)溶出 GST-rhOPRT , 製得rhOPRT溶液。 (2) 免疫以GST-rhOPRT作為免疫原，再使用Freund完全佐劑 (FCA)或Freund不完全佐劑（FIA)，藉由以下方法免疫兔子 (white曰本白色種）。 109077-1010120.doc -14·

第1次：0,2毫克GST-rhOPRT+腹腔注射FCA 第2〜8次：0.5毫克GST-rhOPRT+腹腔注射FIA (3) 純化抗血清回收經免疫之兔子的全血，將該等以1500xg、4°C離心5 分鐘，分離血清。將20毫升所得抗血清以PBS(-)二倍稀釋成40毫升。將該抗血清稀釋液添加至GST蛋白固定化的管柱，GST反應性抗體被吸附後，使直接流過的溶液流過蛋白質A固定化的管柱，被結合之抗體（lgG)用PBS(-)仔細洗淨至在280毫微米無吸光度為止。之後，將0.2M甘胺酸-HCl-pH2.5流過管柱以溶出吸附於抗原的抗體。此外，為了中和此時之pH，預先添加1M Tris於接受溶出抗體的試管中，以防止回收之抗體變質。所製得之抗體分液以 PBS(-)在4°C經一晚透析而成為純化抗體。

(4) 藉由三明治型ELISA法定量人類腫瘤細胞中的OPRT 以0.1 mM碳酸緩衝液pH9.6調製抗rhOPRT抗體成5.0微克/毫升，將0.1毫升分注至96孔ELISA用測定盤中，將之密封並於4°C的培育箱内進行一晚被覆，製得抗體固定化担體。以含有0.05% Tween 20之PBS(-)將96孔測定盤洗淨二次後，添加含有0.1%BSA之PBS(-)0.1毫升進行非特異吸附的阻斷。以洗淨液洗淨二次後，添加0.1毫升稀釋成3、 9、27倍的來自人類胃癌之細胞TMK1細胞之均質液（從 5xl06個細胞調製成0.2毫升之蛋白抽出液），在室溫使之反應1小時。以洗淨液洗淨五次後，每孔分注0· 1毫升以稀釋液稀釋成0.5微克/毫升之過氧化酶標識抗rhOPRT抗體，在 109077-1010120.doc -15- 1363763 室溫反應30分鐘。以洗淨液洗淨七次後，添加0.1毫升含有1.3毫克/毫升鄰-伸苯基二胺及0.01%過氧化氫水溶液、1 mM EDTA的0.1 Μ磷酸-檸檬酸緩衝液ρΗ5.1(呈色液），在室溫暗處進行30分鐘酵素反應。最後’添加0.1毫升的0.1Μ硫酸停止反應，進行492毫微米的吸光度測定° 該結果示於表1。 [表1]

藉由使用抗rhOPRT抗體之三明治型ELISA法檢測〇PRT 稀釋倍率 1/3 1/9 1/27 吸光度（492毫微米） 0.085 0.055 0.15 由於吸光度（492毫微米）太低’完全無法看到其與稀釋倍率間的相關性，因而確認使用OPRT的全長cDNA作成的抗rhOPRT抗體不適用在三明治型EL1SA法。實施例1(抗體的作成）藉由以下操作製得抗OPRT多株抗體。 (1)肽合成合成具有有從人類OPRT的N端起算第86號〜第108號胺基酸序列的肽、具有從人類OPRT的N端起算第428號〜第446 號胺基酸序列的肽及具有從人類〇1>尺丁的\端起算第454號〜第474號胺基酸序列的肽，製得含有以下肽序列之人工肽。具有從人類OPRT的N端起算第86號〜第108號胺基酸序列的肽（抗原名：〇PRT-A) 109077-1010120.doc -16 ·

Cys-Ser-Thr-Asn-Gln-Ile-Pro-Met-Leu-Ile-Arg-Arg-Lys-Glu-Thr-Lys-Asp-Tyr-Gly-Thr-Lys-Arg -Leu (序列號 1) 具有從人類OPRT的N端起算第428號〜第446號胺基酸序列的肽（抗原名：OPRT-B)

Cys-Leu-Gly-Gln-Gln-Tyr-Asn-Ser-Pro-Gln-Glu-Val-Ile-Gly-Lys-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile(序列號 2) 具有從人類OPRT的N端起算第454號〜第474號胺基酸序列的肽（抗原名：OPRT-C)

Gys-Ile-Ser-Ala-Ala-Asp-Arg-Leu-Glu-Ala-Ala-Glu-Met-Tyr-Arg-Lys-Ala-Ala-Trp-Glu-Ala-Tyr(序列號 3) (2) 抗原結合物的作成將4毫克依上述所製得之人工肽及2毫克馬來醯胺活性化 KLH(Pierce)針對各個肽作成肽-KLH結合物。 (3) 免疫以人工肽-KLH作為免疫原，再用Freund(Freund)完全佐劑（FCA)或Freund不完全佐劑（FIA)，依以下免疫兔子 (white曰本白色種）。

1次：皮下注射0.5毫克肽-KLH+FCA 2〜8次：皮下注射0.5毫克肽-KLH+FIA (4) 抗血清的純化回收經免疫之兔子的全血，將該等以1600xg、4°C離心5 分鐘以分離血清。將20毫升所得的抗血清以PBS(-)稀釋二倍成40毫升。將該抗血清稀釋液添加至抗原肽管柱，使之與抗體（IgG)結合，用PBS(-)洗淨至在280毫微米無吸光度 109077-1010120.doc -17- 1363763 為止。之後使0.2 Μ甘胺酸-HCl pH2_5流過管柱溶出吸附於抗原的抗體。另外，此時為了中和pH，於裝溶出抗體之試管預先添加1 M Tris，以防止回收之抗體的變質。所得抗體分液以PBS(-)在4°C透析一晚而成純化抗體。 (5)藉由西方墨點法確認抗OPRT抗體的特異性等量混合來自人類肺癌細胞LC-11細胞的均質液（蛋白質濃度20毫克/毫升）及電泳用樣品調製液（4% SDS、10% β-氫硫乙醇、20%甘油、125 mM Tris、ρΗ6·8)，進行2分鐘煮沸處理，使用10微升於電泳。樣品用10%聚丙烯醯胺電泳後，以電轉寫至PVDF過濾膜，浸至Blockace (阻斷劑，大曰本製藥社製）進行阻斷。以20 mM PBS(-)調製成1_2微克/毫升之各多株抗體用於一次抗體進行1小時反應，以含有 500 mM 氯化納及 0·5°/〇 Tween 20 之 20 mM Tris ρΗ7·0(洗淨液）洗淨過濾膜後，以鹼性磷酸酶標識之葡聚糖聚合物結合抗兔子多株抗體（Dako Cytomation)做為二次抗體，反應1小時。接著以洗淨液洗淨過濾膜，使用化學發光試藥 (CDP-star，Tropix)進行酵素反應，進行OPRT的檢測。該結果如圖1所示，確認本發明抗人類OPRT抗體均僅特異的識別OPRT。實施例2(藉由三明治型EL1SA法定量人類OPRT) (1)標準液係利用培養大腸菌所得之rhOPRT。該製法如下。以PCR選殖人類OPRT的全長cDNA，作成表現麩胱胺酸-S-轉移酶（GST)和rhOPRT的融合蛋白質的質體，將其導入大腸菌BL21，其在100微克/毫升的安皮西林存在下，於 109077-1010120.doc -18- 1363763 100毫升的LB培養基（和光純藥工業社製）中，於37°c震盪一晚培養。將該10毫升培養液移至裝有1升LB培養基的三角錐瓶，再於37°C培養4小時。以離心集菌後，將菌體懸浮於100毫升集菌缓衝液（50 mM Tris，8 Μ尿素，1 mM PMSF，5 mM EDTA，5 mM DTT pH7.4)後，在 4°C 緩慢攪拌30分鐘。懸浮液在4°C以超音波破碎後，以15000xg，在 4 °C進行30分鐘的離心處理。之後，以透析處理將上清液中的尿素濃度徐徐降至1M為止，進行重折疊處理，使2毫升麩胱胺酸（GSH)-瓊脂糖（Sigma公司製）流過填充的管柱，以10毫升洗淨液（20 mM Tris，1M尿素，5 mM EDTA pH7.4)洗淨。該融合蛋白添加結合有麩胱胺酸（GSH)-瓊脂糖及600U的凝血蛋白酶，於2.5 mM氣化鈣存在下，於4°C 反應一晚，切斷GST-OPRT融合蛋白的結合部位。以凝血蛋白酶及rhOPRT的混合物流過Benzamidine-Sepharose管柱，製得目的rhOPRT溶液。藉由布萊得弗（Bradford)法定量蛋白質的結果，製得14毫升濃度為20微克/毫升之 rhOPRT。 (2)抗OPRT抗體組合之比較將抗OPRT-A抗體、抗OPRT-B抗體及抗OPRT-C抗體以 0.1 mM碳酸緩衝液pH9.6調製成5.0微克/毫升，將0.1毫升分注至96孔的ELISA用測定盤，將之密封並在4°C的培育箱内進行一晚被覆，製得抗體固定化担體。以含有0.05% Tween 20的PBS(-)洗淨96孔測定盤二次後，添加0.1毫升含有0.1% BSA的PBS(-)以進行非特異吸附的阻斷。以洗淨液 109077-1010120.doc •19- 1363763 洗淨二次後，添加0.1毫升1.88毫微克/毫升濃度的rhOPRT 溶液，在室溫反應1小時。以洗淨液洗淨五次後’每孔分注0.1毫升以稀釋液（含有0.1%BSA ’ 〇.〇5% Tween2〇之 PBS㈠）稀釋成0.5微克/毫升抗OPRT-A抗體、抗OPRT-B抗體及抗OPRT抗體的過氧化酶標識抗體，在室溫反應30分鐘。以洗淨液洗淨七次後，添加0.1毫升含有丨·3毫克/毫升之鄰-伸苯基二胺及0.01%之過氧化氫水溶液與1 mM EDTA 之0.1 Μ磷酸-檸檬酸缓衝液ρΗ5.1(呈色液），在室溫暗處進行30分鐘的酵素反應。最後，添加〇.1毫升〇·1 Μ硫酸以停止反應，進行492毫微米的吸光度測定。該結果示於圖2。使用抗OPRT-B抗體時’即使是任一組合亦無法獲得極佳的吸光度。抗0PRT-A抗體及抗OPRT-C抗體的組合時’ 確認可測定最高感度的rhOPRT濃度。 (3)藉由三明治型ELISA法之人類0PRT量的定量性將抗OPRT-C抗體以0.1 mM碳酸緩衝液pH9.6調製成5.0 微克/毫升，將0.1毫升分注至96孔的ELISA用測定盤，將之密封並在4°C的培育箱内進行一晚被覆，製得抗體固定化担體。以含有Tween 20的PBS(-)洗淨96孔測定盤二次後，添加0.1毫升含有〇.l%BSA之PBS(-)，以進行非特異吸附的阻斷。以洗淨液洗淨二次後，添加〇.丨毫升調製成 0.47、0.94、1.88、3.75、7.5微微克/毫升的濃度之rhOPRT 溶液’在室溫反應1小時。以洗淨液洗淨五次後，每孔分注0.1毫升以稀釋液稀釋成0.5微克/毫升之過氧化酶標識抗體’在室溫反應30分鐘反應。以洗淨液洗淨七次後，添加 109077-1010120.doc •20- 1363763 0.1毫升含有1.3毫克/毫升之鄰-伸苯基二胺及〇·〇1%之過氧化氫水溶液與1 mM EDTA之0.1 Μ磷酸-檸檬酸緩衝液 ρΗ5.1(呈色液），在室溫暗處進行5分鐘的酵素反應。最後，添加0.1毫升0·1 Μ硫酸以停止反應，進行492毫微米的吸光度測定。該結果示於圖3。使用作為固相化抗體之抗OPRT-C抗體及使用作為檢測抗體之抗OPRT-A抗體時，確認可定量測定rhOPRT濃度，由此確立三明治型ELISA系統。

【圖式簡單說明】圖1顯示抗OPRT抗體的西方墨點法之結果。

圖2顯示用組合抗OPRT-A抗體、抗0PRT-B抗體及抗 0PRT-C抗體之二種的三明治ELISA系的結果。圖中A-B : 固相化之抗OPRT-A抗體-檢測之抗0PRT-B抗體。圖中B-A :固相化之抗OPRT-B抗體固相化-檢測之抗OPRT-A抗體。圖中B-C :固相化之抗0PRT-B抗體固相化-檢測之抗 OPRT-C抗體。圖中C-A :固相化之抗OPRT-C抗體固相化· 檢測之抗OPRT-A抗體。圖中C-B :固相化之抗OPRT-C抗體固相化-檢測之抗OPRT-B抗體。圖3顯示用OPRT-C抗體作為固定化抗體，用〇PRT-A抗體作為檢測抗體之ELISA系檢量線》 109077-1010120.doc -21- 1363763 序列表 <uo>曰商大鵬藥品工業股份有限公司 < 120 >人類乳清酸磷酸核糖轉移酶蛋白之測定方法 <130〉 <140> 095107029 <141〉2006-03-02 < 150> 2005-059221 <151〉2005-03-03 <170> Patent IN version 3.1 <210〉 1 <211〉 23 <212〉PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉根據人類OPRT所設計的肽 . <400> 1

Cys Ser Thr Asn Gin lie Pro Met Leu lie Arg Arg Lys Glu Thr Lys Asp Tyr Gly Thr Lys Arg Leu 15 10 15 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉根據人類OPRT所設計的肽 <400〉 2

Cys Leu Gly Gin Gin Tyr Asn Ser Pro Gin Glu Val lie Gly Lys Arg Gly Ser Asp lie 1 5 10 15 20 <210〉 3 <211〉 22 109077.doc 1363763 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉根據人類OPRT所設計的肽 <400〉 3

Cys lie Ser Ala Ala Asp Arg Leu Glu Ala Ala Glu Met Tyr Arg Lys Ala Ala Trp Glu Ala Tyr 15 10 15 20

V 】09077.doc

Claims

1363763

十、申請專利範圍： 1. 一種人類乳清酸磷酸核糖轉移酶蛋白質測定用套組，其係含有以下抗人類乳清酸磷酸核糖轉移酶抗體：識別包含序列號1之胺基酸序列的肽者，及識別包含序列號3之胺基酸序列的狀者。 2. 如請求項1之測定用套組，其中測定手段為三明治型 ELISA。 3. —種人類乳清酸磷酸核糖轉移酶蛋白質的測定法，其係組合使用以下抗人類乳清酸磷酸核糖轉移酶抗體：識別包含序列號1之胺基酸序列的肽者，及識別包含序列號3 之胺基酸序列的肽者。 4. 如請求項3之測定法，其中該測定手段為三明治裂 ELISA。

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