TWI235031B - Process for producing orchid seedlings by static liquid culture - Google Patents

Description

1235031 玖、發明說明·· 【發明所屬之技術領域】 發明領域 本發明係有關於一種利用靜態液體培養來生產蘭花種 5苗的方法，特別是針對蝴蝶蘭種苗，其中蘭花種子被懸浮 於一適於蘭花種子發芽生長的液態培養基内，並且於培養 開始時，培養容器中的培養基深度被設定在一預定的範圍 内。

C 先前 J 10 發明背景 蘭花（orchids)是台灣外銷花卉之一要角，特別是蝴蝶蘭 (屬名·尸，英文名：m〇th 〇rchid)，其不但為台 灣外銷排名世界第-的產品之一，在國内之盆花銷售市場 上亦是排名第-。在台灣，蝴蝶蘭的瓶苗(flask咖仙吨) 15年產量為九千萬株以上，其中有60%以上是實生苗 (seedling)。蘭花的種苗事業極具有產業發展前途，但要維 持外銷市場之優勢，種苗的組織培養技術即需不斷改進， 俾以降低成本以及提高品質。 目前在蘭花瓶苗的生產上’業者是採用固化洋菜培養基 20 (solidified agar media)。洋菜約佔培養基材料成本= 3〇-4〇% ’是培養基配方中最昂貴的成份，而且融解洋菜是 調製培養基過程中最費時的步驟。此外，對於蘭花種苗的 培育，目前業者仍以無菌播種實生苗（sterile sowing of seedUngs)為主要生產方式，但是其種苗生產流程卻多保留 1235031 傳統方式，例如：以通氣性（ventilation)不佳之玻璃瓶及橡 膠塞為培養容器、以高密度播種（high density sowing)及高 密度繼代（high density subculture)來培養實生苗等。傳統的 種苗生產流程在生產線上常會發生種苗不整齊現象，而需 5 多次分級篩選，且在繼代培養（subculture)過程中，常需丟 棄許多較小的植株，以致造成種苗之損耗以及高人力成本 的花費。因此，改善瓶苗生產流程即成為蘭花花卉產業業 者企圖降低生產成本之一重要考量因素。 另一方面，有文獻報導，當以洋菜作為凝膠物質來製備 10 固體培養基時，洋菜會影響培養基之滲透潛勢（osmotic potential)，進而影響培殖體（explant)對於養分之吸收作用 (Von Arnold and T. Eriksson (1984), Plant Cell, Tissue and 6^训以/仏^，《?:257-2以）。亦有研究指出，培殖體吸收細 胞分裂激素（cytokinin)的數量與培養基的膠體硬度呈負相 15 {Debergh，P. C. and L. J. Maene (1981)，Sci. Hort” 14:335-345; C.H. Bornmam and T.C. Vogelman (1984)， 尸/⑽/, (57/507-5/2)， 進而影響到繁殖率 (multiplication rate) 〇 對於許多花舟作物，例如玫瑰花（JE 4麖、采建#"仰从 20 “培養基物相對組織培養培殖體生長的影響”，農林學報， 44 (4): 71-77、、石偷{Douglas，G. C. (1984)，Scientia Horticulturae，24: 337-347)、操（Viseur，J. (1987)，Acta Horticulturae，212: 117-124、认 奪樹{Paques，Μ· J· et al· (1992)，Acta Horticulturae，319: 95-100、專，液後培秦智己 6 1235031 被證明其達致的培殖體繁殖率要比固體培養所達致者為 高。 但是，若植物種苗長期培養於液體培養基内，容易有玻 璃質化（vitrification)之問題產生（五❿仙e, Η· and Μ. 5 Berthouly (2002)，Plant cell，Tissue and Organ Culture，69: 2/5-237)。有許多研究亦指出，一旦培殖體形成玻璃質狀， 即很難恢復至正常態，而雖然提高培養基之硬度是使玻璃 質化培殖體恢復正常之一有效方式，這對於有些植物[諸如 朵麗蝶蘭⑽;^以)]之擬原球體（protocorm-like-body， 10 PLB)而言卻並不適用（Ζ/ζοκ Π "99从 P/训i Ce// Ι5.Ί8Ι-185)。 利用液體培養基，配合振盪、迴旋或直接提供氣體於 培養基之方式來進行植物之繁殖，最早是利用於秋海棠 {Begonia χ hiemalis){Takayama, S. et al. (1981), Plant Cell 15 尸/23^(9/.，22:4(5/-4(57)，而近十多年來在其他植物品種上亦 多有繁殖成功之研究被發表，例如：百合又Μ α/· (1991)，Automated propagation of microbulbs of lilies. In: Wasil IK (Ed.) Cell Culture and Somatic Cell Genetics of

Plants. Vol. 8:111 -131. Academic Press，Inc·)、納 1 石誤（Ziv， 20 M. et al. (1994)，Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 39:109-115 ； Lilien-Kipnis, H. et al. (1994), Plant Cell,

Tissue and Organ Culture, 39:117-194、、铱 It] (Onishi，N· et al. (1994), Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 39:137-145·, Osuga，K· et al· (1994)，Plant Cell，Tissue and 7 1235031

Organ Culture，39:125-135)以反 1 誕江（Luttman，R. et al. (1994) ，Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 39:157-1 70) 等等。 至於蘭花，有報告指出利用液體培養可以提高擬原球 5 體之分 ί 繁殖率（Adelberg，J. W. et αί.，（1992)，Amer. Orch. Soc. Bull., 61:688-695 \ Adelberg. J. W. et al. (1997)，Plant Cell Tissue Org. Cult·，33:265-271 ； Lakshmanan, P. et al. (1995) ，Plant Cell Rep·，14:510-514 ·，Young，P、S. et al. (2000)，Plant Cell，Tissue and Organ Culture, 63 : 67-72、。 10 但是，實生苗（seedling)需極力避免原球體（protocorm)之分 生（proliferation)，以免延遲葉片之分化（differentiation)或發 生植株突變而影響後代性狀分佈之評估。目前尚未有任何 研究報告，當以靜態液體懸浮播種方式來生產蘭花種苗 時，可避免玻璃質化（vitrification)以及原球體（protocorm) 1 5 的分生。 玻璃質化培殖體（vitrificated explant)的產生主要是由 培養基的水分潛勢（water potential)提高所引起，亦即培殖 體可利用的水分增加，而產生快速的不正常生長，致使培 殖體缺乏木質素（lignin)及角質層（cuticle)而呈水晶狀，且葉 20 綠素含量降低，並產生大量乙稀（P/zC and jP. (1986), Plant Cell，Tissue，and Organ Culture，6:83-94)。高 濃度的細胞分裂激素（cytokinin)以及低洋菜濃度亦會促進 玻璃質化培殖體的產生。於培養基中添加間苯三酚 (phloroglucinol)藥劑（P/za% C. 7. P. 入同 1235031 J：遂 或利用冷處理（56>x队 P, (1978)，Rapport d’Activite Compter Rendus， Gembloux， Belgique. 即./26-72 7)，雖有補救玻璃質化培殖體使其恢復正常生長 之作用，但是最好的方法是降低細胞分裂激素（cytokinin) 5 的濃度、提高洋菜用量或提高容器之氣體交換率來避免玻 璃質化培殖體的產生（Ρα叫如/抓〇，M ei α/. "9§从Αία //ori/cw/仏rae· 3/9: 95-/⑽）。在蝴蝶蘭實生瓶苗的生產上， -因不需使原球體增生，因此甚少使用·細胞分裂激素 (cytokinin)。因此，若考慮以液體培養基來培育實生瓶苗， 10 最需要考慮的是水分潛勢（water potential)與培養容器的通 氣性（ventilation)。 目刖蘭化的瓶苗生產多採用固體培養基，並以玻璃瓶 作為培養容器以及以橡膠塞打洞塞入棉花作為封口方式。 以蝴蝶蘭的實生苗生產為例，在播種後至少須經二次移 15植，歷時約一年後方可出瓶種植。因蝴蝶蘭無菌實生瓶苗 的培育自播種至出瓶，需要3至4次的勞力，約佔生產成本 之65〜70%。因此，若能簡化瓶苗生產的移植手續，甚至減 沙一至二次的移植人力費用，將可大幅降低生產成本。再 者，若可利用液體培養基來培養蘭花瓶苗，因培養基不需 2〇固化而可降低配製成本。而且利用液體培養來生產蘭花實 生苗，可使瓶苗生長整齊，更有利於在作後續的繼代處理 時進行小苗的分級，並可簡化與加速繼代處理的操作流 程，而使人工費用可以降低並提高瓶苗的品質。因此，若 能克服在液體培養時會發生的玻璃質化問題，將可大舉提 9 1235031 南蘭花瓶苗生產的競爭力。 【發明内容3 發明概要 於是，在第一個方面，本發明提供一種利用靜態液體 5 培養來生產蘭花實生苗的方法，其包括下列步驟： (a) 藉由將一適量的蘭花種子散浮於一適於蘭花種子 發芽生長的液態培養基内來製備一種子散浮液 (seed suspension)； (b) 將步驟（a)所製得的種子散浮液放入至一空培養容 10 器内，而使得自該培養容器底部算起，被放入該培 養容器内的種子散浮液具有一不超過大約丨且 足以讓每粒種子被散浮於該液態培養基内的預定 深度；以及 (c) 靜置該培養容器，以容許被散浮在該液態培養基中 15 的種子發芽長出幼苗。 ，蘭花種子可發 。而後，該幼苗 在經過本案方法步驟（C)的靜置培養後 芽長出具有第一個葉片不大於J cm的幼苗 可以下列步驟來進一步培養： (d)將步驟（c)所長出的幼苗放入一含有一適於蘭花種 力 田生長的液態培養基的培養容器内，而使得自該培 養容器底部算起，被放入該培養容器内的液態培養 基具有一不超過大約〗·6 cm且足以讓每株幼苗被 • 政浮於该液態培養基内的預定深度；以及 (e)靜置該培養容器，以容許被散浮在該液態培養基中 10 1235031 的幼苗進一步成長。 如在經過步驟(e)的靜置培養後，該由步驟（c)所長出的幼 苗成長為具有大約2個葉片的幼苗。 10 本案方法不需使用洋菜，而可直接節省30-40%之培養 科成本而且，本案方法不需加熱融解洋菜，而可簡 化培養基的配製流程，估計可節省3〇%以上之配製時間以 及加熱所需之能源。再者，因液體培養基可均勻地接觸種 ^ ’而提高種子的養分吸收效率，因此液體培養基的使用 I7可大巾田地低於固體培養基。而因為液體培養基的使用 里少，生產者可選擇扁平型容器來進行初代培養（initial ㈣叫，則培養容器可以堆疊放置，以提高培養室空間之 :用效率。另夕卜，生長在液體培養基内的種苗於進行繼代 定植時容易被操作，而可提高人工效率。 15 利用本案方法已證實所培養出的幼苗之生長要比採用 傳統的㈣培養所養出者為«、生長快速、乾鮮重比值 提南，且可縮短種苗培育期大約1.”固月以上。此外，利 用本案方法不只可簡化移植手續，由於種苗整齊，可減少 種苗移植次數’而大幅降低生產成本，且可提高種苗品質。 因^對於❹本案方法之生產者而言，將有很满 空間。 在參照以 ，將變得 本發明之上述以及其他目的、特徵與優點， 下之拍說明與較佳㈣例和隨讀附之 明顯，在圖式申： 20 1235031 t實施方式3 較佳貝她例之洋細說明（發明的詳細說明） 自年代發展以無菌播種技術生產蘭花實生苗以來， 至今其生產流程幾乎未有改進，目前仍以通氣性不佳之玻 璃瓶及橡縣作為培養容器，以洋菜鄉製成固體培養基 以及以高密度播種並經多次繼代方式來培養實生苗。但 是’傳統的蘭花實生苗播種技術所培#出的蘭苗生長不整 齊，造成在繼代培養時”進行分級並丟棄許多較小的植 株，而浪費許多資源且增加生產成本。 10 15 20 液體培養不僅可大幅降低培養基配製成本，在許多作物 亦已被證明其繁殖率及生長速率較固體培養為高。液體培 養最大的困難是如何提供植物所需之氧氣，因此，目前非 蘭花植物之液體培養多採用支揮物培養，或利用㈣、旋 轉k養’或將氧乳充人培養基中。這些方法不只設備成本 i曰加’且培養刼作繁雜。再者’這些方法常易造成一高比 例的分生苗產生，而這是非為所欲的。 為改善蘭花種苗的生產流程以及提高種苗品質，申請 人嘗試以靜置液體培養來取代傳統的固體培養，並建立懸 浮播種以及繼代埼養的模式。 蘭花的種子彳艮小而且不具有胚乳，因此在作人工培養 犄而由培養基來提供種子萌芽與生長所需要的養分。而欲 :蘭钇種子養在液體培養基中，也可能需要注意供氡問 題。申請人從事本發明的研Μ基於下面的假^:生物的 演化係起源自水中，«花種子當被播種於-水性環境中 13 1235031 時，應可適應並生存下來。於是，申請人嘗試於培養容器 内來進行蘭花種子懸浮液播種，之後將培養容器靜置於培 養架上並觀察種子的萌芽與生長情形。 在本發明的研究中，申請人發現，在初始培養（initial 5 culture)階段，蘭花種子可於無支撐物的液體培養基中發芽 及生長。申請人並發現培養基的深度會影響蘭花種子的發 育。亦即，雖然培養基的深度太高不會影響到種子發芽， 但會使已發芽的原球體產生玻璃質化；而若培養基的水位 太低，培養基會快速乾燥，而需經常補充水分，反而增加 10 操作次數。此外，當以適當的材質來封口培養容器時，適 當的培養基深度可維持種子發育至下一個培養階段的適當 大小，且相較於採用固體培養者，蘭花原球體的發育快而 整齊。因此，尋找出可使種子發芽，又不需再耗工添加水 分的適當培養基深度，即成為影響蘭花液體播種成功與否 15 的一個主要關鍵。 此外，因為液體播種所利用的培養基量遠較固體培養 基為少，因此，培養基中的養分含量亦可能成為一會影響 原球體發育的因素。依前人研究d 〇/. (7992入 important factor affecting the germination and growth of 20 Phalaenopsis seeds. The SABRAO International symposium on the impact of biological research on agricultural 户ro心w7.2/9-22(S)得知，馬鈴薯為影響蝴蝶蘭種子發 芽與生育的重要成分，可使在高·密度培養下的原球體存活 率提高，且於培養基添加馬鈴薯泥可改善擬原球體的玻璃 14 1235031 質化情形。但是，添加馬鈴薯澱粉則無此效果（Z/2C^, 7兄 (1995)，Plant Cell Rep.，15:181-185、。 但是’當配製液體培養基時，馬鈴薯泥會使培養基的 黏稠度提高而不利於操作。因此，為使蘭花種子能適於液 5體懸浮培養，申請人進一步找出適用於液體培養的播種密 度以及培養基成分，以提高存活率及降低玻璃質化情形產 生。在本發明的研究中，申請人發現蘭花原球體的生長速 率會隨播種密度的升高而減緩。 在液體播種的蘭花原球體生長至第一片葉後，申請人 10進行液體繼代培養（liquid subculture)。結果發現，採用液體 培養的幼苗之莖葉生長仍同樣比採用固體培養者快速且整 齊。亦即，利甩液體培養基自播種至子瓶定瓶，可較傳統 的固體培養方式縮短大約1 · 5個月的培養期。 於是’申請人於本發明中設計出一種利用靜態液體培 15養來生產蘭花實生苗的方法，其包括下列步驟·· U)藉由將一適量的蘭花種子散浮於一適於蘭花種子發 芽生長的液態培養基内來製備一種子散浮液； (b)將步驟（a)所製得的種子散浮液放入至一空培養容 器内，而使得自該培養容器底部算起，被放入該培 2〇 養容器内的種子散浮液具有一不超過大約1 em且 足以讓每粒種子被散浮於該液態培養基内的預定深 度；以及 (C)靜置該培養容器，以容許被散浮在該液態培養基中 的種子發芽長出幼苗。 15 1235031 依據本發明，在培養期間培養 不需進行迴旋或振盪處理。而且， 預定深度，種子可得到適當氧氣， 氧0 容器只要靜置即可，而 因為液體培養基具有一 也不用另外予以充氣供 在本發明的一個較佳具體例中 蝴蝶蘭實生苗。 本案方法被用來生產 10 適合供應詩本案方法的步驟⑷巾的液體培養基可c 為任一種輕蘭花種子發芽生長的培養基。例如，傳制 固態培養基可被採用，但省去洋菜的使用。該液體培養遵 可含有基礎鹽峨如，KnudSGn c (194㈣⑽—，L(测），Amer.orchidsoc.Bulll5:214-啊、糖分⑼如蔑 糖）以及天然成分（例如馬鈴薯泥）。常用的蘭花培養基有Μί 15 IMurashige T. and Skoog R (1962)，physi〇[ ρι福，15, 蝶蘭的播種與組織培養，洋蘭雜誌社出版 20 在本發明的一個較佳具體例中，在本案方法的步驟卬) 中所用的培養容器是-有蓋的培養皿（petridish)。 較佳地，在本案方法的步驟（…中，自該培養容器底部 异起，該培養容器内被放入的種子散浮液具有一落在大約 〇· 1-1.0 cm範圍内的預定深度。更佳地，該培養容器内被放 入的種子散浮液具有一落在大約〇1-〇6 cm範圍内的預定 深度。又更佳地，該培養容器内被放入的種子散浮液具有 一落在大約0.2-0.5 cm範圍内的預定深度。 較佳地，在本案方法的步驟（a)中所製得的種子散浮液 16 Ϊ235031 得幼苗的生長能達致更良好的狀態。 、依據本發曰月，在、經過本案方法步驟⑷的靜置培養後， 破散浮在液態培養基内的蘭花種子發芽長成具有第一個葉 片不大於1 cm的幼苗。在本發明的一個較佳具體例中，蘭 花種子經靜置培養而長出第—個葉片需時大約乃天。 依據本發明，在本案方法步驟（c)中已長出第一個葉片 的幼苗可以下列步驟來進一步培養·· ⑷將步驟⑷所長出㈣苗放入一含有一適於蘭花種 苗生長的液態培養基的培養容器内，而使得自該培 養容器底部算起’被放人該培養容器内的液態培養 基具有-不超過大約L6⑽且足以讓每株幼苗被 散浮於該液態培養基内的預定深度；以及 ⑷靜置該培養㈣，㈣料散浮㈣㈣培養基中 的幼苗進一步成長。 15 較佳地’在本案方法的步驟⑷中所用的培養容器可為 -種方型組織培養容器，例如Mag鳴ga7培養容哭。”、 μ較佳地，在本案方法的步驟⑷中，自該培養容器底部 异起’該培養容器内被放人的液態培養基具有在大約 20 範圍内的預定深度。更佳地，該培養容器内被放 入的液態培養基具有—落在大敎 殊f °又更佳地’該培養容㈣被放人的«培養基具有 一洛在大約0.3-0.8 cm範圍内的預定深度。 (d)中的液體培養基可以 基。例如，傳統的固態 適合供應用於本案方法的步驟 為任一種適於蘭花幼苗發育的培養 18 1235031 培養基可被採用，但省去洋菜的使用。該液體培養基可含 有基礎鹽類[例如，1/4MS鹽類"%2人尽 J:遂β叩叫]、糖分（例如嚴糖）以及天然成分（例如馬鈐薯 泥）。 5 較佳地，在本案方法的步驟（d)中，步驟（c)所長出的幼 苗以一落在大約1-8棵幼苗/ml培養基的範圍内的播種密度 被放入至培養容器内的液態培養基中。更佳地，該幼苗以 一洛在大約1-5棵幼苗/ml培養基的範圍内的播種密度被放 入至培養容器内的液態培養基中。 10 較佳地’在本案方法的步驟⑷中，步驟(C)所長出的幼 田可被放入至在底部不放有支撑物的培養容器内的液態培 養基中。任擇地，步驟⑷所長出的幼苗可被放入至在= 放有-支撐物（support)的培養容器内的液態培養基中。該 支撐物可為組織培養技術所慣用的基材（substrate)，例如濾 15紙、不織布、具透水膜之塑膠筏、纖維棒㈣㈤ 遠由步驟⑷所長出的幼 # 成長為具有大約2個葉片的幼 田。在本發明的_個較佳具 0Λ ^ /鄉（c)所長出的幼苗 2〇經靜置培養而成長至具有2個葉片需時大約45天。 較佳地，在本案方法的步驟⑷中 任何封口材料予以封口。因此” ^ “心又有以 蒸發而減少，而使液態培二培養基中的水分會因 -流動的水，此時幼二= J J以進仃下一階段的培 19 1235031 養’而可方便地從培養容器被移出並續行下—階段的培 ^例如將之放人至在底部放有_支撐物（supp㈣的培養 合内的液恶培養基中，或是將之定植含有固體培養基的 培養容器内。 5 因為本案方法僅採靜態液體培養，相較於傳統的固體 養方式依據本杳明所培養出蘭花幼苗幾乎都是實生苗 而^、有刀生备的產生，而且種苗生長快速又整齊，而顯著 地提高生產品質。 本發明將就下面實驗例來作進一步說明，但應瞭解的 10是"玄等貝驗例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發 明的實施之限制。 為方便說明，在下面所列舉的作為示範用的實驗例中 使用蝴蝶蘭的種子來進行各項試驗。 實驗例1·液髏培養基在培養容器内的深度、培養容器的 15 封口方式以及培養基成分對於蘭花種子的靜 態液禮培養之影響： I、植物材料： 以蝴蝶蘭(Tinny Antique X Sinica Peeress) X Sog〇 Beach]之雜交授粉4.5個月之未裂果莢為材料， 20 並以2%次氣酸鈉予以表面消毒1〇分鐘，接而以無菌水清洗 3次後剖開果莢，並將種子敲下。種子以〇·5%三苯基四唑正 離子氯化物（triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染劑於室 溫下染色24小時以確認其活性。並算出種子活性90%以上 之種子每毫克（mg)有大約500±50粒種子。於下面播種备度 20 1235031 相較於先前技術要藉由添加間苯三酚（phloroglucinol) 藥 m[Phan，C.T. and P，Hafadus (1986)，同上述（suprc^ 良 利用冷處理（如x⑽，尸.（797§入尽j：遂&吵ra))來補救玻璃 質化培殖體以使其恢復正常生長之作用，或是藉由降低細 5胞分裂激素（cytokinin)的濃度、提高洋菜用量或提高容器之 氣體交換率來避免玻璃質化培殖體的產生，本發明以培養 基深度配合封口方式，來使培養基深度緩慢下降以避免原 球體玻璃質化，這是最簡便及節省成本之方式。試驗證明 以9 cm直徑培養皿為容器時，以2〇 mi培養基來培養15 1〇種子（約750 土50粒種子），可於Μ天之培養期不需添加養 液，而可得較固體培養生長一致且生長較佳之原球體（表2)。 在含蔗糖下而無添加馬鈴薯（P1)情形下，原球體無法 轉呈綠色（圖5)，至7週則全部白化死亡；但在添加馬鈴薯無 添加蔗糖時（S1)，原球體於播種後2週，其生長趨緩且呈淡 15綠色（圖7)。此顯示蝴蝶蘭原球體需要馬鈴薯以促進葉綠體 合成，且無法以蔗糖取代。 實驗例2·中母瓶階段液碰培養： I、培養基的配製： 中母瓶培養基成分為1/4MS鹽類、蔗糖20 g/L、馬龄箸 20 33 g/L，固體培養基另加洋菜（Difco Bact〇_agar) 8 g/L。將 培養基的pH值調整為5.3，然後以殺菌釜於i2rc下滅菌i5 分鐘。 26 1235031 IT、ό式驗方法： 5 將液體播種培養之原球體，於發育至第一片葉片發育 前期（約75天）時，以Magenta GA7為容器，分別進行無支撐 物及不同支撐物之中母瓶階段液體培養培養。並以傳統三 角瓶固體培養基作為對照組，處理組別如表3所示，每處理 3重複。分別於培養45天與75天時，調查其葉片與根之生育 情形。並於培養45天時，將1^與8處理之其中一瓶之小植株 疋瓶至固體培養基，其餘繼續培養至75天時，隨機取25株 小植株測其鮮重，在於6〇它烘箱處理48小時後，測其乾重。 10

培養容器 支撐物 培養基量（ml) 原球體數 GA7 GA7 600mi玻璃三角瓶 塑膠筏不織布舖棉紙 洋菜 ^ η Λ Λ

利用液體培養基進行不同處理之中母瓶繼代培養，經 15 45天結果如表4所示，以液體培養之平均葉數、第一片葉長 與第二片葉長皆較固體培養為高。無支撑物之液體培養 (L1、L2)多數已具有2片葉，且葉片長度較有支撐物⑽、 LN)為長。根數則以不織布舖棉紙為支撐物者最多，根長則 以塑膠筏為支撐物者最長。此時將乙邮處理之小植株定瓶 月後’則其生長勢之差異更趨明顯 至固體培養基，經一個 (圖9至11)。 27 20 1235031 於中母瓶培養75天後，液體培養者之葉片生育亦較固 體培養為佳（表5)。其中L1處理多數已有3片葉，且植株之 鮮重、乾重與乾重/鮮重比值最高，生育最佳，但其根長與 有支撐物培養者無差異。至於L2處理根數最少、根長度亦 最短，其葉片長度雖與有支撐物培養者無顯著差異，但植 株葉片變厚而根呈褐黑色。 10 表4·中母瓶繼代培養45天後之小植株生育情形 虛T田 葉片數（％) 葉長（mmΊ ''根數 根長 -----— 未長葉 具1片葉 具2片葉 第1片 L1 2.5 12.5 85 4.6 be* 3 ^ 0 (mm) J , J 3, 0.43 b 3.9 ab L2 7.5 16.3 76.2 5.4 a 3.1 a 0-43 b 2.8 b LR 0 72.2 27.8 4.4 c 2.4 b 0.45 b 5.1 a LN 0 97.2 2.8 5.1 ab 2 7 u 0.75 a 4.1 ab S 23 75 2 2.5 d 1.0 c 0.43 h λ h :出現在同一 橫行内的英文字母係表示藉由杜肯^笳圊埒：-

以液體懸浮播種75天後之原球體，進行中母瓶繼代培 養’經45天之培養結果，㈣料處理者之葉片皆比固體 培養者生長快速Ρ致，且植株皆無化現象發生， 且以無支撐物之液體培養較有支撐物者為佳（表4)，證明無 28 15 1235031 支揮物之液體繼代培養之可行性。在無支撐物處理中，原 球體可浮於液面上，且液面降低速率較有支撐者為快，可 能為防止玻璃質化產生之主要因素。且其整株植株與培養 基接觸，可增加培養基之吸收面積，而加速其生長。 5 以與1^2處理於培養45天後，生長無明顯差異，但是經 天後L2之生長明顯較慢（表5)，且葉片變厚及根變黑， 而培養基亦有褐變情形。此可能因為隨著葉片之生長，對 氧之需求量提高，但在L2處理因培養之株數較多，部分植 株無法浮於液面，造成缺氧及產生乙烤及齡類化合物，使 1〇植株生長異常。因此蝴蝶蘭無支撐物之液體培養，液體表 面積大小對植株之生長之影響可能較水位更重要。而以塑 膠筏為支撐物，經75天培養後有較多及較長之根（表5)，因 為75天後培養基之液面會降低至透水膜以下，可能因此促 使植株根之生長。 在L1處理中，培養45天後培養基已近乾燥，此時再添 加培養基雖可得最佳之生長，但是較費工。而將其繼代至 子瓶固態培養基30天後，其生長勢明顯優於固體培養者（圖 8)。因此，建議以無支撐物液體培養45天之小植株即進行 疋瓶，可不需再添加培養基及避免培養基褐化，且可得最 20 佳之瓶苗生長勢。 圖9至圖11則進一步顯示分別顯示在圖8中所示的經 天繼代培養的蝴蝶蘭培殖體（explant)被定植於固體培養基 30天、60天與120天後的生長情形。 上述實驗顯示，將液體播種75天之原球體，以GA7為 29 1235031 合為，進行有或無支撐物之液體繼代培養。結果液體培養 之至葉生長皆較固體培養快速，但有支撐物之液體培養根 系較多且長。無支撐物之液體培養則以2〇ml培養基置入36 個原球體之生長最佳且整齊。利用液體培養基自播種至子 5瓶定瓶，可較傳統固體培養縮短約1.5個月之培養期。 清楚可見地，在本發明中，利用液體懸浮播種及中母 瓿階段液體繼代培養，可提高培殖體的生長速率以及乾重/ 鮮重比值。經估計，依據本發明的靜態液體培養方法，相 較於傳統玻璃三角瓶之固體培養，可節省大約45天以上的 10 培養期，而證明液體培養在此二階段之可行性。 於本案說明書中被引述之所有文獻資料以其整體被併 入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案的詳細說明（包 含界定在内）將佔上風。 雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地 15在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變 化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範 圍所示者之限制。 【圖式簡單說明】 圖1顯示蝴蝶蘭種子以固體培養基播種與液體培養基 20播種60天後的原球體生長情形，其中左方為固體培養基對 照組，右方為依據本發明採靜態液體培養的實驗組； 圖2顯示不同播種密度對蝴蝶蘭原球體生長的影響； 圖3顯示蝴蝶蘭種子以液體培養基播種，並以封口材料 來封口培養皿，在靜置培養50天後的原球體生長情形。其 30

Claims (1)

1. y° 拾、申請專利範圍： 1· 一種利用靜態液體培養來生產蘭花實生苗的方法 下列步驟： 开匕枯 ⑷藉由將-適量的蘭絲子散浮於—較蘭花種子發芽 生長的液態培養基内來製備_種子散浮液. 10

   ㈨將步尋)所製備_子散料m空培養容器 而使付自該培養容^底部算起被放人該培養容器 内的種子散浮液具有一不超過大約lem且足以讓每粒 種子被散*於該液態培養基内的預定深度；以及 ⑷靜置該培養容器，以容許被散浮在該㈣培養基中 子發芽長出幼苗。 2. T申請專利範圍第1項的方法，其被用來生產蝴蝶蘭實生 苗。 3·如申请專利範圍第i項的方法，其中在步驟⑻中所用的培 養容器是一有蓋的培養皿。

   4.如申請專利範圍帛Μ的方法，其中在步驟(b)中，自該培 養容器底部算起，該培養容器内被放入的種子散浮液具有 一落在大約0·Μ·〇 cm範圍内的預定深度。 5·如申請專利範圍第i項的方法，其中在步驟(a)中被製得的 種子散浮液具有一不超過113土9粒種子/ml培養基的播種密 度0 6.如申請專利範圍第1項的方法，其中在步驟(b)與步驟(〇之 間進行一個使用一封口材料來封口該培養容器的額外步 驟’以減緩被放入該培養容器中的種子散浮液的水分蒸發。 32 nM^ 7·如申請專利範圍第6項的方法，其中該額外步驟中所使用 的封口材料是選自於：石蠟膜(paraffin film)、透氣膠帶以 及此等的組合。 5 15 20 8·如申請專利範圍第1項的方法，其尹在經過步騍(c)的靜置 培養後，被散浮在液態培養基内的蘭花種子發芽長成具有 第一個葉片不大於1 cm的幼苗。 9.如申請專利範圍第8項的方法，其中在步驟(〇所長出的幼 苗進一步以下列步驟來培養： ⑷將步驟⑷所長出的幼苗放人-含有—適於蘭花種苗生 長的液態培養基的培養容器内，而使得自該培養容器 底部算起，被放入該培養容器内的液態培養基具有一 ^大約1.6 em且足以讓每株幼苗被散浮於該液態 培養基内的預定深度；以及 k)靜置該培養容器，以容 幼苗進_步成長。4破政洋在該液態培養基中的 1〇.如申請專利範圍第9項的方法， ^ . “中在步驟(d)中，自該培 養谷益底邛异起，該培養 鬥破放入的液態培養基具有 洛在大約咖.5cm範圍内的預定深度。 •如申凊專利範圍第9項的方法 培養|4 + + 、 再中在經過步驟(e)的靜置 。養傻該由步驟⑷所長出 片的幼苗。 約田成長為具有大約2個葉

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