TWI234585B - HURP gene as a molecular marker for bladder cancer - Google Patents

Description

1234585 玖、發明說明 (發明說明應敘明··發明所屬之技術領域、先前技術、内容、實施方式及圖式簡單說明） 【發明所屬之技術領域3 發明領域 本發明係有關於一種人類肝癌上升-調節的蛋白質 5 (HURP)基因在一人類個體體内的膀胱癌之偵測、初步篩選 與監測中作為一分子標記之使用，其中，自一被懷疑具有 膀胱癌的個體所取得之一樣品内所偵測到的人類HURP基 因之表現，是為有膀胱癌存在之表徵。本發明因此提供一 種用於偵測一人類個體體内的膀胱癌，特別是膀胱移形上 10 皮癌（TCC)的有效方法。本發明進一步提供一種具高精確 性與方便性之用於偵測、初步篩選與監測一被懷疑的個體 體内之泌尿（udnary) TCC的非侵襲性方法，其中一個取自 一被懷疑的人類個體之尿液樣品被分析以檢測該人類 HURP基因的表現，該基因表現之存在係為有泌尿TCC存 15 在之表徵。 t 相關技藝的描述 泌尿上皮癌（urothelial carcinoma)是泌尿道之第二最常 見的惡性腫瘤，並在所有泌尿道腫瘤當中位居第二名的死 20 浪[Konety BR and Getzenberg RH: Urine based markers of urological malignancy. J Urol 165: 600-611，2001) 〇 商敗之 移形上皮癌（TCC)與90%以上的泌尿上皮贅生物有關，且 其表示具有低度惡性潛質的乳突狀表面損害或是會為侵襲 性與致死性的高度腫瘤。當膀胱癌在一局部化階段被I期 1234585 玖、發明說明 檢測出時，5年的存活率為94%。一旦該疾病已區域性地 或遠端地擴散時，五年的存活率會分別地掉落至49%與6% {Droller MJ: Individualizing the approach to invasive bladder cancer. Contemp. Urol, July/August, pp, 54-61, 5 7990)。因此，在癌細胞有時間去改變其行為而成為有侵襲 性之前檢測出表層癌的復發之早期現象，是為重要的。 在經排定的追蹤處理程序下之傳統細胞學與細胞鏡檢 ’係為用於帶有泌尿τ c C之病患的監視之主要方法。對於 低程度腫瘤使用被排泄出的尿之細胞學的低敏感性，需要 10到非侵襲性的細胞鏡檢之經常使用，因而在細胞鏡檢期間 引發由尿道器械所致之有關聯的不舒服以及感染的潛在危 險性。一種在早期階段能特別地檢測出膀胱癌之敏感的非 铋襲性檢驗試驗的發展，會經由較早開始治療而改善臨床 上的結果。

15 發明名稱為“用於檢測癌症之方法與探針組，，之US 6,376，188、發明名稱為“用於檢測尿液中的核酸序列之方法 ’’之0，251，638以及發明名稱為“用於保護尿液中的核酸 序列之方法，，之US 6,287,820已各別地揭示使用由染色體探 針所構成之組來檢測一尿液樣品之膀胱癌檢驗。 1〇 發明名稱為‘‘比較性基因體雜合（CGH)，，之US 6,335，167 揭示藉由檢測核酸序列複本數目之膀胱癌檢驗，特別是偵 測一測試樣品内一獨特序列在至少一個擇自於下列群組中 的位置的擴增·人類第8染色體之q2 i、人類第^ 3染色體 之q31-qter、人類第7染色體之pl5__、人類第8染色體 1234585 玖、發明說明 之q24-qter、人類第η染色體之cenpi3以及人類第9染 色體之ql3-qter。 在發明名稱為“用於檢測細胞增殖性障礙之方法，，之us 6,291，163專利案揭示藉由偵測核酸序列來檢驗一個體體内 5之癌症（包含膀胱癌）與前期癌性，其特徵在於下列步驟·· ⑻在-對於該個體而言是為異種胚子之基因位置處擴增試 驗樣品DNA，其中該基因位置包含有第_與第二對偶基因 ，該基因位置包含有微衛星麵，其中該試驗樣品麵 係來自於一流入至該試驗樣品内之器官的細胞，其中該試 10驗樣品係擇自於該個體之包含下列的群組：尿液、痰、膽 汁、糞便、唾液、淚液、血清與血漿；以及0)藉由比較 存在於該第一對偶基因處的微衛星DNA的位準相對於存在 於該第二對偶基因處的微衛星腿之位準來檢測該基因位 置處之一對偶基因不平衡，其中有一對偶基因不平衡係為 15有癌症或是前期-癌性之表徵。 發明名稱為“用於尿液樣品中的膀胱癌早期檢驗之方法 與裝置之WO 01/86288揭示一種用於一尿液樣品的膀胱 癌早期才欢驗之方法，其包含一將萃取自存在於尿液内的細 胞之RNA加以擴增的步驟，此係藉由使用一用於染色體端 20粒酶的催化組份之訊息RNA之標記、一用於&肌動蛋白以 證明RNA之易取得性與作為定量評估之標準，並組合以至 少一擇自於下列群組中之額外標記：一用於一屬於細胞角 蛋白家族之蛋白質之標記，以及一適用於檢測與贅生性浸 潤有關的發炎細胞之淋巴細胞標記；以及一用以檢測被擴 1234585 玖、發明說明 增的物質之最終步驟。 發明名稱為“癌症之檢驗與治療”之W0 99/63110揭示 一種用於檢驗一人類病患之膀胱癌之方法，其包含下列步 驟：⑴自一病患之膀胱，較佳地是從尿道上皮（urothelium) 5 ，取得一含有核酸及/或蛋白質之樣品；以及（ii)檢測該樣 品是否含有一與膀胱癌有關之Pax 5核酸或蛋白質。 在發明名稱為：“膀胱之移形上皮癌的生物標記”之 W0 02/27329揭示可被使用作為膀胱移形上皮癌（TCC)檢驗 之一輔佐物的蛋白質標記、方法與套組，該案使用有差別 10 地存在於TCC病患之樣品與一對照組（例如測不到有TCC 之個體）内之標記。 US 6,335,170揭示一種用於檢測一尿道上皮或膀胱癌 細胞之表現形式的方法，其包含：偵測一含有尿道上皮或 膀胱癌細胞之樣品内的一或多個基因之表現，藉此，一第 15 一態樣之表現被形成；將該第一態樣之表現扣除掉一第二 態樣之表現，其中該第二態樣係藉由使用該一或多個基因 以及一包含主要為皮下黏膜、平滑肌或結締組織細胞之樣 品而被形成，該扣除步驟形成一反映出尿道上皮或膀胱癌 細胞之表現的第三態樣之表現，而與存在於該樣品内的皮 20 下黏膜、平滑肌或結締組織細胞之比例無涉。 其他針對膀胱癌的相關研究包含：Konety BR and Getzenberg RH: Urine based markers of urological malignancy. J Urol 165: 600-611, 2001; Droller MJ: Individualizing the approach to invasive bladder cancer. Contemp. Urol.， 1234585 玖、發明說明

July/August, pp. 54-61, 1990; Nomura N, Miyajima N, Sazuka T, et al: Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. I. The coding sequences of 40 new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by analysis of randomly sampled cDNA 5 clones from human immature myeloid cell line KG-1. DNA Res 1: 27-35, 1994; Bassal S, Nomura N， Venter D， et al:

Characterization of a novel human cell-cycle-regulated homologue of Drosophila dlgl. Genomics 77: 5-7，2001; Ellis WJ, Blumenstein BA, Ishak LM，et al: Clinical evaluation of the 10 BTA TRAK assay and comparison to voided urine cytology and the Bard BTA test in patients with recurrent bladder tumors. The Multi Center Study Group. Urology 50: 882-887, 1997; Sarosdy MF? Hudson MA, Ellis WJ, et al: Improved detection of recurrent bladder cancer using the Bard BTA stat Test. Urology 50: 349-15 353, 1997; Seripa D, Parrella P, Gallucci M? et al: Sensitive detection of transitional cell carcinoma of the bladder by microsatellite analysis of cells exfoliated in urine. Int J Cancer 95: 364-369, 2001; Ponsky LE, Sharma S，Pandrangi L，et al: Screening and monitoring for bladder cancer: refining the use of 20 NMP22. J Urol 166: 75-78, 2001; Konety BR，Nguyen TS，Dhir R, et al: Detection of bladder cancer using a novel nuclear matrix protein, BLCA-4. Clin Cancer Res 6: 2618-2625, 2000; Rotem D, Cassel A, Lindenfeld N, et al: Urinary cytokeratin 20 as a marker for transitional cell carcinoma. Eur Urol 37: 601-604, 2000; 10 1234585 玖、發明說明

Sanchez-Carbayo M? Urrutia M, Gonzalez de Buitrago JM? et al: Evaluation of two new urinary tumor markers: bladder tumor fibronectin and cytokeratin 18 for the diagnosis of bladder cancer. Clin Cancer Res. 6: 3585-3594, 2000; Sanchez-Carbayo 5 M, Urrutia M, Silva JM, et al: Urinary tissue polypeptide-specific antigen for the diagnosis of bladder cancer. Urology 55: 526-532, 2000; Smith SD? Wheeler MA, Plescia J, et al: Urine detection of survivin and diagnosis of bladder cancer. JAMA 285: 324-328, 2001。 10 不論如何，就申請人之所知，以上所引述的文獻資料 沒有一者曾報導過一 HURP基因在膀胱癌或泌尿上皮癌中 之表現。申請人驚奇地發現，TCC組織樣品展現HURP mRNA轉錄品之可重複且顯著性的表現。根據此一發現， 是有可能藉由分析一人類HURP基因在一生物性樣品（例如 15 腫瘤組織與被排洩出之尿液）中的表現，來發展出一用於偵 測、初步篩檢或監測一人類個體體内之膀胱癌的精確、方 便與非侵襲性方法。 L發明内容3 發明概要 2〇 因此，在本發明的第一方面，本發明提供一種用於檢 測一人類個體體内的膀胱癌之方法，其包含下列步驟： 自一被懷疑具有膀胱癌的個體取得一生物性樣品；以 及 偵測一人類肝癌上升-調節的蛋白質（HURP)基因於該 1234585 玖、發明說明 樣品内的表現，該人類HURP基因被偵測到的表現是為有 膀胱癌存在之表徵。 在第二方面，本發明提供一種用於監測一人類個體體 内的膀胱癌之方法，其包含下列步驟： 5 疋期地自一被懷疑具有膀胱癌的個體取得一生物性樣 品；以及 、 偵測一人類HURP基因於該樣品内的表現，該人類 HURP基因被偵測到的表現是為有膀胱癌存在之表徵。 鲁 在一第二方面，本發明提供一種用於偵測一人類個體 體内的膀胱癌之引子組’其包含一具有一擇自於序列辨識 編號:2與序列辨識編號:4中所述序列的核誓酸序列之順向 引子，以及一具有一擇自於序列辨識編號·3與序列辨識編 號:5中所述序列的核苷酸序列之反向引子。 在一第四方面，本發明提供一種用於偵測一人類個體 15體内的膀胱癌之檢驗套組，其包含至少一個具有一順向引 子與-反向引子的引子對，各個引子具有一核苔酸序列t · 雜合至一具有一核；酸序列對應於序列辨識編號：丨的人類 HURP基因的至少丨3個核苷酸。 -· 本無明之上述以及其他目的、特徵與優點在參照以下 〜 20之詳細說明與較佳實施例和隨文檢附之圖式後會變為明顯 可知，其中： 圖式簡單說明 第1圖顯示人類HURp基因的核苷酸序列的全長（序列 辨識編说：1) ’其中互補於四個根據本發明所設計的引子之 12 1234585 玖、發明說明 核苷酸序列被劃底線以及以粗體顯示； 第2圖顯示一被使用於下述實施例中之載體pET32a (Novagen Inc.)的限制圖譜，其中5am// I的限制位址被使 用來插入該人類HURP基因之一全長核苷酸序列； 5 第3A與3B圖各別地顯示在TCC組織中的HURP與 冷-肌動蛋白之反轉錄酶聚合酶連鎖反應（RT-PCR)分析， 其中N=腫瘤鄰近組織，T=腫瘤組織，以及294、306、307 、315、317、319、320、321、322、327、335 與 337 =病患 編號； 10 第4圖顯示5個取自於良性攝護腺肥大症病患之攝護 腺泌尿上皮樣品中的人類HURP基因表現的RT-PCR分析 ，其中左半部係為β-肌動蛋白（307 bp)，右半部為 HURP(370 bp) ; Nl、N2、N3、N4 與 N5 = 5 個良性攝護腺 肥大症（BPH)樣品；NC=負對照組；以及Μ表示呈鹼基對 15 之分子量標記；以及 第5Α與5Β圖各別顯示被排洩出之尿液（void urine)樣 品中之HURP與β-肌動蛋白之RT-PCR分析，其中2、6、 7、8、14、15、20、5、10、11、12、13、16 與 18=病患編 號；NC=負對照組；以及Μ表示呈鹼基對之分子量標記。 20 【實施方式】 發明之詳細說明 於細胞週期調控與凋亡（apoptosis)中所涉及的基因與 蛋白質已被發現在癌症的發展上是重要的。對於會控制細 胞週期與凋亡的細胞之組份的確認，在本技藝中存在有一 13 1234585 玖、發明說明 持續性需要。 具有一如序列辨識編號:1令所据述的全長核誓酸序列 之人類肝癌上升-調節的蛋白f (HURp)基因_Βι寄存編 5 10 號侧7祕）首先為周成功等人於肝癌研究中被確認是一 涉及細胞生長的新穎癌症·相關基因。在周成功的肝細胞癌 症研究中，從有關於特別是存在於人類啦組織的cDNA 存庫中的新穎基因以及與在微陣職料庫中之細胞週期依 賴型表現之研究’-個新穎的細胞週期調控基因（c陶被 鑑定出是為肝癌上升-調節的蛋白質（HURp)基因⑽⑽等人 ，論文手稿被送件以供發表）。 令人驚if地’中請人首次發現到人類HURp基因對於 膀胱癌可作為-種有力的分子標記，並且可以將人類 HURP基@使用於—錢襲性膀胱檢驗喊，収以敏感 地檢測低程度的膀胱腫瘤並特別的排除掉大部分的非癌症 15 或是臨床上非具意義之病患。 根據本發明，此處提供一種用於偵測、初步篩選或監 測一人類個體體内的膀胱癌，其包含下列步驟： 自一被懷疑具有膀胱癌的個體取得一生物性樣品；以 及 偵測一人類肝癌上升-調節的蛋白質（HlJRP)基因於該 樣品内的表現，該人類HURP基因被偵測到的表現是為有 膀胱癌存在之表徵。 本案方法可被應用於膀胱的移形上皮癌（TCC)之彳貞測 、初步篩選或監測。 14 1234585 玖、發明說明 較佳地，本案方法係使用一個包含有擇自於下列群組 中之細胞的生物性樣品來進行：泌尿上皮癌細胞、膀胱癌 細胞或此二者之一組合。 較佳地，該生物性樣品係擇自於由下列所構成之群組 5 :尿液、泌尿上皮生物檢體、金液、血漿與血清。在本發 明之一較佳具體例中，該生物性樣品係為尿液。

該人類HURP基因具有一如第1圖與序列辨識編號：1 中所描述之核苷酸序列，而根據該核苷酸序列，可雜合至 一人類HURP基因的至少13個核苷酸的寡核苷酸可被設計 10 用來當作一個使用生物技術領域所熟知的傳統方法學來偵 測該基因的表現之檢驗探針或引子。 作為一示範例，參照第1圖，申請人已設計出4個可 用於本案用於偵測膀胱癌的方法中之引子，其包含： 第一引子對： 15 順向引子 l->5’-ggatccaatagacactttggtttg-3’ （序列辨識編號:2)

反向引子 l-^’-ggatcccacctttccttctggttd (序列辨識編號:3) 第二引子對： 順向引子2—5’-caacgaaaacagatgctc-3’ （序列辨識編號:4) 反向引子 2->5’-tgagtagctgatcgagtc-3’ （序列辨識編號:5) 20 被預期的是，該順向引子1可與該反向引子2配對， 且該順向引子2可與該反向引子1配對。 根據本發明，人類HURP基因的表現是藉由一來自人 類HURP基因的mRNA轉錄品或一由人類HURP基因t 15 1234585 玖、發明說明 mRNA轉錄品所轉譯出的蛋白質之分析而被檢測。 由人類HURP基因之mRNA轉錄品所轉譯出的蛋白質 之檢測，可藉由使用生物技術領域所熟知的傳統方法學而 被進行。 5 在本發明之一較佳實施例中，人類HURP基因表現的 檢測是藉由檢測該生物性樣品内的人類HURP基因之 mRNA轉錄品的存在而被進行。

較佳地，人類HURP基因之mRNA轉錄品的存在係使 用下列方法學中之至少一者而被進行：雜合、循環探針反 10 應（cycling probe reaction)、聚合峰連鎖反應（PCR)、巢式 PCR、反轉錄酶聚合酶連鎖反應（RT-PCR)、多重PCR聚合 酶連鎖反應-單股構造多形性、連接酶連鎖反應（LCR)，以 限制片段長度多形性核酸序列為主之擴增反應（NASBA)， 以及轉錄-調節的擴增反應（TMA)。 15 在本發明之一較佳實施例中，人類HURP基因之

mRNA轉錄品的存在之檢測係使用RT-PCR而被進行。 在本發明之一較佳實施例中，人類HURP基因的 mRNA轉錄品的存在之檢測係藉由下列步驟而被進行： (a)自該生物樣品萃取出總RNA ; 20 (b)將源自步驟（a)之被萃取的RNA引至一種使用至 少一個具有一順向引子與一反向引子的引子對的 反轉錄聚合酶連鎖反應（RT-PCR)處理，各個引子 具有一核苷酸序列會雜合至一具有一核苷酸序列 對應於序列辨識編號：1的人類HURP基因的至少 16 1234585 玖、發明說明 13個核；酸；以及 (c)偵測是否有一具有一核苷酸序列相同於或互補於 該人類HURP基因的核苷酸序列之一部分的RT-PCR產物已從步驟（1^之RT-PCr處理被生成，該 5 RT-PCR產物之存在是為有膀胱癌存在之表徵。 較佳地，被使用於步驟（b)中的每一個引子會雜合至人 類HURP基因的至少丨8個核苷酸。 較佳地，被使用於步驟（b)中的該至少一個引子對包含 一具有一擇自於序列辨識編號:2與序列辨識編號:4中所述 10序列的核苷酸序列之順向引子，以及一具有一擇自於序列 辨識編號:3與序列辨識編號：5中所述序列的核苔酸序列之 反向引子。 較佳地，被使用於步驟（b)中的該至少一個引子對具有 一對應於序列辨識編號:4的核苔酸序列之順向引子，以及

15 一具有-對應於序列辨識編號:5 _誓酸序列之反向引子 〇 在本發明之—較佳實施财，步驟⑻中的RT-PCR處 理包3 . 一個使用一第一引子對的第-擴增反應，該第-引子對具有—個具有—對應於序列辨識編號的核苔酸序 列之第-順向引子以及—個具有—對應於序列辨識編號 的核苔酸序列之第一反向引子；以及一個使用一第二引子 對的第二擴增反應，該第二引子對具有_個具有—對應於 序列辨識編號:4的核苔酸序列之第二順向引子以及一個具 17 20 1234585 玖、發明說明 反向引子 有一對應於序列辨識編號:5的核㈣序列之第二 粑據本發明，此處提供一 沾炉扯广 谓，則一人類個體體内 的膀胱癌之引子組，其包 且 八有擇自於序列辨識編號 • Γ序列辨識編號:4中所述序列的㈣醆序列之順向引子 中^:具有—擇自於序列辨識編號:3與序列辨識編號:5 中所4序列的㈣酸序列之反向引子。 在本發明之-較佳實施例中，該順向弓i子具有如序列 辨識編號:2巾所描述之㈣酸序列。 10 15 在本發明之-較佳實施例中，該順向引子具有如序列 辨識編號:4巾所描述之㈣酸序列。 在本發明的-較佳實施例中，該反向引子具有如序列 辨識編號:4中所描述之核苗酸序列。 在本發明的一較佳實施例中，該反向引子具有如序列 辨識編號_·5中所描述之核誓酸序列。 根據本兔明’此處提供一種用於偵測一人類個體體内 的膀胱癌之檢驗套組，其包含至少一個具有一順向引子與 -反向引子的引子對’各個引子具有一核？酸序列會雜合 至具有一核誓酸序列對應於序列辨識編號：i的人類 HURP基因的至少13個核苔酸。 在本發明之另一較佳實施例中，該檢驗套組包含一個 具有一對應於序列辨識編號:2的核苔酸序列之第一順向引 子以及一具有一對應於序列辨識編號:3的核苔酸序列之第 18 20 1234585 玖、發明說明 一反向引子的第一引子對，以及一個具有一對應於序列辨 識編5虎:4的核苔酸序列之弟二順向引子以及一具有^一對鹿 於序列辨識編號：5的核苔酸序列之第二反向引子的第二引 子對。 5 除了上述之外，那些熟知此項技術人士會瞭解，落在 本發明之範圍内的各種不同應用包括使用任一種形式的評 估分析。 例如，RNA與蛋白質可使用本技藝所知之技術從一 試驗樣品而被分離與分析。例如，他們可由新鮮或是經冷 10凍之生物檢體、被福馬林固定之組織，以及諸如血液、血 漿、血清、尿液或唾液之體液而被分離。 雖可使用RT-PCR，其他技術也被預期。這些包含其 他用於分析特定的mRNA物種之技術，包括pcr、巢式 PCR、在原位雜交、北方點墨法、高密度表現陣列、微陣 15列’·還有用於分析特定蛋白質產物之技術，例如酵素連結 免疫吸附法（ELISA)、西方氏點墨法與酵素分析。 本發明將參照下面實施例來作更詳細的說明，該等實 施例僅是為例示說明之目的，而不應被解釋為本發明的範 圍之限制。 20實施例i:hurp基因表現的RT_PCR分析 實驗材料與方法 病患特徵 8〇個取自尿道的TCC樣品係藉由於1998年3月至 19 1234585 玖、發明說明 2001年9月間在奇美醫學中心所做的膀胱切除術與尿道 腫瘤切除術而被獲得。遠端的總體正常組織亦被取得以供 分析，且其等被當作是腫瘤-鄰近組織樣品。所有的組織 樣品被冷凍於液態氮内並於-86°C下被存放了不同的時段 5 。各個冷凍塊的代表性部分被包埋於石蠟内並以蘇木素-伊紅來染色，並由一病理學家來檢閱以評估樣品内的腫瘤 階段。 所有標本係使用世界衛生組織之一修正來分級，而病 理學階段係根據TNM病理學階段系統如>7 //, 10 MB, Reuter VRf et al: The World Health Organization /International Society of Urological Pathology consensus classification of urothelial (transitional cell) neoplasms of the urinary bladder. Bladder Consensus Conference Committee. Am J Surg Pathol 22: 1435-1448, 1998; and 15 Chisholm GD, Hindmarsh JR, Howatson AG, et al: TNM (1978) in bladder cancer: use and abuse. Br J Urol 52: 500-505, 1980) 〇 膀胱腫瘤的階段係顯示該腫瘤已侵入多深。表層腫瘤 被稱為Ta，而T1-4被使用來描述侵入至肌肉内的增高程 20 度。一膀胱腫瘤的分級係以I-IV (1-4)級的尺度來表示。 該分級反應出細胞的細胞學表徵，其中，級數I的細胞幾 乎是正常的，級數II的細胞有些異常，級數III的細胞明 顯地不正常，而級數IV的細胞是高度的不正常。 20 1234585 玖、發明說明 RNA分離 總體RNA係使用Ultraspec™ RNA分離系統（Biotecx Laboratories Inc.，Houston，Texas)而自被冷凍的組織標本 或尿液沉澱物中被分離出。在一手持的玻璃-鐵氟龍試管 5 中，大約0.5-1.0公克的組織於1 ml的Ultraspec™試劑中 被均質化。在均質化之後，均質物被儲存於4°C嚇歷時5 分鐘，然後以0.2 ml之氯仿予以萃取，接著以12,000 g (4 °C)予以離心歷時15分鐘。水層中的RNA以一等體積的 異丙醇予以沉澱，並以75%酒精清洗兩次。RNA的含量 10 藉由分光光度測定法來估算（在A260下測得之1個OD值 等於40 # g/ml的RNA)，且萃取物的純度係使用 A260/280之比值來估算，而在所有的情況下是大於1.75 。為收集尿液，於病人一天中的第一次排泄時取得50 ml 乾淨尿液。樣品於3,000 g (4°C)下離心歷時20分鐘，細 15 胞沉殿物以1 ml之Ultraspec™試劑予以混合，並使用相 同於上述之方法來作萃取。 反轉錄酶-聚合誨連鎮反應

單股互補DNA (cDNA)係於42°C下使用1 μΐ的 Superscript II 反轉錄酶(Life Technologies Inc., 20 Gaithersburg，MD)以 〇lig〇-dT 首次接觸法（priming)來處理 以1 pg的總體RNA歷時50分鐘。於70°C下加熱15分鐘 後，一個第一擴增反應係使用含有下列之Taq聚合酶緩衝 液來進行：1/10體積之經反轉錄的RNA，200 μπιοΙ/L 21 1234585 玖、發明說明 dNTPs、1 U DyNAzyme™ II DNA 聚合酶以及 10 fl Μ 的 各 個人類 HURP 基 因引子 [5’-GGATCCAATAGACACTTTGGTTTG-3’(順向）與 5’-GGATCCCACCTTTCCTTCTGGTTC-3,(反向）]，並在 94〇C 下 5 進行反應變性達1分鐘，於55°C下進行退火歷時1分鐘 ，以及於72°C下進行延長反應歷時1分鐘，作30次循環 ，繼而於72°C下進行培育歷時5分鐘。 對於尿液標本的巢式PCR，1/10的第一擴增產物被引 至一使用巢式 HURP 引子 5，-CAACGAAAACAGATGCTC-10 3’（順向）與 5’-TGAGTAGCTGATCGAGTC-3’（反向）的第二 回的擴增反應，並在94°C下進行變性反應歷時1分鐘， 於60°C下進行退火歷時1分鐘，以及於72°C下進行延長 反應歷時1分鐘，作30次循環，繼而於72°C進行培育歷 時5分鐘。 15 以不具反轉錄酶（RT)作為一模版之例行的RT-PCR對 照組係為一負控組，而以藉由將一個全長HURP核苷酸序 列插入至pET32a(+)載體（得自於Novagen Inc.)而被構建成 如第2圖所示之pET32a-HURP作為一模板者是為正對照 組。經擴增的產物與0.1吨GeneRuler™ 100bp DNA階梯 20 標記（MBI Fermentas，Lithuania)於一 1.5%的瓊脂糖凝膠中 使用電泳法予以分離，並使用溴化乙錠染色以作視觀。 數據的定量與標準化 為定量HURP基因的mRNA表現位準，所有膠片以 1234585 玖、發明說明

Image Master™ VDS 視訊影像系統（Amersham Pharmacia

Biotech Inc·，Piscataway)拍照，並使用 LISCAP 影像捕捉 軟體（Amersham Pharmacia Biotech Inc_，version 1.0)予以紀 錄。PCR產物的光學像素係使用ImageMaster™ TotalLab 5 軟體（Amersham Pharmacia Biotech Inc.，version 1.11)予以 定量至任意單位（arbitrary units)。 為比較受檢測之樣品，數據的標準化是必要的。為此 一目的，β-肌動蛋白的PCR擴增產物被使用作為一内部 標準，以代表被引至PCR之cDNA模版的相當同等的數 10 量。平均值以值士標準偏差來表示，並使用Student’s ί檢 測被比較。 結果ι 於TCC組織樣品與對照組個體内的HURP基因的代表 性表現態樣係如第3Α圖所示。在11組（病患編號：294Ν/Τ 15 、306Ν/Τ、307Ν/Τ、315 Ν/Τ、317 Ν/Τ、319 Ν/Τ、320 Ν/Τ、321 Ν/Τ、327 Ν/Τ、335 Ν/Τ、337 Ν/Τ)的腫瘤部分内 有相當多的mRNA轉錄物被擴增出來（參見第3Α圖）。僅 有1組的組織樣品（病患編號：322 N/T)於兩者皆顯示出無 法檢測到HURP基因的轉錄物。作為一内部標準，β-肌動 20 蛋白的PCR擴增產物（參見第3Β圖）被使用以表示被引至 PCR之cDNA模板的相當同等之數量。 實施例2 :藉由RT-PCR分析的HURP基因表現之腫瘤專 一性評估 23 1234585 玖、發明說明 為檢測HURP之過度表現是否有腫瘤專一性，來自於 良性攝護腺肥大症（BPH)病患的攝護腺尿道上皮之HURP 轉錄物係使用RT-PCR被擴增。 這些實驗係使用如於上述實施例1中所描述之程序而 5 被實施，惟獨該來自良性攝護腺肥大症病患之攝護腺尿道 上皮細胞之HURP轉錄物係使用RT-PCR而被擴增，以檢 測HURP之過度表現是否有腫瘤專一性。

來自具有正常細胞鏡檢之BPH病患的攝護腺尿道上皮 的15個標本被收集並被引至RT-PCR。參見第4圖，β-肌 10 動蛋白轉錄物從5個ΒΡΗ尿道上皮之代表性樣品中被均等 地擴增出，但在這些樣品中沒有檢測到HURP轉錄物。除 了這些BPH樣品之外，非膀胱對照組（包含4個來自肝臟 與4個來自心臟之樣品）被測試，且在這些組織中沒有檢測 到HURP轉錄物（資料未顯示）。

15 實施例3 :藉由HURP基因表現的RT_PCR分析之腫瘤階 段評估 為檢測HURP基因過度表現與腫瘤級數之間的可能關 係，45對之包含有一 TCC與一腫瘤鄰近組織之對應物的 組織樣品之人類HURP轉錄物被分析，並以β-肌動蛋白轉 20 錄物來作標準化。 參閱表1，注意到在35個腫瘤鄰近部分（35/45， 77.8%)所表現的HURP基因的量要低於腫瘤部分（組別I， ρ<0·0001)，並且有10個腫瘤鄰近部分（10/45，22.2%)顯 24 1234585 玖、發明說明 示出幾乎相同於腫瘤部分的HURP基因（組別II)。 80個以病理學被確認為〇個級數I、37個級數π、31 個級數III以及12個級數IV之TCC病患之樣品被收集， 且組織樣品中的人類HURP表現比值被列於表2中。看來 5 HURP表現與腫瘤級數之間並無明顯的相關性。在那些9 個具HURP-陰性之腫瘤中，6個為級數II，1個為級數山 以及2個為級數IV。

表1 TCC腫瘤與腫瘤鄰近組織的HURP表現比值 HURP表現比值 — 組別 編號 (以β-肌動蛋白予以標準化） 平均值±標準偏差 TCC腫瘤組織 腫瘤鄰近組織 I 35 0.658+ 0.061 0·070± 0.085卞 Π * 10 0.820+ 0.275 0.770+ 0.327 :HURP相對於β·肌動蛋白（光學像素之倍數） Ρ < 0.0001 10

TCC病患的HURP表現比值 病患特徵 數目 HURP-陽性 (%) HURP-陰性 (%) HURP表現值— (以β-肌動蛋白予以 標準化） 平均值±標準偏差 TCC， 級數I 0 — — — TCC, 級數Π 37 3 1/37 (83,8) 6/37 (16.2) 0_56± 0.394 TCC, 級數皿 31 30/3 1 (96.8) 1/31 (3.2) 0.59± 0.309 TCC， 級數IV 12 10/12 (83.3) 2/10 (16.7) 0.54± 0.129 總數 80 71/80 (88.8) 9/80 (11.2) 0.55± 0.369 25 1234585 玖、發明說明 實施例4:以HURP基因表現作為TCC檢測之一生物標 記的評估 為評估尿液-HURP作為檢測泌尿TCC之一新穎尿液 分子標記之有潛力的應用，7個帶有新生的或再復發的 5 TCC之額外病患藉由使用RT-PCR來對尿液-HURP作分析 。總體RNA係自尿液細胞沉澱物被萃取出並藉由〇iigo_ dT初次接觸來作反轉錄。擴增反應係以HURP專一性引

子或β-肌動蛋白專一性引子來實施。一段37〇鹼基對的 cDNA從具有TCC之所有病患的尿液細胞沉澱物被擴增出 10 (第5A圖）。相對地，7個額外病患（3個有尿道感染，2個 有慢性尿道膀胱發炎，1個具有腎細胞癌，以及丨個具有 BPH)之尿液細胞沉澱物不具有HURp轉錄物。在受控制 的實驗中，一段307鹼基對之β—肌動蛋白<DNA片段由

對照組個體以及具有TCC之病患之尿液被無法區別地擴 15 增出（第5B圖）。 於本》兒明書中被引述之所有專利與文獻以其整體被併 入本案以作為參考資料1有所衝突時，本案之說明（包含 界定在内）將佔上風。 體例來作描述，明顯地 ’可作出很多的修改和 如隨文檢附之申請專利 雖然本發明已參照上述特定具 在不背離本發明之範圍和精神之下 變化。因此意欲的是，本發明僅受 範圍所示者之限制。 26 20 1234585 玖、發明說明 序列表 <110> 奇美基金醫學中心 陽明大學生命科學系 周成功 5 邱文祥 黃于倫 <120> 作為膀胱癌的分子標記之HURP基因 <13〇> NP-17020-TWN 10 <160> 5 <170> Patentln version 3.1 15 <21〇〉 1 <211> 2 97 9 <212> DNA <213> ( Homo sapiens ) 20 <4 00> 1 agcaaaccaa tcgcaagcct cgt tgagtgg aaggggtggg atc 11ccccg gaagt 11 tgg 60 11 aaagcccc t ccaa t cage ggctcggtgc ggcaagt t tg aat t tcgtgg aggctcgggt no 25 tgtgagggt t cctgct tegg agtcggcggt ggtcgtccag accgagtgt t ctttactttt 180 tgt t tggt tg aggt t teaeg ctagaaggtg gctcaggatg tet tcatcac a 111 tgccag 240 30 tcgacacagg aaggatataa gtactgaaat gat tagaact aaaat tgc tc ataggaaatc 300 actgtctcag aaagaaaata gacataagga ataegaaega aa t agacac t t tggt t tgaa 360 agatgtaaac at tccaacc t tggaaggtag aa 11 c 11g 11 gaat tagatg agaca tc t ca 420 35 agagct tgt t ccagaaaaga ccaatgt taa gccaagggca atgaaaac ta t tctaggtga 480 27 1234585 玖、發明說明 t caacgaaaa caga t gc t cc aaaaa t acaa agaagaaaag caac 11 caaa aa 11gaaaga 540 5 gcagagagag aaagctaaac gaggaatat t taaagtgggt cgt tatagac ctgatatgcc 600 t tgt 11 tc 11 11 a t caaacc agaatgctgt gaaagctgag ccaaaaaagg c ta11 ccat c 660 t tctgtacgg a 11acaaggt caaaggccaa agaccaaa t g gageagae t a agat tgataa 720 10 cgagagtgat g 11 egageaa t ccgacc tgg t ccaagacaa ac 11 c tgaaa agaaagtgtc 780 agacaaagag aaaaaagt tg tgcagcctgt aatgcccacg tegt tgagaa tgactcgatc 840 age tac t caa gcagcaaagc aggt tcccag aacag t c t ca t c t accacag caagaaagcc 900 15 ag t cacaaga gctgctaatg aaaacgaacc agaaggaaag gtgccaagta aaggaagacc 960 tgccaaaaat gtagaaacaa aacccgacaa gggtat t tet tgtaaagtcg atagtgaaga 1020 20 aaa t ac 111 g aa 11 cacaaa ctaatgcaac aagtggaatg aatccagatg gagtet tatc 1080 aaaaa t ggaa aac 11 acc t g aga t aaa t ac tgcaaaaa ta aaagggaaga a 11 cc 11 ege 1140 acctaaggat 11 tatgt t tc agccac tgga tggtctgaag acctatcaag t a a c a c c t a t 1200 25 gac t cccaga ag t gccaa t g c 111111 gac acccag11 ac acctggactc ct t taaaaac 1260 agaagt tgat gag t c t caag caacaaaaga aa 1111ggea caaaaa t g t a aaac 11 ac t c 1320 30 t accaagaca a t acagcaag a 11 caaa taa a11gcca tgt cct t tgggtc ctctaactgt 1380 t tggcatgaa gaacatgt 11 taaataaaaa tgaage t ac t ac t aaaaa 11 taaatggcct 1440 t ccaa t aaaa gaag t ccca t cac t tgaaag aaatgaaggt egaat tgc tc agccccacca 1500 35 tggtgtgcca ta111cagaa a t a t cc t cca g t cagaaac t gagaaa 11 aa c 11 caca 11 g 1560

28 1234585 玖、發明說明 ct tcgagtgg gacaggaaac t tgaat tgga cat tccagat gatgetaaag atet tat teg 1620 5 cacagcag11 gg t caaacaa gactccttat gaaggaaagg 11 taaacagt ttgaaggact 1680 ggt tgatgat tgtgaa ta ta aacgaggtat aaaggagac t acctgtacag atctggatgg 1740 at 11 tgggat atggt tagt t t tcagataga agatgtaatc cacaaat tea acaatctgat 1800 10 caaac 11 gag gaatctgggt ggcaag t caa t aa t aa t a t g aatcataata tgaacaaaaa 1860 tgtct t tagg aaaaaagt tg tc tcaggtat agcaagtaaa ccaaaacagg atgatgctgg 1920 aagaat tgca gcgagaaatc gcctagctgc ca taaaaaa t gcaatgagag agagaat tag 1980 15 gcaggaagaa tgtgctgaaa cagcagt t tc tgtgatacca aaggaagt tg ataaaatagt 2040 gt tcgatgct ggat 111 tea gagt tgaaag tcctgt taaa ttattctcag gactttctgt 2100 20 ctct tctgaa ggcccttctc aaagac t tgg aacacc taag tctgtcaaca aagctgiatc 2160 t cagag t aga aatgagatgg gcat tccaca acaaac taca tcaccagaaa atgccggtcc 2220 tcagaatacg aaaagtgaac atgtgaagaa gac 11 tgt 11 t tgagtat tc ctgaaagcag 2280 25 gagcagcata gaagatgctc agtgtcctgg at taccagat t taat tgaag aaaaccatgt 2340 tgtaaataag acagac t tga aggtggat tg 11 tatccagt gagagaatga gt t tgcctct 2400 30 tct tgctggt ggagtagcag atgatat taa tac taacaaa aaagaaggaa 11 tcagatgt 2460 tgtggaagga atggaactga at tct tcaat tacatcacag gatgt 11 tga tgagtagccc 2520 tgaaaaaaat acagc t tcac aaaa t agea t c t tagaagaa ggggaaacta aaat t tc tea 2580 35 gtcagaacta 11 tgataata aaagtc tcac tac tgaatgc cacct tct tg at tcaccagg 2640

29 1234585 玖、發明說明 tctaaactgc agtaatccat 11 ac t cage t ggagaggaga ca t caagaac a t gccagaca 2700 5 cat t tct 111 ggtggtaacc tgat tact 11 t tcacctcta caaccaggag aat 11 tgaat 2760 t taaaaataa atccaaacat 11 tcct teat at tatcaatg ct tatatat t cc 11 agac t a 2820 t tgaaa 1111 ggagaaaa tg tat t tgtgt t cac 11 c ta t a gcatataatg 111 taatat t 2880 10 ctgtgt teat caaagtgtat 11 tagatata ctct t tetea agggaagtgg ggatat 11 tg 2940 tacat 11 tea acacagaata aaaaatgtac tgtgcct tg 2979 <210> 2 15 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <220> 20 <223> 用於HURP之擴增 <4〇〇> 2 ggatccaata acact t tggt ttg 23 25 <21〇> 3 <211> 23 <212> DNA 30 <213> 人工序列 <220> <223〉 用於HURP之擴增 <4〇〇> 3 35 cctagggtgg aaaggagacc aag 23 30 1234585 玖、發明說明 <21〇> 4 <211〉 18 <212> DNA 5 <213> 人工序列 <22〇> <223> 用於HURP之擴增 10 <4〇〇> 4 caacgaaaac agatgctc 18 <210> 5 15 <2ΐι> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <22〇> 20 <223> 用於HURP之擴增 <4〇〇> 5 tgagtagc tg at cgag tc 18 31 1234585 玖、發明說明 C圖式^^ _^言兌明j 第1圖顯示人類HURP基因的核苷酸序列的全長（序列 辨識編號：1)，其中互補於四個根據本發明所設計的引子之 核苷酸序列被劃底線以及以粗體顯示； 5 第2圖顯示一被使用於下述實施例中之載體pET32a (Novagen Inc·)的限制圖譜，其中如mi/ I的限制位址被使 用來插入該人類HURP基因之一全長核苷酸序列； 第3A與3B圖各別地顯示在TCC組織中的HURP與 10 其中N=腫瘤鄰近組織，τ=腫瘤組織，以及294、306、307 、315、317、319、320、321、322、327、335 與 337=病患 編號； 第4圖顯示5個取自於良性攝護腺肥大症病患之攝護 腺 樣品中的人類HURP基因表現的RT-PCR分析 15 ，其中左半部係為β-肌動蛋白（307 bp)，右半部為 HURP(370 bp) ; Nl、N2、N3、N4 與 N5=5 個良性攝護腺 肥大症（BPH)樣品；NC=負對照組；以及Μ表示呈驗基對 之分子量標記；以及 第5 Α與5Β圖各別地顯示 ^ ^ 樣 20 品中之HURP與β-肌動蛋白之RT-PCR分析，其中2、6、 7、8、14、15、20、5、10、11、12、13、16 與 18=病患編 號；NC=負對照組；以及Μ表示呈鹼基對之分子量標記。 【囷式之主要元件代表符號表】 (無） 32

Claims (1)

1. 衫年/ I月曰 修正本 -f、申請專利範圍 第091122555 ?虎專利申請案申請專利範圍修正本 修正日期·· 93年11月 1. -種用於活體外檢測_人類個體體内的膀胱癌之方 法，其包含下列步驟： ()子取自於被懷疑具有膀胱癌的個體的生物性 樣來偵測人類肝癌上升-調節的蛋白質（HURP) 基因的表現，該人類HURp基因被彳貞測到的表現是 為有膀胱癌存在之表徵。 10 2. 如申請專利範圍第Μ之方法，其中該膀胱癌係為膀胱 的移形上皮癌（TCC)。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該生物性樣品包含 有擇自於下列群組中之細胞：泌尿上皮癌細胞、膀胱癌 細胞或此二者之一組合。 15 4·如申請專利範圍第1項之方法，其中該生物性樣品係擇 自於由下列所構成之群組：尿液、泌尿上皮生物檢體、 血液、血漿與血清。 5.如申請專利範圍第4項 、之方法其中该生物性樣品係為 尿液。 20 6·如申請專利範圍第〗項之方法，其中該人類HuRp基因 具有一如相㈣編號：丨中所描述之《酸序列。 7·如申請專利範圍第6項之方法，其中該人類HURP基因 的表現之㈣，係藉由❹i該生物性樣品内的人類 HURP基因之mRNA轉錄品的存在來進行。 8·如申請專利範圍第7項之方法，其中該人類腿P基因 1 1234585 拾、申sra專利範圍 的⑽N—A轉H存在之_，係藉由❹下列方法學 " ^被進彳T ••雜合、彳盾環探針反應、聚合酶連 鎖反應（PCR)、| ^ 、反轉錄崦聚合酶連鎖反應 π™)、多重PCR聚合物貞反應·單股構造多形 性、連接崎連鎖反應（LCR)，以限制片段長度多形性核 文序列為主之擴增反應（nasba)，以及轉錄·調節的擴 增反應（TMA)。 如申請專利範圍第7項之方法，其中該人類hurp基因 10 的mRNA轉錄品的存在之㈣，係使用r丁-p⑶而被進 行。 1 〇·如申明專利I巳圍帛7項之方法，其中該人類肋基因 的mRNA轉錄品的存在之積測，係藉由下列步驟而被進 行： 0)自該生物樣品萃取出總rNA ; (b)將源自步驟（a)之被萃取的RNA引至一種使用至少 一個具有一順向引子與一反向引子的引子對的反 轉錄聚合酶連鎖反應（rt_PCR)處理，各個引子具 有一核苔酸序列會雜合至一具有一核苷酸序列對 應於序列辨識編號：1的人類HURP基因的至少J 3 個核苔酸；以及 (0偵測是否有一具有一核苷酸序列相同於或互補於 該人類HURP基因的核苷酸序列之一部分的 RT-PCR產物已從步驟（b)之RT-PCR處理被生成， 該RT-PCR產物之存在是為有膀胱癌存在之表徵。 2 J234585 5 10 15 拾、申請專利範圍 】.如申凊專利範圍第〗〇項 Φ ^ ^ Σ , 、乃法，其中被使用於步驟（b 甲之该至少一個引子對包 ’ 編#·2 φ t 具有一擇自於序列辨識 扁號.2與序列辨識編號： 顧θ T所述序列的核苷酸序列之 ，向引子，以及一具有一 自於序列辨識編號：3與序列 辦A編旒：5中所述序列的 …出 斤夕㈣核甘酸序列之反向引子。 2.如_請專利範圍第1〇項 中 法，其中被使用於步驟（b) T之该至少一個引子對々人— 3 一具有一對應於序列辨識 、.扁號：4的核苔酸序列之 ^ χϊ )丨于以及一具有一對應於 序列辨識編號:5的核；酸序列之反向引子。 13.如申請專利範圍第】〇 貝之方法，其中步驟（b)中的 RT-PCR處理包含一個使用子對的第-擴增 反應’該第-引子對具有—個具有—賴於㈣辨識編 號:2的核誓酸序列之第-順向引子以及—個具有一對 應於序列辨識編號：3的核誓酸序列之第一反向引子；以 及一個使用一第二引子對的第二擴增反應，該第二引子 對具有-個具有一對應於序列辨識編號：4的核苔酸序 列之第二順向引子以及一個具有一對應於序列辨識編 號：5的核苷酸序列之第二反向引子。 14· 一種用於監測一人類個體體内的膀胱癌之方法，其包含 下列步驟： 之 / (1)對疋期地取自於一被懷疑具有膀胱癌的個體的生 物性樣品來偵測一人類肝癌上升-調節的蛋白質 (HURP)基因的表現，該人類HURP基因被偵測到的 表現是為有膀胱癌存在之表徵。 3 20 1234585 拾、申請專利範圍 15·如申6月專利圍第14項之方法，其中該膀胱癌係為膀 胱的移形上皮癌（TCC)。 16. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該生物性樣品包 含有擇自於下列群組中之細胞：泌尿上皮癌細胞、膀胱 5 癌細胞或此二者之一組合。 17. 如申請專利範㈣Η項之方法，其中該生物性樣品係 擇自於由下列所構成之群組：尿液、泌尿上皮生物檢 體、血液、血漿與血清。 Ϊ 8.如申請專利範圍第η , ^ τ , 貝之方法，其中該生物性樣品係 1G 為尿液。 19.如申凊專利範圍第㈣之方法，其中該人類臟ρ基 因具有一如序列辨識編號:1中所描述之核苔酸序列。 2〇·如申請專利範圍第19項之方法，其中該人類職ρ基 15 20 口的表現之㈣，係藉㈣測該生物性樣品内的人類 HURP基因之mRNA轉錄品的存在來進行。 儿如申請專利範圍第2()項之方法，其中該人類肋处基 因的m R N A轉錄品的存在之偵測，係藉由使用下列方法 子之至v纟而被進行：雜合、循環探針反應、聚合酶 連鎖反應（PCR)、巢式PCR、反轉料聚合酶連鎖反岸 (RT-PCR)、多重PCR聚合㈣鎖反應_單股構造多形 性、連接酶連鎖反岸f 貞汉應（LCR)，以限制片段長度多形性核 酸序列為主之擴增反應(NASBA)，以及轉錄_調節的擴 增反應（TMA)。 、 22•如申請專·„2()項之方法，其巾該人類職P基 4 1234585 拾、申請專利範圍 因的mRNA棘雜口 —丄 符綠0口的存在之偵測，係使用RT-PCR而被 進行。 2 3.如申請專利範圍^; ? 固弟20項之方法，其中該人類HURP基 因的mRNA韓鍈口从六各 α W綠扣的存在之偵測，係藉由下列步驟而被 5 進行： (a )自"玄生物樣品萃取出總RNA ; ()將源自步驟（a’）之被萃取的RNA引至一種使用至 ^個具有一順向引子與一反向引子的引子對的 反轉錄聚合酶連鎖反應（RT-PCR)處理，各個引子 10 *有一^序列會雜纟至-*有-肖普酸序列 對應於序列辨識編號：i的人類HURp基因的至少 U個核苷酸；以及 (c )谓測是否有—具有_核；酸序列相同於或互補於 該人類HURP基因的核答酸序列之一部分的 15 RT-PCR產物已從步驟（b，）之RT-PCR處理被生 成。玄RT-PCR產物之存在是為有膀脱癌存在之表 徵。 24·如申請專利範SI第23項之方法，其中被使用於步驟（b，） 中之該至少-個引子對包含一具有一擇自於序列辨識 20 、編號：2肖序列辨識編號：4中所述序列的核誓酸序列之 順向引子’以及-具有-擇自於序列辨識編號·3與序列 辨識編號：5中所述序列的核苷酸序列之反向引子。 25•如申請專利範圍第23項之方法，其中被使用於步驟㈦） 中之該至少-個引子對包含—具有一對應於序列辨識 5 1234585 拾、申請專利範圍 編號：4的核苔酸序列之順& 檇向弓丨子，以及一具有一對應於 序列辨識編號：5的核苷酸序列之反向引子。 26·如申請專利範圍第23頊夕士 1 ^ 貝之方法，其中步驟（b，）中的 RT-PCR處理包含：一個使一 hi ^ ,, ^ m 弟一引子對的第一擴增 反應，該第一引子對具有_ _ s + 、曰 個具有一對應於序列辨識編 號:2的核誓酸序列之第-順向引子以及-個具有—對 應於序列辨識編號:3的核答酸序列之第一反向引子;以 及-個使用n子對的第二擴增反應，該第二引子 對具有一個具有一對應於序列 10 15 20 汁幻辨减編唬：4的核苷酸序 列之第二順向引子以及一個 個/、有一對應於序列辨識編 號：5的核苷酸序列之第二反向引子。 27. —個DNA序列，其且右一探ώ μ 一 八有擇自於序列辨識編號：2至序 列辨識編號:5中所描述的序列之核苔酸序歹卜 28. -種用於_-人類個體體内的膀胱癌之引子组，其包 含-具有-擇自於序列辨識編號：2與序列辨識編號:4 中所述序列的Μ酸序狀順向引子，以及—具有一擇 自於序列辨識編號:3與序列_編號：5中所述序列的 核苷酸序列之反向引子。 1如申請專利範圍第28項之引子組，其中該順向引子具 有如序列辨識編號:2中所描述之核苗酸序列。 ;〇·如申請專利範圍第28項之引子組，其中該順向引子具 有如序列辨識編號:4中所描述之核㈣序列。 3!•如申請專利範圍第28項之引子組，其中該反向引子臭 有如序列辨識編號：3中所描述之μ酸序列。 6 1234585 拾、申請專利範圍 32.如申請專利範圍第28項之引子組，其中該反向引子具 有如序列辨識編號：5中所描述之核誓酸序列。 33· —種用於偵測一人類個體體内的膀胱癌之檢驗套組，其 包含有i少一個針對一具有一㈣酸序列對應於序列 5 辨識編號：1的人類HURP基因而被設計的引子對，該至 少一個引子對包含-具有-擇自於序列辨識編號：2與 序列辨識編號：4中所述序列的核誓酸序列之順向引 子以及I有-擇自於序列辨識編號：3與序列辨識編 號：5中所述序列的核苷酸序列之反向引子。 1〇 34·如申請專利範圍第33之檢驗套組，其包含有：一個具 有一對應於序列辨識編號：2㈣答酸序列之第一順向 引子以及一具有一對應於序列辨識編號：3的核苷酸序 列之第反向引子的第—引子對’以及_個具有一對應 15 於序列辨識編號:4的核苷酸序列之第二順向引子以及 15 一具有一對應於序列辨識編號：5的核苔酸序列之第二 反向引子的第二引子對。 7