CN1771337B

CN1771337B - 包含单核苷酸多态性且与结肠癌有关的多核苷酸、包括该多核苷酸的微阵列和诊断试剂盒

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Publication number: CN1771337B
Application number: CN2005800001588A
Authority: CN
Inventors: 朴卿希; 李圭祥; 李娟受; 金载洽; 朴娟雅; 赵志荣; 孙玉庆; 金秉澈; 金旼宣
Original assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Current assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Priority date: 2004-02-20
Filing date: 2005-02-19
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2025-02-19
Also published as: CN1771337A; KR20060042952A; KR20110110758A; KR101138863B1; KR101100437B1

Abstract

本发明提供多核苷酸或其互补多核苷酸，所述多核苷酸包括选自SEQID NOS：1-12的核苷酸序列的至少10个毗连核苷酸，并且包括在该核苷酸序列的101位的核苷酸。

Description

包含单核苷酸多态性且与结肠癌有关的多核苷酸、包括该多核苷酸的微阵列和诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及与结肠直肠癌有关的多核苷酸、包括该多核苷酸的微阵列和诊断试剂盒，以及分析与结肠癌有关的多核苷酸的方法。

背景技术

所有生物体的基因组在它们不断进化的过程中经受自发突变、产生祖先(progenitor)核酸序列的变体形式(Gusella，Ann.Rev.Biochem.55，831-854(1986))。变体形式可赋予相对于祖先形式的进化优点或缺点，或可为等效形式。在一些实例中，变体形式赋予致死的缺点，并且不遗传到该生物体的后代。在另外的实例中，变体形式将进化优点赋予物种，并最终永久地整合入该物种的大多数成员的DNA中且有效地变为祖先形式。在许多实例中，祖先及变体形式都幸存并在物种的种群中共存。序列的多种形式的共存引起多态性。

在多态性中，已知几种类型，包括限制性片段长度多态性(RFLP)、短串联重复(STR)、可变数串联重复(VNTR)和单核苷酸多态性(SNP)。其中，SNP具有相同物种的个体之间单核苷酸变异的形式。当SNP在蛋白编码序列中发生时，一些多态性形式会引起氨基酸的非同义改变，导致表达出有缺陷的或变异的蛋白。在另一方面，当SNP在非-编码序列中，例如在内含子内发生时，这些多态性的一些可导致mRNA的剪接变体，这也引起有缺陷的或变异的蛋白的表达。其他的SNP可以完全不具有表型效应(phenotypic effect)。

据估计，人SNP以在每1,000bp中1个的频率发生。当这样的SNP影响表型的表达，如疾病时，含有该SNP的多核苷酸可用作诊断该疾病的引物或探针。特异性地与该SNP结合的单克隆抗体也可用于该疾病的诊断。目前，SNP的核苷酸序列和功能的研究正由许多研究所进行。鉴定出的人SNP的核苷酸序列和其他实验结果已经制成数据库以使其便于获得。

虽然迄今的发现显示，具体的SNP存在于人基因组或cDNAs上，但还没有揭示出SNP的表型效应。除去少量的SNP之外，大多数SNP的功能也还没有公开。

结肠直肠癌是一种在世界范围包括韩国非常常见的癌症。在韩国，结肠直肠癌在男性和女性中都是第四常见的癌症。在由癌症导致的死亡当中，结肠直肠癌排名第四，并为造成每十万人口中七人死亡的原因。在过去的10年中，结肠直肠癌的死亡率增长大约80％。

已知结肠直肠癌的发生主要由环境因素引起。饮食的快速西方化和动物脂肪或蛋白的过量摄取是发生结肠直肠癌的主要因素。然而，已知大约5％的结肠直肠癌病例由基因的原因引起。

90％以上的结肠直肠癌患者是那些年龄超过40岁的人。已知结肠直肠癌的发生，除去年龄超过40岁的人之外，在具有与结肠直肠癌、炎性肠病(inflammatory bowel disease)、结肠息肉(colonic polyp)、卵巢癌(ovarian cancer)、子宫癌(uterine cancer)和乳癌(breast cancer)相关的家族史的人群(高危组)中是更加频繁的。结肠直肠癌在30-40岁的年轻人中的发生则主要是基因的原因占优势。

结肠直肠癌的早期检测确保几乎100％的治愈率。然而，通常由于结肠直肠癌没有特定的早期症状，早期检测是困难的。大便潜血(fecal occult blood)检验(用于检测大便中痕量的血)通常用作筛选检验以检测结肠直肠癌，尤其当所述的癌症并不引起任何症状的时候。大便潜血检验是选出需要进一步精确检查的个体的方法。然而，由于这项检查具有高比率的假-阳性结果和假-阴性结果，所以它并不适合用于早期诊断。目前，结肠直肠癌的精确诊断通过钡餐灌肠检查(barium enema examination)、内窥镜检查(endoscopy)、放射检查(radiation examination)等等完成。通常采用被称作CEA(癌胚抗原(carcinoembryonic antigen))的肿瘤标记物(tumor marker)检测结肠直肠癌的进展阶段并评估结肠直肠癌的治疗效果。但是，还没有普遍公认并经证实的肿瘤标记物能够通过验血来早期诊断或预测结肠直肠癌。虽然报道了几种标记物用于对易患结肠直肠癌的高危组患者进行筛选或早期诊断，但是这些标记物用于大多数罹患结肠直肠癌的患者时具有局限性。

各种癌症和并发疾病，包括结肠直肠癌，其早期诊断或预后中最严重的问题是，当癌症和并发疾病处于晚期时，该诊断或预测能通过物理方法进行。然而，近来各种分子生物学技术的发展和人类基因组计划的初步完成使发现直接/间接与疾病相关的基因或基因变异成为可能。因此，应用遗传因子预测疾病的发生的早期诊断，取代应用常规表型-或表型疾病-依赖性的诊断方法，成为可行的。目前，生物化学或分子生物学方法可用于结肠直肠癌诊断。由于缺乏与该癌症相关的基因或基因变异以及基因或基因变异与结肠直肠癌发病率之间相关性的信息，目前没有采用分子生物学方法对结肠直肠癌进行符合患者和医生需求的早期诊断。此外，在应用单一生物学标记物的大多数诊断病例中，通常该标记物的灵敏度和特异性不能同时令人满意。通常地，如果灵敏度高，特异性就低，反之亦然。由于此原因，诊断中发生错误的可能性高，所以就难以达到所需的准确性水平。因此，单一生物学标记物仅仅用作为精确检查进行初步筛选的诊断标记物。

发明详述

本发明的技术目标

本发明提供了含有与结肠直肠癌有关的单核苷酸多态性的多核苷酸。

本发明也提供了微阵列和结肠直肠癌诊断试剂盒，其每种含有与结肠直肠癌有关的单核苷酸多态性的多核苷酸。

本发明也提供了应用与结肠直肠癌有关的多核苷酸诊断结肠直肠癌的方法。

本发明的内容

本发明提供了包括选自核苷酸序列SEQ ID NOS：1-12的核苷酸序列的至少10个毗连核苷酸，并且包括该核苷酸序列的多态性位点(第101位)的核苷酸的多核苷酸，或其互补多核苷酸。

所述多核苷酸包括含有选自核苷酸序列SEQ ID NOS：1-12的核苷酸序列中的多态性位点(第101位)的核苷酸(通过n表达)的至少10个毗连核苷酸。所述多核苷酸优选为10-200个核苷酸，更优选为10-100个核苷酸，并且还更优选为10-50个核苷酸。

SEQ ID NOS：1-12所示每一个核苷酸序列是多态性序列。此处多态性序列指含有多态性位点的核苷酸序列，在所述的多态性位点上发生单核苷酸多态性(SNP)。多态性位点指多态性序列上发生SNP的位置。所述的核苷酸序列可为DNAs或RNAs。

在本发明中，SEQ ID NOS：1-12所示多态性序列的每一个多态性位点(第101位)与结肠直肠癌有关。这通过来自结肠直肠癌患者和正常人的血样的DNA核苷酸序列分析证实。此分析结果总结于表1和2中。

表1SEQ ID NOS：1-12所示多态性序列与结肠直肠癌的关联

表2SEQ ID NOS：1-12所示多态性序列的特征

在表1和2中，栏中的内容定义如下。

-ASSAY_ID代表标记物名称。

-SNP为SNP多态性位点的多态性碱基。此处，A1和A2分别代表低频等位基因(low mass allele)和高频等位基因(high mass allele)，作为根据同源MassEXTEND(hME)技术(Sequenom)序列分析的结果，并为了实验的方便随意地设计。

-SNP序列代表含有SNP位点的序列，即在101位含有等位基因A1或 A2的序列。

-在等位基因频率栏，cas_A2、con_A2和Delta分别代表病例组的等位基因A2频率、正常组的等位基因A2频率和cas_A2与con_A2之差的绝对值。此处，cas_A2为病例组中的(基因型A2A2频率×2+基因型A1A2频率)/(样品数×2)，而con_A2为正常组中的(基因型A2A2频率×2+基因型A1A2频率)/(样品数×2)。

-基因型频率代表每种基因型的频率。此处，cas_A1A1、cas_A1A2和cas_A2A2分别为病例组中具有基因型A1A1、A1A2和A2A2的个体的数目，而con_A1A1、con_A1A2和con_A2A2分别为正常组中具有基因型A1A1、A1A2和A2A2的个体的数目。

-df＝2代表具有两个自由度的chi-平方值。chi-值代表chi-平方值，p-值基于chi-值确定。Chi_exact_p-Value代表卡方检验(chi-square test)的Fisher精确检验的p值。当基因型的数目小于5时，卡方检验的结果可能不准确。在这点上，需要通过Fisher精确检验确定更准确的统计显著性(p-值)。Chi_exact_p-Value是在Fisher精确检验中应用的变量。在本发明中，当p-值≤0.05时，认为病例组的基因型与正常组的不同，即，病例组和正常组之间有显著的区别。

-在危险等位基因栏，当参考等位基因是A2而且病例组的等位基因A2频率大于正常组的等位基因A2频率(即，cas_A2＞con_A2)时，就把等位基因A2看作危险等位基因。而在相反的情况下，则把等位基因A1看作危险等位基因。

-优势率(odd ratio)代表病例组中危险等位基因的可能性与正常组中危险等位基因的可能性的比例。在本发明中，采用Mantel-Haenszel优势率方法。CI代表优势率的95％置信区间，采用(置信区间的下限，置信区间的上限)表示。当1落在置信区间内时，认为危险等位基因与疾病的关联不显著。

-HWE代表满足Hardy-Weinberg平衡的结果。此处，con_HWE和cas_HWE分别代表正常组和病例组中相对于Hardy-Weinberg平衡的偏差度。基于卡方检验(df＝1)中chi_值＝6.63(p-值＝0.01，df＝1)，把大于6.63的值看作Hardy-Weinberg不平衡(HWD)，而小于6.63的值看作Hardy-Weinberg平衡(HWE)。

-call rate代表可以对其基因型进行解释的样品的数目比实验中应用的样品总数。此处，cas_call_rate和con_call_rate分别代表病例组和正常组中可解释基因型的样品的数目与应用的样品总数(300个体)的比例。

-rs代表NCBI dbSNP中SNP标识码。

表1和2显示了基于NCBI build 119(2005年2月1日)的SNP标记物的特性。

如表1和2所示，根据本发明的SEQ ID NOS：1-12的多态性标记物的卡方检验，Chi_exact_p-Value在95％置信区间内的0.0000008-0.049范围内。这显示，在SEQ ID NOS：1-12的多态性标记物中，等位基因发生频率的期望值和测量值之间有显著的差异。优势率范围为1.30-2.06，这显示SEQ IDNOS：1-12的多态性标记物与结肠直肠癌有关。

因此，本发明的多核苷酸可以有效地应用于结肠直肠癌的诊断、指纹分析(fingerprinting analysis)和治疗。具体地，本发明的多核苷酸可用作结肠直肠癌诊断的引物或探针。此外，本发明的多核苷酸可用作结肠直肠癌治疗的反义DNA或组合物。

本发明也提供了等位基因特异性的用于诊断结肠直肠癌的多核苷酸或其互补体，其与包括至少10个毗连核苷酸的多核苷酸杂交，所述包括至少10个毗连核苷酸的多核苷酸含有选自核苷酸序列SEQ ID NOS：1-12的核苷酸序列的多态性位点的核苷酸。

等位基因-特异性的多核苷酸指特异性地与每个等位基因杂交的多核苷酸。即，等位基因-特异性的多核苷酸具有在SEQ ID NOS：1-12的多态性序列中区分多态性位点的核苷酸，并特异性地与每个这样的核苷酸杂交的能力。杂交在严谨条件下进行，例如，盐浓度不超过1M，温度不低于25℃。例如，5×SSPE(750mM NaCl，50mM磷酸Na，5mM EDTA，pH7.4)和25-30℃的条件对于等位基因-特异性探针杂交是适合的。

在本发明中，等位基因-特异性的多核苷酸可为引物。如这里所应用的，术语“引物”指单链寡核苷酸，其作为在合适的条件下，例如，在包含四种不同的三磷酸核苷和聚合酶，如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶的缓冲液中以及合适的温度中，在模板指导下进行DNA合成的起始点。所述引物的合适长度可根据应用的目的而不同，通常为15-30个核苷酸。通常地，较短的引物分子需要较低的温度以与模板形成稳定的杂交体。引物序列不需要与模板完全互补，但必须足够互补以与模板杂交。优选地，引物的3’-末端与SEQ ID NOS：1-12的每个多态性位点的核苷酸(n)对应(align)。引物与含有多态性位点的目标DNA杂交并开始等位基因扩增(allelic amplification)，其中引物呈现与目标DNA的完全同源性。引物是成对使用，其第二个引物与相反链杂交。扩增产物通过应用两条引物扩增得到，其意味着有特异性的等位基因形式。本发明的引物包括应用于连接酶链式反应(LCR)的多核苷酸片段。

在本发明中，等位基因-特异性的多核苷酸可为探针。如这里所应用的，术语“探针”指杂交探针，即，能够序列-特异性地与核酸的互补链结合的寡核苷酸。

这样的探针可为肽核酸，如由Nielsen et al.在Science 254，1497-1500(1991)中公开的。本发明的探针是等位基因-特异性的探针。在这点上，当在源自相同物种的两个成员的核酸片段中有多态性位点时，所述的探针与源自一个成员的DNA片段杂交，而不与源自另一个成员的DNA片段杂交。在此情况下，杂交条件应足够严谨以允许根据等位基因之间的杂交强度的显著差异只与一个等位基因杂交。优选地，探针的中部，即15个核苷酸的探针的第7位，或16个核苷酸的探针的第8或第9位，与SEQ ID NOS：1-12的核苷酸序列的每个多态性位点对应。因此，可导致等位基因之间的显著的杂交差异。本发明的探针可应用在用于探测等位基因的诊断方法中。所述诊断方法包括基于核酸杂交的探测方法，例如，southern印迹。在应用DNA芯片进行基于核酸杂交的探测方法的情况下，探针可以是固定在DNA芯片的基板上化的形式。

本发明也提供了用于诊断结肠直肠癌的微阵列，其包括本发明的多核苷酸或其互补的多核苷酸。微阵列的多核苷酸可以为DNA或RNA。所述的微阵列除了包括本发明的多核苷酸外，与普通的微阵列相同。

本发明也提供了包括本发明的多核苷酸的结肠直肠癌诊断试剂盒。该结肠直肠癌诊断试剂盒除去包括本发明的多核苷酸之外，可包括聚合所必需的试剂，例如，dNTPs、各种聚合酶和着色剂。

本发明也提供了诊断个体中结肠直肠癌的方法，其包括：将核酸样品从所述的个体分离，并测定SEQ ID NOS：1-12的多核苷酸或其互补多核苷酸中至少一个多态性位点(第101位)的核苷酸(n)。此处，当样品核酸的至少一个多态性位点(第101位)的核苷酸与表1和2中显示的至少一个危险等位基因相同时，确定该个体具有较高的可能性被诊断为有发生结肠直肠癌的危险。

将核酸样品从所述的个体中分离的操作可通过常规的DNA分离方法进行。例如，核酸样品可通过应用聚合酶链式反应(PCR)扩增目标核酸然后纯化得到。除去PCR之外，可以应用LCR(Wu and Wallace，Genomics 4，560(1989)，Landegren et al.，Science 241，1077(1988))、转录扩增(transcriptionamplification)(Kwoh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173(1989))、自动维持序列扩增(self-sustained sequence replication)(Guatelli et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1874(1990))或基于核酸序列的扩增(NASBA)。后两种方法与基于等温转录的等温反应相关，并产生30或100倍的RNA单链和DNA双链作为扩增产物。

根据本发明的实施方案，测定至少一个多态性位点的核苷酸(n)的操作包括，将核酸样品杂交到微阵列上并检测杂交结果，在所述的微阵列上固定了用于诊断或治疗结肠直肠癌的多核苷酸或其互补多核苷酸，该多核苷酸包括核苷酸序列SEQ ID NOS：1-12中的至少10个毗连核苷酸并包括多态性位点(第101位)的核苷酸。

微阵列和通过将探针多核苷酸固定在基板上制备微阵列的方法在有关的技术领域中是熟知的。本发明与结肠直肠癌相关的探针多核苷酸在基板上的固定可应用常规方法容易地进行。核酸在微阵列上的杂交和杂交结果的检测在有关的技术领域中也是熟知的。例如，杂交结果的检测可以通过以产生可检测的信号的标记物质，如荧光物质(例如，Cy3和Cy5)，标记核酸样品，将标记的核酸样品杂交到微阵列上，及检测由标记物质产生的信号来进行。

本发明的效果

本发明的多核苷酸可用于结肠直肠癌的诊断、治疗或指纹分析。

包括本发明的多核苷酸的微阵列和诊断试剂盒可用于结肠直肠癌的有效诊断。

本发明分析与结肠直肠癌有关的多核苷酸的方法可有效地检测结肠直肠癌的存在或危险。

本发明的优选实施方式

在下文中，将通过实施例更加具体地描述本发明。然而，下述提供的实施例仅仅用于说明，因而本发明不限于或不受它们的限制。

实施例

实施例1

在此实施例中，DNA样品从由已被诊断为结肠直肠癌患者并正在治疗中的300韩国男人和女人组成的患者组和由没有结肠直肠癌患者组的症状的300韩国男人和女人组成的正常组的个体的血流中提取，并评价特异性的SNP的出现频率。所述SNP选自已知的数据库(NCBI dbSNP:http://www.ncbi.nlm.nih.com)或(Sequenom:http://www.realsnp.com/)。与选择的SNP附近的序列杂交的引物用于测试DNA样品中SNP的核苷酸。

1.DNA样品的制备

DNA样品从结肠直肠癌患者和正常人的血流中提取。DNA提取根据已知的提取方法(Molecular cloning：A Laboratory Manual，p 392，Sambrook，Fritsch and Maniatis，2^nd edition，Cold Spring Harbor Press，1989)和由Centrasystem制造的商业试剂盒的说明书进行。在提取的DNA样品中，只采用具有至少1.6的纯度(通过A₂₆₀/A₂₈₀nm比率测定)的DNA样品。

2.目标DNA的扩增

目标DNA为包含待分析的SNP的预定的DNA区域，它们通过PCR扩增。PCR通过如下列条件的常规方法进行。首先，将目标基因组DNAs稀释到浓度2.5ng/ml。然后，制备下述PCR混合物。

水(HPLC级) 2.24μl

10×缓冲液(15mM MgCl₂，25mM MgCl₂，) 0.5μl

dNTP Mix(GIBCO)(每种25mM) 0.04μl

Taq pol(HotStar)(5U/μl) 0.02μl

正向/反向引物混合物(每种1μM) 0.02μl

DNA 1.00ul

总体积 5.00μl

此处，根据已知数据库中SNP的上游和下游序列设计正向和反向引物。这些引物在下面的表3中列出。

PCR条件如下：在95℃温育15分钟；在95℃变性30秒，在56℃退火30秒，在72℃延伸1分钟，并重复45次；最终在72℃温育3分钟并贮存于4℃。结果，得到扩增的目标DNA片段，其长度为不超过200个核苷酸。

3.分析扩增的目标DNA片段中SNP的核苷酸

扩增的目标DNA片段中SNP核苷酸的分析应用从Sequenom可得到的同源MassEXTEND(hME)技术进行。MassEXTEND技术的原理如下。首先，设计终止于目标DNA片段中SNP的前一个碱基的引物(亦称为延伸引物)。然后，将引物与目标DNA片段杂交并开始DNA聚合。此时，聚合溶液含有一种试剂(例如ddTTP)，该试剂使聚合反应在掺入与第一个等位核苷酸(例如，A等位基因)互补的核苷酸之后立即终止。这样一来，当第一个等位基因(例如，A等位基因)存在于目标DNA片段中时，得到的产物中只有与该第一个等位基因互补的核苷酸(例如，T核苷酸)从引物延伸。另一方面，当第二个等位基因(例如，G等位基因)存在于目标DNA片段中时，与该第二个等位基因互补的核苷酸(例如，C核苷酸)被添加到引物的3’-末端，然后引物被延伸直到加入与最接近的第一个等位核苷酸互补的核苷酸(例如，T核苷酸)为止。从引物延伸的产物的长度通过质谱法测定。因此，可以鉴定存在于目标DNA片段中的等位基因。实验条件举例如下。

首先，将未反应的dNTP从PCR产物中去除。为此，加入1.53μl的纯水，0.17μl的HME缓冲液，0.30μl的虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)并在1.5ml试管中混合以制备SAP酶溶液。将试管在5,000rpm离心10秒。此后，将PCR产物加入SAP溶液管，密封、在37℃温育20分钟然后85℃5分钟，贮存于4℃。

接着，应用目标DNA片段作为模板进行同源延伸。用于此延伸的反应溶液的组成如下。

水(纳米级纯水) 1.728μl

hME延伸混合物(含有2.25mM d/ddNTP的10×缓冲液) 0.200μl

延伸引物(每种100μM) 0.054μl

Thermosequenase(32U/μl) 0.018μl

总体积 2.00μl

反应溶液与先前制备的目标DNA溶液彻底地混合，进行spin-down离心。将含有产物混合物的试管或板紧密地封好，在94℃温育2分钟，接着是94℃5秒、52℃5秒及72℃5秒的40个循环，贮存于4℃。所得到的同源延伸产物以树脂(SpectroCLEAN)洗涤。延伸中应用的延伸引物在下面的表3中列出。

表3用于扩增的引物和用于同源延伸目标DNAs的延伸引物

延伸产物中的多态性位点的核苷酸应用质谱法，MALDI-TOF(基质辅助激光解吸离子化-飞行时间法(Matrix Assisted Laser Desorption andIonization-Time of Flight))检测。MALDI-TOF根据如下原理操作。当分析物暴露于激光束时，它与离子化的基质(3-羟基吡啶甲酸(3-hydroxypicolinic acid))一起，在真空状态下飞向位于相对一侧的检测器。此时，计算分析物到达检测器所花费的时间。具有越小质量的物质越快到达检测器。目标DNA片段中SNP的核苷酸根据这些DNA片段和已知的SNP核苷酸序列之间的质量差异测定。

目标DNAs多态性位点的核苷酸应用MALDI-TOF检测的结果在上面的表1和2中显示。每个等位基因可以以个体中的纯合子(homozygote)或杂合子(heterozygote)的形式存在。根据孟德尔遗传定律(Mendel’s Law of inheritance)和哈迪-温伯格定律(Hardy-Weinberg Law)，构成种群的等位基因的基因组成(genetic makeup)以恒定的频率保持。当基因组成具有统计显著性时，可认为它具有生物学意义。本发明的SNP以统计上的显著水平在结肠直肠癌患者中出现，如表1和2中所示，因此能够有效地用于结肠直肠癌的诊断。

序列表

<110>三星电子株式会社(Samsung Electronics Co.Ltd.)

<120>包含单核苷酸多态性且与结肠癌有关的多核苷酸、含该多核苷酸的微阵列和诊断试

剂盒以及用该多核苷酸诊断结肠癌的方法

<130>PN060547

<160>48

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>201

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>变异

<222>(101)

<223>n＝A或C，多态性位点

<400>1

tacattactg tattgtatac attttgtcta tttcttcttt gattttgttt ttgtttttat 60

aattatttca ggtgtgggga aaaattctgt ccctgatact ncatcttgtc cagaactgga 120

agagctcatt atttctttat ttgtactgtt tttatctatt catccatagt gttctcaaca 180

gagctatcaa aagtattatc a 201

<210>2

<211>201

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>变异

<222>(101)

<223>n＝A或G，多态性位点

<400>2

tctataccac agtagtgttg atctcaagag cttagcatgt tggcttaaag acatccaggg 60

atgaggtgtt ggagtcagat tgagtttgaa tcttagctct ncttgtatta ctgtgttatc 120

ttggccaagt atttaacctc tctgaaatag gttttctcag ggctgtgaag tttggaagat 180

acataaaagc ccaaagaaaa a 201

<210>3

<211>201

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>变异

<222>(101)

<223>n＝A或C，多态性位点

<400>3

ccttaaggtg gacagaaaat gaattgtttc cttcttacca tctgttattg tttttgcctg 60

aaggcctgac tgccttccta ctccctaata aacaaagggg nattctattg accaattcat 120

tttcaaagag attttaaaag gcattaagca atcaattctc acatagtgtc caaattgagt 180

ctctcattca ttctcttgcct 201

<210>4

<211>201

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>变异

<222>(101)

<223>n＝G或C，多态性位点

<400>4

tgacctcagg tgatccaccc acctcggcat cccaaagtgc tgggattaca ggtgtgagcc 60

accacaccag gccttgggta ccatgccttg aaccatttca ntgccttttg gagatggatg 120

agttgccagc atccttctta gatccctata tatttgttta tttattgaac aaatacatat 180

taacttatct ttttgaccaa a 201

<210>5

<211>201

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>变异

<222>(101)

<223>n＝G或T，多态性位点

<400>5

cccaggattg gaaatgatgg atgctttcca ggggccccga tccatcatca gatgaatacg 60

cagccccctc cccaaggaag ctcctggttc attgagatgc ntaattctct ccttattttc 120

attactgttt ctcgtttgta tggattattt ttcttcagta atctgggctt tacatgactg 180

aataagaaaa tcatttgttc a 201

<210>6

<211>201

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>变异

<222>(101)

<223>n＝A或T，多态性位点

<400>6

atttcctgcc tgtgataaat gtgtcccaat atttgtcttt tggttgttgt tgttgagaat 60

catttctcat gttgggaaat gtgaagtcaa atagtgtgac nggacttgct gaatgattga 120

gtcaaccaca aatggtattg tcaaccatgg ctgttgaatt aatgagaaca attaaaactc 180

atttttcaga ggtcaaaaga t 201

<210>7

<211>201

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>变异

<222>(101)

<223>n＝G或T，多态性位点

<400>7

attagctaaa cagtttaatg atgatctgcc aagaaattga tgtcagcagt tagaaaacta 60

aagtcctttt ttatgcagag acagcacagt tggtaaaatt nttatagttg acaagttgga 120

aagcagtgca tgtctctgac aagacttcag ctctgtggga agtgtttgga aagaaatgga 180

gtgatagtgt ttgttggcat t 201

<210>8

<211>201

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>变异

<222>(101)

<223>n＝A或C，多态性位点

<400>8

tgctcatgta ccttatggat ttgacccacc tcattctgga caaancctca ggaggatctc 60

ttcagggaca tgatgcagtt ttgagactgg tggagattcg nacggtatga agcatttggc 120

ttcttggagt tttaggtttc taaattttga gctccaaggg tatcacacag tagctctcat 180

ttaagtgagt cttctcatgt t 201

<210>9

<211>201

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>变异

<222>(101)

<223>n＝G或T，多态性位点

<400>9

aatatgatgt cttggatttg cttcaaaata atacaagaaa agggtttgac ttttggtcag 60

tatatagatg agtcatgact gaccatgggg tgacaattgt ngaagctgag ttaggtaccc 120

agaggttcgt tataatattc tgtctatgtt aatctgcaat atgtctgaca ttttttataa 180

ttaaaacttc ttttgaaaag a 201

<210>10

<211>201

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>变异

<222>(101)

<223>n＝G或T，多态性位点

<400>10

attaaaaaac ctgtattttt ggatgtattt ttagaaaaac agatttacag gaaacaaacc 60

aaacaaaaag acttgtggta caagaaaatt agaaaataca ntatatttaa aatggacgtg 120

ttagcttgtc ccaggtaaac tcagttcaaa atatgggata aaagagattt tacttttaac 180

ttcgaacagc tagagaatga t 201

<210>11

<211>201

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>变异

<222>(101)

<223>n＝A或G，多态性位点

<400>11

aattggtaat tactttgatt aaattaattt aaaacttggc agtctgtgga gacatttttg 60

attgttagag cttggagggg ccatccgtgg gaagaggcca nggatgctgc tggaaaccta 120

caatgcccag gacagccctc aacaaaaaat gttctggctt caaatgtcaa tagctctgag 180

attgagaaac cctgttatag t 201

<210>12

<211>201

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>变异

<222>(101)

<223>n＝A或G，多态性位点

<400>12

aagcagaaga tgaccagtct gaggcttcag ggaagaaatc tgtgaaggga gtgtctaaga 60

aatatgttcc tccacgcttg gttccagtac attatggtat naactttggc tgctgcctcc 120

tcagcatgaa ctgtttctct tttctctgtt cttggataac cctgcttatt ttcatcatgt 180

agatgaaaca gaagctgagc g 201

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

acgttggatg gagctcttcc agttctggac 30

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

acgttggatg tcaggtgtgg ggaaaaattc 30

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

tccagttctg gacaagatg 19

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

acgttggatg aaagacatcc agggatgagg 30

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

acgttggatg acttggccaa gataacacag 30

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

tgagtttgaa tcttagctct 20

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

acgttggatg tggacactat gtgagaattg 30

<210>20

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

acgttggatg ccttcctact ccctaataaa c 31

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

tgaaaatgaa ttggtcaata gaat 24

<210>22

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

acgttggatg gggatctaag aaggatgctg 30

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

acgttggatg ttgggtacca tgccttgaac 30

<210>24

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

tccatctcca aaaggca 17

<210>25

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

acgttggatg aaggaagctc ctggttcatt 30

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

acgttggatg tccatacaaa cgagaaacag 30

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

ctcctggttc attgagatgc 20

<210>28

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

acgttggatg ggttgactca atcattcagc 30

<210>29

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

acgttggatg ctcatgttgg gaaatgtgaa g 31

<210>30

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>30

actcaatcat tcagcaagtc c 21

<210>31

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

acgttggatg atgcagagac agcacagttg 30

<210>32

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

acgttggatg gtcttgtcag agacatgcac 30

<210>33

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

agacagcaca gttggtaaaa tt 22

<210>34

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>34

acgttggatg actgtgtgat acccttggag 30

<210>35

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

acgttggatg tgcagttttg agactggtgg 30

<210>36

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

gccaaatgct tcataccgt 19

<210>37

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>37

acgttggatg ataacgaacc tctgggtacc 30

<210>38

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

acgttggatg tgagtcatga ctgaccatgg 30

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

tgggtaccta actcagcttc 20

<210>40

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

acgttggatg tttacctggg acaagctaac 30

<210>41

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>41

acgttggatg ccaaacaaaa agacttgtgg 30

<210>42

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>42

gctaacacgt ccattttaaa tata 24

<210>43

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>43

acgttggatg tcctgggcat tgtaggtttc 30

<210>44

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>44

acgttggatg gattgttaga gcttggaggg 30

<210>45

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>45

gtaggtttcc agcagcatcc 20

<210>46

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>46

acgttggatg agaaatatgt tcctccacgc 30

<210>47

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>47

acgttggatg aacagttcat gctgaggagg 30

<210>48

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>48

ggttccagta cattatggta t 21

Claims

1.一种由核苷酸序列SEQ ID NO：1组成的多核苷酸或其互补多核苷酸。

2.权利要求1的多核苷酸，其为引物或探针。

3.用于诊断结肠直肠癌的微阵列，其包括权利要求1的多核苷酸或其互补多核苷酸。

4.用于诊断结肠直肠癌的试剂盒，其包括权利要求1的多核苷酸或其互补多核苷酸。

5.权利要求1的多核苷酸用于制备诊断结肠直肠癌的微阵列或试剂盒的用途。

6.权利要求5的用途，其中所述的微阵列上固定了权利要求1的多核苷酸或其互补多核苷酸。