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TWI225069B - Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens including immunogenic LHRH peptides - Google Patents

Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens including immunogenic LHRH peptides Download PDF

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TWI225069B
TWI225069B TW088106135A TW88106135A TWI225069B TW I225069 B TWI225069 B TW I225069B TW 088106135 A TW088106135 A TW 088106135A TW 88106135 A TW88106135 A TW 88106135A TW I225069 B TWI225069 B TW I225069B
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peptide
gly
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TW088106135A
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Chang-Yi Wang
Original Assignee
United Biomedical Inc
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Description

1225069 玖、發明說明： 發明領域 本發明係關於一胜肽免疫原，其包括共價連結至所欲目 標抗原部位（包括B細胞抗原表位）之新穎人造τ助手抗原 表位（Th)及視需要包括一般免疫刺激子序列。此人造Th抗 原表位賦予胜肽免疫原謗導強烈T助手細胞中介之免疫反 應，及產生對抗”目標抗原部位”之抗體之能力。本發明亦 提供載體蛋白質的有利取代，及病原-衍生之T助手細胞部 位（位於藉用於改良免疫原性之新穎人造T助手細胞抗原表 位所建立之胜肽免疫原）。 已發展許多預測τ細胞抗原表位之胺基酸序列的規則。 然而’因為沒有某特定胺基酸序列如何或為何可作為τ細 胞抗原表位之主要統一理論，此等規則僅為實驗性而非普 遍適用的。雖熟知此等規則，本發明之新穎人造T助手細 胞抗原表位係藉實驗研究而發展。 本發明之胜肽免疫原係用於引起經免疫接種宿主對所欲 目標抗原部位（包括取自病原生物的部位，及取自平常為免 疫休止之自體-抗原部位，及腫瘤關聯性標的）之抗體反應。 因此，本發明之胜肽係用於種種醫學及獸醫上的應用，諸 如· I疋供保護性免疫以避免傳染性疾病之疫苗；治療正常 生理過程功能失常導致之疾病的免疫療法；治療癌症之免 疫療法及作為介入正常生理過程以產生預期結果之藥劑。 例如’本發明之新穎人造τ助手細胞抗原表位提供新穎 之短胜肽免疫原，其可引起以促黃體激素釋放激素（lhrh)
O:\56\5643 8-920620.DOC 1225069 為標的之抗體，及用於避孕、荷爾蒙-相關腫瘤的控制、預 防豬腥羶、及免疫去勢。已發現本發明之新穎人造Th抗原 表位當與各種微生物/蛋白質/胜肽之目標B細胞抗原表位 結合時可引發免疫反應。除LHRH外，已發現本發明之新 穎人造Th抗原表位可用於與其他目標抗原部位相連結，包 括促進農場動物生長的促生長素抑制素；治療過敏的IgE ; 治療和預防HIV感染及免疫失常的τ助手細胞之CD4受 體；及預防口蹄疫之口蹄疫病毒外套蛋白質。 發明背景 已知大多數抗體免疫反應是細胞-中介的，需要抗原_呈現 細胞，B細胞（抗體-產生細胞，亦具抗原呈現細胞之功能）， 和T助手（Th)細胞間之合作性交互作用。因此，有效抗體 反應之謗發作用需要B細胞辨認主體免疫原的目標抗原位 置（B細胞抗原表位）及τ助手細胞辨認Th抗原表位。一般 而言，主體免疫原上的T助手抗原表位係與它的B細胞抗 原表位疋不同的（Babbitt等人，Nature，1985 ; 317 : 359-361)。B細胞抗原表位係位於所欲目標上藉B細胞辨認 之部位，其相應產生對抗所欲目標部位的抗體。已知標的 物的自然構形決定抗體直接結合的部位。然而，蛋白質之τ 助手細胞對辨認作用卻較複雜且較不為人瞭解。（c〇rneUe 等人 ’ Methods in Enzymology，v〇1 178，， 1989，第 611-634 頁）。 根據目前的理論，Th細胞反應之引發需要τ助手細胞受 體辨認抗原-呈現細胞膜上的複合物，而非辨認所欲之目
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標，此複合物是由目標蛋白質之經處理胜肽片斷與結合類 II主要組織相容複合體（MHC)聯合形成的。因此，目標蛋 白質的胜肽處理及三方位辨識是T助手細胞反應所需。此 三部份複合物特別難以定義，因為關鍵的MHC類II接觸 殘基，位於不同的MHC結合胜肽（Th抗原表位）内，且此等 胜肽為具不同胺基酸序列之各種長度（Rudensky等人， Nature，1991 ; 353:622-627)。再者，MHC 類 II 分子本身 為高度歧異性，依宿主之基因組成而定。對特定Th抗原表 位的免疫反應性係因此部份決定於宿主之MHC基因。事實 上，已有證明顯示某些胜肽只結合至特定類II MHC對偶基 因之產物。因此，確認濫交Th抗原表位，亦即彼等有種間 及單一物種個體間交叉反應性的抗原表位，是很困難的。 已發現Th抗原表位的反應性，縱使在同族群的個體間，是 不同的。
T細胞辨認的各個步驟中之多種及不同之因素：藉抗原 處理細胞處理適當胜肽，藉遗傳基因決定的類II MHC分子 之胜肽而呈現，及MHC分子/胜肽複合物藉T助手細胞上 受體之辨識，使得決定可提供廣泛反應性的濫交Th抗原表 位之必要條件變得很困難（Bianchi等人，EP 0427347 ·· Sinigaglia 等人，Immunological Recognition of Peptides in Medicine and Biology，第 6 章，Zegers 等人編著，CRC Press，1995，第 79-87 頁）。 已清楚知道抗體之謗導，免疫原必須包括B細胞決定子 及Th細胞決定子。通常，為增加目標物的免疫原性，藉偶
O:\56\56438-920620.DOC 1225069 合目標物至載體蛋白質以提供Th反應。此技術的缺點很 多。因下列原因要製造定義明確，安全，且有效妁胜肽-載 體蛋白質結合物是很困難的： 1. 化學偶合是造成大小及組合物的異質性之隨機反應， 例如，與戊二酸的共輛作用（Borras-Cuesta等人，Eur J Immunol ^ 1987 ； 17:1213-1215)； 2. 載體蛋白質造成不希望的免疫反應之可能性，如過敏 及自體免疫反應（Bixler等人，WO 89/06974); 3. 大的胜肽-載體蛋白質引發不相干的免疫反應，明顯地 誤導載體蛋白質而非目標部位（Cease等人，Proc Natl Acad Sci USA，1987 ； 84 : 4249-4253);及 4. 載體蛋白質造成宿主之抗原表位的抑制之可能性，此 宿主先前曾經包括相同載體蛋白質之免疫原免疫接種。當 此宿主隨後以另一免疫原免疫接種其中相同載體蛋白質係 偶合至不同的半抗原，導致的免疫反應係增強載體蛋白 質，卻抑制半抗原（Schutze 等人，J Immunol，1985 ; 135 : 2319-2322)。 為避免此等風險，希望取代載體蛋白質。T助手細胞可 藉共價結合至特性明確的濫交Th決定子以供應給目標抗 原胜肽。已知的溢交Th是衍生自強力的致病劑如痲療病毒 F 蛋白質（Greenstein 等人，J Immunol，1992: 148: 3970-3977) 及B型肝炎病毒表面抗原（Partidos等人，J Gen Virol 199 1 ; 72 : 1293-1299)。本發明者已顯示許多已知的濫交Th在增 強弱免疫原性之胜肽上是有效的，如十胜肽荷爾蒙，促黃
O:\56\56438-920620.DOC 1225069 體荷爾冡-釋放荷爾蒙（LHRHXUS 5,759,551)。已發展其他 敗合胜肤’包括具弱免疫原性之合成胜肽之已知濫交Th抗 原表位’使產生強力之免疫原（B〇rras-cuesta等人，1987)。 良好設計的濫交Th/B細胞抗原表位嵌合胜肽可引發Th反 應’結果得到的抗體反應在遺傳基因歧異性之族群的大多 數成員中，均針對B細胞部位（US 5,759,551)。 對已知溢交Th抗原表位的回顧顯示它們的大小範圍自 約15至50個胺基酸殘基（us 5,759,551)及常與特定目標序 列共有共同的構造特徵。例如，一個共同特徵為兩性螺旋 體的存在。此等是具疏水性胺基酸基團佔據螺旋體的一 面，而帶電價和極性基團佔據周圍各面之…螺旋結構（Cease 等人1987)。已知的激交Th抗原表位也常含額外的初級 胺基酸型式’如帶電價基團，-Gly_，後面跟著2至3個疏 水性基團，再依次跟著一個帶電價或極性基團（R〇thbard及
Tayloi*，EMB〇J，1988 ; 7:93-101)。具此型式之抗原表位稱 為羅士拔（Rothbard)序列。已發現濫交Th抗原表位常遵守 1，4 , 5，8規則，一個正價殘基係在第四，第五，第八的 位置跟著疏水性殘基，此與兩性螺旋體位置1，4 , 5和8 位於同一面的情形一致。此疏水性及帶電價和極性胺基酸 之型式可在單一 Th抗原表位中重覆（Partid〇s等人，j Gen Vkol，1991 ; 72:1293-99)。大部份，並非所有，已知濫交τ 細胞抗原表位含至少一個上述之周期性。 打生自病原之濫交Th抗原表位包括B型肝炎表面及核心 抗原助手T細胞抗原表位（HbsAgTh和HBcTh)，百日咳毒
O:\56\56438-920620.DOC -9- 1225069 素助手T細胞抗原表位（PT Th)，破傷風毒素助手T細胞抗 原表位（TT Th)，痲疹病毒F蛋白質助手Τ細胞抗原表位 (MVF Th)，砂眼披衣菌的主要外膜蛋白質助手T細胞抗原 表位，白喉毒素助手T細胞抗原表位（DT Th)，鐮狀瘧原蟲 環圍種蟲助手T細胞抗原表位（PF Th)，曼氏住血吸蟲三糖 磷酸鹽異構酶助手T細胞抗原表位（SM Th)，及大腸桿菌 TraT助手T細胞抗原表位（TraT Th)。此等病原衍生之Th 抗原表位的序列可發現於US 5,759,551，如此中之SEQ ID NOS: 2-9及42-52表示，並入此中作為參考；亦發現於Stagg 等人，Immunology，1993 ; 79;1-9 ;及 Ferrari 等人，J Clin Invest，1991 : 88 : 214-222，亦併入此中作為參考。 此等病原衍生部位對應用至LHRH之胜肽B細胞部位之 免疫潛能之用途係已描述於US 5,759,551，HIV之用途係 描述於Greenstein等人（1992)，在瘧疾之用途係描述於EP 0 427,347,在逆轉錄病毒之用途係描述於Borras-Cuesta等人 (1987)，在痳參之用途係描述於Parti dos等人（1991)。 有用的Th抗原表位也可包括組合的Th抗原表位。Wang 等人（WO 95/11998)描述一特別種類的組合Th抗原表位， 稱為”結構性合成抗原庫n(SSAL)。此SSAL抗原表位包括 眾多的Th抗原表位，以胺基酸序列圍繞著一在特定位置具 取代物之不變的殘基之結構性架構而組成。SSAL之序列係 藉保留相對不變的基團，同時改變其他基團以提供各種不 同的MHC限制元素之辨認而決定。此可藉下列達成，將濫 交Th的初級胺基酸序列排成一列，選擇並保存造成Th胜 O:\56\56438-920620.DOC -10- 1225069 肽獨特結構的基殘做為骨架，及根據已知的MHC限制元素 改變剩餘的殘團。已有不變位置及具MHC限制元素之較佳 胺基酸的可變位置之清單，可用於得到MHC-結合特色。此 等可作為設計SSAL Th抗原表位時的參考（Meister等人，
Vaccine， 1995 ; 13:581-591) 〇 SSAL的成員可同時產生於單一次的固相胜肽合成，與標 的B細胞抗原表位及其他序列成前後縱排。此Th抗原表位 庫序列乃依，既保持濫交Th抗原表位的結構特色，並同時 提供對較廣範圍的基因連鎖群的反應性，而設計。例如， 退化的Th抗原表位’’SSAL 1 THln (WO 95/11998)，是以取 自痲疹病毒之F蛋白質的濫交抗原表位為模型得到的 (Partidos等人，1991)。SSAL1 TH1乃設計用來與目標抗 原，LHRH，協調合作的。如衍生自痲疹抗原表位，SSAL TH1 是遵循羅士拔（Rothbard)順序及1，4，5，8規則而設計且 係為4個胜肽之混合物： 15 10 15
Asp-Leu-Ser-Asp-Leu-Lys-Gly-Leu-Leu-Leu-His-Lys-Leu-Asp-Gly-Leu (序列鑑別號碼：2)
Glu lie Glu lie Arg lie lie lie Arg lie Glu lie (序列鑑別號碼: :3) Val Val Val Val Val Val Val (序列鑑別號碼: :4) Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe (序列鑑別號碼: :5) 一帶電價殘基Glu或Asp係加到位置1以增加圍繞在Th 疏水面的電價。此兩性螺旋體的疏水面則藉在2，5，8，9， 10，13及16的疏水性殘基而維持。位置2，5，8，9，10 和13被改變以提供具結合至廣範圍MHC限制元素的能力 之外觀。SSAL特徵的淨效果為擴大人造Th (WO 95/11998) 的免疫反應範圍。 O:\56\56438-920620.DOC -11 - 設計納入所有已知濫交Th抗原表位性質及特色的理想 化人造Th抗原表位已被嘗試。包括此等人造濫交Th抗原 表位之數種胜肽免疫原，包括彼等SSAL形式，也已被建 構出來。人造Th部位已與取自自體-抗原和外來抗原的胜 月太序列結合以提供對部位-專一性目標（W0 95/11998)的增 強性抗體反應’冒被描述為高度有效。此等胜肽免疫原係 車乂佳用於提供有效及安全的藉如前所述之理想濫交Th部 位引起之廣泛反應性抗體反應，及其免疫效能。 發明概述 本發明提供一個免疫原性胜肽組合物，包括連接至合成 胜肽B細胞抗原表位或”目標抗原部位”的濫交人造τ助手 細胞抗原表位。此免疫原性胜肽包括人造T助手細胞（Th) 抗原表位，及含B細胞抗原表位之目標抗原部位，及，視 需要地，一般性免疫刺激序列。免疫原性胜肽中之人造Th 抗原表位的存在賦予其誘導產生大量對抗”目標抗原部位，， 柷體的強烈T助手細胞-中介免疫反應。本發明進一步提供 載體蛋白質之有利取代及在已確立的胜肽免疫原上之病源 •衍生T助手細胞部位，專一性設計用以改進它們的免疫原 性。含有本發明之人造Th抗原表位的新穎短胜肽免疫原誘 發高濃度抗促黃體荷爾蒙-釋放荷爾蒙（LHRH)抗體，係有用 於避孕，荷爾蒙-相關腫瘤的控制，豬腥羶的預防，及免疫 去勢。 此人造Th抗原表位係經實驗性，深切注意之對預期濫交 T細胞抗原表位的已知規則而發展。缺乏解釋Th抗原表位 O:\56\56438-920620.DOC -12- 1225069 《機制之統一理論，此等"預測的”規則僅做為設計有效的 人造Th抗原表位之指導原則。已發現本發明之人造Tll抗 原表位連接至目標抗原部位及視需要與免疫刺激序列連接 疋很有用的。本發明之免疫原性胜肽可以下式表示·· (A)n-(目標抗原部位）—(B)0_(Th)m—χ 或
(A)n-(Th)m-(Β)ο-(目標抗原部位）—X 或
(目 & 抗原部位）一(B)o-(Th)m-(A)n-X 或
(Th)m-(B)o_(目標抗原部位）_(A)n一X 其中：A為胺基酸或一般性免疫刺激序列，例如，侵染 素區域（Inv)(胺基酸序列鑑別號碼·· 78)[任何其他的？]當n 大於1，各個A’s可為相同或不同； B 是選自胺基酸，-NHCH(X)CH2SCH2CO-， -NHCH(X)CH2SCH2CO(s_N)Lys-，-；N[HCH(X)CH2S-琥珀醯亞 胺（ε N)Lys_ ’及-NHCH(X)CH2S-(琥轴酿亞胺）-所組成之群；
Th是選自由胺基酸序列鑑別號碼：6_22，3卜35 及其類似物或其片斷所組成之群的人造助手τ細胞抗原表 位； ' π目標抗原部位，，為所欲之Β細胞抗原表位，胜月太 半抗原，或其免疫反應類似物； X為胺基酸a -COOH或a _CONH2 ;
O:\56\56438-920620.DOC -13 - 1225069 η為自1至約1 〇 ; m為自1至約4 ;及 〇為自0至約10 ; 一個胜肽半抗原做為目標抗原部位的例子為LHRH(胺 基酸序列鑑別號碼：77)。 本發明組合物包括能在以免疫接種之宿主身上引發對抗 所欲目標抗原部位的抗體反應之胜肽。該目標抗原部位可 折生自病原生物，正常狀況下為免疫休止之自體-抗原和腫 瘤-相關的標的如LHRH。 因此’本發明組合物在多種醫學及獸醫的應用上很有 用。此等包括對感染性疾病提供保護性免疫的疫苗，因正 常生理過程功能失常導致之疾病的免疫治療，癌症的免疫 治療’及特意介入和修改正常生理過程之藥劑。 除LHRH外，其他有用的標的包括：促進農場動物生長 的促生長素抑制素；治療過敏的IgE ;治療及預防HIV感 染及免疫失常的T助手細胞CD4受體；及做為疫苗以預防 口蹄疫之口蹄疫病毒外套蛋白質。 圖式簡要說明 在圖式中，免疫原注射的間隔在各圖底部以箭頭表示。 圖中各個貪驗動物的實驗數據以實心圓，三角形，方形表 示。 圖1用圖插述以Th/LHRH胜肽（胺基酸序列鑑別號碼： 57’ 58’ 71及75)混合物配製於明礬中投藥豬隻後，以尺认 測得之抗-LHRH血清抗體值，以RIA測得之血清睪酮濃
O:\56\56438-920620.DOC -14· 1225069 度，及以橫切片面積求得之平均大小。 圖2顯示相同的混合物配製於IFA(不完全弗羅恩特氏佐 劑，Freund’s adjuvant)之結果。 圖3顯示相同的混合物配製於ISA 206/DDA(二甲基二硬 脂溴化銨）之結果。 發明詳細說明 理想的人造Th抗原表位已被提供。此等是以兩個已知的 自然Th抗原表位及SSAL胜肽原型為模型，揭示於WO 95/11998。SSALS併入組合的MHC分子結合主體（Meister 等人，1995)意圖在遺傳基因多樣的族群成員中引發廣泛之 免疫反應。此SSAL胜肽原型是依據痲疹病毒的Th抗原表 位及B型肝炎病毒抗原設計的，藉引入多樣的MHC-結合 主體加以修飾。其他Th抗原表位的設計是藉簡化，添加， 及/或修飾多樣MHC-結合主體之其它已知Th抗原表位以 製備一系列新穎之人造Th抗原表位。此新改造之濫交人造 Th部位係併入帶有各式目標抗原部位之合成胜肽免疫原。 所得之嵌合胜肽可刺激對目標抗原部位之有效的抗體反 應。 原型人造助手T細胞（Th)抗原表位如示於表la之n SSAL 1 ΤΗ1Π(4種胜肽之混合物：序列鑑別號碼2，3，4及5)，係 以痲療病毒F蛋白質的溢交Th抗原表位為模型獲致的理想 Th抗原表位（Partidos等人，1991)。模型Th抗原表位如示 於表la之”MVFThff(胺基酸序列鑑別號碼：1)相當於痲疹病 毒F蛋白質的288-3 02殘基。MVF Th(胺基酸序列鑑別號 O:\56\5643 8-920620.DOC -15- 1225069 碼：1)是修飾成SSAL1 Thl原型（胺基酸序列鑑別號碼：2， 3，4及5)，依照”羅士拔規則n(R〇thbard規則），藉由在位 置1加一個帶電價基團Glu/Asp以增加包圍此抗原表位疏 水面的電價；在位置4’ 6’ 12及14加入或存留一帶電價 基團或甘胺酸；及在位置7和11加入或留存一帶電價基團 或甘胺酸。此Th抗原表位的疏水面包括在位置2、5、8、 9、10、13和16之殘基。通常與濫交抗原表位相聯之疏水 性殘基係在此等位置被取代以提供組合的Th SSAL抗原表 位，SSAL1 Thl(胺基酸序列鑑別號碼：2，3，4及5)。符 合羅士拔（Rothbard)序列規則的疏水性殘基以粗體字顯示 (表la，胺基酸序列鑑別號碼：2，3，4及5)。序列中之位 置遵守卜4、5、8規則者以加底線表示。原型SSAL1 Thl(胺 基酸序列鑑別號碼：2，3，4及5)的另一顯著特色為位置1 和4以不完美的重覆在位置9之一邊形成迴圈，以模擬 MHC-結合主體。SSAL1 Thl的"1、4、9”迴圈型式在胺基 酸序列鑑別號碼：6，7及8係進一步經修飾（表la)以更密 切地反映原始的MVF模型Th(胺基酸序列鑑別號碼：1)之 序列。SSAL1 Thl原型（胺基酸序列鑑別號碼：2、3、4及 5)的疏水性也在胺基酸序列鑑別號碼：6，7及8中係藉在 可變位置1、12和14加入甲硫胺酸殘基而調整。實驗數據 顯示胺基酸序列鑑別號碼：6，7及8偶合至目標抗原部位 而增強免疫接種動物對目標抗原部位之抗體反應。
胺基酸序列鑑別號碼：6，7及8係簡化成胺基酸序列鑑 別號碼：6,9，10及11(表la)以提供進一步之免疫原性SSAL O:\56\56438-920620.DOC -16- 1225069
Th抗原表位。胺基酸序列鑑別號碼·· 6，7及§再進一步簡 化成胺基酸序列鑑別號碼：6，12-14(表la)以提供一系列 單一序列抗原表位。SSALTh胺基酸序列鑑別號碼：6, 9， 10及11，和單一順序Th抗原表位胺基酸序列鑑別號碼：6， 12-14 ’偶合至目標抗原部位也提供增強之免疫原性。 已發現胺基酸序列鑑別號碼：6，7及8的免疫原性可藉 以一非極性和一極性不帶電價的胺基酸，如ne和Ser ,延 伸N端’及藉一帶電價和疏水性胺基酸，如Lys和Phe， 延伸C端而加以改進。這在表1 a中以胺基酸序列鑑別號 碼：15，16及17表示，由此衍生出簡化的SSAL Th抗原 表位胺基酸序列鑑別號碼：15，1 8及16，19。胜肽免疫原 包括目標抗原部位及選自展現增強免疫原性之胺基酸序列 鑑別號碼：1 5_ 17，1 5及1 8，及16及19之Th抗原表位。 單一序列胜肽如胺基酸序列鑑別號碼：1 5，20-22也被合成 並在動物測試免疫原性。此等也被發現是有效的Th抗原表 位。 示於表lb之SSAL人造助手抗原表位以nSSAL2 Th2n(胺 基酸序列鑑別號碼：26-30)表示，它是以相當於B型肝炎 表面抗原（HbsAg) 19-33殘基的B型肝炎病毒表面抗原胺基 酸序列鑑別號碼：23的濫交抗原表位為模型得來的 Greenstein等人，1992)。病源-衍生模型Th，係藉由添加3 個離胺酸改進水中溶解度而修飾成胺基酸序列鑑別號碼： 24 ;胺基酸序列鑑別號碼：25的C-端Asp被刪除以促進嵌 合胜肤的合成，其中Gly-Gly被導入作為間隔區。SSAL2 O:\56\56438-920620.DOC -17- 1225069
Th2(胺基酸序列鑑別號碼：26-30)乃經由改變位置1、2、3 和5的正價殘基以改變圍繞螺旋結構疏水面之電價而進一 步修飾自胺基酸序列鑑別號碼：24。在可變位置3的帶電 價胺基酸也貢獻必須的殘基以產生遵守1、4、5、8規則（加 底線的殘基）的理想Th抗原表位，SSAL2 Th2(胺基酸序列 鑑別號碼：26-30)。兩性螺旋體的疏水面由胺基酸序列鑑別 號碼·· 26-30 的 4、6、7、10、11、13、15 和 17 位置之疏 水性殘基組成。原型SSAL2 Th2(胺基酸序列鑑別號碼： 26-30)的羅士拔（Rothbard)序列殘基以粗體顯示。 胺基酸序列鑑別號碼：31-35是如上所述由而簡化自理想 SSAL2 Th2原型（胺基酸序列鑑別號碼：26-30)。例如，可 變疏水殘基係以單一胺基酸如lie或Met(胺基酸序列鑑別 號碼：31-35)取代。位置4之疏水性Phe被併入作為胺基酸 序列鑑別號碼：34之特色，然而三個離胺酸卻被刪除。C-端Asp的刪除係作為胺基酸序列鑑別號碼·· 32，34及35 的特徵。再進一步的修飾包括以共同MHC-結合基序 AxTxIL 取代 C-端（Meister 等人，1995)。 每個新型人造Th抗原表位，胺基酸序列鑑別號碼：6-22 及3 1_35與各種目標抗原部位偶合以提供胜肽免疫原。此 目標抗原部位包括胜肽荷爾蒙，LHRH和生長激素釋放抑 制因子，來自免疫球蛋白IgE的B細胞抗原表位，T細胞 CD4受體，及口蹄疫病毒的VP1外套蛋白質。結果顯示產 生可與多種自我-抗原和外來抗原交叉反應的有效抗-目標 部位抗體。最重要的是此抗體反應乃針對目標抗原部位而 〇：\56\5643 8-920620.DOC -18- 1225069 非新穎Th抗原表位。LHRH新穎胜肽免疫原之lhrh的結 果係π於表2和表3。免疫原性的結果也顯示所產生的抗體 有效地對抗LHRH而非對抗Th抗原表位本身。要強調的是 LHRH是一個無τ細胞抗原表位的目標抗原部位（sad等 人，Immunology，1992 ,· 76 ·· 599-603 和 US 5,759,551)。因 此，本發明之新穎人造Th抗原表位代表新類型的濫交丁助 手抗原表位。 本發明之人造Th抗原表位是包括類n MHC分子結合部 位之連續胺基酸序列（天然或非天然胺基酸）。它們足以加強 或刺激對目標抗原部位之抗體反應。因為几抗原表位可由 連續或不連續的胺基酸片斷組成，並非所有Th抗原表位的 每一個胺基酸都必須參與MHC的辨認。本發明之Th抗原 表位進一步包括免疫功能性同系物。功能性的Th同系物包 括免疫-增強同系物，交又反應同系物及任何此等Th抗原 表位的片斷。功能性Th同系物進一步包括保存性置換，加 入，刪除和插入自丨至約10個胺基酸殘基，及提供此Th 抗原表位的Th-刺激功能。 本發明之濫又Th抗原表位係共價連接至目標抗原部位 的N-或C-端，產生嵌合Th/B細胞部位胜肽免疫原。用語，， 胜肽免疫原”一詞在此用來表示包括共價連結至目標抗原 部位之Th抗原表位之分子，不論它是經由傳統的胜肤鍵結 形成單一較大胜肽，或是經由其他形式之共價連結如硫 酯。因此，Th抗原表位（如胺基酸序列鑑別號碼·· 6_22及 3 1-35)是經由化學偶合或直接合成而共價連結目標抗原部 O:\56\56438-920620.DOC -19- 1225069 位（如胺基酸序列鑑別號碼：77)。Th抗原表位可直接連接 至目標邵位或經由間隔區，如Gly-Gly，連接至目標部位。 除了自B細胞抗原表位物理性分開Th抗原表位（如胺基酸 序列鑑別 7虎碼· 44-64 ’ 71-76，84-90，92，94，96-102， 103及104)，區隔區可瓦解藉Th抗原表位或其功能性同系 物與目標抗原邵位連結造成的任何人為的二級構造，及藉 此排除任何對Th及/或B細胞反應的干擾。加強Th和igE 區域分離的有彈性的鉸鍊間隔區也很有用。有彈性的鉸鍊 序列常冨含脯胺酸。序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(胺基酸 序列鑑別號碼：79)提供了一個特別有用的彈性鉸鍊，其係 以發現於免疫球蛋白重鍊之彈性鉸鍊區域為模型而得到 的。在此Xaa為任何胺基酸，較佳為天門冬胺酸。間隔區（如 序列辨識號碼：80及82)所提供之構形分離允許呈現的胜 肽免疫原和適當的Th細胞及B細胞間之較有效率之相互作 用。因此加強對Th抗原表位之免疫反應，以提供改進的免 疫反應性。 本發明之胜肽結合的免疫原可視需要包括一般的刺激免 疫的胜肤序列。例如，來自細痛耶爾森氏屬（Spp) 的侵染素（Inv)蛋白質的區域（Brett等人，Eur J immunol， 1993 ’ 23 : 1608-1614)。此侵染素區域與呈現於τ細胞上 的（特別是活化的免疫或記憶Τ細胞）沒1整聯蛋白分子作用 的能力導致免疫刺激性質。連結濫交Th抗原表位之侵染素 區域（Inv)的較佳具體實例先前已描述於在us 5,759,551， 且在此納為參考文獻。該Inv區域具有下列序列： O:\56\56438-920620.DOC -20- 1225069
Thr-Ala-Lys.Ser.Lys-Lys.Phe.Pro.Ser-Tyr.Thr.Ala-Thr.Tyr.
Gln-Phe(胺基酸序列鑑別號碼·· 78)或得自另一個耶爾森氏 (Yersinia)菌種的侵染素蛋白質上的相對區域之免疫刺激同 系物。此類同系物因此可含有胺基酸殘基的取代，刪除或 插入以適應菌種間的差異，限制條件為同系物保留免疫刺 激性貝。一般性免疫刺激序列可視需要以間隔區連接至Th 抗原表位。 本發明之胜肽結合物，亦即，包括所述之人造Th抗原表 位的胜肽免疫原可以下式表示·· (A)n_(目標抗原部位）一(B)〇-(Th)m_x 或 (A)n_(Th)m-(B)o-(目標抗原部位）_x 或
(目 & 抗原邵位）—(B)〇_(Th)m-(A)n—X 或 (Th)m-(B)〇-(目標抗原部位）_(Α)η—χ 其中： Α為視需要的，且為胺基酸或一般性免疫刺激序列，當 η>1，各個A可為相同或不同； B 是選自胺基酸，_nhCH(X)CH2SCH2CO-， -NHCH(X)CH2SCH2CO〇N)Lys·，-NHCH(X)CH2S-琥 ί白醯亞 胺（s-N)Lys_，及_NHCH(X)CH2S-(琥拍酸亞胺所組成之群； Th是人造助手T細胞抗原表位（胺基酸序列鑑別號碼：
O:\56\56438-920620.DOC -21 - 1225069 6-22及3 1-35)或免疫增強同系物或其片斷； 目標抗原邵位π為一欲求之B細胞抗原表位或胜肽不完 全抗原’或其類似物； X為胺基酸a -COOH或a -CONH2 ; η為自1至約1 〇 ; m為自1至約4 ;及 〇為自0至約1 〇 ; 本發明之胜肽免疫原包括自約25至約1 〇〇個胺基酸殘 基’較佳為自約25至約80個胺基酸殘基。 當A為胺基酸，它可為任何非天然或天然發生之胺基 酸。非天然存在之胺基酸包括，但不僅限於，D-胺基酸， 石-丙胺故，鳥胺酸，正白胺酸，正纈胺酸，經脯胺酸，甲 狀腺素，7 -胺基丁酸，高絲胺酸，瓜胺酸及其類似物。自 然發生之胺基酸包括丙胺酸，精胺酸，天門冬醯胺，天門 冬胺酸，半胱胺酸，麩胺酸，麩胺醯胺，甘胺酸，組胺酸， 異白胺酸’白胺酸，離胺酸，甲硫胺酸，苯丙胺酸，脯胺 ’絲胺fee ’ I禾胺酸，色胺酸，路胺酸及纈胺酸。此外， 當η大於1 ’且二或二個以上的a是胺基酸，則每個胺基 酸可各自相同或不同。 當A為一個侵染素區域序列，較佳為來自耶爾森氏 (Yersinia)菌種的侵染素蛋白質的刺激免疫抗原表位，在此 以胺基酸序列鑑別號碼：77表示。 當η為3的具體實例中，每一 a依次為侵染素序列，甘 胺酸和甘胺酸。 O:\56\56438-920620.DOC -22- 1225069 B為視需要的，且為包含一或多個天然發生或非天然發 生之胺基酸的區隔區。在（B)。的部分，當〇>1時，每個B 可為相同或不同。B可為Gly-Gly或Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(胺基酸序列鑑別號碼：79)或-NHCH(X)CH2SCH2CO·， NHCH(X)CH2SCH2CO(s-N)Lys_，-NHCH(X)CH2S·琥珀醯亞 胺（s-N)Lys_，及 _NHCH(X)CH2S·(琥珀醯亞胺）-。
Th是選自從胺基酸序列鑑別號碼：6-20及31-35及其同 系物所組成之群的濫交T助手細胞抗原表位。 本發明之胜肽免疫原，可用普通技藝人士所熟知之化學 方法製造。例如，參見Fields等人，Synthetic Peptides中 之第 3 章：A User’s Guide，Grant，W.H_ Freeman & Co.出 版，New York，NY，1992，第77頁。胜肽可用自動化美利 弗德（Merrifield)固相胜肽合成法來合成，以t-Boc或Fmoc 保護α -NH2或支鏈胺基酸。合成胜肽的設備可得自商業來 源。應用生物系統胜肽合成儀430A或431型Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A 或 431 即為一 例0 所欲胜肽免疫原組合完成後，依標準步驟處理樹脂，將 胜肽自樹脂上切下，且去除胺基酸支鏈上的功能基。游離 胜肽以HPLC純化並做生化上之特徵化，如胺基酸分析， 胺基酸定序，或質譜分析。胜肽純化及特徵化的方法為一 般技藝熟練人士所熟知。 其他製造含本發明之Th抗原表位的胜肽免疫原的化學 方法包括藉π硫醚n(thioether)連結的形成，將鹵乙醯化及半 O:\56\56438-920620.DOC •23- 1225069 胱醯基化的胜肽結合。例如，在含Th胜肽的c端加上半胱 胺酸，此半胱胺酸的硫醇基（thi〇lgr〇up)可用於一個親電子 基如N氯乙醯基-修飾的或順丁締二醯亞胺_衍生的離胺酸 或ε-ΝΗ2基形成共價鍵，其依次連接至目標抗原部位胜 肽的Ν端。以此方式，可得到Th抗原表位/Β細胞部位結 合物。 此免疫原亦可被聚合。聚合作用可藉使用例行方法例如 戊二醛離胺酸殘基之-ΝΗ2基團反應而完成。另一方法，利 用添加額外的半胱胺酸至線性構造物之N—端，也可使線性 的Th/B細胞部位免疫原進行聚合或共同-聚合。冰端半胱 胺酸的硫醇基可用於與_乙醯基-修飾的胺基酸或順丁晞 二醯亞胺-衍生的接在一個分支的多_賴胺酸核心分子（如 K2K，K4K2K或K8K4K2K)的N端之離胺酸殘基的α_4ε-ΝΗ2 基形成”硫醚”鍵。本免疫原也可經由在分支的多_離胺酸核 心樹脂上直接合成所欲胜肽構造而聚合為分支結構（Wang 等人，Science，1991 ; 254:285-288)。 車义長的合成胜肽結合物亦可另選擇熟知的核酸選殖技術 來合成。任何分子選殖技術的標準手冊均提供詳細的操作 流程，藉基因重組DNA和RNA的表現以製造包括本發明 Th抗原表位的胜肽。建構表現本發明之τ^/目標抗原部位 胜肽（如胺基酸序列鑑別號碼：36-64，71 _76及80-82)的基 因’胺基酸序列係反轉譯成核酸順序，較佳係使用將被用 來表現遠基因的生物的最佳密碼。接著，製造編碼胜肽之 基因，藉典型地合成編碼胜肽及必需調節元素之重疊寡核 O:\56\56438-920620.DOC -24- 1225069 苷酸。合成的基因係經組合並插入所欲之表現載體。本發 明所包含的合成核酸順序包括彼等編碼本發明之Th抗原 表位者及包括彼等Th抗原表位的胜肽，其免疫功能的同系 物，及其特徵為改變非-編碼順序卻不改變藉其編碼之胜肽 或Th抗原表位的免疫原性質的核酸構築體。合成的基因係 插入適當之選殖載體並得到及特化重組體。Th抗原表位及 包括Th抗原表位的胜肽係接著在適合於所選擇之表現系 統及宿主的條件下表現。藉標準方法純化及特化Th抗原表 位或胜肽。 本發明之胜肽免疫原可單獨或聯合使用以引發對促黃體 激素釋放激素的抗體反應。促黃體激素釋放激素（LHRH)或 促性腺激素-釋放激素（GnRH)是調節雄性和雌性有性生殖 的主要激素。LHRH調節及FSH的釋放，依次控制精子生 成，排卵和動情週期，性發育。LHRH最終控制雄性荷爾 蒙雄激素和睪酮的分泌，及雌性荷爾蒙動情激素和黃體脂 酮的分泌，其本身分別是雄性和雌性生殖力所必須的（Basic 及 Clinical Endocrinology，FS Greenspan 及 JD Baxter 編 著，Appleton & Lange : Norwalk CT. 1994) 〇 長久以來已知對抗LHRH的主動免疫接種可對雄性造成 多種效果，包括減少血清及腦下垂體之LH及FSH，減少 血清之睪酮，抑制精子生成及生殖腺和輔助性器官之可逆 萎縮。（例如，參見 Fraser 等人，J. Endocrinol.，1974 ; 63:399-405 ; Giri 等人，Exp. Molec. Pathol.，1991 ; 54:255-264 ； Ladd 等人，J. Reprod. Immunol.，1989 ; O:\56\56438-920620.DOC -25- 1225069 15:85-101 ;和其中引用的文獻）。對抗LHRH之免疫作用已 證實可用於雄性避孕及有可能治療前列腺癌（Thau，Scand j
Immunol ’ 1992 ; 36 Suppl 11:127-130 ;和 US 5,759,551) 〇 藉對抗L Η R Η之主動免疫之視下丘_腦下垂體生殖腺軸的 免疫干擾也可被用於雌性以抑制性荷爾蒙。因為LHRh調 控腦下垂體前葉的FSH之製造，其再轉而調控卵巢的動情 激素之產生，阻擒LHRH的作用為女性的性荷爾蒙_相關之 疾病的治療法。例如子宮肌肉組織外的子宮内膜組織之異 位發展和維持是由動情激素居間調控。因此，阻斷Lhrh 的作用對子宮内膜組織異位形成之治療是很有用的。再 者，藉類似於前列腺癌，動情激素_驅使之乳瘤也應對lHRH 免疫治療有反應。確實，抗-lhrh誘導疫苗已顯示能有效 地減少女性血清的LH和FSH之含量，為此方法做為避孕 及治療荷爾蒙相關疾病的可能性之例證（Gual等人，
Fertility 及 Sterility，1997 ; 67 ·· 404-407)。 除了提供對一些重要的疾病及男人和女人的可逆不孕症 之治療方法，基於-LHRH之免疫治療也對雌性和雄性動物 才疋供了可逆的避孕方法（如狗，貓，馬和兔子）以及減輕不想 要的雄激素-驅使之行為，如發熱，領土劃界和侵略。 最後，免疫去勢（例如基於-抗體的LHRH作用之抑制）可 應用在頁牧業。雄性動物的肉不被加工成上等肉品，是因 為有一種令人討厭的氣味和味道存在，通稱為豬腥羶。豬 腥羶一般係藉機械去勢去除；然而，雄性食用動物的去勢 不再被認為是人道的。此外，與未_去勢雄性動物相比，機
O:\56\56438-920620.DOC -26 - 1225069 械去勢導致較差的生長表現及身體部位的損傷，此亦被稱 為屠體特徵。然而，免疫去勢動物之生長表現和屠體特徵 較去勢動物不受影響（Bonneau等人，J Anim Sci，1994 ; 72 : 14-20及US 5,573,767)。因此免疫去勢係優於機械去勢。
LHRH(或GnRH)是一個自我-分子，其必須連接至Th成 分為產生抗-LHRH 抗體（Sad 等人，Immunology，1992 ; 76 : 599-603)。數個此類LHRH之免疫原形式係經測試。例如， LHRH胜肽免疫原形式係藉與攜帶蛋白質共軛結合或藉胜 肽合成連接上衍生自病原生物的強力Th部位而製成（WO 94/07530，US 5,759,551，Sad 等人，1992)。包括 LHRH 和 人造Th抗原表位之經改良LHRH胜肽免疫原係例示於實例 1_3。 本發明亦提供包括用於投藥胜肽免疫原之藥學上可接受 之傳送系統的組合物。組合物包括免疫有效量的一或多個 本發明之胜肽免芦原。當如此調配時，包括LHRH或其同 系物作為目標抗原部位之本發明組合物，係用於前列腺癌 之治療，豬腥羶之預防，動物之免疫去勢，子宮内膜異位， 乳癌及其他受性腺類固醇荷爾蒙影響之婦科癌之治療，及 雄性及雌性的避孕。 本發明之胜肽免疫原可用佐劑，乳劑，醫藥上可接受的 載劑或其他例行提供於疫苗組合物之成份而調配成免疫原 性組合物。可用於本發明之佐劑或乳劑包括明礬，不完全 弗維恩特氏佐劑（IFA)，里波息（iip0Syn)，皂角：y：，鯊晞， L121，依馬氏吉（emulsigen)，單磷醯基脂質a(MPL)，QS21， O:\56\56438-920620.DOC -27- 1225069 和ISA 720，ISA 51，ISA 35或ISA 20ό以及其他有效的佐 劑和乳劑。此類調配物可由一般熟習此藝者輕易決定，且 也包括可立即釋放及/或可持續釋放的調配物。此疫苗可藉 任何一般途徑施用，包括皮下，口服，肌肉，腹膜或其他 非經腸途徑或腸胃途徑。相似地，免疫原可以單一劑量或 夕Μ里施用。免疫作用的時程也很容易由一般熟習技術者 決定。 本發明組合物含有效量的一或多個本發明之胜肽免疫原 及醫藥上可接受的載劑。適宜的劑量單元形式之此組合物 通常為每公斤體重含約0.5克至1毫克的胜肽免疫原。當 以多劑量輸送時，可方便地將其均分成每劑含適當量。例 如0.2-2.5毫克的劑量，較佳為1毫克，可藉注射施用，較 佳為肌肉内。也可接著重覆施打（追加注射）。正如從事疫苗 及治療的人士所熟知的，施用的劑量依受施打者的年齡， 體重和一般健康狀況而異。 包括胜肽免疫原混合物的疫苗，特別是包括衍生自MVF Th，即，胺基酸序列鑑別號碼：3-16，和HbsAg Th，即， 胺基酸序列鑑別號碼：21-25，的Th部位的混合物，可對 較廣泛的族群提供增強的免疫效力，及因此提供對抗LHRH 或其他目標抗原部位之改良的免疫反應。 對Th/LHRH胜肽結合物或其他Th/目標抗原部位結合物 的免疫反應可藉將前述免疫原包埋在O’Hagan等人所描述 的生物分解性微顆粒之中或之上的形態輸送而改良 (Vaccine，1991 ; 9 : 768)。此免疫原可含或不含佐劑而膠 O:\56\56438-920620.DOC • 28- 1225069 囊化’及此類械顆粒可帶有免疫刺激性佐劑。微顆粒亦可 與胜肽免疫原共施用以使免疫反應發生。 如一特別之實例，本發明提供謗導抗-LHrh抗體的方 法，即在特定條件下對哺乳動物施用含Th/LHRH胜肽免疫 原的醫藥組合物一段時間以在此哺乳動物身上製造一種不 育狀；。在此所用的不育狀態是指防止受孕的狀態。不孕 可用技藝人士所熟知的方法測量，如精子生成或排卵的評 估，以及動物實驗數據的統計模型。雄性的其他不孕指標 包括血清睪酮的減少至去勢水準和睪丸的衰退。組合物的 適當劑量為每公斤體重約0.5微克至1毫克的每個胜肽。 當以多次施用時此劑量可很方便地分成每劑適當量。 相似地，本發明之LHRH具體實施例係關於一種治療雄 激素-相關癌症的方法，即藉在特定狀況下對哺乳動物施用 本胜肤組合一段時間以防止腫瘤進一步的生長。適當的單 位劑量為每公斤體重約〇·5微克至1毫克的每個胜肽。當 以多次施用時此劑量可很方便地分成每次適當量。 進一步，本發明之LHRH之具體實施例係關於一種改進 雄性家畜的五官器之品質及肉質柔軟度的方法同時保持完 整雄性的有利的生長表現。完整雄性的雄激素類固醇荷爾 蒙是造成快速生長的原因，但非-雄激素類固醇（如5〇c雄脂 酮）和糞臭素（白胺酸的微生物代謝產物）也伴隨著它們存 在’而它們會給予肉品令人不愉快的味道和氣味。此情況 在豬身上稱為豬腥羶，會減損肉的品質。然而以包括本發 明之LHRH胜肽的組合物，及屠宰前數週引起免疫去勢效 O:\56\56438-920620.DOC -29- 1225069 果的接種時程，對幼年雄性動物做主動免疫，可保存許多 非-去勢雄性動物的生長優勢同時提供肉品改良的風味及 柔軟性。 包括目標抗原部位，LHRH之本發明的胜肽組合之功效 可以述於實例1-3中之步驟測試。 實例1 反含LHRH的胜肤免疡屈齋去鼠倣务痛接種 列於表2a和表2b的胜肽是以如下所述的方法合成及測 試 A_胜肽合成列於表2a和表2b的胜肽各別用美利弗德 (Merrifield)固相合成技術在應用生物系統自動化胜肽合成 儀（430，431和433A型）上以Fmoc化學法合成。包含結構 合成抗原庫（SSALs)，如，人造Th部位定名為胺基酸序列 鑑別號碼·· 6-8的胜肽構造物之製備是藉由提供特定位置想 要的胺基酸混合物來完成的。在組合完成想要的胜肽或結 合的胜肽後，依標準程序用三氟醋酸處理樹脂，將胜肽自 樹脂上切下，並除去胺基酸側鏈上的保護基團。 經切下，萃取並清洗過的胜肽以HPLC純化，並以質譜 儀及逆相HPLC鑑定。 合成胜肽以使其LHRH目標抗原胜肽（胺基酸序列鑑別號 碼：77)與每個列於表2a和表2b中經設計的Th抗原表位 成如後縱排。此等Th抗原表位是表和表lb中所示者（胺 基酸序列鑑別號碼·· 6-20及31-35)。為了比較，包含模型 Th部位（胺基酸序列鑑別號碼：36和65)，及原型Th部位（胺 O:\56\56438-920620.DOC -30 - 1225069 基酸順序鑑別號碼·· 37-40及66-70)的先前的胜肽免疫原及 胜肽/載體蛋白質結合物，KLH-LHRH(表2b)亦經製備及測 試。合成Th/LHRH及Inv/Th/LHRH胜肽構造物係在目標抗 原部位和Th抗原表位間帶有Gly-Gly作為間隔區，及在 Th抗原表位與Inv免疫刺激序列間帶有或沒有Gly-Gly作 為區隔區。此外，胺基酸序列鑑別號碼：80-82係在Th部 位和目標抗原部位間以胺基酸序列鑑別號碼：79作為間隔 區而合成。胜肽免疫原胺基酸序列鑑別號碼：80和82之實 驗結果尚不可得。 B ·免疫接種的實驗流程示於表2a及表2b之LHRH胜 肽免疫原係以5至10隻老鼠之群組評估，藉陳述於下面之 實驗的免疫接種流程及血清分析以測定血清樣品的免疫原 性： 動物： 雄性Sprague-Dawley鼠 群組大小：5 -10隻鼠/組 免疫原： 劑量： 佐劑： 施劑時程 途徑： 個別的胜肽免疫原 劑量單位如指定的為微克，在〇·5毫升中 ⑴弗維心特氏不元全佐劑（Freun(j，s incornplete Adjuvat，IFA);或 (2)明礬（氫氧化鋁）； 每組每種免疫原用一種佐劑 在貝驗中特別指明第〇，3，及6週或第〇，3週 肌内注射 且在做ELISA及放射性 收集血液並經處理以得到血清
O:\56\56438-920620.DOC -31 - 1225069 免疫分析（RIA)以測定血清睪酮值前先儲存。 C.免疫原之測定方法抗體活性以ELISA(酵素-連結-免 疫吸附分析法）測定，用96-孔平底微量盤，先塗覆LHRh 胜肽（胺基酸序列鑑別號碼：77)做為免疫吸附劑。以每孔等 量（100微升），濃度為5微克/毫升之胜肽免疫原溶液在37 °C培育1小時。再以3%明膠/磷酸緩衝液溶液在37〇c培 育1小時以封阻微量盤。經封阻的微量盤接著乾燥並用於 刀析。添加♦ I (1 〇 〇微升）之測試免疫血清，係起始以1 · 1 〇 〇 稀釋於樣品稀釋緩衝液，之後做10倍連續稀釋而得，至經 胜肽塗覆之微量盤。微量盤在37°C培育1小時。 微量盤以含0.05%Tween®之PBS清洗6次。100微升之 以辣根過氧化酶標示之羊-抗-鼠IgG抗體以結合稀釋緩衝 液（含0.5莫耳濃度NaCl和正常羊血清的磷酸緩衝液）稀釋 至適當丨辰度後添加。微量盤在3 7 °C培育1小時後再以上述 方法清洗。接著添加等量的（1 〇〇微升）鄰伸苯基二胺受質溶 液。讓酵素顏色反應進行5_15分鐘再加入5〇微升2Nh2S04 以中止反應。每孔中的内容物之A492nm以微量盤讀計讀 出。根據吸光度的線性迴歸分析計算ELISA效價，A492nm 的切斷值設定為〇·5。當與每次分析一起測的稀釋正常對照 樣品的讀值低於0.5時，此切斷值是非常精準的。 力的測定免疫原係藉RIA分析測量血清睪 酮值來評估效力。血清睪酮量的測量是用診斷產品公司 (Los Angeles，CA)的RIA試劑依製造商的指示來做。睪酮 的偵測下限範圍在〇·〇1至〇〇3毫微莫耳/升之間。每個樣
O:\56\56438-920620.DOC -32- 1225069 w白以一重覆分析。當血清樣品的睪酮值低於偵測下限時 即被算為達去勢程度，而<0.1毫微莫耳/升時則為，，接近去 勢。實驗結果與機械去勢老鼠的血清睪酮值比較而得到證 實。 E.|^_在第1〇或12週收集到的血清樣品之結果列於 表2a及表2b。（表中的胜肽是以它們的Th抗原表位的衍生 作用來排列，正如在表la及表lb所做者。）eusa數據（未 不於此）說明藉所有列出之免疫原做的免疫接種在所有動 物導致抗體反應。因為與自然的LHRH交叉反應而產生的 柷-胜肽抗體反應之效力由測定血清睪酮濃度來建立。彼等 實驗結果總結在表2a及表2b的右欄，以每群組中全部動 物之具去勢水準血清睪酮之動物數目來表示。 結果顯示本發明之胜肽，無論是含強佐劑IFA並以高劑 量投藥三次’或含弱佐劑明礬並以低劑量投藥2次皆有效 於製造免疫去勢。Th部位序列鑑別號碼：6，9及15的免 疫原性藉加入Inv區域序列而增進。見序列鑑別號碼：41， 44及45，46間及序列鑑別號碼·· 53和60間之比較。然而， 加入Inv區域序列並非總會導致免疫原性的增進，例如， 比較序列鑑別號碼：51和52，序列鑑別號碼：61和62， 及’序列4監別號碼·· 7 4和7 5。本發明中的二個胜肽（序列 鑑別號碼：5 0和76)只在低劑量含弱佐劑下測試，並未引 起免疫去勢，但與其他胜肽之結果，如，序列鑑別號碼： 73，指出它們在高劑量與強佐劑是有效的。本發明的許多 LHRH胜肽免疫原在引起免疫去勢較KLH/LHRH胜肽載體 O:\56\56438-920620.DOC -33- 1225069 蛋白質結合物或具HbsAgTh(序列鑑別號碼：65及66-70) 的胜肽免疫原具顯著有效性。見表2b。 本發明之胜肽免疫原亦較胜肽/載體結合蛋白質或帶有 較複雜之前案原型Th抗原表位的胜肽免疫原（序列鑑別號 碼：2-5或26-3 0)更容易合成。且，含本發明之人造Th抗 原表位的胜肽免疫原在較少和較低的劑量下可得到相當的 或增進的免疫原性。 獲得本發明之LHRH胜肽的老鼠之抗體反應之血清說明 對抗胜肽之抗體反應係專一地針對目標抗原部位而非針對 新穎人造Th部位。其為此等胜肽免疫原優於傳統胜肽/載 體蛋白質結合物的顯著優點。得自經示於表3的胜肽免疫 原以25微克劑量於明礬在第0和第3週免疫接種之老鼠的 血清樣品係藉ELIS A分析使用LHRH胜肽（序列鑑別號碼： 77)及適當的Th抗原表位（序列鑑別號碼：15及18，31及 34)做為固相受質於基於胜肽之ELISAs，比較其對LHRH 目標部位和Th抗原表位的反應性。此等ELIS As之結果係 示於表3，其顯示雖然針對Th/LHRH胜肽結合物的LHRH 部分有很高的效價反應，但針對人造Th部位的反應性只有 背景值。 實例二 LHRH胜肽混合物在老鼠引發廢泛的免疫去勢 如上面範例1中所示，建立各種人造Th抗原表位/ LHRH 構造物的相對效力，得以選擇其中最有效的來組合增強免 疫原性的胜肽混合物。Th/LHRH胜肽免疫原的混合物較混 O:\56\56438-920620.DOC -34- 1225069 合物中任何個別的胜肽更有效力（US 5,795,551)。再者，帶 有衍生自MVF Th(序列鑑別號碼：2)和HbsAg Th(序列鑑別 號碼·· 18-20)的濫交Th抗原表位的個別構造物之混合物較 只帶有衍生自一個濫交Th抗原表位的Th抗原表位之胜肽 組合在遺傳基因歧異的族群中可提供較廣泛的反應。因 此’包含衍生自MVF Th和HbsAg Th的本發明胜肽混合物 之組合物係經組合，並測試此混合物的功效並與包含混合 物之個別胜肽之組合物比較。 6或8隻雄鼠之群組係以25微克劑量（總劑量）的表4中 所不之胜肽組合進行免疫。混合物中的胜肽以等莫耳比例 混合。胜肽以〇·4%的明礬調配並於第〇和3週以肌内注射 投藥。追蹤血中睪酮含量22週，結果以每群組動物總數中 畢銅值達去勢水準的動物數評分。此等結果列於表4。它們 說明低劑量的胜肽組合物，供給效力相當低的佐劑，一在 第五週可達到睪酮的去勢水準，且此反應可維持到22週。 此外胜肽混合物較一個包含個別胜肽的胜肽組合表現顯 著地較好。可假定若實驗動物數更多且更足以代表真實的 叙群的話’混合物顯示增進的免疫原性將超越其他個別胜 肽組合物。 實例3
一組測試動物已顯示對具不同Th抗原表位的胜肽免疫 原混合物較含單一胜肽免疫原的組合物具有較廣泛的反應 性。然而，對豬腥羶的預防，免疫強效性LHRH胜肽免疫
O:\56\56438-920620.DOC -35- 1225069 原必須足夠強力地可在大多數動物體内引起想要的反應而 同時又可被接受在食用動物身上使用。很重要的是它對生 長速率沒有立即的反作用，且胜肽免疫原或佐劑也不會殘 留在肉中或在屠體可販賣的部分造成損傷。 為了評估本發明的LHRH胜肽混合物之有用的免疫原 性，混合物以三種調配物施用於豬隻，於0.4%明礬，IFA， 或ISA 206/DDA中。ISA 206/DDA是一種油/水乳劑，其 中二甲基二硬脂溴化銨（DDA)係以30毫克/毫升的濃度散 佈於 MONTANIDE® ISA 206 中（MONTANIDE® ISA 206 是一 種油性的可代謝的溶液，由位於Fairfield，NJ的SEPPIC Inc. 供應）。此油質懸浮液接著與胜肽水溶液以體積1 : 1的比 例乳化，此胜肽水溶液已調節胜肽使在0 · 5毫升之最終製 備物中可提供想要的胜肽劑量。 免疫接種流程 動物： 雄的約克-漢普夏雜種豬 3-4週大，未去勢 群組大小：2-3隻動物/組 免疫原： 序列鑑別號碼：42，50和57的等莫耳量混合物 劑量： 0.5毫升中含400微克的胜肽 佐劑： （1)0.4%明蓉， (2) IFA，
(3) ISA 206/DDA 施打時程：第0，4，和13週或第0，4週 途徑： 肌内 O:\56\56438-920620.DOC -36- 1225069 胜肽免疫原調配物的功效藉分析經研究目的而收集來的 豬血清樣品監測，結果以圖形表於圖1-3。分析包括如下所 述之用於測定與溶液中的天然LHRH有交叉反應的抗體之 存在之RIA，和在範例1中所述之睪酮的RIA。再者，平 均睪丸橫切面面積以測徑器的跳動量得。 用於抗-LHRH RIA之抗血清以pH 7.4的1°/。牛血清蛋白 (BSA)稀釋1 : 100倍。添加等體積之稀釋血清至100微升 之稀釋於1%BSA而含有約100微升的[125I]-LHRH(新英格 蘭核子公司，波士頓，馬里蘭州）中加入等體積的稀釋血 清，此[125I]_LHRH是稀釋於1% BSA中使5.25微微克的 LHRH含約15,000 cpm。溶液在室溫培育過夜，抗體-結合 的LHRH以400微升之25%聚乙二醇（MW 8,000)於pH 7.6 的0.01莫耳濃度磷酸-緩衝鹽水（PBS)，和200微升之5毫 克/毫升牛伽瑪（γ)球蛋白於PBS沉澱。抗-LHRH抗體的濃 度以每升血清所結合的毫微莫耳濃度含放射性碘的LHRH 量表示（Ladd 等人，1988，Am J Reprod Immunol，17 : 121-127)。 三項分析的結果以圖描述於圖1-3。免疫原施打的間隔在 圖底以箭頭表示。每一圖中個別實驗動物之測定以實心 圓，三角形及方形表示。豬對三種調配物皆有免疫反應， 如抗-LHRH抗體的存在和伴隨發生的睪酮抑制上所示者。 明礬製備物（圖1)效力最低，產生較低程度的抗體反應。 此組中之一動物的至第11週才達到去勢水準之睪酮含量且 組中全部的二隻動物的睪丸未顯示完全退化。明礬組的動 O:\56\56438-92062O.DOC -37- 1225069 物在第13週未接受免疫接種，而先前處理的效果也被還原。 IFA組的動物（圖2)展現較高程度的抗體反應，三隻之中 的二隻動物在第6週達到且維持去勢水準。然而，在第13 週追加劑量投藥後，三隻豬中反應最弱的一隻卻無反應且 其睪酮含量又回復正常水準，睪丸也恢復未·退化狀態。此 組中其餘二隻有反應的動物在第23週時睪丸達到完全退化 的狀態。 ISA 206/DDA組的二隻豬（圖3)有高且相當一致程度的抗 體反應。此組的睪酮之免疫去勢程度含量在第9週達到且 穩定地持續到第12週。兩隻動物皆對第13週的追加注射 有反應且睪酮含量均保持在去勢水準。到第23週時兩隻動 物的睪丸皆不可偵測到了。 得自ISA 206/DDA調配物之結果為最佳用於預防豬腥羶 者在兩又動物之向且均一的效果是# isa 2〇6/加八調配 物所達成的。1，與會引起損傷的IFA調配物比較，該調 配物在豬為較可接受者。明顯地，因Λ IFA調配物不易被 代謝。 、其說明本發明之人^Th抗原表位刺激對抗LHRH的有效 抗體反應。
O:\56\56438-920620.DOC -38- 1225069 表一 模型、原型、及人造的理想Th抗原表位 a.由此衍生之MVF Th和Th抗原表位
Th辨識者 胺基酸序列 ， MVF Th 序列鑑別號碼：1 LSEIKGVIVHRLEGV SSAL1 Thl 序列鑑別號碼：2 序列鑑別號碼：3 序列鑑別號碼：4 序列鑑別號碼：5 DLSDLKGLLLHKLDGL El Elg iH RIE 工 V V~" VW V V F F FFF F F· 序列鑑別號碼：6 序列鑑別號碼：7 序列鑑別號碼：8 ISEIKGVIVHKIEG工 MT * RT TRM TM L L V 序列鑑別號碼：6 序列鑑別號碼：9 ISEIKGVIVHKIEG工 T RT TR T 序列鑑別號碼：10 序列鑑別號碼：11 MSEIKGVIVHKLEGM LT MRT TRM TV 序列鑑別號碼：6 工SEIKGVIVHKIEG工 序列鑑別號碼：12 工TEIRTVIVTRIETI 序列鑑別號碼：13 MSEMKGVIVHKMEGM 序列鑑別號碼·· 14 LTEIRTVIVTRLETV 序列鑑別號碼：15 序列鑑別號碼：16 序列鑑別號碼：17 rSISEIKGVIVHKIEGILF MT RT TRM TM L L V 序列鑑別號碼：15 i序列鑑別號碼：18 工SISEIKGVIVHKIEGILF T RT TR T 序列鑑別號碼：19 序列鑑別號碼：105 工 SLSEIKGVIVHKLEGMLF MT MRT TRM TV 序列鑑別號碼：15 工SISEIKGVIVHKIEGILF 序列鑑別號碼·· 20 工SITEIRTVIVTRIETILF 序列鑑別號碼：21 工 SMSEMKGVIVHKMEGMLF 序列鑑別號碼：22 工 SLTEIRTVIVTRLETVLF
b.HbsAg Th，原型，和衍生物
Th辨識者 胺基酸序列 HbsAg.Th 序列鑑別號碼·· 23 FFLLTRILTIPQSLD 序列鑑別號碼·· 24 KKKFFLLTRILTIPQSLD 序列鑑別號碼：25 FFLLTRILTIPQSL SSAL2 Th2 序列鑑別號碼：26 序列鑑別號碼：27 序列鑑別號碼：28 序列鑑別號碼：29 序列鑑別號碼：30 KKKLFLLTKLLTLPQSLD RRRIKII RII 工 L IR 一VR豆 V I ▽ F FF FF F V F F 丨 序列鑑別號碼：31 KKKIITITRIITIITTID ^ 丨序列鑑別號碼：32 KKKIITITRIITIITTI 序列鑑別號碼：33 KKKMMTMTRMITMITTID ' i序列鑑別號碼：34 FITMDTKFLLASTHIL 1序列鑑別號碼：35 KKKFITMDTKFLLASTHIL O:\56\56438-920620.DOC -39- 1225069 表二 LHRH胜肽的免疫原性 a-MVF Th衍生物 序列鑑 調配物 別號碼 抗原胜肽的描述 去勢數 去勢數 36 (序列鑑別號碼：l)-GG-(LHRH)a 400微克/劑量 IFA(0,3,6wpi) 8/10 400微克/劑量明 鳖(Ό·3,6 wpi) 5/5 37 38 39 40 (序列鑑別號碼：2)-GG-(LHRH)a (序列鑑別號碼：3)-GG-(LHRH)a (序列鑑別號碼：4)-GG_(LHRH)a (序列鑑別號碼：5)-GG-(LHRH)a 400微克/劑量 IFA (0,3,6 wpi) 9/10 400微克/劑量明 % (0,3,6 wpi) 2/5 41 42 43 (序列鑑別號碼：6)-GG-(LHRH)a (序列鑑別號碼：7)-GG-(LHRH)a (序列鑑別號碼：8)-GG-(LHRH)a 400微克/劑量 IFA (0,3,6 wpi) 6/6 25微克/劑量明礬 (0,3,6 wpi) 3/8 41 44 (序列鑑別號碼：6)-GG_(LHRH)a (序列鑑別號碼：9)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量明礬 ro.3.6 Wpi) 1/6 45 46 (Inv)b-GG-(序列鑑別號碼：6)-GG-(LHRH)a (Inv)b-GG-(序列鑑別號碼：9)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量明礬 (03.6 wpi) 5/5 47 48 (序列鑑別號碼：l〇)-GG-(LHRH)a (序列鑑別號碼：ll)-GG-(LHRH)a 100微克/劑量 IFA(0,3,6wpi) 4/6 25微克/劑量明礬 Γ0.3 wpi) 1/8 45 (Inv)b-GG-(序列鑑別號碼：6)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明_，3 wpi) 2/6 49 (序列鑑別號碼：12)-GG_(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明襞(〇,3 wpi) 5/6 50 (序列鑑別號碼：13)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明襞(〇,3 wpi) 0/6 51 (序列鑑別號碼：14)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明礬(0,3 wpi) 5/6 52 (Inv)b-GG-(序列鑑別號碼：14)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明礬(〇,3 wpi) 3/6 53 54 55 (序列鑑別號碼：15)-GG-(LHRH)a (序列鑑別號碼：16)-GG-(LHRH)a (序列鑑別號碼：17)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明礬(〇,3 wpi) 4/8 53 56 (序列鑑別號碼：15)-GG-(LHRH)a (序列鑑別號碼：18)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明礬(0,3 wpi) 6/6 57 58 (Inv)b-GG-(序列鑑別號碼：15)-GG-(LHRH)a (Inv)b-GG-(序列鑑別號碼：18)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明礬(0,6wpi) 6/6 59 106 (序列鑑別號碼：19)-GG-(LHRH)a (序列鑑別號碼：l〇5)-GG-(LHRH)a 100微克/劑量 IFA(0,3,6wpi) 6/6 25微克/劑量 明礬(0,3 wpi) 14/14 O:\56\56438-92O620.DOC -40- 53 (序列鑑別號碼：15)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明礬(〇,3 wpi) 1/6 60 (Inv)b-(序列鐘別號碼：15)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明礬(〇,3 wpi) 4/6 61 (序列鑑別號碼：20)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明礬wpi) 4/6 62 (Inv)b-GG-(序列鑑別號碼：20)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量明蓉 Γ0.3 wpi) 2/6 63 (Inv)-(序列鑑別號碼：21)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明礬(〇,3 wpi) 1/6 64 (序列鑑別號碼：22)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明霖(〇,3 wpi) 4/6 b.HBs Ag Th衍生物 序列鑑 別號碼 抗原胜肽的描述 配方 去勢數 去勢數 65 (序列鑑別號碼：23)-GG-(LHRH)a 400微克/劑量 IFA(0,3,6wpi) 10/10 400微克/劑量 明礬（〇,3,6wpi) 0/5 66 67 68 69 70 (序列鑑別號碼：26)-GG_(LHRH)a (序列鑑別號碼：27)-GG-(LHRH)a (序列鑑別號碼：28)-GG-(LHRH)a (序列鑑別號碼：29)-GG-(LHRH)a (序列鑑別號碼：30)-GG-(LHRH)a 400微克/劑量 IFA (0,3,6 wpi) 9/10 400微克/劑量 明礬（〇,3,6 wpi) 2/5 71 (序列鑑別號碼·· 31)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明礬（0,3wpi) 8/8 72 (序列鑑別號碼：32)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明礬（0,3wpi) 4/6 73 (序列鑑別號碼：33)-GG-(LHRH)a 100微克/劑量 IFA(0, 3, 6 wpi) 4/6 25微克/劑量明礬 (0,3 wpi) 0/6 74 (序列鑑別號碼：34)-GG-(LHRH)a 100微克/劑量 IFA(0, 3, 6 wpi) 6/6 25微克/劑量 明礬（0,3wpi) 5/8 75 (Inv)b-GG-(序列鑑別號碼：34)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明礬（0,3wpi) 4/6 76 (序列鑑別號碼：35)-GG-(LHRH)a N.D. 25微克/劑量 明礬（0,3wpi) 0/8 KLHc-(LHRH)a N.D. 50微克/劑量 明礬（0,3wpi) 2/8 1225069 a LHRH=EHWSYGLRPG (序列鑑別號碼:77) b INV=侵染素區域 （序列鑑別號碼:78) c KLH=鎖孔貝血藍蛋白 d鉸鍊間隔區=PPXPPXP (序列鑑別號碼：79) O:\56\56438-920620.DOC -41 - 1225069 表三 抗體對目標抗原部位的專一性評估 序列鑑別號碼 LHRH反應性a Th反應性b 53 及 56 6/6 0/6c 71 8/8 0/8d 74 4/8 0/8e 抗-LHRH抗體值>1:1000的動物數/接受免疫接種的動物總數。 此ELISA的胜肽為序列鑑別號碼：77。 b抗-Th反應>0·100 A49G的動物數/接受免疫接種的動物總數。 血清稀釋1: 1〇〇倍而所有的Th胜肽的A490值皆為背景值。 c ELISA胜肽為序列鑑別號碼:15及18。 d ELISA胜肽為序列鑑別號碼:31。 e ELISA胜肽為序列鑑別號碼:34。 表四 人造Th/LHRH胜肽成分及混合物的評估 免疫原a 0 wpi 5 wpi 8 wpi 10 wpi 14 wpi 18 wpi 22 wpi 序列鑑別號碼：64+明礬 0/8b 3/8 8/8 8/8 7/8 5/8 3/8 序列鑑別號碼：57及58+ 明礬 0/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 序列鑑別號碼：64+ 序列鑑別號碼：57及58+ 明礬 0/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 a個別LHRH胜肽組合物或混合的LHRH胜肽組合物以明釁配製。 免疫接種的療程：25微克/劑於第〇和3wpi。 b免疫去勢的動物數/實驗組中動物總數。當動物的血清睪酮 值為<0.1毫微莫耳/升至不可偵測時，此動物便被計為已免疫去勢。 O:\56\56438-920620.DOC -42- 1225069 (2)序列鑑別號碼：1之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：1 :
Leu Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His Arg Leu 1 5 10
Glu Gly Val 15 (2)序列鑑別號碼：2之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：16個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：2 :
Asp Leu Ser Asp Leu Lys Gly Leu Leu Leu His Lys 1 5 10
Leu Asp Gly Leu 15 (2)序列鑑別號碼：3之資料： (i)序列之特點： (A) 長度：16個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 -2- 1225069 (C)拓樸學：直線 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：3 :
Glu lie Ser Glu 工le Arg Gly lie lie lie His Arg 1 5 10 lie Glu Gly lie 15 (2)序列鑑別號碼：4之資料： (〇序列之特點·· (A) 長度：16個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (C) 拓樸學：直線 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：4 ··
Asp Val Ser Asp Val Lys Gly Val Val Val His 1 5 l〇
Lys Val Asp Gly Val 15 (2)序列鑑別號碼：5之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：16個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (C) 拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：5 : 1225069
Asp Phe Ser Asp Phe Lys Gly Phe Phe Phe His 1 5 l〇
Lys Phe Asp Gly Phe 15 (2)序列鑑別號碼：6之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：6 : lie Ser Glu lie Lys Gly Val 工le Val His Lys lie 15 10
Glu Gly lie 15 (2)序列鑑別號碼：7之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：7 :
Met Thr Glu lie Arg Thr Val 工le Val Thr Arg Met 1 5 10
Glu Thr Met 15 20 (2)序列鑑別號碼：8之資料： 1225069 ⑴序列之特點： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：8 :
Leu Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His Lys Leu 15 10
Glu Gly Val 15 (2)序列鑑別號碼：9之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：9 : lie Thr Glu lie Arg Thr Val lie Val Thr Arg lie 1 5 10
Glu Thr lie 15 (2)序列鑑別號碼：10之資料： (i)序列之特點： (A)長度：15個胺基酸 1225069 (B)型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼·· 10 :
Met Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His Lys Leu 15 l〇
Glu Gly Met 15 (2)序列鑑別號碼：11之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：11 :
Leu Thr Glu Met Arg Thr Val 工le Val Thr Arg Met 1 5 10
Glu Thr Val 15 (2)序列鑑別號碼：12之資料： (i) 序列之特點·· (A) 長度：15個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：12 : -6 - 1225069 lie Thr Glu lie Arg Thr Val lie Val Thr Arg lie 1 5 10
Glu Thr He 15 (2)序列鑑別號碼：13之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：13 :
Met Ser Glu Met Lys Gly Val lie Val His Lys Met 1 5 10
Glu Gly Met 15 (2)序列鑑別號碼：14之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：14 :
Leu Thr Glu lie Arg Thr Val 工le Val Thr Arg Leu 15 10
Glu Thr Val 15 (2)序列鑑別號碼：15之資料： 1225069 (i) 序列之特點： (A) 長度：19個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：15 : lie Val His 10 lie Ser lie Ser Glu lie Lys Gly Val 1 5
Lys lie Glu Gly lie Leu Phe 15 (2)序列鑑別號碼：16之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：19個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：16 : lie Val Thr 10 lie Ser Met Thr Glu 工le Arg Thr Val 1 5
Arg Met Glu Thr Met Leu Phe 15 (2)序列鑑別號碼：17之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：19個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 1225069 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：17 : lie Ser Leu Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His 1 5 10
Lys Leu Glu Gly Val Leu Phe 15 (2)序列鑑別號碼：18之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：19個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓'樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：18:
He Ser lie Thr Glu He Arg Thr Val lie Val Thr 1 5 10
Arg lie Glu Thr Ile Leu Phe 15 (2)序列鑑別號碼：19之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：19個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：19 : lie Ser Leu Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His 1 5 10
Lys Leu Glu Gly Met Leu Phe 15 1225069 (2)序列鑑別號碼：20之資料·· (i) 序列之特點： (A) 長度：19個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述··序列鑑別號碼：20 ·· lie Ser 工le Thr Glu 工le Arg Thr Val lie Val Thr 15 10
Arg lie Glu Thr lie Leu Phe 15 (2)序列鑑別號碼：21之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：19個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：21 : lie Ser Met Ser Glu Met Lys Gly Val lie Val His 15 10
Lys Met Glu Gly Met Leu Phe 15 (2)序列鑑別號碼：22之資料： (i)序列之特點： (A)長度：19個胺基酸 1225069 (B)型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：22 :
He Ser Leu Thr Glu lie Arg Thr Val lie Val Thr 1 5 10 Arg Leu Glu Thr Val Leu Phe 15 (2)序列鑑別號碼：23之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：23 :
Phe Phe Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr lie Pro Gin 15 10
Ser Leu Asp 15 (2)序列鑑別號碼：24之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：18個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：24 : -11 - 1225069
Lys Lys Lys Phe Phe Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr 15 10 lie Pro Gin Ser Leu Asp 15 (2)序列鑑別號碼：25之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：14個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：25 :
Phe Phe Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr lie Pro Gin 1 5 10
Ser Leu (2)序列鑑別號碼：26之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：18個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：26 :
Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr 1 5 l〇
Lgu Pro Gin Ser Leu Asp 15 (2)序列鑑別號碼：27之資料： -12- 1225069 (i) 序列之特點： (A) 長度：18個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：27 :
Arg Arg Arg lie Lys lie lie Thr Arg lie lie Thr 1 5 10 lie Pro Leu Ser 工le Arg 15 (2)序列鑑別號碼：28之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：18個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：28 :
Lys Lys Lys Val Arg Val Val Thr Lys Val Val Thr 1 5 i〇
Val Pro lie Ser Val Asp 15 (2)序列鑑別號碼：29之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：18個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽
-13- 1225069 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：29 :
Lys Lys Lys Phe Phe Phe Phe Thr Lys Phe Phe Thr 1 5 l〇
Phe Pro Val Ser Phe Asp 15 (2)序列鑑別號碼：30之資料： (i)序列之特點： (A) 長度：18個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (Π)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：30 :
Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr. 1 5 10
Leu Pro Phe Ser Leu Asp 15 (2)序列鑑別號碼：31之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：17個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：31 :
Lys Lys Lys lie lie Thr lie Thr Arg lie lie Thr 15 10 lie lie Thr Thr 工le Asp 15 -14- 1225069 (2)序列鑑別號碼：32之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：17個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：32 :
Lys Lys Lys lie lie Thr lie Thr Arg 工le lie Thr 1 5 10 lie lie Thr Thr lie 15 (2)序列鑑別號碼：33之資料：
(i) 序列之特點： (A) 長度：18個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線
(ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：33 :
Lys Lys Lys Met Met Thr Met Thr Arg Met lie Thr 1 5 10 Met He Thr Thr He Asp 15 (2)序列鑑別號碼：34之資料： (i)序列之特點·· -15- 1225069 (A) 長度：16個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：34 :
Phe lie Thr Met Asp Thr Lys Phe Leu Leu Ala Ser 1 5 l〇
Thr His lie Leu 15 (2)序列鑑別號碼：35之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：19個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：35 :
Lys Lys Lys Phe lie Thr Met Asp Thr Lys Phe Leu 1 5 10
Leu Ala Ser Thr His lie Leu 15 (2)序列鑑別號碼：36之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：27個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽
-16- 1225069 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：36 :
Leu Ser Glu lie Lys Gly Val 工le Val His Arg Leu 1 5 10
Glu Gly Val Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu 15 20
Arg Pro Gly 25 (2)序列鑑別號碼：37之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：28個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：37:
Asp Leu Ser Asp Leu Lys Gly Leu Leu Leu His Lys 1 5 l〇
Leu Asp Gly Leu Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Glv 15 20
Leu Arg Pro Gly 25 (2)序列鑑別號碼：38之資料： (i) 序列之特點·· (A) 長度：28個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：3 8 :
-17- 1225069
Glu lie Ser Glu 工le Arg Gly lie lie lie His Arg 1 5 10 lie Glu Gly lie Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly 15 20
Leu Arg Pro Gly 25 (2)序列鑑別號碼：39之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：28個胺基酸
(B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：39 :
Asp Val Ser Asp Val Lys Gly Val Val Val His Lys 1 5 10
Val Asp Gly Val Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly 15 20
Leu Arg Pro Gly 25
(2)序列鑑別號碼：40之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：28個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：40 : -18- 1225069
Asp Phe Ser Asp Phe Lys Gly Phe Phe Phe His Lys 1 5 l〇
Phe Asp Gly Phe Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr 15 20
Gly Leu Arg Pro Gly 25 (2)序列鑑別號碼：41之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：27個胺基酸
(B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：41 :
lie Ser Glu lie Lys Gly Val 工le Val His Lys lie 1 5 10
Glu Gly lie Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu 15 20
Arg Pro Gly 25
(2)序列鑑別號碼：42之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：27個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：42 : -19- 1225069 lie Val Thr Arg Met 10 Trp Ser Tyr Gly Leu 20
Met Thr Glu 工le Arg Thr Val 1 5
Glu Thr Met Gly Gly Glu His 15
Arg Pro Gly 25 (2)序列鑑別號碼：43之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：27個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：43 :
Leu Ser Glu He Lys Gly val He Val His Lys Leu 1 5 l〇
Glu Gly Val Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu 15 20
Arg Pro Gly 25 (2)序列鑑別號碼：44之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：27個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：44 : -20- 1225069 lie Thr Glu lie Arg Thr Val lie Val Thr Arg lie 1 5 10
Glu Thr lie Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu 15 20
Arg Pro Gly 25 (2)序列鑑別號碼：45之資料： (i) 序列之特點：
(A) 長度：45個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述··序列鑑別號碼：45 :
Pro Ser Tyr Thr Ala 10 Ser Glu lie Lys Gly 20 Gly lie Gly Gly Glu 35 Pro Gly 45
Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe 1 5
Thr Tyr Gin Phe Gly Gly lie 15
Val lie Val His Lys lie Glu 25 30
His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg 40 (2)序列鑑別號碼：46之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：45個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：46 : -21- 1225069
Thr Ala Lys Ser Lys 1 5 Thr Tyr Gin Phe Gly 15 Val lie Val Thr Arg 25 His Trp Ser Tyr Gly 40
Lys Phe Gly lie lie Glu 30 Leu Arg
Pro Ser Thr Glu 20 Thr lie Pro Gly
Tyr Thr Ala 1CT lie Arg Thr Gly Gly Glu 35 (2)序列鑑別號碼：47之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：27個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：47 : 工le Val His Lys Leu 10 Trp Ser Tyr Gly Leu 20
Met Ser Glu lie Lys Gly Val 1 5
Glu Gly Met Gly Gly Glu His 15
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Leu Thr Glu Met Arg Thr Val 工le Val Thr Arg Met 1 5 10
Glu Thr Val Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu 15 20
Arg Pro Gly 25 (2)序列鑑別號碼：49之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：27個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：49 : 工le Val Thr Arg lie 10 Trp Ser Tyr Gly Leu 20 lie Thr Glu lie Arg Thr Val 1 5
Glu Thr lie Gly Gly Glu His 15
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Met Se-r Glu Met Lys Gly Val lie Val His Lys Met 15 10
Glu Gly Met Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu 15 20
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He Val Thr Arg Leu 10 Trp Ser Tyr Gly Leu 20
Leu Thr Glu lie Arg Thr Val 1 5
Glu Thr Val Gly Gly Glu His 15
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Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala 15 10
Thr Tyr Gin Phe Gly Gly Leu Thr Glu lie Arg Thr 15 20
Val lie Val Thr Arg Leu Glu Thr Val Gly Gly Glu 25 30 35
His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 40 45 (2)序列鑑別號碼·· 53之資料： (i) 序列之特點·· (A) 長度：31個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：53 : lie Ser lie Ser Glu 工le Lys Gly Val lie Val His 1 5 10
Lys lie Glu Gly lie Leu Phe Gly Gly Glu His Tirp 15 20
Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 25 30 (2)序列鑑別號碼：54之資料： (i)序列之特點： (Α)長度：31個胺基酸 (B)型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 -25- 1225069 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述··序列鑑別號碼：54 : lie Ser Met Thr Glu lie Arg Thr Val 工le Val Thr 1 5 10
Arg Met Glu Thr Met Leu Phe Gly Gly Glu His Trp 15 20
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Lys Leu Glu Gly Val Leu Phe Gly Gly Glu His Trp 15 20
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Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala t 5 l〇
Thr Tyr Gin Phe Gly Gly lie Ser lie Ser Glu lie 15 20
Lys Gly Val lie Val His Lys lie Glu Gly lie Leu 25 30 35
Phe Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro 40 45
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Ala lie Leu Pro
Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr 1 5 10
Thr Tyr Gin. Phe Gly Gly lie Ser lie Thr Glu 15 20
Arg Thr Val lie Val Thr Arg lie Glu Thr lie 25 30 35
Phe Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg 40 45
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Glu His Trp
Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 25 30 (2)序列鑑別號碼：60之資料： (i)序列之特點°· (Α)長度：47個胺基酸 (B)型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 -28- 1225069 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：60 :
Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr 1 5 l〇 Thr Tyr Gin Phe lie Ser lie Ser Glu lie 15 20 Val lie Val His Lys lie Glu Gly lie Leu 25 30 Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro 40 45
Thr Ala Lys Gly Phe Gly 35 Gly (2)序列鑑別號碼：61之資料： (i) 序列之特點·· (A) 長度：31個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：61 : lie Ser lie Thr Glu lie Arg 1 5 Arg lie Glu Thr lie Leu Phe 15
Thr Val lie Val 10 Gly Gly Glu His 20
Thr Trp
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Arg Thr Val lie Val Thr Arg lie Glu Thr lie Leu 25 30 35
Phe Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro 40 45
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Val lie Val His Lys Met Glu Gly Met Leu Phe Gly 25 30 35
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Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr 15 10
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Lys Lys Lys Val Arg Val Val Thr Lys Val Val Thr 1 5 l〇
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Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 25 (2)序列鑑別號碼：69之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：30個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：69 :
Lys Lys Lys Phe Phe Phe Phe Thr Lys Phe Phe Thr 1 5 10
Phe Pro Val Ser Phe Asp Gly Gly Glu His Trp Ser 15 20
Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 25 30 (2)序列鑑別號碼：70之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：30個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 -33- 1225069 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：70 :
Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr 1 5 i〇
Leu Pir〇 Phe S0it Leu Asp G1 y G1 y Glu His Tjcp Ser 15 20
Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 25 30 (2)序列鑑別號碼：71之資料： (i) 序列之特點·· (A) 長度：30個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：71 :
Lys Lys Lys lie 工le Thr lie Thr Arg lie lie Thr 15 10 lie 工le Thr Thr 工le Asp Gly Gly Glu His Trp Ser 15 20
Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 25 30 (2)序列鑑別號碼：72之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：29個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：72 : -34- 1225069
Lys Lys Lys lie lie Thr lie Thr Arg lie lie Thr 15 10 lie lie Thr Thr lie Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr 15 20
Gly Leu Arg Pro Gly 25 (2)序列鑑別號碼：73之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度·· 30個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列4監別號碼：73 :
Lys Lys Lys Met Met Thr Met Thr Arg Met lie Thr 1 5 10
Met lie Thr Thr lie Asp Gly Gly Glu His Tirp Ser 15 20
Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 25 30 (2)序列鑑別號碼：74之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：28個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：74 : -35- 1225069
Phe lie 1 Thr His Leu Arg 25
Leu Ala Ser 10 Ser Tyr Gly
Thr Met Asp Thr Lys Phe Leu 5 lie Leu Gly Gly Glu His Trp 15 20
Pro Gly (2)序列鑑別號碼：75之資料·· (i) 序列之特點·· (A) 長度：46個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：75 :
Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala 15 10
Thr Tyr Gin Phe Gly Gly Phe lie Thr Met Asp Thr 15 20
Lys Phe Leu Leu Ala Ser Thr His lie Leu Gly Gly 25 30 35
Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 40 45 (2)序列鑑別號碼：76之資料： (i)序列之特點·· (A) 長度：31個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 -36- 1225069 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：76 :
Lys Lys Lys Phe He Thr Met Asp Thr Lys Phe Leu 1 5 l〇
Leu Ala Ser Thr His He Leu Gly Gly Glu His Trp 15 20
Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 25 30 (2)序列鑑別號碼：77之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：10個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：77 :
Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 15 10 (2)序列鑑別號碼：78之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：16個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：78 : -37- 1225069
Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala 1 5 10
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Lys lie Glu Gly lie Leu Phe Pro Pro Xaa Pro Xaa 15 20
Pro Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 25 30 35 (2)序列鑑別號碼：81之資料： -38- 1225069 (i) 序列之特點： (A) 長度：35個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：81 : lie Ser 工le Thr Glu 工le Arg Thr Val lie Val Thr 1 5 10
Arg lie Glu Thr lie Leu Phe Pro Pro Xaa Pro Xaa 15 20
Pro Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 25 30 35 (2)序列鑑別號碼：82之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：34個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：82 :
Lys Lys Lys lie lie Thr lie Thr Arg lie lie Thr 15 l〇 lie lie Thr Thr lie Asp Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro 15 20 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 25 30 (2)序列鑑別號碼：83之資料： (i)序列之特點： (A)長度：14個胺基酸 -39- 1225069 (B)型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鏗別號碼：83 :
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr 1 5 10
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Glu Gly lie Gly Gly Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe 15 20
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Glu Thr Met Gly Gly Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe 15 20
Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 25 30
(2)序列鑑別號碼：86之資料： (i) .序列之特點： (A) 長度：31個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：86 :
Leu Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His Lys Leu 1 5 l〇
Glu Gly Val Gly Gly Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe 15 20 Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 25 30 (2)序列鑑別號碼：87之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：31個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 -41 - 1225069 (xi)序列之描述··序列鑑別號碼：87 :
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr 1 5 l〇
Ser Cys Gly Gly lie Ser Glu lie Lys Gly Val lie 15 20
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Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr 1 5 l〇
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Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr 1 ' 5. 10
Ser Cys Gly Gly Leu Ser Glu lie Lys Gly Val lie 15 20 Val His Lys Leu Glu Gly Val 25 30 (2)序列鑑別號碼：90之資料： (i) 序列之特點·· (A) 長度：34個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：90 :
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He Ser Glu He Lys Gly Val He Val His Lys He 1 5 10
Glu Gly lie Gly Gly Cys Asn Gin Gly Ser Phe Leu 15 20
Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp 2 5 3 〇 3 5
Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Cys 40 45 (2)序列鑑別號碼：93之資料： (i)序列之特點： (A) 長度：47個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 -44- 1225069 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：93 :
Met Thr Glu 工le Arg Thr Val 工le Val Thr Arg Met 1 5 10
Glu Thr Met Gly Gly Cys Asn Gin Gly Ser Phe Leu 15 20
Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp 25 30 35
Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Cys 40 45 (2)序列鑑別號碼：94之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：47個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：94 :
Leu Ser Glu lie Lys Gly Val He Val His Lys Leu 1 5 10
Glu Gly Val Gly Gly Cys Asn Gin Gly Ser Phe Leu 15 20
Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp 25 30 35
Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Cys 40 45 (2)序列鑑別號碼：95之資料： (i)序列之特點： (A) 長度：25個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 -45- 1225069 (D)拓樸學：直線 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：95 :
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Arg lie Glu 15 Thr Tyr Gin 25
Thr lie Leu Phe Gly Gly Cys 20
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Arg Ala
Val Thr Gly Glu Leu Pro
Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Cys 40 45 (2)序列鑑別號碼：98之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：42個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：98 :
Lys lie Gin Ser Leu Met 35 lie Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His 1 5 10
Glu Gly lie Gly Gly Cys Gly Glu Thr Tyr 15 20
Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala 25 30
Arg Ser Thr Thr Lys Cys 40 (2)序列鑑別號碼：99之資料： (i)序列之特點： (A) 長度：42個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 -47- 1225069 (D)拓樸學：直線 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述··序列鑑別號碼：99 : .Met Thr Glu 工le Arg Thr Val lie Val Thr 15 10 Glu Thr Met Gly Gly Cys Gly Glu Thr Tyr 15 20 Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala 25 30 Arg Ser Thr Thr Lys Cys 40
Arg Met
Gin Ser
Leu Met 35 (2)序列鑑別號碼：100之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：42個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式··胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：1 〇〇 :
Leu Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His Lys Leu 1 5 10
Glu Gly Val Gly Gly Cys Gly Glu Thr Tyr Gin Ser 15 20
Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met 25 30 35
Arg Ser Thr Thr Lys Cys 40 (2)序列鑑別號碼·· 1 〇 1之資料： (i)序列之特點： (A) 長度：45個胺基酸 (B) 型式··胺基酸 -48- 1225069 (D)拓樸學：直線 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼·· 101 ··
Lys Lys Lys lie lie Thr lie Thr Arg lie lie Thr 1 5 10 lie lie Thr Thr lie Asp Gly Gly Cys Gly Glu Thr 15 20
Tyr Gin Ser Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg 25 30 35
Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Cys 40 45 (2)序列鑑別號碼·· 102之資料： (i) 序列之特點·· (A) 長度：63個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：102 :
Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala 1 5 10
Thr Tyr Gin Phe Gly Gly Lys Lys Lys lie lie Thr 15 20 lie Thr Arg lie lie Thr lie lie Thr Thr 工le Asp 25 30 35
Gly Gly Cys Gly Glu Thr Tyr Gin Ser Arg Val Thr 40 45
His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr 50 55 60
Thr Lys Cys (2)序列鑑別號碼：103之資料·· (i)序列之特點： -49- 1225069 (A) 長度：56個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii)分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：103 :
Lys Lys Lys lie lie Thr lie Thr Arg lie lie Thr 1 5 10 lie lie Thr Thr lie Asp Gly Gly Cys Lys Tyr Gly 15 20
Glu Asn Ala Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gin 25 30 35
Val Leu Ala Gin Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr 40 45
Ser Phe Asn Tyr Gly Ala lie Lys 50 55 (2)序列鑑別號碼·· 104之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：72個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：104 :
Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala 15 10
Thr Tyr Gin Phe Gly Gly Lys Lys Lys lie lie Thr 15 20 lie Thr Arg lie lie Thr lie lie Thr Thr lie Asp 25 30 35
Gly Gly Cys Thr Tyr Gly Thr Gin Pro Ser Arg Arg 40 45
Gly Asp Met Ala Ala Leu Ala Gin Arg Leu Ser Arg 50 55 60
Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Val Lys 65 70 -50- 1225069 (2)序列鑑別號碼：105之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：19個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線 (ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：105 : lie Ser Met Thr Glu Met Arg Thr Val lie Val Thr ^ 1 5 10 9
Arg Met Glu、Thr Val Leu Phe ' · 15 - (2)序列鑑別號碼：106之資料： (i) 序列之特點： (A) 長度：31個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)拓樸學：直線
(ii) 分子形式：胜肽 (xi)序列之描述：序列鑑別號碼：106 : lie Ser Met Thr Met Arg Thr Val 工le Val Thr 1 5 10
Arg Met Glu Thr Val Leu Phe Gly Gly Glu His Trp 15 20
Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 25 30 -51 -

Claims (1)

  1. Ι225Ό69, τ公告本 1一 第 688 第t)88|l06135號專利申請案 文申請專利範圍替換本(93年9月） ID· i3條正 年月曰/ 拾、申請專利範圍 1. 一種以下列表示之胜肽免疫原， (A)n-(目標抗原部位）-(B)o-(Th)m-X 或 (目標抗原部位）-(B)o-(Th)m-(A)n-X
    或 (Th)m-(B)o-(目標抗原部位）-(A)n-X 其中： A為離胺酸或序列鑑別號碼：78之一般性免疫刺激 序列，η大於1，各個A可為相同或不同；
    B 是選自胺基酸，-HCH(X)CH2SCH2C〇-， -NHCH(X)CH2SCH2C〇（s_N)Lys-，-NHCH(X)CH2S·琥 珀醯亞胺（s-N)Lys-，及-NHCH(X)CH2S-(琥珀醯亞胺）-所組成之群； Th是選自序列鑑別號碼：6-22、31-35及105所組成 之群或其類似物的人造助手T細胞抗原表位； π目標抗原部位”是LHRH ; X 為一胺基酸 a -COOH 或 a -CONH2 ; η為自1至10 ; m為自1至4 ;及 〇為自0至10。 2.根據申請專利範圍第1項之胜肽免疫原，其中B是選 56438-930913 1225069 自 Gly-Gly，pro-pr〇xaa-pro-pro，-NHCH(X)CH2SCH2CO-， -NHCH(X)CH2SCH2CO(s-N)Lys-，-NHCH(X)CH2S-琥珀醯亞胺 (ε-Ν)賴胺酸-，及-NHch(X)CH2S-(琥珀醯亞胺）-所組成之 群。 3 ·根據申請專利範圍第1項之胜肽免疫原，其中B是 Gly-Gly 〇 4·根據申請專利範圍第1或3項之胜肽免疫原，其係選 自序列鑑別號碼：41-43，49，51，53-56，59，61及 64所組成之群。 5 .根據申請專利範圍第4項之胜肽免疫原，其係選自序 列鑑別號碼：49，51，53-5 6，59，61及64所組成之 群。 6. 根據申請專利範圍第丨或3項之胜肽免疫原，其係爲 自序列鑑別號碼：45 ’ 46 ’ 52，57，58，60，62及2 所組成之群。 7. 一種在哺乳動物引起對LHRH<抗體的醫藥組合物， 其包括免疫有效量之申請專利範圍第丨、2或3項任一 項中之胜肽免疫原，另包括藥學上可接受的载南:、任- 8_根據申請專利範圍第7項的醫藥組合物，其包括^ 有效量之胜肽免疫原，其係選自序列^ = 41-43,49’51’5一，6〖及64所組成之群馬. 9.根據申請專利範圍第7項的醫藥組合物，其力 有效量之胜肽免疫原，兑仔選 ’、匕括免另 51，53-56,59,61及64所組成之群。 56438-930913 1225069 I 0.根據申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中該免疫 有效量之該胜肽或胜肽結合物為每公斤體重每劑量為 0.5微克至1毫克之間。 II ·根據申請專利範圍第8項之醫藥組合物，其中該免疫 有效量之該胜肽或胜肽結合物的為每公斤體重每劑量 為0.5微克到1毫克之間。 12.根據申請專利範圍第9項之醫藥組合物〜其中該免疫 有效量之該胜肽或胜肽結合物為每公斤體重每劑量為 0.5微克到1毫克之間。 56438-930913
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