2 2 2 A7 __B7_ 五、發明説明（1 ) 技術分野 本發明係關於腫瘤免疫學的分野。若要特定則本發明 係關於，具抗腫瘤以及/或抗癌活性的免疫治療劑進行篩 選之物質以及其方法。若進一步特定則本發明係關於，對 in vitro而言，判斷是否獲得in vivo的L A K細胞（ Lymphokine Activated Killed Cell :淋巴激活素活性化殺傷 細胞）是否具活性增強效果的篩選物質以及其方法。 過去技術 關於腫瘤免疫學的基礎槪念，已知腫瘤細胞具有腫瘤 抗原。腫瘤細胞所具有的腫瘤抗原，其於正常細胞中未發 現僅於腫瘤細胞中存在之腫瘤特異抗原（TSA:Tumor Specific Antigen )，或正常細胞中存在者極微量而隨著細 胞的癌化而增強的腫瘤關連抗原（TAA:Tumor Associated Antigen )。如此的腫瘤抗原雖隨著正常細胞的癌化產生的 基因變異而初次被發現，或隨著該變異因表現調節的變化 而被表現。作爲具有異常的抗原性的腫瘤細胞治療法，免 疫治療法爲最普通的方法，其中一例子爲，將被檢體以腫 瘤抗原進行免疫，使用增強被檢體的免疫機能的藥劑。已 知一般破壞腫瘤細胞的活性，以免疫系細胞中亦以N K ( 自然殺傷細胞）爲高，又N K細胞的活性因免疫治療法而 被增強。NK細胞於正常個體中存在的非T非B細胞障礙 性淋巴系細胞，對於腫瘤細胞、病毒感染細胞等不被 Μ H C抗原限制，對不表現Μ H C等級1分子或表現能力 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐） -4- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 餘 --線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 2 2 A7 __B7___ 五、發明說明（2 ) 降低的細胞已知顯示活性障礙。然而現今，亦存在者不被 NK細胞殺傷的腫瘤細胞。 美國國立癌症硏究所（NCI:National Cancer Institute ) 的S. Rosenberg將末稍淋巴球與I L 一 2 (人類間白素）共 同培養時，發現對於含有自身癌症的廣範圍的目標癌細胞. 而言可誘導顯示細胞障礙性的細胞，此細胞可殺傷N K細 胞不可能殺傷的癌細胞亦可殺傷（參考特開昭 62—116518號）。此殺傷細胞取名爲淋巴激活素 活性化細胞（L A K 細胞：Lymphokine Activated Killer Cell ) °LAK細胞於細菌學上已知其非爲均一集團，而 係爲N K細胞系或殺傷T細胞系的細胞集團。近年來，來 自被檢體的末稍淋巴球於細胞培養系中使用I L - 2使其 活化後，顯示抗腫瘤活性的L A K細胞再次被移至被檢體 體內，進行細胞免疫治療法（L A K治療法）。重複投與 此L A K細胞的細胞免疫治療法，有末期癌縮小或增加抑 制的例子被報告。然而，L A K治療法的效果有個體上的 差異，亦有幾乎無效果的狀態。又，有著必須由被檢體分 離大量的白血球細胞而造成被檢體肉體上的負擔，而對於 分離後的白血球細胞必須大量培養造成經濟上的大負擔等 種種問題點。且，進行IL一2直接投與的LAK治療法 時，因必須投與高濃度的I L - 2而產生嚴重的副作用。 具體而言’使用I L 一 2進行LAK細胞免疫治療法 時，會產生全身倦怠、寒冷、發燒、低白蛋白、貧血、好 氧球增加等症狀之副作用，已知這些副作用比單獨使用 ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐) ~ ' -------T------·%--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-Jr i線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1222515 A7 B7 五、發明說明（3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) IL-2時還強。且値得注意的事爲，對於產生幾項重大 副作用而言，可考慮其可能原因爲LAK細胞對於正常細 胞具有活性傷害。有報告指出此LAK細胞所造成的造血 幹細胞傷害，除產生貧血或血小板減少外，亦對淋巴球、 巨噬細胞或對血管內皮細胞的in vitro產生傷害。又，I L - 2經口投與之吸收較差，現今以直接投與的方式進行注 射投與爲主要方式。 因此，效果未顯著的狀態下，不進行有可能產生副作 用的LAK治療法，而對直接投與是否能使LAK活性增 強，重新對m vitro系作篩選被期待著。然而，使用I L 一 2於in vitro進行篩選有費用過高的缺點。 --線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 自過去’知道細菌類或食品等具有抗癌作用。由具此 抗癌作用的細菌類或食品等副作用較少且具安全性的事看 來’可探索來自這些細菌類或食品等的抗癌作用物質，例 如有報告指出使用沙雷氏菌與溶連菌的培養濾液之Coley's 毒素（1964) 、BCG的白血病治療（Mathe，G，Adv. Cancer Res·，14，1，1971)以及 molmot 對癌腫瘤的退縮（Zbar， B·，et al·，J· Natl· Cancer Inst·，48, 83 1，1971 )，以及對酵 母菌多醣體投與之肉瘤1 8 0等移植癌具有效性。 特別關於多醣體，酵母葡聚糖、酵母甘露聚糖、其他 菌體的多醣體、地衣類以及擔子菌類的多醣體等對於抗癌 的效果’已有很多硏究報告。這些中作爲抗癌免疫增強藥 ’現今被販賣的有，擔子菌類的靈芝科之來自河原菇培養 菌絲體的乙酸間甲苯酯（吳羽化學，三共製藥：宿主的免 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）-6 - 2 2 2 A7 ___B7____ 五、發明說明（4) 疫機能賦活劑）以及香菇多醣類的香菇多醣以及末廣菇多 醣體等。 又，香链（Lentinusedodes)爲日本與中國的代表性 食用菇，於日本早在3 0 0年前便實行人工栽培，其藥理 效果與藥效成分僅於最近才解明，例如有報告指出，對於 白老鼠的大腸與肝臟等的移植腫瘤細胞之其具增値抑制效 果（Sugan〇，N. et al·，Cancer Letter，27: 1，1985 ;鈴木康 將等，日本大腸肛門病會誌，43 : 178、1990) 以及促進細胞分裂劑效果（T a b a t a. T. e t a 1.， Immunopharmacology, 24:57, 199 2; Hibino, et al., Immunopharmacology, 28: 77, 1994 .)等 ° 本發明者，注意到香菇所具有的L A K活性增強效果 (抗腫瘤以及/或抗癌活性），香菇菌絲體萃取物直接投 與於生物體內時於in vivo的L A K活性增強效果，本發明 提供一種於in vitro的篩選，其篩選物質以及其方法作爲課 題。 於過去的方法中，實際上將L A K活性增強物質投與 於生物體，或大量調製生物體內的淋巴球，此於in vitro中 以L A K活性增強物質進行活化，此後還原實際於生物體 內活性化的淋巴球，而可確認是否有L A K活性增強效果 。此方法有因治療費用過高的缺點，其他亦有因存在著被 檢體的肉體負擔等問題。然而，實際上L A K活性增強物 質於生物體內是否有效果可由in vitro的簡便篩選，對於被 檢體的肉體、金錢上的負擔則大大減輕。 ---f--— HI —----· I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 幻· 線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -7 - 1222515 A7 __ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（5 ) 發明的摁示 本發明者對於香菇的生活史之可食用型態的子實體前 型態，其菌絲中萃取成分裡，發現其子實體中具有驚人的 免疫賦活活性與抗腫瘤活性以及/或抗癌活性。而且當該 萃取物作爲I L 一 2的代替物於in vitro中作爲L A K活性 誘導物質使用時，將當該萃取物直接投與於生物體內時， 對於in vivo的抗腫瘤作用以及/或抗癌作用，特別對 L A K活性增強作用，發現可於in Vitr0中篩選，於是完成 本發明。 更具體而言，本發明者將含有香菇菌絲萃取物的抗腫 瘤物質或抗癌物質，特別爲L A K活性增強物質直接投與 於生物體內時對於in vivo細胞傷害活性，發現與被檢體中 調製出的淋巴球於in vitro中因前述L A K活性增強物質而 活化時的細胞傷害活性有著正相關性。以下爲本發明的步 驟： 包含 (a )採樣被檢體的末稍血，由此進行淋巴球部分的 調製； (b )調製前述淋巴球部分中添加本發明的篩選物質 之L A K誘導樣品，與無添加篩選物質的對照組樣品； (c )對於前述誘導樣品與前述對照組樣品，互相比 較其測定出的L A K活性結果，而決定對當該被檢體篩選 物質於in vitro中L. A K活性增強作用； (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ¾ 訂-I-· --線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）-8 - 1222515 A7 ___ B7 五、發明說明（6) 之提供適合被檢體而具有L A K活性增強作用之物質 於m vitro可決定的方法。本發明又提供一種使用前述匕 vitro的篩選方法，於in vivo可篩選是否獲得增強的l a K 活性之含有香菇菌絲體萃取物的篩選物質。因此，本發明 係關於’ L A K活性增強物質於in vivo是否能期待l A K 活性增強效果，於L A K活性增強物質投與前可於in Vitr0 中判斷之含有香菇菌絲體萃取物的篩選物質以及篩選方法 ，不僅用於人類亦可使用於家畜類。 .本說明書中，所謂「L A K活性」爲不能攻擊擔任 N K活性的淋巴球所不能辨認的腫瘤，且意味著自身的正 常細胞幾乎不影響細胞障礙性T淋巴球所示的抗腫瘤活性 。「L A K活性增強」係意味著L A K活性的增強，與增 強由淋巴球誘導L AK細胞或既有的L AK細胞之抗腫瘤 活性。 增強L A K活性使L A K細胞的抗腫瘤活性提高，結 果爲細胞性免疫系的提高。因此，既可期待抗腫瘤活性提 高之治療，亦可使用於以提高免疫系爲目的的治療方法。 實施發明的最佳形態： 本發明爲提供一種含有本發明的香菇菌絲體萃取物的 抗腫瘤劑或抗癌劑，特別爲對增強L A K活性的製劑’因 直接投與於生物體內故對是否可期待L A K活性的增強效 果，可於製劑投與前in vitro中判斷，含有香菇菌絲體萃取 物的篩選物質以及其篩選方法。對於本發明所謂「篩選物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱）冬 — T- — !丨！ ·丨| (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
2 2 2 I A7 ___B7____ 五、發明説明（8 ) m 1。本發明的香菇菌絲體萃取物添加於培養細胞前或對 末稍血進行直接添加前，以丙酮進行無菌處理較佳。 作爲使用本發明的篩選物質進行篩選的方法，雖依照 高木們的方法（臨床免疫，1 9 : 245 - 249， 1 9 8 7 )，但代替I L — 2，篩選物質例如使用本發明， 的香菇菌絲體萃取物，此點來看不同於過去的方法。即， 本發明的L A K活性增強篩選方法，爲以下步驟：其含有 (a )採樣被檢體的末稍血，由此進行淋巴球部分的 調製； (b)調製前述淋巴球部分中添加本發明的篩選物質 之L A K誘導樣品，與無添加篩選物質的對照組樣品； (c )對於前述誘導樣品與前述對照組樣品，互相比 較其測定出的L A K活性結果，而決定對當該被檢體篩選 物質於in vitro中L A K活性增強作用；之提供適合被檢體 而具有L A K活性增強作用之物質於in vitro可決定的方法 〇 爲使誘導LAK細胞，由被檢驗者的末稍血中分離淋 巴球。 自被驗者中所採血的末稍血加上肝素，使用Ficoll-Conary液（s · g ·=1 · 077)的比重離心分離方 法使得界面的單核球分離。被分離的單核球以P B S ( ΡΗ7 · 4，不含Ca以及Mg)洗淨2至3次，爲使其 成爲1 X 1 0 6 /m 1懸濁於培養液（較佳爲於 RPMI 1640培養基（Gibco )中適宜地添加FBS( (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂·- --線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -11 - 1222515 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（9) 失活性化血淸）或抗生物質等）中。將此以自身血淸（血 漿）於3 7°C下處理1 5分鐘後移至培養皿中，於3 7°C 下培養1小時。回收非附著性細胞，作爲淋巴球部分。 L A K誘導樣品係由例如由以下的方法所調製出。即 ，由上述的方法得到的淋巴球部分調製至細胞之最終濃度. 爲lxl05/ml〜lxl06/ml ，浮游於培養液中 ，1洞穴添加1 0 0 # 1的細胞懸濁培養液，使其細胞數 爲 lxl04/we 1 1 〜lxl05/we 1 1 ，每 1 w e 1 1的細胞數，對於斯業者爲可以使用的功能細胞（ effects細胞）的活性，對目標細胞的功能細胞之感受性等 而適宜地決定。該浮游液中，依照實驗步驟作爲篩選物質 加入最終濃度爲範圍的香菇菌絲體萃取物。 如此以被檢體的種種淋巴球濃度（含濃度爲零的濃度 )於本發明的香菇菌絲體萃取物存在下培養作爲功能細胞 。對於本發明的說明書，所謂功能細胞，即指進行上述培 養處理3天的細胞而言，包含與LAK活性增強物質共同 培養的淋巴球（L A K活性增強物質添加處理的淋巴球） 以及僅培養於不含L A K活性增強物質的培養液中之淋巴 球（無添加誘導處理之淋巴球）兩者。 對照組爲代替添加的篩選物質使用滅菌的重組I L -2 (rIL-2;2000U/ml)之外，其他調整成 與調製L A K誘導樣品的方法相同。 L A K活性的測定爲進行5 1 C r釋出測定法、〔3 Η 〕尿定法等方法。對於本發明，由簡便性以及客觀性的觀 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· --線· -J. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）-12- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1222515 A7 B7 五、發明説明（10) 點看來，使用5 1 C Γ釋出測定法較佳。5 1 C r釋出測定法 爲測定經L A K活性增強物質處理的淋巴球，其所誘導出 的L AK細胞所引起的目標細胞傷害於in vitro下測定之方 法之一。5 1 C r釋出測定法爲以下的步驟： (i )目標細胞中添加5 1 C r所標識的酪酸鈉而標識 目標細胞。 (ϋ )前述的目標細胞與，篩選物質或作爲對照的以 r I L - 2刺激後的功能細胞（例如，殺傷Τ細胞或 L A K細胞）進行反應； (iii )目標細胞被功能細胞破壞時，於細胞培養液的 上淸液中測出釋出的5 1 C r量； 又上述所成的以功能細胞對目標細胞作細胞傷害活性 的測定方法。 對於5 1 C I·釋出測定，使用作爲目標細胞的連續培養 細胞，較佳爲使用Daudi細胞或Raji細胞。目標細胞的培養 爲，回收培養錐形瓶中的細胞，以5 1 C 1：標識後分裝於微 量滴定培養皿（micro titer plate )中進行。作爲目標細胞 的培養液，爲增殖使用的細胞使用適當的用具，例如 RPMI 1640等培養液中適宜地添加血淸、抗生物 質等而使用。 目標細胞的標識爲，培養後的目標細胞1 0 6個添加 100〜150//Ci的51Cr -酪酸鈉，仔細攪拌後於 3 7 °C下培養1至2小時。培養細胞爲以P B S進行3次 的洗淨後，爲使成1 X 1 0 6/m 1而使用添加1 0 % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） TTTr " ---,------------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 1222515 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ___B7__ 五、發明說明（ιυ F B S懸濁於R Ρ Μ I 1 6 4 0培養基中者。標識後， 使用培養時所用的培養液或磷酸緩衝液（P B S )洗淨， 最後以含有1 0 %的牛胎血淸（F B S )或小牛血淸（ F C S )培養液調製成1 X 1 〇 6 /m 1 ，作用測定使用。 目標細胞爲微量滴定培養皿的各穴中其細胞數能成5 X , 1 04/m 1而分別注入50// 1。 爲測定細胞傷害活性的化驗法中，分注上述的目標細 胞的各穴中，最大解離則再添加1N - HC 1 1〇〇 # 1 ，自然解離則僅添加培養液1 0 0 // 1 ，於是再添加 實驗解離用的種種濃度之含有本發明香菇菌絲體萃取物， 或對照用的2 0 0 0 U /m 1的r I L 一 2所刺激的功能 細胞之培養液1 0 0 // 1。其次，微量滴定培養皿以板式 離心分離機，於800rpm、5分鐘離心處理的細胞集 中於穴底部後，以5 % C〇2培養器於3 7 °C下培養3 · 5 小時。 5 1 C r -酪酸鈉的化驗法中，目標細胞傷害活性可由 以下式子表示算出： τ Λ κ，壬性η/ 實驗解離（QOT7)-自然解離（Q咖）、叫η/Ί L A κ活性％ =最大解離(_)-自然ϋίίφ⑻x100 此式所算出的L A K活性，誘導樣品與對照樣品的値 互相比較下，篩選物質於in vitro中可測出L A K活性誘導 對於上述的最大解離、自然解離以及實驗解離所需求 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _ 14 - -------------壤 i, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂i --線· 1222515 A7 B7____ 五、發明說明（12) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的步驟，目標細胞的培養於5 % C Ο 2，3 7 °C下進行’培 養時間、實驗目的、使用細胞的數目等其他條件’斯業者 可適宜地決定，但本發明爲3 · 5小時。 培養上淸液所釋出的5 1 C r之放射線量，可由使用閃 煉計數管等測出。 . 本發明的較佳狀態爲，雖以實施如下的各步驟’但如 何適切的變更及修飾爲斯業者所認知的。 採取來自培養後的培養皿的各穴培養上淸液，以閃煉 計數管等測出放射活性。 以述的篩選法於in vitro中確認的L A K誘導活性之香 藤菌絲體萃取物於，3 6 0 0m g/天的7天間投與於生 物體中，於in vitro中誘導L A K活性。已知使用述淋巴球 回收方法所取出的淋巴球部分，與上述的L AK誘導樣品 相同的條件下測定L A K活性％ ，於此所獲得的in vivo的 L A K活性增強作用爲於in vitro所得的結果顯示有著正相 關。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 雖本發明於以下的實施例更詳細說明，但僅能代表一 部份的例子，並不能限制本發明的範圍。且不脫離本發明 的精神，對本發明可作種種變更與修飾爲斯業者可瞭解的 事。 實施例 實施例1 :調製香菇菌絲體萃取物 蔗渣9 0重量份，米糠1 0重量份所成的固體培養基 ϋ張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱Υ"""· 15· 1222515 A7 B7 五、發明說明（I3) 使其含適當水後，接種香菇種菌，放置於調整溫度以及濕 度的培養室內，使菌絲體增殖。菌絲體於固體培養基下聚 集後，解開蔗渣基材的纖維素束，使其成爲1 2篩子可通 過份量爲24重量％以下。此解束之後的培養基1 · Ok g中，純水3 · 5L以及純化的纖維酵素2 · Og，以邊. 保持固體培養基爲4 0 °C邊加入，成爲含有培養基的混合 物。 其次，含有培養基的混合物附有變速齒輪的幫浦一邊 將其轉動，一邊將固體培養基於齒輪部分進行粉碎以及禱 爛作用2 0 0分鐘的程度，使其蔗渣纖維能約以8 0重量 %作爲1 2篩子的通過份量，含有培養基的混合物進行粉 碎與禱爛爲，邊徐徐上升該混合物的溫度邊實施。其後， 含有培養基的混合物更加溫至9 0 °C使酵素失去活性同時 進行滅菌，於9 0 °C下放置3 0分鐘。所得的含有培養基 混合液以6 0篩子濾布過濾作爲香菇菌絲體萃取物，濃縮 後得到凍結乾燥粉末。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -------·Ί--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --線· 如此所得的香菇菌絲體萃取物以苯酚-硫酸法進行糖 値分析得知含有糖値爲2 5 · 3 % (重量/重量）、以羅 里法進行蛋白質分析得知含有蛋白質1 9 · 7 % (重量/ 重量），以沒食子酸爲基準的Folon-Denis法得知含有聚苯 酚2 · 6 % (重量/重量）。香菇菌絲體萃取物中亦含有 其他粗脂肪8 % 、粗灰份2 2 % ，糖質以外的可溶性無氨 物約2 0 % 。其中香菇菌絲體萃取物中所構成的糖組成物 如以下所示。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱^ :16- 2 2 2 A7 __B7______ 五、發明說明（14) 實施例2 : L A K活性測定 首先，分別採血來自被檢體A、B以及C的香菇菌絲 體萃取物服用前之末稍血，以及各被檢體以香菇菌絲體萃 取物1 2 0 0 m g每日3次，經過1星期投與後的末稍血， .，使用這些末稍血以下述方法進行分離所得的淋巴球部分 ，對於本發明的萃取物於生物體內之使淋巴球活性化能力 與，使用萃取物淋巴球於in vitro活性化的能力的相關性可
CBB 師进。 首先，所採取這些末稍血加入肝素，使用Ficoll-Conary液（s. g.=1.077)以比重離心分離法 進行界面單核球的分離，再將分離的單核球以P B S ( P h 7 · 4，不含Ca以及Mg)洗淨2次，欲使其成 lxl06/ml將10% FBS (失活牛胎血淸）添加於 培養液中於R Ρ Μ I 1 6 4 0培養基（Gibco )中懸濁。 以上述方法分離的細胞，重新移至使用自身血淸（血漿） 於3 7 °C下處理1 5分鐘塗佈後培養皿中，3 7 °C下培養 1小時後，採取非附著性的細胞作爲淋巴球部分。 1 0 % F B S添加的R Ρ Μ I 1 6 4 0培養液中培 養目標細胞之連續培養細胞（Daudi細胞）以離心分離方式 回收，106細胞中添加100〜150eCi的51Cr —酪酸鈉（New England Nuclear )，5% C〇 2 培養器中 3 7 °C下培養1小時。以5 1 C r標識的培養細胞以P B S 洗淨3次後，欲成1 x 1 〇 6 / πι 1而懸濁於添加1 〇 % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）· 17 _ -------1---------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂·1、 --線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1222515 A7 15/ 五、發明說明（I5) FBS的RPMI 1640培養液。 微量滴定培養皿的各穴中以上述的方法標識的目標細 胞分別注入50//1 (5xl04/well)，而且最大 解離群（陽性對照組）爲分別注入1 〇 〇 # 1的1 N — H C 1 ’自然解離群（陰性對照組）爲分別注入1 〇 〇 A 1的添加10% FBS的RPMI 1640培養液， 於是實驗解離群中以1 〇 // g/m 1濃度的本發明之香菇 菌絲體萃取物或作爲對照組以2 0 0 0 U /m 1濃度刺激 的功能細胞（分別爲1〇〇#1 (lxl〇4/well) )注入之。培養皿離心分離機以8 0 0 r p m，5分鐘離 心處理之細胞聚集於穴的底部後，於5 % C〇2培養器中 3 7 °C下培養3 · 5小時。 由培養的培養基中以S Ο K E N — Ρ Ε Τ Σ — 9 6 採取各穴的培養上淸液，7 -閃煉計數管測定放射活性。 L A K活性由以下的表所算出 τ Amo/ 實驗解離自然解離(Q啦）、/ipp a κ活性％ =最大解離㈣-自然解ϊγ(_χ1〇〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) € •線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 結果於表1與圖1所示 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）_ 18 1222515 A7 B7 五、發明説明（16) 表1 : (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實驗號碼 LAK活性
被檢體A 被檢體B 被檢體C 服用前 13% 27% 14% 萃取物的篩選 (最終濃度：10 // g/ml) 21% 34% 15% 服用萃取物後 40% 43% 15% 產業的可利用性 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 對被檢體A以及B而言，實際上以香菇菌絲體萃取物 經口投與時，可確認in vivo中LAK活性的增強（參考表 1、實驗3 )。對於此使用本發明的萃取物於in vitro的篩 選中，由被檢體A以及B的末稍血中採取的淋巴球，以使 用本發明的萃取物刺激時，與本發明的萃取物直接投與於 被檢體A以及B時所得之L A K活性增強效果，確認其顯 示正相關的L A K活性增強效果（參照表1、實驗2 )。 因此，本發明的香菇菌絲體萃取物經口投與時L A K活性 的增強效果，判斷以in vitro的篩選可預測。 另一方面，對於被檢體C而言，實際上含有香菇菌絲 體的物質經口投與時，及使於in vivo中可確認L A K活性 並無增強（參考表1、實驗3 )。對於此使用本發明的萃 取物於in vitro篩選中，及使由被檢體C的末稍血所採取的 淋巴球以使用本發明的萃取物刺激之，並不能確認本發明 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 一 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1222515 A7 B7 五、發明說明（17) 的萃取物以直接投與時所之L A K活性有增強效果（參考 表1、實驗2 )。因此，由此例中亦可得本發明的香菇菌 絲體萃取物經口投與時於in vivo的LAK活性增強效果， 判斷可由in vitro中篩選而預測之。 因此，可知本發明的L A K活性增強物質經口投與於 生物體時，於in viuo中的LAK活性增強效果，可由in vhro中的篩選結果正確的預測出。於是，本發明的香菇菌 絲體萃取物直接投與時於in vivo的L A K活性增強效果， 可於當該L A K活性增強物質被直接投與前，於in vitro中 簡單地判斷出，不僅對於期待L A K活性增強效果的被檢 體而言，LAK活性增強物質的具效果的投與可迅速進行 ，連對不期待L A K活性增強效果的被檢體而言，可防止 L A K活性增強物質的無用途投與。 又，本發明的方法，不僅無須由被檢體的血液中取出 大量的淋巴球，且L A K活性增強物質於in vivo的治療效 果，可於in vitro中篩選出，顯示可減輕被檢體的肉體負擔 〇 圖面的簡單說明 圖1爲表示使用本發明的香菇俊絲體萃取物篩選 L A K活性增強的結果，其數據以柱狀圖形表示。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）· 20 - ---•丨 _ijj---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· --線.