JP2000162204A - シイタケ菌糸体抽出物を含有するｌａｋ活性スクリーニング物質およびそれを用いたｌａｋ活性スクリーニング法 - Google Patents
シイタケ菌糸体抽出物を含有するｌａｋ活性スクリーニング物質およびそれを用いたｌａｋ活性スクリーニング法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】安価に入手可能な抗腫瘍及び／または抗癌活性
を有する免疫療法剤をスクリーニングするための物質及
びその方法を提供する。 【解決手段】 末梢血を凝血防止剤と混合したのちに単
核球を分離し、非付着性細胞を回収してリンパ球分画を
得て、リンパ球分画にスクリーニング物質を最終濃度１
ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌになるように加える誘導サンプ
ルと何も加えない対照サンプルを用意して、それぞれの
群を３日間室温において静置培養し、両サンプルに関し
て自然解離群、最大解離群および実験解離群を分け、標
的細胞に100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム酸ナトリウムを
添加し、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを加え、自然解離
群には何も加えず、実験解離群には標的細胞を加え、５
％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培養し、
培養上清を採取して放射活性を測定し、計算式： を用いて誘導サンプルと対照サンプルのＬＡＫ活性を算
出して互いを比較する。
を有する免疫療法剤をスクリーニングするための物質及
びその方法を提供する。 【解決手段】 末梢血を凝血防止剤と混合したのちに単
核球を分離し、非付着性細胞を回収してリンパ球分画を
得て、リンパ球分画にスクリーニング物質を最終濃度１
ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌになるように加える誘導サンプ
ルと何も加えない対照サンプルを用意して、それぞれの
群を３日間室温において静置培養し、両サンプルに関し
て自然解離群、最大解離群および実験解離群を分け、標
的細胞に100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム酸ナトリウムを
添加し、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを加え、自然解離
群には何も加えず、実験解離群には標的細胞を加え、５
％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培養し、
培養上清を採取して放射活性を測定し、計算式： を用いて誘導サンプルと対照サンプルのＬＡＫ活性を算
出して互いを比較する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、腫瘍免疫学の分野
に関する。特定すれば、本発明は、抗腫瘍および／また
は抗癌活性を有する免疫療法剤をスクリーニングするた
めの物質およびその方法に関する。さらに特定すれば、
本発明は、インビトロにおいてインビボにおけるＬＡＫ
細胞（Lymphokine Activated Killer Cell：リンホカイ
ン活性化キラー細胞）の活性増強効果が得られるかどう
かを判断するためのスクリーニング物質およびその方法
に関する。
に関する。特定すれば、本発明は、抗腫瘍および／また
は抗癌活性を有する免疫療法剤をスクリーニングするた
めの物質およびその方法に関する。さらに特定すれば、
本発明は、インビトロにおいてインビボにおけるＬＡＫ
細胞（Lymphokine Activated Killer Cell：リンホカイ
ン活性化キラー細胞）の活性増強効果が得られるかどう
かを判断するためのスクリーニング物質およびその方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】腫瘍免疫学における基本的概念は、腫瘍
細胞が腫瘍抗原を有するということである。即ち、腫瘍
細胞に特異な抗原（TSA：Tumor Specific Antigen）、
または正常細胞にもごく微量存在するが細胞の癌化に伴
いその発現が増強される腫瘍関連抗原（TAA：Tumor Ass
ociated Antigen）の存在がわかっている。このような
腫瘍抗原は自己の細胞の変異に伴って生じる遺伝子自体
またはその発現の変化により発現される。抗原性が異常
な腫瘍細胞の治療法としては、免疫療法がもっとも一般
的であり、腫瘍抗原で免疫したり、免疫機能を増強する
薬剤が用いられる。一般に、腫瘍細胞を破壊する活性は
正常細胞よりもＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の方が高
く、またＮＫ細胞の活性も免疫療法により増強されるこ
とが知られている。ＮＫ細胞は正常個体中にも存在する
細胞障害性リンパ系細胞であり、腫瘍細胞、ウイルス感
染細胞等に対してＭＨＣ抗原に拘束されずに障害活性を
示すことが知られているが、ＮＫ細胞でも殺傷し得ない
腫瘍細胞の存在も明らかとなった。
細胞が腫瘍抗原を有するということである。即ち、腫瘍
細胞に特異な抗原（TSA：Tumor Specific Antigen）、
または正常細胞にもごく微量存在するが細胞の癌化に伴
いその発現が増強される腫瘍関連抗原（TAA：Tumor Ass
ociated Antigen）の存在がわかっている。このような
腫瘍抗原は自己の細胞の変異に伴って生じる遺伝子自体
またはその発現の変化により発現される。抗原性が異常
な腫瘍細胞の治療法としては、免疫療法がもっとも一般
的であり、腫瘍抗原で免疫したり、免疫機能を増強する
薬剤が用いられる。一般に、腫瘍細胞を破壊する活性は
正常細胞よりもＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の方が高
く、またＮＫ細胞の活性も免疫療法により増強されるこ
とが知られている。ＮＫ細胞は正常個体中にも存在する
細胞障害性リンパ系細胞であり、腫瘍細胞、ウイルス感
染細胞等に対してＭＨＣ抗原に拘束されずに障害活性を
示すことが知られているが、ＮＫ細胞でも殺傷し得ない
腫瘍細胞の存在も明らかとなった。
【０００３】米国ＮＣＩのＳ．Rosenbergは、リンパ球
をインターロイキン２（ＩＬ−２）と共に培養すると、
広い範囲の腫瘍細胞に細胞障害性を示す、ＮＫ細胞でも
殺傷不可能な腫瘍細胞を殺傷するキラー細胞が誘導され
ることを発見した（特開昭62-116518号参照）。このキ
ラー細胞はＬＡＫ細胞（Lymphokine Activated KillerC
ell：リンホカイン活性化キラー細胞）と命名された。
ＬＡＫ細胞は、細胞学上は均一な集団ではなく、ＮＫ細
胞系やキラーＴ細胞系の細胞集団であることが知られて
いる。近年は、ＬＡＫ細胞を用いた養子免疫が試みられ
ており（ＬＡＫ療法）、ＬＡＫ細胞の繰り返し投与によ
り末期癌の縮小あるいは増殖抑制例が報告されている。
しかしながら、ＬＡＫ療法の効果は個体差があり、ほと
んど効果を享受できない場合もあり、苦痛を伴うＬＡＫ
療法を行っても、効果が出ないことがあった。ましてＩ
Ｌ−２によってＬＡＫ療法を行う場合、多量の白血球分
離に対する肉体的負担や高濃度のＩＬ−２投与による重
篤な副作用があり、大量培養に関する経済的負担も大き
い。具体的には、ＩＬ−２を用いたＬＡＫ養子免疫療法
はＩＬ−２を単独で用いた場合よりも副作用が強く、全
身倦怠、悪寒、発熱、低アルブミン、貧血、好酸球増加
などの症状は必発である。さらに注目すべきは、重大な
いくつかの副作用の発現にＬＡＫ細胞の正常細胞に対す
る傷害活性が関与している可能性が高いことで、造血幹
細胞傷害による貧血や血小板現象のほか、リンパ球、マ
クロファージや血管内皮細胞に対するインビトロ傷害も
報告されている。このようなＬＡＫ療法を行わないで、
直接投与によってＬＡＫ活性を増強させ得るかどうかを
インビトロにおいてスクリーニングすることができる物
質の存在が望まれていた。たとえ、ＩＬ−２を用いてイ
ンビトロでスクリーニングを行なっても、不経済である
上、前述のようにＩＬ−２を直接投与した際の副作用が
大きく、そのスクリーニングによって投与した後インビ
ボで得られると思っていたＬＡＫ活性増強による効果を
帳消しにしてしまうからであった。
をインターロイキン２（ＩＬ−２）と共に培養すると、
広い範囲の腫瘍細胞に細胞障害性を示す、ＮＫ細胞でも
殺傷不可能な腫瘍細胞を殺傷するキラー細胞が誘導され
ることを発見した（特開昭62-116518号参照）。このキ
ラー細胞はＬＡＫ細胞（Lymphokine Activated KillerC
ell：リンホカイン活性化キラー細胞）と命名された。
ＬＡＫ細胞は、細胞学上は均一な集団ではなく、ＮＫ細
胞系やキラーＴ細胞系の細胞集団であることが知られて
いる。近年は、ＬＡＫ細胞を用いた養子免疫が試みられ
ており（ＬＡＫ療法）、ＬＡＫ細胞の繰り返し投与によ
り末期癌の縮小あるいは増殖抑制例が報告されている。
しかしながら、ＬＡＫ療法の効果は個体差があり、ほと
んど効果を享受できない場合もあり、苦痛を伴うＬＡＫ
療法を行っても、効果が出ないことがあった。ましてＩ
Ｌ−２によってＬＡＫ療法を行う場合、多量の白血球分
離に対する肉体的負担や高濃度のＩＬ−２投与による重
篤な副作用があり、大量培養に関する経済的負担も大き
い。具体的には、ＩＬ−２を用いたＬＡＫ養子免疫療法
はＩＬ−２を単独で用いた場合よりも副作用が強く、全
身倦怠、悪寒、発熱、低アルブミン、貧血、好酸球増加
などの症状は必発である。さらに注目すべきは、重大な
いくつかの副作用の発現にＬＡＫ細胞の正常細胞に対す
る傷害活性が関与している可能性が高いことで、造血幹
細胞傷害による貧血や血小板現象のほか、リンパ球、マ
クロファージや血管内皮細胞に対するインビトロ傷害も
報告されている。このようなＬＡＫ療法を行わないで、
直接投与によってＬＡＫ活性を増強させ得るかどうかを
インビトロにおいてスクリーニングすることができる物
質の存在が望まれていた。たとえ、ＩＬ−２を用いてイ
ンビトロでスクリーニングを行なっても、不経済である
上、前述のようにＩＬ−２を直接投与した際の副作用が
大きく、そのスクリーニングによって投与した後インビ
ボで得られると思っていたＬＡＫ活性増強による効果を
帳消しにしてしまうからであった。
【０００４】抗癌剤の開発においては、副作用を回避す
る目的で、古くから抗癌作用を有することがわかってい
る安全な細菌類あるいは食品等に含まれる抗癌作用物質
が模索されている。例えば、細菌により癌を制圧しよう
とする試みは既に1900年代から始められており、セラチ
ア菌と溶連菌の培養濾液を用いたColey'sトキシン（196
4）、ＢＣＧによる白血病治療（Mathe, G., Adv. Cance
r Res., 14, 1, 1971）およびモルモットにおける癌腫
瘤の退縮（Zbar, B.,et al., J. Natl. CancerInst., 4
8, 831, 1971）、および酵母壁多糖体の投与によるサル
コーマ180等の移植癌に対する有効性等が報告されてい
る。
る目的で、古くから抗癌作用を有することがわかってい
る安全な細菌類あるいは食品等に含まれる抗癌作用物質
が模索されている。例えば、細菌により癌を制圧しよう
とする試みは既に1900年代から始められており、セラチ
ア菌と溶連菌の培養濾液を用いたColey'sトキシン（196
4）、ＢＣＧによる白血病治療（Mathe, G., Adv. Cance
r Res., 14, 1, 1971）およびモルモットにおける癌腫
瘤の退縮（Zbar, B.,et al., J. Natl. CancerInst., 4
8, 831, 1971）、および酵母壁多糖体の投与によるサル
コーマ180等の移植癌に対する有効性等が報告されてい
る。
【０００５】特に、多糖体に関しては、酵母グルカン、
酵母マンナン、その他の菌体の多糖体、地衣類および担
子菌類の多糖体における抗癌効果の追求に多大な労力が
注がれてきた。これらのうちで抗癌免疫増強薬として現
在市販されているものとしては、担子菌類のサルノコシ
カケ科のカワラタケ培養菌糸体由来のクレスチン（呉羽
化学、三共製薬：宿主の免疫機能賦活剤）およびシイタ
ケ多糖体のレンチナン並びにスエヒロタケ多糖体などが
ある。また、シイタケ（Lentinus edodes）は日本並び
に中国を代表する食用キノコであって日本では約300年
も前から人工栽培が行われてきたが、その薬理効果並び
に薬効成分がごく最近解明されつつあり、例えば、ラッ
ト・マウスにおける大腸および肝臓等の移植腫瘍細胞の
増殖抑制効果（Sugano, N, et al., Cancer Letter, 2
7: 1, 1985；鈴木康将ら、日本大腸肛門病会誌、43: 17
8、 1990）およびマイトジェン効果（Tabata, T. et a
l.,Immunopharmacology, 24: 57, 1992；Hibino, et a
l., Immunopharmacology, 28: 77, 1994）などが報告さ
れている。
酵母マンナン、その他の菌体の多糖体、地衣類および担
子菌類の多糖体における抗癌効果の追求に多大な労力が
注がれてきた。これらのうちで抗癌免疫増強薬として現
在市販されているものとしては、担子菌類のサルノコシ
カケ科のカワラタケ培養菌糸体由来のクレスチン（呉羽
化学、三共製薬：宿主の免疫機能賦活剤）およびシイタ
ケ多糖体のレンチナン並びにスエヒロタケ多糖体などが
ある。また、シイタケ（Lentinus edodes）は日本並び
に中国を代表する食用キノコであって日本では約300年
も前から人工栽培が行われてきたが、その薬理効果並び
に薬効成分がごく最近解明されつつあり、例えば、ラッ
ト・マウスにおける大腸および肝臓等の移植腫瘍細胞の
増殖抑制効果（Sugano, N, et al., Cancer Letter, 2
7: 1, 1985；鈴木康将ら、日本大腸肛門病会誌、43: 17
8、 1990）およびマイトジェン効果（Tabata, T. et a
l.,Immunopharmacology, 24: 57, 1992；Hibino, et a
l., Immunopharmacology, 28: 77, 1994）などが報告さ
れている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、直接投
与した際のインビボでのＬＡＫ活性増強効果をインビト
ロでスクリーニングすることができるスクリーニング物
質およびその方法を提供すべく、シイタケの持つＬＡＫ
活性増強効果（抗腫瘍および／または抗癌活性）に着目
した。
与した際のインビボでのＬＡＫ活性増強効果をインビト
ロでスクリーニングすることができるスクリーニング物
質およびその方法を提供すべく、シイタケの持つＬＡＫ
活性増強効果（抗腫瘍および／または抗癌活性）に着目
した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、シイタケ
の食用形態である子実体の前の形態である菌糸から抽出
された成分中に、子実体をはるかに凌ぐ免疫賦活活性並
びに抗腫瘍および／または抗癌活性があることを見いだ
し、しかも当該抽出物をＩＬ−２の代替物としてインビ
トロにおけるいてＬＡＫ活性誘導物質として使用するこ
とにより、当該抽出物を直接投与した際のインビボにお
ける抗腫瘍および／または抗癌作用、特にＬＡＫ活性増
強作用をスクニーリングできることを見いだして、本発
明を完成するに至った。
の食用形態である子実体の前の形態である菌糸から抽出
された成分中に、子実体をはるかに凌ぐ免疫賦活活性並
びに抗腫瘍および／または抗癌活性があることを見いだ
し、しかも当該抽出物をＩＬ−２の代替物としてインビ
トロにおけるいてＬＡＫ活性誘導物質として使用するこ
とにより、当該抽出物を直接投与した際のインビボにお
ける抗腫瘍および／または抗癌作用、特にＬＡＫ活性増
強作用をスクニーリングできることを見いだして、本発
明を完成するに至った。
【０００８】即ち、本発明は、シイタケ菌糸体抽出物を
含む抗腫瘍剤もしくは抗癌剤、特にＬＡＫ活性増強のた
めの製剤の直接投与によるＬＡＫ活性増強効果を期待で
きるか否かを、直接投与前にインビトロにおいて判断す
ることができる、シイタケの菌糸体抽出物を含有するス
クリーニング物質およびそのスクリーニング方法に関す
る。よって、本発明のスクリーニング物質およびスクリ
ーニング法は、ヒトのみならず家畜にも使用可能であ
る。
含む抗腫瘍剤もしくは抗癌剤、特にＬＡＫ活性増強のた
めの製剤の直接投与によるＬＡＫ活性増強効果を期待で
きるか否かを、直接投与前にインビトロにおいて判断す
ることができる、シイタケの菌糸体抽出物を含有するス
クリーニング物質およびそのスクリーニング方法に関す
る。よって、本発明のスクリーニング物質およびスクリ
ーニング法は、ヒトのみならず家畜にも使用可能であ
る。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明による、スクリーニング物
質として用いられるシイタケ菌体抽出物とは、シイタケ
菌を固体培地上で培養して得られる菌糸体、好ましくは
菌糸体を含む固体培地を水および酵素の存在下で粉砕、
分解して得られる抽出物を言う。
質として用いられるシイタケ菌体抽出物とは、シイタケ
菌を固体培地上で培養して得られる菌糸体、好ましくは
菌糸体を含む固体培地を水および酵素の存在下で粉砕、
分解して得られる抽出物を言う。
【００１０】シイタケ菌糸体抽出物は、好ましくは以下
の方法により得られたものを使用するが、これに限定さ
れない。即ち、バカス（サトウキビ濃度がしぼりかす）
と脱脂米糠を基材とする固体培地上にシイタケ菌を接種
し、次に菌糸体を増殖させて得られる菌糸体を含む固体
培地を１２メッシュ通過分が３０重量％以下となるよう
に解束し、この解束された固体培地に水およびセルラー
ゼ、プロテアーゼまたはグルコシダーゼから選択される
酵素１種またはそれ以上を３０−３５℃の温度に保ちな
がら、前記固体培地に添加すると共に、前記固体培地を
前記酵素の存在下で粉砕、擂潰してバカス繊維少なくと
も７０重量％以上が１２メッシュ通過分であるようにし
て、次に９５℃までの温度に加熱することにより酵素を
失活させると共に滅菌し、得られた懸濁状液体を濾過す
ることによりシイタケ菌糸体抽出物を得る。シイタケ菌
糸体抽出物はそのまま本発明の免疫療法剤に用いてよい
が、これを濃縮、凍結乾燥して粉末として保存して、使
用時に種々の形態で使用するのが便利である。凍結乾燥
して得られる粉末は褐色粉末であり、吸湿性があり、特
異な味と匂いを有する。
の方法により得られたものを使用するが、これに限定さ
れない。即ち、バカス（サトウキビ濃度がしぼりかす）
と脱脂米糠を基材とする固体培地上にシイタケ菌を接種
し、次に菌糸体を増殖させて得られる菌糸体を含む固体
培地を１２メッシュ通過分が３０重量％以下となるよう
に解束し、この解束された固体培地に水およびセルラー
ゼ、プロテアーゼまたはグルコシダーゼから選択される
酵素１種またはそれ以上を３０−３５℃の温度に保ちな
がら、前記固体培地に添加すると共に、前記固体培地を
前記酵素の存在下で粉砕、擂潰してバカス繊維少なくと
も７０重量％以上が１２メッシュ通過分であるようにし
て、次に９５℃までの温度に加熱することにより酵素を
失活させると共に滅菌し、得られた懸濁状液体を濾過す
ることによりシイタケ菌糸体抽出物を得る。シイタケ菌
糸体抽出物はそのまま本発明の免疫療法剤に用いてよい
が、これを濃縮、凍結乾燥して粉末として保存して、使
用時に種々の形態で使用するのが便利である。凍結乾燥
して得られる粉末は褐色粉末であり、吸湿性があり、特
異な味と匂いを有する。
【００１１】このようにして得られるシイタケ菌糸体抽
出物はフェノール−硫酸法による糖質分析により糖質を
２５．３％（重量／重量）、ローリー法によるタンパク
質分析によりタンパク質を１９．７％（重量／重量）、
没食子酸を規準とするFolon-Denis法によりポリフェノ
ールを２．６％（重量／重量）含んでいた。シイタケ菌
糸体抽出物には、その他に粗脂肪８％、粗灰分２２％、
糖質以外の可溶性無窒素物を約２０％含んでいた。
出物はフェノール−硫酸法による糖質分析により糖質を
２５．３％（重量／重量）、ローリー法によるタンパク
質分析によりタンパク質を１９．７％（重量／重量）、
没食子酸を規準とするFolon-Denis法によりポリフェノ
ールを２．６％（重量／重量）含んでいた。シイタケ菌
糸体抽出物には、その他に粗脂肪８％、粗灰分２２％、
糖質以外の可溶性無窒素物を約２０％含んでいた。
【００１２】また、シイタケ菌糸体抽出物の構成糖組成
（５）は以下のとおりであった。Ｘｙｌ：１５．２；Ａ
ｒａ：８．２；Ｍａｎ：８．４；Ｇｕｌ：３９．４；Ｇ
ａｌ：５．４；ＧｌｃＮ：１２．０ＧＬｕＵＡ：１１．
３。
（５）は以下のとおりであった。Ｘｙｌ：１５．２；Ａ
ｒａ：８．２；Ｍａｎ：８．４；Ｇｕｌ：３９．４；Ｇ
ａｌ：５．４；ＧｌｃＮ：１２．０ＧＬｕＵＡ：１１．
３。
【００１３】本発明のスクリーニング物質に含有される
シイタケ菌糸体抽出物は、末梢血から得られるリンパ球
分画に対して直接添加することができるが、添加の前に
アセトンによる無菌処理を行うことが好ましい。本発明
のスクリーニング物質に含有されるシイタケ菌糸体抽出
物の直接添加する際の濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ
〜１００ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは１μｇ／
ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、特に好ましくは１０μ
ｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。
シイタケ菌糸体抽出物は、末梢血から得られるリンパ球
分画に対して直接添加することができるが、添加の前に
アセトンによる無菌処理を行うことが好ましい。本発明
のスクリーニング物質に含有されるシイタケ菌糸体抽出
物の直接添加する際の濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ
〜１００ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは１μｇ／
ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、特に好ましくは１０μ
ｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。
【００１４】本発明のスクリーニング剤を用いてスクリ
ーニングを行う方法としては、高木らの方法に従い（臨
床免疫、１９：２４５−２４９，１９８７）、ＩＬ−２
に代えてシイタケ菌糸体抽出物を含有する本発明のスク
リーニング物質を用いることができる。
ーニングを行う方法としては、高木らの方法に従い（臨
床免疫、１９：２４５−２４９，１９８７）、ＩＬ−２
に代えてシイタケ菌糸体抽出物を含有する本発明のスク
リーニング物質を用いることができる。
【００１５】即ち、本発明のＬＡＫ活性増強スクリーニ
ング法は、以下の工程： （ａ）末梢血を凝血防止剤と混合したのちに単核球を分
離し、（ｂ）非付着性細胞を回収してリンパ球分画を得
て、（ｃ）リンパ球分画に本発明のスクリーニング物質
を最終濃度１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌになるように加え
る誘導サンプルと何も加えない対照サンプルを用意し
て、それぞれの群を３日間室温において静置培養する
が、その際、両サンプルに関して自然解離群、最大解離
群および実験解離群を分け、（ｄ）標的細胞に100〜150
μCiの51Ｃｒ−クロム酸ナトリウムを添加し、（ｅ）工
程（ｃ）の最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを加え、自然解
離群には何も加えず、そして実験解離群には工程（ｄ）
で得られた標的細胞を加え、５％ＣＯ 2培養器にて３７
℃において３．５時間培養し、（ｆ）培養上清を採取し
て放射活性を測定し、そして、（ｇ）以下の計算式： を用いて誘導サンプルと対照サンプルのＬＡＫ活性を算
出して互いを比較することを含む。
ング法は、以下の工程： （ａ）末梢血を凝血防止剤と混合したのちに単核球を分
離し、（ｂ）非付着性細胞を回収してリンパ球分画を得
て、（ｃ）リンパ球分画に本発明のスクリーニング物質
を最終濃度１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌになるように加え
る誘導サンプルと何も加えない対照サンプルを用意し
て、それぞれの群を３日間室温において静置培養する
が、その際、両サンプルに関して自然解離群、最大解離
群および実験解離群を分け、（ｄ）標的細胞に100〜150
μCiの51Ｃｒ−クロム酸ナトリウムを添加し、（ｅ）工
程（ｃ）の最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを加え、自然解
離群には何も加えず、そして実験解離群には工程（ｄ）
で得られた標的細胞を加え、５％ＣＯ 2培養器にて３７
℃において３．５時間培養し、（ｆ）培養上清を採取し
て放射活性を測定し、そして、（ｇ）以下の計算式： を用いて誘導サンプルと対照サンプルのＬＡＫ活性を算
出して互いを比較することを含む。
【００１６】本発明の好ましい態様において、各工程は
以下のとおりに実施するが、適切な変更および修飾がな
されてよいことは、当業者には認識される。
以下のとおりに実施するが、適切な変更および修飾がな
されてよいことは、当業者には認識される。
【００１７】工程（ａ）：被験者から採血した末梢血に
ヘパリンを加え、Ficoll-Conary液（s.g.＝1.077）を用
いた比重遠心分離法により界面の単核球を分離する。
ヘパリンを加え、Ficoll-Conary液（s.g.＝1.077）を用
いた比重遠心分離法により界面の単核球を分離する。
【００１８】工程（ｂ）：分離された単核球をＰＢＳ
（ｐＨ７．４、ＣａおよびＭｇを含まず）により２〜３
回洗浄したのち、１×１０6／ｍｌになるように１０％
ＦＢＳ（非働化血清）を加えたＲＰＭＩ 1640培地（Gib
co）に懸濁する。自己血清（血漿）を３７℃１５分処理
してコートしたペトリ皿に移し、３７℃１時間培養す
る。非付着性細胞を回収して、リンパ球分画とする。
（ｐＨ７．４、ＣａおよびＭｇを含まず）により２〜３
回洗浄したのち、１×１０6／ｍｌになるように１０％
ＦＢＳ（非働化血清）を加えたＲＰＭＩ 1640培地（Gib
co）に懸濁する。自己血清（血漿）を３７℃１５分処理
してコートしたペトリ皿に移し、３７℃１時間培養す
る。非付着性細胞を回収して、リンパ球分画とする。
【００１９】工程（ｃ）：エフェクター細胞を１ウエル
あたりの最終個数が１００μｌになるように濃度を調節
して培養液に浮遊させる。最終培養細胞濃度が１×１０
6／ｍｌを越えないようにする。該浮遊液に、シイタケ
菌糸体抽出物を最終濃度１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌにな
るように加える。本発明のスクリーニング法において、
シイタケ菌糸体抽出物は末梢血に対して直接添加するこ
とができるが、添加の前にアセトンによる無菌処理を行
うことが好ましい。スクリーニング物質に含有されるシ
イタケ菌糸体抽出物の直接添加する際の濃度は、好まし
くは１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌであり、さらに好
ましくは１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、特に
好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。９
６穴Ｕ底マイクロテストプレートにエフェクター細胞と
抽出物含有培養液１００μｌずつを入れ、炭酸ガス培養
器で培養するこの際、自然解離用と最大解離用のウエル
を用意して全体がプレートの中央にまとまるようにす
る。自然解離用のウエルには培養液のみを２００μｌ入
れる。培養は、３日間室温において静置する。対照は何
も加えない。培養細胞を再び新鮮な１０％ＦＢＳ添加Ｒ
ＰＭＩ 1640培地に懸濁する（１×１０6／ｍｌ）。
あたりの最終個数が１００μｌになるように濃度を調節
して培養液に浮遊させる。最終培養細胞濃度が１×１０
6／ｍｌを越えないようにする。該浮遊液に、シイタケ
菌糸体抽出物を最終濃度１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌにな
るように加える。本発明のスクリーニング法において、
シイタケ菌糸体抽出物は末梢血に対して直接添加するこ
とができるが、添加の前にアセトンによる無菌処理を行
うことが好ましい。スクリーニング物質に含有されるシ
イタケ菌糸体抽出物の直接添加する際の濃度は、好まし
くは１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌであり、さらに好
ましくは１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、特に
好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。９
６穴Ｕ底マイクロテストプレートにエフェクター細胞と
抽出物含有培養液１００μｌずつを入れ、炭酸ガス培養
器で培養するこの際、自然解離用と最大解離用のウエル
を用意して全体がプレートの中央にまとまるようにす
る。自然解離用のウエルには培養液のみを２００μｌ入
れる。培養は、３日間室温において静置する。対照は何
も加えない。培養細胞を再び新鮮な１０％ＦＢＳ添加Ｒ
ＰＭＩ 1640培地に懸濁する（１×１０6／ｍｌ）。
【００２０】工程（ｄ）：標的細胞である継代培養細
胞、好ましくはDaudiあるいはRajiを遠心分離により集
菌し、100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム酸ナトリウムを添
加する。５％ＣＯ2培養器にて３７℃において１時間培
養する。培養細胞をＰＢＳにより３回洗浄後、１×１０
6／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培
地に懸濁する。
胞、好ましくはDaudiあるいはRajiを遠心分離により集
菌し、100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム酸ナトリウムを添
加する。５％ＣＯ2培養器にて３７℃において１時間培
養する。培養細胞をＰＢＳにより３回洗浄後、１×１０
6／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培
地に懸濁する。
【００２１】工程（ｅ）：上記マイクロテストプレート
の各ウエルについて、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを分
注し、自然解離群（対照）には１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭ
Ｉ 1640培地を分注し、そして実験解離群にはエフェク
ター細胞（５０μｌ（１×１０4／ウエル）ずつ）を分
注する。プレート遠心分離機により800rpmにおいて５分
間遠心分離して、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において
３．５時間培養する。
の各ウエルについて、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを分
注し、自然解離群（対照）には１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭ
Ｉ 1640培地を分注し、そして実験解離群にはエフェク
ター細胞（５０μｌ（１×１０4／ウエル）ずつ）を分
注する。プレート遠心分離機により800rpmにおいて５分
間遠心分離して、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において
３．５時間培養する。
【００２２】工程（ｆ）：培養したプレートからSOKEN-
PET Σ-96にて各ウエルの培養上清を採取し、γ−シン
チレーションカウンターにより放射活性を測定する。
PET Σ-96にて各ウエルの培養上清を採取し、γ−シン
チレーションカウンターにより放射活性を測定する。
【００２３】工程（ｇ）：ＬＡＫ活性は、以下の表に従
って算出する。
って算出する。
【００２４】本発明を以下の実施例によりさらに詳細に
説明するが、これらはあくまで例示であって、本発明の
範囲を限定するためのものではない。本発明の精神から
逸脱することなく、本発明に対する様々な変更あるいは
修飾がなされてよいことは、当業者には理解される。
説明するが、これらはあくまで例示であって、本発明の
範囲を限定するためのものではない。本発明の精神から
逸脱することなく、本発明に対する様々な変更あるいは
修飾がなされてよいことは、当業者には理解される。
【００２５】
【実施例】実施例１：シイタケ菌糸体抽出物の調製 バカス９０重量部、米糠１０重量部からなる固体培地に
純水を適度に含ませた後に、シイタケ種菌を接種し、温
度および湿度を調節した培養室内に放置し、菌糸体を増
殖させた。菌糸体が固体培地に密集した後、バカス基材
の繊維素を解束し、１２メッシュ通過分が２４重量％以
下となるようにした。この解束された培地１．０ｋｇ
に、純水３．５ｌおよび精製シルラーゼ２．０ｇを、固
体培地を４０℃にた持ちながら加えて培地含有混合物と
した。
純水を適度に含ませた後に、シイタケ種菌を接種し、温
度および湿度を調節した培養室内に放置し、菌糸体を増
殖させた。菌糸体が固体培地に密集した後、バカス基材
の繊維素を解束し、１２メッシュ通過分が２４重量％以
下となるようにした。この解束された培地１．０ｋｇ
に、純水３．５ｌおよび精製シルラーゼ２．０ｇを、固
体培地を４０℃にた持ちながら加えて培地含有混合物と
した。
【００２６】次いで、培地含有混合物を変速ギヤー付ポ
ンプにより循環させながら、固体培地にギヤー部分にお
いて粉砕および擂潰作用を２００分間程度加えて、バカ
ス繊維の約８０重量％が１２メッシュ通過分となるよう
にした。培地含有混合物の粉砕および擂潰は、該混合物
の温度を徐々に上昇させながら実施した。その後、培地
含有混合物をさらに９０℃まで加熱して酵素を失活せし
めると同時に滅菌して、９０℃に３０分間放置した。得
られた培地含有混合液を６０メッシュ濾布により濾過し
てシイタケ菌糸体抽出物とし、濃縮した後、凍結乾燥粉
末を得た。 実施例２：ＬＡＫ活性の測定 被験者Ａ、ＢおよびＣからシイタケ菌糸体抽出物服用前
の末梢血を採血した。
ンプにより循環させながら、固体培地にギヤー部分にお
いて粉砕および擂潰作用を２００分間程度加えて、バカ
ス繊維の約８０重量％が１２メッシュ通過分となるよう
にした。培地含有混合物の粉砕および擂潰は、該混合物
の温度を徐々に上昇させながら実施した。その後、培地
含有混合物をさらに９０℃まで加熱して酵素を失活せし
めると同時に滅菌して、９０℃に３０分間放置した。得
られた培地含有混合液を６０メッシュ濾布により濾過し
てシイタケ菌糸体抽出物とし、濃縮した後、凍結乾燥粉
末を得た。 実施例２：ＬＡＫ活性の測定 被験者Ａ、ＢおよびＣからシイタケ菌糸体抽出物服用前
の末梢血を採血した。
【００２７】被験者Ａ、ＢおよびＣ各々に、シイタケ菌
糸体抽出物１２００ｍｇを毎日３回、１週間投与した。
糸体抽出物１２００ｍｇを毎日３回、１週間投与した。
【００２８】被験者Ａ、ＢおよびＣからシイタケ菌糸体
抽出物服用後に採血した。これらの末梢血にヘパリンを
加え、Ficoll-Conary液（s.g.＝1.077）を用いた比重遠
心分離法により界面の単核球を分離した。分離された単
核球をＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＣａおよびＭｇを含まず）
により２回洗浄したのち、１×１０6／ｍｌになるよう
に１０％ＦＢＳ（非働化血清）を加えたＲＰＭＩ 1640
培地（Gibco）に懸濁した。
抽出物服用後に採血した。これらの末梢血にヘパリンを
加え、Ficoll-Conary液（s.g.＝1.077）を用いた比重遠
心分離法により界面の単核球を分離した。分離された単
核球をＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＣａおよびＭｇを含まず）
により２回洗浄したのち、１×１０6／ｍｌになるよう
に１０％ＦＢＳ（非働化血清）を加えたＲＰＭＩ 1640
培地（Gibco）に懸濁した。
【００２９】標的細胞である継代培養細胞（Daudi）を
遠心分離により集菌し、100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム
酸ナトリウム（New England Nuclear）を添加した。５
％ＣＯ2培養器にて３７℃において１時間培養した。培
養細胞をＰＢＳにより３回洗浄後、１×１０6／ｍｌに
なるように１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁
した。
遠心分離により集菌し、100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム
酸ナトリウム（New England Nuclear）を添加した。５
％ＣＯ2培養器にて３７℃において１時間培養した。培
養細胞をＰＢＳにより３回洗浄後、１×１０6／ｍｌに
なるように１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁
した。
【００３０】上記マイクロテストプレートの各ウエルに
ついて、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを分注し、自然解
離群（対照）には１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地
を分注し、そして実験解離群にはエフェクター細胞（５
０μｌ（１×１０4／ウエル）ずつ）を分注した。プレ
ート遠心分離機により800rpmにおいて５分間遠心分離し
て、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培
養した。
ついて、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを分注し、自然解
離群（対照）には１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地
を分注し、そして実験解離群にはエフェクター細胞（５
０μｌ（１×１０4／ウエル）ずつ）を分注した。プレ
ート遠心分離機により800rpmにおいて５分間遠心分離し
て、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培
養した。
【００３１】培養したプレートからSOKEN-PET Σ-96に
て各ウエルの培養上清を採取し、γ−シンチレーション
カウンターにより放射活性を測定した。
て各ウエルの培養上清を採取し、γ−シンチレーション
カウンターにより放射活性を測定した。
【００３２】ＬＡＫ活性は以下の表に従って算出した。
【００３３】結果を表１並びに図１に示す。
【００３４】一方、スクリーニングするためには、被験
者Ａ、ＢおよびＣから採血したシイタケ菌糸体抽出物服
用前の末梢血にヘパリンを加え、Ficoll-Conary液（s.
g.＝1.077）を用いた比重遠心分離法により界面の単核
球を分離した。分離された単核球をＰＢＳ（ｐＨ７．
４、ＣａおよびＭｇを含まず）により２回洗浄したの
ち、１×１０6／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ（非働
化血清）を加えたＲＰＭＩ 1640培地（Gibco）に懸濁し
た。自己血清（血漿）を３７℃５分処理してコートした
ペトリ皿に移し、３７℃１時間培養した。非付着性細胞
を回収して、リンパ球分画とした。
者Ａ、ＢおよびＣから採血したシイタケ菌糸体抽出物服
用前の末梢血にヘパリンを加え、Ficoll-Conary液（s.
g.＝1.077）を用いた比重遠心分離法により界面の単核
球を分離した。分離された単核球をＰＢＳ（ｐＨ７．
４、ＣａおよびＭｇを含まず）により２回洗浄したの
ち、１×１０6／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ（非働
化血清）を加えたＲＰＭＩ 1640培地（Gibco）に懸濁し
た。自己血清（血漿）を３７℃５分処理してコートした
ペトリ皿に移し、３７℃１時間培養した。非付着性細胞
を回収して、リンパ球分画とした。
【００３５】エフェクター細胞を１ウエルあたりの最終
個数が１００μｌになるように濃度を調節して培養液に
浮遊させた。該浮遊液に、シイタケ菌糸体抽出物を最終
濃度１０μｇ／ｍｌにて加えた。９６穴Ｕ底マイクロテ
ストプレートにエフェクター細胞と抽出物含有培養液１
００μｌずつを入れ、炭酸ガス培養器で培養した。この
際、自然解離用と最大解離用のウエルを用意した。自然
解離用のウエルには培養液のみを２００μｌ入れた。培
養は、３日間室温において静置した。尚、対照は何も加
えなかった。培養細胞を再び新鮮な１０％ＦＢＳ添加Ｒ
ＰＭＩ 1640培地に懸濁した（１×１０6／ｍｌ）。
個数が１００μｌになるように濃度を調節して培養液に
浮遊させた。該浮遊液に、シイタケ菌糸体抽出物を最終
濃度１０μｇ／ｍｌにて加えた。９６穴Ｕ底マイクロテ
ストプレートにエフェクター細胞と抽出物含有培養液１
００μｌずつを入れ、炭酸ガス培養器で培養した。この
際、自然解離用と最大解離用のウエルを用意した。自然
解離用のウエルには培養液のみを２００μｌ入れた。培
養は、３日間室温において静置した。尚、対照は何も加
えなかった。培養細胞を再び新鮮な１０％ＦＢＳ添加Ｒ
ＰＭＩ 1640培地に懸濁した（１×１０6／ｍｌ）。
【００３６】標的細胞である継代培養細胞（Daudi）を
遠心分離により集菌し、100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム
酸ナトリウム（New England Nuclear）を添加した。５
％ＣＯ2培養器にて３７℃において１時間培養した。培
養細胞をＰＢＳにより３回洗浄後、１×１０6／ｍｌに
なるように１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁
した。
遠心分離により集菌し、100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム
酸ナトリウム（New England Nuclear）を添加した。５
％ＣＯ2培養器にて３７℃において１時間培養した。培
養細胞をＰＢＳにより３回洗浄後、１×１０6／ｍｌに
なるように１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁
した。
【００３７】上記マイクロテストプレートの各ウエルに
ついて、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを分注し、自然解
離群（対照）には１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地
を分注し、そして実験解離群にはエフェクター細胞（５
０μｌ（１×１０4／ウエル）ずつ）を分注した。プレ
ート遠心分離機により800rpmにおいて５分間遠心分離し
て、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培
養した。
ついて、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを分注し、自然解
離群（対照）には１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地
を分注し、そして実験解離群にはエフェクター細胞（５
０μｌ（１×１０4／ウエル）ずつ）を分注した。プレ
ート遠心分離機により800rpmにおいて５分間遠心分離し
て、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培
養した。
【００３８】培養したプレートからSOKEN-PET Σ-96に
て各ウエルの培養上清を採取し、γ−シンチレーション
カウンターにより放射活性を測定した。
て各ウエルの培養上清を採取し、γ−シンチレーション
カウンターにより放射活性を測定した。
【００３９】ＬＡＫ活性は以下の表に従って算出した。
【００４０】この結果も合せて表１並びに図１に示す。
【００４１】
【表１】 実験番号 ＬＡＫ活性 被験者Ａ 被験者Ｂ 被験者Ｃ １ 服用前 １３％ ２７％ １４％ ２ 抽出物によるスクリーニング （最終濃度：１０μｇ／ｍｌ） ２１％ ３４％ １５％ ３ 抽出物服用後 ４０％ ４３％ １５％
【００４２】
【発明の効果】被験者ＡおよびＢにおいては、本発明の
スクリーニング物質を使用したスクリーニングにおいて
ＬＡＫ活性の増強効果が認められたため、シイタケ菌糸
体抽出物を経口投与した際のＬＡＫ活性の増強効果が期
待できることが判明した。実際にシイタケ菌糸体含有物
を経口投与したところ、インビボにおいてもＬＡＫ活性
が増強していることが確認され、スクリーニングの妥当
性を確認することができた。一方、被験者Ｃにおいて
は、本発明のスクリーニング物質を使用したスクリーニ
ングにおいてＬＡＫ活性の増強効果が認められなかった
ため、シイタケ菌糸体抽出物を経口投与した際のＬＡＫ
活性の増強効果は期待できないことが判明した。実際に
シイタケ菌糸体含有物を経口投与したところ、インビボ
においてもＬＡＫ活性が増強していないことが確認さ
れ、スクリーニングの妥当性を確認することができた。
シイタケ菌糸体抽出物を含有するスクリーニング物質を
用いて、直接投与した際のインビボでのＬＡＫ活性増強
効果をインビトロでスクリーニングすることができた。
スクリーニング物質を使用したスクリーニングにおいて
ＬＡＫ活性の増強効果が認められたため、シイタケ菌糸
体抽出物を経口投与した際のＬＡＫ活性の増強効果が期
待できることが判明した。実際にシイタケ菌糸体含有物
を経口投与したところ、インビボにおいてもＬＡＫ活性
が増強していることが確認され、スクリーニングの妥当
性を確認することができた。一方、被験者Ｃにおいて
は、本発明のスクリーニング物質を使用したスクリーニ
ングにおいてＬＡＫ活性の増強効果が認められなかった
ため、シイタケ菌糸体抽出物を経口投与した際のＬＡＫ
活性の増強効果は期待できないことが判明した。実際に
シイタケ菌糸体含有物を経口投与したところ、インビボ
においてもＬＡＫ活性が増強していないことが確認さ
れ、スクリーニングの妥当性を確認することができた。
シイタケ菌糸体抽出物を含有するスクリーニング物質を
用いて、直接投与した際のインビボでのＬＡＫ活性増強
効果をインビトロでスクリーニングすることができた。
【００４３】よって、本発明のスクリーニング物質に、
シイタケ菌糸体抽出物を使用することができるといえ
る。これにより、直接投与した際のインビボでのＬＡＫ
活性増強効果を直接投与する事前にインビトロで簡便に
判断することができ、ＬＡＫ活性増強効果の期待できる
被験者に対して、ＬＡＫ活性増強物質の効果的な投与を
迅速に行うことができるだけでなく、ＬＡＫ活性増強効
果の期待できない被験者に対しては、ＬＡＫ活性増強物
質の無駄な投与を防止することができる。
シイタケ菌糸体抽出物を使用することができるといえ
る。これにより、直接投与した際のインビボでのＬＡＫ
活性増強効果を直接投与する事前にインビトロで簡便に
判断することができ、ＬＡＫ活性増強効果の期待できる
被験者に対して、ＬＡＫ活性増強物質の効果的な投与を
迅速に行うことができるだけでなく、ＬＡＫ活性増強効
果の期待できない被験者に対しては、ＬＡＫ活性増強物
質の無駄な投与を防止することができる。
【図１】図１は、本発明のシイタケ菌糸体抽出物を用い
たＬＡＫ活性増強スクリーニングの結果を示す表１のデ
ータを棒グラフにより表す。
たＬＡＫ活性増強スクリーニングの結果を示す表１のデ
ータを棒グラフにより表す。
フロントページの続き (72)発明者 松田 由紀子 大阪府大阪市淀川区三津屋南３−13−35 小林製薬株式会社内 (72)発明者 田島 裕 佐賀県佐賀市八戸溝３丁目10番511号 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 BB20 BB34 CA17 CA20 CA25 CB02 CB20 CB21 CB30 FB03 FB08 GC30 JA01 4C088 AA08 AC17 BA05 NA14 ZB09 ZB26
Claims (2)
- 【請求項１】 インビボにおいてＬＡＫ活性を増強し得
るかどうかをインビトロにおいてスクリーニングし得
る、シイタケ菌糸体抽出物を含有する、スクリーニング
物質。 - 【請求項２】 以下の工程： （ａ）末梢血を凝血防止剤と混合したのちに単核球を分
離し、 （ｂ）非付着性細胞を回収してリンパ球分画を得て、 （ｃ）リンパ球分画に請求項１に記載のスクリーニング
物質を最終濃度１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌになるように
加える誘導サンプルと何も加えない対照サンプルを用意
して、それぞれの群を３日間室温において静置培養する
が、その際、両サンプルに関して自然解離群、最大解離
群および実験解離群を分け、 （ｄ）標的細胞に100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム酸ナト
リウムを添加し、 （ｅ）工程（ｃ）の最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを加
え、自然解離群には何も加えず、そして実験解離群には
工程（ｄ）で得られた標的細胞を加え、５％ＣＯ2培養
器にて３７℃において３．５時間培養し、 （ｆ）培養上清を採取して放射活性を測定し、そして、 （ｇ）以下の計算式： を用いて誘導サンプルと対照サンプルのＬＡＫ活性を算
出して互いを比較することによる、ＬＡＫ活性増強スク
リーニング法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35392698A JP4308350B2 (ja) | 1998-11-27 | 1998-11-27 | シイタケ菌糸体抽出物を含有するｌａｋ活性スクリーニング物質およびそれを用いたｌａｋ活性スクリーニング法 |
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