TWI296285B - Promoter sequences from wssv immediate early genes and their uses in recombinant dna techniques - Google Patents

Description

1296285 九、發明說明： L潑^明所屬技抽^領域】 • 本發明是有關經分離的核苔酸序列，它們是衍生自一 最近被鑑定出的白點症病毒（WSSV)的極早期基因 5 (immediate early gene)，而且它們具有啟動子活性以驅動一 標的基因在一非天然的宿主細胞内的轉錄，因而在供生物 技術領域的使用上具有很大的潛力。 【m袖ί】（相關技藝的描述） • 重組型多肽/蛋白質的生產在生物技術的領域中是一 1〇 非常重要的遺傳工程技術。它的基本原理涉及到將一能表 現一所欲基因產物[例如，核酸代酶(ribozymes)和RNA轉錄 物(RNA transcripts)、工業和農業用酵素、治療性蛋白質、 干擾素（interferons)、間白素（interleukins)、激素 (hormones)、生長激素（growth hormones)、抗原性多肽 15 (antigenic polypeptides)、抗體以及類似物]的標的基因 (target gene)選殖至一個適當的載體内，以及隨後將所形成 ® 的重組型載體轉移至一勝任的宿主細胞（competent host cell)中。由此所形成的重組型宿主細胞可於合適的培養條 件下被於培養於一合適的培養基中，並且該標的基因的表 2〇 現可於一適當的時機下被誘導，以便達到大量生產該所欲 的基因產物的目的。 依據遺傳工程領域中的現今知識與技術，大腸桿菌 (心細胞是最被廣泛運用且最為有效的宿主 細胞，並且已有發展出許多類型的質體載體來供宿留於這 1296285 個細菌物種内。該等質體載體通常被建構成具有一誘導性 人工啟動子（artificial promoter)被選殖在位於一標的基因的 上游處，以便能控制該標的基因的表現。一般最常被使用 的人工啟動子包括/ac、吵、_、ire、araBAZ)、儿?/^和丁7 5啟動子，而這些啟動子可藉由異丙基-/5硫代半乳糖哌喃 甘（isopropyl-万-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、乳糖 (lactose)、阿拉伯糖(arabinose)的加入、溫度的變化或類似 方式而被誘導(S.C· Makrides ei αΖ· (1996)，jRev·, 60: 512-538)。 10 另一方面’ 一被選殖的標的基因若含有一組成性啟動 子（constitutive promoter)，它可被直接地選殖至一載體内。 當使用此一標的基因來建構一重組型載體時，通常無須藉 由誘導的方法來引發重組型多肽/蛋白質的生產。 可被用來進行載體轉形（vector transformation)的其他 15 原核細胞(prokaryotic cells)包括，但不限於，衍生自下列的 細胞：其他的細菌物種/屬[諸如枯草桿菌（jgac/ZZws 似以）、黏質沙雷氏桿菌、乳样菌屬 物種(L似π·)、鏈黴菌屬物種(仍⑺m;yCa π·)以 及沙門氏傷寒桿菌0^/η·)]、藍綠蕩 20 、放線菌(AcizViomycWM)等等。 但是，原核細胞並不會，而酵母菌僅有限地進行被表 現的多肽/蛋白質的轉譯後修飾（post-translational modifications)，然而高等真核細胞能夠執行通常為蛋白質 的適當功能所必需的複雜的蛋白質修飾。因此，如果轉譯 6 1296285 後修飾是重組型多肽/蛋白質所需要的，可能會更加希望使 用真核細胞(eukaryotic cells)來生產該重組型多肽/蛋白質。 適合用於進行載體轉形的真核細胞包括，例如··真菌 細胞、原生動物細胞(protozoan cells)、植物細胞、昆蟲細 5 胞、動物細胞以及人類細胞。合適的真菌細胞的實例有： 酵母菌細胞，例如麵包酵母菌（Sacc/mramyca 或 嗜甲醇酵母菌CP/c/n_(2 以及克魯維酵母 [諸如乳酸克魯氏酵母(K Mci⑷與馬克斯 克魯維酵母([的細胞。合適的植物細胞是那些 10 衍生自裸子植物（gynosperms)或被子植物（angiosperms) 的，較佳為單子葉植物(monocots)與雙子葉植物(dicots)，特 別是作物(crops)，而且是衍生自這些植物的根、莖、葉或 分生組織(meristem)，並且呈原生質體(protoplasts)或癒合組 織(callus)的形式被培養。合適的昆蟲細胞的實例是果蠅S2 15 細胞以及衍生自秋行軍蟲/rwg/penia)的Sf21細 胞與Sf9細胞等等。合適的動物細胞可以是被培養的細胞或 活體内細胞’較佳為衍生自脊椎動物，更佳為衍生自哺乳 動物’並且是衍生自這些動物的器官或組織(諸如腎臟、肝 臟、肺臟、卵巢、乳房、皮膚、骨骼、血液）。動物細胞的 20 代表例包括：CHO、COS、BHK、HEK-293、HeLa、NIH3T3、 VERO、MDCK、MOLT-4、Jurkat、K562、HepG2等等。 供應用於轉形上面所示的宿主細胞的載體包括那些通 常被使用於遺傳工程技術中的，例如：噬菌體，諸如又噬 菌體；質體，諸如來自大腸桿菌（五· 的質體（包括 7 1296285 pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pQE-30、ρΕΤ12、ΡΕΤ30 等等），來自枯草桿菌的質體（包括pUBllO、pTP5、pci94 等等），用於大腸桿菌和枯草桿菌的穿梭載體（例如 pHY300PLK)，以及來自酵母菌的質體（包括pSH19、PSH15 5等等），黏接質體，病毒’包括··昆蟲病毒，例如桿狀病毒 (baculoviruses);動物病毒，例如牛痘病毒（vaccinia viruses)、巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、反轉錄病毒 (retroviruses)等等0 ^ 為達成一選定的標的基因的一個有效表現，希望能構 10 築一含有一有功能的啟動子/調節序列的載體，而該有功能 的啟動子/調節序列被可操作地連結至一為該載體所攜帶 的標的基因。此（等）啟動子/調節序列可以衍生自下列任何 一個：病毒、細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、藻類細 胞（algal cells)、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞與人類細 15 胞。例如：一種可用於大腸桿菌（五·⑺/〇細胞的啟動子包 括，但不限於··如c啟動子、T5啟動子、T7啟動子、T7 A1 _ 故動子、lac敗動子、trp故動子、trc敗動子、recA故動子、

Zpp啟動子、arajBAD啟動子以及；I 啟動子。一種可用 於桿菌屬物種細胞的啟動子包括，但不限於：SP01啟動 20 子、SP0啟動子、penP啟動子等等。一種可用於酵母菌細 胞的啟動子包括，但不限於：PH05啟動子、PGK啟動子、 GAP啟動子、ADH啟動子等等。一種可用於昆蟲細胞的啟 動子包括，但不限於：多角體蛋白（polyhedrin)啟動子、p10 啟動子、〇pIE2 (OpMNPV 啟動子等等。一種可用於動 8 1296285 物細胞的啟動子包括，但不限於：SRα啟動子、SV40早期 啟動子、RSV-啟動子、HIV-LTR啟動子、HSV-TK啟動子、 CMV啟動子、CMV-HSV胸苷激酶(thymidine kinase)啟動子 等等。一種可用於植物細胞的啟動子包括，例如：35S CaMV 5 啟動子、肌動蛋白（actin)啟動子、泛素(ubiquitin)啟動子等 等。適合供應用於嗔乳動物細胞的調節要素（regUlat〇ry elements)包括：CMV-HSV胸苷激酶啟動子、SV40早期啟動 子、RSV-啟動子、CMV增強子以及SV40增強子。 ® 另外，代表性的RNA聚合酶啟動子可被分類成下面的 10 類型：誘導性啟動子、組成性啟動子、組織專一性啟動子 以及合成的啟動子。代表性的誘導性啟動子是：熱誘導性 Hsp70啟動子、一種金屬硫蛋白（metaii〇thi〇nein)啟動子、一 種醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)啟動子以及一種半乳糖 (galactose)啟動子。代表性的組成性啟動子是勞氏肉瘤病毒 I5 (Rous sarcoma virus，RSV) LTR啟動子、人類巨細胞病毒 (CMV)主要極早期基因啟動子以及Sv4〇早期啟動子；以及 ® 代表性的組織專一性啟動子是一種阿爾發血紅素（alpha globm)啟動子與一種貝他血紅素(betaglobin)啟動子。合成 的啟動子可以藉由化學地或重組地修飾天然的啟動子而被 20 生成。 除了缺乏轉譯後修飾機轉之外，存在有其他的與在原 核細胞内表現某些蛋白質有關聯的問題。例如，某些被表 現的異源性蛋白（heterolog〇Us pr〇teins)是有如不溶性包涵 體被儲存在原核細胞内，而使該等蛋白質的回收變得困 9 1296285 難。許多與原核表現系統有關聯的困難可以藉由使用經轉 形的哺乳動物細胞培養系統來生產被轉譯後加工的蛋白質 (post-translationally processed proteins)而被克服0 然而，哺 乳動物細胞培養物可能相對地較不有效，因為它們生長緩 5 慢以及在維持上較困難且花費較高。 在昆蟲細胞的培養上的進步，以及以桿狀病毒為主的 表現系統之發展，已經促進異源性蛋白質藉由經轉形的昆 蟲細胞株的表現(Lwcbw Swmmers (7988)，iB/cvTec/i·，（5, 47-55·，Miller (1988)，Annu· Rev· Microbiol·，42, 177-199)。良 10今，異源性蛋白質在經轉形的昆蟲細胞株内的表現主要是 使用衍生自桿狀病毒苜蓿尺蠖核多角體病毒 californica multicapsid nucleopolyhedrosis virus, AcMNPM)(Luckow and Summers (1988)，如上述；Miller (79SSJ，如2遂)的載體而被完成。 15 桿狀病毒是雙股的DNA病毒，它們是藉由在一典型的 感染週期之後的溶胞作用（lySis)來殺死被感染的昆蟲細 胞。已知有各種不同的桿狀病毒，它們各個對於一種特定 的節肢動物物種(arthropod species)是特有的。尚不知桿狀 病毒是否可在節肢動物門以外的動物體内進行複製。 20 在一昆蟲的天然的桿狀病毒感染期間當中的基因表現

被南度0周控並且有如一有順序的級聯（〇r(JerecJ cascacje)來發 生。病毒基因可以依據它們在這個基因表現的級聯内的位 置而被分類成四個不同的類別··極早期（IE)、遲發早期 (DE)、晚期以及與非常晚期。早期基因表現發生在病毒dnA 1296285 複製的開始之前，並且似乎是晚期病毒基因表現的誘導所 必要的（Blissczrd and Rohnnann (1990)，Amm· Rev· Entomol” 35: 127-155·，Guarino and Summers (1988)，J· Virol 62 * 463-471·，Miller et al· (1983)，Virology，126·· 376-380、。實驗 5證據顯示出·在無其他病毒因子的存在下，桿狀病毒^基因 是由宿主的RNA聚合峰Π所轉錄。因此知道桿狀病毒化基因 具有可被宿主細胞的轉錄機制所辨識的啟動子。 上面有關於才干狀病毋及其化基因的描述是引述自us 20020116723 A1，該案揭露使用衍生自一桿狀病毒極早期 10啟動子的啟動子來控制一可選擇的標記基因的表現，該標 記基因提供針對博萊黴素/腐草黴素型抗生素 (bleomycin/phleomycin-type antibiotics)的家族當中一個的 抗性。特別地，US 20020116723 A1揭露：衍生自黃杉毒 蛾核多角體病毒（0客>^ «料姒multicapsid 15 nucleopolyhedrosis virus, OpMNPV)的ie/和z>2基因的和 化2啟動子可以被可操作地連結至一可選擇的標記基因以便 控制自該可選擇的標記基因的轉錄作用，並且該可選擇的 標記基因可以是會對昆蟲細胞提供Zeocin抗性的印度斯坦 鍵異壁菌⑽//〇如Me基因。 2〇 描述病毒載體和/或含有病毒啟動子的載體的構築的 專利以及被公開的專利申請案包括，但不限於：US 5,077,214、US 5，162,222、US 5，168,062、US 5,385,839、 US 20020116723A卜 US 20030108524A1、US 20030108863

Al、US 20030229046 Al、US 20040082531 Al、US 11 1296285 20040161841 A1、US 20040197313 A1、WO 99/61636 A1 以 及WO 0105992 A1。 與用於構築可應用於宿主細胞的轉形（transformation) 和/或轉染(transfection)的載體的病毒啟動子和/或調節序列 5 的鑑定相關的文獻參考資料包括，但不限於：r〇m A.

et al· (1997)，Gene，188，183-190·，Steven S. Pullen and Paul D· Friesen，June 1995，69 (6)，3575-3583·，Fan Xiu Zhu et al·， J· Virol” July 1999，73 (7)，5556-5567·，R.L· Harrison and B.C· Bonning (2003)，J· Gen· Virol·，84 (Pt 7)，1827-1842·， 10 Ε·Β· Carstens et al·，Virus research (2002)，83，13-30\ Μ·Κ· Barnhart et al·，J· Virol·，Jan· 1997，71 (1)，337-344\ LA· Guarino and M.D· Summers，J· Virol” Feb· 1986，57 (2)， 563-571\ V.A. Olson et al, J. Viroly May 2003, 77 (10), 5668-5677·，Ε·Α· van Strien et al·，Arch Virol· (2000)，145, 15 2115-2133、VA· Olson et al” J. Virol” Sep· 2002，76 (18)， 9505-9515·，Andrew K· Cheung (1999)，Nucleic Acid Research, 17 (12), 4637-4646; Alexandra Garcia-Maruniak et al.，J· Virol·，July 2004, 78 (13)，7036-7051·，K· Kojima et al. (2001)，Arch Virol·，146, 1407-1414 〇 20 雖然如上所述，本技藝中的研究人員仍然致力於探究 任何有潛力的啟動子和/或調節序列，它們可被用於構築可 應用在重組型多肽/蛋白質的生產的重組型表現載體。 白點症病毒（white spot syndrome virus WSSV)或白點 桿狀病毒(white spot bacilliform virus，WSBV)，它是一種有 12 1296285 外套的橢圓體狀大型雙股DNA病毒，是全世界的養殖蝦類 的最毒且最危險的病毒性病原當中的一個([/nowK以αΖ·， Fish Pathol· (1994)，29:149-158认 S^Fish Pathol· (1996)，31: 39-45\ Nakano et al·，Fish Pathol· (1994)，29 (2):135-139\ 5 Takahashi et al” Fish Pathol· (1994)，29 (2): 121-125’，Η·-Υ· Chou et al· (1995)，Dis· Aquat· Org·，23:165-173·，J· Huang et aLy Marine Fish Res. (1995), 16:1-10 and Marine Fish Res. (1995)，16:11-23; C.-F· Lo，et al·，Dis· Aquat· Org· (1996)， 27，215-225以反J· Fish· Soc, Taiwan (2003)，30，1-13·，C，H. 10 Wang et al. (1995), Dis Aquat. Org., 23:239-242; C. Wongteerasupaya et al· (1995)，Dis· Aquat· Org·，21:69-77·， T.W· Flegel (1997)，World J. Microbiol. Biotech·，13, 433-442·，Y· Lu et al· (1997)，J. Gen· Virol” 84:1517-1523、。 它也會攻擊許多其他的甲殼類（crustaceans)，諸如蟹類 15 (crabs)和螯蝦(crayfishes)。另外，由於WSSV的獨特性，要 藉由直接地應用其他病毒的感染模式來解釋WSSV的感染 策略是困難的。結果，WSSV的感染策略可能必須從頭開始 研究。 形態上，WSSV的病毒粒子(virion)是一大約為275x120 20 nm並且具有一撖視至桿狀的形狀的非封埋性有外套的顆粒 體(nonoccluded，enveloped particle)，並且具有一帶有垂直 於長軸的週期性條紋的核殼體(3〇〇X7〇 nm)(d 以 aL (J995)， Dis Aquat Org·， 23: 239-242·， C.

Wongteerasupaya et al (1995)，Dis· Aquat· Org,，21: 13 1296285 仍-77)。WSSV的最顯著特徵是在病毒粒子的一端處存在有 一尾狀的延伸部分（肠叩(7995)，如2遂； S· Durand et al· (1997)，Dis. Aquat· Org·，29:205-211) 〇 完整基因組定序（genome sequencing)已在3種WSSV分 5 離株上被執行（關於台灣分離株WSSV T-l，參見NCBI登錄 編號AF440570 ;關於泰國分離株，參見NCBI登錄編號 AF369029 ;以及關於中國分離株，參見NCBI登錄編號 AF332093)。WSSV基因組（〜300 kb)比長囊水雲病毒 [五cioarp⑽hZ/cw/omy virus，EsV-1，藻去氧核糖核酸病毒 10 科(PA；ycW⑽v/r/也^)]的335,593 bp基因組要小〜30 kb，長囊 水雲病毒是迄今已被定序的最大病毒基因組(/.L. van Etten et al· (2002)，Arch Virol” 147，1479-516、。 針對個別基因的先前研究以及完整的基因組序列的分 析暗示WSSV不屬於任何已知的病毒科乃⑴· ei β/.， 15 Virology (2000), 277, 92-99 and Virology (2000), 277:100-110; W.J· Liu et al”（2001)，Virology 289: 362-377·， Feng Yang et al·，J· Virol” Dec. 2001，75 (23): 11811-11820·， C.W. Marielle et aL, Virology. July 20, 2001, 286 (l):7-22\ L.-L. Chen et al· (2002)，Virology 301: 136-147·，H. Marks et 20 al· (2003)，J Gen Viwl 84:1517-1523)。最近，WSSV被提議 是歸屬於線病毒科的白點病毒屬（Μπ·v/rws) 的典型物種(type species)(M.i4· Mfl；yo (2002J，Arc/t· Vz><9/·， 147, 1655-1663)。 在申請人針對台灣分離株使用微陣列技術(microarray 14 1296285 technique)的較早基因組分析中，這個分離株被鑑定出具有 總共532個推定的開放讀取架構（0pen reading frame， 〇RF)，它們是以一個ATG起始密碼子來開始並且可能編碼 一為至少60個胺基酸長的多肽，在這些〇RF當中，迄今已 5有39個被鑑定出是WSSV結構基因以及有少於12個是非結 構基因。另外，對於〜90%的這些ORF已偵測到有轉錄本 (transcripts)^.-C. Wang, et aL UDNA microarrays of the white spot syndrome virus genome: genes expressed in the gidls of infected shrimp，” Marine Biotechnology，付特中）〇 男 10 外’根據針對NCBInr資料庫的同源性搜尋（homology searches)，就該台灣分離株而被公佈的大多數ORF與其他已 知的蛋白質顯示出沒有顯著的相似性。關於其他雨種分離 株有相似的結果被報導(Μαη·έ7& C.W· van 以αΖ·，

Virology· July 20，2001，286 (l):7-22; Feng Yang et al” J. 15 Viwl” Dec· 2001，75 (23)·· 11811-11820、〇 然而，雖然WSSV基因的暫時性表現已藉由個別的基因 研究(L,L· Chen et al· (2002)，Virology，301，136-147·，J.-H· Leu，et al· (2005)，J· Virol” Jan· 2005, 79 (1)，140，149.，W.-J· Liu，et al. (2001)，Virology 289, 362-377·，M.-F· Tsai et al·， 20 Virology (2000), 277, 92-99 and Virology 277 {2000), 川以及藉由總體性分析(从上乃以以以（200句，乂 Virol· 78, 11360-11370·，H，C· Wang et al·，“DNA microarrays of the white spot syndrome virus genome: genes expressed in the gills of infected shrimp，” Marine Biotechnology，竹梓中、 15 1296285 而被探討，迄今，沒有WSSV極早期(IE)基因被鑑定出。 從文獻而注意到的，病毒IE基因的表現會視宿主細胞 機制而定，且不涉及任何病毒的從頭蛋白質合成（A novo protein synthesis)而發生，這表示該等IE基因在決定宿主範 5 圍上是格外重要的（P.D· Friesen (1997)，“心抑/如·⑽< Baculovirus early gene expression^ In: Miller, L.K., (Ed.), The baculoviruses. Plenum Press, New York and London, pp. 141-170)。該等IE基因產物，一旦被表現，在感染期間可以 產生有如調節性反式-作用因子（regulatory trans-acting 10 factors)的功能以及可以用來起始病毒的複製事件。在病毒 的調節事件的級聯中，病毒複製的連續階段要依靠位於前 一個階段内的基因的適當表現。例如，在諸如桿狀病毒 (baculoviruses)和泡療病毒（herpesviruses)大型 DNA病毒所 致的感染期間當中，基因表現被調控而使得極早期（IE或α ) 15 基因首先被轉錄，繼而分別為早期（Ε或/3)與晚期（L或τΟ 基因的表現（G. W. 口99(5J，C;yi(9iec/m(9/(9g;y，2(9, 73-93; G.W· Blissard and G.F· Rohrmann (1990)，Annu· Rev· Entomol·，35，127-155、P.D· Friesen and L.K Miller (1986)， Curr. Top. Microbiol Immunol. 131 f 31-49; R.W. Honess and 20 B. Roizman (1974)，J. Virol·，14, 8-19、。 為了研究病毒IE基因的轉錄，病毒感染是在一種藉由 阻止轉譯而防止從頭蛋白質合成的蛋白質合成抑制劑[通 常是放射菌酮(cycloheximide，CHX)]的存在下被誘發。假使 IE基因的轉譯（而非轉錄)被遏阻，病毒的感染週期同樣會被 16 1296285 阻遏在IE階段。因此，在CHX的恆定存在下，在病毒感染 期間被偵測到的RNA轉錄本的存在是用於鏗定病毒正基因 的良好證據。 在此第一次，儘管缺乏任何被公認的永生不死的蝦細 5胞株以及在活體内使用CHX有困難，申請人成功地使用 CHX作為一抑制劑來阻遏病毒的從頭蛋白質合成。一種總 體性分析微陣列技術與反轉錄酶聚合酶連鎖反應(RT—PCR) 隨後被使用以決定WSSV的轉錄態樣（transcription pattern)，從這所得到的結果，3個—”極早期⑽基因候 10送物被鑑疋出並被命名為、化2和化3。另外，從該wgjsv 基因被選殖(cloned)出的啟動子·調節區域被證實在非天 然的宿主細胞（亦即Sf9昆蟲細胞）内具有啟動子活性，因而 在供重組DNA技術領域的應用上具有極大的潛力。 C發明内容]J 15 發明概要 因此’依據第-個方面，本發明提供一種經分離的 WSSV極早期啟動子·調節區域，它基本上是由一選自於下 列群組中的核苷酸序列所構成： ⑴為序列辨識編號：29的核g酸序列； (11)為⑴的才玄苔酸序列的5、戴短的片段(5，-truncated fragment)，[具有切顺識編號：洲〗，端算起 的至少92個核笞酸殘基； ⑽核酉夂序列，它是由使用-白點症病毒(WSSV)基 因組DNA作為模板以及—具有〆順向引子與一反 17 1296285 向引子的引子組的聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction)而被擴增出，該順向引子基本上是由 一選自於如序列辨識編號：15與序列辨識編號：π 所示的核苷酸序列當中的核苷酸序列所構成，而該 5 反向引子基本上是由一為序列辨識編號：16的核苔 酸序列所構成；

10 15

(iv) —為⑴的核苷酸序列的核酸類似物（nucieic acid analogue)，它與⑴的核苷酸序列具有至少大約6〇% 的序列相同性，並且可以驅動一被可操作地連結 (operatively connected)至該核酸類似物的標的基因 的表現； (v) —為(ii)的5’-截短的片段的核酸類似物，它與⑴)的 5’-截短的片段具有至少大約60%的序列相同性，並 且可以驅動一被可操作地連結至該核酸類似物的 標的基因的表現； (vi) —為⑴的核苷酸序列的變異體(variant)，它含有至 少一個守恒性取代（conservative subs_ti〇n)，並且 可以驅動一被可操作地連結至該變異體的標的基 因的表現；以及 (VII)—為(ii)的5’-截短的片段的變異體，它含有至少一 個寸恆性取代，並且可以驅動一被可操作地連結至 該變異體的標的基因的表現。 上述的WSSV極早期啟動子，節區域可以觸發一異源 t生基口在非天錢彳§主細胞内的表現，而因此可被用來構 18 1296285 築各種不同的重組型表現載體以供用於轉形—廣泛範圍的 伯主細胞。因此’依據第二個方面，样 現載體，它們被構建成包含有 *，錢表 W基□’以及上述的wssv極早期啟動子調節區域被可 操作地連結至該標的基因。 依據第三個方面，本發明提供重組型宿主細胞，它們 是由以上述的重組型表現載體來轉形宿主細胞而被產生。 10 15 可以預期到本發明的實施並不受限於特定的宿主細胞 的使用。事實上，本發明可被應用至各式各樣的原核與真 核宿主細胞’包括細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、植 物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等等，並且可被用來生 產有用的核酶和RNA轉錄物，以及不同類型的蛋白質，包 括：存在於細胞質㈣〇plasm)或近膜間隙(pedpiasmic space) 内的虫白貝、存在於細胞膜(ceu membrane)上的蛋白質或細 胞外的蛋白質，以及可供應用在卫業、農業、食品工業、 兄工業、水產業和畜牧業上的酵素，尤其是醫藥用蛋白 質和胜肽’諸如干擾素、人類和動物激素、免疫性抗原以 及抗體。 依據第四個方面，本發明提供一種用於一 WSSV極早期 20啟動子4周節區域的選殖的引子組，其包含有一順向引子和 一反向引子，該順向引子基本上是由一選自於如序列辨識 編號· 15 (亦即被顯示於實施例中所描述的表2内的引子 126-lk-F)與序列辨識編號：17 (亦即被顯示於實施例中所描 述的表2内的引子i26-2k-F)所示的核苷酸序列的核笞酸序 19 1296285 列所構成，*該反向引子基本上是為相辨識編號： 16 (亦即被顯示於實施例中所描述的表2内的弓丨子126_R)的 核苷酸序列所構成。 圖式簡單說明 5 本發明的其他特徵與優點，在參照下面的較佳實施例 之詳細說明和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，在圖式中： 圖1顯示，於3個以不同劑量的CHX來進行的病毒攻毒 試驗(virus challenge trial)中，在WSSV感染（縱軸)相對於假 感染（mock infection)(橫軸）的條件下，位在微陣列上的532 10個WSSV開放閱讀架構(〇RFs)的被正規化的Cy3螢先強度 (normalized Cy3 florescence)(亦即表現位準）的散佈圖，其 中 A組：12·5 mg/kg CHX處理；B 組：62·5 mg/kg CHX處理； 以及C組：250 mg/kg CHX處理；

圖2顯示3個WSSV IE基因候選物的ORFs (ORF126、 15 ORF242、ORF418)以及WSSV DNA聚合酶基因（如叩⑹(正 對照組）的瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis) RT-PCR結果，其中Μ : 100 bp DNA階梯(Lambda Biotech Inc·，台灣）；徑1 : 250 mg/kg CHX-預處理組的RT-PCR產 物；徑2 :載劑-預處理組（只有20%乙醇）的RT-PCR產物； 20 徑3 : 250 mg/kg CHX-預處理組的PCR產物；以及徑4 :從 WSSV基因組DNA被擴增出的PCR產物[擴增產物(amplicon) 大小參考品]; 圖3顯示在被所出示的質體轉染歷時72 h之後的Sf9昆 蟲細胞内的WSSV IE基因候選物的啟動子活性，其中該等 20 1296285 細胞在亮視野(BF組)與暗視野(EGFP組，用以觀察綠色螢光 的存在/不存在)下被檢視；比例尺=1〇〇 μιη ; 圖4顯示來自於圖3的相同經轉染的sf9昆蟲細胞的經 SDS-PAGE分開的細胞溶胞產物（SDS_pAGE separated cell 5 lysates)的西方墨點分析結果(Western blotting results)，其中 該細胞溶胞產物的經墨點分析的總蛋白質（bl〇tted t〇tal proteins)是使用抗-EGFP或者抗-沒-肌動蛋白（對照組)抗體 來作探測，並且藉由一種ECL化學冷光系統（ECL chemiluminescence system)來作顯像； 10 圖5顯示WSSV化7轉錄本的5,和3,端的圖譜，其中被用 於5’ RACE和 3’ RACE的引子（126SP1、126SP2、126SP3和 128SP1)被劃底線，位在介於轉譯起始點（transiati〇I1 start) 前方的-92和-43 nt之間的陰影區域顯示可能的基本啟動子 要素(如NNPP程式所預測的）；彎曲的箭頭表示轉錄起始位 15 址(transcriptional start sites)，該位址是藉由定序7個隨機選 出的5’ RACE選殖株而被標示出；TATA和聚腺苷酸化訊號 (polyadenylation signal)(AATAAA)被分別地加框以及粗體 字化，以及聚（A)加入位址[p〇ly(A) addition site]是以一箭頭 來作標示； 20 圖6顯示WSSV DNA聚合酶、RIU、RR2以及IE1基因的 5’-未轉譯的區域(5’ UTR)，其中起始開始位址扣⑽“也⑽ start)均位在TATA盒（TATA box)下游的〜26 nt處；該等 TATA盒被陰影標示，以及措由5 ’ RACE而被鑑定出的轉錄 起始位址是以彎曲的箭頭來作標示； 21 1296285 圖7顯示藉由RT-PCR而作的WS S V暫時轉錄分析的 結果，其中使用ki-特異性引子126F/126SP1 (Α組）、如叩Α 特異性引子(B組)與(C) vp2S-特異性引子(C組），而蝦冷-肌 動蛋白-特異性引子（D組）與基因間的（intergenic)引子 5 Ι(^Ρ2/Κ>Ϊ13(Ε組）被分別地用作為内部對照組；徑]v[是一 100 bp DNA階梯（Lambda Biotech Inc·，Taiwan)，以及被標 示在其他徑上方的數字代表以感染後的小時數(hours p0St infection，hpi)來表示的轉染時間；以及 圖8顯示位在2 kbp WSSV化7啟動子/增強子區域内的 10 被預測的調節要素(regulatory motif)的DNA序列結構與位 置。 【實施方式3 較佳實施例之詳細說明 除非另外有所定義，本文中所使用的所有技術性與科 15 學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意 義。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。 本文中所用的“啟動子序列（promoter sequence)”此術 語是指一DNA序列，它通常是位在一DNA聚合體内所存在 的一個基因的上游處，而且它提供一用於起始該基因的轉 20 錄以生成1111^^^的位址。適用於本發明的實施的啟動子序 列可以是衍生自病毒(viruses)、嗟菌體(bacteriophages)、原 核細胞或真核細胞，而且可為一組成性啟動子(constitutive promoter)或是一誘導性啟動子(in(jucible promoter)。 當一個啟動子不是直接緊鄰於（亦即，共價地連接至） 22 1296285 ^系在匕所衍生而出的生物體的天然發生的基因組内所 鄰接的編碼序列時，該啟動子是經分離的。所謂“經分離 的，它是指一種經分離的物質已經與它在其他情況[例 如’活體内(Z>2 V/V0)]下會締合的其他組份（諸如生物組份) 、貝也刀開或疋被純化出，精此，该經分離的物質本身可 以被操作或處理。“經分離的”此術語因此包括：藉由標準 純化方法而被純化出的物質、藉由重組DNA技術而於一宿 主内所製得的物質以及化學合成的物質。因此，可以預期 到，依據本發明的經分離的WSSV極早期啟動子-調節區域 10可以藉由從天然來源來作分離、化學合成以及重組DNA技 術而被獲得。 15 20 轉錄與轉譯的控制序列是DNA調節序列，諸如啟動 子、增強子（enhancer)、聚腺苔酸化訊號（p〇lyadenylati〇n signal)、終止子(terminat〇r)以及類似物，它們提供一編碼序 列在一宿主細胞内的表現。一“順式要素，，是一種核苔酸序 列匕會與可以增量調控(uPre§ula⑹或減量調控（upregulate) 特定基因位點（gene 1〇cus)的表現的蛋白質互相作用。 某些DNA序列，它們通常位在_DNA聚合體内的一個 基因之則，ϋΕ且提供一用於起始該基因的轉錄而成為 mRNA的位址，被稱為“啟動子，，序列。其他的麵或臟 序列^疋但’又有必要位在一結構基因的“上游，，處）會結 合那些決定轉錄和/或轉譯起始的頻度或速率的蛋白質。這 些其他的序列，包拉^ 依弱化子（attenuator)、增強子、操縱基 因（operator)與類似物 被矛冉為调控子(regultor)”序列。因 23 1296285

此，會操縱以決定_基因的轉錄與最後的表現是否要發生 的序列被集合土也稱作為“啟動子/調控子，，DNA序列。X -個DNA‘‘編碼序列，，是—雙股疆序列，當被置於適 當的調節序列的控制下時，它於活體内被轉錄成RNA，而 5该RNA被轉澤成-多肽。該編碼序列的邊界是以一個位在 5’(胺基)端的起始密碼子與一個位在3,(絲)端的終止密碼 子來決定。一個編碼序列可包括，但不限於：原核生物的 序列、來自會感染原核生物或真核生物的病毒的基因組的 序列、來自真核細的cDNA、來自真核生物（例如， 10哺乳動物）的DNA的基因組DNA序列，以及甚至是合成的 DNA序列。——個聚腺苷酸化訊號與轉錄終止序列通常是位 在該編碼序列的下游處。一個“cDna”被定義為複本-DnA (copy DNA)或互補-DNA (complementary DNA)，並且是一 來自一個mRNA轉錄本的反轉錄反應（reverse transcripti〇n 15 reaction)的產物。 一個“訊息序列”亦可被包含在該編碼序列之内，並且 編碼一個位在該多肽的N-端處的訊息胜肽，該訊息胜肽與 宿主細胞溝通並且指引該多肽至適當的細胞位置處。訊息 序列可被發現與原核生物和真核生物所天然擁有的各種不 20 同的蛋白質相締合。 本文中所使用的術語“核酸”以及“核酸序列，，是指一呈 單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列，該 序列包含有天然存在的以及已知的核苷酸或是人造化學仿 效物（aritificial chemical mimics)。本文中所用的“核酸”此術1 24 1296285 語可與術語“基因，，、“cDNA，，、“mRNA，，、“募核苷酸，，和‘‘聚 核苷酸”交換使用。 除非另有指明，一核酸序列除了於本文中所揭示的特 疋序列外’亦涵蓋其互補序列（complementary sequences)， 5 以及它們的守恆性類似物（conservative analogs)、相關的自 然存在的結構變異體和/或合成的非自然存在的類似物。例 如具有簡併性密碼子取代(degenerative codon substitutions) 的同源性序列（homologous sequences)。特別地，組成性取 代可以藉由，例如，位於本文中所揭露的特定序列的一個 10 核甘酸殘基處的一個核苷酸殘基取代而被產生，而不影響 該序列的啟動子活性。 “重組DNA技術”意指用於聯合兩種異源性DNA分子的 技術，通常是來自於不同生物體的DNAs的活體外接合的一 個結果。重組型DNA分子通常是藉由遺傳工程的實驗而被 15 產生。同義的術語包括“基因剪接(gene splicing)”、“分子選 殖(molecular cloning)”和“遺傳工程（genetic engineering)”。 這些操作的產物形成一種“重組體”或“重組型分子”。 用來操作核酸的技術，諸如那些用於產生序列中的突 變（mutation)、次選殖(subcloning)、標示（labelling)、探針檢 20 測(probing)、定序(sequencing)、雜交(hybridization)等等， 在科學刊物和專利文獻中皆有詳細說明。參見，例如：

Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Current Protocols in Molecular Biology, 25 1296285

Ausubel ed., John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I, Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen ed., Elsevier, 5 Ν·Υ· (1993)。 兩個聚核苷酸的序列相同性（sequence identity)可以藉 由熟悉此項技藝的人士已知的數種不同的方法而被決定， 包括，但不限於，Altschul等人的BLAST程式(/. Mo/.价说， 215, 403-410, 1990) 〇 10 為了界定本發明，一個啟動子區域被界定為在它的3, 端處以轉錄起始位址作為邊界，並且往上游(非轉錄股的5, 方向）延伸而包含要起始處在高於背景值的可偵測位準下 的轉錄所需要的最小數目的核苷酸。此外，一啟動子區域 的序列可以往上游（非轉錄股的5,方向）延伸俾而包含所有 15 會定性地或定量地影響該啟動子區域的操作和/或效率的 核苷酸。在該啟動子區域序列之内會發現到有一個轉錄起 始位址’還有負責RNA聚合酶的結合的蛋白質結合領域。 真核生物的啟動子通常，但非總是，含有“TATA”盒與“CAT，， 盒0 本文中所用的術語“被可操作地連結至（〇peratively connected)”是指一個第一序列被配置在充分接近於一個第 二序列，而使得該第一序列可影響該第二序列或處在該第 二序列控制之下的區域。例如，一啟動子序列可被可操作 地連接至一基因序列，且通常是在該基因序列的5，端位 26 1296285 置而使得.亥基因序列的表現是在該啟動子序列的控制之 下此外，一调節序列可被可操作地連接至一啟動子序列， 俾以增強該啟動子序列啟動轉錄的能力。在這種情況下， 該調節序列通常是位在該啟動子序列的5,端處。 5 本文中所用的術語“表現載體，，是指任何一種重組型表 現系統，匕可於活體外（/n 或活體内（ίη νζ·νο)，在任何 種佰主細胞内構成地(c〇nstitutively)或誘導地(inducibly) 表現一被選定的核酸序列。該表現載體可為一呈線性或環 狀形式的表現系統，並且涵蓋維持游離基因（episomal)形式 1〇或是被整合至宿主細胞的基因組内的表現系統。該表現系 統可具有或不具有自我複製的能力，並且它在一宿主細胞 内可能只驅動暫時性表現(transient expression)。 根據本發明’當術語“轉形(transformati〇n)’’是指將一外 源性核酸分子引入至一選定的宿主細胞内時，該術語可與 I5術语‘轉染（transfection)”互換地使用。依據本技藝中已知的 技術，一核酸分子（例如，一重組型DNA建構物或一重組型 載體）可藉由各種不同的技術而被引入至一選定的宿主細 胞内，諸如磷酸鈣或氯化鈣媒介的轉染作用（calcium phosphate- or calcium chloride-mediated transfection) > 電穿 20 孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)、粒子揞擊 法（particle bombardment)、脂質體媒介的轉染作用 (liposome-mediated transfection)、使用嗟菌體的轉染作用、 利用反轉錄病毒（retrovirus)或其他病毒[諸如牛痘病毒 (vaccinia virus)或昆蟲細胞的桿狀病毒(baculovirus)]的轉導 27 1296285 作用（transduction)、原生質體融合法(protoplast fusion)、農 桿菌媒介的轉形法(Agrafeacia/wm-mediated transformation) 或其他方法。 本文中所用的術語“細胞’’、“宿主細胞’’、“轉形宿主細 5 胞（transformed host cell)”與“重組型宿主細胞（recombinant host cell)”可被互換地使用，而且不僅指特定的個體細胞 (individual cells)，還包括繼代培養的子代（sub-cultured offsprings)或其可能的子代(potential offsprings)。在後續世 代中所形成的繼代培養的子代可能因為突變作用或環境影 10 響而發生特定的遺傳修飾（genetic modification)，因此，該 繼代培養的子代可能事實上不完全相同於衍生出該繼代培 養的子代的母細胞。然而，繼代培養的細胞仍然落在本文 中所用的術語的涵蓋範疇内。 本文中所用的術語“多肽”、“胜肽”和“蛋白質”可被互換 15 地使用，並1是指一種由胺基酸殘基所構成的聚合物，其 中一或多個胺基酸殘基是天然存在的胺基酸或人造化學仿 效物。 在申請人較早的研究中，一種WSSV的病毒分離株，亦 即草蝦1994 台灣分離株(WSSV 20 T-1)，它是分離自草蝦（Pen似w m⑽，已根據布達佩 斯條約（Budapest Treaty)而於1996年1月11日被寄存於中國 典型培養物保藏中心（the China Center for Type Culture Collection (CCTCC)，武漢大學，珞珈山，武漢，湖北， 430072，中華人民共和國），並且被給予寄存編號 28 1296285 CCTCC-V96001 (參見授予郭光雄等人的仍5,824,53^us 6，190,862 以及 L.-L· C7z⑼ 从（2002)，3〇人 D6-W7)。這個台灣分離株的完整基因組隨後被定序，並且 經由直接提送而以登錄編號AF440570被登錄於NCBI資料 5 庫中。 就申請人所知，迄今沒有任何一篇報導有鑑定出WSSV 極早期（IE)基因。於本發明中，申請人使用放射菌酮(CHX) 作為一種抑制劑來阻遏WSSV-感染的蝦體内的病毒從頭蛋 齡白質合成，繼而藉由根據使用衍生自WSSVT-1的532 0RFS 10的特異性引子（參見描述於下面的實施例中的表1}而得的 WSSV PCR產物所設計的WSSv DNA (0RF/基因)微陣列來 檢查病毒極早期基因的RNA轉錄本。可能為WSSV極早期基 因候選物的3種〇RFs，亦即ORF126、ORF242和ORF418， 被成功地4監定出。一個有關3種至今為止有被報導的WSSV 15分離株的基因組序列比對顯示：在這3個已知的WSSV分離 株中’這3個〇RFs沒有一個有發生過刪除。ORF126、〇RF242 ® 與〇1^418因此被分別地命名為WSSV Μ (極早期基因 、ie2與ie3 〇 個短暫報導基因分析（transient reporter assay)隨後被 20執行，以探究這3種WSSVIE基因候選物的啟動子區域於一 非天然的宿主細胞(例如Sf9昆蟲細胞）内觸發一個異源性基 因[例如’增強的綠色螢光蛋白質（EGFP)基因]的表現的可 此性’該基因於該分析中亦當作一個報導基因。被用於構 ‘短暫表現載體(transient expression vectors)的引子被列在 29 1296285 描述於貫施例中的表2。出人意料地，依據本發明而被選殖 出的WSSV W的1 kbp和2kbp啟動子區域在WSSV的非天然 宿主細胞内是有功能的，這暗示該WSSV id的啟動子區域 在供應用於構築用來轉形一廣泛範圍的宿主細胞的各種不 5同的重組型表現載體上具有極大的潛能。 WSSV化/被進一步進行使用描述於實施例中的表3内 所列的引子的5，/3，RACE分析。所獲得的結果顯示：相對於 ATG轉譯起點的-52 nt G代表WSSV化7的主要轉錄起始 點。另外，一個推定的TATA盒(TATAA)被發現位於轉錄起 10始位址的上游(-26 nt)(亦即位在相對於ATG轉譯起點的_82 nt至-78 nt處)。該tata要素(TATA motif)與轉錄起始子一 起被認為是RNA聚合酶II啟動子的基本要素。WSSv w推 定的轉錄起始位址的上游序列的NNPP [有關於啟動子預測 的中樞網路(Neural Network for promoter prediction)]分析 15鑑定出一個高可能性的被預測的基本啟動子區域是位在推 疋的轉澤起始密碼子前方的-92 nt和-43 nt之間。此外，由 啟動子活性分析所得到的實驗結果暗示wssv 的轉錄不 受限於它的天然宿主的RNA聚合酶II。 另外，依據核苷酸序列分析，該WSSVid的5, UTR(未 20轉譯的區域)被發現包含有數個序列是符合於GATA要素 (A/T)GATA(G/A)的共有序列（consensus seqUences)。這可能 是重要的，因為該G A T A要素被確認是轉錄因子的一個結合 位址，例如在桿狀病毒0pMNPV IE基因，卯64,的啟動子 內（Ρ·Η· Kogan and G.W. Blissard (1994)，j· virol·，68 30 1296285 S73-S22)。亦存在數個其他可能的調節要素，包含：2個直 接重複序歹U (CACACACA與CTCTCTCTCT)、2#1短序歹ij白勺 重複(TTTCTGG與CCAGAAA)、桿狀病毒早期基因啟動子 要素（上游調節要素）(CGTGC)(/?.Z>. and B.c. 5 jBcmmTig (2003J，/· S岑（Pi 7人 7S27-7842)、桿狀 病毒晚期啟動子起始子（TTAAG)(L.A. Gwar/⑽and M.叱

Smith (1990)，Virology，179，1-8\ T.D. Morris and L.K·

Mi…r (7994)，7祁，以7」53)，以及一個可產生有如一 轉錄增強子的功能的迴文序列（palindromic seqnence)(C. Γ. 10 McMurray et al. (1991)，Proc· Natl· Acad· Sci· USA·，88, 666-670·，C· Rasmussen et al. (1996)，Virology，224, 235-245) 〇 除了上述以外，被選殖的3’ RACE產物的序列分析顯示 聚(A)被加入在一個位於AATAAA聚腺苷酸化訊號的下游 15 的17 nt位址處（參見圖5)。

GenBank/EMBL、SWISSPROT和 PIR 資料庫的 BLAST 分析預測該WSSV id編碼區域含有Cys2/His2-型鋅指要素 (Cys2/His2-type zinc finger motif)。這個要素在DNA結合上 具有一角色，而它的存在暗示該WSSV 可能產生有如一 20 轉錄因子的功能。 WSSV W的被選殖出的2 kbp啟動子區域[它是藉由使 用引子126-2k-F (序列辨識編號：17)和引子126-R (序列辨 識編號：16)的PCR而被擴增出]的核苷酸序列被顯示於序列 辨識編號：29中。該WSSV 編碼區域的核苷酸序列以及 31 1296285 一為其所編碼的推定的胺基酸序列被分別地顯示於序列辨 識編號：30和序列辨識編號：31中。 根據以上所述，本發明提供一種經分離的Wssv極早期 啟動子-調節區域，它基本上是由一選自於下列群組中的核 5 苷酸序列所構成： ⑴一為序列辨識編號：29的核苷酸序列； (ii) 一為⑴的核苷酸序列的5、截短的片段(5，七uncated fragment) ’它具有由序列辨識編號：29的3,端算起 # 的至少92個核苷酸殘基； 10 (丨丨丨）一核酸序列，它是由使用一白點症病毒(WSSV)基 因組DNA作為模板以及一具有一順向引子與一反 向引子的引子組的聚合酶連鎖反應（P〇lymeraSe chain reaction)而被擴增出，該順向引子基本上是由 一選自於如序列辨識編號：15與序列辨識編號：π 15 所示的核笞酸序列當中的核苷酸序列所構成，而該 反向引子基本上是由一為序列辨識編號·· 16的核苷 • 酸序列所構成； (iv) —為⑴的核苔酸序列的核酸類似物（nucleic acid analogue)，它與⑴的核苷酸序列具有至少大約60% 20 的序列相同性，並且可以驅動一被可操作地連結 (operatively connected)至該核酸類似物的標的基因 的表現； (v) —為（ii)的5’-截短的片段的核酸類似物，它與出)的 5’-截短的片段具有至少大約60%的序列相同性，並 32 I296285 且可以驅動一被可操作地連結至該核酸類似物的 標的基因的表現； (vi) —為⑴的核苷酸序列的變異體(variant)，它含有至 少一個守恆性取代(conservative substitution)，並且 可以驅動一可被操作地連結至該變異體的標的基 因的表現；以及 (vii) —為⑻的5’-截短的片段的變異體，它含有至少_ 個守恆性取代，並且可以驅動一被可操作地連結至 該變異體的標的基因的表現。 10 15 20 依據本發明，當該經分離的WSSV極早期啟動子-調節 區域基本上是由⑴的核苷酸序列的一個5，_截短的片段所構 成時’它較佳地具有由序列辨識編號·· 29的3，端算起的至 少160個核苷酸殘基。更佳地，該⑴的核苷酸序列的5,〜截短 的片段具有由序列辨識編號：29的3’端算起的至少25〇個桉 4酸殘基。更佳地，該_核㈣序列的5，截短的片段^ 有由，列辨識編號：29的3,端算起的至少5_核誓酸^ 基。取佳地，該⑴的核答酸序列的截短的片段具有二 列辨硪編號：29的3’端算起的至少1_個核^:酸殘基。 依據本發明，該經分離的極早期啟動 擴增反應而被;ΓΓ子和一反向引子的引子組的。cr 列辨識編號：恤序=向引子基本上是由—選自於如序 辨識職：17所示的核t 汁幻所構成，而該反向引子基本上是由_為序 33 1296285 列辨識編號：16的核苷酸序列所構成。在本發明的一個較 佳具體例中，該DNA模板是萃取自台灣分離株WSSVT-1， 該分離株的樣品以寄存編號CCTCC-V96001被寄存於中國 典型培養物保藏中心。 5 依據本發明，該經分離的WSSV極早期啟動子^周節區 域也可以包括序列辨識編號：29的核苷酸序列的守恆性變 異體（conservative variants)以及合成的類似物（synthetic analogues)[諸如序列的刪除(deieti〇n)、插入(inserti〇n)、反 置(inverison)、取代（substitution)或加入(addition)]，但有條 10件是該等變異體和類似物可以同樣地觸發位在它的下游處 並且被可操作地連結的序列的轉錄。 在各種不同的具體例中，該等變異體與類似物可與被 使用前文中的該術語是實質同源的，或是當使用前文中所 載述的演算法來測定時，有大於60%、7〇%至1〇〇%、至少 15 80%、至少9〇%或至少95%的相同性。 依據本發明，該經分離的WSSV極早期啟動子_調節區 域可以被攜帶於一個表現匣内。如本文中所用的，術語‘‘表 見匣疋‘一個被合成地或重組地產生的核酸建構物，它攜 系列的核酸要素以允許一個特定的核酸在一標的細胞 〇内的轉錄與轉譯。各種不同的策略可以供應用於組合或接 合DNA的片段，並且依照該等£^八片段的終端的本質而 定，一合適的策略對於熟悉此項技藝人士而言會是立即就 明白的。 上述的WSSV極早期啟動子_調節區域能夠驅動一異源 34 1296285 (translation termination site)、一 插入選殖位置（insertion cloning location)、一增強子序列(enhancer sequence)、一個 聚腺苷酸化位址(polyadenylation site)、一調節序列等等。 另外，本發明的載體可以包含有一有關於一或多個限制内 5 切酶辨識位址（restriction endonuclease recognition sites)的 核苷酸序列。這些序列是熟習此項技術人士所熟知的。 適用於本發明的標記基因包括，例如，用於真核細胞 培養物的二氫葉酸還原酶基因以及G418或新黴素 (neomycin)抗性基因，用於昆蟲細胞培養物的Zeocin抗性基 10 因，以及用於大腸桿菌與其他細菌培養物的胺苄青黴素 (ampicilin)、鏈黴素（streptomycine)、四環素（tetracycline) 或康那黴素(kanamycine)抗性基因。 在本發明的一個較佳具體例中，該重組型表現載體進 一步包含有一個第二標的基因坐落在另一個啟動子序列的 15 下游且被可操作地連結至該另一個啟動子序列，該另一個 啟動子序列可以是或者不是一個本文中所揭露的wssv極 早期啟動子-調節區域。 依據本發明，該第一和第二標的基因獨立地編碼一個 選自於下列所構成的群組中的基因產物：酵素、治療性多 20 肽、抗原決定位和抗體。 在本發明的一個較佳具體例中，該重組型表現載體是 pIZME/WSSV126-2k/V5-EGFP-His。 在本發明的另一個較佳具體例中，該重組型表現載體 是pIZAIE/WSSV126-lk/V5-EGFP-His。 36 1296285 、 、的重"且型表現載體可以被用來轉形或轉染一被欲 ，勺侣主田胞。因此，本發明提供重組型宿主細胞，它們 、t的重組型表現載體來轉形宿主細胞而被產生的。 可以預期到本發明的實施並不受限於使用特定的宿主 5細胞。事貫上，本發明可以被應用至各式各樣的原核與真 核招主細胞’包括：細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、 植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等等，並且可以被用 來生產有用的核酶和RNA轉錄物，以及不同種類的蛋白 貝匕括存在於細胞質或近膜間隙(periplasmic space)内 10的蛋白、存在於細胞膜上的蛋白質或細胞外的蛋白質，以 及可以供應用於工業、農業、食品工業、環境工業、水產 業和畜牧業的酵素，尤其是醫藥用蛋白質和胜肽，諸如干 擾素、人類和動物激素、免疫性抗原和抗體。 可被使用於本發明的宿主細胞可以是原核或真核生物 15細胞’且可以是未經轉形/轉染的細胞，或是已被至少一種 非本文中所揭露的特定核酸序列的其他的重組型核酸序列 轉形/轉染的細胞。 適用於本發明的原核生物細胞包括，但不限於：彳 自下列的細胞：細菌，例如大腸桿菌（五· 、枯草椁菌 20 (万沉⑹似⑽办⑹以）、乳桿菌屬物種5*ρ·)、鍵徵 菌屬物種（Streptomy 577·)以及沙門氏傷寒桿菌 (Salmonella typhi);轰綠豫（Cyanobacteria) ·，故电儀 (Aci/nomyceia)等等。 適用於本發明的真核細胞包含，例如：真菌細胞、原 37 1296285 生動物(protozoa)細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞以 及人類細胞。合適的真菌細胞實例是酵母菌細胞，諸如麵 包酵母菌απνζϋ幻或嗜甲醇酵母菌 (Ρί(：/Η·α 的細胞。合適的植物細胞是那些衍生自裸 5 子植物(gynosperms)或被子植物（angiosperms)的，以單子葉 植物（monocots)與雙子葉植物（dicots)為佳，特別是作物 (crops)，而且是衍生自這些植物的根、莖、葉或分生組織 (medstem)，並以原生質體(pr〇t〇plasts)或癒合組織(callus) 丨 的形式被培養。合適的昆蟲細胞的實例是果繩S2細胞以及 10衍生自秋行軍蟲也)的Sf21細胞與Sf9細 胞。合適的動物細胞可以是培養的細胞或活體内細胞，較 佳是衍生自脊椎動物，更佳為衍生自哺乳動物，並且是衍 生自這些動物的器官或組織，諸如腎臟、肝臟、肺臟、卵 巢、乳房、皮膚、骨絡、血液。動物細胞的代表例包括： 15 CHO、COS、BHK、HEK_293、HeLa、NIH3T3、VERO、 MDCK、MOLT-4、Jurkat、K562、HepG2等等。 _ 在本發明的一個較佳具體例中，該重組型宿主細胞是

Sf9昆蟲細胞。 適用於進行DNA重組技術的宿主細胞的適當培養基以 20及培養條件是生物技術領域中已詳知的。例如，可將宿主 細胞培養在一發酵生物反應器、一搖動燒瓶、一試管、一 微滴定盤或—培養孤中，並且該等宿主細胞的培育可在適 合於該等細胞生長的條件（包括培養溫度、培養基的pH值， 以及培養物的溶氧濃度）下來進行。 38 1296285 最後，本發明提供一用於選殖一WSSV極早期啟動子— 調節區域的引子組，其包含有一順向引子與一反向引子， 該順向引子基本上是由一選自於如序列辨識編號：15與序 列辨識編號：17所示的核苷酸序列當中的核苷酸序列所構 5成，而該反向引子基本上是由一為序列辨識編號：16的核 苷酸序列所構成。 邊引子組可被用來選殖演化上同源於本文中所揭露的 特定序列的WSSV極早期啟動子-調節區域。 可預期到本文中所揭露的所有的材料與方法學均可用 10 來實施本發明。 本發明將就下面實施例來作進一步說明。一個具有本 技蟄中的通常知識的人士會熟悉於許多容許這些實施例以 及在本案揭露内容中所注意到的實施例（它們也應用本發 明的基本的、新穎的或有利的特徵）的修飾的技術和教示。 15因此，本發明的範疇並不受此處或其他地方所列的特定實 施例所限制。 實施例 I·材料與方法 病毒的基因微陣列—晶片的製備 20 草蝦WssV 1994台灣分離株(WSSV Τ_υ(它的基因組 以登錄編號AF4405 70被登錄於NCBI資料庫中）被使用於以 下面所描述的所有實驗中。這個WSSVT〜1分離株已根據布 達佩斯條約而於1996年1月11日被寄存於中國典型培養物 保藏中、（CCTCC，武漢大學，珞珈山，武漢，湖北，430〇72， 39 1296285 中華人民共和國），並且被給予寄存編號CCTCC-V96001 (參見授予郭光雄等人的1^ 5,824,535與1；5 6，190,862)。 WSSV病毒基因微陣列（晶片）是根據WSSV T-1分離株 的基因組而被設計的。簡要而言，各個晶片含有532個預測 5的WSSV ORFs以及草蝦/5-肌動蛋白基因的一個部分序 列。在進行使用衍生自這532個ORFs的特異性引子的聚合 酶連鎖反應(PCR)之後，對於各個WSSVORFs而言具有200 至600 bp的擴增產物大小的PCR產物以三重複方式被打點 在預塗覆的玻璃載玻片（U-Vision Biotech Inc·，臺灣）上， 10 而有關蝦（草蝦肌動蛋白基因也是作3個複製。蝦/5-肌 動蛋白基因當作一正對照組，且被用來正規化載玻片之間 的數據。 製備病毒微陣列的細節被描述於各種不同的文獻中， 參見’例如H.-C. Wang，et al· “DNA microarrays of the white 15 spot syndrome virus genome: genes expressed in the gills of infected shrimp，” Marine Biotechnology，付梓中。 病毒基因微陣列-標的的製備 有關於病毒接種物的製備以及病毒攻毒試驗(viral challegene trial)的插作程序被描述於从乃仍· α/. (*/999)， 20 Dis· Aquat. Org·，38 (2)，107-114 中。 用來進行CHX (Sigma)處理與病毒攻毒試驗的養殖的 無WSSV蝦（草蝦）是由行政院農業委員會水產試驗所的東 港水產貫驗中心（Tung-Kang Marine Laboratory，Taiwan Fisheries Research Institute)慷慨提供。在實驗期間當中，在 40 1296285 25C的環溫下，具一體重為3545公克的蝦被養殖於8個含 有無菌的33 ppt (千分之一）海水的1000公升的FRP (纖維強 化塑膠)槽中。 WSSV接種物是製備自經實驗感染的蝦（草蝦）的集合 5的組織。為了鑑定WSSVIE基因，在病毒攻毒試驗之前2小 時’ WSSVT-1感染的蝦藉由肌肉内注射被處理以不同劑量 的CHX (12.5 mg/kg、62.5 mg/kg與250 mg/kg體重，製備於 2〇%乙醇中）。對照組蝦只被注射以2〇%乙醇。 於病毒攻毒試驗中，經CHX與20%乙醇預處理的蝦分 10別地以一個〇·9% NaCl溶液予以假感染（m0Ck-infected)或藉 由肌肉内注射被感染以一劑量為5〇 pL/10 g體重的WSSV接 種物（製備於0.9% NaCl溶液中）。由於鰓組織是WSSV感染 的一個主要標的（C.-F· Lo, ef αί· (J996)，Dis. AquaL Org·， 27, 215-225·，md H，C. Liu，et al· (1997)，Dis, Aquat· Org·， 15 53-72)，在感染8小時之後(hpi)，經假感染與WSSV-感染 的瑕的鰓組織被收集並被立即地冷凍在液態氮内直到RNA 萃取之時。 依據製造商的操作程序，使用一Rneasykit(Qiagen)而 從所收集的蝦鰓組織來收穫總RNA (total RNA)。為了製造 20 cDNA標的物，依據製造商的操作指南，使用一個CyScribe First cDNA Labeling kit (Amersham Bioscience)而將 RNA樣 品（2〇 kg)螢光標示以Cy3dUTP。之後，使用Microcon YM-30管柱(Amicon)來移除未被併入的游離核苷酸。由此 而得到的Cy3 -標示的cDNA被濃縮，並在隨後的實驗中被用 41 1296285 作為微陣列標的物。 病毒基因m車列-探針I標的物的雜交、掃描與統計學分析 上面所製備的Cy3-標示的cDNA標的物被引至與位在 WSSV微陣列内的所有1：^八點進行雜交反應，繼而使用一 5 個共軛聚焦雷射掃描儀(confocal laser scanner，GeneTAC™ LS IV Microarray Sc麵er，Genomic Solutions)來掃描微陣 列。被掃描的螢光強度是藉由GenePix 3·〇 (Axon Instruments)來定量。 有關那些被結合至微陣列探針的轉錄本，它們被偵測 10到的成號強度疋精由扣除背景訊號位準(background signal levels)而被轉變成為大概的絕對表現量的測量值。正對照組 (草嘏石-肌動蛋白基因）的訊號位準被用來正規化不同陣列 之間的病毒基因表現結果。WSSV的基因表現是藉由以經 CHX-預處理的WSSV-感染的晶片上的被正規化的基因表 I5 現位準相對於經假感染的晶片内的對應基因的正規化比率 (normalized ratios)來繪圖而被決定。 藉由CHX-不敏感的基因的RT-PCR分析來確認微陣列結果 關於處在CHX處理的最高位準(250 mg/kg體重）下的微 陣列結果，那些在WSSV-感染的樣品内的強度的中間位準 20 要比在假感染的樣品内所具者至少高1.5倍的ORFs被進行 反轉錄酶-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)。 於RT-PCR分析中，模板是製備自原始批次的總RNA (亦即來自經250 mg/kg CHX-預處理的WSSV-感染的蝦）的 樣品，以及一另外批次的RNA (萃取自以20%乙醇預處理的 42 1296285 WSSV-攻毒的蝦)。該等RNA樣品（20 pg)於37°C下被處理以 不含核糖核酸酶(Rnase)的去氧核糖核酸酶I (DNase I， Roche)歷時1小時以便除去位於所製備的總RNA樣品内的 任何病毒基因組DNA污染物。一分裝部分的總RNA (〜10 pg) 5 藉由使用配於一為20 μί的反應混合物内的Superscript II反 轉錄酶（Invitrogen)與募（dT)引子而被用來合成第一股 cDNA。在RT反應之後，一分裝部分(2 pL)的反應產物(含有 大約1 pg的cDN A)以對應於那些被表現於CHX-預處理的被 感染的蝦内的WSSV基因（亦即，被顯示於微陣列分析結果 10中的該等IE基因候選物）的特異性引子組來進行pCR。作為 CHX處理組的一個正對照組，亦以一基因_特異性引子組 dnapolF/dnapolR (表1)來進行PCR，該引子組是根據一先前 報導的WSSV遲發早期基因，亦即办叩W，而被設計出（乙丄

Chen et al· (2002)，Virology，301，136-147)。 15

43 1296285 表1.被使用於藉由微陣列與CHX處理來篩選wssv IE基因的引子 ORF/基因 引子序列（5’- 3’） WSSV T-1 基 因組序列座標 擴增產物 大小（bp) ORF126"W 126F: gactctacaaatctctttgcca (序列辨識 編號：1) 126SP1: ctacctttgcaccaattgctag (序列辨 識編號：2) 65729—65750 66209—66230 502 bp ORF242/^2 242F1: ataccaacaaccccagaa (序列辨識編 號：3) 242R1: atggggcgggatacaaaa (序列辨識 編號：4) 131117—131134 131332—131349 233 bp 0RF418/^3 418F1: gctggaggaggcttgttgat (序列辨識 編號：5) 418R1: gggccagaaatgccttacag (序列辨識 編號：6) 242832—242851 243081—243100 269 bp DNA pol dnapolF: tgggaagaaagatgcgagag (序歹】J 辨 識編號：7) dnapolR: ccctccgaacaacatctcag (序歹辨 識編號：8) 26292-^26311 26858 — 26877 586 bp VP28 vp28F: ctgctgtgattgctgtattt (序列辨識編 號：9) vp28R: cagtgccagagtaggtgac (序列辨識 編號：10) 278914—278933 279450 — 279468 555 bp 基因間的 IC-F2: cagactattaatgtacaagtgcg (序列辨 識編號：11) IC-R3: gaatgattgttgctggttagaacc (序歹辨 識編號：12) 126597-^126619 125494—125517 1126 bp 蝦/3 -肌動蛋白 肌動蛋白 FI: gaygayatggagaagatctgg (序 列辨識編號：13) 肌動蛋白 Rl: ccrgggtacatggtggtrcc (序 列辨識編號：14) — 686 bp

作為一用以檢查WSSV基因組DNA污染物的品質管 制，亦以未進行反轉錄作用的CHX-預處理的WSSV-感染的 RNA樣品來進行PCR。擴增自WSSV基因組DNA的PCR產物 5用來作為一PCR正對照組，並且也被用來作為一相關的大 小標記。 啟動子活性分析 對於以RT-PCR而被確認的各個WSSV IE基因候選物， 一個短暫報導基因分析(transient reporter assay)被執行。關 44 1296285 於這俩分析，Sf9昆蟲細胞(Invitrogen)被數個裡面各別地攜 帶有一個EGFP報導基因的啟動子分析質體所轉染。 作為這個分析的一個起始點，一質體pIZAIE/V5-His是 從一商業上可取得的質體pIZ/V5-His(Invitrogen)，藉由刪除 5 坐落在多重選殖位址(MCS)之前的0pIE2 (OpMNPV化2)啟 動子改質而得。隨後，一EGFP基因（BD Biosciences)被插入 至pIZAIE/V5-His的MCS内以便生成一個第一衍生質體 pIZAIE/V5-EGFP-His。 之後，藉由使用在它們的5,端處含有適當的限制内切 10 酶辨識位址的引子（參見表2)的PCR，而從WSSV基因組 DNA擴增出各個WSSV IE基因候選物的5’未轉譯區域（5, UTRs)的部分（〜1 kbp)。使用GFX PCR產物純化套組(Roche) 來純化所形成的各個PCR產物，以限制内切酶予以消化， 並接而予以插入至pIZAIE/V5-EGFP-His MCS内的EGFP基 15因之前。所形成的質體被命名為 pIZAIE/WSSVx/V5-EGFP-His，其中 “X” 代表一個藉由 RT-PCR分析而被選出的0RF。 一個藉由將EGFP基因選殖至質體PIZ/V5-His内而被建 構出的質、體pIZ/V5-EGFP-His用來作為正對照組質體，而一 2〇 對應的AIE質體，亦即pIZME/V5-EGFP-His用來作為一負對 照組。另一個負對照組質體是藉由將EGFP基因與WSSV 啟動子區域至插入質體pIZAIE/V5-EGFP-His内來生 成pIZME/WSSVdnapol/V5-EGFP-His而被建構出。對於一 個提供正訊號(positive signal)的啟動子序列候選物，它的反 45 1296285 向序列被用來構築一個被命名為 pIZME/WSSVxrev/V5-EGFP-His 的額外對照組質體。 最後，除了這些1 kbp的順向與反向質體之外，各卷 可虽有 一質體表現一高位準的EGFP時，它的啟動子藉由構築—個 5 由一段2 kbp順向片段所驅動的EGFP-報導基因質體而被進 一步分析。所有這些選殖株的正確性係透過DNA定序予以 確認。該等用於這些質體的構築之引子被列示於表2中。

表2·被用來構築用於啟動子活性分析的短暫表現載體的引子

質體 引子序列（5’- 3’)/限制酶* 擴 大小（bp、 ρΙΖΔΙΕ/WSS V126-1 k/V5-EGFP-His F: cg£^Mi£gagatcctagaaagaggagtg (序列辨 識編號·· 15)/EcoRl R: ccg£i££^£cttgagtggagagagagagc (序列辨 識編號： 997 pIZAIE/WSSV126-2k/V5^EGFP-His F: cggMli£gatgatggtgatgtttctagg (序列辨識 編號·· 17)/EcoRl R: ccg£l£^£cugagtggagagagagagc (序列辨 識編號：16)/XhoI 2063 pIZAIE/WSSV126rev/V5-EGFP-His F: cgg^£cttgagtggagagagagagc (序列辨 識編號：18)/£coRl R: ccgctceaegacatcctaeaaaeaeeagtg (^ ^»| 辨識編號：19)/X/ioI 997 pIZAIE/WSSV242/V5>EGFP-His F: eeeetaccetcttcaacatcttcttgttcg 識編號：20)ΑίΓρηΙ R: ataagaatgcsecceccatsaaeatctctgegaaatg (序列辨識編號：21)/Λ^ίΙ 987 pIZAIE/WSSV418/V5-HGFP-His F: cseaattcetcecacatetgtctaaacttc 識編號：22)/£cMI R: ccectceaecaacaaecctcctccaecc 識編號：23) /X/^I 841 pIZAIE/WSSVdnapol/V5-EGFP-His F: tagaectcacttctccteacactcttsactsat H 辨識編號·· 24)/Sacl R: gtggaagagggtgatggagctggagatgatcatc (序 列辨識編號：25) 571 :該等引子的限制酶切割位址被劃底線。 10 為了進行DNA轉染，Sf9昆蟲細胞被播種於一個24井培 養盤(3xl05細胞/井）内，並且於27°C下在Sf-900 II SFM無 46 1296285 血清的培養基(Invitrogen)内生長過夜。質體DNA以TE緩衝 液(pH 8.0)予以稀釋至1 pg/pL，以及sf9細胞的脂質體媒介 的轉染（1 gg的質體DNA/井)是依據製造商的操作指南使用

Cellfectin Reagent (Invitrogen)來進行。在轉染 72 小時之 5後，在一 Olympus 1X71倒立營光顯微鏡（inverted fluorescence microscope)下觀察EGFP螢光訊號，並且使用 一 Olympus DP50 數位顯微鏡照相機（digital microscope camera)來作拍照紀錄。在那個時候，收穫並且溶解細胞。 Φ 從各井而因此得到的細胞溶胞產物被調整成一等量的 10 總蛋白’並藉由西方墨點分析法(Western blotting)來分析 EGFP。關於西方墨點分析法，各個細胞溶胞產物的總蛋白 在15% SDS-PAGE上被分開，轉移至一PVDF膜（Osmonics) 上’並使用抗-EGFP單株抗體（B-2, Santa Cruz Biotechnology)或抗-人類/3 -肌動蛋白多株抗體（η>496, 15 Santa Cruz Biotechnology)來作探針檢測。墨點（blots)是使用 一增強的化學冷光(enhanced chemiluminescent-light，ECL) _ 偵測套組(detection kit)(NEN Life Sciences)而被顯像，其中 被結合以辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)的山羊抗-小鼠IgG或山羊抗-兔IgG被用來當作一種二級抗體 20 (secondary antibody) 〇 製作極早期基因轉錄本的5’與3’端點的圖譜 極早期基因轉錄本的5’和3’區域是藉由cDNA 5，/3,端 的快速擴增（rapid amplification)而被獲得(M.A. Fro/憤⑽d al·，（1988)，Proc· Natl· Acad· Sci· USA· 85, 8998-9002)，這便 47 1296285 用到一種商業的5，/3, RACE套組(Roche)，該套組具有一禽 骨髓胚細胞過多病毒(avian myeloblatosis virus，AMV)反轉 錄酶(Roche，被包含於該套組中）。在這個研究中被用於5，/3, RACE分析的RNA樣品是從被WSSV感染24 h後的蝦體予以 5 分離出，並接而以不含RNase的DNase I (Roche)予以處理。 被用於cDNA 5’/3’端的快速擴增的適當基因-特異性引子被 列示於表3中。最終的擴增產物被選殖至pGEM-T Easy載體 (Promega)内並被定序。插入物的序列與WSSV基因組DNA 的序列進行比較。 10 表3·用於ORF126 5’ RACE與3’ RACE的特異性引子 _ 引子序列（5’-3’)_ 用法

126SP1: ctacctugcaccaattgctag (序列辨識編號：2) 5, RACE

126SP2: gtacagtactgtccatgtcgat (序列辨識編號：26) 5, RACE

126SP3: cctcttcatcacctcaatacc (序列辨識編號：27) 5, RACE

128SP1: gagactgatcgacatggacagtac (序列辨識編號:28) 35 RACE 藉由RT-PCR的WSSV極早期基因轉錄本的暫時性分析 WSSV-攻毒的蝦(草蝦)在〇 hpi(也就是在感染之前的時 刻）以及在2、4、6、8、12、18、24、36、48、60與72 hpi 被採樣。總RNA是從在各個時間點所收穫的蝦的腹足被萃 15取出，以TRIzol Reagent (Invitrogen)予以純化，並接而以不 含RNase的DNase I (Roche)來處理以便移除任何殘留的 DNA。第一股cDNA的合成是使用募(dT)引子來執行，並且 2 μί (〜1 gg)的cDNA於一含有一適當引子組（參見表^的 50-μί反應混合物内進行PCR。為作比較，WSSV心與 2〇叩2(§基因的片段亦分別地以引子組dnapolF/dnapolR與 vp28F/vp28R而自相同的模板被擴增出。一個蝦万_肌動蛋 48 1296285 白引子組，肌動蛋白F1/肌動蛋sR1，被用來作為RNA品質 與擴增效率的一個内部對照組。為了確認在該等RNA樣品 内不存在有WSSVDNA污染物，一WSSV基因組DNA-特異 性引子組，IC-F2/IC-R3 (它們是係衍生自WSSV基因組的一 5個基因間的區域），亦被用來作為一個品質對照組。該等被 用來擴增標的ORF/基因序列的引子組被列示於表1中。 極早期基因啟動子與編碼區域的分析 根據WSSV T-1的基因組(NCBI登錄編號·· AF440570)， 該等ORFs以及該等ORFs的上游區域的核苷酸序列是使用 10 電腦程式NNPP (Reese，M.G·, EecKman，F.H·，1995· New neural network algorithms for improved eukaryotic promotor site recognition. In: The seventh international genome sequencing and analysis conference. Hilton Head Island, S. C.; M.G. Reese, et al. (1996), Large scale sequencing 15 specific neural networks for promotor and splice site recognition. In: Hunter, L., Klein. T.E. (Eds.), Biocomputing: Proceedings of the 1996 Pacific symposium. World Scientific Publishing，Singapore)以及GenBank/EMBL、SWISSPROT、 PIR和EMBOSS資料庫而被分析的。 20 Π ·結果 使用微陣列與CHX處理以篩選WSSVIE基因 當WSSV DNA (ORF/基因）微陣列被用來檢查病毒基因 表現時，於WSSV-感染的蝦體内存在的蛋白合成抑制劑 CHX被預期會導致病毒極早期基因的RNA轉錄本的特定蓄 49 1296285 積。這是因為，雖然所有其他病毒基因的轉錄會需要病毒 蛋白作為轉錄因子，該等蛋白的合成由於CHX的存在而已 受到抑制。

圖1顯示，於3個以不同劑量的CHX (12.5 rng/kg、62.5 mg/kg與250 mg/kg)來進行的病毒攻毒試驗中，在^^^感 染相對於假感染（mock infection)的條件下，位在微陣列上 的532個WSSV ORFs的被正規化的Cy3螢光強度（亦即表現 位準）的散佈圖。 各個被繪出的點是根據三重複的微陣列結果，對應於 一個單一的WSSVORF，並且表示Cy3螢光位準相對於β_肌 動蛋白的表現位準的比值。與45。等值線的接近性 (Proximity to the 45。line of equivalence)表示在被感染的與 未被感染的條件下的表現有相似的位準。差異性表現的臨 界線(differential expression cut-off line)(1.5:l)被顯示於圖 1 的C組中。 如自圖1中可以看到的，在有漸增劑量的CHX的存在 下，WSSV基因的差異性表現位準漸增地接近該45。等值 線。所觀察到的結果不僅證實CHX處理成功地抑制病毒蛋 白合成，也暗示對於大多數的這些532個WSSV ORFs而 20言，WSSV基因轉錄確實要依靠一或多種病毒蛋白的存在。 相當地不受最高的CHX劑量所影響（亦即具有一大於 1 · 5:1的差異性表現位準）的orf被認為是IE基因的候選 物。雖然接近於該等散佈圖的初始點的數據點無法被清楚 地辨認’電腦分析從圖1的C組中鑑定出60個IE基因候選物。 50 1296285 CHX-不敏感的基因的阶_代认分析 於上面被鑑定出的60個IE基因候選物被進一步進行 RT-PCR分析。圖2顯示3個WSSV IE基因候選物的〇RFs (ORF126、ORF242、ORF418)的瓊脂糖凝膠電泳RT-pCR結 5 果，其中WSSV DNA聚合酶基因（也叫70/)被用作為一對照 組，被用來擴增標的0RF/基因序列的引子組被列示於表1 中，以及結果是根據從在8 hpi之時的WSSV-感染的蝦的鯨 所萃取出的總RNA。徑1顯示250 mg/kg CHX-預處理組的 RT-PCR結果；徑2顯示載劑-預處理組（只有20%乙醇）的 10 RT-PCR結果；徑3顯示未進行反轉錄反應的250 mg/kg CHX-預處理組的PCR結果；以及徑4顯示從WSSV基因組 DNA擴增出的PCR產物(PCR正對照組）；以及徑Μ是100 bp DNAp皆梯(Lambda Biotech Inc.，Taiwan) 〇 所獲得的結果鑑定出3個CHX-不敏感的〇RF，亦即 15 ORF126、ORF242與ORF418。來自不同的個別呢3%感染 的蝦的總RNA樣品的重複查對確認在圖2中所觀察到的該 CHX-不敏感性是一致的。這3個〇rfs在3個已知的〜^¥分 離株的基因組内的可能的序列座標被概述於表4中。可看出 這3個ORFs的任何一個在該3個已知的WSSV分離株中沒有 20 發生刪除。 51 1296285 表4· 3個被鑑定出的CHX-不敏感的ORFs在3個已知的WSSV分 離株基因組内的序列座標 台灣分離株(WSSV T-1)* 泰國分離株** 中國分離株*** NCBI登錄編號 NCBI登錄編號 NCBI登錄編號 AF440570 AF369029 AF332093 ORF126 65711〜66385 81077〜81751 32125〜32799 ORF242 131023〜131349 146706〜146380 97436〜97762 ORF418 242850〜243032 256954〜257136 207904〜208086 *:分離自臺灣被感染的草蝦，它的完整基因組序列被直接地提送至 GenBank來供寄存；以及術語“T-1株，，是於L.-L. d (2獻2)， 5 30人j?36-W7中被首次描述。 **:分離自於1996年自泰國進口的被感染的草蝦，參見C.W vim Hulten et al·，Virology· July 20, 2001，286 (1):7-22。 ***:於1996年10月分離自中國東部的廈門市同安區（Tongan，Xiamen，east China)被感染的斑節瑕，參見, j 10 Virol” Dec. 2001，75 (23): 11811-11820 〇 WSSV IE基因候選物的啟動子活性分析 參見圖3，在轉染後72小時之時，由被表現的EGFP (增 強的綠色螢光蛋白質）所產生的綠色螢光訊號被觀察到只 出 現在被 pIZME/WSSV126-lk/V5-EGFP-His 或 15 pIZMEAVSSV126-2k/V5-EGFP-His (這雨個重組型質體被 構築成分別地含有依據本發明的WSSV ORF126的1 kbp與2 kbp啟動子序列）所轉染的sf9細胞，以及在被正對照組質體 (pIZ/V5-EGFP-His)所轉染的 Sf9細胞。 被構築成分別地含有其他兩個WSSV IE基因候選物的 20啟動子序列的質體，亦即piZME/WSSV242/V5-EGFP-His 與卩12八压/\¥83乂418/\^5$0??-耶，在被它們所轉染的8£9 昆蟲細胞内提供負面結果(數據未示出）。 ORF126因而被命名為WSSV W (極早期基因#1)。同樣 驚奇地觀察到：該WSSV 基因的1 kbp與2 kbp啟動子序 25列兩者要比該正對照組質體pIZ/V5-EGFP-His產生更高的 52 1296285 EGFP螢光訊號，該正對照組質體含有昆蟲病毒QpMNPV [貫杉毋蛾核多角體病毒（Orgyia Pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrosis virus)] 基因的啟動子，亦即办正2啟 動子（參見圖3)。在西方墨點分析中也發現到相似的結果（圖 5 4)。另外，在這兩個不同的啟動子活性分析的重複實施中 也觀察到一致的結果（資料未顯示出）。 由圖3也觀察到，無綠色螢光訊號在被質體 ρΙΖΔΙΕ/WSSV126rev/V5-EGFP-His (它被構築成含有 wssv ORF126的1 kbp啟動子序列的反向序列）所轉染的sf9昆蟲 10 細胞中被產生。這個事實暗示該WSSV /el基因的啟動子較 佳地是呈順向方位被可操作地連結至一標的基因。 製作iel轉錄本的5’和y端的圖譜 被選殖至pGEM-T Easy載體内的5，RACE產物的分析 顯示：在7個首先被隨機挑選出的選殖株之中的6個選殖株 15内，5’端是坐落在位於推定的ATG起始密碼子的上游的52 nt (G)處，而在另一個選殖株内，5’端是位在51 nt (τ)處（圖 5)。這暗示-52 nt G代表主要的轉錄起始點。在該轉錄起始 位址的上游(-26 nt)(相對於ATG轉譯起點的-82 nt至-78 nt 處），發現有一個推定的TATA盒(TATAA)。該W推定的轉 2〇錄起始位址的上游序列的NNPP [有關於啟動子預測的中柩 、、罔路(Neural Network for promoter prediction)]分析鐘定出 一個高可能性的被預測的基本啟動子區域是位在推定的轉 譯起始密碼子前方的-92 nt和-43 nt之間（圖5)。 另外，被選殖的3, RACE產物的序列分析顯示聚⑷被 53 1296285 加入在一個位於A AT AAA聚腺苷酸化訊號的下游17 nt處的 位址（圖5)。 圖6顯示一個非常相似的5’ UTR態樣亦被發現存在於 WSSV dnapol基 M (L，L· Chen et al· (2002)，Virology 301， 5 136-147)，以反 WSSV ηΛ 與 rr2 基舀（M.-F· Tsai et al· (2000)，

Wro沁277, 92-99)。由於這4個基因的轉錄起始位址均順 應於節肢動物起始要素，亦即（八/<：/1^八(0/1[)1[(1>.(：/1^^ and P· Cherbas (1993)，Insect Biochem· Mol· Biol” 23, Sh90)，可以合理地推論：這些病毒基因全都具有允許它們 10 藉由至少節肢動物宿主RNA聚合酶II而被轉錄的轉錄基本 要素。 藉由RT：_?CR的ΨSSV iel基因轉錄作用的暫時性分析 一個RT-PCR暫時性分析顯示轉錄本是首先在2 hpi 被偵測到，並且持續到72 hpi均被發現到（圖7)。該PCR 15 產物條帶的強度隨著時間而增加，在18 hpi之時達到最大值 並且之後持績處在一南表現位準下。作為一比較，另外兩 個WSSV基因，也叩W和vp2S [—個WSSV主要外套蛋白質 基因（major envelope protein gene)，參見X-/f. L⑼，以 α/. (2005), Λ Ww/·，Am· 2005, 79 (7)，以0-以9]，的轉錄本直到 20 4 hpi時均未被偵測到。 Π ·討論 病毒的極早期（ΙΕ)基因是在一病毒的初次感染或再活 化之後立即被表現。這群的基因是藉由它們即使在蛋白質 合成抑制劑的存在之下會產生轉錄本的能力而被實驗地界 54 1296285 定出（F.X· Zhu et al· (1999)，J· Virol·，73, 5556-5567)。 在本發明中，在以wssv攻毒蝦(草蝦)之前，一個蛋白 合成抑制劑，CHX，被用來預處理該等瑕(草蝦）。蝦被注射 以3個不同劑量的CHX (每kg體重各為12.5、62.5和250 5 mg)，而如所預期的，當CHX的劑量被增加時，被表現的 WSSV基因數目被減少（圖1)。然而，於微陣列分析中，即 使是在最高的CHX劑量(250 mg/kg體重，於預先的試驗中， 以這個劑量來處理的未攻毒的蝦只存活歷時大約12小時， 資料未示出）下，仍然有60個產生相當地高數目的轉錄本的 10 WSSV ORFs (圖 1 的c組）。 RT-PCR將IE基因候選物的數目減少到只有3個會一貫 地顯示出CHX-不敏感性(圖2)。就所觀察到的IE基因候選物 的咼初始數目（或偽陽性）的一個可能原因也許是，在活體 内，CHX不能同步地以及完全地抑制每一個細胞内的所有 I5 IE基因的表現，尤其是對於具有一個強啟動子的m基因而 吕。結果，由於任何一個病毒];E基因轉錄因子的出現可能 會立即地觸發下游基因的表現級聯，極有可能遲發早期和 晚期基因的轉錄亦會非常快地開始。 另一方面，參見圖1的C組.，可以注意到，不只是丨5:1 2〇 差異性表現臨界線標準（differential expression cutwff criterion)有點武斷，絕對的表現位準（absolute expression levels)也隨著CHX的劑量漸增而被大大地降低，這使得要 準確地定量螢光強度數據更為困難。因此，可以合理的來 推測·可旎仍存在有未被包含在圖1的C組中所鑑定出的6〇 55 1296285 個候選物内的其他IE基因。 在文獻中曹報導過有數種桿狀病毒極早期基因在病毒 感染過程的早期被表現於一範圍的昆蟲細胞株内，而且通 常是藉由跨越物種的宿主細胞轉錄機制而被轉錄（2λΖλ 5 Hegedus et al· (1998)，Gene，207, 241-249·，Y.G· Zhao and Ρ· 五狀/如⑽"999)，/fzacf Me?/·价从，S，。因此，IE基因 在宿主範圍的決定上可能是重要的。 就申請人所知，昆蟲細胞株内的WSSV感染尚有待被文 件證實。然而，在本文中被鑑定出的wssv啟動子能夠 10 於非宿主的Sf9細胞中驅動短暫的EGFP表現（圖3)。該WSSV 化7啟動子因此必定共有用於無脊椎動物轉錄因子辨識的守 十亙性序列。 因此，基於該WSSV化1啟動子即使是藉由一個非十足 目動物（non-decapod)宿主的轉錄因子可被活化的事實，可 15 以合理的假設：WSSV能夠感染一廣泛範圍的宿主，甲殼類 以及，可能地，非甲殼類（7：W. (i997), WorM /.

MicrobioL Biotech., 13, 433-442; D.V. Lightner (1996), A handbook of pathology and diagnostic procedures for disease of penaeid shrimp. World Aquaculture Society, Baton Rough, 20 L.A··，C.-F· Lo, et al· (1996)，Dis· Aquat· Org·，27, 215-225)。 有關另外兩個被鑑定出的CHX-不敏感的基因，亦即 ORF242與ORF418 (它們的啟動子在被轉染的Sf9細胞中無 法驅動EGFP的表現），我們推論某些其他的特定轉錄因子可 能是這兩個IE基因候選物的啟動子要行使功能所需要的。 56 1296285 這些因子據推測是十足目動物的，並且不存在於Sf9細胞 中。這兩個候選物可能是具蝦細胞特異性的，而因此應該 在被排除是屬IE基因之前於蝦細胞内來進行分析。 TATA要素是許多桿狀病毒早期啟動子的主要調節要 5 素，並且是由一個位在轉錄起始子上游的25〜31核苔酸處的 富含 Α/τ的要素所組成(G.W· Blissard and G.F. Rohnnarm (1991)，J，Virol·，65，5820-5827\ G.W· Blissard et cil. (1992) Virology，190，783-793·，J.A. Dickson and P.D· Friesen (1991)，J· Virol·，65, 4006-4016·，L.A· Guarino and M.W· 10 Smith (1992)，J· Virol·，66, 3733-3739·，S.S. Pullen and P.D· Friesen (1995)，J. Virol” 69, 156-165)。該 TATA要 I 與轉錄 起始子合起來是RNA聚合酶II啟動子的基本要素。 該WSSV 啟動子區域亦順應這個態樣（圖5)，這暗 示：如同大多數的昆蟲桿狀病毒早期基因，WSSV 轉錄 15是由宿主RNA聚合酶Η所媒介。圖6顯示WSSV^^/、rrj? 和rr2亦順應這個態樣。它們的轉錄起始位址相符於 CAGT/CAGT相關的要素(U· C/ze/i α/· (2002)，

301，136-147\ L· Cherbas and Ρ· Cherbas (1993)，Insect Biochem· Mol· Biol” 23，81-90·，S.S· Pullen and P.D. Friesen 2〇 "995)，X VzroZ·，69, 3575-35S3)，並且它們是位於該TATA 盒下游的25至28個核苷酸處。這暗示這3個基因應該也是藉 由宿主RNA聚合酶II而被轉錄。然而，這些全被chx處理 所抑制的基因在轉染分析中並未被表現（關於如叩，參見 圖3，而關於rd和rr2，資料未示出）。因此推測：、 57 1296285 r"和rr2的成功轉錄需要有病毒蛋白質轉錄因子（無論是除 了 RNA聚合酶II所用的宿主轉錄因子之外，或是作 聚合酶II所用的伯主轉錄因子的一個替代物）的存在。 啟動子活性分析的結果（圖3)暗示該W S S V化J編碼區 5域的上游的序列在sf9細胞内活化基因的表現是非常有效 的。如由圖8可看到的，的5, UTR (未轉譯區域）包含數 個序列是符合於GATA要素(A/T)GATA(G/A)的共有序列。 這可能是重要的，因為該GATA要素被確認是轉錄因子的一 個結合位址，例如在桿狀病毒OpMNPV IE基因，從料，的 10 敗動子内（Ρ·Η· Kogan and G.W. Blissard (1994)，J· Virol 68, 813-822)。 圖8亦顯示數個其他可能的調節要素，包含：2個直接 重複序歹丨J(CACACACA與CTCTCTCTCT)、2個短序列的重 複(TTTCTGG與CCAGAAA)、桿狀病毒早期基因啟動子要 15 素（上游調節要素）(CGTGC)〇R.L.丹 (2肌?)，/· G^z· Wro/·，抑(Ti 7)，」S27dS42)、桿狀病毒晚期 啟動子起始子（TTAAG)(L.A. M. W. (1990)，Virology，179，1-8·，T.D. Morris and L.K· Miller

Gmg 7扣，747453)，以及一個可產生有如一轉錄增 2〇 強子的功能的迴文序列（palindromic sequence)(C.r. McMurray et al· (1991)，Proc· Natl· Acad· Sci· USA·，88, 666-670; C. Rasmussen et aL (1996), Virology, 224, 235-245) 〇 特別地，由於該迴文序列是坐落在轉譯起始位址的上 58 1296285 游1，000 nt更遠之處，它可能有助於解釋 pIZME/WSSV126-2k/V5-EGFP-His 與 pIZME/WSSV126-lk/V5-EGFP-His在被轉染的Sf9細胞内的表現位準之間的 差異（圖3)。 5 在另一方面，在由處於24 hpi之時的WSSV-感染的蝦所 萃取出的RNA上所進行的5, RACE分析沒有產生證據來顯 示TTAAG桿狀病毒晚期啟動子起始子曾有產生有如一用 於WSSV id轉錄的起始子的功能。 最後 ’ GenBank/EMBL、SWISSPROT與HR資料庫的 10 BLAST分析預測該化7編碼區域含有Cys2/His2型鋅指要素 (Cys2/His2-type Zinc finger m〇Uf)。這個要素在DNA結合上 具有一角色，並且暗示化7是產生有如一轉錄因子的功能。 進步的研究應探討有那些wssv基因是使用W作為一轉 錄因子。 於本木°兒明書内所弓1用的所有專利與文獻資料以及當 •參Γ娘以它們的整體在此被併入本案以作 内m佔1風。。咖物㈣，本⑽剛（包含界定在 20 的㈣已就它料定《例來作說明，可瞭解到 的疋，它可以作進一+沾作 啄肿巧 涵蓋本發明的任何變並且本件”案被欲求能 本發明的原㈣包含M、/纽造物，它料常是遵循 實施方式而且可被… 本發明所屬技藝中的慣用 以及落在了 ^ 以上所描述的必要特徵的變更， 在下面隨文檢附的申請專利範圍的射内。 59

Claims (1)

1296285 修每目期年朵月P、 第094100625號專利申請案說明書修正頁 十、申請專利範圍： —種經分離的白點症病毒(WSSV)極早期啟動子-調節 區域匕基本上是由一選自於下列群組中的核苷酸序列 所構成： (I) 一為序列辨識編號：29的核苷酸序列； (II) 一為⑴的核苷酸序列的5，_截短的片段，它具有由序 列辨識編號：29的3,端算起的至少92個核苔酸殘 • 基； (111) 一核酸序列，它是由使用一白點症病毒(WSSV)基 口、、且dna作為模板以及一具有一順向引子與一反 向引子的引子組的聚合酶連鎖反應(pCR)而被擴增 出，该順向引子基本上是由一選自於如序列辨識編 號：15與序列辨識編號：17所示的核苷酸序列當中 的核苷酸序列所構成，而該反向引子基本上是由一 為序列辨識編號·· 16的核苷酸序列所構成； (1V) 一為⑴的核苷酸序列的核酸類似物，它與⑴的核普 酸序列具有至少大約60%的序列相同性而且在它 的一個對應於由序列辨識編號：29的3,端算起的92 個核％酸殘基的區域内是守恒的，並且可以驅動一 被可操作地連結至該核酸類似物的標的基因的表 現；以及 (v)—為（ii)的5，-截短的片段的核酸類似物，它與(叫的 截短的片段具有至少大約60%的序列相同性而 且在它的一個對應於由序列辨識編號：29的3,端算 63 第094100625號專利申請案說明書修正頁 修正日期：97年2月19曰 起的92個核答酸殘基的區域内是守怪的，並且可以 驅動一被可操作地連結至該核酸類似物的標的基 因的表現。 2.如申請專利範圍第1項的經分離的WSSV極早期啟動子一 調節區域，它基本上是由該核苷酸序列⑴的一個5，_截短 的片段所構成，其中該5，_截短的片段具有由序列辨識編 5虎· 29的3’端算起的至少16〇個核苷酸殘基。 3·如申請專利範圍第1項的經分離的WSSV極早期啟動子_ 調節區域，它基本上是由該核苷酸序列⑴的一個5，_截短 的片段所構成，其中該5，_截短的片段具有由序列辨識編 號：29的3’端算起的至少250個核苷酸殘基。 4·如申請專利範圍第1項的經分離的WSSV極早期啟動子一 調節區域，它基本上是由該核苷酸序列⑴的一個5，_截短 的片段所構成，其中該5，-截短的片段具有由序列辨識編 號：29的3’端算起的至少500個核苷酸殘基。 5·如申請專利範圍第1項的經分離的wssv極早期啟動子_ 調節區域，它基本上是由該核苷酸序列⑴的一個5，_截短 的片段所構成’其中該5’-截短的片段具有由序列辨識編 號· 29的3’端算起的至少1〇〇〇個核苷酸殘基。 6·如申請專利範圍第1項的經分離的wssv極早期啟動子_ 調節區域，其中在該次項⑽中，要被用來作為模板的 WSSV基因組DNA是萃取自一以一寄存編號 CCTCC-V96001被寄存於中國典型培養物保藏中心的 台灣分離株WSSVT-1。 1296285 第094100625號專利申請案說明書修正頁 修正日期：97 干2月19日 7·如申請專利範圍第1項的經分離的WSSV極早期啟動子 調節區域，它是藉由化學合成而被獲得。 8·如申請專利範圍第1項的經分離的WSSv極早期啟動子 調節區域，它是藉由重組DNA技術而被獲得。 5 9·如申請專利範圍第1項的經分離的WSSV極早期啟動子 調節區域，其中（iv)或(v)的核酸類似物包含—對應於由 序列辨識編號：29的3’端算起的92個核苷酸殘基的區 • 域。 10· —種重組型表現載體，其包含有··一編碼一選定的基因 1〇 產物的第一標的基因，以及一如申請專利範圍第i項的 經分離的WSSV極早期啟動子-調節區域被可操作地連 結至該第一標的基因。 11·如申請專利範圍第10項的重組型表現載體，其中該經分 離的WSSV極早期啟動子-調節區域是呈順向方位坐落 I5 在ό亥弟一標的基因的上游處。 Φ 12·如申請專利範圍第10項的重組型表現載體，它進一步包 含有下列的至少一者：一個坐落在與該wssv極早期啟 動子-調節區域分隔開的位置處的另外的啟動子序列、 一個編碼一第二基因產物的第二標的基因、一轉錄起始 20 位址、一轉錄終止位址、一核糖體結合位址、一分泌信 5虎編碼序列、一RNA奐接位址、一Shine-Dalgarno序列、 一標記基因、一報導基因、一抗生素抗性基因、一個轉 譯終止位址、一插入選殖位置、一增強子序列、一個聚 腺苷酸化位址以及一調節序列。 65 1296285 第094100625號專利申請案說明書修正頁 修正日期：97年2月19日 13. 如申請專利範圍第12項的重組型表現載體，其中該第一 和苐一標的基因獨立地編碼一個選自下列群組中的基 因產物：酵素、治療性多肽、抗原決定位和抗體。 14. 如申請專利範圍第1〇項的重組型表現載體，它是 5 pIZME/WSSV126-2k/V5-EGFP-His。 15·如申請專利範圍第1〇項的重組型表現載體，它是 pIZME/WSSV126-lk/V5-EGFP-His。 馨 16· —種重組型宿主細胞，它是藉由以一如申請專利範圍第 10項的重組型表現載體來轉形一宿主細胞而被生成的。 1〇 η·如申請專利範圍第16項的重組型宿主細胞，它是選自於 下列所構成的群組：細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、 植物細胞、昆蟲細胞、甲殼類細胞、非甲殼類動物細胞 以及人類細胞。 18.如申請專利範圍第π項的重組型宿主細胞，它是Sf9昆 15 蟲細胞。 鲁 19. 一種用於選殖一wssv極早期啟動子調節區域的引子 組，它包含有一順向引子與—反向引子，該順向引子基 本上是由一選自於如序列辨識編號：15與序列辨識編 號：17所示的核㈣序列當中的核㈣序列所構成，而 20 該反向引子基本上是由一為序列辨識編號：16的核苷酸 序列所構成。 66 1296285

tggtgtaatcgctgttgtgggcggagcatatttgtgta|tataa|gagcccgtgttagctcc -61 蠢繼i l·2,3,5,9，10 tcgattcagtcacaagagcgcacacacacgcttataactagctctctctctccactcaag -1 atggcctttaattttgaagactctacaaatctctttgccaatatggacttgacggctggc 60 MetAlaPheAsnPheGluAspSerThrAsnLeuPheAlaAsnMetAspLeuThrAlaGly 20 acaacaacagaccctacccgccccaatatcatattctttgaaagtctactccccaactct 120 ThrThrThrAspProThrArgProAsnllellePhePheGluSerLeuLeuProAsnSer 40 ggtattgaggtgatgaagaggcgtctcgtacggcaaggaaagtgtgggaattttqaagca 180 ^-12 6SP3 GlylleGluValMetLysArgArgLeuValArgGlnGlyLysCysGlyAsnPheGluAla 60

agtggaggtgctatgtcgtatttctggctcgaagataatgcagaagatatggagaatctc 240 SerGlyGlyAlaMetSerTyrPhetrpLeuGluAspAsnAlaGluAspMetGluAsnLeu 80 aacagtggttcccatgtcaagacaaactgcttggcattattccttcaagagtttatcagc 300 AsnSerGlySerHisValLysThrAsnCysLeuAlaLeuPheLeuGlnGluPhelleSer 100 _128SP1 ►_ aactggattgaagagactgatcgacatggacagtactgtacttttccccaatacatggac 360 ^- 126SP2 AsnTrpIleGluGluThrAspArgHisGlyGlntyrCysthrPheProGlnTyrMetAsp 120 ggtggggatggttcacgtgggggatattttacttcgctagccatgaaatggatggctagg 420 GlyGlyAspGlySerArgGlyGlyTyrPheThrSerLeuAlaMetLysTrpMetAlaArg 140 gatgtgactttctttgtgtttgttgataggaataatactgtagaaaatgcggcatccata 480 AspValThrPhePheValPheValAspArgAsnAsnThrValGluAsnAlaAlaSerlle 160

tqqatqtaccaaaaactactagcaattggtgcaaaggtagtaaaggtgattgttgacaat 540 ^——126SP1 TrpMetTyrGlnlysLeuLeuAlalleGlyAlaLysValValLysVallleValAspAsn 180 gcatcaaacccaatgttttctgtatgtaatgcgtgtaggtgcaagtacccaggcccagtg 600 AlaSerAsnProMetPheSerValCysAsnAlaCysArgCysLysTyrProGlyProVal 200 tcatacgttattgaaggccatggagtgggtcattctgatttgacatgtgatgagatttct 660 SerTyrVallleGluGlyHisGlyValGlyHisSerAspLeuThrCysAspGluIleSer 220 ggattctttgtataataaaaccccataagaaacaataatcttttttattcaacacccatg 720 聚A訊號 + GlyPhePheVal * 選殖株編號：2，3，5, 6 224 聚A加入位址

1296285

1296285 fduu4J6u4JJJnJ5iti55a5asunJuas(d4J54Jw4-)c>ualy4-)-p4J5u4J5fdu4Jas4Jcdcntrl4J4Jfd::>ulT)4J4Jcdas(tiaJ4-)clJcd4-)mcnuuu4Jc>4J55fdcdfdasnJ5(xscdu55asl4JIul4JI4-)l4-)l54JIa3lcnl4JIcnl6wfdl64JIaslcnl SCS9CSII > Ur ^ £ • 1-\si/ 4 I>e+ 5ρ·ραϋαϋ·ρίΰΓΰΓΰυα5·υυ·ρϋΓϋ5ΗΓϋΡΊ4-)·υ·ι-):ίΓϋΓϋ-ρ:ί·ρυυ5ι5·ριΓΰιι5ΙΓΰΗιυι·ρ1υι{ϋιυ—ϋ1·ριυι·ριυι·ριιυιι·ριυι-ριιυιΙΡΊ(ϋ·ρυ(ϋ<ϋ-ρΓΰ-ρ·Μυσ1ϋρυ1ΓϋιυιΓϋιυ1Γΰιυισ>υ5(ΰ5Γΰ(ϋυΓϋυ·ρ5Γϋυ·υ·ρ(ϋ5ϋ·υυυ4-) ^vHvl β9π ^ 丨φ^^-ίτ 礙^—ilgliB蛛媒 寸91ucnoiaJwcnJJlJIuuucrlnJBaslpJJIcdlJJIfduCJl^cnJJwwaswcdutTlpcnDIuDIcncnJJcnaJJJcnJJucnuJJccaJJJcnJJmcrlwtTSfdcdEaswuuJJwftiJJJJwasuwufdJJJJDlypiDupJJ-ucdaJcnBaslmJJIJJIcnJJrdu-lJtTJ Z|^1^罅柄 寸VDIH-f«cn4J4J4Jcn4Jucntn4Jfdasfdfdcn4JfdD1pucn4J4Junippcr)cn4Jcnfdumupuuaspu4Jp4J55cncna5cn-p4Ju+Jas4J-u4J4JCJl4JasuaJcn:D4JaJ4-):DaJ4J4J4Jufd6cnas54J4JfdmaJnJIHcdlcnlmulul4Ju654Jmcd 寸VDCN-4J4J4JwnJ56fdcn4J4Jcnmas4Juuo:i4-)fd:Dunscncd-po:Du4J5u5uu64J64J4-)tJ)cducnaJa36f«aJcls4J4Jcn4J6cnfdcn4J4Jn3;:DaJuu:Dcd4Jasas4Jcd4J:i4JfduaJuasucnufdcn4Jcncn4J4Ju4JuaJu4Juu4J 寸 9ΓΟ-cdwuJJcnnssascnscnuufdfdfdmJJuJJcnEcnwtTIcnpaJwcnftiuutJlcnJJfdEWuJJaJu-poascnJJuyJJuJJuJJoaiyaJupcdusJJ-UJasJJasftiuJJJJuuucnwcnuBcncnwJJcncncnuJJcnJJfdcncdcnDIucncd 寸9 寸— BCTIusnsuJJHJJDlJJJJBccuiDcnJJmuwcnJJwasascnpcncnJJfdfdJJuEcnwcnJJfdJJwJJJJpfdowucnaJucdIJIJJasufduucrlaJeuuJJuuaJJJuJJuDItJlaJfd.IJJJuupuuJJuyfdcnEUajJJuuwflJaJcn VIVO 寸9 SIcn4Jfdut7)cnua5Dl4JaJ4J4-)fd54-)nJcncnfdcd5fdl4JIaJIcnl4JI(tcnfdu;D4JaJ(Ti-efti6ascnascn4J:Du:D(TJ5cdnJas4Jun34J(d4JctiBu055JJ4JaJasu:icdcrl4J4-)rd4J5cncnaJaJfdcncn4Jufd4JaJ-IJ4-)aJcnuu4J4Ju4J4J5 VHVO 寸99-4-)uulp4JIn5l54JInJ4Jasc«54Jucn4Jcncn4J4J4J4Jfd;D4-)5u5cn4JaJaiuu4J4-)fd56utl54Jr«4-)6::>uuaJcn664J4J4Jrdcnfd55cnfd5fdu6tti5fd4JaJcr)uttJ4Jfd4J4J655pcnfd:i6f«ufd554J4JJJ4J4JaJaJ5 寸 9I>-c7)cnu5u4JcnD164Jfdm4JucnuCIJfd654Ju4Jrtuctiulajl4JIcdl5cdlfdcnma15aJasuu5m4J4JaJnJcxlaJpniuucnupcnfc3rs4JaJmut7lcncn5asu:ipu4J:15cn4Jcnu4J:D-IJufdascnaJp5Dl4Jcn4J4Jcnp55fd - 寸 900-cnftiDlcnaJo^JJJJufdasfdasEfdfduuftiJJucduJJuJJwcnaJuuaJwfduuaJuascnumcnfdcnuiJJJowiDWuJJJJmcnfdcnuaJasrduuuunscncnJJJJaJuJJfduuJJccwuaJuaJEcnDIfduftiaJscnJJunJfdcn 寸9 6— m4Jid5uas55aJrd6(TiasB5B^BB^Bi¥¥B^55^?iFiB55fdu4J6ai4J;DUaJaJcn4J4J4Jcti4JaJasu-pmuaJnJ5fd5cn5fd6cn4-)as4JronJ;D4Jas34Jfd:DuaJfd4J4Jcdu4Jfdumcncn4J4-)ufd:;>4Ju _^_ 寸9 OH-CTIJJuupusascnDItTIcdcnfdmaJaJaJcdJJocnJJIDcncnJJ+JfdJ-ipoDIuoasJJBOJJIaslftilaslmtlJIitilmulidlcdliJIcdlJJIcdlfdlJJIaJIpJJIyypaJiJJftiJJctiaswJJcnidasmuuyctiuasiJwaJJJsasuuuwcnJJcnucnBDIBnsJJ 寸9 ΤΙ I H5cnfdu4J4Jcnfdu4J4J6CTluu4Juuu4JuBasas5maJ4J5-l-)5uuuwfdcnmasfduns4Jfd4-)4J4Jwucnuuu6ucd-pcnu54JaJuu4Jcd4J4J4J5fd54J4Jcn4Jucd5uaJ4JaJuc«u4-)u4J54Jaicn4-)ascn4J4Jcn^ENr 寸VO3H-4Jid:DucnHu4J4Jucr»4-)ucncd5cn4-)5uwai4-)cn5uascn-p:Duasucnmasu4-)4Ju4J4Jum4Jcnmfd;D4-)4J4J4-)cn4Jascdu4J4JlTI54JaJ4Jfd4Jaiua3cn4-)fdasascnfduu4J5uBain3aicn4J5JJuJ-)4J-puuu4J4Jas I瓦岭罅麵 VIVO 寸9ΓΟΙ-OJuuDlcn5asrdcnclsu4J4Jasu4Jcn4Jas4J4Jid(d4-)cn5ilscn54Ju4JJJ4Jctia3cnnJ5tnrti55fdufdaJ56clsnJ54J4J3CTJ4Jofdfdfdcn4-)4J:D4J4J4JctiH4Jo4J54J4Jas4-):i4J:D4J4Ju:iufdn3fd4Ju4Ju4Jfti4JaiaJ4Jas I VIVO VIVO 寸 9 寸H- B¥4Jcnasfd5mmnJI4JIm54JI4-)cn4J4J54J4Jm4J554J4JuH6a5u4Jctim6fdn3cncncn6cn4Jas5(Tiucnu4Juuu4J4Jmu:16asn5Bc«4Jcticn4-):i5ucn4JilJr«u4Jcn4J4J5Dlup5asucnu4J4J4Jcncnfd(T3c7)4Ju4J 寸 9SI-uu55a3cticd4J5u4JJJ4J4J54Jnicn54J6u46u4J6fdasCISaJasufdt«5uaJ4J4-)4J4Jni4JnJt«D1fdcnaJcticrlctiuua5cna55as4J-eu::>-pas4-)4Jas;D:DJ-)asasaJnsasu4Ju4Jcnucnu4Ju4J5u54-)5u::>cn4Jfdcn4J ^991-4JuasaJfd3ucn4Jcnfduuilsu4Jasu4-)cn:luD14Ju4J4Jcnrti:Du4JaJfdon4J-IJucd-BaJ4J5asfd54J4J4Juu4J4Jcn4Juucnfdu4Juu4J4Ju4J4J4Ju4Ju4-)u4J4Ju:DiTSas4Jn3u4Ju4J4-)uu4JcdtJl4J4-)u4J4Juclsfd 寸νβΔΤ Iuu4Jcn:Ducduidrdpcduu5fd-pucncnaJu4J-l-)4J-p4-):DaJ5as4J5fd-IJuBnicrlnsucn4-)4Ju4J4Juasuufd4Jfd(ISufdfd(IJas5n54JcnufdHu4J4J4J4J4-)ctiufda55u4Jucti:Dcdfd4Jcdrd:l:D4Jasascn4Juu6ni6 VHVOVHVO 寸 9811clsasftipcn4J4Ju4J4Jfdcnu(TScn4J4JIfdl4JIcdlcnl4JI6c7)a5cnaJu4JaJns4J5upuu5cdu4J4-)4Jfdu4J4-)4J4J-p4JcticnHucn4J554J5fdBu4J4Jcn5fdfd-Bfdu4-)cn4JIa5l4JIa5lcnl-e(ISfdcnuu4Jcd+Jcn4J4Jufd4JfdaJftifdu S6I- s £ϊ £s