CN114107176A - 一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞重组与蛋白表达技术领域，具体涉及一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系及其构建方法和应用，本发明公开了一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系，所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO‑CD2v，于2021年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:62052。本发明的细胞系是将外源基因CD2v整合入中国仓鼠基因组内已知的安全位点，从而实现转入基因的正常表达而又不影响细胞的正常生理功能，其构建过程简单，克隆准确度高。该细胞系可以用于高产CD2v蛋白，非洲猪瘟药效筛选、疫苗生产等方面，对于非洲猪瘟的诊断和疫苗生产具有非常重要的意义。

Description

一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系及其构建方法 和应用

技术领域

本发明属于细胞重组与蛋白表达技术领域，具体涉及一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASF virus,ASFV)引起猪的一种出血性，高度接触性传染病，其临床症状与猪瘟极其相似。ASF是全球养猪业的一种新兴疾病。该病于2018年8月在我国辽宁省沈阳市首次发生，ASF的传入已严重威胁到我国生猪产业的存续。该疫情难以控制的一个主要原因是目前世界范围内尚无商品化的有效疫苗，并且由于缺乏关于ASF病毒(ASFV)抗原的知识而阻碍了相关研究的进展。有研究表明，ASFV血清型特异性蛋白CD2v(EP402R)对于防止同源ASF感染是具有至关重要的作用。

CD2v是存在于ASF病毒颗粒外部包膜上的唯一蛋白质，为病毒进入细胞或在细胞之间传播的特征蛋白，由信号肽序列和一个跨膜区组成，因为它拥有两个免疫球蛋白样的结构域，其氨基酸序列与CD2分子非常相似。存在于病毒外部包膜上的CD2v通过介导细胞外病毒粒子与红细胞的附着，可以促进病毒的传播。此外，CD2v还可以通过抑制淋巴细胞增殖从而使病毒在体外具有免疫抑制活性。

CHO细胞，即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)，该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。与其他细胞表达系统相比，CHO表达系统具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子，同时，CHO还具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白。除此之外，CHO还具有重组基因高效扩增和表达，外源蛋白整合稳定等优点。因此，CHO被视为表达复杂生物大分子的理想宿主。

综上可见，利用基因工程技术将CD2v稳定整合至中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的基因组以构建稳定表达的CD2v细胞系，对于非洲猪瘟的诊断和疫苗生产具有非常重要的意义。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系。

本发明的第二个目的是提供上述稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的构建方法。

本发明的第三个目的是提供上述稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的应用。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系，所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-CD2v，于2021年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:62052。

血清型特异性蛋白CD2v(EP402R)是存在于病毒颗粒外部包膜上的唯一蛋白质，为病毒进入细胞或在细胞之间传播的特征蛋白。存在于病毒外部包膜上的CD2v可以通过介导细胞外病毒粒子与红细胞的附着，促进病毒的传播。此外，其还可以通过抑制淋巴细胞增殖从而使病毒在体外具有免疫抑制活性。因此构建可以稳定表达CD2v的细胞系，对于非洲猪瘟的诊断和疫苗生产具有非常重要的意义。而中国仓鼠卵巢细胞CHO可以将外源基因整合入基因组内已知的安全位点，实现转入基因的正常表达而又不影响细胞的正常生理功能。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：

上述稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，包括以下步骤：

S1、将目的基因CD2v连接至DC-SH02载体上，构建得到DC-SH02-CD2v重组质粒，所述DC-SH02-CD2v重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

S2、将重组质粒DC-SH02-CD2v和pROSA26-Cas9 gRNA质粒共转染至中国仓鼠卵巢细胞CHO中；

S3、对转染后的细胞利用嘌呤霉素筛选方法和有限稀释法筛选得到稳定表达CD2v的细胞系。

本发明首先构建了DC-SH02-CD2v过表达质粒，然后通过DC-SH02-CD2v和pROSA26-Cas9 gRNA质粒共转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，最后利用嘌呤霉素筛选方法和有限稀释法成功获得单克隆细胞株，即稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系，为研制非洲猪瘟制剂提供了参考，对于非洲猪瘟的诊断和疫苗生产具有非常重要的意义。

优选地，步骤S1中，所述目的基因是以pMD18-CD2v质粒为模板，用引物CD2v-F和CD2v-R扩增得到，所述CD2v-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CD2v-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述引物CD2v-F和CD2v-R中，5’端均含有酶切位点和对应的保护碱基。具体地，所述酶切位点为KpnI和BamHI。

优选地，步骤S2中，是通过重组质粒DC-SH02-CD2v将目的基因CD2v导入到中国仓鼠基因组的安全位点。

优选地，步骤S2中，所述安全位点为ROSA26安全位点。

ROSA26位点(GenBank：NC_000072)位于小鼠基因组第6号染色体，最早是在一支名为ROSAβgeo26的小鼠品系中被发现的。该品系的小鼠因为一个随机插入的基因，在所有组织中都能检测到高水平的β半乳糖苷酶表达。该位点表达一个编码转录本和两个非编码的转录本，只有非编码转录本的序列受到这个外源插入的干扰。虽然两个等位区都带有外源插入片段，但纯合子小鼠幼崽的出生率略低于杂合子幼崽，但纯合子幼崽也能正常发育并繁殖。自此，“ROSA26”位点就被用于基因转入；这个位点的基因敲入对细胞及小鼠的健康无副作用，并能保证转入基因的正常稳定表达。

特异靶向ROSA26位点的TALEN或CRISPR-Cas9体系能在小鼠第6号染色体上的ROSA26位点上生成DNA双链断裂，触发细胞的DNA修复机制，诱导基因组与ROSA26供体克隆之间发生同源重组(HR)，从而将供体克隆上的DNA片段整合到基因组上的ROSA26safeharbor位点，这为构建稳定表达CD2v的细胞系提供了可能。

优选地，步骤S1中，所述DC-SH02载体包含有CMV启动子序列和ROSA26安全位点重组臂(MRL和MRR)。所述MRL和MRR分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

优选地，所述DC-SH02载体还包含有PolyA信号序列和嘌呤霉素耐性基因序列。

进一步地，所述PolyA信号序列为bGH PolyA信号。

优选地，步骤S3中，嘌呤霉素筛选为利用含有嘌呤霉素的培养基对转染后的细胞进行培养，挑出单个细胞集落，所述嘌呤霉素在培养基中的浓度为7μg/mL。

嘌呤霉素(Puromycin)是一种由白黑链霉菌产生的氨基苷类抗生素。其可以打乱核糖体上的肽转运，造成翻译过程中的不成熟链终止，从而抑制蛋白质合成。在原核和真核细胞中，嘌呤霉素都是强效翻译抑制剂。在本发明中，所构建的载体携带有Puro抗性，因此Puromycin可用于已成功转染细胞的筛选。

优选地，步骤S2中，重组质粒DC-SH02-CD2v和pROSA26-Cas9 gRNA质粒的加入量为1:1。

优选地，所述重组质粒DC-SH02-CD2v含有CD2v基因序列或片段、CMV启动子序列和ROSA26安全位点重组臂(MRL和MRR)。

进一步地，所述重组质粒DC-SH02-CD2v还含有荧光标记序列。具体地，所述荧光标记序列为绿色荧光蛋白序列。

本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：

上述稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系在制备CD2v蛋白中的应用。

上述稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系在非洲猪瘟的药效筛选和/或疫苗生产中的应用。

通过在质粒中加入荧光标记序列，从而使可以指示出CD2v蛋白在转染细胞内的表达情况，而如果施加给转染细胞的药物或制剂具有结合CD2v基因的能力或具有抑制CD2v表达的能力，则可以根据荧光强度判断出其药物的有效性。可见，上述稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系除了可以用于高产CD2v蛋白外，还可以用于非洲猪瘟的药效筛选和/或疫苗生产，此外，也可以为非洲猪瘟病毒的分离提供细胞模型，为非洲猪瘟与宿主之间的致病机理的研究提供平台。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明公开了一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系，所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-CD2v，于2021年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:62052。本发明的细胞系是将外源基因CD2v整合入中国仓鼠基因组内已知的安全位点，从而实现转入基因的正常表达而又不影响细胞的正常生理功能。同时，本发明的细胞系的构建采用了CRISPR/Cas编辑技术，构建过程简单，可重复性好，效率高，而且通过嘌呤霉素压力筛选及定点整合后左右同源臂序列PCR的鉴定测序，确认其克隆准确度高，确保正确克隆的获取。此外，该细胞系除了可以用于高产CD2v蛋白外，还可以用于非洲猪瘟的药效筛选和/或疫苗生产，也可以为非洲猪瘟病毒的分离提供细胞模型，为非洲猪瘟与宿主之间的致病机理的研究提供平台，对于非洲猪瘟的诊断和疫苗生产具有非常重要的意义。

附图说明

图1为质粒载体1(DC-SH02)的质粒图谱；

图2为模板质粒2(DC-SH02-CD2v)的质粒图谱；

图3为pROSA26-Cas9 gRNA的质粒图谱；

图4为转染细胞的荧光示意图(A为转染细胞培养24h后的荧光示意图，B为经过嘌呤霉素压力筛选10d后的荧光示意图)；

图5为转染细胞的单克隆细胞群落荧光示意图；

图6为左同源臂特异引物(a)、右同源臂特异引物(b)和CD2v特异引物(c)的扩增电泳结果(M为DNAmarker，1-3为CHO-CD2v细胞的DNA)；

图7为单克隆细胞株不同培养代次CD2v基因的mRNA鉴定结果；

图8为SDS-PAGE Western Blot电泳条带(A为CHO-CD2v细胞表达的蛋白的SDS-PAGE电泳图，B为内参GAPDH蛋白的SDS-PAGE电泳图，1代表CHO细胞，2代表CHO-CD2v细胞)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

实施例1稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系CHO-CD2v的构建

1、试验材料

大肠杆菌感受态细胞DH5α购自广州擎科生物技术有限公司；CHO细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，并由本实验室传代保存；鼠ROSA26 Safe Harbor基因敲入载体(包括DC-SH02、pROSA26-Cas9 gRNA)购自广州易锦生物技术有限公司，并由本实验室保存；胎牛血清，DMEM/F-12K培养基，脂质体LipofectamineTM 3000、嘌呤霉素、质粒抽提试剂盒、基因组DNA抽提、RNA抽提等试剂盒和Phusion Hot Start II High-Fidelity PCR MasterMix均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；限制性内切酶KpnI和BamHI及T4 DNA连接酶均购自NEB；携带CD2v基因的pMD18-CD2v质粒由军事兽医科学院扈荣良教授馈赠。

2、引物的设计

根据CD2v基因序列(数据库编号：MK333180.1)设计引物，分别在上下游引物5’端连接酶切位点KpnI和BamHI以及相应的保护碱基(下划线部分为酶切位点和对应的保护碱基)。

上述引物组的序列具体为：

上游引物F(CD2v-F)：5’-GGGGTACCATGTTCATAAAATGATAATACTTAT-3’(SEQ IDNO.1)；

下游引物R(CD2v-R)：5’-GCGGATCCTTAAATAATTCTATCTACG-3’(SEQ ID NO.2)。

3、细胞系的构建

(1)扩增目的基因

以pMD18-CD2v质粒为模板，PCR扩增目的基因。

其中，PCR扩增的反应体系为：

模板	1μL
		Mix	25μL
上游引物F	2μL
		下游引物R	2μL
ddH<sub>2</sub>O	补充至50μL

上述Mix为Phusion Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix。

PCR扩增的反应程序为：

98℃预处理30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸10min。

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认正确后用DNA纯化试剂盒(Thermo)进行切胶回收目标基因。

(2)模板质粒2的制备。

将上述步骤回收的目标基因与质粒载体1(DC-SH02，质粒图谱如图1所示，含有CMV启动子序列，ROSA26安全位点重组臂，PolyA信号序列和嘌呤霉素耐性基因序列，所述PolyA信号序列为bGH PolyA信号)，分别用限制酶KpnI和BamHI进行双酶切处理，回收酶切后的片段，采用本领域常规方法用连接酶将目的基因序列连接至质粒载体1中，得到模板质粒2(模板质粒2：DC-SH02-CD2v，其质粒图谱如图2所示，其中，MRL和MRR为ROSA26安全位点重组臂；模板质粒2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，含绿色荧光蛋白序列)，将模板质粒2转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选转化结果为阳性的细胞克隆，并使用限制酶KpnI和BamHI进行酶切和测序鉴定确保克隆正确性。

模板质粒2的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：

Atgataatacttatttttttaatattttctaacatagttttaagtattgattattgggttagttttaataaaacaataattttagatagtaatattactaatgataataatgatataaatggagtatcatggaatttttttaataattcttttaatacactagctacatgtggaaaagcaggtaacttttgtgaatgttctaattatagtacatcaatatataatataacaaataattgtagcttaactatttttcctcataatgatgtatttgatacaacatatcaagtagtatggaatcaaataattaattatacaataaaattattaacacctgctactcccccaaatatcacatataattgtactaattttttaataacatgtaaaaaaaataatggaacaaacactaatatatatttaaatataaatgatacttttgttaaatatactaatgaaagtatacttgaatataactggaataatagtaacattaacaattttacagctacatgtataattaataatacaattagtacatctaatgaaacaacacttataaattgtacttatttaacattgtcatctaactatttttatactttttttaaattatattatattccattaagcatcataattgggataacaataagtattcttcttatatccatcataacttttttatctttacgaaaaagaaaaaaacatgttgaagaaatagaaagtccaccacctgaatctaatgaagaagaacaatgtcagcatgatgacaccacttccatacatgaaccatctcccagagaaccattacttcctaagccttacagtcgttatcagtataatacacctatttactacatgcgtccctcaacacaaccactcaacccatttcccttacctaaaccgtgtcctccacccaaaccatgtccgccacccaaaccatgtcctccacctaaaccatgtccttcagctgaatcctattctccacccaaaccactacctagtatcccgctactacccaatatcccgccattatctacccaaaatatttcgcttattcacgtagatagaattatttaa。

MRL序列(SEQ ID NO.4)：

Gtcagttaacggcagccggagtgcgcagccgccggcagcctcgctctgcccactgggtggggcgggaggtaggtggggtgaggcgagctggacgtgcgggcgcggtcggcctctggcggggcgggggaggggagggagggtcagcgaaagtagctcgcgcgcgagcggccgcccaccctccccttcctctgggggagtcgttttacccgccgccggccgggcctcgtcgtctgattggctctcggggcccagaaaactggcccttgccattggctcgtgttcgtgcaagttgagtccatccgccggccagcgggggcggcgaggaggcgctcccaggttccggccctcccctcggccccgcgccgcagagtctggccgcgcgcccctgcgcaacgtggcaggaagcgcgcgctgggggcggggacgggcagtagggctgagcggctgcggggcgggtgcaagcacgtttccgacttgagttgcctcaagaggggcgtgctgagccagacctccatcgcgcactccggggagtggagggaaggagcgagggctcagttgggctgttttggaggcaggaagcacttgctctcccaaagtcgctctgagttgttatcagtaagggagctgcagtggagtaggcggggagaaggccgcacccttctccggaggggggaggggagtgttgcaatacctttctgggagttctctgctgcctcctggcttctgaggaccgccctgggcctgggagaatcccttccccctcttccctcgtgatctgca。

MRR序列(SEQ ID NO.5)：

Tgggcgggagtcttctgggcaggcttaaaggctaacctggtgtgtgggcgttgtcctgcaggggaattgaacaggtgtaaaattggagggacaagacttcccacagattttcggttttgtcgggaagttttttaataggggcaaataaggaaaatgggaggataggtagtcatctggggttttatgcagcaaaactacaggttattattgcttgtgatccgcctcggagtattttccatcgaggtagattaaagacatgctcacccgagttttatactctcctgcttgagatccttactacagtatgaaattacagtgtcgcgagttagactatgtaagcagaattttaatcatttttaaagagcccagtacttcatatccatttctcccgctccttctgcagccttatcaaaaggtattttagaacactcattttagccccattttcatttattatactggcttatccaacccctagacagagcattggcattttccctttcctgatcttagaagtctgatgactcatgaaaccagacagattagttacatacaccacaaatcgaggctgtagctggggcctcaacactgcagttcttttataactccttagtacactttttgttgatcctttgccttgatccttaattttcagtgtctatcacctctcccgtcaggtggtgttccacatttgggcctattctcagtccagggagttttacaacaatagatgtattgagaatccaacctaaagcttaactttccactcccatgaatgcctctctcctttttctccattt。

(3)筛选最适Puro(Puromycin，嘌呤霉素)筛选浓度

将CHO细胞接种于96孔板(DMEM/F-12K培养基)，培养至85％-90％细胞密度后，用含有不同Puro浓度的DMEM/F-12K培养基(分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/mL)培养，每日更换培养基，连续观察4-7d，其中，在培养3-4d后全部细胞死亡的培养基中的最低Puro浓度即为最适Puro筛选浓度。

结果发现，CHO细胞加不同Puro浓度的培养液后，从第2天开始，除空白对照组之外，药物筛选组均有少量细胞死亡。筛选至4d，6μg/mL组有40％细胞死亡，7μg/mL-10μg/mL组有90％细胞死亡，最后经确认CHO细胞的最适合Puro筛选浓度为7μg/mL，因为偏高puro浓度虽然能很快将细胞杀死，但不利于质粒在细胞内的表达，而较低puro浓度则无法在合适时间内杀死足够多的未转染成功的细胞，不利于后续对单克隆细胞的筛选。因此，本实施例对CHO细胞的最适合Puro筛选浓度为7μg/mL，既能满足在限定时间内杀死足够多的细胞来满足实验的需求，而且该浓度对细胞的毒性相对更低。

(4)转染细胞

取CHO细胞培养于DMEM/F-12K培养液(含10％胎牛血清)。转染前1d将细胞接种至6孔板(2×10⁵个/孔)，过夜培养至细胞密度达到90％-95％。然后使用脂质体(Lipofectamine^TM3000)将上述制备得到的模板质粒2和pROSA26-Cas9 gRNA(模板质粒2和pROSA26-Cas9gRNA加入比例(质量比)为1∶1)共转染至CHO细胞内，转染48h后，更换为含有嘌呤霉素的培养基进行筛选。

(5)分离单克隆细胞系

1)在灭菌的96孔板每孔中加入100μL培养基(DMEM/F-12K)，留空左上角A1孔。

2)在A1孔加入200μL细胞悬浮液(2×10⁴cells/mL)，取其中100μL与B1孔中的培养基混匀，混匀过程中避免产生气泡。继续在第1列进行同样的1:2稀释至H1孔，并用培养基将第1列每孔体积定容至200μL。

3)混匀第1列的细胞悬浮液，各取其中100μL加至第2列孔中。用移液器轻柔混匀，避免产生气泡。重复此1:2稀释至第12列，并用培养基将每孔体积定容至200μL。

4)将培养板放在37℃培养，避免扰动。

5)培养7-10天后通过显微镜观察到细胞，在培养板盖上对含单群落的孔进行标记，然后将单群落细胞消化下来，依次采用上述同样的方法经24孔、6孔板扩大培养。

共转染CHO细胞培养24h后，以及压力筛选10d后的情况如图4所示。图4表明，转染后24h，死亡细胞约为20％，而余下80％细胞有荧光表达，压力筛选10d后，大部分非荧光细胞死亡，有70％-90％细胞有荧光表达。经10d压力筛选后的荧光细胞经消化后，按有限稀释法转入96孔板后，培养10d后单个细胞形成单克隆细胞群落情况如图5所示，单克隆细胞群落中的细胞均出现荧光，说明克隆无误。

其中，将阳性细胞克隆株使用DMEM/F-12K培养基连续传代10次以上，按常规方法冻存、复苏，通过观察阳性克隆细胞的荧光，qPCR检测CD2v基因的表达水平，来检测细胞系的稳定性，鉴定方法具体步骤如下：

对细胞克隆株培养过程中的第3代、第5代和第10代为检测对象，使用试剂盒或本领域常规方法提取DNA，利用定点整合后的左右同源臂序列【MRL-F：CAAAGCCCCCAGGGATGTAA(SEQ ID NO.6)；MRL-R：CGCCCATTGATGTACTGC(SEQ ID NO.7)；MRR-F：CTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC(SEQ ID NO.8)；MRR-R：TGTCGCCGGTATTGTTCG(SEQ ID NO.9)】，以及扩增CD2v基因序列的特异性引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)分别进行PCR鉴定。

鉴定结果如图6所示，其中，图6a为CD2v基因序列左同源臂，序列长度为1.2kb；图6b为右同源臂，序列长度为1.5kb；图6c为CD2v基因序列，序列长度为1.083kb。产物大小符合实验预期，且测序结果验证正确，确定目的基因整合无误，最后将构建的细胞系命名为CHO-CD2v。

对细胞克隆株培养过程中的第3代、第5代和第10代为检测对象，用哺乳动物细胞RNA提取试剂盒提取筛选细胞总RNA，反转录为cDNA后按照表1的反应体系和表2的反应程序用qPCR鉴定CD2v基因的转录水平。qPCR所用的引物为：CD2v-qF：ATGCGTCCCTCAACACAACC(SEQ ID NO.10)，CD2v-qR：GGGATATTGGGTAGTAGCGGG(SEQ ID NO.11)，扩增曲线见图7，说明CD2v基因敲入到细胞基因组内。

表1 反应体系

表2 反应程序

4、细胞系的CD2v表达效果检测

采用Western Blot来检测细胞系的CD2v表达效果，具体步骤如下：

在6孔细胞培养板中培养CHO-CD2v及CHO细胞，待细胞汇合度为80～90％时移除培养基，PBS冲洗3次，6孔板中每孔加入200μL Pierce IP Lysis Buffer(货号：87787，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，和10μL蛋白酶抑制剂(货号：P005，购自碧云天生物技术)，在冰上静置10min后，用细胞刮刀将细胞刮下并转移至1.5mL Eppendorf管中，4℃、12000g/min离心5min，吸取上清，酶标仪检测蛋白浓度(BCA法)，-20℃保存待用。将相同蛋白浓度的两份样品进行SDS-PAGE电泳后转移到硝酸纤维素滤膜(NC膜)上，将其放在5％脱脂奶粉中于室温摇床封闭2h。PBST冲洗3次，置于含有一抗(CD2v鼠单抗)的稀释液(1∶100)中，4℃摇床过夜孵育后，用PBST冲洗3次；置于含有二抗(辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG)的稀释液(1∶1000)中，37℃摇床作用2h后，用PBST冲洗3次，最后用ECL显色液显色，出现反应条带后，用去离子水冲洗NC膜以终止反应。

SDS-PAGE Western Blot电泳条带如图9所示，与正常CHO细胞相比，上述实施例中构建得到的稳定表达CD2v细胞系能够正确的表达CD2v蛋白。

综上所述，通过对阳性细胞克隆株不同培养代次进行CD2v基因的PCR和qPCR扩增(第3代、第5代和第10代)，均有阳性扩增，以及Western Blot鉴定出特异性的条带。由此可证明上述实施例中构建的CHO-CD2v细胞系能够正确且稳定地表达CD2v蛋白，可以为ASF疫苗生产的进一步研究提供良好的细胞模型。

最后，将上述实施例中制备得到的细胞系CHO-CD2v(中国仓鼠卵巢细胞)于2021年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:62052。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系及其构建方法和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA/RNA

<213> CD2v-F(人工序列)

<400> 1

ggggtaccat gttcataaaa tgataatact tat 33

<210> 2

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> CD2v-R(人工序列)

<400> 2

gcggatcctt aaataattct atctacg 27

<210> 3

<211> 1083

<212> DNA/RNA

<213> DC-SH02-CD2v(人工序列)

<400> 3

atgataatac ttattttttt aatattttct aacatagttt taagtattga ttattgggtt 60

agttttaata aaacaataat tttagatagt aatattacta atgataataa tgatataaat 120

ggagtatcat ggaatttttt taataattct tttaatacac tagctacatg tggaaaagca 180

ggtaactttt gtgaatgttc taattatagt acatcaatat ataatataac aaataattgt 240

agcttaacta tttttcctca taatgatgta tttgatacaa catatcaagt agtatggaat 300

caaataatta attatacaat aaaattatta acacctgcta ctcccccaaa tatcacatat 360

aattgtacta attttttaat aacatgtaaa aaaaataatg gaacaaacac taatatatat 420

ttaaatataa atgatacttt tgttaaatat actaatgaaa gtatacttga atataactgg 480

aataatagta acattaacaa ttttacagct acatgtataa ttaataatac aattagtaca 540

tctaatgaaa caacacttat aaattgtact tatttaacat tgtcatctaa ctatttttat 600

acttttttta aattatatta tattccatta agcatcataa ttgggataac aataagtatt 660

cttcttatat ccatcataac ttttttatct ttacgaaaaa gaaaaaaaca tgttgaagaa 720

atagaaagtc caccacctga atctaatgaa gaagaacaat gtcagcatga tgacaccact 780

tccatacatg aaccatctcc cagagaacca ttacttccta agccttacag tcgttatcag 840

tataatacac ctatttacta catgcgtccc tcaacacaac cactcaaccc atttccctta 900

cctaaaccgt gtcctccacc caaaccatgt ccgccaccca aaccatgtcc tccacctaaa 960

ccatgtcctt cagctgaatc ctattctcca cccaaaccac tacctagtat cccgctacta 1020

cccaatatcc cgccattatc tacccaaaat atttcgctta ttcacgtaga tagaattatt 1080

taa 1083

<210> 4

<211> 780

<212> DNA/RNA

<213> MRL(人工序列)

<400> 4

gtcagttaac ggcagccgga gtgcgcagcc gccggcagcc tcgctctgcc cactgggtgg 60

ggcgggaggt aggtggggtg aggcgagctg gacgtgcggg cgcggtcggc ctctggcggg 120

gcgggggagg ggagggaggg tcagcgaaag tagctcgcgc gcgagcggcc gcccaccctc 180

cccttcctct gggggagtcg ttttacccgc cgccggccgg gcctcgtcgt ctgattggct 240

ctcggggccc agaaaactgg cccttgccat tggctcgtgt tcgtgcaagt tgagtccatc 300

cgccggccag cgggggcggc gaggaggcgc tcccaggttc cggccctccc ctcggccccg 360

cgccgcagag tctggccgcg cgcccctgcg caacgtggca ggaagcgcgc gctgggggcg 420

gggacgggca gtagggctga gcggctgcgg ggcgggtgca agcacgtttc cgacttgagt 480

tgcctcaaga ggggcgtgct gagccagacc tccatcgcgc actccgggga gtggagggaa 540

ggagcgaggg ctcagttggg ctgttttgga ggcaggaagc acttgctctc ccaaagtcgc 600

tctgagttgt tatcagtaag ggagctgcag tggagtaggc ggggagaagg ccgcaccctt 660

ctccggaggg gggaggggag tgttgcaata cctttctggg agttctctgc tgcctcctgg 720

cttctgagga ccgccctggg cctgggagaa tcccttcccc ctcttccctc gtgatctgca 780

<210> 5

<211> 800

<212> DNA/RNA

<213> MRR(人工序列)

<400> 5

tgggcgggag tcttctgggc aggcttaaag gctaacctgg tgtgtgggcg ttgtcctgca 60

ggggaattga acaggtgtaa aattggaggg acaagacttc ccacagattt tcggttttgt 120

cgggaagttt tttaataggg gcaaataagg aaaatgggag gataggtagt catctggggt 180

tttatgcagc aaaactacag gttattattg cttgtgatcc gcctcggagt attttccatc 240

gaggtagatt aaagacatgc tcacccgagt tttatactct cctgcttgag atccttacta 300

cagtatgaaa ttacagtgtc gcgagttaga ctatgtaagc agaattttaa tcatttttaa 360

agagcccagt acttcatatc catttctccc gctccttctg cagccttatc aaaaggtatt 420

ttagaacact cattttagcc ccattttcat ttattatact ggcttatcca acccctagac 480

agagcattgg cattttccct ttcctgatct tagaagtctg atgactcatg aaaccagaca 540

gattagttac atacaccaca aatcgaggct gtagctgggg cctcaacact gcagttcttt 600

tataactcct tagtacactt tttgttgatc ctttgccttg atccttaatt ttcagtgtct 660

atcacctctc ccgtcaggtg gtgttccaca tttgggccta ttctcagtcc agggagtttt 720

acaacaatag atgtattgag aatccaacct aaagcttaac tttccactcc catgaatgcc 780

tctctccttt ttctccattt 800

<210> 6

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> MRL-F(人工序列)

<400> 6

caaagccccc agggatgtaa 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> MRL-R(人工序列)

<400> 7

cgcccattga tgtactgc 18

<210> 8

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> MRR-F(人工序列)

<400> 8

ctgcattcta gttgtggttt gtc 23

<210> 9

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> MRR-R(人工序列)

<400> 9

tgtcgccggt attgttcg 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> CD2v-qF(人工序列)

<400> 10

atgcgtccct caacacaacc 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> CD2v-qR(人工序列)

<400> 11

gggatattgg gtagtagcgg g 21

Claims (10)

1.一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系，其特征在于，所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-CD2v，于2021年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:62052。

2.权利要求1所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将目的基因CD2v连接至DC-SH02载体上，构建得到DC-SH02-CD2v重组质粒；

S2、将重组质粒DC-SH02-CD2v和pROSA26-Cas9 gRNA质粒共转染至中国仓鼠卵巢细胞CHO中；

S3、对转染后的细胞利用嘌呤霉素筛选方法和有限稀释法筛选得到稳定表达CD2v的细胞系。

3.根据权利要求2所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述目的基因是以pMD18-CD2v质粒为模板，用引物CD2v-F和CD2v-R扩增得到，所述CD2v-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CD2v-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.根据权利要求2所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，步骤S2中，是通过重组质粒DC-SH02-CD2v将目的基因CD2v导入到中国仓鼠基因组的安全位点。

5.根据权利要求4所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述安全位点为ROSA26安全位点。

6.根据权利要求2述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述DC-SH02载体包含有CMV启动子序列和ROSA26安全位点重组臂。

7.根据权利要求6所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，所述DC-SH02载体还包含有PolyA信号序列和嘌呤霉素耐性基因序列。

8.根据权利要求2述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，步骤S3中，嘌呤霉素筛选为利用含有嘌呤霉素的培养基对转染后的细胞进行培养，挑出单个细胞集落，所述嘌呤霉素在培养基中的浓度为7μg/mL。

9.权利要求1所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系在制备CD2v蛋白中的应用。

10.权利要求1所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系在非洲猪瘟的药效筛选和/或疫苗生产中的应用。

Images