TWI294461B - Cell culture and method for screening for a compound useful in the treatment or prevention of hepatic cirrhosis - Google Patents

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1294461 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 I本發明係有關於一種藥物篩選方法及篩選用細胞模 型，尤指一種應用改質之肝細胞與星狀細胞作為抗肝硬化 5藥物高通量篩選之筛選方法及篩選用細胞模型。 【先前技術】 一般認為肝硬化（hepatic cirrhosis)的發生是因為 肝細胞（hepat0Cyte)受到酒精、藥物破壞或病毒感染，進而 ίο釋放出某些訊息，使得肝臟組織中的星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC)活化轉型成為肌纖維母細胞 (myofibroblast，MF)，而肌纖維母細胞可分泌大量的細胞外 基質（extracellular matrix，ECM)，如：膠原蛋白（collagen)、 纖維糖蛋白（fibronectin)、層黏蛋白（Laminin)和蛋白多糖 15 (Proteoglycan)，使得肝臟產生纖維化（fibr〇sis)的現象，同 時也因為細細胞外基質的阻隔，使得肝臟細胞得不到氧氣 及養分的供給而壞死，簡而言之，肝硬化是肝細胞壞死及 星狀細胞活化分泌細胞外基質所共同造成，導因於細胞外 基質的降解速度與生合成速度的失衡。 20 一般肝硬化藥物的篩檢，可分為體外細胞培養篩檢和 體内動物實驗篩檢兩種模式。體外細胞培養篩檢通常用單 一種細胞，如肝腫瘤細胞株（HepG2)、初代大鼠肝細胞或 正常肝臟所为離出來的上皮狀細胞（Chang liver cell)，利用 酒精、四氯化石厌或α-半乳糖胺（a_gaiact〇samine，Gain )損 1294461 傷後，以保肝藥物處理，再以白蛋白⑷bumin)產生

> MTT 分析、麩胺基硫轉移酵素（glutathione_S_transferase，GST) 活性或細胞色素P450 ( cytochrome P450)活性為指標， 量測這些細胞經藥物處理後恢復的能力。另外亦可使用星 5狀細胞或肌纖維母細胞，觀察藥物抑制其活化情形，通常 以ex-肌動蛋白（a-actin)、肌間線蛋白（desmin)、膠原 蛋白產生量、MMP-3或-9 (膠原蛋白酶）活性為指標。 動物實驗方面通常使用小鼠、大鼠、兔子或犬類等動 物，以四氯化碳、α-半乳糖胺、膽管結紮或感染日本血吸 10蟲引發急性或慢性肝硬化，施以保肝藥物治療，觀察其恢 復情形。 然而，若每一種合成或新型藥物均需用動物實驗來證 明=療效，並不符合經濟及人道的觀點；且目前的體外細 胞核式只使用單-種細胞，即肝細胞或星狀細胞，並不符 15 =肝臟硬化的生理模式，也容易產生偏差。其所篩選出之 樂物其可具有療效的抗肝硬化藥物應該具有一方面可提昇 =貝的產生，因此，一個符合肝臟生理功能的肝硬化細 胞模式實有必要。 ' >Q . 、, 旦目則可見的新藥高速篩選設備每次僅能使用單一 胞並對其單層結構（monolayer)進行篩檢。單層結構 ::田胞並無法真實的表現生理狀態，更無法同步對其他多 :田胞進仃師檢’因此無法碟切瞭解檢測藥物的實際功能 織專一性，亦會造成其他重要用途之遺漏，而被誤認 1294461 為無效藥’這也是新藥高速篩選技術為人所詬病之原因。 本發明特點在建立一細胞模型，用以抗肝硬化藥物之 丰才欢利用基因改質之肝細胞及星狀細胞作為檢測的 工具單7G，以報導基因釋放出螢光訊號，再利用螢光光譜 5儀項取，即可達成快速、靈敏與同步檢測細胞狀況之偵測， 以提什藥物篩選的精確度，甚至能在未來取代動物實驗， 大幅IV低產業界新藥篩選開發所需之成本與時間。 【發明内容】 1〇 為了建立套此確貫符合肝硬化細胞模式的系統，同 曰守兼具提供穩定的細胞來源與反應偵測的功能，本發明利 用星狀細胞或/和肝細胞進行細胞改質，以細胞特異性之調 控序列（cell specific regulat〇ry sequence)接合報導基因，製 作成一套細胞動態的活性偵測系統。如此，不僅可以提供 15肝組織陣列(liver tissue array)W穩定細胞來源，而細胞株 本身也可以作為細胞活性的偵測系統；配合細胞晶片的設 計，將可成為一項研究肝組織系統的作業平台；同時，將 肝組織星狀細胞和肝細胞進行多層次共培養，更符合肝臟 組織的結構，能反應真實細胞在受到藥物作用時之相互調 20 控。 本發明之主要目㈣在提供—種抗肝硬化藥物 細胞模型，俾能利用基因改質之肝細胞及星狀細胞作為檢 測的工具’並藉報導基因表現測知受測藥物之效果，達二 快速、靈敏及能同步檢測多種細胞狀況，以明確藥物作用 1294461 本發明之又一目的係在提供一種抗肝硬化藥物篩選 細胞模型，俾能於細胞存活之狀態下即時檢測其活性，且 可進行藥物對活細胞影響之長期監控。 為達成上述目的，本發明係提供一抗肝硬化藥物篩選 5 細胞模型，其模型包括一細胞群，該細胞群係衍生自肝細 胞與星狀細胞之共培養，其該細胞群中至少有一種細胞帶 有一細胞特異性調控序列以及一報導基因核苷酸序列片 本發明細胞模型中，細胞群係共培養於一培養基及一 10 覆有細胞外基質之基材；且星狀細胞與肝細胞開始生長細 胞濃度比例不限，較佳係為1:10之比例。 本發明細胞模型中，該星狀細胞與肝細胞之共培養方 法可參考Naoki Uyama等人培養大鼠肝細胞之研究報告（J. Hepatology. 36:5 90-599,2002)，其可為混合共培養（mixed 15 co-culture)或層疊共培養（separated co-culture) 〇 「調控序列（regulatory sequence)」係指一啟動子 (promoter)、增強子（enhancer)或其他調控蛋白質（如轉錄因 子，transcription factors)優先結合之DNA片段。 本發明細胞模型中，細胞特異性調控序列係分別選自 20 肝細胞與星狀細胞特異性的啟動子。「細胞特異性的啟動 子（cell specific promoters)」係泛指一段核酸上的驗基序 列，位於基因起始之上游（upstream)，其可與RNA聚合酶 (RNA polymerase)形成起始複合物（initiation complex)進行 轉錄，且調控著細胞特異性表現，如肝細胞特異性的啟動 1294461 子如白蛋白（albumin，ALB )啟動子或α-Ι胰蛋白酶抑制酶 (α-Ι antitrypsin，AAT)。星狀細胞特異性的啟動子較佳為第 一型膠原蛋白（collagen type I)啟動子。 本發明細胞模型中，較佳之報導基因為可於細胞内表 5 現且該產物可被偵測及量化，如β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)、氯黴素乙醢轉移酶（chloramphenicol acetyl transferase，CAT)，冷光酶（luciferase)及榮光蛋白 (fluorescence protein)，報導基因之DNA片段亦可包括一正 選擇標諸（positive selection marker)，如抗藥性基因 10 (antibiotic resistance gene)，較佳抗藥性基因如抗潮黴素 (hygromycin)基因或抗新黴素（neomycin)基因。 本發明細胞模型中，肝細胞或星狀細胞亦可選擇性地 進行細胞不朽化（immortalization)之改質，即使該細胞帶有 一不朽化基因核苷酸序列之DNA片段。 15 本發明細胞模型中，所使用之不朽化基因不限’較佳 為人染色體端粒酶中的反轉錄酶之催化次單元（Human telomerase reverse transcriptase catalytic subunit，hTERT) 或猿猴病毒 40(simian virus40，SV40)大 T 抗原（large T-antigen，Tag)之基因。 20 本發明細胞模型中，該細胞特異性調控序列以及該報 導基因之核苷酸序列之DNA片段或該不朽化基因核苷酸 序列之DNA片段可藉由轉染（transfection)方式將該DNA片 段導入至細胞；轉染可用之方法包括：電穿孔法 (electroporation)、微脂粒轉染（lipofection)、麟酸姜弓（calcium 1294461 phosphate)、及 DEAE-糊精（DEAE-dextran)等方法。 本發明細胞模型中，所使用之細胞外基質不限，可以 是任何習知之細胞外基質，較佳係膠原蛋白（c〇llagen)或基 底膜基質（matrigel)。 5 本發唄更包括一種利用細胞模型篩選抗肝硬化藥物之 方法，其步驟包括：（a)將一測試用化合物施用於上述之細 胞模型；（b)檢測該模型中細胞群之細胞活性或報導基因表 現；（c)比較該細胞活性或報導基因表現變化；以及（幻分 析該變化對該測試用化合物對抗肝硬化之關聯性。 10 本發明方法中，該變化若星狀細胞報導基因表現下降 和/或肝細胞報導基因表現上昇即表示該測試用化合物為 抗肝硬化藥物；或者星狀細胞活性下降和/或肝細胞活性上 昇亦表示該測試用化合物為抗肝硬化藥物。 本發明方法中步驟（a)之前或之後更可包括一步驟（a，） 15將一已知與肝硬化相關之物質施用於上述細胞模式。 本發明檢測報導基因之表現方式不限，較佳係藉螢光光譜 儀、酵素聯結免疫測讀儀（ELISA Reader)或流式細胞儀分 析’本舍明檢測該培養之細胞活性方式不限，較佳係藉螢 光強度觀察、反轉錄聚合酶鏈鎖反應（RT_pCR)、四唑藍比 20 色法（MTT assay)或甲基藍分析（methyiene blue assay)方 式。 除非有另外定義，本發明中所用到相關之技術與科學 術ασ與一般習知本項技藝者之認知是相同的。雖然有與本 文中相似或相同的方法與材料可試驗或實施於本發明，但 1294461 較佳的方法與材料將敘述於後。 【實施方式】 為能讓貴審查委員能更瞭解本發明之技術内容，特 5 舉數較佳具體實施例說明如下。 貫施例一、含不朽化質體（immortalized plasmid)反轉錄病 毒之製備，與細胞株之轉染 於本實施例中，該篩選藥物細胞模型之一細胞係採用 人類肝臟星狀細胞，而該細胞係經過實施例一之不朽化病 10 毒之轉染。將pCl_neo hTERT質體（圖1A，購自Promega公 司）利用限制酵素五cM /及/進行切割，並對pMSCV-neo 載體（圖1B，購自Clontech公司）利用限制酵素五cM /及Zh /進行切割後，利用洋菜凝膠電泳（Agarose Gel electrophoresis)分離出所需片段後，以QIAGEN公司之QIA 15 quick Gel Extraction Kit將所需片段純化後，利用T4 DNA 連接酶（T4 DNA ligase)將兩片段進行接合後，為 pMSCV-neohTERT反轉錄載體，其圖譜如圖1C所示。 利用脂質體轉染試劑（Lipofectamine Reagent)(講自 Invitrogen)轉染構築成功之pMSCV-neo hTERT載體至病毒 20 組裝細胞株（packaging cell line) : RetroPackTMpT67 或 AmphoPackTM-293中；蒐集含有反轉錄病毒的細胞培養 基，直接將含有病毒之培養基加入星狀細胞之培養液中， 以感染這些人類肝臟星狀細胞；之後於星狀細胞培養液加 入抗生素-新黴素（neomycin)，抗生素可以抑制未被反轉錄 25 病毒轉染成功之星狀細胞的生長。 11 1294461 為確認反轉錄病毒已成功的將neo-hTERT鑲嵌至星狀 細胞染色體，可利用RT-PCR證實新黴素基因mRNA的表 現，請見圖2 A，其中「-」符號代表未經轉染之星狀細胞， 電泳圖亦證實其不具有新黴素基因mRNA，而圖2A上「+」 5 符號則是代表經neo-hTERT轉染之星狀細胞，且電泳圖上 證實其帶有新黴素基因mRNA ;另一方面，可利用西方點 墨法（Western blot)證實hTERT蛋白質的表現，如圖2B所 示，圖中「-」符號代表未經轉染之星狀細胞，「+」符號 則是代表經neo-hTERT轉染之星狀細胞，箭頭符號顯示經 10 neo-hTERT轉染之星狀細胞確實有hTERT蛋白質的表現。 轉染成功的不朽化細胞株可冷凍保存於液態氮中，以使用 於未來的藥物篩檢實驗。 實施例二、含白蛋白啟動子（albumin promoter)質體之反轉 錄載體構築 15 於本實施例中，篩選藥物細胞模型之肝細胞係採用

HuH-7細胞株，且已經過含白蛋白啟動子質體之反轉錄載 體病毒之轉染；本例所用之白蛋白啟動子質體係利用抗潮 黴素基因進行選殖，此反轉錄載體除含有抗潮黴素基因， 另含有一具有肝細胞特異性之白蛋白啟動子，以及一 EGFP 20 作為報導基因。 在白蛋白啟動子質體之構築，本實施例係利用 GenBank核酸序歹丨J編號00178343設計出募核苷酸引子 hSA-3(如 SEQ ID NO: 1)和 hSA-5(如 SEQ ID NO: 2)，進行反 轉錄聚合酶鏈鎖反應（RT-PCR)，自人類cDNA中放大出1個 12 1294461 白蛋白啟動子基因片段，其序列請見序列表中SEQ ID N0:3。 增強型綠色螢光蛋白基因片段（EGFP)係利用2段寡核 苷酸引子EGFP-1(如 SEQ ID N0:4)和 EGFP-3(如SEQ ID NO: 5 5)，由pGFP-1質體（圖3A，購自Clontech公司）以PCR方式放 大出綠色螢光蛋白基因片段；而抗潮黴素基因之選殖，則 是利用2段寡核苷酸引子hyg-Ι(如SEQ ID NO:6)和hyg-2(如 SEQ ID NO:7)，由 pMSV_hyg質體（圖 3B，購自 Clontech公 司）PCR放大出抗潮黴素基因。 10 含白蛋白啟動子質體之反轉錄載體的構築方式如下， 首先將抗潮黴素基因以T4 DNA連接酶接合到 pLP-LNCX_21oxP反轉錄載體（圖4A)，再以T4 DNA連接酶 將EGFP基因片段接合到含有抗潮黴素基因的反轉錄載體 上，最後將白蛋白啟動子序列以T4 DN A連接酶接合，而產 15 生出反轉錄載體pLPLhyg-PALB5/3-EGFP(圖 4B)。 實施例三、含α-Ι胰蛋白酶抑制酶（α_ 1 -antitrypsin)啟動子質 體之反轉錄載體構築 於本實施例中，篩選藥物細胞模型之另一細胞亦可採 用經過含α-Ι胰蛋白酶抑制酶啟動子質體之反轉錄病毒轉 20 染之HuH-7細胞株。本實施例中之反轉錄質體同樣含有抗 潮黴素基因與一 EGFP基因，另具肝細胞特異性之啟動子係 α-Ι胰蛋白酶抑制酶啟動子。 在質體構築方面’ α-Ι膜蛋白酶抑制酶啟動子部分係選 自GenBank核酸序列編號〇〇 177830,為具有人類肝細胞特 13 1294461 異性之α-Ι胰蛋白酶抑制酶啟動子核酸序列，在設計出2段 寡核皆酸引子ΑΑΤ-1(如SEQ ID Ν0:8)和ΑΑΤ-2(如SEQ ID N0:9)後，利用RT-PCR，自人類cDNA中放大出1個α-Ι胰蛋 白酶抑制酶啟動子基因片段，其序列如序列表中SEQ ID 5 NO: 10所示。 EGFP基因同樣利用2段寡核苷酸弓|子EGFP-1(如SEQ ID NO:4)和 EGFP-3(如 SEQ ID NO:5)，對 pGFP-Ι 質體（圖 3A，Clontech)以PCR方式放大出綠色螢光蛋白基因片段； 而抗潮黴素基因，亦利用2段募核苷酸引子hyg_l (如SEQ ID ίο NO:6)和 hyg-2(如 SEQ ID ΝΟ··7)，對pMSV-hyg 質體（圖 3B， Clontech)PCR放大出抗潮黴素基因。 反轉錄載體的構築方式一如上述，首先將抗潮黴素基 因以T4 DNA連接酶接合到pLP-LNCX-21oxP反轉錄載體 (圖4A)，再以T4 DNA連接酶將EGFP基因片段接合到含有 15 抗潮黴素基因的反轉錄載體上，最後將α-Ι胰蛋白酶抑制酶 啟動子以Τ4 DN Α連接酶接合，而產生出反轉錄載體 pLPLhyg-PAAT-EGFP(圖 5)。 實施例四、含第一型膠原蛋白（collagen type I)啟動子質體 之反轉錄載體構築 20 於本實施例中，篩選藥物細胞模型之另一細胞係採用 肝臟星狀細胞，且經過含第一型膠原蛋白啟動子質體之反 轉錄載體病毒之轉染。本例所用之第一型膠原蛋白啟動子 係為COL1A1及COL1A2之啟動子，並利用抗潮黴素基因進 行含有上述啟動子之質體選殖，本反轉錄載體除含有抗潮 14 1294461 黴素基因’另含有一具有星狀細胞特異性之第一型膠原蛋 白啟動子，以及一DsRed作為報導基因。 在第一型膠原蛋白C0L1A1啟動子質體之構築，本實 施例係利用GenBank核酸序列編號4755084設計出募核苷 5 酸引子3段寡核苷酸引子COL-A3(如SEQ ID ΝΟ:11)及 COL-A5(如 SEQ ID NO: 12)以及 COL-B1 (如 SEQ ID NO:13)，進行反轉錄聚合酶鏈鎖反應（RT-PCR)，自人類肝 臟星狀細胞cDNA中放大出2個第一型膠原蛋白αΐ啟動子基 因片段，如序列表SEQ ID NO: 14之Α3Β1、以及如序列表 10 SEQ ID NO: 15之 A5B1。 在第一型膠原蛋白COL1A2啟動子質體之構築，本實 施例係利用GenBank核酸序列編號2735714設計出寡核苷 酸引子2段寡核苷酸引子COL-A2-l(如SEQ ID NO:16)以及 COL-A2_2(如SEQ ID NO:17)，進行反轉錄聚合酶鏈鎖反應 15 (RT-PCR)，自人類肝臟星狀細胞cDNA中放大出1個第一型 膠原蛋白αΐ啟動子基因片段（COL-αΙ)，其序列為SEQ ID NO: 18。 報導基因紅色螢光蛋白（DsRed)同樣利用2段寡核苷酸 引子DS-1(如SEQIDNO··19)以及DS-2(如SEQIDNO:20)， 20 對pDsRed2-l質體（圖6,購自Clontech)以PCR方式放大出紅 色螢光蛋白基因片段；而抗潮黴素基因，亦利用2段寡核苷 酸引子hyg_l(如 SEQ ID NO:6)和 hyg-2(如 SEQ ID NO:7)，對 pMSV-hyg質體（圖3B，Clontech)PCR放大出抗潮黴素基因。 反轉錄載體的構築方式一如上述，首先將抗潮黴素基 15 1294461 因以T4 DNA連接酶接合到pLP-LNCX-21oxP反轉錄載體 (圖4A)，再以T4 DNA連接酶將DsRed基因片段接合到含有 抗潮黴素基因的反轉錄載體上，最後將第一型膠原蛋白啟 動子以T4 DNA連接酶接合，而產生出三種反轉錄載體 5 pLP-Hyg-A3Bl-DsRed(圖 7A)、pLP-Hyg-A5Bl-DsRed(圖 7B) 以及pLP-Hyg-COLlA2-DsRed (圖 7C)。 實施例五、細胞株轉染含反轉錄載體之病毒顆粒 將實施例二及三之帶有不同肝細胞專一性啟動子質體 之反轉錄載體送入包裹細胞株（packaging cell line)製成病 10 毒後，分別感染HuH-7細胞株；同樣的，實施例四中帶有 不同星狀細胞專一性啟動子質體之反轉錄載體亦送入包裹 細胞株（packaging cell line)製成病毒後，分別感染初代星 狀細胞。 利用脂質體轉染試劑（購自Invitrogen)將構築成功之反 15 轉錄病毒載體 _-pLPLhyg-PAlb5/3-EGFP(圖 4B)、 pLPLhyg-PAAT-EGFP(圖 5)、pLP_Hyg-A3Bl-DsRed(圖 7A)、 pLP-Hyg-A5Bl-DsRed(圖 7B)、pLP-Hyg-COLlA2-DsRed (圖7C)轉染至病毒組裝細胞株：RetroPackTMpT67或 AmphoPackTM_293 (AP293)中；加入抗生素-潮黴素，將感 2〇 染失敗的組裝細胞殺死，抽取經過反轉錄質體感染的PT67 或者AP293細胞株的培養基上清液，進一步利用RT-PCR證 實此培養基上清液含有成功組裝之反轉錄病毒。 蒐集含有反轉錄病毒的細胞培養基，直接將病毒加入 培養液，以感染這些細胞；加入抗生素潮黴素’將轉染失 1294461 敗的細胞殺死；利用PCR證實病毒DNA已經鑲嵌至細胞的 染色體中；再藉RT-PCR證實螢光蛋白基因的表現。 實施例六、檢測經改質後之細胞株 實施例五中轉染成功的細胞可以在螢光顯微鏡下觀察 5螢光的表現。透過影像分析軟體可以分析其螢光強度。此 外’ EGFP螢光強度可以利用螢光光譜儀或elISA reader測 定，利用488 nm波長激發，偵測510 nm波長的發射光強 度；DsRed螢光則利用558 nm(紅色螢光)波長激發，偵測583 nm波長的發射光強度；或是透過流式細胞儀分析（如bd 10 FACSCalibur)，檢測FL-1的發射光強度。 實驗結果如圖8與圖9所示，圖8(a)為pLPLhyg-Palb 5/3-EGFP，圖 8(b)為pLPLhyg-PAAT-EGFP，由結果圖可觀 察到此兩個載體均可使HuH-7細胞株產生綠色螢光；另 外，HepG2/C3A 細胞株經 pLPLhyg-Palb5/3-EGFP 及 15 pLPLhyg-PAAT-EGFP兩個載體轉染亦可產生綠色螢光，如 圖 9 所示，圖 9(a)為 pLPLhyg-Palb5/3-EGFP，圖 9(b)為 pLPLhyg-PAAT-EGFP ；而 pLP-Hyg-A3B 1-DsRed 、 pLP-Hyg-A5Bl-DsRed 及 pLP-Hyg-COLlA2-DsRed 三個質 體可使轉染之星狀細胞產生紅色螢光，分別如圖10中的 20 (a)、（b)與（c)所示。 實施例七、藥物篩選細胞模型建立 本實施例將實施例一與實施例六所製備完成改質後之 人類星狀細胞與HuH-7細胞株進行層疊培養，先將不朽化 人類肝臟星狀細胞種植入先行被覆細胞外基質之2 4孔細胞 17 1294461 培養盤，本實施例所使用之細胞外基質為第一型膠原蛋白 (Type Icollagen)或基底膜基質（matrigel)。經過6小時，待 星狀細胞貼附後，再接種入含有白蛋白啟動子反轉錄載體 之 HuH-7pALB-EGFP 之 HuH-7 細胞株。 5 在經過一天後，加入1000、5000、10000 IU/ml的干擾 素（interferon α，購自Roche藥廠）到培養液，3個小時後， 再加入100mM硫代乙酸胺(thioacetamide，購自Sigma公司） 對細胞進行損傷，經過24小時後，利用曱基藍分析測定細 胞活性，其結果如圖11A所示；同時，利用螢光光譜儀測 10 定綠色螢光強度，其結果如圖11B所示；兩者實驗結果相 符，證實干擾素可以減緩本實施例所建立之藥物篩選細胞 模型受到硫代乙醯胺的破壞。 為比較本實施例與正常肝細胞與星狀細胞經過藥物處 理之結果，本實施例另使用不朽化之人肝細胞THLE-2 15 (ATCC編號CRL-2706，該細胞係為初級正常肝細胞經過 SV40 large T antigen基因轉染）及未經轉染之人類星狀細 胞，以上述相同方式進行層疊共培養24小時後，加入1000、 5000、10000 IU/ml的干擾素（interferon α)到培養液，3個小 時後’再加入1 〇〇mM硫代乙醢胺（thioacetamide)對細胞進行 20 損傷，經過24小時後，利用曱基藍分析測定細胞活性，其 結果如圖11C所示，且此結果與經過 PLPLhyg-Palb5/3-EGFP轉質之藥物筛選細胞模型相符（圖 11A)。 上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所 18 1294461 主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限 於上述實施例。 【圖式簡單說明】 _ 5 圖1A係實施例一中pCl-neo hTERT質體。 ， 圖1B係實施例一中pMSCV-neo載體。 . 圖1C係實施例一pMSCV-neo hTERT反轉錄載體。 圖2A係實施例一利用RT-PCR證實新黴素基因mRNA的表 現。 · 10 圖2B係實施例一利用西方點墨法（Western blot)證實hTERT 蛋白質的表現。 圖3 A係實施例二中pGFP-1質體 圖3B係實施例二中pMSV-hyg質體。 圖4A係實施例二中pLP-LNCX-21oxP反轉錄載體 15 圖4B係實施例二中pLPLhyg-PALB5/3-EGFP反轉錄載體。 圖5係實施例三中pLPLhyg-PAAT-EGFP反轉錄載體。 圖6係實施例四中pDsRed2-l質體。 鲁 圖7A係實施例四中pLP-Hyg-A3Bl-DsRed反轉錄載體。 圖7B係實施例四中pLP-Hyg-A5Bl-DsRed反轉錄載體。 20 圖7C係實施例四中pLP-Hyg-COLlA2-DsRed反轉錄載體。 圖8係實施例五中分別以二質體轉染HuH-7細胞株產生綠 _ 色螢光之結果圖，（a)為 pLPLhyg-PALB5/3-EGFP，（b)為 - pLPLhyg-PAAT- EGFP質體轉染後之細胞。 圖9係實施例五中分別以二質體轉染HepG2/C3A細胞株產 25 生綠色螢光之結果圖’ （a)與（b)分別代表以 19 1294461 pLPLhyg-PALB5/3-EGFP 及 pLPLhyg-PAAT-EGFP 質體轉染後 之細胞。 圖10係實施例六中分別以三質體轉染星狀細胞產生紅色螢 光之結果圖，（a)為 pLP-Hyg-A3Bl-DsRed ; (b)為 5 pLP-Hyg-A5Bl-DsRed ; (c)為 pLP-Hyg-COLlA2-DsRed質體 轉染之星狀細胞。 圖11A係以曱基藍分析方法分析干擾素之結果，顯示可以 減緩HllH-7pALB_EGFP與不朽化星狀細胞受到硫代乙酿胺的 破壞。 10 圖11B係以螢光光譜儀分析干擾素之結果，顯示可以減緩 HuH-7pALB-EGFP與不朽化星狀細胞受到硫代乙^胺的破 壞’榮光係來自HllH-7pALB-EGFP。 圖11C係甲基藍分析方法分析干擾素之結果，顯示可以減 緩不朽化之肝細胞THLE-2與不朽化星狀細胞受到硫代乙 15 醯胺的破壞。 【主要元件符號說明】 1294461 序列表 5 10 15 20 <110> 財團法人工業技術研究院 <120〉 抗肝硬化藥物篩選細胞模型及其篩選方法 <160〉 20 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213〉 人工序列 <220> <223> 募核苷酸引子<400〉 1 atttgggact taactctttc agt 23 <210〉 2 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉 人工序列 <220〉 <223> 募核苷酸引子 <400> 2 agaaaagcta ggacaaacgg agg 23 <210〉 3 <211〉 414

21 1294461 <212〉 DNA <213> 人類 <220> <221> 啟動子 5 <222> (1)..(414) <223> 白蛋白啟動子 <400> 3 gggatcctta actctttcag tatgtcttat ttctaagcaa agtatttagt ttggttagta 60 10 attactaaac actgagaact aaattgcaaa caccaagaac taaaatgttc aagtgggaaa 120 ttacagttaa ataccatggt aatgaataaa aggtacaaat cgtttaaact cttatgtaaa 180 atttgataag atgttttaca caactttaat acattgacaa ggtcttgtgg 15 agaaaacagt 240 tccagatggt aaatatacac aagggattta gtcaaacaat tttttggcaa gaatattatg 300 aattttgtaa tcggttggca gccaatgaaa tacaaagatg agtctagtta ataatctaca 360 20 attattggtt aaagaagtat attagtgcta atttccctcc gtttgtccaa gctt 414 <210> 4 <211〉 25

25 <212〉 DNA 22 1294461 <213〉 人工合成 <220> <223〉 募核苷酸引子 <400〉 4 5 cccgggatcc accggtcgcc accat 25 <210> <211〉 <212> 10 <213> <220> <223> <400> 27 DNA 人工合成 寡核苷酸引子

gatttcggcc tattggttaa aaaatga 27 15 <210〉 6 <211> 21 <212> DNA <213〉 人工合成 20 <220〉 <223〉 寡核苷薇引子 <400> 6

tttcgacctg catcccgcca c 21 23 1294461 5 <210> 7 <211〉 21 <212> DNA <213〉 人工合成 <220> <223〉 寡核苷酸引子 <400> 7 atcagctctt gttcggtcgg c 21 10 <210〉 <211〉 <212> <213> <220> 15 <223〉 <400> 34 DNA 人工合成 寡核苷酸引子 ctgtcctcgt ccgtatttaa gcagttgatc caga 34 20 <210> 9 <211〉 28 <212> DNA <213> 人工合成 <220〉 <223> 寡核苷酸引子 24 1294461 <400> 9 gccaggcact tcacccgagg cacttcac 28

<210〉 10 5 <211〉 737 <212> DNA <213> 人類 <220> <221〉 啟動子 10 <222> ⑴"(737) <223〉 οι-i胰蛋白酶抑制酶啟動子 <400> 10 ggatcctcac ccgaggcact tcacaagcat gcttgggaat gaaacttcca actctttggg 60 15 atgcaggtga aacagttcct ggttcagaga ggtgaagcgg cctgcctgag gcagcacagc 120 tcttctttac agatgtgctt ccccacctct accctgtctc acggcccccc atgccagcct 180 gacggttgtg tctgcctcag tcatgctcca tttttccatc gggaccatca 20 agagggtgtt 240 tgtgtctaag gctgactggg taactttgga tgagcggtct ctccgctctg agcctgtttc 300 ctcatctgtc aaatgggctc taacccactc tgatctccca gggcggcagt aagtcttcag 360 25 catcaggcat tttggggtga ctcagtaaat ggtagatctt gctaccagtg 25 1294461 ίο gaacagccac 420 taaggattct gcagtgagag cagagggcca gctaagtggt actctcccag agactgtctg 480 actcacgcca ccccctccac cttggacaca ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat 540 gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc 600 gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac 660 tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca gcctcccccg ttgcccctct ggatcaactg 720 cttaaatacg gaagctt 737

<210> 11 15 <211> 26 <212> DNA <213> 人工合成 <220〉 <223〉 寡核苷酸引子 20 <400> 11 agatctccat tccaactccc aattgg 26

<210〉 12 <211> 25 25 <212> DNA

26 1294461 <213〉 人工合成 <220> <223> 募核苷酸引子 <400> 12 5 agatctagca gaagaattga catcc 25 10 <210〉 13 <211〉 27 <212> DNA <213> 人工合成 <220> <223> 寡核苷酸引子 <400> 13 aagcttcgat atagagtatg gttgcac 27 15 <210〉 14 <211> 411 <212〉 DNA <213〉 人類 20 <220〉 <221〉 啟動子 <222> (1)..(411) <223> 第I型膠原蛋白αΐ啟動子 <400> 14 27 1294461 atctccattc caactcccaa attgggggcc gggccaggca gctctgattg gctggggcac 60 gggcggccgg ctccccctct ccgaggggca gggttcctcc ctgctctcca tcaggacagt 120 5 ataaaagggg cccgggccag tcgtcggagc agacgggagt ttctcctcgg ggtcggagca 180 ggaggcacgc ggagtgtgag gccacgcatg agcggacgct aaccccctcc ccagccacaa 240 agagtctaca tgtctagggt ctagacatgt tcagctttgt ggacctccgg 10 ctcctgctcc 300 tcttagcggc caccgccctc ctgacgcacg gccaagagga aggccaagtc gagggccaag 360 acgaagacag taagtcccaa acttttggga gtgcaaggat actctatatc g 411 15 <210> <211〉 <212〉 <213〉 20 <220〉 <221〉 <222> <223> <400> 15 952

DNA 人類 啟動子 ⑴"(952) 第I型膠原蛋白αΐ啟動子 15 atctagcaga agaattgaca tcctcaaaat taaaactccc ttgcctgcac ccctccctca 60 28 25 1294461 5 10 15 20 gatatctgat tattcctaag ctccatcccc taattcccag cttcctctgt tagctcttgc caggatatca cacccccaac ccttccacct acttcttcta gattggaggt gcccacgcca ttctgaggac gctggggggc tggggaggca tcctcctccc cctctccatt ggctggggca cgggcggccg atcaggacag tataaaaggg gggtcggagc aggaggcacg cccagccaca aagagtctac gctcctgctc tcttaatgtc tagaaaggaa tctgtaaatt gttccccaaa 120 tagccacacc agaagacacc cccaaacagg cacatctttt 180 tttggagagg tcctcagcat gcctctttat gcccctccct 240 gagggtgact ggggcacagc caggaggacc ccctccccaa 300 ttggaagtct ccccacccag ctccccagtt ccccagttcc 360 cccaggaaga gagcagaggg gcacccctac ccactggtta 420 ccagctgcac ccctaccaca gcacctctgg cccaggctgg 480 gagctgcgaa gaggggagat gtggggtgga ctcccttccc 540 ccaactccca aattgggggc cgggccaggc agctctgatt 600 gctccccctc tccgaggggc agggttcctc cctgctctcc 660 gcccgggcca gtcgtcggag cagacgggag tttctcctcg 720 cggagtgtga ggccacgcat gagcggacgc taaccccctc 780 atgtctaggg tctagacatg ttcagctttg tggacctccg 840 29 25 1294461 ctcttagcgg ccaccgccct cctgacgcac ggccaagagg aaggccaagt cgagggccaa 900 gacgaagaca gtaagtccca aacttttggg agtgcaagga tactctatat eg 952 5 <210> 16 <211〉 35 <212> DNA <213〉 人工合成 10 <220〉 <223> 寡核苷酸引子 <400> 16 cgcggatccc attaccaccc tgagtcattt tgctc 35 15 <210〉 17 <211> 36 <212〉 DNA <213> 人工合成 <220> 20 <223〉 寡核苷酸引子 <400> 17 acgcaagctt gtctagcact tagacatgca gaette <210> 18 25 <211〉 2431 30 36 1294461 <212> DNA <213〉 人類 <220> <221> 啟動子 5 <222> (1〕 丨"(2431) <223> 第I型膠原蛋 白al啟動子 <400> 18 cattaccacc ctgagtcatt ttgctcagaa ttagtctctg actctcagca acacaggaca 60 10 aatacacaca tatgccctgc aaaggtaatt cagcacagtg gtaacaatga ttcttagaaa 120 tcatttctca ctcttctgat atgcagaaaa aaatttgtta tgatgtagta ttgaagtttt 180 tctttcctga taaaaatgat ttccacttta aaagtttttt gttagttctg 15 taacggtgat 240 atttcaggga aatgttaaaa atgttcttgg aatatacaat tcaacctcag gtcttttgtt 300 gttgttgttc ctagaaccta gaaaacttca aacattgttg cctagttaga aaaaaatttg 360 20 aatgtggatt gctccctgta aacccccttc taggaatgac cagtaaccct ttcaaattct 420 ttcactccca gttacttcaa aaaatcatcc aaagtggtct cccaagtgag tgcctttaat 480 tagaataaaa caagagttta ttatagtttt tggttatcca cttttacttg 25 cattaacctt 540 tttttcttct tttacattta gaaagagtaa cctgctttag aatagtccct 31 1294461 tttatttaca 600 gaagctgctg atggagttaa cttctgcaga aattcttcct taaggcaaag caaaaaaagc 660 ggggaggggg tggggggaag gaagggaaaa agattctcag ggaactacag 5 cccacttgct 720 tctgtttctt agagacagaa ctgacctaaa gatgccccct ttgcgatgac ttctgggata 780 gagcagcact ctaactaggc ccccgctgcc tcatggggac cttaggcaag

tagaggagag 840 10 gcctgacaca cacacacaca cacacacaca cacacacgca cacgcgcgcg cgcgcgcaca 900 cacacacaca cagcctttca aacctagggc ctggaatgcc atcccaagag gctttagaaa 960 aaggcacagg acctttggcc tcccacctca gggtcaaagt accagttcct 15 cctctcccta 1020 gtagggagtg gagggttgga tggaggcggc cagagaagag ggaagttggg tgctggggag 1080

agagttaaca tccacgttgg tgggcgcact gcttggggtg ttaccagcga agattacgaa 1140 20 gaccccaagc tcgaatcaga agggcctctg gatgtgctag gggaggtgct tgggtgtaac 1200 tgtaagagat gggacagaga gtaagcagca aggtcaagag ggaccggggg gctcacggga 1260 gggttgaagg gtccaggctc agggtagaac tggtaaatcc agacaaggag 25 cccatggaga 1320 aggggagggg agactggaaa ccatgaaaga tcccccaccg cagcctcaga 32 1294461 aaggagagac 1380 tgagaaataa gttctcggtc tccaggtcgg ttggagtcgt gtcggagtgc cagaccatcc 1440 cccaaaagac cctctttgga atgagcctca gcaaaggcaa gctaggaggt 5 cgaaggactt 1500 ccccaggtga ctcggtctag tctagagttc gcaaagccta tcctccctgt agccgggtgc 1560 caagcagcct cgagcctgct ccccagccca cctgccaaca aaaggcgccc

tccgactgca 1620 10 acccagccct ccacagacag gacccgccct ttcccgaagt cataagacaa agagagtgca 1680 tcactgctga aacagtgggc gcacacgagc cccaaagcta gagaaaagct ggaaggggct 1740 gggggcgggg tgcaggggtg gaggggcggg gaggcgggct ccggctgcgc 15 cacgctatcg 1800 agtcttccct ccctccttct ctgccccctc cgctcccgct ggagccctcc accctacaag 1860

tggcctacag ggcacaggtg aggcgggact ggacagctcc tgctttgatc gccggagatc 1920 20 tgcaaattct gcccatgtcg gggctgcaga gcactccgac gtgtcccata gtgtttccaa 1980 acttggaaag ggcgggggag ggcgggagga tgcggagggc ggaggtatgc agacaacgag 2040 tcagagtttc cccttgaaag cctcaaaagt gtccacgtcc tcaaaaagaa 25 tggaaccaat 2100 ttaagaagcc agccccgtgg ccacgtccct tcccccattc gctccctcct 33 1294461 ίο ctgcgccccc gcaggctcct attggtggag gcccttttgg ggcagatccg ggctttatta ggtactggcc acgactgcat ggctctgcga cacaaggagt 2160 cccagctgtg gctgcccggg cccccagccc 2220 aggcacccta gggccaggga aacttttgcc 2280 ttttagcacc acggcagcag gaggtttcgg 2340 gcccgcgccc gccaggtgat acctccgccg 2400 ctgcatgtct aagtgctaga c cagccctccc gtataaatag ctaagttgga gtgacccagg 2431

<210〉 19 <211〉 26 <212〉 DNA 15 <213〉 人工合成 <220> <223> 募核苷酸引子 <400〉 19

aagcttccat ggcctcctcc gagaac 20 26 <210〉 20 <211> 24 <212> DNA <213> 人工合成 <220> 34 1294461 <223> 寡核苷酸引子 <400> 20 acctcgagaa atgtggtatg gctg

Claims (1)

1294461 第 93141016 號，96 公告本 ""ΤΓ%—一一— 1 聲1日'修(0正本 申請專利範圍: 1· 一種筛選抗肝硬化藥物之細胞模型，其包括一細胞 群，該細胞群係衍生自一肝細胞與一星狀細胞之共培養， 5 °亥"、田也群中至少有一種細胞帶有一細胞特異性調控序列以 及一報導基因核苷酸序列片段，其中，該報導基因之產物 係為一能被偵測及量化之酵素或螢光蛋白，該細胞特異性 調控序列係一肝細胞特異性啟動子或一星狀細胞特異性啟 動子，該肝細胞特異性啟動子包括白蛋白（albumin，alb) 10啟動子及α_Ι胰蛋白酶抑制酶（α-Ι antitrypsin，AAT)啟動 子，該星狀細胞特異性啟動子包括一第一型膠原蛋白 (collagen type I)啟動子。 2·如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該肝 細胞與該星狀細胞係來自人類細胞。 15 3·如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該細 胞群係共培養於一培養基及一覆有細胞外基質之基材。 4·如申請專利範圍第3項所述之細胞模型，其中該細 胞外基質係膠原蛋白（c〇llagen)或基底膜基質（matrigei)。 5·如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該細 20胞群中之該星狀細胞與該肝細胞之起始細胞種植比例係 1:10 〇 6·如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該星 狀細胞與該肝細胞之共培養係為混合共培養（mixed co-culture)或層疊共培養（separated co-culture)。 25 7·如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該白 36 1294461 蛋白啟動子之核苷酸序列係為SEQ ID NO: 3。 8.如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該α-Ι 騰蛋白酶抑制酶（α-Ι antitrypsin，AAT)啟動子之核苷酸序列 係為 SEQ ID NO: 10。 5 9.如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該第 一型膠原蛋白啟動子為COL1A1啟動子。 10.如申請專利範圍第9項所述之細胞模型，其中該 COL1A1啟動子核苷酸序列係為SEQ ID NO: 14。 *11.如申請專利範圍第9項所述之細胞模型，其中該 10 COL1A1啟動子核苷酸序列係為SEQ ID NO: 15。 12. 如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該 第一型膠原蛋白啟動子為COL1A2啟動子。 13. 如申請專利範圍第12項所述之細胞模型，其中該 COL1A2啟動子核苷酸序列係為SEQ ID NO: 18。 15 14.如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該 報導基因為β-半乳糖苦酶（β-galactosidase)、氯黴素乙醢轉 移酶（chloramphenicol acetyl transferase，CAT)、冷光酶 (luciferase)或榮光蛋白（fluorescence protein) 〇 15. 如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該 20 報導基因係為一螢光蛋白。 16. 如申請專利範圍第15項所述之細胞模型，其中該 螢光蛋白為加強型綠色螢光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP) ° 17. 如申請專利範圍第15項所述之細胞模型，其中該 37 1294461 螢光蛋白為紅色螢光蛋白（DsRed)。 18. 如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該 細胞更帶有一抗藥性基因核苷酸序列片段。 19. 如申請專利範圍第18項所述之細胞模型，其中該 5 抗藥性基因係為抗潮黴素（hygromycin)基因或抗新黴素 (neomycin)基因。 20. 如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該 細胞特異性調控序列以及該報導基因之核苷酸序列片段係 藉由微脂粒方式轉染入該細胞。 10 21.如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該 細胞更可帶有一不朽化基因核苷酸序列片段。 22. 如申請專利範圍第21項所述之細胞模型，其中該 不朽化基因係為人染色體端粒酶中的反轉錄酶之催化次單 元(Human telomerase reverse transcriptase catalytic 15 subunit，hTERT)或猿猴病毒40(Simian virus40，SV40)大T 抗原（large T-antigen，Tag) o 23. 如申請專利範圍第22項所述之細胞模型，其中該 不朽化基因核苷酸序列片段係藉由微脂粒方式轉染入該細 胞。 20 24.如申請專利範圍第1項所述之細胞模型，其中該 細胞模型係可應用於治療肝硬化藥物之篩選。 25. 一種利用細胞模型篩選抗肝硬化藥物之方法，其 步驟包括： (a)將一測試用化合物施用於一細胞模型，該細胞模型 38 1294461 係衍生自一肝細胞與一星狀細胞共培養之細胞群，該細 月己群中至少有一種細胞帶有一細胞特異性調控序列以及一 報=基因核苦酸序列片段，其中，該報導基因之產物係為 月b被偵測及£化之酵素或螢光蛋白，該細胞特異性調控 5序列係一肝細胞特異性啟動子或一星狀細胞特異性啟動 子該肝細胞特異性啟動子包括白蛋白0腕_，ALB)啟 動子及α-Ι胰蛋白酶抑制酶（心〗antitrypsin，aat)啟動子， 忒星狀細胞特異性啟動子包括一第一型膠原蛋白（collage type I)啟動子； 1〇 (b)板測该細胞模型中該細胞群之細胞活性或報導基因 表現； (c) 比較該細胞活性或報導基因表現變化；以及 (d) 分析該變化對該測試用化合物對抗肝硬化之關聯 性。 15 26.如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該白蛋 白啟動子之核苷酸序列係為SEq π) NO: 3。 27·如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該α—工 胰蛋白酶抑制酶（aj antitrypsin，AAT)啟動子之核苷酸序列 係為 SEQ ID NO: 10。 0 28·如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該第一 型膠原蛋白啟動子為COL1A1啟動子。 29·如申請專利範圍第28項所述之方法，其中該 COL1A1啟動子核苷酸序列係為犯卩ID NC): 14。 30·如申請專利範圍第28項所述之方法，其中該 39 1294461 C0L1A1啟動子核苷酸序列係為SEQ ID NO: 15。 31. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該第一 型膠原蛋白啟動子為COL1A2啟動子。 32. 如申請專利範圍第3 1項所述之方法，其中該 5 COL1A2啟動子核苷酸序列係為SEQ ID NO: 18。 33. 如申請專利範圍第28項所述之細胞模型，其中該 報導基因為β-半乳糖苷酶（β-galactosidase)、氯黴素乙醯轉 移酶（chloramphenicol acetyl transferase，CAT)、冷光酶 (luciferase)或螢光蛋白（fluorescence protein)。 10 34.如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該報導 基因係為一螢光蛋白。 35.如申請專利範圍第34項所述之方法，其中該螢光 蛋白為加強型綠色螢光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP) 〇 15 36.如申請專利範圍第34項所述之方法，其中該螢光 蛋白為紅色螢光蛋白（DsRed)。 37. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該細胞 更帶有一抗藥性基因核苷酸序列片段。 38. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該細胞 20 更可帶有一不朽化基因核苷酸序列片段。 39. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中於該步 驟（a)之前或之後更包括一步驟（a’），將一已知與肝硬化相 關之物質施用於該細胞模型。 40. 如申請專利範圍第39項所述之方法，其中該已知 1294461 與肝硬化相關之物質為硫代乙醯胺。 41·如申請專利範圍第25項所诚+ 如、曾* m * 汁魂之方法，其中該檢測 報導基因表現係藉螢光光譜儀、酵专 式細胞儀分析。 酵素聯結免疫測讀儀或流 5 42.如申請專利範圍第25項所述之方法，其 檢測細胞活性係藉螢光觀察、反轉錄聚合酶：該且 (RT-PCR)、四唾藍比色法（ΜΤΤ咖㈣或甲基藍貞^應 (methylene blue assay)方式。 期^ 分析