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TWI412742B - 藥物篩選裝置與方法 - Google Patents

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TWI412742B
TWI412742B TW95132847A TW95132847A TWI412742B TW I412742 B TWI412742 B TW I412742B TW 95132847 A TW95132847 A TW 95132847A TW 95132847 A TW95132847 A TW 95132847A TW I412742 B TWI412742 B TW I412742B
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TW95132847A
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Shih Hwa Chiou
Tung Hu Tsai
Yuh Lih Chang
Original Assignee
Taipei Veterans General Hospital
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藥物篩選裝置與方法
本發明係與藥物篩選或測試有關的裝置及方法。
多種藥物篩選的方法和設備，諸如核酸探測、螢光探測、細胞存活率分析(cell viability assay)、互補試驗(complementation assay)及使用人類幹細胞或酵母菌細胞，已經揭露在許多文獻或專利上。為了能快速及有效率地發現疾病治療，藥物篩選方法和設備正不停的在研究及發展。
與本發明特別有關的微透析技術(microdialysis)及開放式微小灌流技術(microperfusion)有共同的充滿灌注液的導管灌注，藉由開放式微小灌流技術的開放式孔眼將體液進行混合；而再透過微透析技術，藉由一層膜來進行流體交換。這層膜具有選擇性控制體液和灌注液之間的分子交換的優勢，可以在諸如分子的大小、形狀、電性等等作出篩選；然而這些特性卻會因為內生性物質(主要是蛋白質，也包括細胞)的沉積而隨著時間改變。這些沉積物的存在往往伴隨著膜在分子傳遞能力方面上的改變，而這現象亦會被反應在灌注液裡分子濃度的降低(U.S.Pat.No.7,022,071)。
除此之外，其他文獻亦指出其他多種的微透析技術方法和設備。下列美國專利揭露了許多說明性的方法和設備，而其中每一個完整的專利公開範圍皆被具體顯現在以下的參考文獻：U.S.Pat.No.6,463,312(名稱為”Microdialysis-Probe Integrated with a Si-Chip”)；U.S.Pat.No.6,091,976(名稱為"Determination of Glucose Concentration In Tissue")；U.S.Pat.No.6,030,358(名稱為"Microcatheter and Method for Site Specific Therapy")；U.S.Pat. No.5,741,284(名稱為"Dialysis Combination and Microdialysis Probe and Insertion Device")；U.S.Pat.No.5,735,832(名稱為"Reinforced Microdialysis Probe")；U.S.Pat.No.5,706,806(此中包含了一種結合了短半透性膜「改良式線性微透析探針」，而該膜部分包含了由具彈性從內部支撐或強化的纖維，該纖維穿過入口與出口而連結到長片段上)；U.S.Pat.No.5,441,481(此中包含了一種「具有主探針，如電探針，保護的微透析探針」藉此微透析探針得以與主探針同心而延展)；U.S.Pub.No.20030225067(名稱為“Microdialysis methods and applications for treatment and/or prophylaxis of tumors and/or infections in the central nervous system(CNS)and/or in other parenchymal organs”)。
大多數抗憂鬱的藥物會增加單胺類血清素(serotonin；5-羥色胺，5-hydroxytrytamine；5-HT)或去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)的濃度；這表示在5-HT/NA系統內生化的不平衡，可能導致情緒失控的發生。一種名為Moclobemide(MB)的抗憂鬱藥物，而對於單胺氧化酵素A(monoamine oxidase A)具有選擇性及可逆性的抑制，因此能增加血清素和正腎上腺素的濃度。最近的報告已經指明MB得以在慢性壓力的老鼠體中，增生調控(upregulate)海馬迴神經前驅細胞(hippocampal progenitor cell)的增殖(Li,Y.F.et al.,2004,Acta Pharmacol.Sin.,25,1408-1412)。Bonnet et al.(Bonnet,U.,et al.,2000,Neuropharmacology,39,2067-2074)也顯示細胞內pH值和CA3海馬迴神經元的神經活性的降低可以有助於MB神經保護(neuroprotective)的特性。然而，MB是否能增加神經元新生(neurogenesis)，是否促進前驅細胞的增生，以及其是否在海馬迴和中樞神經系統(CNS)裡引起專一性分化，則尚未有所定論。
藉由分離技術(Chiou,S.H.,et al.,2005,Biochem.Biophys.Res.Commun.,326,578-585)，來自成鼠海馬迴組織的NSCs被培養作為試管內藥物反應試驗的模型，以便於在闡明MB在NSCs細胞增殖和生物反應裡所扮演的角色。另外，新近研究已經顯示，促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/細胞外調節激酶 (extracellular-regulated kinase，ERK)的訊號傳遞路徑可能對於存活的神經元與憂鬱症的神經可塑性的轉譯活性及蛋白質合成是相當重要的(Einat,H.,et al.,2003,J.Neurosci.,23,7311-7316；Mercier,G.,et al.,2004,J.Mol.Nrurosci.,24,207-216；Hayley,S.,et al.,2005,Neuroscience,135,659-678)。MAPK/ERK路徑的活化可以誘使Bad(一種前細胞凋亡蛋白質)磷酸化與增加Bcl-2的表現量以達成抑制細胞凋亡(apoptosis)的目的(Choi,I.J.,et al.,2003,Infect.Immun.,2,830-837；Hayley,S.,et al.,2005,Neuroscience,135,659-678)。更進而言之，Bcl-2也是心情緒穩定劑(mood stabilizer)的作用標的，並居中媒介參與許多內生性神經生長因子(endogenous neurotrophic factor)的有利效應(Segal & Greenberg,1996；Manji & Chen,2002)。因此，吾人更進一步試圖在NSCs上研究神經保護作用和MB的分化能力，除此之外，亦探索與MAPK/ERK路徑相關的可能作用機制。
本發明係關於一種用於藥物篩選或者測試的裝置，包括：一透明容器(5)，其中包含可放置幹細胞的主體；一微透析探針具有一通道(8)與灌注液入口(9)和透析液出口(10)，且該通道包括一層透析膜(2)並位於該透明容器(5)內；一灌注液之連續來源，即自動泵浦(13)，連接該灌注液入口(9)；及一自動樣品收集器(14)，連接該透析液出口(10)用以收集透析液。
本發明之裝置進一步包括一伴隨該收集透析液容器之分析設備(14、16，如圖9C)。
本發明之裝置進一步包括一台共軛顯微鏡(15)，用以監控藥物治療效用。在較佳實施例裡，該幹細胞係為人體幹細胞。在更佳實施例裡，該幹細胞是指神經幹細胞。
如圖9，本發明之裝置，其中該透明容器(5)係以透明材質製備，以直接 觀察內部空間，該透明容器具有兩個孔洞(11)(12)以提供灌注液入口(9)和透析液出口(10)之裝設。更進一步而言，灌注液入口和透析液出口彎曲成預設角度(圖9A)以與該通道(8)之軸線交會。
本發明另關於一種用於藥物篩選或測試的方法，包括：(a)將幹細胞置於上述裝置之透明容器中；(b)使待測化合物與該幹細胞透過微透析探針在液態環境下接觸；(c)自該微透析探針之透析液出口收集透析液；及(d)分析透析液和/或觀察該幹細胞以篩選對該幹細胞有預期效果之待測化合物。
在較佳實施例裡，該幹細胞係為人體幹細胞。在更佳實施例裡，該幹細胞是指神經幹細胞。
在本發明的步驟(d)中，觀察該幹細胞係指觀察其形態改變、發育、分化、或可見之改變。又，觀察該幹細胞係在與步驟(a)相同的的透明容器(5)實施。
在本發明的方法，該預期的效應包括軸突擴增、樹突發育、神經分化和神經傳遞物質的功能釋放
並非僅限於以下的例子，其僅僅是本發明多樣的面向與特徵的的代表而已。
實施例一：材料和方法 細胞培養和神經誘發物質(NGF)
PC-12細胞(ATCC細胞系)在組織培養基(3)(圖9B)中，施以5%的馬血清、10%的胎牛血清(兩者皆來自Gibco)、以及2-mM的L-麩氨醯氨(L-glutamine)(Sigma，St.Louis，MO，USA)調配而成的RPMI 1640(Gibco，Grand Island，NY，USA)，促使其生長。對於神經誘發來 說，PC-12細胞被培養在一每平方公分有2-8×104個細胞的相對較低密度，且事先以1μg/ml的纖維連接素(fibronectin)(Gibco)覆蓋上的培養基(3)中。在鋪上去後兩個小時之後，以由0.25%的牛血清清蛋白(BSA，Sigma)和50 ng/ml的NGF(R&D系統，Minneapolis，MN)組成的DMEM/F 12(Gibco)替換了先前的基質，誘發神經分化。
化學物品和試劑
從Sigma化學公司購買DA和單胺類血清素(serotonin；5-羥色胺，5-hydroxytrytamine；5-HT)。從E.Merck(Darmstadt，德國)獲取液體層析級的甲醇和反應試劑。將三重去離子水(Millipore,Bedford,MA,美國)全數用於製備。標準貯存DA和5-HT溶液在濃度10μg/m的貯存溶液中製備，其中該貯存溶液係由0.1 M高氯酸(perchloric acid)組成，並儲存在-70℃的暗室中。對於每日配置標準混合物來說，這些貯存溶液部份會在4℃融化，而稀釋到該含有0.1M高氯酸的溶液的合適濃度。
細胞存活率分析
PC12細胞在24 well的培養基(3)中生長，其中每個well密度係在RPMI-1640培養基上，2×104個細胞/well，且以methyl thiazol tetrazolium分析法(MTT分析；Sigma-Aldrich Co.)測試細胞存活率。PC12細胞然後與0.25 mg/ml MTT一起在37℃中培養4個小時，並且這項反應係以加入100%的異丙醇而結束。MTT formazon結晶物的量則是透過微盤分析儀(Microplate Reader)者以及在560nm的吸光度(SpectraMax 250,Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)測得。
即時反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)
對於即時RT-PCR而言，如先前所述(Kao,C.L.,et al.,2005,Mol.Pathol.,18,769-778)，全部的RNA皆係以RNAeasy kit(Qiagen,Valencia,CA,USA)萃取。簡言之，每個樣品的總RNA(1μg)皆在20μL的0.5μg oligo dT和200 U Superscript II RT(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中進行反轉錄。放大效應則是在總體積20μl中進行，其中含有0.5μM的每個引子、4mM MgCl2、2μl LightCyclerTM -FastStart DNA Master SYBR green I(Roche分子系統，Alameda，CA，USA)以及1：10稀釋的cDNA。在未知樣本中定量的工作則是透過LightCycler Relative Quantification 3.3版的軟體(Roche分子系統，Alameda，CA，USA)完成。在每個實驗過程中，GAPDH輔助工作基因被作為一個參考標準而被放大。GAPDH引子被如下設計：GAPDH(f)：GGGCCAAAAGGGTCATC ATC(nt 414-434,GenBank accession no.BC059110.1),GAPDH(r)：ATGACCTTGCCCACA GCCTT(nt 713-733)。其他目標基因引子則如下：Bax(f)：GTGGTTGCCCTCTTCTACTTTGC(nt 328-351,GenBank accession no.NM_017059.1),Bax(r)：GAGGACTCCAGCCACAAAG ATG(nt 522-544).Bcl-xL(f)：CAGCTTCATATAACCCCAGGGAC(nt 402-425,GenBank accession no.U72350.1),Bcl-xL(r)：GCTCTAGGTGGTCATTCAGGTAGG(nt 586-610).Bcl-2(f)：TGTCAC AGAGGGGCTACGAG(nt 302-321,GenBank accession no.L14680),Bcl-2(r)：GAGCGATGTTGTCCACCAGG(nt 729-748).MAP2(f)：GTTTACATTGTTCAGG ACCTCATGG(nt 316-341,GenBank accession no.U12008.1),MAP2(r)：TCGGTA AGAAAGCCAGTGTGGT(nt 551-573).Fas(f)：AGAGCTGTGGCTACCGGTGAT(nt 301-322,GenBank accession no.NM_012908.1),Fas(r)：AGAGGGATGGACCT TGAGCG(nt 524-544).TH(f)：TTCTGGAACGGTACTGTGGCTA(nt 1140-1161,GenBank accession no.L22651),TH(r)：TGGGAGAACTGGGCAAATGT(nt 1397-1416)；AADC(f)：AAGAGGGAAGGAGATGGTGGAT(nt 79-100,GenBank accession no.U31884),AADC(r)：AGCCCAGGAGAAGCCAATGC(nt 354-373)。製備反應係以雙股並且加熱到95℃，持續10分鐘；隨後再在95℃的環境下，進行40個分離(denaturation)循環10秒鐘，55℃下引子煉合(annealing)5秒鐘，以及在72℃下的引子延伸(extension)20秒。全部的PCR反應皆已雙股模式操作。在每個樣本中，為每個目標基因以及內生參考物(GAPDH)繪製了標準曲線(循環臨界值對模股濃度)。為了確認PCR反應的專一性，PCR產物是在1.2%的膠體進行電泳。
Bcl-2 RNA干擾現象
Ambion股份有限公司(Austin,TX,USA)化學合成了Bcl-2的雙股、短干擾RNA(siRNA)，並且單股序列和其互補序列(sense and antisense sequences)設計如下：Sense：GCGCUGGAUAUAACUUCUUtt；Antisense：AAGAAGUUAUAUCCAGCGCtt，從Bcl-2序列的第137個核苷酸開始(accession number L14680)。轉移感染siRNA則係使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，根據廠商的說明書操作。簡之，以0.25%的胰蛋白酶(trypsin)、1 mM溶於磷酸緩衝鹽且無Ca2+、Mg2+存在的EDTA獲得細胞，並鋪在6 well的培養皿中，每平方公分105個。然後3.5μl的siRNA(100μM的溶液)與125μl的無血清的培養基在室溫下混合5分鐘。在這段孕育的期間，5μL的Lipofectamine 2000在無血清的培養基中被稀釋了。這兩種混合物結合、慢慢地混合，並且，20分鐘後，在室溫下孕育為複雜的形態。該205μl的siRNA-Lipofectamine混合物接著被加入到一最後每個well 2.5 ml體積的細胞中。被轉移的細胞每天以新的基質培養，直到他們被分析。
酵素鍵結免疫呈色分析法((ELISA)及TUNEL分析
ELISA工具確定了caspase 8和3的活性(Medical & Biological Laboratories Co.,Ltd.,Nagoya,Japan)並且以A490 nm的偵測儀定量(MRX；Dynatech Laboratories,Chantilly,VA)。每個個別的樣品分析三次。在組織切片裡的細胞凋亡細胞則被以TUNEL方法辨識。(In Situ Cell Death Detection Kit,POD,Roche Boehringer Mannheim Corp.,IN,USA)。簡而言之，蓋玻片下的那些細胞係以1X PBS清洗，加上4%的三聚甲醛(paraformaldehyde)固定10分鐘，以0.1%的triton X-100滲透5分鐘，最候和提供的TUNEL試劑一起培養1小時。接著，呈色發生與3-amino-9-ethyl-carbazole一併被應用，並且玻片以H&E染色複染。
免疫螢光染色法
一種avidin-biotin複合物的方法用於在已分化的PC12細胞裡，做免疫螢光染色法。以3%的過氧化氫和疊氮化鈉洗滌之後，使用微波挽回抗原性。然後每個玻片以Bcl-2(Chemicon,Temecula,CA,USA)、MAP2(微管相關蛋白-2，microtubular associated protein-2.Chemicon,Temecula,CA,USA)以及TH(酪胺酸水解酵素，tyrosine hydroxylase,Chemicon,Temecula,CA,USA)的抗體處理。免疫反應信號被一種生物 素化的二級抗體rabbit antimouse IgG和Fluoesave(Calbiochem,La Jolla,CA,USA)的混合物偵測到，並且以紅螢光的信號指明了陽性的免疫反應。
微透析技術
微透析技術系統係由一基本的微透析技術幫浦，即自動泵浦(13)(CMA/100 model,CMA,Stockholm,Sweden)、一餾分收集器，即自動樣品收集器(14)(CMA/140)以及微透析探針(2)，全被鞏固到有蓋透明容器(5)上(圖9B)。連接到有蓋透明容器的微透析取樣技術係根據最初被程等人描述而在我們自己的實驗室建造(Cheng et al.,2000；Wu et al.,2000)；而且一個相似的系統也被報導出已被Miyamoto、Schams(Miyamoto and Schams 1991)和Maas等人(Maas et al.,1992)使用。透析探針係以30mm長的透析膜(2)做成(圖9B)，外徑150μm和名義上13000的切割分子量(Molecular Weighe Cut Off)。林格氏液(Ringer solution，8.6 g/l NaCl，0.3 g/l KCl和0.33 g/l CaCl2)以2μl/分的流速穿過探針而佈滿。微透析樣品每10分鐘收集一次。
HPLC-ED
由帶有Ag/AgC的3電極電池作為參考電極用、一個輔助電極和一個石墨電極作為工作電極組成的型號HTEC-500的HPLC-ED系統(16)(圖9C)((Eicom,Kyoto,Japan)，被拿來測量DA和5-HT。實驗運用了一個有25μm厚的墊片及控制電位(applied potential)定值在相對於Ag/AgCl+450mV的石墨工作電極。用於分離的管柱則是室溫25℃下的PP-ODS(4.6 x 30mm)(Eicom,Japan)。移動相係由0.1 M鈉磷酸鹽緩沖液(0.1 M NaH2PO4：0.1 M Na2HPO4=1000：160，v/v)、1%的甲醇、500 mg/l的sodium secanesulfonate和50 mg/l的EDTA組成，再以5 M的NaOH以每分鐘0.5 ml的流動速率調整其pH值為6.0。10μl的注射體積則是在相同的取樣日手動注入。
試管內微透析技術的回收率
一個在試管內的實驗被用來計算該微透析探針的相對的回收率和可變性。微透析探針(2)(圖9B)被放在培養基質中，其包含了25和50 ng/ml 的DA和5-HT。相對回收率(回收率試管內=Cout/C基質，Cout是在透析液裡每個分析液的濃度，而C基質則是在有蓋透明容器裡的分析液濃度)係比較電化學檢測儀偵測到的DA和5-HT層析圖中的峰(peak)下面積(Cheng,F.C.,et al.,2000,J.Chromatogr.A,870,405-411)。
實施例二 NGF增加PC12細胞的存活率和促進神經分化
PC12細胞的存活率係透過MTT還原分析。PC12細胞分別暴露於濃度0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100和200 ng/ml的NGF 24、48和72小時(h)。如圖10中的A、B和C所示，細胞的增殖在50 ng/ml NGF處理過的PC12細胞內有顯著增加(p<0.05)。當NGF的濃度是比80 ng/ml還低的時候，細胞存活率並未顯著減少(圖10中的A-C)。當NGF的濃度增加到200 ng/ml時，PC12細胞的存活率，在24小時時減少了大約20%，48小時時減少了30%，72小時時則減少了45%(p<0.05；圖10 D)。因為50 ng/ml的NGF被顯示可增加細胞存活率(圖10 A-D)，所以選擇濃度50 ng/ml的NGF進行更進一步實驗。
為了調查NGF在PC12細胞樹突的發育和神經分化裡所扮演的角色，這些細胞被放在覆有纖維連接素(fibronectin)薄層的培養皿中內培養，然後以濃度的50 ng/ml的NGF處理。在NGF的刺激之前，PC12細胞的形態是小且呈現卵圓形(圖11A)。在48小時之後，NGF處理的PC12細胞呈現神經炎並且分化出帶有長突起的樹突型態(圖11B)。微管相關蛋白-2(MAP-2，神經元標記)的蛋白質表現被更進一步評價並且分析(圖11C)。透過使用免疫螢光分析法，MAP-2的信號(圖11C)在第7天，以NGF處理過的PC12細胞中有顯著的增加(p<0.05；圖11D)。這些結果支持了NGF的刺激誘導在樹突形成和神經元分化中扮演重要角色的想法。
以即時RT-PCR偵測NGF處理過的PC12的基因表現
為了調查NGF在已分化的PC12細胞的基因表現中所扮演的角色，以即時RT-PCR偵測第1、3、5天，已用NGF處理過的PC12細胞中的Bax(前 細胞凋亡基因)、Bcl-XL(抗細胞凋亡基因)、Bcl-2(抗細胞凋亡基因)、MAP2及Fas的基因表現。在第1、3、5天，已被NGF處理過的PC12細胞的Bcl-XL和Bcl-2的mRNA表現較沒有NGF處理過的，有相當的向上調控(up-regulation)(圖12A)。但是Bax和Fas兩者的表現卻非都在已用NGF處理過的和未用NGF處理過的PC12細胞的第1、3、5天中被活化。(圖12A)。而且，透過使用免疫螢光染色，MAP2(圖12B)和Bcl2(圖12C)表現的陽性訊號在第3天的以NGF處理的PC12細胞中被偵測到(圖12 B、C和D)。
實施例三 透過ELISA、TUNEL分析和SiRNA方法評估在以NGF處理的PC12細胞中FasL所誘導的抗細胞凋亡活性
PC12細胞本質上在細胞膜上表現了Fas/FasL系統和Fas(CD95)的受器，因而為Fas依賴型細胞凋亡的研究提供了一個生理模型。被NGF誘發的Bcl-2向上調控是否會在NGF處理過的PC12細胞中，增加或者減少Fas依賴型的細胞凋亡現象。進行FasL誘導細胞凋亡的研究(FasL的重組蛋白200 ng/ml，；Upstate Biotechnology；NY,USA)，然後重複的樣品加入NGF處理過的PC12細胞培養皿中48個小時。在FasL重組蛋白處於暴露的狀態下，我們的數據顯現了caspases 8和3的細胞凋亡活性，在NGF處理的該組顯著較未以NGF處理的組減少(p<0.05；圖13A和B)。恰和caspases 8和3的數據一致，TUNEL分析的結果更進一步得到NGF的處理能在以NGF處理過的PC12細胞內防護FasL誘發的細胞凋亡(圖13C)，但在非NGF處理過的PC12中則無(圖13C)。我們的結果顯示，caspase抑制劑Z-VAD-fmk(泛caspase抑制劑；40μM)在PC12細胞中，透過caspase 8、caspase 3和DNA DNA片斷化的活性抑制，可防止Fas誘發的細胞凋亡(圖13A-C)。除此之外，藉由使用抑制Bcl-2的SiRNA，Fas誘發的細胞凋亡活性在FasL和NGF處理的PC12結合物中被顯著提高(p<0.05；圖13A-C)。這個結果確認了NGF在PC12裡，透過Bcl-2的活性而阻止了Fas誘導的caspase依賴型細胞凋亡。
實施例四 NGF對PC12細胞樹突發育的影響
為了調查在PC12細胞中，NGF在神經元分化中的角色，未被處理的PC12細胞(圖14 A)被培養在覆有纖維連接素薄層的培養皿內，然後加入50 ng/ml的NGF。吾人在PC12細胞中觀察7日內的形態發育(突起、突起長度和原始樹突的數量)。如圖14B所示，處理過的PC12細胞呈現出了突起，並且分化成有著長突起的樹突形成。而且，在第1、3、5天，突起、突起長度和的主要dendrities的數量，在NGF處理PC12細胞中有較在非NGF處理的PC12細胞內顯著增加(p<0.05；圖14D、E和F)。為了測試NGF刺激的突起發育是否是被Bcl-2的表現所調節或抑制，SiRNA方法被使用，並且我們數據確認了NGF處理的PC12細胞突起發育與只已NGF處理的PC12相較，有顯著地被Bcl-2 SiRNA的轉移感染所抑制(圖14 C、D、E和F)(p<0.05)。
實施例五 層析
圖15A是DA和5-HT標準溶液的層析圖，其中每個的濃度皆是100 ng/ml。圖15B則是分別從基質濃度為6.04和0.18 ng/ml的DA和5-HT的非誘導PC12細胞培養基中所收集的透析液的層析圖。圖15C則係在覆有polyornithine/laminin薄層的培養皿與PC12細胞的NGF誘導後，所收集含有46.9 ng/ml的DA和2.84 ng/ml的5-HT的樣本層析圖。該分析物使用目前的層析狀況而被很好地分離。顯然DA和5-HT在滯留時間(retention time)分別為1.7和3.9分鐘的情況下，仍被處理得很好且避免了來自培養基中的透析液的干擾。透析液的總進行時間(run time)是5分鐘。與我們先前的報告相比(Cheng,F.C.,et al.,2000，J.Chromatogr.A,870,405-411)，這項結果已經將進行時間從30分鐘縮短成為了5分鐘，而且DA和5-HT的代謝物因管柱物質的獨特設計(PP-ODS,Eicom,Japan)而不大會殘留在管壁上。
準確度與精密度
該分析的精密度和準確度被DA和5-HT的標準混合物所檢驗。內部和外部變異性分析係以6次重複所確定，並以相對標準差表示(RSD%)精密度與準確度的偏差百分比。該分析的外部和內部分析準確度和精密度在DA和5-HT濃度為0.1、5和100 ng/ml時，不到10%(表格1和2)。
觀察濃度係以平均值±標準差表示之。
觀察濃度係以平均值±標準差表示之。
偵測與定量測定的線性、回收和限制
校正曲線圖的最小線性平方回歸分析顯現了在0.05-100 ng/ml的範圍間，反應和DA與5-HT T公稱濃度之間的線性關係。對於DA和5-HT，其線性方程式分別是y=24504x+1603.2和y=30537x+2566.6。相關係數則是比0.995高。垂直軸y是峰下面積，水平軸X則是分析物濃度的量，單位為ng/ml。在PC-12細胞培養皿的微透析探針的DA和5-HT，其試管內回收率分別是31.62±1.21%和23.77±1.05%，其基準是DA和5-HT的25和50 ng/ml濃度(表3)。對於DA和5-HT的檢測限制(LOD)，在濃度0.01 ng/ml時，其訊號與雜訊比為3。定量測定(LOQ)的限制則是DA和5-HT的線性範圍的最低濃度0.05 ng/ml。
實施例六 偵測在NGF處理過的PC12細胞中的多巴胺濃度
透析液樣品每隔20分鐘，即從該培養皿中收集並且接著進行分析。圖16顯現了DA和5-HT從PC-12細胞中釋放。在10個小時的培養時間後，NGF被加進PC-12細胞的培養皿中。在加入NGF之後的第6個小時，DA和5-HT的濃度有顯著增加。這個結果暗證了DA的水平遠遠高於被培養基所引起的5-HT水平，並且NGF有助於DA從PC-12細胞釋出。為調查NGF在已分化的PC12細胞中基因表現所扮演的角色，酪胺酸水解酶(tyrosine hydroxylase；TH)芳香族脫羧基酶(aromatic acid decarboxylase；AADC)和Bcl-2的基因表現，透過RT-PCR，在第0、12、24以及36小時，在NGF處理過的PC-12中偵測到。根據HPLC的結果，在NGF處理過12小時的PC12細胞中，其TH和AADC的表現較未以NGF處理者有顯著的向上調節(圖16B)。增加的TH和AADC的RNA量皆與PC12細胞以NGF處理過後的時間呈現正相關(圖16A和B)。有趣的是，Bcl-2(一種抗細胞凋亡基因)在NGF處理過24小時後的PC12細胞中被表現了(圖16B)。透過使用SiRNA方法，DA產物專一地在NGF處理過 的第24小時和第36小時內的PC12細胞中，被Bcl-2 SiRNA的轉移感染所抑制(圖17)。
實施例七
在本發明中，透過MTT分析證明了濃度50 ng/ml的NGF能增加細胞存活率和促進細胞增殖(圖10)。RT-PCR的結果則顯示了NGF誘導能向上調節MAP-2、Bcl-XL和Bcl-2基因的表現；但Bax則否(圖11)。透過ELISA和TUNEL分析，我們的數據更進一步地確認了50 ng/ml NGF處理過的PC12細胞能防止FasL誘導引起的細胞凋亡，但在未以NGF處理的PC12細胞中則否(圖13)。更重要的是，藉由即時、連續的微透析技術與液態層析和電化學的評估，我們提供了TH、AADC和Bcl-2的基因表現與DA在NGF處理過的PC12細胞中釋放的時間呈現正相關的證據(圖16)。因此，向上調控的Bcl-2在NGF處理的PC12細胞表現更進一步暗示了神經保護和神經分化，以及突起擴大的刺激，在PC12細胞的發育過程中起關鍵的作用。
關於NGF對PC12細胞的影響的詳細機制，在本研究中發現了提高的Bcl-2轉譯和轉錄水平。Bcl-2，一種抗細胞凋亡基因蛋白質，最近已被辨識出其為神經細胞死亡的抑制物，並且在由化學損傷和組織缺氧所引起的神經細胞死亡辦演了重要的關鍵(Myers,K.M.,et al.,1995，J.Neurochem.,65,2432-2440)。Manakova(Myers,K.M.,et al.,1995,J.Neurochem.,65,2432-2440)所提供的一流研究中，指出在帕金森的疾病模型中，Bcl-2蛋白質能保護6-OHDA誘發的神經毒性和細胞凋亡。如圖13所示，我們發現NGF透過bcl-2的活化在PC12細胞中增加了抗細胞凋亡的活性。透過使用SiRNA方法，細胞凋亡的活性(caspase 8、casepase 3以及TUNEL)與NGF/FasL處理的PC12細胞相比，在NGF/FasL/Bcl-2 SiRNA處理的PC12細胞有顯著的增加(圖13)。因此，NGF處理的PC12細胞的神經保護能歸功於Bcl-2的活化和防護FasL誘發的細胞凋亡。
更進一步而言，Bcl-2的基因活化能幫助神經傳遞物質的形成、神經元 的產生和神經分化(Myers,K.M.,et al.,1995,J.Neurochem.,65,2432-2440；Manji,H.K.,et al.,2001,Nat.Med.,7,541-547)。最近的研究證明，Bcl-2的表現不僅在神經保護中起作用，也與胚胎幹細胞分化成多巴胺神經元的觸發有關。初步的死後大腦研究已經顯示，Bcl-2可能在情緒失控時有所參與，並且Bcl-2的向上調控將施加營養效應，而在治療情緒失控過程中提升細胞的彈性(Bachmann,R.F.,et al.,2005,Mol.Neurobiol.,32,173-202 Review；Manji,H.K.,et al.,2001,Nat.Med.,7,541-547)。另外，Bcl-xL，一抗細胞凋亡基因，是Bcl-2家族成員並能刺激鼠胚胎細胞分化成多巴胺和色氨酸神經元。這項Manjii等人的研究提供了Li+的調控能強烈地增加Bcl-2的表現，並且在臨床前的案例中，對神經可塑性和神經保護產生影響。Hayley等人更進一步提出，Bcl-2表現的減少不僅削弱了神經元新生，也減少了在沮喪和慢性緊張性刺激的暴露下，神經分岔的過程(Hayley,S.,et al.,2005,Neuroscience,135,659-678)。根據這些結論，我們的結果顯示了，在PC12細胞中，NGF能向上調控mRNA和Bcl-2蛋白質的表現(圖12和16)。而且，我們還證明了NGF能促進神經元分化(MAP-2陽性細胞；圖11)與促進神經軸突的發育(突起、突起長度和原始樹突的數量；圖14)。另外並附帶觀察了神經分化和被NGF誘發的色氨酸的功能性釋放(圖16A)。這些觀察暗指了NGF可能在細胞增殖、突起生長和CNS神經的可塑性的某些形式中起關鍵作用。除此之外，藉由使用SiRNA方法，我們的數據更進一步確認了軸突發育和NGF處理的PC12細胞中DA的釋放是由Bcl-2的活性調控的。
總之，在NGF處理的PC-12細胞中，目前研究的結果替DA釋放的和基因表現的即時偵測提供了直接證據。向上調控的Bcl-2在NGF處理的PC12細胞中的表現更進一步暗示了在神經分化以及突起的擴增刺激中，扮演了多巴胺神經元發育和功能性過程中的關鍵角色。而且，我們的研究支持以下的想法：試管內監控模式可視為一在藥物效應研究中，發現新機制和篩選基因的有價值工具。
實施例八 新設備的方法和描述
圖9顯示(A)微透析設備、自動泵浦、自動樣品收集器和CO2細胞培養器。(B)有蓋透明容器的微透析系統示意圖。(1)：導引管；(B2)：(30 mm長)的透析膜；(3)：培養基；(4)：有蓋透明容器的蓋子；(5)：有蓋透明容器本體；(6)：PE-10；(7)：底部流通管；(8)：通道；(9)灌注液入口；(10)：透析液出口。(C)即時評估系統。
圖15顯示(A)以HPLC-ED方法測得的標準DA和5-HT在每一50ng/ml的濃度。(B)從非誘發的PC12細胞基質，伴隨6.04ng/ml和0.18ng/ml的DA和5-HT，取得的透析液樣品。(C)收集在以HPLC-ED分析PC12細胞的NGF誘發後的分析液樣品，其中包含50.06ng/ml的DA和2.94ng/ml 5-HT。
據報導，其係用於神經保護、神經分化和神經元新生裡篩選可能藥物的一個新穎系統。首先，神經幹細胞(NSCs)在透明容器(細頸瓶)中培養，並且在CCD共軛顯微鏡系統下觀察細胞發育和分化(圖4、5、7、11以及14)。與微透析技術和HPLC-ED方法相結合，包括在NSCs中的突起增擴、樹突發育、神經分化和神經遞質(多巴胺和5-HT)功能性釋放等等的藥物處理效應，可以真正的即時和同時地以這新設備監控(圖9)。
當本發明已提供充足的描述與實施例的細節，而足被本技術領域中具有通常知識者的所能製造和運用時，各種替換、修改和改進應該顯然不能背離本發明的精神和範圍。
本技術領域中具有通常知識者會很快的體會到，本發明對於實施標的與獲得前述的結果和優勢係相當地合適，且那些固有的特性亦是。胚胎、動物和生產他們的過程和方法是較佳的實施例代表、模範，且並不能被當成為本發明的範圍上的界限。本技術領域中具有通常知識者將可能有從其中修改與用作其他用途之情事。這些修改包含在本發明的精神內並且在專利申請範圍中被確定。
圖1 顯示神經幹細胞(NSCs)的培養以及藉由MTT評估MB試驗下，NSCs細胞生存率的評估。(a)NSCs在無血清的培養基質中聚集形成神經球(neurosphere)。(b-d)以免疫螢光分析技術(immunofluorescent assay)(比例條：50 mm)偵測在神經球裡的巢蛋白(nestin)(b和d：紅色螢光)和DAPI(c：藍色螢光；d：融合影像)的表現。(e-f)GFAP-陽性細胞(e：綠色螢光)及MAP-2陽性細胞(綠色螢光)在分化的NSCs裡被偵測到(比例條：20 mm；a-f係進行三個獨立的實驗)。(g)使用MTT分析法分析NSCs的細胞生存率。NSCs分別以0,10,25,50,75,100,200，以及400 mM的MB做24、48和72小時的處理。數據(六個獨立實驗的平均值7標準差)以控制的百分比值(不加入MB)表示。與控制組作比較，*P<0.05。(h)NSC細胞的生長曲線：在6公分的培養皿上，平鋪104個NSCs細胞，分別加有MB或不加入MB。在以50和200 mM的MB處理，經過24、48及72小時後，以血球計數器(hemocytometer)計算NSCs細胞的數量，每個點計算3次。0.1%的DMSO係用來控制載體(vehicle control)。
圖2 顯示以即時RT-PCR與免疫螢光分析技術偵測到Bcl-2在MB處理過的NSCs細胞中的表現量。(a)透過即時RT-PCR與免疫螢光分析技術偵測MB處理後第1、3、5天的NSCs細胞內，Bcl-2、Bcl-xL、MAP-2和巢蛋白的RNA之表現量。這裡的數據是以三個實驗的平均值±標準差表示。C：控制組；M：MB；與控制組(不加入MB)作比較，*P<0.05，**P<0.01。(b)透過免疫螢光分析技術辨識出在有以MB處置與未以MB處理的NSCs細胞內，Bcl-2(b、d、e和g；紅色螢光)、DAPI(c、d、f和g；藍色螢光)和融合影像的的正面訊號(比例條：100 mm；b-g係是三個獨立進行的實驗)。
圖3 顯示出FasL所引起的細胞凋亡活性，在有以moclobemide處理與未以之處理的NSCs細胞中的評估。(a)以流式細胞技術(flow cytometry)，分別在以MB處理過後的NSCs細胞與和未以MB處理過的細胞中，測量annexin-5的活性。(b、c)以ELISA發現caspase 8和caspase 3的細胞凋亡活性。(d)以TUNEL分析出DNA斷片化的嚴重。對照組(Ctl：未加入FasL；在a-d的第一欄中)未以MB處理的、NSCs組(no MB；在a-d 的第二欄中)以及以MB處理的NSCs組(在a-d的第三欄中)。這裡顯示的數據係三個實驗的平均值±標準差；**P<0.01。
圖4 顯示MB對突起(neurite)的發育和擴大之影響。(a-d)以MB處理的NSCs(箭頭處)呈現了突起的特性，並且分化成帶有長突起的樹突形成(箭頭：原始分支；比例條：40 mm)。觀察並測量NSCs分別以MB處理或不以MB處理的培養皿，在第1、3、5、7天時的(e)突起的數量、(f)突起的長度、和(g)神經分化的原始樹突的形態發育。這裡顯示的數據係三個實驗的平均值±標準差；與控制組(不帶MB)相較，*P<0.05；**P<0.01。0.1%的DMSO係用來控制載體(vehicle control)。
圖5 顯示caspase抑制劑和PD98059對於有和沒有MB處理的NSCs的影響。(a)檢查ZVAD-FMK(泛-caspase抑制劑)、Z-DEVD-FMK(caspase-3的選擇性抑制劑)以及PD98059(ERK1/2抑制劑)的對NSCs的處理效應。這裡顯示的數據係三個實驗的平均值±標準差。控制組：沒有MB處理。(**P<0.01；MB處理過的NSCs與對照組相比)(#P<0.01；PD98059處理過的NSCs與對照組相比)。(b)PD98059明確地抑制分化的NSCs的突起發育。(c)在MB處理過的NSCs裡觀察神經形成和突起擴張(比例條：30 mm)。0.1%的DMSO係用來控制載體(vehicle control)。
圖6 顯示MB透過ERK1/2在NSCs內磷酸化作用調控Bcl-2的表現。(a)以西方轉印法偵測在沒有以MB處理的NSCs中，第1、3、5天的Bcl-2、磷酸化的ERK1/2和全部ERK1/2的總蛋白質數量。(b)在第3天和第5天，以MB處理過的NSCs中，Bcl-2和磷酸化的ERK1/2的表現被調節了(沒有加入PD98059)。(c)在以MB處理過的NSCs中，Bcl-2和磷酸化的ERK1/2的表現量被PD98059明確抑制。這裡顯示的數據係三個實驗的平均值±標準差。**P<0.01。
圖7 顯示MB促使NSCs分化成血清胺酸神經元。(a)以免疫螢光分析法在相同的已分化的NSCs裡，偵測5-HT(綠色螢光)MAP2(紅色螢光)以及DAPI(藍色螢光)的蛋白質表現量(比例條：20 mm)。以免疫螢光訊號測量(b)5-HT-陽性細胞、(c)MAP2陽性細胞和(d)5-HT/MAP2陽性細胞在 理和沒有MB處理的NSCs中百分比。(b，c)5-HT陽性細胞和MAP2陽性細胞在MB處理的NSCs中的誘發發生率。PD98059顯著地抑制MB。這裡顯示的數據係三個實驗的平均值±標準差。(* P<0.05，**P<0.01；MB處理組與非MB處理組相比)(#P<0.05，#P<0.01；MB與PD98059處理組與單純MB處理組相比)。0.1%的DMSO係用來控制載體(vehicle control)。
圖8 顯示以HPLC-ECD偵測NSCs培養皿中5-HT的含量。典型的層析圖係從以下獲得：(a)含有3，4-dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC；5.2分鐘)、多巴胺(dopamine、DA；6.87分鐘)、hydroxyindoleacetic acid(5-HIAA；7.78分鐘)、homovanillic acid(HVA；10.90分鐘)和5 hydroxytryptamine(5 HT；15.67分鐘)的標準混合物；分析在20分鐘內完成。(b)從純培養基中獲得基線(baseline)。(c)從MB處理的NSCs皿中使用微透析設備收集透析液樣品。(d)以HPLC-ECD測量在用MB和沒有MB處理的NSCs的培養基中的5-HT在第1、3、5、7天的含量。這裡顯示的數據係六個實驗的平均值±標準差。(* P<0.05，**P<0.01；MB處理組與非MB處理組相比)(#P<0.05，#P<0.01；MB和PD98059處理組對純MB處理組)。0.1%的DMSO係用來控制載體(vehicle control)。
圖9 顯示(A)微透析設備、自動泵浦、自動樣品收集器和CO2細胞培養器。(B)有蓋透明容器的微透析系統示意圖。(C)即時評估系統。(1)：導引管；(2)：(30 mm長)的透析膜；(3)：培養基；(4)：有蓋透明容器的蓋子；(5)：有蓋透明容器本體；(6)：PE-10；(7)：底部流通管；(8)：通道；(9)：灌注液入口；(10)：透析液出口；(11)：孔洞；(12)：孔洞；(13)：自動泵浦；(14)：自動樣品收集器；(15)：共軛顯微鏡；(16)：HPLC-ED系統。以HPLC-ED的微透析分析法同時監控在CCD共軛顯微鏡下的神經幹細胞突起的分化(突起的數量、長度和原始樹突)和DA與5-HT的濃度。
圖10 顯示PC12細胞在暴露於NGF24、48和72個小時的(A)~(C)細胞存活率和(D)細胞數目。這裡顯示的數據係六個實驗的平均值±標準差。(#P<0.05，#P<0.01)。
圖11 顯示(A)在NGF處理前PC12細胞的形態，(B)PC12細胞在NGF處理後48小時的形態，(C)細胞的MAP2表現量，與(D)MAP2陽性細胞的百分比。
圖12 顯示(A)Bax(前細胞凋亡基因)、Bcl-XL(抗細胞凋亡基因)、Bcl-2(抗細胞凋亡基因)、MAP2和Fas在有NGF處理和未以NGF處理的第1、3、5天時的(C)PC12細胞中的基因表現，以及(B)~(D)在以NGF處理後3天的PC12細胞內MAP2和Bcl-2陽性訊號的螢光染色。這裡顯示的數據係三個實驗的平均值±標準差；*P<0.05。
圖13 顯示在NGF處理過的PC12細胞中，對FasL引起的抗細胞凋亡活動的評估。(A)caspase 8的相對活性，(B)caspase 3的相對活性，以及(C)TUNEL的相對活性。這裡顯示的數據係三個實驗的平均值±標準差；*P<0.05，#P<0.05。
圖14 顯示NGF對PC12細胞的樹突發育的影響。(A)未經處理的PC 12細胞，(B)NGF處理，伴隨著以箭頭指出樹突形成的PC12細胞，和(C)被Bcl-2 SiRNA轉移感染抑制神經發育的NGF處理過的PC12細胞。(D)~(F)顯示在以NGF處理過後的第1、3、5天的PC12細胞，突起的數量、長度和原始樹突較未以NGF處理者顯著增加。這裡顯示的數據係三個實驗的平均值±標準差；*P<0.05，**P<0.01，#P<0.05。
圖15 顯示(A)以HPLC-ED方法測得的標準DA和5-HT在每一50ng/ml的濃度。(B)從非誘發的PC12細胞基質，伴隨6.04ng/ml和0.18ng/ml的DA和5-HT，取得的透析液樣品。(C)收集在以HPLC-ED分析PC12細胞的NGF誘發後的分析液樣品，其中包含50.06ng/ml的DA和2.94ng/ml 5-HT。
圖16 顯示(A)DA和5-HT從PC-12細胞裡釋放。這裡顯示的數據係三個實驗的平均值±標準差。(B)在NGF處理後的第0、12、24、36小時，PC12細胞裡各種酵素的基因表現
圖17 顯示DA在PC12細胞有或沒有NGF處理後的第12、24、36小時的產量。
(1)‧‧‧導引管
(2)‧‧‧透析膜
(3)‧‧‧培養基
(4)‧‧‧有蓋透明容器的蓋子
(5)‧‧‧有蓋透明容器本體
(6)‧‧‧PE-10
(7)‧‧‧底部流通管
(8)‧‧‧通道
(9)‧‧‧灌注液入口
(10)‧‧‧透析液出口
(11)‧‧‧孔洞
(12)‧‧‧孔洞
(13)‧‧‧自動泵浦
(14)‧‧‧自動樣品收集器
(15)‧‧‧共軛顯微鏡
(16)‧‧‧HPLC-ED系統

Claims (12)

  1. 一種用於藥物篩選的裝置，包括：(a)一透明容器，其中包含可放置幹細胞的主體；(b)一微透析探針具有一通道與灌注液入口和透析液出口，且該通道包括一層透析膜並位於該透明容器內；(c)一灌注液之連續來源，連接該灌注液入口；及(d)一容器，連接該透析液出口用以收集透析液，該裝置進一步連接至一CO2細胞培養器，用以即時監控幹細胞釋放物質。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之裝置，其進一步包括一伴隨該收集透析液容器之分析設備。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之裝置，其進一步包括一台共軛顯微鏡，用以監控藥物治療效用。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中該幹細胞係指神經幹細胞。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中該透明的容器係以透明材質製備，以直接觀察內部空間。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中灌注液入口和透析液出口彎曲成預設角度以與該通道之軸線交會。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中該透明容器具有兩個孔洞以提供灌注液入口和透析液出口之裝設。
  8. 一種用於藥物篩選的方法，包括：(a)將幹細胞置於申請專利範圍第1項所述之裝置之透明容器中；(b)使待測化合物與該幹細胞透過微透析探針在液態環境下接觸；(c)自該微透析探針之透析液出口收集透析液；及(d)分析透析液和/或觀察該幹細胞以篩選對該幹細胞有預期效果之待測化合物。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中幹細胞係指神經幹細胞。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中觀察該幹細胞係指觀察其形態改變、發育、分化、或可見之改變。
  11. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中預期的效應包括軸突擴增、樹突發育、神經分化和神經傳遞物質的功能釋放。
  12. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中，觀察該幹細胞係在與步驟(a)相同的的透明容器實施。
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