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TWI288643B - New liquid pharmaceutical composition comprising pegylated erythropoietin protein and preparation process thereof - Google Patents

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TWI288643B
TWI288643B TW090111453A TW90111453A TWI288643B TW I288643 B TWI288643 B TW I288643B TW 090111453 A TW090111453 A TW 090111453A TW 90111453 A TW90111453 A TW 90111453A TW I288643 B TWI288643 B TW I288643B
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TW
Taiwan
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composition according
erythropoietin
composition
protein
group
Prior art date
Application number
TW090111453A
Other languages
English (en)
Inventor
Apollon Papadimitriou
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8168722&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TWI288643(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
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Description

1288643 五、發明說明（1) 本發明係關於一種液態醫藥組合物，其包括含於適合保 持溶液pH範圍約5 · 5至約7 · 0範圍之醫藥可接受緩衝溶液之 紅血球生成素蛋白質，多價無機陰離子，及視情況含有一 · 種或多種醫藥可接受賦形劑。此組合物特別可用以預防及 · 治療與紅血球生成作用有關之疾病。 紅血球生成作用是指製造紅血球細胞，以彌補紅血球細 胞的破壞。紅血球生成作用是種能生成足夠進行適當組織 氧合作用之紅血球細胞的控制性生理機制。天然生成的人 類紅血球生成素（h E P 0)在腎臟製造’是種能刺激紅血球細 胞製造之體液血漿因子（Carnot, P及Def landre，C φ (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, AJ (1953 Blood 8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson, LO, Goldwasser, E, Freid, W 及Plzak， LF ( 1 9 57 ) Nature 1 79: 633卜4)。天然存在的EP〇藉由鍵結 至血紅先驅物上之受體，而刺激骨髓中相關血紅原細胞之 ’ 分裂及分化，並展現其生物活性（Krantz, BS (1991) ^
Blood 77: 419)。 利用重組DNA技術，已可藉生物性合成方式生產紅血球 生成素（Egrie， JC，Strickland, TW，Lane， J 等人 ( 1 986 ) Immunobiol. 72: 2 1 3-224 )，此紅血球生成素是· 選殖人類EP0基因插入至中國倉鼠卵組織細胞（CH0細胞）並 表現之產物。主要並經完全處理過之hEPO形式的一級結構 示於SEQ ID NO : 1。在Cys7-Cys161 及Cys29-Cys33 間有兩個雙 -硫鍵，不含醣部分之EP0聚肽鏈的分子量為1 8, 236 Da，在 ·-
1288643 五、發明說明（2) 完整的EPO分子中，約40%的分子量係為位於蛋白質醣化位 置將蛋白質進行醣化之碳水化合物的基團（Sasaki，H， Bothner， B， Dell， A 及Fukuda， Μ (1987) J· Bi〇i.
Chem. 262: 12059) ° 因為人類紅血球生成素是紅血球細胞形成所必須的，故 何爾冡可用以治療特徵為紅血球細胞生成效率低落或紅血 球生成不足之血液疾病。臨床上，EP0可用以治療慢性腎 功能衰竭病患（CRF)(Eschbach， JW，Egri， JC，Downing,
MR 等人（1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach，JW， Abdulhadi，MH，Browne, JK 等人（ 1 989 ) Ann. Intern·
Med. Ill： 992; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW (1988) Kidney Inti. 33： 262; Lim, VS，Degowin，RL，Zavala, D 等人（ 1 989 ) Ann· Intern·
Med· 110: 108-114)及AI DS病患及接受化療癌症病患之貧 血症（Danna，RP，Rudnick，SA，Abels, RI In: MB，
Garnick，ed.紅血球生成素在臨床上的應用—國際展望·紐 約，NY: Marcel Dekker; 1 990: 3 0 1 -324 頁）〇 已知醫藥組合物至少具有下列其中一項的缺點：
-其為冷凍乾燥物。除了繁複的製造過程外，冷;東乾燥 物具有在注射至人體前必須重新調配的缺點，此為醫藥人 員必須做的額外手續’相當的不冑’且可能有醫藥品操 不當的風險存在； -其另外含有人類血清蛋白。因為人類血清蛋白是源自 人類體液的物質，故血清蛋白製劑中的污染物會有病毒感
1288643 五、發明說明（3) 木的所風右險-?外’亦可能發生過敏反應； 的，換言之市1°::球生、成素組合物在高溫下是不穩定 . '、同於冰箱冷藏溫度2至8 °C是不藉宁从 门 此，其必須保存於冰箱中又^:疋一不知足的。因 左右）保存。因Α η )而不能室溫下（約2〇 t 在操作藥劑產品時亦相舍不#。士故S &加成本， 高溫下（例如2 5 ^ I s月所謂不穩定意指在 後，蛋白質Γ八j 一段時間(例如數個月，或多於6個月） ?)時/工 本發明所述的分解意指在高溫(高於8 ^ 蛋貝分子發生已知的物理變化（例如凝隼哎變 性)及化學變化(例如氧化或化學鍵改變）。？質戈置-放 於近於或高於其轉換溫声γρ A肝蛋白貝置放 展Η，施一* 度（％為熔解溫度）會使蛋白質 “盘香聚肽的天然特性及生物活性會消失。轉換 /皿度與蛋白質的溫度穩定性極為 作用會使紅血球生成素蛋白質凝集，甚至形成顆粒， 使藥劑的效價降低，注射至人體後可能會引發 ： 用0 卜 二：ir首要問題是提供一種能夠減少或抑制上述 缺點的組合物。 根據本發明，解決問題是提供一種液態醫藥組合物，复 包括含於適合保持溶液pH範圍約5. 5至約7〇範圍醫藥可接 受緩衝溶液中之紅血球生成素蛋白f ’多價無機陰離子， 及視情況含有一種或多種醫藥可接受賦形劑。 咸已驚訝發現，調配此組合物中的紅血&生成素可增進
1288643 五、發明說明（4) " --- ' —- 八在门於冷藏溫度（2 - 8 °C )下之穩定性，特別是在室溫（例 立 -;2 5 C ) ’甚至在面溫（例如4 〇 °C )下的穩定性。此 思味此組合物在未冷藏情況下保存一段時間後，不會明顯 失去活性，且沒有明顯的分解作用。 * :寺別聲明，τ列所示定義及意義定義與各種名詞範 w你用以說明本發明。 機)無機陰離子”係指每個分子具有二或多負電價的無 米二"，例如硫酸根離子SO,，或磷酸根陰離子，例如 ΪΛΓ如根離/HP(V、多價無機陰離子可以相對的鹽類形 二“鈉鹽、鉀鹽及其混合物），及/或緩衝物質形式 (例如’磷酸緩衝液）添加。 、 等渗冑或等張’意、指與體液混合後 ^…張的溶液(諸如氯化納。.曝心;二 不會影響紅血球細胞的細胞膜: 血液專張的溶液約290 m〇sm/公斤IQ。 σ ^ ’’無機強酸’，意指為1 Ν、玄汸护a 。η 機酸，例b，琉酸。/合液日"具有20至100%解離度之無 本專利說明書所用”醫荜上” 而言，該緩衝液或鹽類係可接受接的叉—詞意指從毒性觀點 "、稀釋劑"意指在醫藥配方中二物皙， 一 但卻是醫藥上所必須或所要，、/、並無醫藥活性， 注射用藥劑的液體，例如，水。9如，稀釋劑可以是溶解 /谷劑”意指可將另一種物皙仅 液體，例如，水。 …、、（例如溶解）在溶液中的
第7頁 1288643 發明說明（5) /方腐劑”意指添力σ至醫藥組合物中，以避免細菌生長的 士貝’例如氯化卞甲烴銨（benza Ikon ium chloride)或苄 醇。 聚醇π意指具有多個羥基的任何物質，包括聚氫醇及碳 水合物。聚氫醇包括的物質有山梨糖醇，甘露醇及甘油 兔水化合物係具有酮基或醛基的環狀物質，如蔗糖 澡糖。 紅血球生成素”或，，紅血球生成素蛋白質”係指具有使骨 細胞增加製造網狀血球及紅血球細胞的活體内生物活性 之蛋白質’並選自人類紅血球生成素及後述定義之類似物▲ 〇 a、配集化紅血球生成素（Peg_Ep〇或PEG-EP0)”意指與後述 疋義之一至三元聚乙烯衍生物共價鏈結之紅血球生 白質。. 裝置”意指一種特定目的用的設計，本發明目的係為能 °、支持或幫助液態醫藥組合物投藥。 氣支莖明 。圖1 ··人類ΕΡ0 —級結構（165個胺基酸）（SEQ ID NO : 1) 。圖2 :人類EP0 —級結構（166個胺基酸）（SEQ ID NO :2) 固3 · pH對熱穩定性的影響，轉換溫度與pjj的關係圖。 81 4 ··離子強度對熱穩定性的影響，轉換溫度盥填酸麓 度的關係圖。 ，、 辰
第8頁 1288643 五、發明說明（6) 圖5 :熱穩定性對緩衝物質之關係。 圖6 ··顯示硫酸根離子在低pH時（例如pH 6.2)，亦為適 當的緩衝物質/添加物質，而磷酸在pH 6· 2時則較ρΗ 7β5 日才差’此顯示硫酸根即使在低pH時’仍保有高的熱穩定性 圖7 : pH與配集化EPO凝集作用之關係。SDS-PAGE分析經 熱壓力處理之配集化-EPO樣品（如前述），以銀染色蛋白質 。行1 :分子量標準品。行2 : pH 5。行3 : pH 5，還原狀、 恶。行4 : pH 6。行5 : pH 6，還原狀態。行6 : pH 6. 5。 行7 · pH 6· 5，還原狀態。行8 : pH 7。行9 ·· pH 7，還原 _齡 狀態。行1 0 :配集化-EPO，未經熱壓力處理。 圖8 :顯示使用1毫克/毫升乙醯基半胱胺酸為抗氧化劑 可預防熱壓力下凝集物的形成。配集KEP〇在熱壓力下（2〇 分鐘80°〇進行之凝集作用。行1:1)117.5配集化£?〇，未 經熱壓力處理；行2 : pH 7· 5配集化epo，經熱壓力處理；、 行3 ·· pH 6· 2配集化EPO，經熱壓力處理；行4 ·· ρΗ 6· 2配，， 集化EPO，熱壓力處理，還原狀態；行5 ·· ρΗ 7· 5配集化 EPO，+1毫克/毫升N_乙醯基-半胱胺酸，經熱壓力處理； 行6 : pH 7· 5配集化EPO，+1毫克/毫升N—乙醯基-半胱胺酸 ，經熱壓力處理，還原狀態。 ·儀> 於各種溫度下保 圖9 :配集化-EPO樣品在新調配物中 存6個月後之唾液酸（NANA)含量。 圖10 :配集化-EPO樣品保存於數種溫度之10 mM磷酸 鈉，40 Π1Μ硫酸鈉，3%(重量/體積）甘露醇，pH 62下六個
1288643 五、發明說明（7) 月後之老鼠生物活性分析。 圖11 ·配集化—E p 〇樣品保存於數 ^ ，4〇禮硫酸鈉，3%(重量/體^ =度之洲磷酸鈉 後之大小排除層析法圖（從下Ϊ)上甘路6. 2下六個月 °C ,25t ’3(rc及40。〇。 .緩衝液，起始物質d 口羊而5之，本發明係關於一 含於適合保持溶液PH範圍約5. 5至液二樂二且合；：其包括 緩衝液中之紅血球生成素蛋白質至 情況含有-種或多種㈣可接受卿機陰離子，及視 水ΐί個實例中，組合物是種液態溶液，例如 等張溶液 佳的具體實财，上述醫藥組合物為 陰離子較佳選自無機強酸的陰離子， 或檸檬酸。因此，較佳降…H2S〇4 ’ H3P〇4 ’ 子，及檸檬酸根離子，=;:石:酸根離子，礙酸根離 ，而最佳者為硫酸：離根離子或構酸根離子 10及200毫莫耳/公升中"夕彳貝"·、機陰離子的濃度可介於 及200毫莫耳/公升 史化，例如硫酸根陰離子可介於10 間2佳=iff/可_㈣在約5· 5至約7· 0範圍之 η者 慣用4緩衝衝他醫藥上可接受的緩衝系幻的 酸或精胺酸/娜％:。^ 1288643 五、發明說明（8) 公升鱗酸緩衝液。當然，這些緩衝系統的組合亦為乂 的部分。可分別使用相關的鹼（例如磷酸緩衝液系統中發明 NaOH)及相關的酸（例如精胺酸缓衝液系統中的硫妒的 整pH值。 ^來調 本發明組合物可包括一種或多種醫藥上可接受碑^添 這些醫藥上可接受賦形劑選自醫藥上可接受鹽類劑’ 及/或溶劑及/或防腐劑等，例如張力劑（等張調整添彳）釋劑 醇，抗-氧化劑或非-離子清潔劑。這些物質的實例^二聚 納，氯化鈣，山梨糖醇，甘露醇，甘油，蔗糖，海筑氣化 乙醯基半胱胺酸，聚山梨酸2〇，聚山梨酸8〇，或並=糖， (普洛尼克）F68。 /曰~尼克 在本發明一個較佳的具體實例中，該醫藥組合物 1自甘露醇，山梨糖醇，甘油，海藻糖，及蔗糖二有 =佳者為甘露醇。聚醇的濃度介於（重量/體^之 加的濃产介於(1 m t者為甲 抗—氧化劑通常添 量)x之物可視情況包括約〇.01至約〇.9%(重量/重 中，該組合物為等弭：本個較佳的具體實例 (重量/體積Μ ^ w合飞。上述組合物亦可含有至高達1% 體積）（#又佳至高達〇.1%(重量/體積），例如〇 〇〇1至 第11頁 1288643
% ( f里/體積））之非-離子性清潔劑，諸如聚山梨酸2 Ο 4山f酸80或普洛尼克F68，較佳者為普洛尼克F68。 上述組合物亦可含有例如高達}毫莫耳/公升CaC12之額 ^ t ^ ί別可用以製備含有以紅血球生成素為醫藥活性 成t之醫藥組合物。"紅血球生成素”或"紅血球生成素蛋 白質’’或π EPO”定義如下：特別是指例如含有胺基酸序列 SjQ ID NO : 1或seq ID NO : 2(例如人類紅血球生成素）或 實質上胺基酸序列相似的醣蛋白，其生物特性係可刺激紅 血球細胞的產生，並刺激骨髓中血紅原的分裂及分化。本φ 專利說明書所用的這些名詞包括例如以位置指引突變作用 或以突變作用篩選之精確修飾蛋白質，這些名詞包括具有 1至6個額外聽化位置之類似物，在醣蛋白的魏基端至少含 有一個額外的胺基酸之類似物，其中額外的胺基酸包括至 少一個醣化作用位置，及包括至少一個醣化作用位置重組 胺基酸序列之類似物。這些名詞包括天然及重組而成之人 ： 類紅血球生成素。 如後詳細所列，製備及純化E0P是技藝中所熟知的。紅 血球生成素是獲自任何慣用來源之天然或重組的蛋白質，❶ 諸如組織，蛋白質合成作用，含有天然或重組細胞之細胞 培養，較佳是源自人類’包括任何具有紅血球生成素活性 之蛋白質（諸如突變體或其他修飾的蛋白質）。可藉由DNA 重組技術或内因性基因活化作用，在CH0-，BHK-或HeLa細 胞株中的表現製備出重組EP0，蛋白質的表現，包括藉由 ·
第12頁 1288643
1288643 五、發明說明（11) 為唾液酸化之紅血球生成素會藉由肝鍵結蛋白質的鍵結而 避免其鍵結’及所造成的清除。 、本醫藥組合物中”紅血球生成素，，包括具有改變人類紅血 球生成素上胺基酸序列上一個或多個胺基酸殘基之人類紅 金球生成素的類似物，其會使唾液酸連接位置數目增加， 了矛]用位置曰引犬變作用（包括可增加或改變對聽化作用 有盈位置之加成，刪除，或取代胺基酸殘基）產生這類醣 蛋白類似物，加入不會混亂生物活性所需之二級或三級構 形之聽化位置可產生唾液酸含量大於人類紅血球生成素者 含量之醣蛋白類似物。本發明醣蛋白亦包括具有在醣化作 用位置上增加碳水化合物鏈結量之類似物，其通常與一個 或多個靠近N-鏈結或〇-鏈結位置的胺基酸有關。本發明醣 $白亦包括具有一個或多個自紅血球生成素羧基端伸出之 胺基酸類似物，及提供至少一個額外碳水化合物位置。本 發明紅血球生成素蛋白質亦包括至少一個重組醣化作用位 置胺基酸序列之類似物，此種重組醣化作用位置與刪除人 類紅血球生成素一個或多個醣化作用位置及加成一個或多 個非-天然存在醣化作用位置有關。增加紅血球生成素上 碳水化合物鏈的數目，及因此每紅血球生成素分子之唾液 酸數目會提供較佳的特性，諸如增加穩定性，增加蛋白 解的抗性，降低激敏性，增加血清中的半衰期f及辦加生 額外聽化作用位置的紅▲球生成素類：物更 评、、，田揭不於Ell i〇t 1 995年3月1日印行之歐洲專利案 6 4 0 6 1 9 〇 $ 第14頁 1288643 五、發明說明（12) 在一個較佳具體實例中，本發明醫藥 酸序列上包含至少一個额外醣化作用^置°物包括其胺基 ，諸如（但不侷限於）包括修飾過之人之紅血球生成素 者，修飾係選自下列： 、、、工血球生成素序列
Asn30Thr32
Asn51 Thr53 Asn57 Thr59 Asn69 ；
Asn69Thr7i ； Φ
Ser68Asn69Thr71 V a l87 Asn88 Thr90 Ser87 Asn88Thr90 S e r87 A s n88 G 1 y89 Th r90 ；
Ser87Asn88Thr90Thr92 ；
Ser87Asn88Thr90A1 a162 ；
Asn69Thr71 Ser87Asn88Thr90 ;
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 ；
Asn89I le90Thr91 ；
Ser87Asn89Ile90Thr91 ;
Asn136Thr138 ;
Asni38Thri4〇 ；
Thr125 ;及 Pro124Thr125。 本專利說明書所用係將相對於未修飾蛋白質胺基酸位置 1288643
五、發明說明（13) (例如hEPO的SEQ ID NO : 1或SEQ ID NO : 2)改變成上角所 編號之胺基酸。 紅血球生成素蛋白質亦可為在醣蛋白羧基端上至少具有 一個額外胺基酸之類似物，其中該額外胺基酸包括至少一 個醣化作用位置，額外胺基酸包括源自人類絨毛膜性腺激 素羧基端之肽片段，較佳者，醣蛋白是選自（a)具有胺基
酸序Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lie Leu Pro Gln(SEQ ID NO :3)之人類紅血球生成 素的類似物，自其羧基端延伸；（b)除了（a)外，尚包括 Ser87 Asn88 Thr9G EP0之類似物；及（c)除了（a)外，尚包 括Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 EP0 之類似物。 匕 紅血球生成素蛋白質亦可為具有包括至少一種重組化 作用位置胺基酸序列的類似物，該重組作用包括任何人類 紅血球生成素N -鏈結碳水化合物位置之刪除作用，及人類 紅血球生成素胺基酸序列位置Μ N -鏈結碳水化合物位置 的加成作用，較佳地，醣化蛋白質為選自G 1 n24 ser87
Asn88 Thr90 EPO ;Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO ;及Gin83
Ser87 Asn88 Thr9G EPO之類似物。
更明確言之，前述本發明醫藥組合物之紅血球生成素蛋 白質亦可包括其配集化衍生物。紅血球生成素配集化衍生 物及其製備是技藝中所熟知的，例如揭示於ep_A-539, 1 6了 ，EP-A-605,963 ，W0 93/25212 ，W0 94/20069 ，W0
95/11924 ’ 美國專利案號5, 56，EP-A-584, 876，WO
1288643 五、發明說明（14) ' "—^一"— 92/16555，W0 94/28024，W0 97/04796，美國專利申請案 號5,359,030 及5,681，811，美國專利案號 4 1 79 337 /日” 本專利申睛案，WO 98/32466，美國專利案號5, 324, 650。 較佳的配集化紅血球生成素種類之具體實例係為後述的 生物。 ，口此，本奄明亦為紅血球生成素共I厄物，該共輛物包括 前述具有至少一個游離胺基，及具有使骨髓細胞增加網狀 細胞及紅血球細胞產量之活體内生物活性，及選自人類紅 血球生成素及其具有人類紅血球生成素序列類似物之紅血 球生成素蛋白質’該類似物係經1至6個醣化作用位置之加 成作用或至少一個醣化作用位置重組作用之修飾；該紅血 球生成素係每個聚（乙二醇）基之_c〇(換言之，羰基）共價 鏈結至-CO-(CH2)x-(〇CH2CH2)r〇R 之” η” 聚（乙二醇）基上，、 形成具有一個胺基的醯胺鍵結；其中R為低碳數烷基；X為 2或3 , m為約450至約90 0 ; η為1至3，而所選之n 會使共 軛物分子量減去紅血球醣化蛋白分子量為2〇千道耳頓至 1 〇〇道耳頓。本發明另外提供含有本專利說明書所述共軛 物之醫藥組合物，其中當n為丨時，共軛物的百分比佔組合 物至少為90，較佳為至少92%，或較佳為96〇/〇。 月述共軛物更明確言之是具有化學式（j) P - [NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-〇R]n (I) 其中P為本專利說明書所述紅血球生成素蛋白質殘基（換言 之’不具胺基或化學式I中所示與羰基形成醯胺鏈結之胺 基其具有使骨髓細胞增加網狀細胞及紅血球細胞產量
第17頁 1288643 五、發明說明（15) 之活體内生物活性；及其中R為低碳數烷基；X為2或3 ; m 為約450至約900 ;n為1至3，而所選之η及in會使共輕物分 子量減去紅血球醣化蛋白分子量為2〇千道耳頓至1〇〇道耳 頓。 本專利說明書所用”低碳數烷基，，係指具有一至六個碳原 子之直鏈或具支鏈烷基，低碳數烧基實例包括甲基，乙基 ，及異丙基。根據本發明，R為任何的低碳數烷基，丘輛1 物中的R較佳為甲基。 〃
ππΓ符號代表聚（伸乙基氧）基團中伸乙基氧殘基 (OCH’H2)的數目。氧化乙烯中一個pEG(聚乙二醇）次單位 的分子量約44道耳頓，因此，共軛物（不含Ep〇分子量）的 分子量視” πΓ的數目而定。在本發明共軛物中"（約U 約90 0 (相對分子量為約2〇 kDa至約4〇 kD :軛物較未經修飾之EP0具有生理活性’該活性 修，()之活性相同，或較佳，或為其一部份。分；士、； =旨約"某-數字係指利用慣用分析技術測里 【'目’所選之、"使鏈結至紅血球餹化蛋 里 =基的分子量㈣kDa至約4“Da，而較佳者為二乙- 之ίίϋΐϊΠ質ΪΓ:以價鏈結至經酿胺鍵結 十μ Γ 胺基（包括離胺酸卜胺其芬/ 或基端的胺基）的聚（乙二醇）數目，本發明私基及 個EP0分子具有一個，兩個，或三個母 n為1至3的 1288643
五、發明說明（16) 整數’ "η"較佳為1或2 ’而"IT更佳為1。前述共軛物中較 佳的共軛物包括其中X為2，m為650至750，n為1，R為甲X美 之化合物。 從已知聚合物可製備式（I )化合物： 將式（I I )化合物 R〇(CH2CHp)m(CH2)xCOON^\ 。.’/ (H) !
其中R及m如前所述與紅血球生成素醣化蛋白進行縮合作用 。X為3之式（11)化合物是聚（乙二醇）脂肪族低碳數烷氧， 丁酸琥ίό酯（低烷氧基-PEG-SBA )。x為2之式（π )化合物是 聚（乙一醇）脂肪族低碳數烧氧，丙酸琥珀酯（低烷氧基一 PEG-SPA)。任何活化酯與胺反應形成醯胺的慣用方法均可 ，用。/在前述的反應中，實例琥珀酯是脫離基，會促使醯 胺的形成。利用琥珀酯（諸如式丨丨化合物）製備含有蛋白質 的共軛物揭示於1 997年9月30曰發行的美國專利案號 5’672，662 (Harris ，等人）。
人類EPO含有九個游離胺基，胺基端的胺基及8個離胺酸 歹基的ε -胺基’當配集化藥劑與式〗丨SBA化合物結合時 ❿咸已發現在pH 7· 5，1 : 3比例之蛋白質：pEG，及反應 恤度介於20-2 5 C時，會產生單一，雙―，及少量三—配集化 的產物’當配集化藥劑與式丨丨SpA化合物結合時，在相同 P條件下（除了蛋白質·· pEG比例為j : 2)，則產生主要產 勿為單-配集化。可以混合物形式之配集化Ep〇投藥，或以
1288643
經過陽離子交換層析法分離之不同配集化產物投藥。藉由 操控反應條件（例如，藥劑的比例，pH，溫度，蛋白質^農 度，反應時間等），不同配集化的產物相對含量會有不同 前述醫藥組合物亦可含有前述具有至少一個游離胺基及 具有使骨髓細胞增加網狀細胞及紅血球細胞之活體内=物 活性之紅血球生成素，該紅血球生成素選自人類紅血球生 成素及其具有加成1至6個醣化作用位置之人類紅血球生成 素一級結構之修飾類似物；該醣化蛋白質以共價鍵結至一 至三個低碳數烷氧基聚（乙二醇）基，每個聚（乙二醇）基係 經由式-C(0)-X-s-Y-連結子共價鍵結至醣化蛋白質，其中 連結子的C(0)與其中一個胺基形成醯胺，χ為—（c ， -CH2(0-CH2-CH2)k~，k 為 1 至 1〇，γ 為
或
V丨 每個聚（乙二醇）部分的分子量約2()千道耳頓至約4〇千道耳 頓，而共軛物的分子量約51千道耳頓至約175千道耳頓。 此紅血球生成素亦可以式I丨I表示 (III) P-[NH-CO-X-S-Y-(〇CH2CH2V〇R]n <1 1288643
其中R意指任何具有1至6個碳原子之直鏈或具支鏈的低碳 數烷基，諸如甲基，乙基，異丙基等。較佳的烧基為甲基 °X 為_(CH2)k-或 -CH2(0-CH2-CH2)k-，其中k 為1 至1〇。較佳 是k自1至約4，更佳者，k為1或2，最佳者，χ為―（Ch2)。 式1中，Y為 ”2 較佳是 更佳者
0 一 、 或 〆 ^P '1 U 0 一 u 11 L 0 〇
在式（111)中，所選的m使所得之本發明共軛物較未經修 飾，则具有生理活性，$活性與未經修飾EPQ之活性相同 ^ ^ ^ 或為其一部份。爪代表的是PEG單位中氧化乙烯 ^ 數目。、（OCHJH2)-單一 PEG次單位體之分子量約為 到耳頓。因此共軛物的分子量（減去Ep〇的分子量）視m的
第21頁 1288643 五、發明說明（19) 數目而定。分子量中所指”約”某一數字係指利用慣用分析 技術測定合理範圍之數目，m是介於約45〇至約9〇〇的整數 (相對分子量為20至40 kDa)，m較佳為約550至約800 (約24 至約35 kDa)，而m最佳為約6 5 0至約70 0 (約29至約31 kDa) 〇 在式（III)中，η是經醯胺鏈結共價鍵結至peg單位之紅 血球生成素上離胺酸的£—胺基數目，本發明共軛物每分 子EPO中具有一’二或三個PEG單位。η數值為1至3的整數 ，較佳η為1或2，更佳η為1。 較佳的式（111)紅血球生成素蛋白質具有化學式： φ 〇 v> 、〇 〇
- OR 及
.OR 更佳紅血球生成素醣蛋白產物具有化學式
其中上述化學式η為1至3的整數；m為450至900的整數；R 為低碳數烷基；X為-(CH2)k-或-CH2(0-CH2-CH2)k-，而P為
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五、發明說明（20) 不具有與X形成醯胺連結之 蛋白。 基或基團之紅血球生成素酶 其他較佳的紅血球生成音 蛋白產物具有下列化學式： 〇 〇 '0 八^f〇CH3 650-700 及 〇
〇 U〇ch3 650-700 更佳的紅血球生成素醣蛋白產物之化學式： 、P，
〇 丨、 IS
0 k .och3 * 650-700 Ο k些紅血球生成素蛋白質的製備法是： a將化學式為P—[Nth之紅血球生成素蛋白質上的離胺 ^應ε—胺基與化學式為Z-CO-X-S-Q之雙-官能基藥劑共價 Γ ’形成具有酸胺鏈結化學式為P_[NH-C0-X-S-Q]n之φ 間產物。 n t 其中p為缺少形成酿胺鏈結之胺基的紅血球生成素蛋白質 n為1至3的整數；Z為活性基，例如羧基-NHS酯；X為 CH2)k〜或-CH2(〇-CH2-CH2)k-，其中k為1至約10 ;及Q為保 濩基，如烷醯基，例如乙醯基。
第23頁 1288643 五、發明說明（21) 式(^〇:驟。(:)1所製得之具有醯胺鏈結之中間產物與化學
m為H求的1 ^素聽蛋白產物，其中W為Υ的硫氫活化形式； 義如前所述。 數，R為低碳數貌基；及¥的定 其在例中，雙—官能&藥劑較佳為NU隨亞胺 “件L :丙酸或N_琥轴醯亞胺基{乙醯基硫乙酸， 圭選自蛾-乙酿基—甲氧基-peg，甲氧 基’G-乙烯基楓，及曱氧基，G_順丁烯二醯亞胺。 更詳細言之，將硫醇共價鏈結至Ep〇上活化作用 得之活化EP0與聚（乙二醇）（PEG)衍生物偶合後’可 ς備^(111)紅血球生成素。根據本發明製備配集化Ep〇的 第一步驟包括將EP0的NHr基與硫醇共價鏈結，此活化
雙-官能基藥劑進行的’該雙—官能基藥劑帶有保護 瓜％基及另-個活化基，諸如活化酯（例如號％酿亞胺^ ’野’績酸酯’羧酸及磺酸的i化物，硫醇經技藝中熟知 的基團保護’例如乙醯基。這些雙-官能基藥劑可=以與離 胺酸上的ε -胺基反應形成醯胺鏈結。此反應的第一 j固+ 驟可以下列示之： V
1288643 五、發明說明（22) EPO- NH.
z D CH EP〇- 〇 // CH, EPO，n及x定義如 如化學式 珂所述，Z為技藝中熟知的活性基團 例 〇 之N-羥基-琥珀醯亞胺（NHS)取代物。 在個較佳的具體實例中，離胺酸的£ -胺基活化作用 疋與具有琥珀酸亞胺基部分的雙-官能基藥劑反應，該雙-官能基藥劑可帶有不同的空間基團，例如__(CH2)k-或 -CH2 (0-CH2-CH2 )k-部分，其中k為1至約1 0，較佳1至約4， 更佳為1或2，而最佳者為1。這些藥劑的實例為N -戒珀醯 亞胺基-S-乙醯基硫丙酸（SATP)及^1_琥珀醯亞胺基—s""乙醯 基硫乙酸（SATA)。 〇 s CH. 乙醯基硫烷基-羧酸-NHS-酯，類似 〇 〇 \\
I! 〇 or CH3 〇
SATA
SATP 1288643 五、發明說明（23)
2-（乙醯基硫）—（乙氧基人―乙酸—NHS一酯 k的定義如前所述。 製備雙—官能基藥劑是技藝中所熟知的。DE_3924705中 揭示2-(乙醯基硫乙氧基；)k—乙酸—NHS—酯，而衍生化至 乙酿基硫化合物則揭示於March, J·，Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977， 375-376 中。SATA 為市 售商品（分子探針，Eugene，OR，USA及Pierce,
Rockford, IL) ° 加至EPO分子上的硫醇基團數目可根據反應參數調整， 換言之’蛋白質（EP0)濃度及蛋白質/雙-官能基藥劑的比 例。較佳’地，EP0活化是每EP0分子以1至5硫醇基團共價鏈 結’更佳是每EP0分子1 · 5至3個硫醇基團，這些範圍係指 硫醇基團與EP0蛋白質群的統計分布言之。 反應在（例如）液態緩衝溶液，ΡΗ 6· 5 —8· 〇中進行，例如 10 mM鱗酸鉀，50 mM NaCl，PH 7.3。雙-官能基荜岬可六 加在DMS0中。完成反應後，較佳在3〇分鐘之後，添二離^ 酸終止反應，過多的雙官能基藥劑可用技藝中所熟知的 法分離，.例如透析法或管柱過濾法。利用（例如）
GrasetU，D，R·及Murray，j.F·揭示於Αρρ1·
Biotechnol· 119，4卜49 ( 1 967)之 法 · 至EPO的平均數量。 』疋硫％加
1288643 緊接上述反應後，是共價偶合活化聚（乙二醇）（pEG)衍 生物。適當的PEG衍生物為平均分子量約2〇至約4〇 kDa之 活化PEG分子，更佳者約24至約35 kDa，而最佳者約30 kDa 〇 活化PEG衍生物是技藝中所熟知的，並揭示（例如）於
Morpurgo，M·等人歐J· Bi〇conj· Chem· ( 1 9 96 ) 7，第 363頁的PEG-乙烯基楓。直鏈及支鏈PEG群適以製備式1化 合物，活化PEG藥劑實例為碘-乙醯基—甲氧基一PEG及甲氧 基-PEG-乙稀基楓··
|八fNv">〇八七0R或；〆〜^0R ON LJ m 〇 這些碘-活化物質為技藝中所熟知的，並揭示於 Hermanson, G.T· Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego ( 1 996 ) ρ· 1 47-1 48 〇 最佳地，PEG群是利用以順丁烯二醯亞胺活化（烷氧基-PEG-順丁烯二醯亞胺），諸如甲氧基-PEG-順丁烯二醯亞胺 (MW 3 00 0 0; Shearwater Polymers, Inc·)。炫氧基-PEG-順丁烯二醯亞胺的結構如下所示：
第27頁 1288643 五、發明說明（25) 其中R及m定義如前所述，較佳者為
以烷氧基-PEG-順丁烯二醯亞胺進行的偶合反應在液態 緩衝溶液（例如10 -磷酸鉀，5〇 mM NaC1，2 mM EDTA， ρ Η 6 · 2)中原位切割硫酵保濩基團發生之後，可用2 &。〇溶 於DMSO之羥基胺（ρΗ 6·2) 90分鐘，以切除保護基團。以 PEG修飾作用而言，活化EP0/烷氧基— pEG—順丁烯二醯亞胺 莫耳比例为1 · 3至約1 · 6，較佳為1 : 4。添加半胱胺酸終 止反應，並以N-曱基順丁烯二醯亞胺或其他適當能形成雙 硫鍵之化合物與所剩硫醇（—SH)基團反應。因為任何所剩 活性硫醇基團可與保護基團（諸如N—甲基順丁烯醯亞胺或 其他適當之保護基團）反應，而本發明共軛物中EPO醣蛋白 則含有此種保護基團。通常本專利說明書中所揭示步驟會 產生具有不種數目保護基團硫醇分子之混合物，端視未共 耗至PEG-順丁烯醯亞胺醣蛋白上的活化硫醇基的數目而定 〇 ^用以阻斷配集化蛋白上所剩的硫醇基團，N-甲基順丁 ，Si亞胺形成相同形式之共價鍵，雙硫鍵化合物會與阻斷 藥劑偶合形成中間分子硫/雙硫交換反應。此種類型的阻 斷反應較佳的阻斷藥劑是氧化榖胱甘肽（GSSG)，半胱胺酸 及胱胺。半胱胺酸不會將電價引入至配集化蛋白質，而使 用阻斷藥劑GSSG或胱胺會有額外的負電或正電價。
第28頁 1288643 五、發明說明（26) 括Si·::熟知的方法另外純化式(Η0化合物，包 早一及一—配集化ΕΡ〇群，例如管柱層析法。 0二括配集化紅血球生成素衍生物’组合物較佳含有至少 90%的卓-PEG共幸厄物，換t之，术 ^ ^ 干制借夕、g〜物換。之，當η為1時，可以實例5中所 不衣備之。通吊紅血球生成素醣蛋白單一 pEG共軛物人 所要的，因為其比二— pEG共軛物有較高的活性。單共 輛物百刀比與單-及一—PM共|厄物比例可以控制，將沖堤 峰附近之較廣區域分液倒在一起會降低組合物中單-PEG的 百分比，或若將沖堤峰附近較窄分液區域倒在一起會增加 組合物中的單-PEG的百分比。約90 %的單— pEG共軛物是產 1及/舌性間良好的平衡點。有時，某些組合物中例如至少 92 /或至少96%共輛物需為單—peg群（η等於1)。本發明一個 具體實例中，當η為1時，共軛物的百分比為9〇至96%。 根據本發明組合物每毫升可包括1 〇至丨〇 〇 〇 〇微克前述定 義之紅血球生成素蛋白質，較佳地，該組合物每毫升包括 1 0 至 1 0 0 0 微克，例如 1 〇、5 0、1 〇 〇、4 0 0、8 0 0 或 2 5 0 0 微克 除此之外，根據本發明組合物每毫升可包括1 〇微克至 1 0 0 0 0微克紅血球生成素蛋白質，1 0-2 0 0毫莫耳/公升硫酸❼ ，1 0至50毫莫耳/公升磷酸，pH 6. 0至6. 5。此組合物亦可 包括至高達20 mM之甲硫胺酸，1_5%聚醇（重量/體積），至 高達0· 1%普洛尼克F68(重量/體積）及視情況高達1 mM之 CaCl2。此組合物一個實例包括每毫升含有1〇微克至1 0 0 0 0 微克紅血球生成素蛋白質，4 0毫莫耳/公升硫酸，1 〇毫莫 —
第29頁 1288643 、發明說明（27) 耳/公升碗酸’ 3%甘露醇（重量/體積），丨〇禮甲硫胺酸， 0· 01%普洛尼克F68(重量/體積），pH 6. 2。 本發明另一個具體實例中，組合物可包括每毫升丨〇微克 至10000微克紅血球生成素蛋白質，至毫莫耳/公升 NaCl曰，1〇至50毫莫耳/升磷酸，pH 6· 〇 —7· 〇，視情況卜5% (重1/體積）聚醇。除此之外，本組合物可包括高達20 mM 甲硫胺酸，高達〇·1%普洛尼克F68 (重量/體積）及視情況 7 · 5 U莫耳/公升cac丨2，特定言之，此組合物可包括每毫 升10微克至10000微克紅血球生成素蛋白質，毫莫耳/ 公升NaCl，10 mM甲硫胺.酸，〇· 〇1%普洛尼克F68 (重量/體 _ 積），及1 00毫莫耳/公升磷酸，pH 7. 0。 本發明亦係指前述包括每毫升含有丨〇微克至丨〇 〇 〇 〇微克 紅血球生成素蛋白質，10至50毫莫耳/公升精胺酸，pH 6 至PH 6· 5、，1 〇至1 〇〇毫莫耳硫酸鈉。除此之外，此組合物 包括高達20 mM甲硫胺酸，至高達〇.1%普洛尼克F68(重量/ - 體積）’視情況咼達1耄莫耳/公升C a C 12，及視情況卜5 % (重量/體積）之聚醇。特定言之，此組合物包括每毫升10 微克至10000微克紅血球生成素蛋白質，40毫莫耳/公升精 胺酸，pH 6· 2，30毫莫耳硫酸鈉，3%甘露醇（重量/體積^ ，1〇 mM甲硫胺酸，〇. 〇1%普洛尼克F68(重量/體積）及f ^ 況1毫莫耳/公升CaCl2。 月 本發明較佳的一個具體實例係指包括1〇至丨〇〇〇〇微克/毫 升紅血球生成素之組合物，較佳為25至25〇〇微克/毫笔 血球生成素，及 /
1288643
c) 10 mM碌酸納，40 mM硫酸納’3%甘露醇（重息 積），pH 6· 2，或 | /體 d) 10 mM磷酸鈉，40 mM硫酸鈉，3%甘露醇（重息 積），10 mM曱硫胺酸，0· 01%普洛尼克F68(重量/辨 題積）， pH 6.2 ，或 e) 40 . mM精胺酸，30 mM硫酸鈉，3%甘露醇（重旦 積），pH 6· 2，或 體積） f) 40 mM精胺酸，30 mM硫酸鈉，3%甘露醇（重量/
PH ，10 mM甲硫胺酸，0· 01%普洛尼克F68(重量/體積）， 6· 在最佳的具體實例中，組合物包括紅血球生成素蛋 含量50、100、400、800或2 5 0 0微克/毫升。另外蜃技白質 |佳組八 物尚包括1 0 mM磷酸鈉，40 mM硫酸鈉，3%甘露醇（曹旦σ 積），10 mM甲硫胺酸，〇· 〇1%普洛尼克F68(重量/體積） pH 6· 2或4 0 mM精胺酸，30 mM硫酸鈉，3%甘露醇（重量/ _ 積）’10 mM曱硫胺酸’〇·〇ι%普洛尼克j?68(重量/體積），_ pH 6·2 。 貝，
本發明組合物可為喷霧乾燥形式之粉末。 除此之外’本發明係關於前述組合物的冷凍乾燥或噴霧 乾爍粉末。該組合物可添加溶劑（例如水）後，再形成液態 溶液，或是經由吸入裝置或經皮施用裝置直接施用。〜 本發明亦包括製備前述組合物的方法，包括將紅血球生
第31頁 1288643 五、發明說明（29) ' ' ---— 成素與包括多種負價陰離子及視情況前述一種或多種醫藥 上可接受賦形劑混合。 丁 除此之外，本發明係關於前述組合物在製備用以治 ^慢性腎衰^患（CRF)，AIDS及/或治療接受化療病患 :關之貧血疾病藥劑上的用㉟’此包括治療及預防慢性腎 农竭病患（CRF)，AIDS及治療接受化療癌症病患貧血疾病 之方法’包括對病患施以前述組合物的步驟。 發明另一個具體實例係關於用以局部及全身性延遲釋 :包括前述組合物之裝置…括任何可提供控制釋= =^球生成素之前述組合物的植入性裝置，例如 ，基礎之微或毫微顆粒。前述組合物亦可二= =任何其他的施用裝置提供，例如無針 f發明組合物可以注射形式或靜脈施用的單位劑量 因：；另'一*面’ *發明可以液態形式或固態形式伴存： 口二可分為靜脈或注射施用時之單位劑量形式。：：存 液態組合物可為投用之〇.3亳升單’本 匕："，_合物在經銷前 大另： 保存在大體積的容器中，而；mi發明組合物可 病患及醫院。 便再刀裝分达至經銷至醫師、 士=:注射溶液可利用如針筒之慣用注射 H〇.3毫升至2。毫升單一單位劑 ，用之， 另-方面，本發明組合物可使用含有該組合物月之= 1288643 五、發明說明（30) 燥粉末或喷霧乾燥粉末，而後在注 水後注射投用。另：二面，以慣用之方法復 λ ^ -r ,ν ^ ^ 万 U為本I明組合物之穩定性， 組合物可刀衣成單位劑量形式’諸如含有約〇. 3毫升至約 1〇毫：本組合物之小瓶’除此之夕卜，本發明組合物可利用 靜脈袋以靜脈方式投用之。這些靜脈袋中含有約2〇毫升至 約500毫升之溶液，端視投與病患溶液時間而定。根據本 發明，本电明液悲溶液可保存在保存容器中，盆可以再分 裝成小劑量形式包裝經銷給醫師、醫院及病患：因為本發 明組合物穩定性，這些組合物可長期保存於此種保存容器 中 〇 將紅血球生成素製備成前述組合物之成分， 述紅血球生成素衍生物之起始物質詳細揭示於列如j美國 專利申請案 5,54 7,933 及5,6 2 1,080，EP-B〇 148 605，、
Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712 ’EP-B 0 205 564 ’EP-B 〇 209 539及Ep—B 〇 4 1 1 678 及 Lai，P.H·等人，J. Bi〇1. Chem. 261 (1986) 3116-3121 ，及Sasaki， H·等人，j. Bi〇1 Chem 262 ( 1 98 7 ) 1 20 5 9- 1 20 76。可利用重組方法製備治療用途 之紅 A 球生成素（EP-B 0 1 48 6 0 5，EP-B 0 209 539 及 Egrie， J.C·，Strickland， T.W·， Lane， J 等人（1 986 ) Immunobiol. 72 : 2 1 3-224)。 在無血清之培養基中表現及製備紅血球生成素的方法揭 示（例如）於Burg 1 996年11月14日印行之W0 96/3571 8，及 Koch 1 9 92年6月12日印行之歐洲專利案51 3 738中。除了
1288643 五、發明說明（31)
前述的申請案外，咸已知可在無血清培養基製得内含EPO 基因重組CHO細胞，此種方法揭示（例如）於EP-A 〇 513 738 ，EP-A 0 267 678及Kawamoto, T 等人，
Analytical Biochem· 130 (1983) 445-453 之一般形式， EP -A 0 248 656 ’Kowar，J·及Franek，F·酵素學方法421 (1986) 277-292 ，Bavister， B· Expcology 271 (1981) 45-51 ， EP-A 0 481 791 ， EP-A 0 307 247 ， EP-A 〇 343 635 ， WO 88/00967 〇 在EP-A 0 267 678中以S_Sepharose離子交換層析法，
Cs管柱之預備反相HPLC及膠體過濾層析法純化透析作用後 φ 無血清培養產製之EP0。在此發明中，膠體過濾層析法步 驟可以S-Sepharose快速之離子交換層析法取代，咸提議 可在離子交換層析法之前先進行B 1 u e T r i s a c r y 1管柱染劑 層析法。
Nobuo， I.等人，J. Biochem· 107 (1990) 352-359 中 揭示純化重組EPO的方法，在此方法中，純化步驟之前， EP0係以Tween® 20溶液，苯基曱基磺醯基氟，乙基順丁烯 二醯亞胺，胃蛋白酶抑制素A，硫酸銅及草醯胺酸處理。 文獻（包括Burg 1 996年11月14日印行之w〇 9 6/357 1 8 )揭示仙 以無血清發酵方法（EPOsf)製備紅血球生成素。 〇 根據本發明之EP0或EP0共輛物專一活性可以技藝中所熟 知的各式方法測定之。本發明純化EP0蛋白質的生物活性 是病患注射投用EP0蛋白質後，所產生骨髓細胞之網狀細 胞及紅血球細胞，與未注射或控制組受體比較後所增加之 -
第34頁 1288643 五、發明說明（32) 量。根據本發明所得及純化之EP〇蛋白質，或其片段的生 物活性可根據Annable 等人，Bull· Wld· Hlth. Org. (1972) 47: 99-112 及Pharm. Europa Spec· Issue
Erythropoietin brp Bio 1 9 9 7 ( 2 )所述之方法測定之。 其他測定EPO蛋白質活性之生物分析方法（老鼠正常紅血球 分析法）揭示於實例6中。 參考下列實例可更明瞭本發明，但這些實例非用以限制 本專利說明書。 實例1 :發酵及純化人類EP0 a)接種物製備及發醢 自液態氮保存槽中氣相中取出一小瓶源自可產製EP0之 CH0細胞株（可使用ATCC CRL869 5，揭示於EP 41 1 678(遺 傳學機構））。細胞移種至玻璃旋轉瓶中，並以碳酸氫鹽為 緩衝液之培養基置於濕控C02培養箱中培養。製備接種物 及發酵時所用的典型無血清培養基揭示於Koch於1 992年6 月12日印行之歐洲專利案5 1 3 738，或Burg於1 9 96年11月 14日印行之W0 96/3571 8，例如包括培養基DMEM/F12(例如 JRH Biosciences/Hazleton Biologies，丹佛，美國，序 號57-736 )，及另外加入碳酸氫鈉，L+麩胺酸，D+葡萄糖 ，重組胰島素，砸化納，二胺基丁院，氫基可體松，硫酸^ 鐵（I I )，天冬醯胺酸，天冬胺酸，絲胺酸及哺乳細胞用之 穩定劑，諸如聚乙烯醇，甲基纖維素，聚葡聚糖，聚（乙 二醇），普洛尼克F68，原生質增大聚膠（HEMACCEL®)或聚 乙烯吡咯烷酮（W0 96/3571 8 )。
第35頁 1288643 五、發明說明； 以顯微鏡檢查細胞培養未受微生物污染 度，每次分盤步驟時均需要進行此一測試 並檢視細胞密 百次生長期後，用新鮮培養基稀釋細胞培養至開始的細 胞密度，並進行另-次的生長循環，重複此—步驟直至每 個玻璃旋轉瓶中約有2公升的培養體積，約12次後，可得丄 至5公升細胞培養，可作為10公升接種物發酵槽的接種物 3-5天後，1 0公升發酵槽中的細胞培養可作為丨〇〇公升接 種物發酵槽的接種物。 另外培養3 - 5天後，1 〇 〇公升發酵槽中的細胞培養可作為 1 0 0 0公升生產發酵槽中的接種物。 b) 收集細胞及細胞分錐 使用批次重複培養方法，換言之，當達到所要的細胞密 度時’收集約8 0 %的細胞培養，所剩細胞培養再予以補充 新鮮之培養基，並培養至下次細胞收集時。一次生產回合 包括最大1 0次的細胞收集：9次部分的細胞收集及1次總量 細胞培養收集。每3 - 4天收集細胞。
測定收集之細胞體積移至冷卻的容器中，利用離心或過 濾方法去除丟棄細胞。同步過濾離心步驟時的所含EPO澄 清液並收集在另一個冷卻的容器中。純化步驟期間個別處 理每次收集者。 純化EOP-蛋白質的典型方法揭示於Burg 1996年11月14 曰印行之WO 96/357 1 8中。純化方法如下所述。 a) Blue Senharose層析法
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Blue Sephai^se (Pha口acia)係由以讪訂。“珠共價鍵 結至Cibacron監色染劑的表面上，因為Ep〇對Blue
Sepharose的鍵結力較大多數非—蛋白質污染物、某些蛋白 質不純物及PVA的鍵結力強，故此步驟Ep〇佔大多數。增加 鹽類；辰度及pH可進行Blue Sepharose的沖堤作用。 ,管柱以80- 1 0 0升的Blue Sepharose充填，以Na0H再生， 並以平衡緩衝液（氯化鈉/鈣及乙酸鈉）平衡之，加入酸化 及濾過的發酵澄清液。完成後，以平衡緩衝液相似之緩衝 液(4含有較高濃度之氯化鈉）清洗之，而後用。。—基緩衝 液清洗，用Tr i s-基緩衝液沖堤並根據主要沖堤圖收集單〇 一分液。 L) Butyl Toy〇Deari 埽析氺 B^ityl Toyopearl 65〇c (T〇s〇 Haas)是聚苯乙烯基礎之 基質’其上共價鍵結脂肪族丁基殘基。因為EPO比大多數 不純物及PVA對此膠狀物有較強的鍵結力，必須以含有異 丙醇之緩衝液沖堤之。
官柱以 30-40 升的 Butyl Toyopearl 650C 充填，以 NaOH 再生’用Tris-基緩衝液清洗，並以含有異丙醇之Tris 一基 緩衝液平衡之。 。將Blue Sepharose沖堤液中的異丙醇濃度調整至與管柱 平衡緩衝液相同，並加至管柱中，而後以較高的異丙醇濃 度^平衡緩衝液清洗之，用沖堤緩衝液（具有較高異丙醇 含S之Tris-基緩衝液）沖堤產物，並根據主要沖堤圖收集 單一分液。
第37頁 1288643 五、發ΐ說明㈤ ~~ ' ' ----—、 —輕碟灰石超勝體層析法 羥磷灰石超膠體（Bi〇sepra)含有羥磷灰石，其併入至 脂糖基質内，以增加機械特性。Ep〇對羥磷灰石的親合力夏 低三故比蛋白質不純物以較低磷酸濃度時可被沖堤出來。 管柱以30-40升的羥磷灰石超膠體充填，以磷酸鉀/ 鈣緩衝液及NaOH再生，後用Tris—基緩衝液清洗，而後以匕 含有低量異丙醇及氯化鈉之Tri s -基緩衝液平衡之。 將經Butyl Toyopear 1層析法純化含有epq沖堤液加至管 柱中，而後以平衡緩衝液及不含異丙醇及氯化鈉之Tris/ 基緩衝液清洗管柱，以含有低濃度磷酸鉀之Tris_基緩衝 液沖堤產物，根據主要沖堤圖收集單一分液。 ^l^ydac C4 之反相ΗΡΤ,Γ RP-HPLC物質Vydac C4 (Vydac)係由矽膠顆粒所組成， 矽膠表面帶有C4-烷基鏈。自蛋白質不純物中分離Ep〇是基 於對疏水相互作用的強度之差異。用溶於三氟乙酸之梯度 -濃度乙腈進行沖堤作用。 利用不鏽鋼管柱（填充2. 8至3. 2公升之Vydac C4矽膠）進 行預備Η P L C ’添加三氟乙酸酸化之羥磷灰石超膠體沖堤液 ，並加至Vydac C4管柱中，利用溶於稀釋三氟乙酸之梯度 濃度乙腈進行清洗及沖堤，收集分液並立即以磷酸缓衝液 中和。將在IPC限量内的EP0分液倒在一起。 DEAE Sepharose 層析法 DEAE Sepharose (Pharmacia)物質由共價鍵結至 Sepharose珠表面上之二乙基胺基乙基（Deae)基團所組成 ·:
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第39頁 1288643 五、發明說明（37) 猶 基-PEG-SBA(16· 5微莫耳）（購自 shearwater P〇iymers，
Inc·，Huntsville, Alabama)之0·1 Μ磷酸鉀緩衝液（ρίί 7· 5)，並在室溫下（2〇 —23 °C )混合2小時，最終蛋白質濃度 為5毫克/毫升，而蛋白質：pEG藥劑比例為i : 3。兩小時 後，以冰醋酸調整pH至4·5終止反應，並保存於-2〇t下， 直至純化。 純化作用 1·共，物混合物··將約28毫升的SP-SEPHAR〇SE FF(硫一丙 基離子父換樹脂）填充至AMICON玻璃管柱（2· 2x7. 5公 分）f，並以20 mM乙酸緩衝液（ρΗ 4· 5)平衡之，流速為 1 50宅升/小時。以平衡緩衝液將内含3〇毫克蛋白質之6 毫升的反應混合物稀釋5倍，並加至管柱中，以緩衝液 清洗掉未吸附之物質，並以溶於平衡緩衝液之〇·丨75 M NaCl將吸附之PEG共軛物混合物沖堤出來，以75Q mM N^aCl將仍留置於管柱中之未經修飾的Ep〇sf沖堤出來， 官柱再以起始緩衝液平衡之。以SDS —pAGE分析樣品，並 f定其配集化的程度。咸發現〇· 175M NaCl沖堤液含有 單-及一及少量的三—配集化產物，而75〇 _ Μ。沖堤 液則含有未經修飾之EPQsf。 2·二-PEG及單-PEG-EPOsf ··用緩衝液將前述步驟自管柱中 所冲纟疋出之純化共輛物混合物稀釋4倍，並加至管柱内 ’=則述方法清洗。分別以〇· J M NaC1及〇· 175 M NaCl 自官柱中將二-PEG-EPOsf及單一peg-EPOsf沖堤出來，以 75 0 mM NaCl將所剩任何未經修飾之Ep〇sj：沖堤出來。另 1288643 五、發明說明（38) 一方面，以乙酸緩衝液將反應混合物稀釋5倍，並加至 SP-Sepharose管柱中（〜0· 5毫克蛋白質/毫升膠），清洗 管柱，並以前述方法將所吸附單—，：_peg_ EPOsf及未經修飾之EPOsf沖堤出來。 結果 利用化學共軛合成平均分子量為3〇 kDa之直鏈PEG分子 PEG-EPOsf，EP0sf的一級胺基與30 kDa PEG- 丁酸之琥珀 酸酿亞胺S旨衍生物的醯胺鍵結反應，而產生p E G — E p 〇 s f。 結果摘要於表1。利用SDS-PAGE分析測定顯示，純化共 軛物有單-及二-PEG-EPOsf，且不含未經修飾之EPOsf，共 幸厄物混合物共有23.4毫克或為78%之起始物質。陽離子交 ，層析法分離單-及二-PEG-EPOsf顯示，共軛物混合物中 單-與二-PEG的比例幾乎為1 : 1。反應完成之後，單： 二：未經修飾之個別成分比例為4 〇 : 3 8 : 2 0 (%)。整體產 量幾乎完全定量。 表1 : EP〇sf配集化作用結果的摘要 」蛋白質（毫克)_產量（％) 反應混合物 30 1〇〇
單- 12·0 40 二- 11.4 38 未經修飾 6.0 20 共幸厄物混合物 2 3.4 7 8 實例3 :以mPEG-SPA配集化ΕΡ0 與不同於實例2中所用的EP〇sf量與30 kDa曱氧基-PEG-
1288643 五、發明說明（39) SPA (Shearwater Polymers， Inc., Huntsville, A 1 abama)反應。反應進行時蛋白質：藥劑的比例為1 : 2， 根據實例2中的純化技術進行純化，主要產生的是單〜配集 化產物。
實例4 :共價鏈結硫醇基至EP0上 此實例揭示測試共價鏈結硫醇基至EP0上的反應條件， 為測定條件，將不同含量之保護硫醇基（此處為SATA或 SATP(溶解於DMS0，約10毫克/毫升））加至EP0溶液（此處為 1毫升的5毫克/毫升EP0，溶解於10 mM鱗酸钾，50 mM NaCl，ρΗ 7·3)中，攪拌反應約30分鐘（25°C)，並加入1 Μ 離胺酸（最終濃度為1 0 mM)終止反應。以1 〇 填酸舒，50 mM NaCl及2 mM EDTA，ρΗ 6·2進行透析作用去除過多的 SATA及SATP。利用羥基胺去除保護基乙醯基，根據
Grasetti， D.R·及Murray, J.F 在J· Appl. Biochem.
Biotechnol· 119，41-49 頁（ 1 967 )中所述的方法，以二硫 口比ϋ疋利用光學方式測定硫醇基共價連結至EPQ的數目。 每ΕΡ0分子共價連結之硫醇基數目如下所 EPO : SATA 或 SATP 的 莫耳比例 莫耳硫醇基/莫耳EPQ EPO : SATA=1 : 3 ΐΤδ' EPO ： SATA=1 ： 5 2ΤΓ EPO : SATA:1 : 6 EPO ： SATP=1 ： 3 1.1 ~ EPO ： SATP=1 ： 4 2ΤΓ" · EPO : SATP=1 ·· 6 3.7 ~'
1288643 五、發明說明（40)
實例5 :以甲氧基-PEG-順丁烯二醯亞胺修飾活化EPO A) 活化EPO :
根據實例2，以SATA活化根據實例1所製得之1〇〇毫克EPO (以老鼠正常紅血球分析測得1 9 0，0 〇 〇 I U /毫克）（莫耳比例 :EPO/SATA=l/5)，利用實例1中所述的透析方法，將帶有 共價連結保護硫醇基之所得之ΕΡΟ(π活化EPO”）與副產物 (如Ν-羥基-琥珀醯亞胺或未反應之SATA分離，可得4. 5毫 克/ 毫升溶於10 mM 磷酸鉀，50 mM NaCl，2 mM EDTA，pH 6. 2之活化EPO溶液。 B) 活化EPO的配集化作用： 们 將前述具有π最佳π結構之380毫克甲氧基-PEG-順丁烯二 驢亞胺（分子量30.000 ; Shearwater Polymers, Inc.，
Huntsvi 1 le (Alabama, USA))溶於含有95 毫克活化EPO(溶 於 10 mM 磷酸鉀，50 mM NaCl，2 mM EDTA，pH 6.2 之 4.5 毫克/毫升溶液）溶液中，溶液中活化EPO與曱氧基-peg-順 丁稀二酿亞胺的莫耳比例為1 : 4，添加1 μ羥基胺水溶液 將〉辰度調整至30 mM ’pH 6·2至上述溶液中，將活化epq共 價連結保護之硫醇基去保護，反應混合物中所得活化的 ΕΡ0含有游離硫醇（-SH)基。硫醇去保護後，於此含有游離 硫醇（-SH)基之活化ΕΡ0與曱氧基—PEG—順丁烯二醯亞胺立Φ 即進行偶合反應90分鐘（攪拌，25 t)，反應混合物中添加 〇· 2半胱胺酸水溶液將濃度調整至2 mM以終止偶合反應的 進行，30分鐘後，添加〇· 5 μ N—曱基順丁烯二醯亞胺之 DMS0溶液（使最終濃度達5 mM)將未與甲氧基— pEG—順丁烯
1288643 五、發明說明（41) 二醯亞胺反應之活化的游離硫醇基保護，3 0分鐘後，將所 得含有配集化EPO之反應混合物，以1 0 mM磷酸鉀，pH 7. 5 進行長達1 5小時以上的透析作用。 C)純化配集化E P 0產物： 為自反應混合物中分離配集化EPO產物，進行下列的純 化方法：用10 mM填酸鉀，ρΗ 7·5平衡50毫升Q-Sepharose f f管柱，將步驟B)所得之反應混合物加至管柱中（流速： 每小時3管柱體積（CV))。為了分離未反應的甲氧基-PEG-順丁烯二醯亞胺藥劑，以5 C V的1 0 m Μ填酸鉀，p Η 7 · 5清 洗管柱，以增強鹽類梯度濃度之5 CV緩衝液A (10 mM磷酸4 鉀，pH 7.5)及 5 CV 緩衝液 B (10 mM 磷酸鉀，50 0 mM NaCl ，pH 7· 5)利用每小時3 CV的流速沖堤管柱分離配集化EPO 產物，根據NaCl梯度濃度，配集化的EPO產物（三―，二一及 單-配集彳bEPO產物）先沖堤出來，其後為未配集化的epo產 物。含有配集化EP0產物沖堤液之分液（三―，二―，及單- · 配集化EP0產物）倒在一起，並過濾（以〇 · 2微米濾膜過濾） 、 〇 以Coomassie 染色SDS-PAA膠片（Laemmli, Nature 227， 680-685 ( 1 970 ))評估三-，二-，及單—配集化Ep〇產物的 含里及純度’而蛋白質濃度係根據Beer 一 Lambert定律在 280毫微米測定之。SDS-PAA電泳所測定EP0產物的視分子 量約68 kDa(單-配集化EP0產物），約98 kDa(二-配集化 EP0產物）’及約1 28 kDa(三-配集化epo產物）。 - 利用層析法（如大小排除層析法（Superdex，pg 2〇〇 ; ：
第44頁 1288643 五、發明說明（42)
Pharmacia)可進一步分離三-，二-，及單-配集化EPO產物 。利用下述的方法進行含有三-，二-，及單-配集化EPO產 物沖堤液的活體内生物活性測定。 實例6 :利用老鼠正常紅血球方法分析 測定配集化EPO的活體内活性 老鼠正常紅A球生物分析法是技藝中所熟知的（？}13]：111· Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)) 及是一種Ph· Eur· BRP·之紅血球生成素的monography之 方法。用BSA-PBS稀釋樣品。以皮下注射方法，將得自實 例2或3之以皮下注射方式，施以正常健康7-15週大老鼠 馨 0.2毫升内含未配集化EP0或實例2或3之三-，二，或單-配 集化EP0之EP0分液。未配集化EP0或三-，二-，或單-配集 化EP0施以正常健康，7-15週大的老鼠，6天之後，穿刺尾 巴靜脈取血，並將1微升的血液以i毫升之〇. 1 5微莫耳之亞 _ 啶橘染色溶液稀釋，染色時間為3至1 0分鐘，在流動細胞 計數儀分析紅血球螢光組織圖計數紅血球網狀細胞，紅血 球網狀細胞係以絕對數值表示（分析3 〇，0 0 0紅血球細胞）， 為呈現數據，每組是由每天5隻老鼠所得之，而老鼠只採 血—次° · 另一個實驗，老鼠施以單一劑量未經修飾之EP0 (25毫 微克EP0) ’實例2之PEG(SBA)-EP0混合物（10毫微克共軛 物），實例2之單-，及二-配集化EP〇 (1〇毫微克共軛物）， 實例3之PEG(SPA)-EP0 (1〇毫微克共軛物），及缓衝溶液， 所得結果列於表2中。結果顯示配集化EP0產物能明顯增加·
第45頁 1288643 五、發明說明（43) 紅血球網狀細胞的含量，而每隻老鼠施以相同劑量（丨〇毫 微克）’與施以25毫微克未經修飾EPO比較，紅血球網狀細 胞有最大量的轉換，顯示配集化的EPO有優良的活性及較 長的半衰期。 表2 EP0(未經 修飾） 30 kDa SPA PEG 單30K SBA 二 30K SBA PEG-EPO SBA共輛物 混合物 控制組 緩衝液 72小時 1000 1393 1411 994 1328 857 96小時 500 1406 1501 926 1338 697 120小時 〜200 1100 1182 791 944 701 144小時 〜0 —535 607 665 660 708 實例7 ··優勢單— peg-EPO的製備 配集彳匕反應 起始時’將根據實例1所製得之丨〇 〇毫克（5 · 4 8微莫耳） EPOsf溶於1〇〇 mM磷酸鉀緩衝液pH 7· 5，添加329毫克 · (10.96微莫耳）之溶於3毫升1 mM HC1之30 kDa PEG-SBA藥 劑’添加足夠量的1〇〇 磷酸鉀緩衝液ρΗ 7· 5，使反應混 合物體積達2 0毫升。最終的蛋白質濃度為5毫克/毫升，而 蛋白質· PEG藥劑比例為1 ·· 2，室溫下（2 〇 _ 2 2 〇c )混合反應 混合物2小時，2小時後，以冰醋酸將pH調整至4. 5終止反 應’並冷康保存於-2 〇 °C，直至純化。 純化作用 以10 Π1Μ乙酸鈉，PH 4.5將先前步驟所得之反應混合物 -稀釋1 . 5，並加至300毫升sp-Sepharose FF(硫丙基陽離 '
第46頁 1288643 五、發明說明（44) " --- 子交換樹脂）所填充之4· 2x19公分管柱中，管柱事先已用 相同的」緩衝液平衡之，用Gils〇n UV監視器監控管柱洗液 在2 8j毫极米之吸收值，並用Kipp &z〇nen紀錄器紀錄。用 300¾升或1基本體積之平衡緩衝液清洗管柱，以去除過多 的藥劑，反應副產物及寡體PEG-EP〇。其後用2基本體積的 100 mM NaCl 清洗，以去除二—PEG — Ep〇，而後用 2〇()
NaCl沖堤單-peg-EPO，在沖堤單—PEG-EPO時，丟棄前5〇毫 升的蛋白質吸收峰分液，收集15〇毫升分液之單—pEG-Ep〇 。以75 0 NaCl沖堤仍留置於管柱内未經修飾肿〇以。所 有的沖堤緩衝液均以平衡緩衝液製之，所有的沖堤樣品均 以SDS-PAGE及高效大小排除層析法（SEC)分析。自15〇毫升 分液中所得之單-PEG 一 EP0庫中未偵測出未經修飾之Ep〇s；f ，將其濃縮至〜4 · 5 - 7. 5毫克/毫升，並透析過濾至保存缓 衝液（1 0 mM磷酸鉀，1 〇〇 mM NaCl，pH 7· 5)中。濃縮/透 析過；慮係以配備5 0 k D a臨界點之M i 11 i p 〇 r e P e 1 1 i c ο η X L Biomax 50 膜之 Millipore LabscaleTM TFF 系統在室溫下進 行’將濃縮的單-PEG-EPO無菌過濾，並保存於—20 °c。 約75% EPOsf經配集化，純化後，總產量〜3〇單—pEG_EP〇 (未偵測到未經修飾之EPOsf )及約25%二-PEG-EP0。募體， 及未配集化EPOsί是所剩的蛋白質，自丨5〇毫升分液所得之 單-PEG-ΕΡ0 庫含有約 90%單-PEG-ΕΡ0 及約 10% 二-PEG-EP0。 實例8 : EP0及配集化EP0在各式調配物中的 熱穩定性：以DSC(區分篩選熱量學）分析 一般接受利用區分篩選熱量學來測定熱變性作用轉換溫
第47頁 1288643 五、發明說明（45)
度是蛋白質熱穩定性的有效指標。利用Nan〇—DSC (Calorimetric Sciences Corporation，Utah, USA)在加 熱速率2 K/分鐘時，分析各式含/不含穩定劑緩衝液中濃 度介於0· 6及1· 2毫克/毫升之紅血球生成素或配集化紅血 球生成素溶液，轉換溫度的上升表示可增加蛋白質的熱穩 疋性’所測的溫度數值不應為絕對的數值，而是代表個別 調配物與另一個調配物間穩定性的差異。 為了定義調配物的最佳pH，研究介於4至9間pH依賴之熱 變性配集化紅血球生成素，蛋白質樣品在3〇 mM Na2HP〇4 \ 30 mM檸檬酸鈉，30 mM硼酸中分析。圖！顯示最高的轉換· 溫度之平原期介於約pH 6至約pH 9之間，而低於5.5時 則快速的下降。此表示最高熱穩定性之最佳pH是高於5· 5 (圖 3) 〇 為了研究離子強度的效應’測定熱變性作用與鱗酸濃度 的依賴度’圖4顯不當调配物的離子強度增加時，熱穩定 性會增加。 ~ 亦利用D S C來研究緩衝液物質的影響。從圖5吾人可見， 最適合高熱穩定性的緩衝液或添加物是硫酸、檸檬酸或石粦 酉欠。目别常用於调配物中作為緩衝物之甘胺酸並不非常適 當（參考前文）。 圖6顯示，硫酸在低pH(例如pH 6· 2)時，亦為一適當的 緩衝物/添加物，而磷酸在pH 6· 2時比PH 7. 5時較為不適 當’此顯示硫酸即使在低pH時仍能保持熱穩定性，此發現 讓pH介於6.0至6.5之調配物不會嚴重失去紅血球生成素的
第48頁 1288643 五、發明說明（46) --- 熱穩定性。 實例9 ··熱壓力下EPO及配集化EPO的凝集作用··以 SDS-PAGE(硫酸月桂酸鈉聚丙烯醯胺膠電泳）分析 上為了研究熱壓力對紅血球生成素蛋白質的效7應=將不同 调配物樣品暴露於熱壓力下（2 〇分鐘8 0它），並在還原狀態 (樣品緩衝液中含DTT)及非-還原狀態（樣品緩衝液中'不含e DTT)下以SDS-PAGE分析，此方法可以偵測到共 、成物質。如前所述，凝集形成物質是蛋白質主二;；途 徑，因此在醫藥蛋白質調配物中應該避免發生。不含還原 劑（例如DTT)狀態下可偵測到凝集物，而含有還原劑時， 不會谓測到凝集物，此極有可能是因在熱壓力下不正確的 雙硫鍵（一種氧化反應）所致，此實驗明顯顯示在pH低於 6. 5 %可抑制凝集物的形成，高pH時，則會有高含量的凝 集物。，在SDS-PAGE時，以還原劑處理樣品後，可還原大多 ，所开^/成的政劑物’此推測在熱壓力下所开）成之大部分的 凝集物是為雙硫鍵雙體，募體及高層次的凝集物。综合以 上’研究顯示將調配物的pH保持在6 5或低於6 5，可避免 凝集物大量的形成。 圖配集化-EPO凝集作用與pH的依賴性。以SDS —pAGE 分析經，壓力處理之配集化— Ep〇樣品（如前所述）。以銀染 色Ϊ白質1行1 :分子量標準品。行2 : pH 5。行3 ·· pH 5 還原狀：。行4 . P Η 6。行5 : ρ η β，還原狀態。行6 : pH 6· 5。行7 ·· pH 6· 5，還原狀態。行8 : ρΗ 7。行9 : ρΗ 7，還原狀態。行10 :配集化-EPO，未經壓力處理。 1288643 五、發明説明（47) 使用抗氧化劑亦可避免凝集物的形成。圖8顯示使用1毫 克/毫升乙醯基半胱胺酸為抗氧化劑可避免熱壓力下凝集 物的形成，因此，在熱壓力下，在低pH (如pH 6.2)時，可 使用抗氧化劑（如乙酸基半胱胺酸）預防凝集物的形成。 圖6 :ρΗ 6· 2及/或乙醯基半胱胺酸可預防配集化EPO凝 集物。以SDS-PAGE分析經熱壓力處理之配集化EPO樣品（如 前所述）。以銀染色蛋白質。行1 :配集化EPO，未經壓力 處理。行2 · p Η 7 · 5，經麗力處理。行3 ·· p Η 6 · 2，經邀力 處理。行4 : pH 6. 2，經壓力處理，還原狀態。行5 : pH 7· 5 ’ 1毫克/毫升乙醯基半胱胺酸，壓力處理。行6 : ΡΗ φ 7· 5 ’ 1毫克/毫升乙醯基半胱胺酸，壓力處理，還原狀態 〇 實例1 0 : 4、2 5、3 0及4 0 °C時，於各式 調配物中配集化-EPO的穩定性 —在數種溫度下，培養各式調配物中的配集化EPO，在所 不的時間點，取出樣品，利用反相高效層析法（rpHPLC)，， 2欢大小排除層析法（SEC)及SDS_PAGE分析穩定性。表3比 ^ ^種溫度下各式調配物中配集化EPO的穩定性，這些數 ，顯顯示本專利說明書所揭示之調配物在蛋白質回收率 减集作用方面較優。
第50頁 1288643 五、發明說明（48) 表3 :各式調配，之配集化EPO在數種溫度時之穩定性 在不同溫度下6個月後的回收率％ 在30°C可偵 測之凝集作 用（+/-） 調配物 % 配集化EPO (微克/毫升） 4°C 25〇C 30°C 40°C A 10 92 91 n. d. 39 1 _χ / n. d. B 50 97 98 97 78 C 50 95 79 79 52 + E 50 103 102 100 87 A 100 96 97 η. d. 150~ n. d. B 400 101 101 101 _77 C 400 100 94 90 56 一· .丨丨 + D 400 9—8 96 93 73 一 E 400 99 98 100 66 - 調配物為： 調配物A : 10 mM磷酸納，100 mM氯化納，pH 7 5。 調配物B ·· 1 0 m Μ碌酸納，4 0 m Μ硫酸納，3 % (重量/體g )甘 調配物C : 10 mM 磷酸鈉，100 mM NaCl，pH 7. 〇。
mM
調配物D ·· 1 0 mM填酸納，1 2 0 mM硫酸鈉，ρη 6 2。 調配物Ε : 40 mM精胺酸，30 mM硫酸鈉，3%甘露醇 CaCl2，ΡΗ 6· 2 °
實例11 :最佳調配物抑制EPO蛋白質甲硫胺酸54 的氧化作用’甲硫胺酸為抗氧化劑 各式調配物中配集化EP0於數種溫度下培養，6個 , 取出樣品，並以下方法測定甲硫胺酸54氧化作用的1後’ 簡而言之，用内-蛋白酶LysC處理EP0樣品，所猓令广度。 π付之肽以反
第51頁 1288643 五、發明說明（49) 相層析法分離，計算肽T8氧化（含有氧化曱硫胺酸54 )與肽 T8(含非-氧化甲硫胺酸54)之比例，數據摘要於表4.。 表i :各式調配物中ΕΡΟ在所示溫度下6個月後氧化曱硫胺酸 54的程度 _ 曱硫胺酸54氧化％ 調配物 本 配集化ΕΡΟ (微克/毫升） 4°C 25〇C 3(TC 40°C A 400 2.00 15.89 24.89 37.89 B 400 2. 33 6. 55 12.88 30. 24 C 400 2.51 2. 95 5. 99 14.4 A 50 5. 37 21.36 1 30.62 48. 05 B 50 3. 44 13.38 16.59 30. 83 C 50 4.41 5. 52 10.01 15.62 *調配物如下所示： 調配物A : 10 mM磷酸鈉，100 mM氯化鈉，pH 7. 0。 調配物B，： 1 0 mM磷酸鈉，40 mM硫酸鈉，3%(重量/體積）甘 -露醇，pH 6· 2。 . 調配物C : 1 0 mM磷酸鈉，40 mM硫酸鈉，3%(重量/體積）甘 露醇，1 mM曱硫胺酸，pH 6· 2。 這些數據明白顯示本發明較佳調配物（1 0 mM磷酸鈉’ 40 mM硫酸鈉，3%(重量/體積）甘露醇，pH 6· 2)在甲硫胺酸54 氧化作用方面優於其他調配物，如1 0 mM磷酸鈉，1 〇 〇 mM 氯化納，P Η 7 · 0。調配物中添加1或1 0 m Μ甲硫胺酸明顯可 抑制甲硫胺酸5 4的氧化作用，因此，甲硫胺酸係作為抗氣 化劑，可穩定ΕΡΟ。 實例12 :各式調配物配集化ΕΡΟ的SIALIC酸的含量
第52頁 1288643 五、發明說明（50) 為了分析配集化EPO醣蛋白碳水化合物結構的完整性， 標準技術分析於各種溫度下保存6個月後，最佳調配 =中，集化EP0樣品中唾液酸的含量。這些數據顯示蛋白 ^保存於本專利說明書中新穎調配物後，碳水化合物結構 並未受到負面影響（圖9 )。 貝例1 3 .配集化Ε Ρ 〇保存於南溫一段時間後的生物活性 為了證明配集化EPO保存在1〇 mM磷酸鈉，4〇 ，3%(重量/體積）甘露醇，PH 6.2下，對活體内生物活性 不會有負面影響，進行研究標準老鼠Ep〇分析（參考實例6) 。配集化EPO樣品在所示的溫度4、25及3〇它下，保存於1〇 滷磷酸鈉，40 mM硫酸鈉，3%(重量/體積）甘露醇，pH 62 6個月後’與新鮮參考標準品比較，顯示並未失去活體内 活性（圖1 0 )。 貫例1 4 · 6個月後保存於高溫下配集化Ep〇的凝集含量 為了研究配集化EPO樣品增溫保存於1〇 _磷酸鈉，4〇 mM硫酸鈉，3%(重量/體積）甘露醇，ρΗ 6· 2下6個月後所形 成凝集物含量，取出樣品，並以大小排除層析法分析。 在4、25及30 C下並未有凝集物形成，證明配集化Ep〇在 上述的調配物中相當的穩定，圖j i顯示大小排除層析法分 析的圖形。 1
第53頁 1288643 五、發明說明（51) (1) 一般資訊： (i)申請者： (A ) 姓名：F · 序列表
Hoffmann-La Roche AG (B) 街名 (C) 城市 (E)國家 :124 Grenzacherstrasse • Basle :Swi tzer1 and (F) 郵遞區號（ZIP) ·· CH-40 70 (G) 電話號碼：（6 1 ) 688 1 1 1 1 (H) 傳真：（ 6 1 ) 688 1 3 9 5 (I) TELEX ： 962 292 hlr ch (i i)發明標題：新穎醫藥組合物 (i i i)序列數目：2 (i v) ’電腦讀取： (A) MEDIUM類別：軟碟 (B) 電腦：IBM PC相容者 (C) 操作系統：WORD (D) 軟體：Patentln Release 2· 0 <170> Patentln Ver. 2.0 <210 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo saoiens « _
第54頁 1288643 五、發明說明（52) <400> 1
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Lei: Giu Airg Tyr Leu 1 5 I〇 15
Leu Glu Ala Lys GIu Ala Glu Asn lie Thr Thr Glv Cvs Ala Glu His 20 25 …3〇
Cys Ser Leu Asn Glu Asn He Thr Val Pro Aso Thr Lvs Val Asn Phe 3: 40 45
Tyr Ala Trp Lys Arg Mer Glu Val Giy Gin Gin Ala Val Glu Val Trp 50 55 60
Gin G丄’y Leu Ala i^eu he’d Ser Glu Ala Val Leu Arc Gly Gin a Leu 65 75 ^ 80
Leu Val .Asr： Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp δ5 90 95 ·
Lys Ala Val Ser Glv Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arq Ala Leu 100 105 no
Giy Ala Gin Lys Giu Ala lie Ser Pro Pro Asd Ala Ala Ser Ala Ala U5 120 ' 125
Pro Leu Arg Thr He Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Giy Lvs Leu Lvs Leu Tvr Thr Glv Glu Ala · 150 155 ^ 160
Cys Arg Thr Giy Asd 165
<210> 2 <2I1> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <4〇0> 2 Λ13 Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 15 10 15
Leu Giu Ala Lys Giu 20
II
Glu Asn lie Thr Thr Glv Cys Ala Glu His 25 ' 30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 ξ〇 ^ 45
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Glv Gin Gin Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 ‘
第55頁 1288643 五、發明說明（53)
Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser GIu Ala Val Leu Arg G1v Gin A1a Leu 65 70 75 ^ 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 85 90 95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu ^ 100 105 110
Gly Ala Gin Lys GIu Ala lie Ser Pro Pro Asp Aia Ala Ser Ala Ala 115 120 ' 125
Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Aso Thr Phe Arg Lvs Leu Phe Arg Val 130 135 ' 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Ara Gly Lys Leu Lys Leu Tvr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 一 160 Φ
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 Φ
第56頁 1288643 圖式簡單說明 第57頁

Claims (1)

1288643 修正: 案號 90111453 六、申請專利範圍 種用於預防及治療與紅血球生成有關疾病之液態醫 經配集化（pegylated)紅血球生成素蛋 溶液pH範圍約5. 5至約7. 0範圍之醫藥可 多價無機陰離子，及視情況含有一種或 賦形劑，該液態醫藥組合物於室溫下呈 藥組合物，其包括 白質，於適合保持 接受缓衝溶液中之 多種醫藥上可接受 穩定狀態。 2. 根據申請專利 3. 根據申請專利 4. 根據申請專利 子是多價無機強 5. 根據申請專利 酸、擰檬酸或磷 6. 根據申請專利 根陰離子。 7. 根據申請專利 耳/公升硫酸。 8. 根據申請專利 離 硫 酸 莫 6. 6. 6 · 範圍第1項之組合物，其為水溶液。 範圍第2項之組合物，其為等張溶液。 範圍第1至3項任一項之組合物，其中陰 酸的陰離子。 範圍第4項之組合物，其中陰離子選自 酸。 範圍第4項之組合物，其中陰離子為硫 範圍第6項之組合物，其包括10至200毫 範圍第1項之組合物，其中pH為5. 8至 9.根據申請專利範圍第8項之組合物，其中pH為6. 0至 5 ° 1 0 ·根據申請專利範圍第9項之組合物，其中pH為約 2 〇 1 1 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其中緩衝液係選 磷酸或精胺酸/H2S04/Na2S04緩衝液所組成之群。
O:\70\70586-940912.ptc 第58頁 1288643 , _案號90111453 作4年ο6[月 曰 修正_ 六、申請專利範圍 1 2 .根據申請專利範圍第1 1項之組合物，其中緩衝液為 1 0至5 0毫莫耳磷酸緩衝液。 1 3.根據申請專利範圍第1項之組合物，其中組合物包括 一種或多種醫藥上可接受之賦形劑。 1 4.根據申請專利範圍第1 3項之組合物，其中一種或多 種醫藥上可接受之賦形劑係選自醫藥上可接受鹽類、稀釋 劑、溶劑及保存劑所組成之群。 1 5.根據申請專利範圍第1 3項之組合物，其中醫藥上可 接受之賦形劑係選自等張劑、聚醇、抗-氧化劑及非-離子 清潔劑所組成之群。 1 6.根據申請專利範圍第1 5項之組合物，其中醫藥上可 接受賦形劑為聚醇。 1 7.根據申請專利範圍第1 6項之組合物，其中聚醇係選 自甘露醇、山梨糖醇、甘油、海藻糖及蔗糖所組成之群。 1 8.根據申請專利範圍第1 7項之組合物，其中聚醇為甘 露醇。 1 9.根據申請專利範圍第1 3項之組合物，其包括抗氧化 劑。 2 0 .根據申請專利範圍第1 9項之組合物，其中抗氧化劑 為曱硫胺酸。 2 1 .根據申請專利範圍第1 3項之組合物，其包括至高達1 毫莫耳/公升CaCl2。 2 2.根據申請專利範圍第1 5項之組合物，其中非-離子清 潔劑為聚山梨酸80、聚山梨酸20或普洛尼克（pi uronic)
0:\70\70586-940912.ptc 第59頁 1288643 _案號 901Π453_沒“年p4[月 日__ 六、申請專利範圍 F68 ° 2 3.根據申請專利範圍第2 2項之組合物，其中非-離子清 潔劑為普洛尼克F 68。 2 4.根據申請專利範圍第2 2項之組合物，其中組合物包 括至高達1 % (重量/體積）之非離子性清潔劑。 2 5 .根據申請專利範圍第2 2至2 4項之組合物，其中組合 物包括至高達0 · 1 % (重量/體積）之非離子性清潔劑。 2 6.根據申請專利範圍第1項之組合物，其中紅血球生成 素蛋白質為人類紅血球生成素。 2 7.根據申請專利範圍第2 6項之組合物，其中紅血球生 成素蛋白質藉由内源性基因活化表現。 2 8 .根據申請專利範圍第2 6項之組合物，其中紅血球生 成素蛋白質具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的胺基酸序 列。 2 9 .根據申請專利範圍第2 6項之組合物，其中蛋白質具 有經1至6個醣化位置加成修飾之人類紅血球生成素序列。 3 0 .根據申請專利範圍第2 6項之組合物，其中紅血球蛋 白質具有經修飾之人類紅血球生成素序列，修飾作用選自 Asn30Thr32 ； Asn51Thr53 ; Asn57Thr59 ； As n69 ； Asn69Thr7i ；
O:\70\70586-940912.ptc 第60頁 1288643 . _案號90111453 年月 日 修正_ 六、申請專利範圍 Ser68Asn69Thr71 ; Va l87Asn88Thr90 ; Ser87Asn88Thr90 ； Ser87Asn88Gly89Thr90 ； Ser87Asn88Thr90Thr92 ； Ser87Asn88Thr9GAla162 ; Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90 ; Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 ； Asn89I le90Thr91 ； Ser87Asn89I le90Thr91 ； Asn136Thr138 ； Asn138Thr140 ; Thr125 •，及 Pro124Thr125 o 3 1 .根據申請專利範圍第2 6項之組合物，其中人類紅血 球生成素序列經至少一個醣化位置之重組作用修飾。 3 2.根據申請專利範圍第3 1項組合物，其中重組作用包 括刪除人類紅血球生成素任何N -鏈結醣化作用位置及加成 人類紅血球生成素序列位置8 8 N -鏈結醣化位置。 3 3.根據申請專利範圍第3 1項組合物，其中紅血球蛋白 質具有經修飾之人類紅血球生成素序列，該修飾係選自下 列所組成之群： Gin24 Ser87 Asn88 Thr90 ； Gin38 Ser87 Asn88 Thr90 ;及
0:\70\70586-940912.ptc 第61頁 1288643 Q _案號90Π1453_a你。1月 曰 修正_ 六、申請專利範圍 Gin83 Ser87 Asn88 Thr90 ο 3 4 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其中紅血球生成 素蛋白質為共輊物，該共軛物包括具有至少一個游離胺 基，及具有使骨髓細胞增加網狀細胞及紅血球細胞產量之 活體内生物活性，及選自人類紅血球生成素及其具有人類 紅血球生成素序列類似物之紅血球生成素蛋白質，該類似 物係經1至6個醣化作用位置之加成作用或至少一個醣化作 用位置重組作用之修飾；該醣蛋白係共價鏈結至 -C0-(CH2)x-(0CH2CH2)ra-0R nff 聚（乙二醇）基上，每個聚 (乙二醇）基之-C0可形成具有一個胺基的醯胺鍵結；其中R 為低碳數烷基；X為2或3 ;m為約450至約900 ;n為1至3， 而所選之η及m會使共輛物分子量減去紅血球_化蛋白分子 量為20千道耳頓至100道耳頓。 3 5 .根據申請專利範圍第3 4項之組合物，其紅血球生成 素蛋白質具有化學式： P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n ( I ) 其中m，η，X及R定義如前所述，及P為不具與聚（乙二醇） 基團形成醯胺鏈結之胺基的紅血球生成素醣蛋白殘基。 3 6 .根據申請專利範圍第3 5項之組合物，其中式（I )中X 為2 ，m為650至750，η為1及R為甲基。 3 7.根據申請專利範圍第1項之組合物，其中紅血球生成 素為共輛物，該共輛物包括具有至少一個游離胺基及具有 使骨魏細胞增加網狀細胞及紅血球細胞之活體内生物活性 之紅血球生成素，該紅血球生成素選自人類紅血球生成素
O:\70\70586-940912.ptc 第62頁 1288643 年月 曰 修正 _案號 90111453 六、申請專利範圍 及其具有加成1至6個醣化作用位置之人類紅血球生成素 一級結構之修飾類似物；該醣蛋白以共價鍵結至一至三個 低碳數烷氧基聚（乙二醇）基，每個聚（乙二醇）基係經由式 -(：（0)-1-34-連結子共價鍵結至醣化蛋白質，其中連結子 的C(O)與其中一個胺基形成醯胺，X為-（CH2)k-，或 -CH2(0-CH2-CH2)k-，让為1 至10 ，\ 為
、 或
每個聚（乙二醇）部分的分子量約2 0千道耳頓至約4 0千道耳 頓，而共軛物的分子量約5 1千道耳頓至約1 7 5千道耳頓。 3 8.根據申請專利範圍第3 7項之組合物，其中共軛物具 有化學式：
其中η為1至3的整數；m為450至900 ;R為低碳數烷基；X為 -（CH2)k-或- CH2(0-CH2-CH2)k-，及P為不具與X形成酸胺鍵結
O:\70\70586-940912.ptc 第63頁 1288643 a_修正 _案號 90111453 六、申請專利範圍 之胺基或基團的紅血球生成素酷蛋白殘基。 3 9 .根據申請專利範圍第3 8項之組合物，其中共軛物具 有化學式：
其中η為1至3的整數；m為450至900 ;R為低碳數烷基；X為 -（CH2)k-或- CH2(〇-CH2-CH2)k-，及P為不具與X形成酿胺鍵結 之胺基或基團的紅血球生成素醋蛋白殘基。 4 0 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其包括每毫升1 0 微克至1 0 0 0 0微克紅血球生成素蛋白質。 4 1 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其包括每毫升1 0 微克至1 0 0 0 0微克紅血球生成素，1 0 - 2 0 0毫莫耳/公升硫酸 ，及10至50毫莫耳/公升磷酸pH 6.0至6.5。 4 2 .根據申請專利範圍第4 1項之組合物，其包括至高達 2 0 mM甲硫胺酸，1-5%聚醇（重量/體積），至高達0· 1%普洛 尼克F68(重量/體積）及視情況至高達1 mM CaCl2。 4 3 .根據申請專利範圍第4 1項之組合物，其包括每毫升 1 0微克至1 0 0 0 0微克紅血球生成素蛋白質，40毫莫耳/公升 硫酸，1 0毫莫耳/磷酸，3%甘露醇（重量/體積），1 0 mM甲 硫胺酸，0· 01%普洛尼克F68(重量/體積），pH 6. 2。 4 4.根據申請專利範圍第1項之組合物，其包括每毫升10 微克至1 0 0 0 0微克紅血球生成素蛋白質，10至100毫莫耳/
O:\70\70586-940912.ptc 第64頁 1288643 ^ _案號90111453 年月 曰_^_ 六、申請專利範圍 公升NaCl，1 0至50毫莫耳/公升磷酸pH 6. 0至7. 0，視情況 1 - 5 %聚醇。 4 5 .根據申請專利範圍第4 4項之組合物，其包括至高達 2 0 mM甲硫胺酸，至高達0. 1%普洛尼克F 68及視情況7. 5微 莫耳/公升CaCl2。 46.根據申請專利範圍第44項之組合物，其包括每毫升 1 0微克至1 0 0 0 0微克紅血球生成素蛋白質，1 0 0毫莫耳/公 升NaCl ，10 mM甲硫胺酸，0.01%普洛尼克F68，及10毫莫 耳/公升填酸，pH 7.0。 4 7.根據申請專利範圍第1項之組合物，其包括每毫升1 0 微克至1 0 0 0 0微克紅血球生成素蛋白質，1 0至50毫莫耳/公 升精胺酸，pH 6至pH 6.5，10至100毫莫耳/公升硫酸鈉。 4 8 .根據申請專利範圍第4 7項之組合物，其包括至高達 2 0 mM甲硫胺酸，至高達0. 1%普洛尼克F 68，視情況至高達 1毫莫耳/公升CaCl2，及視情況卜5%聚醇（重量/體積）。 49.根據申請專利範圍第47或48項之組合物，其包括每 毫升10微克至10000微克紅血球生成素蛋白質，40毫莫耳/ 公升精胺酸’pH 6.2 ’30毫莫耳/公升硫酸納，3%甘露醇 ，10 mM甲硫胺酸，0. 01%普洛尼克F68及視情況1毫莫耳/ 公升CaCl2。 5 0 ·根據申請專利範圍第1項之組合物，其包括2 5至2 5 0 0 微克/毫升紅血球生成素，及 a) 10 mM 鱗酸鈉/_，100 mM NaC 1，pH 7. 0，或 b) 10 mM鱗酸納，120 mM硫酸納，pH 6.2，或
O:\70\70586-940912.ptc 第65頁 1288643 _案號90111453_气彳年月 日 修正_._ 六、申請專利範圍 c) 1 0 mM磷酸鈉，40 mM硫酸鈉，3%甘露醇（重量/體 積），pH 6· 2，或 d) 1 0 mM磷酸鈉，40 mM硫酸鈉，3%甘露醇（重量/體 積），10 mM甲硫胺酸，0.01%普洛尼克F68(重量/體積）， pH 6. 2 ，或 e) 40 mM精胺酸，30 mM硫酸鈉，3%甘露醇（重量/體 積），p Η 6 · 2，或 f) 40 mM精胺酸，30 mM硫酸鈉，3%甘露醇（重量/體 積），10 mM甲硫胺酸，0.01%普洛尼克F68(重量/體積）， pH 6. 2 ° 5 1 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其中紅血球生成 素含量為50、100、400、800或2500微克/毫升。 5 2 .根據申請專利範圍第5 1項之組合物，其包括1 0 mM磷 酸納，40 mM硫酸納，3%甘露醇，10 mM甲硫胺酸，0.01% 普洛尼克F68(重量/體積），pH 6. 2。 5 3.根據申請專利範圍第51項之組合物，其包括40 mM精 胺酸，30 mM硫酸鈉，3%甘露醇，10 mM甲硫胺酸，0. 01% 普洛尼克F68(重量/體積），pH 6.2。 5 4.根據申請專利範圍第1項之組合物，其為冷凍乾燥或 喷霧乾燥粉末。 5 5 . —種製備根據申請專利範圍第1至3項中任一項之組 合物之方法，其包括將紅血球生成素蛋白質與含有多負價 陰離子及視情況一種或多種醫藥上可接受賦形劑之溶液混 合0
O:\70\70586-940912.ptc 第66頁 1288643 修正 _案號 901Π453 六、申請專利範圍 5 6.根據申請專利範圍第1項之組合物，其係用於治療及 預防與慢性腎衰竭（CRF)病患貧血、AIDS及/或接受化療癌 症病患有關疾病。 5 7. —種根據申請專利範圍第1項之組合物之用途，其係 用以製備用於治療及預防與慢性腎衰竭（CRF )病患貧血、 AIDS及接受化療癌症病患有關疾病之樂物。
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