[go: up one dir, main page]

HU230874B1 - Pegilezett humán eritropoietin-fehérjét tartalmazó, szobahőmérsékleten stabil folyékony gyógyászati készítmények - Google Patents

Pegilezett humán eritropoietin-fehérjét tartalmazó, szobahőmérsékleten stabil folyékony gyógyászati készítmények Download PDF

Info

Publication number
HU230874B1
HU230874B1 HU0302114A HUP0302114A HU230874B1 HU 230874 B1 HU230874 B1 HU 230874B1 HU 0302114 A HU0302114 A HU 0302114A HU P0302114 A HUP0302114 A HU P0302114A HU 230874 B1 HU230874 B1 HU 230874B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
preparation according
epo
protein
erythropoietin
peg
Prior art date
Application number
HU0302114A
Other languages
English (en)
Inventor
Apollon Papadimitriou
Original Assignee
F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8168722&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU230874(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by F. Hoffmann-La Roche Ag filed Critical F. Hoffmann-La Roche Ag
Publication of HUP0302114A2 publication Critical patent/HUP0302114A2/hu
Publication of HUP0302114A3 publication Critical patent/HUP0302114A3/hu
Publication of HU230874B1 publication Critical patent/HU230874B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

FEGILEZETT HUMÁN ERITROPOfETÍN-FEHÉRJÉT TARTALMAZÓ, SZOBAHŐMÉRSÉKLETEN STABIL FOLYÉKONY GYÓGYÁSZATI KÉSZÍTMÉNYEK
A találmány pegilezett humán entropoietin fehérjét tartalmazó, szobahőmérsékleten stabil folyékony gyógyászati készítményekre vonatkozik. A találmány szerinti készítmények különösen entropoiesissel kapcsolatos betegségek megelőzésére és kezelésére alkalmasak.
Az entropolesis a vörös vérsejtek termelése, amely a sejtpusztulás megakadályozása céljából játszódik le. Az eritropoiesis szabályozott fiziológiai mechanizmus, amely a sejtok megfelelő oxigénellátásához elegendő mennyiségű vörősvérsejtet bocsát rendelkezésre. A természetben előforduló humán entropoietin (hEPO) a vesében termelődik, és a vörös vénsejtek termelését serkentő humorális plazmafaktor [Carnot, P. és Deflándre, C., G.R. Acad, Scí. .143:432 (1906); Erslev, AJ., Blood 8'349 (1953); Reissmann, K.R., Blood 5:372 (1950); Jacobson, A.O., Goldwasser, E., Freid, W. és Plzak, L.F., Natúré 179:6331-4 (1957)]. A természetben előforduló EPD a ocsontvelőben kialakult eritroid progenítorok osztódását és differenciálódását segíti elő, és biológiai aktivitását az eritroid prekurzorokon a receptorokhoz történő kötődéssel fejti ki [Krantz, B.S., Blood 77:419 (1991)].
Az eritropoíetint rekombináns DNS technológia felhasználásával állítják elő [Egrié, 3.C., Stnckiand, T.W., Lane, J. és fsai, Immunobtol. 72:213-214 (1986)]. Az entropoietin kínai hörcsög petefészeksejtekben (CHO sejtek) illesztett és ott kifejezett klónozott humán EPO gének terméke. A hEPO domináló, teljesen feldolgozott formájának primer szerkezetét a SEQ ID NO:1 szekvenciában tüntetjük fel. A Oys^Oys135 és Cys^-Cys33 között kél szulfid-híd helyezkedik el. Az EPO polipeptid láncának molekulatömege a cukor-molekulák nélklül 18 236 Da. Az intakt EPO molekulában a molekulatömeg kb. 40 %-át a fehérjét a fehérje glikozítezésAhelyeken glikozilező szénhidrát-csoportok teszik ki [Sasaki, H_, Sothner, B., Deli. A. és Fukuda, M., J. Bioi.
Chem. 262:12059 (1987)],
Mivei a humán eritropoíetin a vörösvérsejt-képzödés szempontjából fontos, a hormon alacsony vagy hiányos vőrösvérsejt-termeléssel jellemzett vér- rendel lenességek kezelésére használható. A klinikai gyakorlatban az EPO-t krónikus veseelégtefenségben szenvedő betegeken (CFR) [Eschbach, J.W., Egri, J.C., Downing. M.R. és tsai, NEJM 316: 73-78; Eschbach, J.W., Abduihadi. M.H., Browne, J.K éstsal, Ann. intern. Med. 1'11.992: Egrié,. J.C., Eschbach, J.W., McGutre, T., Adamson, J.W., Kidney Inti. 33:262; Lim, V.S., Degowín, R.L, Zavala, D. és tsai, Ann. intern. Med. 110: 108-114], valamint AIDS-ben szenvedd és kemoterápiás kezelésnek aláveted rákos betegek [Dánná, R.P., Rudníck, S.A., Abels, R.I., In: M.B Garnick (ed.) Erythropoietin in Glinioal Applications - An Intemationaí Perspective (New York, N.Y., Maróéi Dekken 301-324,1990)] kezelésére használják,
A pegi lesett erítropoiefin származékok az erítnopoíetin fehégék előnyös csoportját képezik, mert aktivitásuk nagyobb és biológtaf fé -élettartamuk hosszabb az alapfehérjéénéi.
A WO 96/40073 sz, nemzetközi közzétételi irat eritropoietint tartalmazó, nyújtott hatöanyag-felszabaduiású szdárd készítményeket ismertet. Ezek előállításának egyik lépésében az eritropoíetin vizes oldatából ammónsum-szulfátíal kisózzák az eritropoietí nt, és az aggregádíóval szemben így stabilizált szilárd anyagot polimer mátrixban diszpergálják. A 2 171 304 sz. nagy-britanniai és a 4 992 419 sz. USA szabadalom olyan eniropoietín-tartalmú, parenterálisan adagolandó készítményeket ismertet, amelyeket liofiíizáit állapotban kell tárolni, és közvetlenül a beadás előtt kell vízzel a kívánt folyékony alakra hozni. A 909 564 sz. európai szabadalom smínosav stabilizálószerek használatáról számol be eritropoíetin oldatokban. A 178 665 sz. európai szabadalom szerint eritropoietin-készitmények stabilizálásához poíi-etilén glikoit, fehérjéket, cukrokat, aminosavakat. szervetlen sókat, szerves sókat, kéntartalmú redukálószereket vagy ezek kombinációit használják. Ezek a készítmények vizes oldat formájában szobahőmérsékleten való 1 hetes tárolás után már csak az eredeti aktivitás 60-70 %-át őrzik meg. Az. 5 661 125 sz. USA szabadalom eritropoietínt és konzérválószert (benzíl-alkoholt, parabént, fenolt vagy kombinációit) tartalmazó készítményeket ismertet, amelyek hűtőszekrényben tárolva (2-8”C) stabilok.
Az ismert folyékony gyógyászati készítmények legalább egy alábbi hátrányt mutatnak'
Az ismert készítmények csak liofilizátumokként. tarthatók el,. amelyeket közvetlenül beadás előtt kell folyékony alakra hozni. A liofilizáiás bonyolult és költséges művelet. A liofilizátum folyékony alakra hozása többletmunkát igényel a kórházi személyzet részéről, és a készítmény helytelen kezelésének kockázatát is magában hordozza.
Az ismert: készítmények adalékanyagként humán szérumalbumínt tartalmaznak. A humán széruma lbum in az emberi testfolyadékokból leszármaztafható termék,, amely az albumin készítményekben lévő szennyezések miatt vírusos fertőzéseket okozhat. Ezen kívül allergiás reakciók is kialakulhatnak.
Valamennyi jelenleg kereskedelmi forgalomban lévő folyékony készítmény magasabb, azaz a hűtőszekrény! értéket (kb. 2-8¾) meghaladó hőmérsékleten instabil. Ezért az ismert készítmények hűtőszekrényben iároiandók. és szobahőmérsékleten (kb 20®C) nem: tárolhatók. Ez a tárolás és az alacsony hőmérsékleten történő szállítás többletköltséget ökoz, és a gyógyszertermék tárolása is nehézkes. A jelen összefr-üggésben használt instabil” kifejezés azt jelenti, hogy magasabb hőmérsékleten (kb. 25®C) hosszabb időn át (azaz több hónapon keresztül:, vagy fél évnél hosszabb időn át) történő tárolás a: fehérje lebomlásához vezet. A hebómlás* kifejezés ebben az összefüggésben a fehérje magasabb (8°C fölötti, de az átmeneti hőmér séklet alatti) hőmérsékleten ismert mádon lejátszódó fizikai el változásaira (aggregáció vagy denaturálódás) és kémiai elváltozásaira (pl. a kémiai kötések oxidációja vagy módosulása) vonatkozik. így pl a denaturálódás az erítmpoíetín molekulák aggregáeiójához, azaz dimerek (kovalens vagy nem-kovalens), magasahbrendű aggregátumok, sőt mákrorészecskék képződéséhez vezethet. Ezáltal a gyógyászati hatóanyag hatékonysága csökken, és a betegbe történő befecskendezéskor nemkívánt mellékhatások: léphetnek fel. A fehége átmeneti hőmérsékletének közelében vagy a: felett (olvadási hőmérsékletnek is nevezik) történő inkubálása már a fehérje kíhajtogatásához vezet., és így elvesz a polípeptíd natív szerkezete és biológiai aktivitása. Az átmeneti hőmérséklet szoros összefüggésben van a fehérje termikus stabilitásával, és a fehérje környezetétől (pl, pH. sók, ionerösség, pufferanyag st.b.) is függ.
Célul: tűztük ki olyan, pegiíezett humán erítropoietin fehérjét tartalmazó folyékony készítmény kidolgozását, amely szobahőmérséklet körül is stabil, és ezt a stabilitását igen hosszú időn át megtartja anélkül:, hogy a pegiíezett humán eritropoietín fehérje észrevehető szerkezeti változást szenvedne.
A fenti: célt a találmány szerinti megoldassa! értük el.
Találmányunk tárgya szobahőmérsékleten stabil folyékony gyógyászati készítmény, amely valamely pegiíezett humán erítropoíetín fehérjéi, az oldat pH-ját 5,5 és 7,0 közötti tartományban tartó gyógyászatilag alkalmas pufferben valamely többszörös töltésű szervetlen aniont és adott esetben egy vagy több gyógyászatilag alkalmas excipienst tartalmaz, ahol az anion szulfát anion.
Meglepő módon azt találtuk, hogy a találmány szerinti: készítményben jelentősen javul: a hatóanyag stabilitása. Ez azt jelenti, hogy a készítmény az aktivitás szignifikáns mennyiségének elvesztése és szignifikáns lebomlás nélkül hűtés nélkül hosszabb Időn át tárolható.
A jelen szabadalmi leírásban és- igénypontokban használt kifejezések értelmezése a következő, feltéve, hegy mást nem közlünk:
A. többszörös töltésű szervetlen anion” kifejezésen szulfát anion (SÓZ) értendő. Ez valamely megfelelő só (pl. nátriomsó, kaliumső vagy ezek keverékei) és/vagy a pufferanyag formájában adagolható.
Az izoozmólárís” vagy ízotóniás kifejezés olyan oldatokra vonatkozik, amelyek az emberi testnedvekkel a komponensek befolyásolása nélkül elegy íthetök. A vérrel izotomás oldatok (pl 0,9 %-os nátrium-klorid oldat) izotoníoitása a széruméval megegyezik, és ezért a vörösvérsejtek membránjait nem befolyásolják
A “gyógyászati lag^ alkalmas” kifejezés azt jelenti, hogy a megjelölt puffer vagy só toxioitási szempontból elfogadható.
Az Werős szervetlen sav” kifejezésen 1 n oldatban 20-1ÖÖ %-os disszociációt mutató szervetlen savakat értünk (pl. kén sav),
A hígitószert kifejezésen farmakológia! aktivitással nem rendelkező, azonban gyógyászatilag szükséges vagy kívánatos komponensek értendők. így pl. a hígítószer a befecskendezendő hatóanyag(ok) oldódásához szükséges folyadék lehet (pl. víz).
Az “oldószert kifejezésen valamely anyagot oldatban tartó - azaz feloldó - folyadékok (pl. víz) értendők..
A “tartósítószert kifejezés a gyógyászati készítményhez bakteriális növekedés megakadályozása céljából hozzáadott anyagokra vonatkozik (pl. benzalkón um-klarid vagy benzíl-alkohoí).
A “pokol kifejezésen bármely olyan anyag értendő, amely több hidroxíl-osoportot tartalmaz (beleértve a tőbbértékö alkoholokat és szénhidrátokat). A tóbbértékö alkoholok közül pl. a szóróitok mannitot és glicerint említjük meg. A szénhidrátok ketovagy aldehid-csoportot tartalmazó gyűrűs molekulák (pl. szacharóz vagy trehaióz).
Az. entröpöfeiih vagy “erítropoíetin fehége kifejezésen olyan in vivő biológiai aktivitással rendelkező fehérjék értendők, amelyek a csontvelő sejteket a retikulociták és vörösvérsejtek termelésének fokozására késztetik; ezek a fehérjék a humán erítrgpoíetln és analógjai alábbiakban részletezésre kerülő csoportjába tartoznak.
A. ''pegílezett erítropoietin (Peg-EPO vagy PEG-EPO) kifejezés egy-hárorn polietilén-származékhoz kovalens kötéssel kapcsolódó erítropoietin fehérjékre vonatkozik (lásd az alábbiakban következő ismertetést).
A készülék” kifejezés specifikus célból létrehozott berendezésre vonatkozik. A jelen szabadalmi leírás szennt ez. a cél a folyékony gyógyászati készítmény beadagolásának lehetővé tétele, elősegítése vagy megkönnyítése.
Az. ábrák ismertetése:
1. ábra: A humán EPO primer szerkezete (166 amínosav) (SEQ ID NO:1).
2. ábra: A humán EPO primer szerkezete (166 amínosav) (SEQ ID IMO::2).
3. ábra: A pH hatása a termikus stabilitásra. Az átmeneti hőmérsékletet a pH függvényében ábrázoljuk.
4. ábra: Az ionerősség hatása a termikus stabilitásra. Az átmeneti hőmérsékletet a foszfát-koncentráció függvényében ábrázoljuk.
5. ábra: A termikus stabilitás függése a puffer-anyagtól.
A 6. ábrán bemutatjuk, hogy a szulfát alacsony pH értéken (pl. pH 6,2) is megfelelő puffer-adalék.. míg a foszfát pH 7,5 értékkei Összehasonlítva 6,2 értéken kevésbé alkalmas. Ez azt jelenti,, hogy a szulfátot tartalmazó készítményben a hatóanyag még alacsony pH értéken is megtartja magas termikus stabilitását.
7. ábra: A peg-EPO aggrégáció függése a pH-tól. Peg-EPO mintákat a fentiekben leírt termikus stressz után ESD-PAGE analízisnek vetünk alá. A fehérjéket ezüsttel megfestjük. 1. pálya: molekulatömeg standard. 2. pálya: pH 5, 3. pálya; pH 5, redukált 4. pálya: pH 6. 5. pálya: pH 6, redukált, 6, pálya: pH 6,5, 7, pálya: pH 6,5, redukált. 8. pálya: pH 7. 9. pálya: pH 7. redukált. 10. pálya: peg-EPO stressz nélkül A 8, ábrán bemutatjuk, hegy 1 mgfml acetíl-dsztein antíoxídánsként történő felhasználása termikus stressz alatt az aggregátumok képződését megakadályozza. A peg-EPO aggregácipja termikus stressz alatt (20 percen át 8G°C-on): peg-EPO pH 7,5, stressz nélklül, 2. pálya. peg-EPO pH 7,5, stressz után: 3. pálya. peg-EPO pH 6,2, stressz után: 4. pálya: peg-EPO pH 6,2, stressz után, redukált; 5. pálya: pegEPO^ pH 7,5 * 1 mgfml N-aceH-cisztem, stressz, után;. 6. pálya: peg-EPO pH 7,5 * 1 mg/ml N-acetil-cisztein, stressz után, redukált.
9. ábra: Hat hónapon át különböző hőmérsékleteken tárolt új készítményekben a peg-EPO minták szsálsav (NANA) tártaimé.
10. ábra: Peg-EPO minták egér bioaktivitás tesztje, 10 mM nátrium-foszfátot, mM nátrium-szulfátot, 3 tömegltérfogat % monoltot tartalmazó közegben (pH 6,2) 6 hónapon át különböző hőmérsékleteken történő tárolás után.
11. ábra: Peg-EPO minták méretkizárásos kromatogramja, 10 mIM nátrium-foszfátoi, 40 mM nátrium-szulfátot, 3 tömeg/térfogat % mannitot tartalmazó közegben (pH 6,2) 6 hónapon át történő tárolás után (alulról: felfelé: puffer, kiindulási anyag, 4*0, 25*0, 30*0 és 40°C).
Előnyös kivitek alak szerint a találmány szerinti gyógyászati készítmények izotóniás oldatok.
A szulfát anion koncentrációja a találmány szerinti készítményben 10-200 miilimői/l.
A találmány szerint felhasznált puffét a pH-t kb. 5, 5 és kb. 7,0 közötti tartományban, előnyösen 5,8-6,7 érteken, még előnyösebben 8,6-6,5 értéken, a legelőnyösebben kb. 6,2 értéken tartja. E célra szervetlen vagy szerves savak szokásos pufferjei alkalmazhatók, pl. foszfát-pufferek, arginin/kénsav/nátnum-szulfát pufferek vagy más gyógyászatiíag alkalmas puffer-rendszerek. Találmányunk előnyös kiviteli alakja szerint á készítmény valamely foszfát-puffért vagy árgininikénsavmátrium-szulfát puffért, különösen előnyösen 10-50 mHiimöl/l foszfát-puffé?! tartalmaz. Találmányunk szerint természetesein a puffer-rendszerek kombinációi is használhatók. A pH-értéket a foszfát-puOer rendszerben megfelelő bázissal (pl. nátrium-hidmxtó>(: illetve az arginin puffer-rendszerben megfelelő savval (pl. kénsav) állíthatjuk be.
A találmány szerinti készítmények egy vagy több gyógyászatiíag^ alkalmas excipienst tartalmazhatnak, Győgyászatilag alkalmas excipíensként gyógyászatilag alkalmas sók, hígítószerek és/vagy oldószerek és/vagy tartósítószerek stb.f pL tompítást beállító szerek (izotóníát beállító szerek), poliolok. antioxidáasok vagy nernionos detergensek alkalmazhatók. A. gyógyászatiíag^ alkalmas excipiensek közül a nátnum-kloridot, kalcium-klorídot, szorbitot, mannitot. glicerint, szacharózt, trehalózt, aoetii-ciszfeint, poliszorbát 20-at, políszorbát 80-at vagy pluronic F68~at említjük meg.
Találmányunk előnyős kiviteli alakja szerint a gyógyászati készítmények pokolként mannitot, szorbitot, glicerint, trehalózt vagy szacharózt, előnyösen mannitot tartalmaznak. A polioí-koncentráció 1 -1 ö tömegAérfogat %.
Antioxidánskéni pl. cisztein. metionin, acetil-cisztein vagy aszkorbinsav, előnyösen metionin alkalmazható. Az antioxidánst általában 0,01 -0,5 tömeg/térfogat % koncentrációban adhatjuk a készítményhez, így pl. a metionin-koncentrácíó 1 -20 mM.
A találmány szerinti készítmények kívánt esetben klx 0,01 tömegAömeg % és kb. 0,9 fömegAömeg % közötti mennyiségben valamely izotóníát beállító szert is tartalmazhatnak. Az Ilyen adalékok az Irodalomból ismertek, így pl. nátrium-klorídot vagy nátrium-szulfátot alkalmazhatunk. Találmányunk előnyös kiviteli alakját képezik az. izotóniás oldatok formájában előállított'készítmények. Az ilyen készítmények valamely nem ionos detergenst is tada Imazhatnak. E célra pl. pofi szórtját 20, políszorbát 80 vagy pluronic F68, előnyösen pluronic F68 alkalmazható, pl. 1 tömeg/térfogat %-ig teneoő mennyiségben.. előnyösen 0:1 tómeg/Lérfogat %-ig terjedő mennyiségben, pl. 0,001-0,01 tömegftérfegat % mennyiségben.
A fenti készítmények további sókat is tartalmazhatnak, pl. 1 miíhmól/í koncentrációig terjedő mennyiségben kalcium-klondot.
A találmány szerinti gyógyászati készítmények hatóanyagként pegilezett eritropoietin fehérjét tartalmaznak. Az feritropcietin vagy entropoietin fehérje vagy ΈΡ0’’ értelmezése a következő: valamely gkkoprotein, részletesebben humán erltropoietin, pl. a SEQ ID NO:1 vagy BEQ ID NO.:2 ammosav-szekvenoiát vagy annak olyan lényegében homológ amínosav-szekvenoiáját tartalmazó humán eritropoietin, amelynek a biológiai tulajdonságai a vörősvérsejt termelés serkentésére, valamint a csontvelőben a keletkező erítroíd pmgeniíorök osztódásának és differenciálódásának serkentésére vonatkoznak. Ide tartoznak továbbá a szándékosén - pl. helyreirányított muíagenezís útján ~ vagy mutáció által véletlenszerűen módosított fehérjék is. A fenti kifejezés továbbá az alábbi analógokra is kiterjed 1-^6 további glikozilezési helyet tartalmazó analógok: a glikoprotein karboxi végződésén legalább egy további arnínosavat tartalmazó analógok, amely további aminosav legalább egy glikozilezési helyet tartalmaz; és legalább az egyik glikozilezési helyen átrendeződést tartalmazó amin-esáv-szekvenciával rendelkező analógok. A fenti kifejezések a természetes és a rekombináns úton termelt humán entropoietint egyaránt magukban foglalják.
Az EPO előállítása és tisztítása az alábbiakban ismertetésre kerülő módon az irodalomból jól ismert. Az feritropöietirf kifejezésen természetes vagy rekombináns humán fehérjék, azaz bármely szokásos forrásból (pl. szövetek, fehérjeszintézis, természetes vagy rekomblnáns sejtekkel végzett sejttenyészetek) nyert fehérjék értendők. Ez a kifejezés a humán eritropoietin aktivitásával rendelkező bármely fehérjére (pl. műtétnek vagy másképpen módosított fehérjék) kiterjed. A rekpmblnáns EPO CHO-, 8HK- vagy HeLa sejtvonalakban történő kifejezés útján, rekombínáns DNS technológiával vagy endogén génaktiválással állítható elő. A fehérjék kifejezése - beleértve az endogén gén aktiválást - az irodalomból ismert, pl. az alábbi szabadalmi: bejelentésekből és leírásokból: 5,733,761, 5,641.670 és 5,733,746 sz. USA szabadalom; W0 93/09222, WÖ 94/12650, WO 031566, WO 90/11354, WO 91/06667 és WO 91/09955 sz. nemzetközi közrebocsátásí irat; a fenti irodalmi helyek tartalma hivatkozásként a jelen szabadalmi leírás részét képezi. Az eritropoietn glikoprotein termékek előállításához EPO-spacieskénf humán EEO species alkalmazható. Különösen előnyösen alkalmazható a SEQ ID NO:1 vagy SEQ ID NÖ:2 szekvencián feitűnfetett aminosav-székvenciát tartalmazó humán EPö, még előnyösebben a SEQ ID NO:1 szekvencián feltünta-tett aminosav-szekvanciát tartalmazó humán EPO..
Humán ehtropoietínként továbbá 1-6 gükoziiezésí helyet tartalmazó glíkoproteinek alkalmazhatók. Az agy vagy több oügoszacharid-csoportot tartalmazó fehérjék glikozilezése a pokpeptíd váz mentén specifikus helyeken játszódik ie, és a fehérje fizikai tulajdonságait (pl. fehérjestabíliíás, kiválasztás, szubcelíuíáris lokalizálás és biológiai aktivitás) nagymértékben befolyásolja. A glíkozilezésnek általában két típusa van. Az Ö-kótődésü oligoszacharidök a szerin- vagy treonin-maradékokhoz, míg az N-kötödésü c-lígoszacharidok az aszparagín-maradékokhoz kapcsolódnak. Az ohgoszacharidok egyik típusa ö kapcsolódást és N-kapcsolódást egyaránt tartalmaz; ez az Gligoszachand a 9 vagy több szénatomot tartalmazó ammocukrok családjába tartozó N-acetii~neuraminsav (sziálsav). A sziáisav általában az N-kapcsolódást és O~ -kapcsolódást egyaránt tartalmazó olígoszachahdok terminális maradéka, és negatív töltése révén a glikoproteinnek savas tulajdonságokat, kölcsönöz. A 165 aminosavat tartalmazó humán entropoietin három; N-kapcsolódású és egy D-kapcsotódásű oligoszacharid-láncot foglal magába, és a glikoprotein teljes molekulatömegének kb. 40 %-át alkotja. Az N-kapcsolódásu glikozifeződés a 24-, 38- és 83-halyzetben lévő aszparagin-maradékokon, míg az O-kapcsoiódású giikozilezödés a 126-helyzetben lévő
II szeri n-maradékon játszódik le, Az olígoszacharid-láncokat a terminális sziáísav mara dékok. módosítják, A sziálsav maradékoknak aglikozilezetteritropoietinről történő enzimatikus eltávolítása az in vivő aktivitás elvesztését eredményezi, ugyanakkor az in vitro aktivitás megmarad, mert az eritropoietin sziálozása a kötődést és az azt kővető clearancet a fehérje hepatikus megkötése révén meggátolja.
Az eritropoietin” kifejezés a találmány szerinti gyógyászati készítmény vonatkozásában a humán eritrapöieiin aminosav szekvenciájában a sziéisav kapcsolódási helyek, számának növekedését előidéző egy vagy több változtatást tartalmazó humán eritropoietin analógokra is kitéped. Ezek a glikoproteln analógok helyreirányított mutagenezissei állíthatók elő. és az aminosav-maradékok körében a glikozilezéshez rendelkezésre álló helyek számát növelő vagy megváltoztató addíciókat, törléseket vagy helyettesítéseket tartalmaznak, A humán eritropoietinhez viszonyítva nagyobb sziéisav szintű glikoprotein analógok oly módon képezhetők, hogy a biológiai aktivitáshoz szükséges szekunder vagy tercier konformációt meg nem bontó glikoziiezésí helyeket adunk hozzá. A találmány szerint felhasználható glikoprofeinekhez tartoznak továbbá a glikozilezési helyen megnövekedőt! szintű szénhidrát kötődést mutató analógok, amelyekben egy N-kötödéss vagy O-kőtödési hely közvetlen közelében egy vagy több aminosav-helyettesífést hajtunk végre, A találmány szerint felhasználható giikoproteinek közé tartoznak továbbá az egy vagy több olyan amn nosavat tartalmazó analógok, ameiy(ek) az eritropoietin karboxi végződésétől helyezkedik ^helyezkednek) el, és legalább egy további szénhidrát helyet tártál maz(nak). A találmány szerinti készítményekben szereplő eritropoietin fehérjék közé tartoznak továbbá az olyan analógok, amelyek legalább az egyik glikozilezési helyen átrendeződést magában foglaló aminosav-szekvenciát tartalmaznak. Az ilyen glikozilezési hely-átrendeződések közé tartozik a humán entroposetinben lévő egy vagy több glikozilezési hely törlése, és a természetben elő nem forduló egy vagy több glikozi lezésí hely addicíója. Az eritropoietin szénhidrái láncai számának és ezáltal az egy entropoíetin molékuiára jutó sziálsavak számának növelése a molekulának előnyős tulajdonságokat (pl. nagyobb oldhatóság. proteoHzissel szembeni erősebb ellenállás, kisebb immunogenioitás. hosszabb szé-rum felezési idő és nagyobb biológiái aktivitás) kölcsönözhet. A további glikozílezésí helyeket tartalmazó entropoletin-analogók részletesebben az 1995. március 1-jén nyilvánosságra hozott 640 619 sz. euróoai közrebocsátás! iratban (Elliot) kerültek ismertetésre,
A találmány szerinti: gyógyászati készítmények előnyös kiviteli alakja legalább egy további glikozilezesl helyet tartalmazó ammosav szekvenciával rendelkező eritropoietin fehérjéket tartalmazó gyógyászati készítményekre vonatozik. Ezek közül példálódzó, nem korlátozó jelleggel az. alábbi módosított szekvenciája humán erítrcpuietíneket említjük meg:
Ash3üThr3;
AsnsW3;
Asn Thr;
Asnss:
Asn^Thr·
Ser^AsnRW’: aFAsn^ThA
Ser^Asn^Thr0;.
Ser^ÍAsn^Gly^Thr90;
Se^^Asn^Thr^Thr52: Se^^Asn^hr^Ala162;
AsnssThrt' SerS; AsnssThr°;
Asn^Thr^Val^Asn^Thr^
Asn^le^ThA
Se/' AsnS9l le^Thr51;
As/WhR: Asn'Whr1'/ Thr'2S: és Prot24Thr12ö:,
A fenti módosítóit aminosav-szekvencíákban a megfelelő módosítatlan fehérje (pl. hEPO; SEQ ID NO’1 vagy SEQ ID NO;2) átírt számmal vagy számokkal jelölt helyzeteit a szöbanforgó átírt számot, vagy számokét közvetlenül megelőző aminosavra vagy aminosavakara változtattuk.
Az eritropoietín fehérje továbbá a glikoproteín karboxi: végződésén legalább egy további aminosavat tartalmazó analóg lehet, amely további: aminosav legalább egy glikozilezési helyet tartalmaz. A további aminosav a humán korion gonadotropln karboxi végződéséből leszármaztatható peptld fragmenst tartalmazhat. A glikoprotein előnyösen valamely alábbi csoportba tartozó analóg lehet:
a) a karboxi terminustól terjedő, Ser Ser Ser Ser Lys Alá Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro He Leu Pro Gin aminosav-szekvéneiét tartalmazó humán eritropoietín (SEQ ID NO:3);
b) további Se/LAsn^Thr83ΈΡΟ részt tartalmazó (a) szerinti analóg'
c) további Asn^Thr^VaPkAsn^Thr00 EPO részt tartalmazó (a) szerinti analóg.
Eritrepeietln fehérjeként továbbá olyan analógok is alkalmazhatók, amelyek legalább egy glikozilezési hely átrendeződését magában foglaló ammosav·· -szekvenciát tartalmaznák. Ez az átrendeződés az alábbi lehet: a humán eritropoietín bármely N-kapcsolódása szénhidrát helyének törlése: és a humán eritropoietín aminosav-szekvenciája Bő-helyzetében egy N-kapcsolódású szénhidrát hely addíoiója. Glikoproteinként előnyösen valamely GhMSe/?AsneéTh/u EPO, Gln^Se/' Asi/^h/0 EPO és Gln^Ser^Asn^Th/3 EPO analóg alkalmazható.
A találmány szennti gyógyászati készítményekben a humán eritropoletin fehérjék pegiiezett tormában vannak jelen.· Az eritrapsietin pegilezert származékai és előállításuk az irodaiamból ismert, és pl. az alábbi szabadalmi bejelentésekben, illetve szabadalmi bírásakban került Ismertetésre: EP-A-539,167, EP~A~605,963, WÖ 93/25212, WO 94/20989, WO 95/11924, EP-A-584,876, WO 92/16555, WO 94/28024, WO 97/04796, US 5,359,030 és 5,681,811, US 4,179,337, WO 98/32466, US 5,324,650. A pepilezett humán eritropoietin speciesek előnyös kiviteli alakjait az alábbiakban ismertetjük.
Találmányunk szerint edtropoietm konjugátumokat is alkalmazhatunk, amelyek valamely fentiekben leírt, legalább egy szabad amínacsoportot tartalmazó, a csontvelő-sejteket retíkulociták és vörösvérsejtek termelésére készető biológiai aktivitással rendelkező eritropoietm fehérjét tartalmaznak. Ide tartoznak a humán eritropoietir· olyan analógjai, amelyekben a humán eritropoietin szekvenciája 1-6 gkkc-ziiezési hely addíclöja, vagy legalább egy gükozifezödésí hely átrendeződése által módosítva van: ez az eritropoietin -CO-lCH^jx-íOCHsOHaj^-OR általános képleiű ni polí(etiíéngíikol)-csoporthoz minden paii(etiiénglikc-l)-csoport karboníl-csoportjával (-CO-) kapcsolódik, és ezekkel az amino-csoportokkaí amidkötést képez. A képletben R jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport; κ értéke 2 vagy 3; m értéke kb. 450 és 900 közötti szám; n értéke 1-3; mlmellett n és m értékét úgy választjuk meg, hogy a koniugátum molekulatömege az eritropoietin glikoprotein nélkül 20-109 kOa.
Találmányunk tárgya továbbá gyógyászati kész tmény, amely valamely fentiekben leírt konjugátumot tartalmaz, és az n ~ 1 értéknek megfelelő konjugáíum százalékos mennyisége - a készítményben lévő konjugátum összmennyiségére vonatkoztatva - legalább 90 előnyösen legalább 92 %, még előnyösebben 99 %.
Különösen előnyösen alkalmazhatunk (I) általános képietü koniugátumokat [ahol P jelentése valamely fentiekben leírt eritmpoíetin fehérje maradéka (azaz a karbonll-csoporttal amídkötést képező aminoásoport(ok) nélkül; lásd (!) képlet), amely a csontvelősejtsket a nstikulociták és vörösvérsejtek termelésének növelésére késztető in vivő biológiai aktivitással rendelkezik; R jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport, x értéke 2 vagy 3, m értéke kb. 450 és kb. 900 közötti szám, π értéke 1-3, mimelleit n és m értékét oly módon választjuk meg, hogy a konjugátum molekulatömege az eritropoietin glikoproteín nélkül kb. 20 kDa és kb. 100 kDa közötti érték.
A jelen szabadalmi leírásban használt “kis szénatomszámú alkilcsoport”· kifejezés egyenes vagy elágazó láncú, 1-6 szénatomot tartalmazó alklicsoponokra vonatkozik, pl. metii-, etil- vagy izopropii-csopört. A jelen, szabadalm i leírás szerint R bármely kis szénatomszámú alkiioseporfet jelenthet. Előnyösek az R helyén metilosoportot tartalmazó konjugátumok.
Az m szimbólum jelentése a polifetilénoxidj-csoportban lévő (OCH2CH2) képiem etílénoxid-maradékok száma. A PEG-ben (poíletilénglikol) lévő egyetlen etílénoxld alegység molekulatömege kb. 44 dalion. így a konjugátum molekulatömege (az EPö molekulatömege nélkül) 'W értékétől függ. A találmány szerint felhasznált konjugátumokban m értéke kb. 450 és 900 között van (kb. 20 kDa és kb. 40 kDa közötti molekulatömegnek felel meg), előnyösen kb. 650 és kb. 750 közötti érték (kb. 30 köa molekulatömegnek felei meg). Az “mK értékét oly módon választjuk meg, hogy a találmány szerinti készítményben lévő konjugátum fiziológiai aktivitása a módosítatlan EPO hatásával összehasonlítható legyen, azaz a módosítatlan EPO aktivitásával azonos, annál nagyobb vagy egy része legyen. A molekulatömeggel kapcsolatban megadott !'kb.“ jelző azt jelenti, hogy a molekulatömeg a szokásos analitikai módszerekkel meghatározható tartományon belül van. Az “nT értékét oly módon választjuk meg, hogy az eritropoietin gllkoproteínhez kovalensen kapcsolódó minden poli(eti!énglikol) csoport molekulatömege kb. 20 kDa és kb. 40 kDa közötti érték, előnyösen kb. 30 kDa legyen.
A találmány szerinti készítményekben szereplő konjagátomokban n'' az eritropoiétin fehérje szabad aml-nöcsoportjaihoz (beleértve a llzin aminosav s-aminocso~ portjait és/vagy az amino-terminális aminocsoportöt) amidkötésen vagy -kötéseken keresztül kapcsolódó poíitetiiénglikolj-csoportck számát jelenti. Az ilyen konjugátumok EPO molekulánként egy, két vagy három PEG-csoportot tartalmazhatnak. így ,:n'! értéke 1-3, előnyösen 1 vagy 2, különösen előnyösen 1. A találmány szerint felhasznált konjugátamok közül előnyösek azok, a vegyületek, amelyekben x értéke 2, m értéke SSö-750, n értéke i, és R jelentése mctí lesöpört.
Az (!) általános képietű vegyületeket a (II) általános képietű ismert polimer anyagokbol (ahol R és m jelentése a fent megadott) valamely eritropoietín glikoproteinnei történő kondenzációval állíthatjuk elő. Az x ~ 3 értéknek megfelelő (II) általános képietű vegyületek a pöli(etilénglikol) a~kis szénatomszámú alkoxi-v^sav-szukcinímldil-észterei (kis szénatomszámú alkoxePEG-SBA). Az x » 2 értéknek megfelelő (II) általános képleté vegyületek a polí(etiién-glíkcl) is szénatomszámú alkoxi-propionsavszakoínímidil-észterei (kis szénatomszámú alkolxl-PEG-SPA). Az eljárási aktivált észterek és aminek amídképződéssei járó bármely szokásos reakciójával elvégezhetjük. A fenti reakcióban a példaként bemutatott szokcinimidil-észter az amidképződést előidéző kilépő csoport. Szukcínímidil-észterek [pl. (II) általános képietű vegyületek] fehérjékkel történő konjugátum-képziését az 1997. szeptember 39-án megadott 5,672 652 sz. USA szabadalomban ismertették (Hamis és tsai).
A humán EPO 9 amínonsóportöt tartalmaz; éspedig az amino-iermínálís amínocsoportot és a 8 lizin-maradék s-aminöcsoportjaít, A. pegllező reagtens és a (II) általános képietű SBA vegyület kombinálásakor azt találtuk, hogy pH 7,5 értéken, T,3 arányú fehérje:PEG arány és 20~25°C reakcióhömérsékiei mellett a mono- és di-pegílezett terméknek a tri-pegílezett species nyomnyi mennyiségét tartalmazó keveréke keletkezik. Pegilező reagensként (II) általános képietű SPA-vegyüteteknek a fentiekhez hasonló körül menyek között, azonban 1:2 arányú fehérje; EEG arány mellett történő alkalmazása esetén elsősorban muno-pagilezeit termék keletkezik. A pegiiezett EPO keverék formájában adható be, vagy kationcserélő kromatografáiással a különböző pegílezett speciesekre szétválasztható. A reakciókörülmények (pl a reagensek aránya, pH, hőmérséklet, fehégekonoentráciő, reakcióidő stb.) változtatásával a különböző speciesek relatív mennyisége változtatható.
A találmány szerinti fent ismertetett gyógyászati készítmények továbbá olyan, a fentiekben meghatározott erítropoietin fehérjét >s tartalmazhatnak, amely legalább egy szabad amínocsaportot tartalmaz, és a csontvelő-sejteket a retí-kulooiták és vörösvérsejtek termelésének növelésére késztető biológiai aktivitással rendelkezik. Ide tartoznak a humán erítropoi etin és 1-6 giikozíiezési he ly add tolójával módosított primer szerkezetű analógjai: mimeiiett a ghkoprotein egy-három kis szénatomszámú alkoxi-poli(etifenglikol)-csopcrthoz kovalens kötéssel kapcsolódik, minden poli(etilénglikoi)-osoport a glikoproteinhez -C(O)~.X~S-Y képletü iinkeren keresztül kovalensen kapcsolódik, a iinker C(O) csoportja az egyik fent említett aminocsoporttal amidkötést képez, X jelentése -(0¾)^ vagy -QH2(Q-€H2-CHs)k-, k értéke 1-10, Y jelentése (1)!; (2), (3; vagy (4) képletü csoport, minden polifetléngiikol) rész átlagos molekulatömege kb. 2Ö kDa és kb. 40 kDa közötti érték, és a konjugátum molekulatömege kb. 51 kDa és kb. 175 kDa közötti érték.
Az erítropoietin species a (III) általános képlettel is kifejezhető (ahol R jelentése egyenes vagy elágazó láncú 1-6 szénatomos kis szénatomszámü aIkilesöpört, pl. mstil·. etil·, izopropií- sth. csoport, előnyösen metdcsopcrt; X jelentése -(CH2)k- vagy CH?(O-CHj-CH2)r; k értéke 1 és kb. 10 közötti szám, előnyösen 1 és kb. 4 közötti szám, különösen előnyösen 1 vagy 2]. X jelentése legelőnyösebben -(CH2>-.
A (III) általános képletben Y jelentése (1), (2), (3) vagy (4) képletü csoport, előnyösen (2) vagy (4) képletü csoport, különösen előnyösen (4) képletü csoport.
A (Hl) általános képletű vegyietekben m értékét előnyösen oly módon választjuk meg, hogy a kialakult (Hl) általános képletű konjugétum fiziológiai aktivitása a módosufeiian humán EPO aktivitásával összehasonlítható legyen, amely aktivitás a módosulaton humán EPO aktivitásával azonos, annál nagyobb vagy annak egy része lehet. *m* értéke a REG egységekben levő etilénoxid maradékok száma. A PEG egyetlen -(O-CH2CH2) alegységének molekulatömege kb. 44 deltán. így a konjugátum molekulatömege - az EPO molekulatömege nélkül - “m” értékétől függ. A molekulatömeggel kapcsolatban a kb.” kifejezés azt jelzi, hogy a jelzett szám a szokásos analitikai módszerekkel meghatározott tartományon belül van. W értéké kb. 450 és kb. 900 közötti szám (2G-4Ö kDa molekulatömegnek feleli meg), előnyösen kb. 550 és kb. 800 közötti szám (kb. 24-35 kDa molekulatömegnek felel meg), legelőnyösebben kb. 650 és kb. 700 közötti szám (kb. 29 és kb. 30 kDa közötti molekulatömegnek felel meg).
A (Hl) általános képletben n értéke az entropoietin fehérjében lévő, a PEG egységhez amaldkötésen keresztül kapcsolódé lízin amínosav s-aminocsoportjaínak a száma. A találmány szénát felhasznált konjugátum EPO molekulánként egy, két vagy három PEG egységet tartalmaz. így n értéke 1 -3, előnyösen 1 vagy 2, különösen előnyösen 1.
A (Hl) általános képletű entropoietin fehérjék előnyösen a (IVA) vagy (!V): legelőnyösebben a (IV) általános képletnek feleinek meg (mely képletekben n értéke 1-3; m értéke 450-900; R jelentése kis szénatomszámú aikiicsoport; X jelentése (CH2)k~ vagy -CH2(O-CH:rCH2)r; és P jelentése az entropoietin ghkoprotein az X-el amidkötést képező aminocsoportok nélkül).
További előnyös entropoietin glikoproteín termékek az (V) és (VI) általános képletnek felelnék meg.
Még előnyösebbek a (Vl) általános képletnek megfelelő entropoietin glikoproteín termékek.
A fenti eritropoíetin fehérjéket oly módón állíthatjuk slő, hogy
a) valamely Ρ-(ΝΗ2)Π: általános képletű eritropoíetin fehérjében lévő lízm amlnosav s-amínoosoport]át valamely Z-CÖ-X-S-Q általános képletéi brfunkciós reagenssel (VII) általános képletű, amidkötést tartalmazó közbenső termék képződése közben reagáitatunk [mely képletekben P jelentése valamely humán eritropoíetin fehérje, az amidkötést képező ammacsoport nélkül; n értéke 1-3: Z jelentése reakcióképes csoport, pl, karbexi-NHS-észter; X jelentése -(CH2fe vagy -CH^'O-CHaCH?)^-; k értéke kb. 1 és kb 10 közötti szám; és Q jelentése védöosoport, pl, aikancíiosoport, mint pi. acetilesöpört]:
b) az a) lépésnél kapott, amidkötést tartalmazó közbenső terméket valamely W-|OCH2CH2]rn-OR általános képletű aktivált poli(etiíénglikoi) származékkal (VHI) általános képletű eritropoíetin glikoprotein termék képződése közben reagaltaguk (mely képletekben W jelentése Y kialakítására alkalmas reakcióképes szuifhldriicsopcrt; m értéke kb. 450 és kb. 900 közötti szám: R jelentése kis szénatomszámú atkílcsoport: és ¥ jelentése a fent megadott) .
A fenti ki viteti alak szerint bifunkcionáiis reagensként előnyösen N-szukcínimidr-S-acetiltio-propíonátot vagy N-szukcínímidil-S-aeetiltio-acetátot alkalmazunk; Z jelentése előnyösen N-hidroxi-szukcinimid; és a W-[OCH2CH2Jt-OR általános képletű aktivált poh(stilénglíkol) származék előnyösen jód-acetil-metoxi-PEG, metoxi-PEG-vinii-szuifon vagy meíoxi-PEG-maleimld.
Részletesebben: a (Hl) általános képletű eritropoíetin fehérjéket oly módon állíthatjuk elő, hogy tiolosopertokat kovalensen EPO-hoz kapcsolunk (aktiválás), majd a kapott aktivált EPO-t valamely poíi(etilénglikol) (PEG) származékkal kapasoljuk, A találmány szerinti készítményekben szereplő pegilezett EPO előállítási eljárásának első lépése során a tíoícsoportokát kovalens kötéssel aminacsoportckon keresztül kapcsoljuk az EPO-hoz. Az EPO aktiválását védett tiolcsóportut és további reakcióképes csoportot tartalmazó bifunkcíonáíis reagensekkel végezzük el: e célra pl. aktív észtereket (pl szűkei nímidll-észterek), anhidrideket, szulfonsavak észtereit, karbonsavak és szulfonsavak halogenldjelt stb, alkalmazhatunk. A tiolcsoportot az irodalomból ismert módón védjük meg (pL aoetilcsoportfal). A fent említett bífurfclonális reagensek a lizin amlnosavak c-aminccsoporbaival amidkötés képzése közben reagálni képesek.
A reakció első lépését az 1. reakciósémán tűntetjük fel [ahol EPG, n és .X jelentése a fent megadott, és Z jelentése aza irodalomból ismert reakcióképes csoport, pl, (5) képletü N-hidroxi-szukcínímid (NH8) szubsztituens).
Az s-amino lizincsoponok aktiválását előnyösen szukcínimidóil-osoportot tartalmazó bifunkcíonáíis reagenssel történő reagáitatássaí végezhetjük el. A bifunkcionálís reagensek különböző spaoer-osoportokat tartalmazhatnak, pl. -(CH2)k- vagy -CHsíP-CHa-CHa^-' általános képletű csoportokat (ahol k értéke i és kb. 10 közötti szám, előnyösen 1 és kb. 4 közötti szám, különösei! előnyösen 1 vagy 2, legelőnyösebben 1). A fenti reagensek közül példálódzó jelleggel az N-szukcínimidil-S-acetiltiopropicnátot [(X) képletü SATP], az (N-szukcinimídíi-S-aeeiiltía-acetáiot [(XI) képletü SATA], a (IX) általános képletü aoetiltio-karbonsav-NHS-észterekef, mint pl. a már említett (X) képletü SATP-t, a (XI) képletü SATA-t és a (XII) általános képletü 2-acetiltio-(etoxi)jí-ocetsav-NSH-észtereket (ahol k jelentése a fent megadott) említjük meg.
A bifunkcíonáíis reagensek előállítása az irodalomból ismert, A 2-acetíltio-(etoxílk-eGeisav-NSH-észterek prekurzorait a 3,924,705 sz. német közrebocsátásí iratban ismertették, míg az acetiltio-vegyűletekhez vezető származék-képzést az alábbi irodaim; helyen írták le: March J., Advanced Organlc Chemistry, McGraw-HIIL SZÖSZE (1977). A SATA kereskedelmi forgalomban beszerezhető (htolecular Probes, Eugene, OR, USA, és Pierce, Rockford, IL).
Az EPO molekulához hozzáadandó tíólcsoportok számát a reakcióparaméterak (azaz a fehérje (EPO) koncentráció és a fehéQBfbifunkcíonáHs reagens-arányj beá ll kásával választhatjuk meg Az EPO-t előnyösen molekulánként 1-5 tíolosoport, előnyösen: 1,5-3 tlolcsoport/EPÖ molekula kovalens kapcsolásával aktiválhatjuk. A fenti arányok a tiolcsoportnak az EPO fehérje populáción belől történő statisztikus eloszlását jelentik.
A reakciót pl. pH 6,5-6,0 értékű vizes pufferoldatban végezzük el (pl. 10 mM foszfátpuffer, 50 mM náthum-klorid, pH 7,3). A blfunkciós reagenst dimetll-szulfoxidban adhatjuk hozzá. A reakció teljessé válása után - előnyösen 30 perc elteltével - a reakciót lizin hozzáadásával leállítjuk. A bifunkdonálís reagens fölöslegét az irodalomból ismert módszerekkel (dialízis vagy oszlopon történő átszúrás) választhatjuk el. Az EP O-hoz adott tiolcsoportök átlagos számát fotometriás módszerekkel határozhatjuk meg [lásd pl. Grasetti, D.R. és Muray, J.F., J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119. 4149 (1967)7
A fenti reakció után valamely aktivált polli(eiiléngliköi) (REG) származékot kovalensen kapcsolunk. PEG-származékként előnyösen kb. 20 kDa és kb. 40 kDa közötti, különösen előnyösen kb. 24 kDa és kb. 35 kDa közötti, legelőnyösebben kb. 30 kDa molékulatömegű: aktivált PEG-molekulákai alkalmazhatunk.
.Az aktivált PEG-származékok az irodalomból ismertek, így pl. a PEG-vinil-szulfont az alábbi közleményben Írták le: Morpurgo, M. és tsai, J. Bioconj Chem. 7. 363 (1996).
A (III) általános képletű vegyüietek előállításához egyenes vagy elágazó láncú PEG specieseket alkalmazhatunk. Reakoióképes PEG reagensként pl. (XIII) általános képletű jód-aceíií-metoxi-PEG vagy (XIV) általános képletű metoxl-PEG-vinil-szulfen alkalmazható.
A fenti jóddal aktivált vegyültek felhasználása aza irodalomból ismert, lásd pl. Hermenson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Pross, San Diego 147-148. oldal (1996).
Legelőnyösebbek a maieimid által aktivált alkexi-PEG-maleimidek [pl. metoxí-PEG-maleimíd (MW 3QG0G: Shearwater Polamers, Inc.) ] fel használásával aktivált
PEG-specíesek.
Az alkoxi-PEG-maleimidek szerkezete: a (XV) vagy (XVI) általános: képletnek, előnyösen a (XVI) általános képletnek telel meg (mely képletekben R és m jelentése a fenti).
Az alkoxi-PEG-maieimiddel történő kapcsolási reakció a tiol-védöcsoport in situ hasítása után vizes pufferoldatban (pl 10 mM kálium-foszfát, 50 mM NaCI, 2 mM EDTA, pH 6,2) játszódik le. A védöcsoport lehasítását pl hidroxilaminnal, dimetil· szulfoxldban, 25&Oon, pH 6,2 értéken, kb. 90 percen át végezhetjük. A PEG-módosításhoz az aktivált EPO/aíkoxi-PEG-maleimid rnólaránynak kb. 1:3 és kb. 1 6 \ozotts értéknek kell lennie: a mólarány előnyösen 1:4. A. reakciót dszteln hozzáadásával és a maradék tiolcsoportok (-SH) N-meíil-mafeímiddel vagy diszulfid-kötések képzésére alkalmas más megfelelő vegyietekkel történő reagáltatással állíthatjuk le. Minthogy á megmaradt aktív tiolcsoportok a védöcsoportokkai (pl. N-metil-maleimid vagy más megfelelő védőcsoportok) reakcióba lépnek, a találmányunk szerint felhasznált EPO-glikoprotelnek ilyen védőcsoportokat tartalmazhatnak. A fenti eljárás általában különböző számú védöcsuporttal védett;, változó számú flott tartalmazó molekulák keverékét eredményezi, a ghkoproteinben lévő, PEG-maíeimidhez konjugáltan nem kapcsolódó aktivált tiolcsoportok számától függően.
Míg az N-metií-maleimsd a pegiíezett tehénén lévő maradék tiolcsoportok blokkolására történő felhasználásakor ugyanolyan típusú kovalens kötést képez, addig a díszulfid-vegyületek Intermoiekuláris szulfídrdíszulfid kicserélési: reakcióban a blokká ló ágens diszuífíd h időn át történő kapcsolásához vezetnek. Az ilyen; típusú blokkoló reakcióhoz blokkoló reagensként előnyösen oxidált giutatíon (GSSG), císzíeín és cisztamin alkalmazható .Míg a ciszteínnel a pegilezett fehérjébe további töltést nem viszünk be, addig a GSSG vagy cisztamin blokkoló reagens alkalmazása további negatív vagy pozitív töltést eredményez.
A (III) általános képletű vegyülitek további tisztítását - beleértve a mono-, diós tn-pegílezett EPO-specíesek elválasztását - az irodalomból ismert módszerekkel (pl, oszlopkromatografálás) végezhetjük el
A pegilezett entropoietin-származékot magában foglaló készítmény előnyösen legalább 90 η - 1 jelentésnek megfelelő mono-PEG konjugátumot tartalmaz, és az 5. példában leírt módon állítható elő. Általában az eritropoietm ghkoproteinek monoPEG-konjugátjai kívánatosak, mivel a. dí-PEG koniugátumoknáí magasabb aktivitással rendelkeznek. A monc-PEG konjugátumok %-os mennyisége, valamint a mono- és diPEG speciesek aránya az eluáiási csúcs környezetében szelesebb frakciók összegyűjtésével szabályozható, a mono-PEG vagy szőkébb frakciók %-os arányának csökkentése és a készítményben mono-PEG %-os mennyisége növelése céljából. A kb. 90 % mono-PEG kuniugátomOk a kitermelés és aktivitás szempontjából jól kiegyensúlyozott eredményeket szolgáltatnak. Bizonyos esetekben pl. legalább 92 % vagy legalább 96 % mono-PEG species (n-1) tartalmú konjugátumokra lehet szükség. Találmányunk e kiviteli alakja szerint a n~1 értéknek megfelelő konjugátumok %cs mennyisége 90-96 %,
A találmány szerinti készítmények mi-anként 10-10000 ug eritropoietin fehérjét tartalmazhatnak. A készítmények entropoietin fehérje-tartalma 10-10000 pg, pl. 10,
50, 100, 400, 8O0 vagy 2500 pg/ml.
A találmány szerinti készítmények továbbá ml-enként 10-10000 pg eritropoietín fehérjét, 10-200 míííimői/í szulfátot és 10-50 mUmől/i foszfátot tartalmazhatnak, pH 6 0-6.5.
A készítmény továbbá 20 mM értékig terjedő mennyiségű meticnini, 1 -5 tőmeg/térfogat % policlt, 0,1 tömeg/térfogat % értékig terjedő mennyiségű pluronic F68at és adott esetben 1 mM értékig terjedő mennyiségű kalcium-klorídot tartalmazhat. A fenti készítmény pl. ml-enkent 10-10000 pg entropoietin fehérjét, 40 míllimól/l szulfátot, 10 milümoM foszfátot, 3 tömeg/tértogat. % mannítot, 10 mM metionim, 0,01 tömegdértogat % pluronic. F68-at tartalmazhat, pH 6,2.
Találmányunk további kiviteli alakja· szerint a készítmény ml-enként 10-10000^ pg entropoietin fehérjéi, 10-100 millimoí/l nátrium-kíorídot, 10-50 millimúl/l foszfátot (pH 6,0-7,0) és adott esetben 1-5 tömeg/tértogat % poliolt tartalmazhat. A készítmény továbbá 20 mM értékig: terjedő· mennyiségű: metionint, 0,1 tőmegAértogat M értékig terjedő mennyiségű pluronic F68-at és adott esetben 7,5 pmól/í kalcium-kioridot tartalmazhat A készítmény specifikusán ml-enként 10-10000 pg entropoietin fehérjét, 100 millimol/i nátrium-kloridot, 10 mM metionint, 0,01 tőmeg/térfogat % pluromc F68at és 10 millimól/l foszfátot tartalmazhat, pH 7.0.
Taiálmányunktárgya továbbá készítmény, amely ml-enként 10-10000 pg eritropoietin fehérjét, 10-50 millirnól/l arginínt (pH 6,0-6,5) és 10-100 milllmol/i nátriumszulfátot tartalmaz. A készítmény továbbá 20 mM értékig terjedő mennyiségű metionini, 0,1 tőmeg/térfogat %-ig terjedő mennyiségű pluronic F68-at, adott esetben 1 millimol/l értékig terjedő mennyiségű kaieium-kloridct és adott esetben T-5 tőmeg/térfogat % poliolt tartalmazhat. A készítmény specifikusan ml-enként 10-10000 pg entropoietin fehérjét, 40 millimől/i arginint (pH 6,2), 30 millimól/l nátrium-szulfátot, 3 tömeg/térfogat % mannitot, 10 mM metionint, 0,01 tö-meg/térfogat % pluronic F68-at és adott esetben 1 miHimől/l kalcium-klorídot tartal-mazhat
A találmány szerinti készítmény előnyös kiviteli alakja szerint 10-10000 p.g/ml, . előnyösen .25-2500 pg/mi eriirdpsietint és
a) 10 mM nátrium/kálium-foszfámt, 100 mM nátrium-kloridot, pH 7,0; vagy
b) 10 mM nátrium-foszfátot, 120 mM nátrium-szulfátot, pH 6,2; vagy
c) 10 mM nátrium-foszfátot, 40 mM nátrium-szulfátot, 3 tömeg/térfogat % mannitot, pH 6,2; vagy
d) 10 mM nátrium-foszfátot, 40 mM nátrium-szulfátot, 3 tömeg/térfogat % mannitot, 10 mM metionmt, 0,01 tömeg/térfogat % plumnic F68~ats pH 6,2; vagy
e) 40 mM argínínt, 30 mM nátrium-szulfátot, 3 tömeg/térfogat.% mannitot, pH 6,2: vagy
f) 40 mM arglnini, 30 mM nátrium-szulfátot, 3 tömeg/térfogat % mannitot, 10 mM métíonínt., 0.01 tömeg/térfogat % pluronio F68-at (pH 6,2) tartalmaz.
Találmányunk legelőnyösebb ki virsli alakja szerint a készítmény ml~enként 50, T005 400, 800 vagy 2500 pg eritropoietín fehérjét tartalmaz, A legelőnyösebb készítmény 10 mM nátrium-foszfátot, 40 mM nátrium-szulfátot, 3 tömeg/térfogat % mannitot, 10 mM metionínt 0,01 tömeg/térfogat % pluronio F68-at (pH 6,2), vagy 40 mM arginint, 30 mM nátrium-szulfátot, 3 tömeg/térfogat % mannitot, 10 mM métionint, 0,01 tömeg/térfogat: % pluronio F68-at (p ' 6 2) tartalmaz, ismertetünk továbbá porlasztva szárított, por alakú készítményt.
Ismertetünk továbbá a fentiekben íeírt, ííofilizátum vagy porlasztva szárított por alakiában előállított készítményt. Ez a készítmény oldószer (pL víz) hozzáadásával folyékony készítménnyé (oldat) alakítható, vagy közvetlenül juttatható a szervezetbe pl. beiéiegeztető vagy transzdermális adagoló készülék sesgítségével.
Találmányunk tárgya továbbá eljárás a fentiekben leírt készítmény előállítására oly módon, hogy valamely pegiíezett humán eritropoietín fehérét valamely több szőrös negatív töltésű aniont tartalmazó oldattal és adott esetben égy vagy több, a fentiekben meghatározott excípienssel összekeverünk, és a keverék pH-ját gyógyászatilag alkalmazható pufferrel 5,5-7,0-ra állítjuk, ahol áz anion szulfát anion.
Találmányunk tárgya továbbá a fentiekben meghatározott készítmények felhasználása krónikus veseelégteienségben szenvedő betegeken (CFR), AIDS-ben és/vagy kemoterápiás kezelésnek alávetett rákos betegeken vérszegénységgel őszszefüggö betegségek kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmények előáll (fására.
Találmányunk szerint továbbá valamely fentiekben tárgyalt készítményt helyt és szisztémás késleltetett leadásra alkalmas formára hozhatunk. Ez. a fentiekben leírt eritropoietmt tartalmazó készítmény szabályozott leadására alkalmas bármely típusú implantátum lehet. A fent említett készítmények továbbá eröreteltött fecskendő vagy bármely adagoló készülék (pl. iümentes injekciós készülék vagy mhaíáló berendezés) segítségével juttathatók a szervezetbe.
A találmány szerinti készítmény injekciós vagy intravénás adagolásra szolgáló dózisegység alakjában állítható elő. A találmány szennti készítmény továbbá folyékony alakban tárolható, majd intravénás vagy Injekciós adagolásra szolgáló dózísegységekre osztható. A találmány szerinti folyékony készítmény egyszeri dózisban történő adagoláshoz kis, akár 0,3 ml~es mennyiségben alkalmazható. Alternatív módon a találmány szerinti készítmény nagy, akár 60 l-es térfogatban is előállítható, amelyet tá-rolás után ősziünk szét csomagolt dőzisformákra. A találmány szennti készítmények nagyfokúi stabilitásuk révén nagy tartányokban tárolhatók, és így később szerelhetők ki az orvosoknak, betegeknek és kórházaknak eljuttatott kisebb csomagolási egysé-gek formájában.
A találmány szerinti befecskendezhető oldatokat szokásos injekciós eszközökkel juttathatjuk a szervezetbe, így pl egyetlen dózisegységként 0,3-20 ml-es adagé kát kilövellő fecskendők segítségével, Lehetséges az injekciós készítményeket ampullák felhasználásával is adagolni, amelyek a készítmény liofílizált formáját tartalmazzák, és a befecskendezés előtt szokásos módon végleges formára hozandók. A találmány szerinti készítmények továbbá nagyfokú stabilitásuk révén kb. 0,3-10 ml készítményt tartalmazó ampullák segítségével adagolhatok. A találmány szerinti készítmények adagolása továbbá intravénás tasakok felhasználásával intravénásén történhet. A tasakok az oldat beadásához szükséges időtől függően kb, 20-500 ml oldatot tartalmaznak, A találmány szerinti folyékony oldatok tartányokban tárolhatók, majd innen az orvosok, kórházak és betegek számára; történő eíiuttatáshoz kis adagolási; egységeket tartalmazó csomagokba oszthatók szét. A találmány szerinti készítmények nagy stabilitása a tartányokban a felhasználás előtt hosszú időn át történő tárolást tesz lehetővé.
A találmányunk szerinti készítményekben komponensként felhasznált eritropoietin-származékck, és az ezek előállítására kiindulási anyagként alkalmazott éritFopoletinek előállítását pl. az alábbi; irodalmi helyeken ismertették: US 5,547,933 és 5,621,080; EP-B 0,148,605; Huang, S.L.. Proc. Natl. Acad, Sói USA 2706-2712 (1964): EP-B 0,205,564; EP-B 0,209,539; EP-B 0,411,678( Lai, P,H. és fsai, J. Bioi, Chem. 261, 3116-3121 (1986): Sasaki, H. és fsai. J. Bioi. Ohem. 262, 12059-12076 (1987). A gyógyászati célokra alkalmas eritropöíetinek rekombináns módszerekkel való előállítását ismertetik a kővetkező közlemények: EP-B 0,148,605: EP-B 0,209,539; Egrié, 3.C., Strícklánd, T..W;,. Lane„ J, és fsai, Immuno-bioi, 72, 213-224 (1986).
Az entropoietin kifejezésére és előállítására szérummentes táptalajban alkalmas módszerek az 1996. november 14-én nyilvánosságra hozott WO 96/35718 sz, nemzetközi kőznsbccsátási iratban (Burg) és az 1992. június 17-én nyiívándsságrá hozott 513,738 sz. európai közrebocsátás! iratban (Koch) kerültek ismertetésre. A fent említett közlemények mellett ismeretes, hogy EPO gént tartalmazó rekomhináns CHO sejtek szérummentes fermentációja elvégezhető, ilyen módszerek pl, az ΓΡΆ 0,513,738 és ΞΡ-Α 0,267,678 sz. európai közrebocsátás! iratban és általános formában az alábbi irodalmi helyeken kerültek ismertetésre . Kawamotos T. és fsai, Analytical Biochem, 130,445-453 (1983); EP-A 0,248,656; Kowar. J. és Franek, F., Methods Enzymology 421,277-292 (1986); Bavíster, 8., Exology 271,45-51 (1981); EP-A 0,481,791; EP-A 0,307,247; EP-A 0,343635; WO 88/00967.
Az EP-A 0,287,678 sz, európai közrebocsátást iratban S-Sepharosen végzett ioncserélő kromatografalást, C8 oszlopon végrehajtott preparativ fordított fázisú HPLC-t és gélszüréses kromatografalást írtak lé szérummentes tenyészetben termelt EPO dialízis után történő tisztítására. A gélszúréses krömatugrafálo lépés S-Sapharcsen végzett gyorsáramú ioncserélő kromatografálással helyettesíthető. Az irodalom szerint az ioncserélő krómatografalás után Blue Trí sacryl oszlopon történő színezék kromafografálást is javasoltak,
Rekomblnáns EPO tisztítására szolgáló eljárás az alábbi irodalmi helyen került Ismertetésre: IMobüo, 1. és fsai, J, Biochem. 107, 352-359 (1999). Az eljárás során azonban az EPO-í a tisztítási lépések előtt TweenR 20, fenil-metil-szulfonü-fluorid, etil-maleimid, pepsztatin-A, rézszulfát és oxámsav oldatával kezelik. Más irodalmi helyek (pl. az 1996. november 14-én nyilvánosságra hozott WO 96/35718 sz. nemzetközi közzétételi irat, Burg) szerint erítropoietin szérummentes fermentációs eljárással állítható elő (EPCfo).
A találmány szerinti felhasznált EPO vagy EPO-konjugátumok fajlagos aktivitása az irodalomból ismert különböző módszerekkel határozható meg, A találmány szerint felhasznált tisztított EPO fehérjék humán egyebekbe befecskendezve a csontvelő-sejteket a kezeletlen vagy konmoll-csoporthoz viszonyítva fokozott retikulocita és vörös vérsejf termelésre késztetik, A találmány szerinti készítményekhez kiindulási anyagként használható ÉPO fehérjék vagy frag-menseik biológiai aktivitása pl. az alábbi irodalmi helyeken leírt módszerekkel határozható meg: Annable és tsai, Buli. IMed. Wld: Hlth. Org. 47:99-112 (197) és Pharm. Európa Spec. isséé Erythropoietin BRP Bio (1997/2). Az EPO-fehérje aktivitásának meghatározására szolgáló további biológiai tesztet (nomiocitémás egér teszt) a 6. példában ismertetünk:
Találmányunk további részleteit: az alábbi példákban ismertetjük, anélkül, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk.
PEL.OÁK
1. oéida: Humán EPO fermentációja és tisztítása
a) inokulum előállítása és fermentációsa
Folyékony nitrogén tároló tartály gázfázisúból leveszünk egy ampullányl munka-sejtbankoi, ami egy humán EPÓ-termelő CHO sejtvonalból (ATCC CRL8695; lásd EP 4T1,678) származik. A sejteket üvegedénybe visszük át, és megnedvesítelt CO3 inkubátorban hidrogén-karbonáttal puffarait táptalajban tenyésztjük.. .Az inokulum készítéséhez és a fermentációhoz felhasznált tipikus szérummentes táptalajt az 1992. jönius 12-én nyilvánosságra hozott 513,738 sz. európai közrebocsátási iratban (Koch), vagy az 1996. november 14-én nyilvánosságra hozott WO 96/35718 sz. nemzetközi közrebocsátási iratban (Burg) ismertettek. A táptalaj pl. DMEM/F12-t (pl. JRH Biosoiences/Hazletcn Biologics Denver, US, rendelési szám: 57-736), és ezen kívül náthum-hidrogén-karhonátot, L+glutamint, D+glükózt, rekombináns inzulint., náirium-szelenitet, díamino-butánt, hidrokortizont, ws(lll)~szulfátot„ aszparagint, aszpartámsavat, szerint és valamely emlős sejtstabílízátort, pl. poli(vinít~alköhol)t, metíl-celluíőzt, pölídéxtránt, pölí(etí lén-glikol)t, pluronic F68-at, plazma expander poligelínt (HEMACCELr) vagy ρούίνίηίΙ-ρί^οίΒόοη)! tartalmaz (WO 96/35718).
A tenyészeteket szennyező mikroorganizmusok távoliéiért mikroszkóposán vizsgáljuk, és a sejtsürűséget meghatározzuk. Ezeket a teszteket minden hasítási lépésnél elvégezzük.
A kezdeti növekedési szakasz után a sejtienyészetet friss táptalajjal a kezdeti sejtsűrűségre hígítjuk, és további növekedési ciklust hajtunk végre. Ezt a műveletet üvegenként kb. 2 liter tenyészettérfogat eléréséig megismételjük. Hozzávetőlegesen 12 Ismétlés után 1~uliter tenyészet all rendelkezésre, amelyet 10 literes inokulum fermentor számára inokulumként alkalmazunk.
3-5 nap után a 10 literes fermentor tenyészetét használjuk fel inokuiumként a 100 literes inokulum fermentor számára.
További 3-5 napos tenyésztés után a 100 literes fermentor tenyészetéi használjuk fel inokulumként: az 1009 literes termelő fermentor számára.
h) Összegyűjtés (levétel) és seítelválaszíás
Sszakaszos újrabetáplálásos eljárást alkalmazunk, azaz a kívánt sejisűrűség elérése után a tenyészet kb. 80 %~át vesszük le. A maradék tenyészetet friss táptalajjal kiegészítjük, és a következő levetehg tenyésztjük. Egy termelési ciklus maximum 10 egymást követő levételből áll: 9 részleges levétel és 1 végső levétel a fermentáció végén. A. levétel 3-4 napig tart.
A meghatározott levett térfogatot hüt.őtartányba visszük át. A sejteket centrifugálássai vagy szűréssel elválasztjuk és előnyük, A centrifugálás során nyert EFOfertalmü felűiúszót szögűk, és egy második hűtött: tartányban gyűjtjük Össze. Minden levett sarzsc-t külön-külön végzett tisztítással dolgozunk fel.
Az EPG-fehége tisztítására szolgáló tipikus eljárás az 1996. november 14-én nyilvánosságra hozott WO 96/35718 sz, nemzetközi közrebocsátási iratban (Burg) került ismertetésre, A tisztítási eljárást az alábbiakban ismertetjük:
a) Blue Sepharose kromatografáiás
A Blue Sepharose (Pharmacia) Sepharose gyöngyökből áll, amelyeknek a felületére kovalensen Cibacron blüé színezék kötődik. Az EPO a Blue Sepharcse-hoz erősebben kötődik, mint a legtöbb nem fehérjeszerö szennyezés, bizonyos fehérjeszerű szennyezések és s PVA: ezért ennél a lépésnél az EPO feldúsítható. A Blue Sepharose oszlop eluálását a sókoncentráció és a pH növelésével végezzük el.
Az oszlopra 80-100 liter Blue Sepeharcse-t tökünk, nátrium-hldroxíddal regeneráljuk, és kiegyensúlyozó pufferrel (nátrium/kalciurn-kiond és náirium-acetát) egyensúlyba hozzuk. A megsavanyított és szűrt fermentcr felülúszót felvísszük az oszlopra. E művelet befejezése után az oszlopot előbb a kiegyensúlyozó pufferhez hasonló összetételű, azonban nagyobb nátrium-klorid koncentrációjú pufferrel, majd trisz-bázis pufferrel mossuk. A terméket írisz-bázis pufférrel eiuáljuk, és a mestert eluáló profilnak megfelelően egyetlen frakcióban összegyűjtjük.
b) Butvl Toyopearl kromafografálás
A Bátyi Toyopearl 650 C (Tosö Haas) polísztlrol alapú mátrix, amelyhez kovalens kötéssel alifás bút il-maradékok kapcsolódnak. Minthogy az EPG ehhez a gélhez erősebben kötődik, mint a legtöbb szennyezés és a PVA, izopropanol-tarialmú pufférrel kell cicáiéi.
Az oszlopra 30-40 liter Butyí Toyopearl 050 C-t töltünk, nátríum-hidroxíddal regeneráljuk, trísz-bázís puffoméi mossuk, és izopropanol-tartalmú tnsz-bázis pufferrel kiegyensúlyozzuk.
A Bice Sepharose eluátumot az oszlopot kiegyensúlyozó puffer izopropancl-koncentrációiára állítjuk be, és felvisszük az oszlopra. Az oszlopot ezután nagyobb ízcprcpanol-koncentrációjú kiegyensúlyozó pufferrel mossuk. A terméket eluáió puffemel (nagy izopropanol-tartaímú trísz-bázís puffer) eluáijuk, és a mestert eluáló profilnak megfeieiően egyetlen frakcióban összegyűjtjük.
Μ® atografálás
A hídroxi-apatít Ultrogel (Biosepra) hidroxl-apatitból áll, amelybe a mechanikai tulajdonságok javítása céljából agaróz-mátrixot építettek be. Az EPO a hidroxi-apatithoz kis affinitást mutat, és ezért alacsonyabb foszfátkoncentráció mellett eluálható, mint a fehérje szennyezések.
Az oszlopra 30-40 liter hidroxi-apatit Uitrogelt töltünk, és kálium-foszfát/kalcí um-kloríd pufferrei és nátnum-hidroxiddal, majd trísz-bázis pufferrei regeneráljuk. Az oszlopot ezután kis mennyiségű: izopropanolt és nátdum-klorídot tartalmazó trisz-bá zis pufferrei kiegyensúlyozzuk.
A Butyl Toyopeari kromatografálás EPO-tartalmú eluátumát felvisszük az oszlopra. Ezután az oszlopot kiegyensúlyozó pufferrei és izopropanol-mentes, valamint nátríum-kíöríd-mentes trísz-baals pufferrei mossuk. A terméket alacsony kállum-foszfát: kGncentráoiójű trisz-bázis puffemel eluáüuk, és a mester eluáló profilnak megfelelően egyetlen frakcióba gyűjtjük össze.
A Vydao 04 (Vydao) RP-HPLC anyag a felületen C4-alkil-Íáncökat hordozó szíiikagéi részecskékből áll. Az EPO-nak a fehérjeszerü szennyezésektől való elválasztása a hidrofób kölcsönhatások erősségében megnyilvánuló különbségeken alapul. Az eluálást híg tnfiuor-ecetsavban acetoniffll gradienssel végezzük el.
A preparatív HPLC-t 2,8-3,2 liter Vydac C4 szilikagéllei töltött rozsdamentes acél oszlop felhasználásával végezzük el. A hferoxi-apatit Ultrogel eluátumol tnfluor-ecetsav hozzáadásával megsavanyitjuk, és a Vydac C4 oszlopra töltjük. Mosáshoz és eluáiáshoz híg trifluor-ecetsavban acetonítrii gradienst alkalmazunk. A frakciókat összegyűjtjük, és foszfát, pufferrei azonnal semlegesítjük Az IPC határokon beiül lévő humán EPO-frakciókat összegyűjtjük.
e) DEAE Sepharose kromatoqrafálás .A DEAE Sepharose (Pharmacia) anyag Sepharose gyöngyök felületéhez kovalensen kötött dieíilamino-etil (DEAE) osóportokból éli. Az EPO-nak a DEAE csoportokhoz való kötődését ionos kölcsönhatások közvetítik. Az oszlopon megkötödés nélkül acetonltrílt és frlfluor-ecetsavat viszünk át. Ezen anyagok kimosása után a nyomokban jelenlévő szennyezéseket acetát-pufferrel alacsony pH értéken végzett mosással eltávolítjuk az oszlopról. Ezután az ősziopot semleges föszfátfeuffemel mossuk, és az EPO-t nagyobb ionerősségö: puffénál eluaijuk.
Az oszlopot gyors átfolyású DEAE Sepharose-vai megtöltjük. Az osziopiérfogatot oly módon állítjuk be, hogy az EPO/töltet arány 3-10 mg EPO/ml gél nagyságrendbeessék. Az oszlopot vízzel és kiegyensúlyozó pufferrel (nátdumJkállum-foszfát) mossuk. A HPLC eluátum összegyűjtött frakcióit feivisszük az oszlopra. Az oszlopot kiegyensúlyozó pufférrel, maid mosó pufferrel (nátríum-acetát puffét), végűi kiegyensúlyozó pufferrel mossuk. Az EP0-1 eluáló pufferrel (nátrium-klorid, nátriumfkálíumfoszfat) eiuáijuk az oszlopról, és a “mester* eluáló profilnak megfelelően egyetlen frakcióban összegyűjtjük.
A DEAE Sepharose oszlop eluátumát beállítjuk a meghatározott vezetőképességre. A kapott EPQ-t sterilen teflon üvegekbe szögűk, és -70-C-on tároljuk.
2. példa: EPQ pegüezése mPEG-SBA felhasználásával
Az 1, példa szerinti szérummentes eljárással tisztított EPÖ (EPG^ analitikai módszerekkel történő meghatározás szerint homogén, és 8 izoformból álló tipikus izoform jelleget mutat. Az EPO fajlagos biológiai aktivitása normositémás egér teszttel történő meghatározás szenet 190 000 NE/mg. Pegiiező reagensként metoxiPEG-SBA-t alkalmazunk; ez olyan (H) általános képletű vegyülök amelyben R jelentése metílcsoport. x értéke 3, és m értéke 650-750 (átlagosan kb. 680, ami kb. 30 kDa átlagos molekulatömegnek felél meg).
Peailezési reakció
100 mg EPOsrhoz (9,71 ml 1(13 mg/ml EPO*? törzsoldat, 5,48 umóí) 506 mg (18,5 gmól) 30 kDa metoxi-PEG-SBA-t tartalmazó 0,1 mólos kálium-foszfát puffért (10 ml, pH 7,5) adunk (a Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama cégtől szereztük be), és szobahőmérsékleten (2Ö-23X) 2 órán át elegyítjük. A végső fehérjekoncentráció 5 mg/ml, és a fehérje:PEG reagens aránya 1:3. A reakciót 2 óra múlva oly módon állítjuk le, hogy a pH-t jégecettel 4,5 értékre állítjuk be. Az elegyet -20f>C-on tároljuk, majd tisztítjuk.
Tisztítás (1) Konjugátum keverék: 28 ml SP-SEPHAROSE FF-et (szulfopropíl katíoncserélö gyanta) AMI GOIM üvegoszlopra (2.2x7.5 cm) töltünk, és az oszlopot 20 mM aoe~ tát-pufferrel (pH 4,7) 150 ml/óra átfolyási sebességgel kiegyensúlyozzuk. 30 mg fehérjét tartalmazó 6 ml reakcióelegyet kiegyensúlyozó pufferei ötszörösére hígítunk, és faivisszük az oszlopra, A nem adszorbeálódott anyagokat kimossuk a pufferrel, és az adszorbeálódott PEG~konjugátum keveréket 0,175 nátríum-kíöhdöt tartalmazó kiegyensúlyozó pufferrel éluálíuk az oszlopról. Az oszlopon maradt módosítatlan hunián EPChrt 750 mM nátrium-kieriddal eiuáljuk. Az oszlopot a kiindulási pufferrel újra kiegyensúlyozzuk. A mintákat SOS-PAGE analízisnek vetjük alá,, és meghatározzuk a pegilezési szintet. Azt találtuk, hegy a 0,175 M nátríum-klorid eluátum mono-pegiiezett speciest, di-pegílezett speciest és nyomnyí mennyiségű trl-pegliezett speciest tartalmaz: a 750 mN nátrium-kíorid eluátum módosítatlan EPCVt tartalmaz.
(2) Di-PEG és mono-PEG-EPOsf: Az oszlopról az előző lépésben eluáít tisztított konjugátum keveréket a pufferrel négyszeresre hígítjuk, az oszlopra újra felvísszúk, és a leírt módon mossuk. A dl-PEG-EPOsH és mono-REG-EPCM 4Z oszlopról 0,1 M nátrium-kloríddal, illetve 0,175 M nátnum-kloriddal kűlőn-kúiön eiuáljuk. Az eluálást 750 mM nátríum-klonddal is elvégezve a maradék módosítatlan EPO^t elhaljuk.
Alternatív módon a reakdóelegyet acetát-pufferrel ötszörösre hígítjuk, és Sepharose oszlopra falvi sszük (kb. 0,5 mg fehérje/ml gél). Az oszlopot mossuk, és az adszorbeálódott mono-PEG-EPO^l, di-PEG-EPOSf-i; valamint a módosítatlan EFCM az első szakaszban leírt módén eluáíjuk.
Eredmények
A PEG-EPOsrt oly módon szintetizáljuk, hogy lineáris PEG molekulát kémiailag konjugáiunk; átlagos molekulatömeg 30 kDa. A PEG-EPÖSf az EPO^ primer amínocsoportjaí és a 30 kDa REG vejsav-szukcínímidil-észter származéka között lejátszódó reakció eredményeként jön létre, amelynek során amidkötés alakul ki.
Az eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze. A tisztított konjugátum keverék mono- és dí-PEG-humán^ EPOsrt tartalmaz, és SDS-PAGE analízis szerint módosítatlan humán EPCkrtől mentes. A konjugátum keverék a kiindulási anyagból 23,4 mg-t (78 %) tartalmaz. A mono- és di-PEG-humán EPOsf katloncserélőn végzett kromatográfiás szétválasztása azt mutatja, hogy a konjugátum keverékben a mono-PEG es a dí-PEG aránya majdnem 1:1. A reakció befejezése után a mono:dl:módosítatlan komponensek aránya 40:38:20 (%), Az összkítermelés csaknem kvantitatív.
1. táblázat
EPCkf pegiíezés eredményeinek összefoglalása
Minta
Fehérje, mg Kitermelés, %
Rxn kev.
MonoDíMódositatian
Konjugátum keverék
30100
12.040
11438
6,020
23,478
3. példa: Humán EPO beailezése.mPEG^SPAfeihaszn.ál.ásáyai
A 2, példában felhasznált humán; EPOsf különböző alikvöt részeit 30 kDa mei~ oxí-PEG-SPA-val (Shearwater Poiymers, Inc,, Huntsville, Alabama) reagáltatok. A reakciót 1:2: fehérje:reagens arány mellett végezzük el és a 2. példa szerinti tisztítási módszereket alkalmazzuk, Elsősorban mono-pegilezett speciest kapunk.
4. példa Tiol-csoportok kovalens kapcsolása EPO-hoz
Ebben a példában iiol-cscpcrtoknak kovalens kötéssel EPO-hoz történő kapcsolásának reakciókörülményeit határozzuk meg. A reakciókörülmények meghatározása céljából az EPO oldathoz (jelen esetben 1 ml 5 mg/ml EPO, 10 mM kálium-feszfátot és 50 mii nátrium-kloridot tartalmazó, pH 7,3 értékű oldatban) blokkolt tkiol-csoportot tartalmazó reagens különböző mennyiségeit adjuk (jelen esetben SATA vagy SATP dimetíl-szulfexidban oldva, 10 mg/ml hozzáadva). A reak~ oióelegyet 30 percen át 25*C-on keverjük, majd a reakciót 1 mólos lizin oldat hozzáadásával (10 mM) leállítjuk, A SATA és SATP fölös mennyiségét 10 mM kálium-foszfátot, 60 mii nátrium-kloridot és 2 mO; EDTA-t tartalmazó, pH S,2 értékű oldattal szemben végzett diai ízissei eltávolítjuk. Az acetil-védőosópórt hidröxil-aminnal történő eltávolítása után az EPO-höz kovalens kötéssel kapcsolódó tlol-csoporfek számát ditio-piridinnel fotometriásen határosak meg az alábbi; irodalmi helyen leírt módszer szerint' Grasetti. D,R. és Murray, J.F., J, Appl Biochem. Biofechnol. 119.41-49 (1967). Az 1 EPO molekulához kovalensen kapcsolódó tiol-csoportok számát az alábbi táblázatban tüntetjük fel.
EPO: SATA vagy EPOGATP mólarány mól tiol-osoportf mól EPO
EPO-.SATA 1-3 1,5
Ο Λ
c r u. oa i λ — i. a
EPO: SATA = 1,6 3,2
EPO:SATP 1:3 1 r3
EPOiSATP 1:4 2,5
EPO.SATP 1:6 3,7
5. példa: Aktivált EPO módosítása metoxí-PEG-maieimíddel
A) ΕΡΌ aktiválása
100 mg, az 1. példa szerint termeit EPO-t.(190 000 NE/rag, normodtémiás egér teszttel történő meghatározás szerint) a 2. példa szerint SATA-val aktiválunk (EPO:SATA mólarány - 1:5). A kapott, kovalensen kapcsolódó blokkolt tiol-csoportokát tartalmazó EPO-t (aktivált EPO) a melléktermékektől (pl. N-hidroxi-szukoinimid vagy reagálatlan SATA) az 1. példában leírt módon dialízissel választjuk el. Ily módon 4 5 mg/m.l aktivált EPO-t kapunk 10 mM kálium-foszfátot, 50 mM nátrium-kloridot és 2 mM EDTA-t tartalmazó oldatban (pH 6,2).
B) Az aktivált EPO pegHezése
360 mg, a fentiekben feltüntetett “iegelönyösebb szerkezetű metoxi-PEG-maleímidét (MW 30 000; Shearwater Polymers, Inc., Huntsviíle, Alabama, USA) 95 mg humán EPO-t tartalmazó fenti oldatban oldunk (4.5 mg/ml: 10 mM kálium-foszfátot. 50 mM nátrium-kloridot, 2 mM EDTA-t tartalmazó pH 3.2 értékű oldat). Az oldatban az aktivált EPO és a metoxi-PEG-maleimid mólaránya 1:4. A fenti oldathoz 1 mólos vizes hídroxilamin oldatot adunk (30 mM, pH 6,2), és ily módon az aktivált EPO kovalensen kapcsolódó blokkolt tioi-csoportjait deblokkoijuk. A reakcíóelegyben lévő aktivált EPO szabad ticl-csoportokat (-SH) tartalmaz. A tini-csoportok debíokkolása után a szabad t tol-csoportokat: (-SH) tartalmazó aktíváit EPO-fazonnal kapcsoljuk a metoxi-PEG-rnaleimíddei; a kapcsolási reakciót keverés közben 25°C-on 90 percen át végezzük. A kapcsolási reakciót oly módon állítjuk le, hogy a reakcíóelegyhez 0,2 mólos vizes ciszteln oldatot adunk (ad 2 mIMI). Az aktivált EPO-n lévő, a metöxi-PEGmaleimiddeí reakcióba nem lépő fölös szabad tiol-csoportokat 0.5 mólos dimetii-szuífoxidos N-metil-maleírta oldat hozzáadásával blukkukuk: az elért koncentráció 5 mM A pegílezeit EPO speciest tartalmazó kapott reakcióeíegyet 30 pere múlva 10 mM kálium-foszfátot tartalmazó, 7,5 pH értékű oldattal szemben >15 órán át dializáljuk.
C) Pegilezett EPO species tisztítása
A pegilezett EPO speciesnek a reakcióelegybői történő elválasztásánál az alábbi tisztítási eljárási alkalmazzuk: 50 ml~es Q-Sepharose ff oszlopot 10 mM kálium-foszfáttal (pH 7,5) kiegyensúlyozunk. A B) lépés szerint kapott reakclóelegyet az oszlopra felvisszük (áramlási sebesség: 3 oszloptérfogat/óra). A reagálatlan metoxi-PEG-maleímid reagens eltávolítása céljából az oszlopot 5 oszloptérfogat 10 mM kálium-foszfát oldattal (pH 7,5) mossuk. A pegilezett: EPO specfest növekvő sógradiens mellett 5 oszloptérfogat ’W puffer (10 mM kálium-foszfát, pH 7,5) és 5 oszloptérfogat ”B” puffer (10 mM kálium-foszfát, 500 mM nátríum-klond, pH 7.5) elegyével mossuk 3 oszleptérfogaifora áramlási sebességgel. A nátnum-klorid gradiens alapján először a pegilezett EPO specieseket (írí- di- és mono-pegilezett species), majd a nem pegilezett EPO speciest eluáljuk. A pegilezett specieseket (tri-: dl- és möHC-pegílezett EPO species) tartalmazó eluátumfrakciókat összegyűjtjük és szűrjük (0,2 um-es szűrón végzett steril szűrés).
A tri-, dí~ és mono-pagilezetf EPO speciesek tartalmát és tisztaságát Coomassie-val megfestett SDA-PAA géleken (Laemmli, Natúré 227. 680-685 (1970)) értékeljük, míg a fehérje koncentrációját a Beer-Lambert törvény szerint 260 nm mellett mérjük. Az EPO speciesek látszólagos molekulatömegét SDS-PAA elektroforézis sei határozzuk meg. Az eredmények a kővetkezők: kb. 68 kDa (mono-pegiiezeit EPO species), kb. OS kDa (dí-pegí lezett EPO species), és kb. 128 kDa (trí-pegilezett EPO species).
A trídl- és mono-pegiiezett EPO speciesek további szétválasztását kromatográfiás úton, pl. méretkizárásos kromatográflával végezhetjük el (Superdex, pg 200; Pharmaeía). A iri-, dl- és mono-pegílezeti speciest tartalmazó eluátum in vivő Mágiái aktivitását az alábbiakban ismertetésre kerülő módszerrel határozzuk meg.
6. példa: Pegilezett EPO in vivő aktivitásának meghatározása normocitémás egér teszttel
A normocitémás egér bioteszt az irodalomból ismert [Pharm. 'Európa Spec. issue Erthrcpoietin 8RP Bio 1997 (2)]; ez a módszer az entropoietin monográfiájában (Ph. Eur. BRP) szerepei. A mintákat 8SA-PBS felhasználásával hígítjuk. 7-15 hetes normál egészséges egerekbe s.c. úton 0,2 ml, nem pegilezett EPO-t vagy tri-, divagy monö-pegilézetf EPO-t tartalmazd EPQArakoiói (lásd 2. vagy 3, példa) fecskendezünk. A farokvéna pungáíásával 6 napon át vért veszünk, és azt úgy hígítjuk, hogy 1 mi 0,5 umólos akridin orange színezék oldat 1 pl vért tartalmazzon. A színezés időtartama 3-10 perc. A retikulocita számlálást mikrofluorometrikusan végezzük el aramlasi citométerben, a vörös fluoreszcencia hisztogram analízisével. A retíkulocitaszámot abszolút értékek formájában adjuk meg (per 30 000 analizált vérsejt) A közölt adatokhoz felhasznált minden csoport naponta· 5 egérből állt, és az egereket csak egyszer véreztettük.
Különálló kísérletekben az egereknek egyetlen dózisban módosítatlan EPO-t (25 ng EPO), a 2. példa szerinti PEG(SBA)-EPO keveréket (10 ng konjugátum), a 2. példa szerinti mono- és dí-pegilezétt EPO-t (10 ng konjugátum), a 3. példa szerinti PEG(S8A)-EPO-t (10 ng konjugátum) és pufferoldatot adunk be. A kapott eredményeket a 2. táblázatban tűnteíjük fel. Az eredmények a pegilezett EPO speciesek jobb aktivitását és hosszabb felezési ideiéi igazolják, amelyet a retikulocíták szignifikáns mértékben megnővekedett mennyisége és a retíkuloclia-szám maximumának eltolódása jelen, egerenként azonos dózis (10 ng) alkalmazása mellett, a 25 ng módosítatlan EPO-val összehasonlítva.
2. táblázat
Idő óra
EPO (módo- 30 kDa skálán SPA Pc
1000
500
120
1100
144
535
Mono 30 K SBA Di 30 K SBA PEG-EPO SBA konjugátum kev. Kontra puffer
1411 994 1328 857
1501 926 1338 697
1182 791 944 701
60? 665 660 708
mono-PEG-EP 0 előállítása
Peqilezési reakció
100 mg (5,48 umól), az 1. példa szerint előállított EPOs; 100 mM kálium-foszfát pufferrel (pH 7,5) képezett oldatához 329 mg (10,96 pmól) 30 kDa PEG-SBA reagens 3 ml 1 mM sósavval képezett oldatát adjuk. A reakcióelegy térfogatát 100 mM káliumfoszfát puffer (7,5) hozzáadásával 20 ml-re egészítjük ki. A végső fehérjekoncentráció 5 mg/ml. és a fehérje:PEG reagens aránya 1:2. A reakoióelegyet szobahőmérsékleten (20-22X) 2 órán át elegyítjük, majd 2 óra elteltével a reakciót oly módon állítjuk le, hogy a pHrt jégecet hozzáadásával 4,5-re állítjuk be. A reakcíóelegyet tisztításig -20öC-on fagyasztva tároljuk
Tisztítás
Az: elázó lépésnél kapott reakciöelegyet 10 m:M nátríum-acetáttal (pH 4,5) 1:5 arányban hígítjuk, és 4,2x19 cm-es, 300 ml SP-Sepharose FF-el (szulfopropil kationcserélő gyanta) töltőit oszlopra visszük fel. Az oszlopot előzetesen ugyanezzel a puf
4:
Perrel kiegyensúlyoztuk. Az oszlopról távozó effiuenseket Gílson UV monitor segítségével 208 nm mellett monitorozzuk, és Kipp és Zonen recorder felhasználásával regisztráljuk. Az oszlopot a reagensfőlősleg, a reakcióban keletkező melléktermékek és az oligomer PEG-EPO eltávolítása céljából 300 ml vagy 1 agytérfogat kiegyensúlyozó pufferrel mossuk. Az oszlopot ezután a dÍ~PEG~EPO eltávolítása céljából 2 agytérfogat 100 mM nátrium-kioríddal mossuk. A mcno-PEG-EPO-t ezután 200 mM nátriumkloriddai ©báljuk, A mo.nc-PEG-E.PO eluálása során a fehérjecsúcs első 50 ml-ét elöntjük, és a mono-PEG-EPO-t 150 mi~es frakció formájában összegyűjtjük. Az oszlopon maradó módosítatlan EPOs,f-t750 mM nátríum-kionddai eluáljuk. Minden eluáló puffért a kiegyensúlyozó pufferben készítünk el. Az összes élűéit mintát SDSPAGE és nagy teljes ítöképességú méret-kizárásos kromatográfla (SEC) segítségével analizáljuk. A150 ml-es frakcióból összegyűjtött, kimutatható módosítatlan EPCVi nem tartalmazó mono-PEG-EPO-t ezután kb. 4,5-7,5 mg/ml-re betőményítjűk, és tároló pufferbe (10 mM kákum-feszfat, 100 mM nátríum-klond, pH 7,5) diaszűgük. A betöményítést és diaszűrést szobahőmérsékleten 50 kDa vágási értékű Millípore pellicon XI. Bionax 50 membránnal ellátott Millípore Labscaíe·^ TPF-rendszer felhasználásával végezzük el. A betöményített mono-PEG-EPO-i sterilen szűrjük, és -20öC-on fagyasztva szárítjuk.
Az EPQ$; kb. 75 %-át pegilezzük. Tisztítás után az összkitermelés kb. 30 % mono-PEG-EPO, amely módosítatlan EPCvrt kimutatható mennyiségben nem tartalmaz, és kb, 25 % di-PEG-humán EPO. A maradék fehérjét oligomerek és nem pegílezett EPO^ teszik ki A 150 ml-es frakcióból nyert összegyűjtött mono-PEG-EPO kb. 90 % mono-PEG-EPO-t és kb. 10 % di-PEG^EPOrt tartalmaz.
8. példa: EPO és pegdezett EPO termikus stabilitása különböző kompozíciókban - DSC (differenciális letapogató kaiorimetría) analízis
A termikus denafurálódás differenciális letapogató kalorímetríával mért átmeneti hőmérsékletét a fehérjék termikus stabilitása általánosan elfogadott indikátorának tekintik. Eritropoietínt vagy pegilesett entropoietint 0,6-1,2 mg/ml koncenfráo-őjú pufferoldatokban különböző stabílízátorok jelenlétében vagy azok nélkül Nano-DSC (Calorimetric Soiences Cerporation, Utah, USA) felhasználásával 2 K/perc fűtési sebesség mellett analizálunk. Az átmeneti hőmérséklet emelkedése a fehérje termikus stabilitásának növekedését jelzi. A mért hőmérsékletek, nem abszolút értékek, hanem az egyes készítmények egymáshoz viszonyított stabilitásában jelentkező különbségek.
A készítmény optimális pH értékének meghatározása céljából pegilezeit éritropoíetín 4-9 pH-tarfományban lejátszódó termikus denaturálódását vizsgáljuk. A fehérjemintákat 300 mM dinátrium-hidrogén-foszfatct, 30 mM nátríum-citrátst és 30 mfe barátot tartalmazó oldatban analizáljuk.. A 3. ábra kb. 6 és kb. 9 közötti pH értéken a maximális átmenet: hőmérséklet platóját mutatja, és pH 5,5 érték alatt éles csökkenés jelentkezik. Eszerint a maximális termikus stabilitás szempontjából az optimális pH érték 5.5 fölötti (3. ábra).
Az ionerösség hatásának vizsgálata céljából a termikus denaturálódás foszzát-koncentrácíótől való függését meghatározzuk. A 4. ábrán látható, hogy a termikus stabilitás a készítmény íonerösségének növelésével emelkedik.
A pufieranyag hatását DSC segítségével vizsgáljuk. Az 5. ábrából kitűnik, hogy a magas termikus stabilitás szempontjából a szulfát, cifrát vagy foszfát bizonyult a legalkalmasabb puffernek. A jelenleg forgalomban lévő készítményekben használt glicín (lásd fent) kevésbé alkalmas.
A 6. ábrából látható, hogy a szulfát alacsony pH értéken (pl. pH 6,2) is megfelelő puffer/adalék, míg a foszfát 6,2 pH értéken kevésbé alkalmas mint pH 7,5 mellett. Ez bizonyítja, hogy a szulfátot tartalmazó készítmény nagyfokú termikus stabilitását még alacsony pH értéken Is megtartja. Ez lehetővé teszi olyan készítmény kialakítását, ami 6,0 és 6,5 közötti pH értéken az ecitropaletin termikus stabilitásának jelentősebb elvesztése nélkül előállítható.
A termikus stressz (pegilezett) eritropoietín fehérjére kifejtett hatásának vizsgálata céljából különböző készítményeket termikus stressznek teszünk ki (20 perc, 80°C), és nátríum-dodecii-szuifát/pohaknlamid gél elektroforézissel (SDS-PAGE) redukáló (DTT-vel minta püffedjen) és nem redukáló (DDT nélkül minta puffert>en) körülmények között, analizáljuk. Ez a módszer a kovalens aggregátum-képződés kimutatását teszi lehetővé. Mint arra a korábbiakban már rámutattunk, az aggregátum-képződés a fehérjék egyik fő bomlási útja, és ezért a fehérjéket tartalmazó gyógyászati készítményekben megakadályozandó. A redukál ószer (pl. OTT) távollétében kimutatható, azonban redukálószerjelanlétében nem kimutatható aggregátumok valószínűleg nem megfelelő diszulfid-híd képződés következtében keletkeznek; ez a termikus stressz alatt lejátszódó oxidációs reakció. A 7. ábrán az aggregáció alatt lejátszódó termikus stressz pH-függését tüntetjük fel. A kísérlet világosan igazolja, hogy az aggregátum-képződés 6,5 alatti pH érteken visszaszorul. Minél magasabb a pH, annál nagyobb mértékű az aggregátum-képződés. A képződött aggregátum nagy része a minták redukálószemei SDS-PAGE alatt történő kezelésévei redukálható, ami azt. sugallja, hogy a termikus stressz alatt képződött aggregátumok nagy része diszulfid-híd szerkezetű dlmer, oi;gomer és magasabbrendű aggregátum. Összességében ez azt jelzi, hogy az aggregátum-képződés a kompozíció pH 6,5 vagy alacsonyabb értéken tartásával nagymértékben megakadályozható,
Ufe: A PEG- -EPO aggregácíó függése a pH-iol. PEG-EPO mintákat a fentiekben leírt termikus stressz után SDS-PAGE analízisnek vetünk alá. A fehegéket ezüsttel megfestjük. 1. pálya:; mulekuíatömeg standard. 2. pálya: pH 5. 3. pálya: pH5, redukált 4. pálya: pH 6. 5. pálya: pH 8, redukált. 6. pálya: pH 8,5. 7. pálya: pH 6,5, redukált 8. pálya: pH 7. 9. pálya: pH 7,: redukált 10. pálya: PEG-EPO stressz nélkül.
8. ábra: A PEG-EPO aggregációja pH 6,2 érték és/vagy acetil-cisztein alkalmazásával megakadályozható. A PEG-EPO· mintákat a fentiekben leírt termikus stressz után SDS-PAGE analízisnek vetjük alá. A fehérjéket ezüsttel· festjük meg. 1 pálya: PEG-humán EPO, stressz nélkül. 2. pálya: pH: 7,5, stressznek alávetve. 3. pálya' pH 6,2, stressznek alávetve. 4. pálya: pH 6,2, stressznek alávetve, redukált. 5. pálya: pH 7,5, 1 mg/ml acetil-cisztein, stressznek alávetve. 6. pálya: pH 7,5,1 mg/mli acetil-cisztein, stressznek alávetve, redukált.
10. példa: PEG-EPO stabilitása különböze kompozíciókban 4, 25. 30 és 40°C on
Peqilezett EPO-ΐ különböző készítményekben mbb hőmérsékleten inkubálunk. Megadott időpontokban mintát veszünk, és a stabilitást ferdített fázisú nagy teljesítőképességű méretkizárásos kromatografálás (rpHPLC), nagy teljesítőképességű méretkizárásos kromatografálás (SEC) és nátrium-dcdecil-szuífáypolíakrilamid gél eiektroferézis (SDS-PAGE) segítségével meghatározzuk. A 3. táblázatban PEG-EPO (pegEPO): különböző készítményekben, eltérő hőmérsékleti értékeken mutatott stabilitását hasonlítjuk össze. Az adatok világosan bizonyítják, hogy a találmány szerint; készítmények a fehérje visszanyerés és aggregáciö tekintetében kedvezőbb tulajdonságokkal rendelkeznek.
PEMPÖ^tabilitáeaJ^^
%~os vi sszanvere s 6 hónap uis m Aggregáció
Készítmény pegEP O 4*C-on 25*C-or 30°C-on 40sC-or 30°C-on kimu-
uö/mi ........Wi^fo..í±Zd...........
A 10 92 91 n.v. 39 n.v.
B 50 97 98 97 78 —-
C 50 95 79 79 52 4-
E 50 103 102 '? ΑΛ í v'U 87
A 100 96 97 n.v. 50 n.v.
B 400 101 ιοί 101 77 -
C 400 100 94 90 56
D 400 98 96 93 73 -
E 400 99 98 100 66
A készítmények összetétele:
A készítmény: 1:0 mM nátrium-foszfát, 100 mM nátrium-kíorid, pH 7,5
B, készítmény: 10 mM nátrium-foszfát, 40 mM nátrium-szulfát, 3 tömeg/tértogat % manóit, pH 6,2
C. készítmény: W mM nátrium-foszfát, 100: mM nátrium-klorid, pH 7,0
D. készítmény. 10 mM nátrium-foszfát, 120 mM nátrium-szulfát, pH 6,2
E, készítmény: 40 mM arginin, 3Ö mM nátrium-szulfát,, 3 % manóit, 1 mM kaíoium-kíorid, pH 6,2.
példa: Metionin54 oxidációíának.yisszaszgrkása.pesüezett..E.P.O..fe.hériében: metionin antioxidánsként történő alkalmazása, opíMízáltkés^n^^
Pegilezett. EPO-t különböző készítményekben eltérő hőmérsékleti értékeken ínkubálunk.. Hat hónap múlva mintát veszünk, és a metionin54 oxidáció mértékét meghatározzuk a következőképpen: A mintákat ando-protemáz LysC-el kezeljük. A keletkező peptídeket fordított fázisú: kromatografálással választjuk szét. A T8 oxidált pepiid (oxidált metionm54~et tartalmaz) és a pepiid T8 (nemoxidált metianín54-eí tartalmaz) arányát kiszámítjuk. Az adatokat a 4. táblázatban foglaljuk össze.
áUáblszat
Peqilezett EPO fehérje (peqEPO) oxidációjának értéke különböző készítményekben a megadott hőmérsékleteken 6 hónapon át történő tárolás után
Készítmény pegEPí pgfml ) _ Oxidált metíonln54 %
4*C-an 25°C-on 30cC~on 40X-on
A 400 2,00 15,89 24,99 37,89
B 400 2,33 6.55 12,88 a on 30,24 Ί ,·4 .Z
<..· 4UU A 60 Z/OI 5,37 21,36 39,62 j 48,05
B 50 3.44 13.38 16,69 30,83
Q 50 4.41 5,52 19,01 15,82
A készítmények összetétele:
A. készítmény; 10 mM nátrium-foszfát, 100 mM nátríum-kiorid, pH 7,0
B, készítmény: 10 mM nátrium-foszfát, 10 mM nátrium-szulfát, 3 tömeg/térfogal % mannit pH 6,2.
C. készítmény: 10 mM nátrium-foszfát, 40 mM nátrium-szulfát 3 lömeg/térfogat % mannit, 1 mM metionin, pH 6,2:.
A fenti eredmények világosan bizonyítják, hogy a nátrium-szulfátot tartalmazó előnyös találmány szerinti készítmény (10 mM nátrium-foszfát, 40 mM nátnum-szulfát, 3 tömeg/térfogat % mannit, pH 6,2) a met;onin54 oxidáció mértéke tekintetében felülmúlja a többi készítményt (pl. a 10 mM nátrium-foszfátot és 100 mM nátrium-kloridot tartalmazó, 7,0 pH értékű: készítményt). A készítményhez hozzáadott 1 mM metionin
4?
a metionh54 oxidációt határozottan visszaszorítja. Ezért a metlonín antioxidánsként hat, és stabilizálja a fehérjét
12. példa: PEG-EPO minták sziálsav-tartalma különböző készítményekben
A PEG-EPO glikoprotein szénhidrát-szerkezete integritásának elemzése céljából a PEG-EPO minták sziálsav-tartalmát optimalizált készítményekben különböző hőmérsékleteken történő 6 hónapos tárolás után standard módszerekkel analizáljuk. Az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti új készítmé-nyekben a fehérje tárolása a szénhidrát szerkezet integritását nem befolyásolja károsan (9. ábra).
13. példa: Pegiíezett EPO bíoaktivítása magasabb hőmérsékleten hosszad időn át történő tárolás után
A teszt segítségével bizonyítjuk, hogy PEG-EPO tárolása 10 mM nátriumfoszfátot, 40 mM nátrium-szulfátot, 3 tömeg/térfogat % mannitot tartalmazó oldatban (pH 6,2) a bíőaktiviiást nem befolyásolja károsan. Stndard egér EPO in vivő tesztet végzünk el (lásd 6. példa). A PEG-EPO mintákat 10 mM nátrium-foszfátot. 40 mM nátrium-szulfátot, 3 tömeg/térfogat % mannitot. tartalmazó, pH 6,2 értékű oldatban a megadott hőmérsékleteken 6 hónapon át tároljuk. Azt találtuk, hogy az in vivő aktivitás a friss referens standarddal összehasonlítva 4, 25 illetve 30:>C-on végzett tárolás után nem csökken (10. ábra).
14. példa: PEG-EPO aggregátum tartalma magasabb hőmérsékleten 6 hónapon át történő tárolás után
A PEG-EPO minták aggregátum-tartalmát magasabb hőmérsékleten 10 mM nátrium-foszfátot, 40 mM nátrium-szulfátot, 3 tömeg/térfogat % mannitot tartalmazó oldatban (pH 6,2) történő tárolás után meghatározzuk. 6 hónapos tárolás után mintákat veszünk, amelyeket méretkizárásos kromatografálással analizálunk.
A 4*C~on, 25öC-on és történő támlás után aggregátum nem volt kimu tatható, ami a psgitezett EPO-nak a fenti készítményekben mutatott stabilitását bizonyítja. A11. ábrán a méretkizárásos kromatogrammokat tűntetjük fel

Claims (38)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Szobahőmérsékleten stabil folyékony gyógyászati készítmény, amely valamely peg kezeit búmén entropoíetíh fehérjét, az oldat pH-ját 5,5 és 7,0 közötti tártömányban tartó gyógyászatdag alkalmas püffedjen valamely többszörös töltésű szervetlen aniont és adott esetben egy vagy több gyógyászatilag alkalmas exclplenst tartalmaz, ahol az anion szulfát anion.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény vizes oldat formájában.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény izotóniás oldat formájában.
    4 Az 1. igénypont szerintii készítmény, amely 10-200 mi llimól/l .szulfát aniont tartalmaz.
  4. 5. Az 1-4 igénypontok: bármelyike szerinti készítmény, amelynek, a pH-|a 5,8-6,7.
  5. 6. Az 5. igénypont szerinti készítmény, amelynek a pH-ja 6,0-6,5.
  6. 7. A 6. igénypont szerinti készítmény, amelynek a pH-ja 6,2.
    8 Az 1 -7. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely pufferként valamely foszfátpuffert tartalmaz, vagy arginin/kénsav/ nátrium-szulfát puffért tartalmaz.
  7. 9. A 8. igénypont szerinti készítmény, amely 10-50 midiméi foszfátpuffert tartalmaz.
  8. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szennti készítmény, amely egy vagy több gyógyászatilag alkalmas exnipienst tartalmaz.
  9. 11. A 10. igénypont szerinti: készítmény, amely egy vagy több gyógyászatilag alkalmas exoipiensként valamely gyógyászatilag alkalmas sót, hígítészert. oldószert vagy tartósítószert tartalmaz.
    12:, A10. vagy 11.. igénypont szerinti készítmény, amely győgyászatilag: aíkaímás excípiensként valamely tonicitást beállító szert, paliéit, antioxidánst vagy némlones detergensi tartalmaz.
  10. 13. A 10-12. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely gyógyászatiig alkalmas excípiensként valamely políolt tartalmaz
  11. 14. A 13. igénypont szerinti készítmény, amely polioiként mannitot, szóróitól, glicerint, trehalózt vagy szacharózt tartalmaz,
  12. 15. A 14. igénypont szerinti készítmény, amely polioiként mannitot tartalmaz.
    16.. A 10-15. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely valamely anti~ oxídánst tartalmaz.
  13. 17. A 16, igénypont szerinti- készítmény, amely antioxidánsként meiionint tar talmaz.
  14. 18. A 10-17. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely 1 millimól/i értékig terjedő mennyiségben kalchm-klondot tartalmaz.
  15. 19. A 12-18. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely nemionos detergensként. políszorbát 80-at, políszorbát 20-at vagy pluronic F68-aí tartalmaz
  16. 20. A 19. igénypont szerinti készítmény, amely nemionos detergensként pluronic F68-at tartalmaz.
  17. 21. A 19. vagy 20. igénypont szerinti készítmény, amely 1 tömeg/tértógat %~ig tegedo mennyiségű nemíonos detergensi tartalmaz.
  18. 22. A 19-21. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely 0,1 tömeg/térfogat %-ig terjedő mennyiségű nemionos detergensi tartalmaz.
  19. 23. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely eritropoietin fehérjeként egy konjugátumot tartalmaz, ami humán eritropoietin glikoproteint foglal magába, mímeílett ez a ghkoprotein kovalens kötéssel ’n -CO-(CH2)x(OCH2CH2)ri
    -OR általános képletű poli(etíléngnkol)-osoporthoz kapcsolódik, amelyben minden porlfetíléngiikolj-osoport -CD- csoportja amidkötés képzése közben valamely feni említett aminocsoporthoz kapcsolódik, R jelentése kis szénatomszámú alkílcsoport; x értéke 2 vagy 3; m értéke 450 és 900 közötti szám; n értéke 1-3; és n és m: értékét oly módon választjuk meg, hogy a konjugátum molekulatömege az ent-ropoletín glikoprotein nélkül 20-100 kDa.
  20. 24. A 23. igénypont szerinti készítmény, amely (I) általános képletű entropoietin fehérjét tartalmaz, ahol m, n, x és R jelentése a 23, igénypontban megadott, és P jelentése a glikoprotein maradéka a polí(etHénglikoQ~csoporttal vagy csoportokkal amidkötést vagy -kötéseket képező *h aminocsoport(ok) nélkül
  21. 25. A 24. igénypont szerinti készítmény, amely (I) általános képletű eritmpoietin tehénét tartalmaz, ahol x értéke 2, m értéke 650-750, n értéke 1, és R jelentése metilespport.
  22. 26. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely entropoietin fehérjeként egy konjugátumot tartalmaz, amely konjugátum humán eritropoietín giíkoproteint foglal magába, mimeliett ez a glikoprotein kovalens kötéssel egy-három kis szénatomszámú aikoxí-pulí(etiiéngiíkal)~asoporthoz kapcsolódik, mindegyik poli(etílénglíkoí)-osoport a giikcprotelnhez valamely -O(O)-X~S-¥- általános képletű línkeren keresztül kovalensen kapcsolódik, amely linker C(O) csoportja a fenti aminocsoporiok valamelyikével amidkötést képez, X jelentése -(CHJr· vagy -CH2(OCH2CH^„ k értéke 1-10, Y jelentése (1), (2), (3) vagy (4) képletű csoport, minden poli(etiiéngii~ koí)~csöport átlagos molekulatömege 20 kDa és 40 kDa közötti érték, és a konjugátum molekulatömege 51 kDa és 175 kpa közötti érték.
  23. 27. A 26. igénypont szerinti készítmény, amelyben a konjugátum (IVA) általános képletű vegyülat, mely képletben n értéke 1-3, m értéke 450 és 900 közötti egész szám, R jelentése kis szénatomszámú: alkílcsoport, X jelentése -(CH2X- vagy
    -CHí(OCH2CH2)k~; és P jelentése az eritroprotein glikoproteín maradéka az X csoporttal amídköíést képező am:inocsoport(ak) nélkül.
  24. 28. A 27. igénypont szerinti készítmény, amelyben a konjugátum (IV) általános képleté vegyűlet, mely képletben: n értéke 1-3, m értéke 450: és 900 közötti egész szám, R jelentése kis szénatomszámű alkiícsoport, X jelentése ~(CH2))r -C:H2(O~CHSCH2)K-, és P jelentése az eritroprotein giikoprotein maradéka az X csoporttal amidkőtést képező aminccsoport(ök) nélkül:.
  25. 29. Az 1-28. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely mi-ként 10-10 090 pg: eritropoietin fehérjét tartalmaz.
    80. Az 1-29. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely mi-ként 10-10 000 ug eritropoietin fehérjét, 10-200 miIIímól/l szulfátot és 10-50 millimól/l foszfátot tartalmaz (pH 6,0-6,5).
  26. 31. A 39. igénypont, szerinti készítmény, amely 20 mk* értékig terjedő mennyiségű metionint, 1-5 tömeg/terfegat % poliolt, 0,1 tőmeg/tértogat % értékig terjedő mennyiségű plúronlc :F68-at és adott esetben 1 m:M értékig terjedő mennyiségű kaicium-klondot tartalmaz.
  27. 32. A 30. vagy 31. igénypont szerinti készítmény, amely mi-ként 10-10 000 p.g eritropoietín fehérjét, 40 millimói/l szulfátot, 10 millimól/l foszfátot, 3 tömeg/térfogat % monoltot, 10 mM metlonmt és 9,01 tomeg/térfogat % pluronic F68-at tartalmaz (pH 6,2).
  28. 33. Az 1-29. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely mi-ként 10-10 000 pg eritropoietin fehérjéi, 10-100 milli-mól/1 nátnum-kloridot, 10-50 miliímól/i foszfátot (pH 6,9-7.0} és adott, esetben 1-5 % pallóit tartalmaz.
  29. 34. A 33. igénypont szerinti készítmény, amely 20 mM értékig terjedő mennyiségű metionint, 0.1 %-ig terjedő mennyiségű pluronic F68-at és adott esetben 7.5 pmói/l kaicium-kiorídot tartalmaz.
  30. 35. A 33. vagy 34. igénypont szerinti készítmény, amely mi-ként 10-10 000 pg entroppíeíin fehériát,: 100 miliimól/l nátnurn-Wndoi, W mM metípplnt. 0,01 % plufoníe F68-ai és 10 miHmől/r foszfátot (pH '7,0) tartalmaz
    36 Az 1-29 igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely mi-ként 10-10 000 ag eritropoíetin fehérjét. 10-50 miliméi/i argininl (pH 6,0-6.5) és 10-100 miiiimói/l nátrium-szulfátot tartalmaz.
  31. 37. A 36 igénypont szerinti készítmény, amely 20 mM értékig terjedő mennyiségű metmnint, 0.1 % értékig terjedő mennyiségű piuronic F66-at. adott esetben 1 milhrnói/l értékig terjedő mennyiségű kalcium-kioridot és adott esetben 1 -5 % poliolt tartalmaz
  32. 38. A 36 vagy 37 igénypont szerinti készítmény, amely ml-énként 10-10 000 pg eritropoíetin fehérjét, 40 millímói/l arginint (pH 6.2), 30 miliimól/l nátrium-szulfátot. 3 % mannitot, 10 mM metionint, 0,01 % pluronio F63-at és adott esetben 1 millimól/l kaloium-kloridot tartalmaz.
  33. 39. Az 1-29. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely 25-2500 pg/mi eritropoíetin fehérjét és
    a) 10 mM nátnum/kaliuín-foszfátol. 100 mM nálnum-kiormoí. pH 7.0 vagy
    b) 10 mM nátrium-foszfátot. 120 mM nátrium-szulfátot pH 6,2: vagy
    c) 10 mM nátrium-foszfátot. 40 mM nátrium-szulfátot. 3 % mannitot, pH 6,2: vagy
    d) 10 mM nátrium-foszfátot, 40 mM nátrium-szulfátot. 3 % manóitól, 10 mM metionmt, 0,01 4: pruronio F68-at, pH 6,2: vagy
    e) 40 mM arginint. 30 mM nátrium-szulfátot, 3 % mannitot, pH 6.2, vagy fi 40 rnM argmint, 30 mM nátrium-szulfátot, 3 % mannitot, 10 m.M metionint, 0,01 % phjromc F68-at pH 6 2
    SZTNH-100113034
  34. 40. Az 1-39. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely 50, 100, 400,
    800 vagy 2500 pg/mi entropoletin fehérjét tartalmaz.
    41 A 40. igénypont szerinti készítmény, amely 10 mM nátrium-foszfátot.. 40 mM nátrium-szulfátot, 3 % mannitot, 10 mM mefionint és 0,01 % pluronic F88-al tartalmaz pH 6,2
  35. 42. A 40. igénypont szerinti készítmény, amely 40 mM aram-nt, 30 mM nátrium-szulfátot, 3 % mannitot, 10 mM mefionint és 0,01 % pluronic F68-at tartalmaz pH 6,2
  36. 43. Az 1-42 igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az ehtropoíelin fehérje aminosav szekvenciája SEQ iD NO:1 vagy SEQ ID N:O:2 szerinti.
  37. 44. Eljárás az 1-43. igénypontok bármelyike szerinti készítmény előállítására, azzal jellemezve, hegy valamely pegilezett humán erítropoietin fehérjét valamely többszörös negatív töltésű aniont tartalmazó oldattal és adott esetben egy vagy több gyógyászatiiag alkalmas excipienssel összekeverünk, és pH-iát gyógyászaülag alkalmazható pufferrel 5,5-7,0-ra áilitmk. miméi lett az anion szulfát anion.
  38. 45. Az 1-43. igénypontok bármelyike szerinti készítmény felhasználása krónikus veseeiégtelenségben szenvedő (CRF) betegeken és AIDS esetében vérszegénységgel összefüggő betegségek kezelésére és megelőzésére, es/vagy kemoterápiának alávetett rákos betegek kezelésére alkalmas gyógyászat; készítmények előállítására
HU0302114A 2000-05-15 2001-05-08 Pegilezett humán eritropoietin-fehérjét tartalmazó, szobahőmérsékleten stabil folyékony gyógyászati készítmények HU230874B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00110355.5 2000-05-15
EP00110355 2000-05-15
PCT/EP2001/005187 WO2001087329A1 (en) 2000-05-15 2001-05-08 Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivate

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0302114A2 HUP0302114A2 (hu) 2003-10-28
HUP0302114A3 HUP0302114A3 (en) 2012-12-28
HU230874B1 true HU230874B1 (hu) 2018-11-29

Family

ID=8168722

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0302114A HU230874B1 (hu) 2000-05-15 2001-05-08 Pegilezett humán eritropoietin-fehérjét tartalmazó, szobahőmérsékleten stabil folyékony gyógyászati készítmények

Country Status (35)

Country Link
US (2) US7169754B2 (hu)
EP (2) EP1311285B2 (hu)
JP (1) JP3967594B2 (hu)
KR (3) KR20070032815A (hu)
CN (1) CN1309416C (hu)
AR (2) AR035034A1 (hu)
AT (1) ATE291436T2 (hu)
AU (1) AU784091B2 (hu)
BR (1) BRPI0110914B8 (hu)
CA (1) CA2408685C (hu)
CZ (1) CZ304855B6 (hu)
DE (1) DE60109625T3 (hu)
DK (1) DK1311285T4 (hu)
EC (2) ECSP024352A (hu)
ES (1) ES2237574T5 (hu)
HR (1) HRP20020880B1 (hu)
HU (1) HU230874B1 (hu)
IL (2) IL152659A0 (hu)
JO (1) JO3404B1 (hu)
MA (1) MA26901A1 (hu)
ME (1) MEP90708A (hu)
MX (1) MXPA02011303A (hu)
MY (1) MY128654A (hu)
NO (1) NO330934B1 (hu)
NZ (1) NZ522030A (hu)
PE (1) PE20020050A1 (hu)
PL (1) PL219131B1 (hu)
PT (1) PT1311285E (hu)
RS (1) RS51292B (hu)
RU (1) RU2281116C2 (hu)
SI (1) SI1311285T1 (hu)
TW (2) TWI288643B (hu)
UY (1) UY26704A1 (hu)
WO (1) WO2001087329A1 (hu)
ZA (1) ZA200208500B (hu)

Families Citing this family (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5545553A (en) * 1994-09-26 1996-08-13 The Rockefeller University Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them
US7304150B1 (en) 1998-10-23 2007-12-04 Amgen Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
WO2001077137A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-18 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
MXPA02011303A (es) * 2000-05-15 2003-04-25 Hoffmann La Roche Nueva composicion farmaceutica.
WO2002049673A2 (en) * 2000-12-20 2002-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)
JP4656814B2 (ja) * 2000-12-20 2011-03-23 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー エリスロポエチンコンジュゲート
FR2823220B1 (fr) * 2001-04-04 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
EP1401477A4 (en) * 2001-05-25 2005-02-02 Human Genome Sciences CHIMIOKINE BETA-1 HYBRID PROTEINS
US20030104996A1 (en) * 2001-08-30 2003-06-05 Tiansheng Li L-methionine as a stabilizer for NESP/EPO in HSA-free formulations
JP2003152145A (ja) * 2001-08-31 2003-05-23 Sumitomo Electric Ind Ltd 半導体放熱用基板とその製造方法及びパッケージ
US7795210B2 (en) * 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7399613B2 (en) * 2001-10-10 2008-07-15 Neose Technologies, Inc. Sialic acid nucleotide sugars
US7473680B2 (en) 2001-11-28 2009-01-06 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycoconjugation of peptides
CA2484556A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP2277889B1 (en) * 2001-12-21 2014-07-09 Human Genome Sciences, Inc. Fusion proteins of albumin and interferon beta
DE60336555D1 (de) * 2002-06-21 2011-05-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylierte glykoformen von faktor vii
SI21258A (sl) * 2002-07-17 2004-02-29 LEK farmacevtska dru�ba d.d. Stabilni farmacevtski pripravek, ki vsebuje eritropoietin in poloksamerni poliol
US7459435B2 (en) * 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
CA2497960A1 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Warren Pharmaceuticals, Inc. Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
US7470779B2 (en) * 2002-09-20 2008-12-30 Pfizer Inc. Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein
US7459436B2 (en) 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
EP1594530A4 (en) 2003-01-22 2006-10-11 Human Genome Sciences Inc HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN
NZ542094A (en) * 2003-03-14 2008-12-24 Neose Technologies Inc Branched polymer conjugates comprising a peptide and water-soluble polymer chains
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US20070026485A1 (en) 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
EP1613261A4 (en) * 2003-04-09 2011-01-26 Novo Nordisk As INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES
US20080146782A1 (en) * 2006-10-04 2008-06-19 Neose Technologies, Inc. Glycerol linked pegylated sugars and glycopeptides
BRPI0410164A (pt) * 2003-05-09 2006-05-16 Neose Technologies Inc composições e métodos para preparação de mutantes de glicosilação de hormÈnio do crescimento humano
DE602004028725D1 (de) * 2003-05-12 2010-09-30 Affymax Inc Neue poly(ethylenglycol) modifizierte erythropoietinagonisten und deren verwendungen
DE602004020610D1 (de) 2003-05-12 2009-05-28 Affymax Inc Neue, an den erythropoietinrezeptor bindende peptide
KR101227666B1 (ko) * 2003-05-12 2013-01-31 아피맥스, 인크. 에리스로포이에틴 수용체에 결합하는 펩티드
US7919118B2 (en) 2003-05-12 2011-04-05 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly (ethylene glycol) modified peptide based compounds
CN1802171B (zh) * 2003-06-10 2010-10-13 株式会社Lg生命科学 不包含血清白蛋白的人红细胞生成素的稳定水溶液
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US8633157B2 (en) * 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
EP1694347B1 (en) * 2003-11-24 2013-11-20 BioGeneriX AG Glycopegylated erythropoietin
US20070254836A1 (en) * 2003-12-03 2007-11-01 Defrees Shawn Glycopegylated Granulocyte Colony Stimulating Factor
US20080318850A1 (en) * 2003-12-03 2008-12-25 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated Factor Ix
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
US7956032B2 (en) 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
SI1696947T1 (sl) 2003-12-19 2014-05-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Uporaba eritropoetina pri zdravljenju motenj porazdelitve železa pri kroničnih vnetnih črevesnih boleznih
WO2005070138A2 (en) * 2004-01-08 2005-08-04 Neose Technologies, Inc. O-linked glycosylation of peptides
SG135176A1 (en) * 2004-02-02 2007-09-28 Ambrx Inc Modified human four helical bundle polypeptides and their uses
DE202004020676U1 (de) * 2004-03-10 2005-11-10 Bioceuticals Arzneimittel Ag Erythropoietin-Flüssigformulierung
WO2005089743A1 (ja) * 2004-03-19 2005-09-29 Ajinomoto Co., Inc. 腎性貧血治療剤
US20050282751A1 (en) * 2004-03-19 2005-12-22 Ajinomoto Co., Inc. Therapeutic agent for renal anemia
US20050267026A1 (en) * 2004-03-26 2005-12-01 Cheung Wing K Combination dosing regimen for erythropoietin
AR049580A1 (es) * 2004-07-07 2006-08-16 Lundbeck & Co As H Epo carbamilada y metodo para su produccion
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US20090292110A1 (en) * 2004-07-23 2009-11-26 Defrees Shawn Enzymatic modification of glycopeptides
US20060029551A1 (en) * 2004-08-05 2006-02-09 Kui Liu Stable particle formulations of erythropoietin receptor agonists
US7772182B2 (en) * 2004-08-05 2010-08-10 Alza Corporation Stable suspension formulations of erythropoietin receptor agonists
US8268967B2 (en) * 2004-09-10 2012-09-18 Novo Nordisk A/S Glycopegylated interferon α
ES2566670T3 (es) * 2004-10-29 2016-04-14 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glucopegilación del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)
JP2006137678A (ja) * 2004-11-10 2006-06-01 Shionogi & Co Ltd インターロイキン−２組成物
CN101142234A (zh) * 2004-11-11 2008-03-12 阿费麦克斯公司 结合红细胞生成素受体的新肽
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
JP2008526864A (ja) * 2005-01-06 2008-07-24 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 糖断片を用いる糖結合
JP4951527B2 (ja) 2005-01-10 2012-06-13 バイオジェネリックス アーゲー 糖ｐｅｇ化顆粒球コロニー刺激因子
WO2006079155A1 (en) * 2005-01-25 2006-08-03 Apollo Life Sciences Limited Molecules and chimeric molecules thereof
US20060246544A1 (en) * 2005-03-30 2006-11-02 Neose Technologies,Inc. Manufacturing process for the production of peptides grown in insect cell lines
US20070154992A1 (en) * 2005-04-08 2007-07-05 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20070037886A1 (en) * 2005-04-26 2007-02-15 Ajinomoto Co., Inc. Bone marrow erythroid progenitor cell(s) differentiation inducer
EP2975135A1 (en) * 2005-05-25 2016-01-20 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
WO2006127910A2 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
US20110003744A1 (en) * 2005-05-25 2011-01-06 Novo Nordisk A/S Glycopegylated Erythropoietin Formulations
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7790679B2 (en) * 2005-08-05 2010-09-07 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
CA2619969A1 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor vii and factor viia
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20070072795A1 (en) * 2005-09-28 2007-03-29 Anton Haselbeck Treatment of neurodegenerative disorders
US20090048440A1 (en) * 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
ES2839549T3 (es) 2005-11-23 2021-07-05 Acceleron Pharma Inc Antagonistas de activina-ActRIIa de utilización en la estimulación del crecimiento óseo
CN101015684B (zh) * 2006-02-10 2011-08-24 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 一种重组人红细胞生成素溶液制剂
WO2007108505A1 (ja) * 2006-03-22 2007-09-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha エリスロポエチン溶液製剤
US20080248959A1 (en) * 2006-07-21 2008-10-09 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
KR101304081B1 (ko) * 2006-08-04 2013-09-05 프로롱 파마슈티컬스, 엘엘씨 수식된 에리스로포이에틴
EP2054521A4 (en) * 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As PROCESS FOR CLEANING POLYPEPTIDE CONJUGATES
US20080207487A1 (en) * 2006-11-02 2008-08-28 Neose Technologies, Inc. Manufacturing process for the production of polypeptides expressed in insect cell-lines
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
TW201803890A (zh) 2007-02-02 2018-02-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
PL2144923T3 (pl) 2007-04-03 2013-12-31 Biogenerix Ag Sposoby leczenia z użyciem glikopegilowanego G-CSF
US20090053167A1 (en) * 2007-05-14 2009-02-26 Neose Technologies, Inc. C-, S- and N-glycosylation of peptides
US20080286341A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-20 Sven-Borje Andersson Buffered coated nicotine containing products
WO2008151258A2 (en) * 2007-06-04 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. O-linked glycosylation using n-acetylglucosaminyl transferases
EP2170919B8 (en) 2007-06-12 2016-01-20 ratiopharm GmbH Improved process for the production of nucleotide sugars
WO2009002521A2 (en) * 2007-06-25 2008-12-31 Amgen Inc. Compositions of specific binding agents to hepatocyte growth factor
US7968811B2 (en) * 2007-06-29 2011-06-28 Harley-Davidson Motor Company Group, Inc. Integrated ignition and key switch
AR067537A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Purificacion de polipeptidos pegilados
AR067536A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
EP2197919B1 (en) 2007-08-27 2014-04-09 ratiopharm GmbH Liquid formulation of g-csf conjugate
US8207112B2 (en) * 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
CN101456911A (zh) * 2007-12-12 2009-06-17 江苏豪森药业股份有限公司 促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐和其制备方法与用途
CN102037004A (zh) * 2008-01-08 2011-04-27 生物种属学股份公司 使用寡糖基转移酶的多肽的糖缀合
EP2626079A3 (en) 2008-02-27 2014-03-05 Novo Nordisk A/S Conjungated factor VIII molecules
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
PL3494986T3 (pl) 2008-08-14 2020-11-16 Acceleron Pharma Inc. Pułapki GDF
WO2010034442A1 (en) 2008-09-23 2010-04-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Purification of erythropoietin
JP5912078B2 (ja) 2009-06-08 2016-04-27 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法
JP2012529294A (ja) 2009-06-12 2012-11-22 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 切断型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質
JP5738285B2 (ja) 2009-06-24 2015-06-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 再使用可能なクロマトグラフィー装置の特徴決定方法
BRPI0902481B8 (pt) 2009-07-31 2021-05-25 Soc Beneficente De Senhoras Hospital Sirio Libanes composição farmacêutica compreendendo hemopressina e seu uso.
KR20200124322A (ko) * 2009-08-13 2020-11-02 악셀레론 파마 인코포레이티드 적혈구 수준을 증가시키기 위한 ｇｄｆ 트랩과 에리트로포이에틴 수용체 활성인자의 병용
UA107678C2 (uk) * 2009-09-23 2015-02-10 ратіофарм ГмбХ Процес очищення рекомбінантного людського еритропоетину (епо), епо, очищений таким чином, та фармацевтична композиція, що містить його
CA2781152A1 (en) 2009-11-17 2011-05-26 Acceleron Pharma Inc. Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
JP5621052B2 (ja) 2010-12-21 2014-11-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュアーゲーＦ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ クロマトグラフィー装置の特徴決定
AR094821A1 (es) 2012-07-25 2015-09-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada
CN102816227A (zh) * 2012-08-30 2012-12-12 深圳赛保尔生物药业有限公司 回收促红细胞生成素的方法
NZ707477A (en) 2012-11-02 2019-09-27 Celgene Corp Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
CU20140003A7 (es) 2014-01-08 2015-08-27 Ct De Inmunología Molecular Biofarmacuba Conjugado que comprende eritropoyetina y una estructura polimérica ramificada
CA2943906A1 (en) * 2014-03-29 2015-10-08 Intas Pharmaceuticals Ltd. Liquid pharmaceutical composition of conjugated erythropoietin
TN2016000553A1 (en) 2014-06-13 2018-04-04 Acceleron Pharma Inc Methods and compositions for treating ulcers
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
US11608357B2 (en) 2018-08-28 2023-03-21 Arecor Limited Stabilized antibody protein solutions
EP3372242A1 (en) 2017-03-06 2018-09-12 Ares Trading S.A. Liquid pharmaceutical composition
EP3372241A1 (en) 2017-03-06 2018-09-12 Ares Trading S.A. Liquid pharmaceutical composition
WO2018184692A1 (en) * 2017-04-07 2018-10-11 Ares Trading S.A. Liquid pharmaceutical composition
JP7227633B2 (ja) * 2017-12-29 2023-02-22 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． Ｐｅｇ化タンパク質組成物を提供するための方法
CN111558046A (zh) * 2020-05-27 2020-08-21 华润昂德生物药业有限公司 海藻糖在制备重组人促红素液体制剂中的应用及重组人促红素液体制剂、制备方法和应用
TWI740635B (zh) * 2020-09-09 2021-09-21 財團法人工業技術研究院 聚偏氟乙烯薄膜組成物及聚偏氟乙烯隔離膜

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US147431A (en) * 1874-02-10 Improvement in game boards
US115833A (en) * 1871-06-13 Improvement in grain-driers
JPS6197229A (ja) * 1984-10-18 1986-05-15 Chugai Pharmaceut Co Ltd 安定なエリトロポエチン製剤
US4732889A (en) * 1985-02-06 1988-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for the treatment of the anemia of rheumatoid arthritis
DE3729863A1 (de) * 1987-09-05 1989-03-16 Boehringer Mannheim Gmbh Stabilisierte erythropoietin-lyophilisate
DE3734923C1 (de) 1987-10-15 1989-01-26 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur Herstellung einer sterilen Plasmaproteinloesung,die Fibrinogen und den Gerinnungsfaktor XIII enthaelt
DE4014654A1 (de) 1990-05-08 1991-11-14 Behringwerke Ag Galenische waessrige formulierungen von erythropoietin und ihre verwendung
CA2069746A1 (en) * 1990-09-28 1992-03-29 Jonathan I. Rosen Hybrid growth factors
US5272135A (en) 1991-03-01 1993-12-21 Chiron Ophthalmics, Inc. Method for the stabilization of methionine-containing polypeptides
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
NZ244778A (en) 1991-10-21 1994-03-25 Ortho Pharma Corp Peg imidates and protein derivatives thereof
DE4135542A1 (de) 1991-10-28 1993-04-29 Boehringer Mannheim Gmbh Lagerfaehige proteinloesungen
US5460944A (en) 1991-10-28 1995-10-24 Boehringer Mannheim Gmbh Storable protein solution
US5716644A (en) * 1992-06-11 1998-02-10 Alkermes, Inc. Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin
US5661125A (en) * 1992-08-06 1997-08-26 Amgen, Inc. Stable and preserved erythropoietin compositions
US5354934A (en) † 1993-02-04 1994-10-11 Amgen Inc. Pulmonary administration of erythropoietin
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
ZA946122B (en) * 1993-08-17 1995-03-20 Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
TW518219B (en) * 1996-04-26 2003-01-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Erythropoietin solution preparation
ATE341344T1 (de) * 1996-08-02 2006-10-15 Ortho Mcneil Pharm Inc Polypeptide mit einzelnem kovalent gebundenen n- terminalen wasserlöslichen polymer
US5919656A (en) 1996-11-15 1999-07-06 Amgen Canada Inc. Genes encoding telomerase protein 1
EP0885613A1 (de) 1997-06-21 1998-12-23 Roche Diagnostics GmbH Verwendung von modifizierten Hämoglobinen zur Behandlung von Anämien und Kombinationspräparate umfassend Erythropoietin und modifiziertes Hämoglobin
DE19734293A1 (de) 1997-08-08 1999-02-11 Boehringer Mannheim Gmbh Verwendung von pharmazeutischen Kombinationspräparaten enthaltend Erythropoietin und Eisenpräparate zur Behandlung von rheumatischen Erkrankungen
ES2283139T5 (es) 1998-10-23 2018-03-05 Amgen Inc. Métodos y composiciones para la prevención y tratamiento de la anemia
UY25790A1 (es) 1998-11-06 2000-08-21 Bio Sidus S A Formas farmaceuticas de eritropoyetina humana recombinante estables a temperatura ambiente y apropiadas para su uso en humanos, formulaciones y procedimientos de liofilizacion para su obtencion.
JP2000247903A (ja) * 1999-03-01 2000-09-12 Chugai Pharmaceut Co Ltd 長期安定化製剤
TR200103788T2 (tr) † 1999-04-09 2002-05-21 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Farmasötik eritropoietin bileşimleri
US6309663B1 (en) 1999-08-17 2001-10-30 Lipocine Inc. Triglyceride-free compositions and methods for enhanced absorption of hydrophilic therapeutic agents
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
CZ299516B6 (cs) † 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
EA006220B1 (ru) 1999-07-22 2005-10-27 Авентис Фармасьютиклс, Инк. Многодозовые эритропоэтиновые составы
EP1232753B1 (en) † 1999-09-08 2008-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stable protein solution filled in a container made from a hydrophobic resin and method of stabilizing the same
EP1260230A4 (en) 2000-02-29 2008-08-06 Chugai Pharmaceutical Co Ltd LONG-TERM STABILIZED PREPARATIONS
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
MXPA02011303A (es) * 2000-05-15 2003-04-25 Hoffmann La Roche Nueva composicion farmaceutica.
EP1336410A4 (en) † 2000-08-04 2005-10-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROTEIN INJECTION PREPARATIONS
JP4656814B2 (ja) * 2000-12-20 2011-03-23 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー エリスロポエチンコンジュゲート
US20030104996A1 (en) 2001-08-30 2003-06-05 Tiansheng Li L-methionine as a stabilizer for NESP/EPO in HSA-free formulations
US6818613B2 (en) 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins

Also Published As

Publication number Publication date
IL152659A0 (en) 2003-06-24
MXPA02011303A (es) 2003-04-25
YU83502A (sh) 2005-11-28
AU6593401A (en) 2001-11-26
PL219131B1 (pl) 2015-03-31
BRPI0110914B8 (pt) 2021-05-25
JO3404B1 (ar) 2019-10-20
CZ20024005A3 (cs) 2004-01-14
CN1429116A (zh) 2003-07-09
JP2003533487A (ja) 2003-11-11
SI1311285T1 (hu) 2005-08-31
NO20025450D0 (no) 2002-11-14
HK1056683A1 (en) 2004-02-27
NO20025450L (no) 2002-11-14
ME00673B (me) 2011-12-20
HUP0302114A3 (en) 2012-12-28
KR20070032815A (ko) 2007-03-22
BR0110914A (pt) 2003-02-11
EP1525889A1 (en) 2005-04-27
NO330934B1 (no) 2011-08-22
ES2237574T5 (es) 2017-08-09
RS51292B (sr) 2010-12-31
DE60109625T2 (de) 2006-03-30
HUP0302114A2 (hu) 2003-10-28
TWI288644B (en) 2007-10-21
EP1311285A2 (en) 2003-05-21
EP1311285B1 (en) 2005-03-23
US7169754B2 (en) 2007-01-30
WO2001087329A8 (en) 2002-03-07
AU784091B2 (en) 2006-02-02
PT1311285E (pt) 2005-06-30
DK1311285T4 (en) 2017-07-24
ES2237574T3 (es) 2005-08-01
BRPI0110914B1 (pt) 2016-03-01
IL152659A (en) 2010-12-30
HRP20020880A2 (en) 2004-12-31
MY128654A (en) 2007-02-28
ZA200208500B (en) 2004-01-28
CN1309416C (zh) 2007-04-11
ATE291436T2 (de) 2005-04-15
WO2001087329A1 (en) 2001-11-22
US20020037841A1 (en) 2002-03-28
DK1311285T3 (da) 2005-06-27
PL361341A1 (pl) 2004-10-04
CA2408685A1 (en) 2001-11-22
JP3967594B2 (ja) 2007-08-29
KR20050121762A (ko) 2005-12-27
AR092919A2 (es) 2015-05-06
CZ304855B6 (cs) 2014-12-10
NZ522030A (en) 2004-11-26
DE60109625D1 (de) 2005-04-28
KR100758044B1 (ko) 2007-09-11
US7202208B2 (en) 2007-04-10
KR20030001509A (ko) 2003-01-06
ECSP10004352A (es) 2011-01-31
UY26704A1 (es) 2001-12-28
MA26901A1 (fr) 2004-12-20
ECSP024352A (es) 2003-03-31
US20040147431A1 (en) 2004-07-29
MEP90708A (hr) 2011-12-20
HRP20020880B1 (en) 2006-04-30
TWI288643B (en) 2007-10-21
DE60109625T3 (de) 2017-08-03
EP1311285B2 (en) 2017-04-12
PE20020050A1 (es) 2002-02-01
CA2408685C (en) 2011-02-01
AR035034A1 (es) 2004-04-14
RU2281116C2 (ru) 2006-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230874B1 (hu) Pegilezett humán eritropoietin-fehérjét tartalmazó, szobahőmérsékleten stabil folyékony gyógyászati készítmények
AU736067B2 (en) Erythropoietin derivatives
CA2378533C (en) Erythropoietin conjugates with polyethylenglycol
AU2005225151B2 (en) New pharmaceutical composition