TWI286160B - Improved detection signal and capture In dipstick assays - Google Patents

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1286160 五、發明說明（2) 月旲之接觸端與樣品溶液接觸，樣品溶液藉由毛細作用在濾 膜上虹吸’且經過探針帶及捕獲帶。當樣品溶液通過探針 帶時會使探針移動，且與樣品溶液上升而朝向捕獲帶，而 移動的偵測探針之後能與存在於樣品溶液中任何目標DNA 之第二區作雜交。 當雜交的偵測探針及目標DNA到達捕獲帶，目標DNA之 第一區能與固定於捕獲帶之捕獲探針雜交，因此在目標核 酸、捕獲探針及標示偵測探針間形成三元複合物，因此， 捕獲帶上標示之出現表示其樣品溶液中目標DNA之存在。 依傳統檢棒分析之第二型態，標示DNA偵測探針並非固 定於硝化纖維濾膜，反而是在偵測探針可雜交至樣品溶液 中的任何目標核酸之允許條件下，將偵測探針加入樣品溶 液中，之後硝化纖維濾膜與樣品溶液接觸，且任何雜交至 偵測探針之目標核酸於捕獲帶中被捕獲探針捕獲。 然而，已發現以傳統檢棒的核酸偵測之敏感性甚低，尤 其如果目標核酸爲雙股時。因此，在樣品溶液中目標核酸 之出現有時並不能偵測，使用傳統檢棒測試事實上被認爲 並不能偵測環狀雙股的目標核酸，因此需要改良藉由檢棒 的目標核酸偵測之敏感性。 根據本發明之第一觀點，其提供在檢棒分析中複數的不 同偵測探針之用法，以測試在樣品溶液中目標核酸之存在 ，各偵測探針能夠雜交至目標核酸之不同區域，因此可利 用偵測探針進行目標核酸之偵測。 -4- 1286160 五、 發明說明 ( 6) 或偵測探針包含複 數 偵 測 配位 體， 其使 用偵 測 探 針 可間接偵測目標核酸€ 根 據 本 發 明 之第二觀點 其 亦 提供 種 :檢棒 以測 試 樣 品 溶 液 中 標 核 酸之存在， 其 包含 ·· — 種 具 有 接 觸端以接觸 樣 品 試 劑之 層析片； —^ 種 固 定 於 接觸端之另 一 端 之 捕獲 帶的 捕獲 部分 ， 捕 獲 部 分 能 夠 直 接 或間接結合 至 標 核酸 ，及 一 種 可 釋 放 地固定於層 析 片 之 偵測 探針 ,其 位於 接 觸 端 與 捕 獲 帶 之 間 ，偵測探針 能 夠 雜 交至 目標 核酸 ，其 中 偵 測 探 針 包含 複 數 標示，其使 用 偵 測 探針 可直 接偵 測目 標 核 酸 或 偵 測 探 針包含複數偵 測 配 位 體， 其使 用偵 測探 針 可 間 接 偵 測目 標 核 酸。 本 發 明 第 二 觀點之捕獲 部 分 能 包含 捕獲 探針 ，其 能 夠 直 接 地 雜 交 至 巨 標核酸或已 結 合 至 目標 核酸 之吊 鈎捕 獲 探 針 或捕 獲 部份可包含捕獲 配 位 體 結合 部分 ，其 能夠 結 合 至 已 結 合 巨 標 核 酸的捕獲探 針 之 捕: 獲配' /_U 1¾¾ ίΐΔ體 〇 如 果 捕 獲 部 分包含能夠 結 合 至 捕獲 配位 體之 捕獲 配 位 體 結 合部 分 則 本發明之套 組 或 檢 棒能 進一 步包含含有 捕 獲 配 位 體 之捕 獲 探針。 根 據 本 發 明 第三觀點， 其 提 供在檢 棒分析中 複數 的 不 同 偵 測 探 針 之 用 法，以測試 在 樣 品 溶液 中目 標核 酸之 存在 5 每 一 測 探 針 能 夠雜交至目 標 核 酸 之不 同區 域， 因此 巨 標 核 酸 被 捕 獲 部 分 (其固定於 檢 棒 -8- 上 且能 夠結 合捕 獲探 針 ) 捕 1286160 五、發明說明（7) 獲至檢棒上。 根據本發明之第三觀點，其亦提供一種套組以測試樣品 溶液中目標核酸之存在，其包含： i ) 一種檢棒，包括： 一種具有接觸端以接觸樣品試劑之層析片；及 一種固定於接觸端另一端之捕獲帶的捕獲部分； 1 1 )複數的捕獲探針，各捕獲探針能夠雜交至目標核酸之 不同區域，且當捕獲探針已雜交至目標核酸，各捕獲 探針能夠被捕獲部分結合；及可選擇地 i 1 i )偵測探針能夠雜交至目標核酸，因此使用偵測探針可 直接偵測目標核酸，偵測探針可釋放地固定於層析片 之探針帶，其位於接觸端與捕獲帶之間，或偵測探針 與檢棒分離。 根據本發明之第三觀點，其亦提供一種檢棒以測試樣品 溶液中目標核酸之存在，其包含： 一種具有接觸端以接觸樣品試劑之層析片； 一種固定於接觸端另一端之捕獲帶的捕獲部分； 可釋放地固定於層析片的探針帶之複數捕獲探針，其位 於接觸端與捕獲帶之間，各捕獲探針能夠雜交至目標核酸 之不同區域，且當捕獲探針已雜交至目標核酸，各捕獲探 針能夠被捕獲部分結合。· 本發明第三觀點之各捕獲探針能包含捕獲配位體，其能 被捕獲部分結合。 1286160 五、發明說明（8) 本發明第三觀點之各捕獲探針能包含複數捕獲配位體， 其能被捕獲部分結合。 ， 根據本發明第四觀點，其提供在檢棒分析中捕獲探針之 、用法，以測試在樣品溶液中目標核酸之存在，捕獲探針能 夠雜交至目標核酸，其中捕獲探針包含複數捕獲配位體， 其能被檢棒之捕獲配位體結合部分結合，因此可將目標核 酸捕獲至檢棒上。 根據本發明之第四觀點，其亦提供一種套組以測試樣品 溶液中目標核酸之存在，其包含： 1) 一種檢棒，包括： 一種具有接觸端以接觸樣品試劑之層析片；及 一種固定於接觸端另一端之捕獲帶的捕獲部分； i i ) 一種能夠雜交至目標核酸之捕獲探針，其中當捕獲探 針已雜交至目標核酸，捕獲探針偶聯至各自能被捕獲 部分結合之複數捕獲配位體；及可選擇地 i i 1 )偵測探針能夠雜交至目標核酸，因此使用偵測探針可 偵測目標核酸，偵測探針可釋放地固定於層析片之探 針帶，其位於接觸端與捕獲帶之間，或偵測探針與檢 棒分離。 根據本發明之第四觀點，其亦提供一種檢棒以測試樣品 溶液中目標核酸之存在，其包含： 一種具有接觸端以接觸樣品試劑之層析片； 一種固定於接觸端另一端之捕獲帶的捕獲部分； -10- 1286160 五、發明說明（9 ) 一種可釋放地固定於層析片的探針帶之捕獲探針，其位 於接觸端與捕獲帶之間，捕獲探針能夠雜交至目標核酸， 且當捕獲探針已雜交至目標核酸，其中當捕獲探針已雜交 至目標核酸，捕獲探針包含各自能被捕獲部分結合之複數 捕獲配位體。 本發明第四觀點之套組的偵測探針包含一種標示，其使 用偵測探針可直接偵測目標核酸，或包含一種偵測配位體 ’其使用偵測探針可間接偵測目標核酸。 包括含一或多個偵測配位體之本發明套組及檢棒能進一 步包含標示的偵測配位體結合部分，用以在檢棒之捕獲帶 偵測偵測探針結合至目標核酸。 標示以非放射性爲佳，合適的標示實例包括紡織染料、 如膠狀金之金屬膠質溶液，及如有色乳液粒子之有色粒子 。適合的配位體之例子包括生物素（例如藉由抗生物素抗 體’或藉由標示之抗生蛋白鏈菌素或含部分抗生物素蛋白 而可被偵測的）、螢光素（例如藉由標示之抗螢光素抗體 而可被偵測的）及2，4一二硝苯酚（DPN )(例如藉由抗 DPN抗體而可被偵測的）。 可了解本發明之套組能進一步包含樣品溶液中偵測目標 核酸所需之任何試劑。 適當地，本發明之套組及檢棒能用於下列檢棒分析之步 驟，以測試樣品溶液中目標核酸之存在： 1)提供一種檢棒，其包含具有接觸端之層析片及固定 -11- 1286160 五、發明說明（1〇) 於接觸端另一端之捕獲帶的捕獲探針，捕獲探針能夠雜交 至目標核酸。在偵測探針-雜交至目標核酸之條件下，偵測 探針（或複數之不同偵測探針）與樣品溶液接觸，樣品溶 液與檢棒之接觸端接觸，以引起樣品溶液藉由毛細作用移 至檢棒之捕獲帶，因此可使目標核酸及偵測探針（或探針 )隨著樣品溶液一起移至捕獲帶，而目標核酸於捕獲帶被 捕獲，偵測探針（或探針）隨後於捕獲帶偵測，存在於捕 獲帶之偵測探針（或探針）指示出目標核酸存在於樣品溶 液中。 在本分析之變化上，偵測探針（或探針）可釋放地固定 在檢棒之接觸端與捕獲帶之間，以代替與檢棒分離。當樣 品溶液與檢棒之接觸端接觸，以引起樣品溶液藉由毛細作 用移至捕獲帶，偵測探針（或探針）釋放入樣品溶液，以 便釋放的偵測探針（或探針）在樣品溶液移至捕獲帶時能 雜交至其中的目標核酸。 在本分析之進一步變化上，偵測探針（或探針）可與樣 口口丨合液分離’而與檢棒之接觸5而接觸，這通常進行於檢棒 之接觸端已與樣品溶液接觸後，偵測探針（或探針）能直 接地與捕獲帶接觸，或偵測探針（或探針）能於一種分離 探針溶液中’而與檢棒之接觸端接觸，引起樣品溶液藉由 毛細作用移至捕獲帶。 2)提供一種檢棒，其包含具有接觸端之層析片及固定 於接觸端另一端之捕獲帶的捕獲探針，捕獲部分能夠結合 -12- 1286160 五、發明說明（11) 至目標核酸。在捕獲探針（或探針）雜交至目標核酸之條 件下’捕獲探針（或複數之不同偵測探針）與樣品溶液接 觸’樣品溶液與檢棒之接觸端接觸，以引起樣品溶液藉由 毛細作用移至檢棒之捕獲帶，因此可使目標核酸及捕獲探 針（或探針）與樣品溶液一起移至捕獲帶，且目標核酸藉 由捕獲部分結合至捕獲探針於捕獲帶被捕獲，目標核酸隨 後於捕獲帶被偵測，目標核酸能使用如分析（丨）描述之 偵測探針（或探針）被偵測，偵測探針（或探針）能添加 於具有捕獲探針之樣品溶液，或與捕獲探針分離（於任何 順序下）。或者是偵測探針（或探針）可釋放地固定至檢 棒，其位於接觸端與捕獲帶之間，或如分析（1 )描述能 個別地與捕獲帶接觸。 在分析（2 )之變化上，以捕獲探針（或探針）代替與 樣品溶液混合，其可釋放地固定至檢棒，其位於接觸端與 捕獲帶之間。當檢棒之接觸端與樣品溶液接觸，以引起樣 品溶液藉由毛細作用移至捕獲帶，捕獲探針（或探針）釋 放入樣品溶液，以便釋放的捕獲探針（或探針）在樣品溶 液移至捕獲帶時能雜交至其中的目標核酸。目標核酸能使 用能與樣品溶液接觸之偵測探針（或探針）偵測，其可釋 放地固定至檢棒而位於接觸端與捕獲帶之間，或個1別地與 捕獲帶接觸。 在分析（2)之進一步變化上，捕獲探針（或探針）可 在樣品溶液藉由毛細作用達到捕獲帶前（或特別纟也於同日寺 -13- 1286160 五、發明說明（12) )與捕獲帶接觸，此將可使捕獲探針（或探針）於捕獲帶 被捕獲部分結合，以便目標核酸能被捕獲。捕獲探針（或 探針）能於一種分離的捕獲探針溶液中，其藉由直接施用 於捕獲帶或藉由捕獲探針溶液與檢棒之接觸端接觸而分別 地與捕獲帶接觸，以使捕獲探針（或探針）藉由毛細作用 移至捕獲帶’隨後地檢棒之接觸端與樣品溶液接觸將使目 標核酸藉由毛細作用移至捕獲帶。此外，目標核酸能使用 能與樣品溶液接觸之偵測探針（或探針）偵測，其可釋放 地固定至檢棒而位於接觸端與捕獲帶之間，或個別地與捕 獲帶接觸。當選擇性的使用偵測探針（或探針）於分析（ 2)中，目標核酸能於樣品中直接被標示，例如標示藉由 共價結合至目標核酸，此能藉由前驅物標示與樣品溶液接 觸’且在標示共價結合至目標核酸之條件下，培育樣品溶 液與前驅物標示。 分析（2)之捕獲部份可爲能夠雜交至捕獲探針之一般 捕獲探針，或捕獲部分能夠藉由非鹼基配對相互作用結合 至捕獲探針。例如當捕獲探針包含一或複數捕獲配位體， 則捕獲部分爲捕獲配位體結合部分。 當檢棒分析使用一種以上之能夠雜交至目標核酸的探針 ，則較佳的爲將所有探針添加至樣品溶液，且雜交完成於 單一步驟中。此種簡化的分析，使得它更容易且更快速的 施行。現已發現使用單一步驟雜交分析的目標核酸之偵測 敏感度，大致上相當於在多步驟所完成雜交之偵測敏感度 -14- 1286160 五、發明說明（13) 。多步驟雜交能藉由不同探針之連續雜交至樣品溶液中的 目標核酸而完成’或藉由檢棒與各含不同探針之不同溶液 接觸。一般來說，後面的多步驟雜交方法在檢棒接觸不同 探針溶液時將需要加以淸洗，雖然以多步驟雜交爲較佳的 情況，但評估上較簡單而快速的單一步驟雜交一般較佳。 其更佳的爲樣品溶液含有能夠在單一雜交步驟發生雜交 反應的合適組成物，及亦可使非鹼基配對相互作用發生（ 例如介於偵測配位體及偵測配位體結合部分之間，及介於 捕獲配位體及捕獲配位體結合部分之間），且藉由毛細作 用運送包含目標核酸及一或複數雜交探針與（選擇地）配 位體結合部分之複合物至檢棒上。使用某些樣品溶液，其 將可察知在樣品溶液直接接觸於檢棒之接觸端之前（不需 事前或事後稀釋樣品溶液），雜交反應能隨後發生於單一 步驟，且任何配位體-配位體結合部分交互作用能發生， 如果需要時，當樣品溶液遷移至捕獲帶，配位體-配位體 結合部分交互作用可附帶地或選擇地發生於檢棒上，簡單 而快速的目標核酸之檢棒偵測因而更容易。 本發明者已發現這些結果可伴隨含標準雜交緩衝液（如 SSPE緩衝液或三羥甲基氫基甲烷（Tims)緩衝液）與鹽、 淸潔劑及如BSA或粉狀乳之封阻蛋白的樣品溶液而完成， 使用此分析之偵測目標核酸的敏感度已發現較其他檢棒分 析大約相等或更好。 較佳的目標核酸之捕獲探針或偵測探針結合區域爲至少 1286160 五、發明說明（14) 相隔1 0個核苷酸以上。 根據本發明，其亦提供一種本發明之檢棒或套組之用法 ’用以測試樣品溶液中目標核酸之存在，較佳的目標核酸 爲砂眼衣原體核酸。 根據本發明，其亦提供一種能夠雜交至目標核酸之探針 ’以偵測或捕獲包含核酸或核酸類似物之目標核酸，其中 當探針已雜交至目標核酸時，核酸或核酸類似物偶聯至複 數標示，而可直接偵測目標核酸，或其中當探針已雜交至 目標核酸時，核酸偶聯至複數的配位體（能被配位體結合 部分結合以偵測或捕獲目標核酸）。 爲了連接配位體或標示至核酸或核酸類似物，有時候必 須使用調節物，其包含能夠與核酸或核酸類似物反應之第 一反應族群，及能夠與配位體或標示反應之第二反應族群 〇 例如第一反應族群可包含能夠與核酸或核酸類似物之羥 基反應之磷醯胺鹽。如果配位體或標示包含羧基，則第二 反應族群可包含第一胺族群。連結配位體或標示至核酸或 類似物之5，- 0H或3 ’ - 0H的適合調節物實例爲6 -(三氟乙 釀胺）己基-(2 -氰乙基）-(Ν’，N -—異丙基）-憐酸月女 鹽（C6 - TFA )。第五圖顯示一些其他調節物之化學結構’ 而可適合連接配位體或標示至核酸或類似物之內部0H -基 ，這些調節物進一步包含與磷酸基反應之第三反應族群（ 保護的0H基），因此藉由與磷醯胺鹽及保護的0H基反應 -16- 1286160 五、發明說明（15) 而使核苷酸連接在一起，第5圖顯示與生物素反應後之化 學結構。 ， 一旦調節物已經與核酸或核酸類似物及配位體或標示反 應，以連結核酸或核酸類似物至配位體或標示，則反應調 節物在此被稱爲”連接劑”。 對於複數標示或配位體的每一個標示或配位體，連接劑 可共價地偶聯標示或配位體至核酸或核酸類似物，因而形 成梳狀結構（詳見第4圖）。 複數標示或配位體能被分支連接劑共價地偶聯至核酸或 核酸類似物，因而形成叉狀構造（詳見第4圖）。 連接劑較佳的包含非核苷酸，以聚乙二醇較佳。 較佳的配位體或標示被間隔劑（spacer)偶聯至核酸或 核酸類似物，爲了連結配位體或標示至間隔劑，其有時必 須使用包含能與間隔劑反應之第一反應族群及能與配位體 或標示反應之第二反應族群的調節劑，合適的調節劑實例 爲 C6-TFA 。 一旦調節物已經與間隔劑及配位體或標示反應，以連結 間隔劑至配位體或標示，則反應調節物在此被稱爲”連接 劑”。 較佳的間隔劑包含核苷酸或磷酸六乙二醇。 較佳的標示爲非放射標示。 ·、. 本發明之具體例現以附隨圖示爲參考資料之實例敘述， 其中： -17- 1286160 五、發明說明（16) 第1圖說明樣品溶液中目標核酸岑在之測試方法； 第2圖槪要地說明實例1的實驗構成； ， 弟3圖槪要地說明貫例2的實驗構成； 第4圖槪要地顯示偵測探針偶聯至多偵測配位體之兩種 不同排列；及 第5圖槪要地顯示連接劑與偵測探針一同連結至生物素 偵測配位體之化學結構實例； 第6圖顯示在分析敏感度上探針標示之效果；及 第7圖顯示單一步驟雜交分析之結果。 下列實例關於砂眼衣原體（CT )隱性質體之DNA片段的 偵測，CT爲一種最常見的性別傳染性疾病之病因，CT傳 染病可引起不孕或當懷孕時導致自然流產、死產或產後子 宮內膜炎。在新生兒方面，CT傳染病可引起視盲及慢性呼 吸道疾病。大約10%感染之男性及高於70%感染之女性並 不表現出CT傳染病之症狀。因此，CT傳染病之正確診斷 非常重要，以便可開始疾病之早期治療。 在下列實例1及3至5中，使用檢棒1 〇測試在樣品溶 液1 4中偵測雙股CT目標核酸1 2，檢棒1 〇包含具有接觸 端1 8之硝化纖維帶1 6以接觸樣品溶液1 4，及固定於硝化 纖維帶16之捕獲帶22 (位於接觸端18之另一端）的捕獲 探針20，抗生物素抗體-染料結合劑24可分離地固定於硝 化纖維帶之接合帶26 (介於接觸端18及捕獲帶22之間） ，捕獲探針20能夠雜交至目標核酸1 2單股（第一股）之 -18- 1286160 五、發明說明（17 ) 弟一^序列。 各能雜交至雙股目標核酸1 2之第一股不同區域的偵測 探針2 8及幫手探針3 0之後添加至樣品溶液1 4，偵測探針 28包含偶聯至生物素的核酸（使用之方法爲熟悉技術者所 熟知）。包含偵測探針28及幫手探針30之樣品溶液14 加熱至足夠將雙股目標核酸1 2之互補股相互分離（其至 少分離第一股上偵測探針28及幫手探針30結合之區域） ’之後冷卻至偵測探針28及幫手探針30能夠雜交至雙股 目標核酸第一股，偵測探針及幫手探針雜交至第一股避免 了第一股再退火（re-annealing)至第一股，至少爲第一 股上偵測探針2 8及幫手探針3 0結合區域。 檢棒1 0之接觸端1 8隨後與樣品溶液1 4接觸，樣品溶 液1 4及任何被偵測探針28及幫手探針30雜交之目標核 酸1 2藉由毛細作用上升至檢棒1 〇，當樣品溶液1 4通過接 合帶26，其移動抗生物素抗體-染料結合劑24，釋放的抗 生物素抗體-染料結合劑24隨後能結合至生物素（其與目 標核酸1 2雜交的偵測探針28連結）。 在抗生物素抗體-染料結合劑24、偵測探針28、幫手探 針30及目標核酸12之間形成複合物，之後移至檢棒10 之捕獲帶22,複合物之目標核酸可雜交至固定的捕獲探針 20,幫手探針30被認爲使目標核酸容易雜交至檢棒上的 捕獲探針20。 捕獲探針20固定於捕獲帶22上，以此方式使其並不能 -19- 1286160 五、發明說明（1 8 ) 在樣品溶液1 4通過捕獲帶22時被移動。因此，結合至捕 獲探針之複合物遺留在捕獲帶，且可被捕獲帶，抗生物素 抗體-染料結合劑所存在之染劑偵測出。 如果樣品溶液中沒有CT目標核酸，則偵測探針28不能 在捕獲帶22上被捕獲，故無法在捕獲帶上見到染劑。如 果樣品溶液中有CT目標核酸，但沒有充足的目標核酸在 捕獲帶被捕獲，樣品溶液中存在之目標核酸將不會被偵測 到。 由以上描述之目標核酸之捕獲參照如直接探針捕獲。下 列實例2中，使用抗體捕獲技術，此技術中，抗體替代捕 獲探針而固定於檢棒之捕獲帶上，捕獲探針偶聯至能被抗 體結合之捕獲配位體（如生物素），且與幫手及偵測探針 一起添加至樣品溶液中。捕獲探針與幫手及偵測探針同時 雜交至目標核酸，偵測探針偶聯至染劑粒子。 捕獲、幫手及偵測探針已經雜交至目標核酸後，檢棒之 接觸端與樣品溶液接觸，包含目標核酸、捕獲探針、幫手 探針及偵測探針（藉由抗生物素抗體-染料結合劑）之複 合物隨後於捕獲帶被固定於捕獲帶之抗體捕獲，樣品溶液 中目標核酸之存在藉由捕獲帶中染劑粒子再被偵測出，因 此，捕獲探針雜交至目標與其說是發生於檢棒上，不如說 是在樣品溶液中。 已發現如果目標核酸上捕獲探針雜交區域與偵測探針雜 交區域之間隔小於26個核苷酸，則目標核酸偵測之敏感 -20- 1286160

五、發明說明（19) 度會降低，因此，較佳的是這些區域之間隔至少爲26個 核苷酸，且最好爲至少200個核苷酸。 _ 實例中所使用之探針選自下列探針序列： HP SEQ ID No 1: 5， GAT AAA ATC CCT TTA CCC ATG AAA HP SEQ ID No Γ: 55 CTT GCT GCA AAG ATA AAA TCC CTT HP SEQ ID No 2: 5’ TAA AAT GTC CTG ATT AGT GAA ATA AT HP SEQ ID No 3: 5’ TCG GTA TTT TTT TAT ATA AAC ATG AAA A HP SEQ ID No 4: 55 TGC AAG ATA TCG AGT ATG CGT TGT TA HP SEQ ID No 5: 5， AAA GGG AAA ACT CTT GCA GA HP SEQ ID No 6: 55 TCT TTT CTA AAG ACA AAA AAG ATC CTC GAT SEQ ID No 1: 59 TGC AAC TCT TGG TGG TAG ACT TTG C SEQ ID Nq 2: 5， GCG CAC AGA CGA TCT ATT TTT TGC A SEQ ID No 3: 5， CGG GCG ATT TGC CTT AAC CCC ACC A SEQ ID No 4: 55 CCA AGC TTA AGA CTT CAG AGG AGC G SEQ ID No 5: 5’ CAT GCG TTT CCA ATA GGA TTC TTG G SEQ ID No 6: 59 CAC AGT CAG AAA TTG GAG TGC TGG C SEQ ID No 15: 5, CTT GCT GCT CGA ACT TGT TTA GTA C SEQ ID No 16: 5’ AGA AGT CTT GGC AGA GGA AAC TTT T SEQ ID No 17: 5， CTA GAA TTA GAT TAT GAT TTA AAA GGG SEQ ID No 18: 5， TTC ATA TCC AAG GAC AAT AGA CCA A SEQ ID No 19: 5， TGA TCT ACA AGT ATG TTT GTT GAG T SEQ ID No 20: 59 TGC ATA ATA ACT TCG AAT AAG GAG AAG -21 - 1286160 五、發明說明（2〇) SEQ ID No 21: 5， TCC CTC GTG ΑΤΑ TAA CCT ATC CG SEQ ID No 22: 55 CAG GTT GTT AAC AGG ATA GCA CGC SEQ ID No 23: 5’ CTC GTT CCG AAA TAG AAA ATC GCA SEQ ID No 24: 59 GGT AAA GCT CTG ΑΤΑ TTT GAA GAC SEQ ID No 25: 55 CTG AGG CAG CTT GCT AAT TAT GAG T 下列實例中所述之生物素不能直接與偵測或捕獲探針反 應，以便生物素共價地偶聯至偵測或捕獲探針，連結至含 反應族群之連接劑的生物素與偵測或捕獲探針之核苷酸， 或與連結至偵測或捕獲探針之核苷酸的間隔劑一起反應。 使用 PerSeptive Biosystem Expedite 8909 合成器將連 接劑之反應族群與核苷酸或間隔劑一起反應。連接劑能爲 含有直線或分支構造之核苷酸或以非核苷酸形式較佳（第 5圖A及B)，更佳的連接劑包含聚乙二醇（第5圖C )。 實例1 實驗構成 實驗構成槪要地顯示於第2圖。 捕獲：使用被BSA固定於檢棒上之探針SeQ ID No 23 直接探針捕獲； 偵測形式：包含探針Seq ID No 21、22、24或25之一 或複數偵測探針，計1 〇 12個複製體，每一探針偶聯至生物 素，且被抗生物素抗體-染料結合劑偵測； 幫手探針：HP SEQ ID No 3 及 HP SEQ ID No 4 計 1〇12 個複製體； -22- 1286160 五、發明說明（21) 目標：872 bp雙股DNA計10lQ個複製體。 結果 1種偵測探針 Seq ID No 21 Seq ID No 22 Seq ID No 24 Seq ID No 25 信號 0 0 0.5 0.5 2種偵測探針 Seq ID No 21 及 22 Seq ID No 21 及 24 Seq ID No 21 及 25 Seq ID No 22 及 24 Seq ID No 22 及 25 Seq ID No 24 及 25 信號 3.0 3.0 3.0 3.0 2.5 3.5 3種偵測探針 Seq ID No 21， 22 及 24 信號 4.0 4種偵測探針 Seq ID No 21, 22, 24 及 25 信號 4.5 這些結果顯示增加偵測探針之數目可增加目標核酸之偵 測敏感度。 實例2 實驗構成_ 捕獲形式：抗體捕獲-抗生物素抗體固定於檢棒上，偶 聯至生物素之捕獲探針Seq ID Nos 21, 22，23，24及25 計1〇12個複製體； 偵測形式：偵測探針包含被BSA偶聯至染劑粒子的探針 -23- 1286160 五、發明說明（24 ) 數的生物素偵測配位體連結至偵測探針之單一位置，與（ 使用分離連接劑）各個複數的生物素偵測配位.體連結至偵 測探針之不同位置（參考這些不同形式分別地如’’梳狀’ ’ 或’’叉狀’’結構-詳見第4圖）相比較下，並無發現偵測敏 感度有顯著差異。然而，使用叉狀構造較不好，因爲連接 至複數偵測配位體的探針產率通常少於梳狀構造。 實例4 實驗構成 捕獲形式：直接探針捕獲（cp ) Seq ID No 18 (固定於 檢棒上）； 偵測探針：偵測探針包含偶聯至一或多生物素偵測配位 體的Seq ID No 21之探針，各生物素偵測配位體被六核 苷酸間隔劑偶聯至它的探針上，且使用1 0 12個偵測探針複 製體。偵測形式：抗生物素抗體-染料結合劑； 幫手探針：幫手探針HP SEQ ID No 5及HP SEQ ID No 6 (這些幫手探針雜交之目標核酸區域鄰接於被SeQ ID No 18 辨識出之區域）；HP SEQ ID No 1 及 HP SEQ ID No 2 ( 這些幫手探針雜交之目標核酸區域鄰接於被Seq ID No 21 辨識出之區域），計1 0 12個複製體。 目標 DNA : 87 2 bp ds DNA 片段或 10186 bp 質體 DNA。 -26- 1286160 五、發明說明（25) 結果^ 目標DNA之複製體數目 2χ101ϋ 5χ109 1 X B 0.0 0.0 2 X B 1.5 0.0 3 X B 2.0 0.5 4 X B 3.0 1.0 5 X B 3.5 1.5 6 X B 4.5 2.5 7 X B 4.5 2.5 8 X B 4.0+ 2.5 B =偶聯至連接劑之生物素 結論 這些結果顯示每個偵測探針增加生物素之數量可增進目 標核酸之偵測敏感度。每個偵測探針有三個以上生物素偵 測配位體與每個偵測探針有單一生物素偵測配位體相較下 ，可產生大於4次疊合（4 - f ο 1 d )放大之偵測信號。在此 實例使用之條件下，每個偵測探針有6及7生物素偵測配 位體可獲得最大信號放大作用。 實例5 :分析敏感度上探針標示之效果 實驗構成 捕獲形式：寡核苷酸探針捕獲 Seq : CGT CTG TTG TGT GAC TCT GG (固定於檢棒上）； -27- 1286160 五、發明說明（28) 由檢棒膜而自由移動。 元件符號對照表 10 檢棒 12 目標核酸 14 樣品溶液 16 硝化纖維帶 18 接觸端 20 捕獲探針 22 捕獲帶 24 抗生物素抗體-染料結合劑 26 接合帶 28 偵測探針 30 幫手探針 -30- 1286160 表：砂眼衣原體之單一步驟核酸檢棒分析偵測 N0 EB* 5X106 106 5X105 2.5X105 105 7.5X104 5X104 2.5X104 104 5X103 NC** 第一次信 號時間 2.20, 2.50, 3.30, 4.30， 5.35, 8.10， 8.45, 14.055 24， - - 10分鐘之 信號 4 3 2.5 2 1.5 1 1 0.5 0 0 0 20分鐘之 信號 5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.25 0 0 30份鐘之 信號 5 4.5 4.0 3,5 3,0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 0 1小時之 信號 5 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.0 0.5 0 0

*砂眼衣原體之原粒體數目 * * N C :負控制組

Claims (1)

1286160 十、申請專利範圍 趙謂·鲁i明示> -Γ V, ,： ； y 日修 或_式/:.厂 5 死明 t 、〜-〜/咋+钓蝴」〇 第901 1 6570號「檢棒分析之偵測信號及捕獲的改良」專 利案 ( 2006年3月修正） 1 · 一種測試樣品溶液中目標核酸存在之檢棒，其包含： 一種具有接觸端以接觸樣品溶液之層析片； 一種固定於遠離接觸端之捕獲帶的捕獲部分，該捕 獲部分能夠直接或間接結合至目標核酸；以及 (i ) 一種偵測探針可釋放地固定於層祈片接觸端與捕 獲帶之間的探針帶上，該偵測探針能夠雜交至目標 核酸，其中該偵測探針含有複數標示使能利用該偵 測探針直接偵測目標核酸，或其中該偵測探針含有 複數偵測配位體使能利用該偵測探針間接偵測目 標核酸；或 (i i )複數偵測探針可釋放地固定於層析片接觸端與捕 獲帶之間的探針帶上，各偵測探針能夠雜交至目標 核酸不同區域，藉此利用該偵測探針以偵測目標核 酸；或 (i i i )複數捕獲探針可釋放地固定於層析片接觸端與捕 獲帶之間的探針帶上，各捕獲探針能夠雜交至目標 核酸不同區域’且當捕獲探針已雜交至目標核酸時 ，各捕獲探針能夠被捕獲部分結合。 2 ·如申請專利範圍第1項之檢棒，其中（丨i )複數偵測探 針中各偵測探針含有一種標示，藉此利用該偵測探針 1286160 以直接偵測目標核酸，或其中各偵測探針含有一種偵 測配位體，藉此利用該偵測探針以間接偵測目標核酸 0 3 ·如申請專利範圍第2項之檢棒，其中各偵測探針含有 複數標示或複數偵測配位體。 4 .如申請專利範圍第1項之檢棒，其中（i i i )之各捕獲探 針含有能被捕獲部分結合之捕獲配位體，以結合捕獲 探針至捕獲部分。 5 ·如申請專利範圍第4項之檢棒，其中各捕獲探針含有 複數各自能被捕獲部分結合之捕獲配位體。 6 ·如申請專利範圍第1項之檢棒，其中捕獲部分含有能 夠雜交至目標核酸之捕獲探針，或雜交至已結合目標 核酸之吊鈎捕獲探針上。 7 _如申請專利範圍第1項之檢棒，其中捕獲部分含有捕 獲配位體結合部分，其能夠結合至捕獲探針之捕獲配 位體，捕獲探針能夠雜交至目標核酸，以至捕獲部分 能藉此間接結合至目標核酸。 8 ·如申請專利範圍第7項之檢棒，其進一步含有捕獲探 針。 9 ·如申請專利範圍第1、2或3項中任一項之檢棒，其中 各標示爲非放射性。 1 〇 ·如申請專利範圍第4或5項之檢棒，其中捕獲部分含 有抗體或抗體片段，其能夠結合至各捕獲配位體。 1 1 . 一種測試樣品溶液中目標核酸存在之套組，其包含： 1286160 一種具有接觸端以接觸樣品溶液之層析片； 一種固定於遠離接觸端之捕獲帶的捕獲部分，該捕 獲部分能夠直接或間接結合至目標核酸；以及 (1 ) 一種偵測探針能夠雜交至目標核酸，其中該偵測探 針含有複數標示使能利用該偵測探針直接偵測目標 核酸’或其中該偵測探針含有複數偵測配位體使能 利用該偵測探針間接偵測目標核酸；或 (i i )複數偵測探針，每一偵測探針能夠雜交至目標核 酸不同區域，藉此利用該偵測探針以偵測目標核酸 ;或 (i i i )複數捕獲探針，每一捕獲探針能夠雜交至目標核 酸不同區域，且當捕獲探針已雜交至目標核酸時， 各捕獲探針能夠被捕獲部分結合。 1 2 ·如申請專利範圍第1 1項之套組，其中（i i i )進一步含 有能夠雜交至目標核酸之偵測探針，藉此使用該偵測 探針以偵測目標核酸，該偵測探針可釋放地固定在位 於層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶，或該偵測探 針與檢棒分離。 i 3 .如申請專利範圍第11項之套組，其中複數偵測探針 中各偵測探針含有一種標示’藉此利用該偵測探針以 直接偵測目標核酸，或其中各偵測探針含有一種偵測 配位體，藉此利用該偵測探針以間接偵測目標核酸。 i 4 .如申請專利範圍第1 3項之套組’其中各偵測探針含 有複數標示或複數偵測配位體。 1286160 1 5 ·如申請專利範圍第π項之套組，其中（i i i )之各捕獲 探針含有能被捕獲部分結合之捕獲配位體，以結合捕 獲探針至捕獲部分。 1 6 ·如申請專利範圍第1 5項之套組，其中各捕獲探針含有 複數各自能被捕獲部分結合之捕獲配位體。 1 7 ·如申請專利範圍第1 2項之套組，其中偵測探針含有 一種標示，其能藉此利用該偵測探針直接偵測目標核 酸’或其中偵測探針含有一種偵測配位體，藉此利用 該偵測探針間接偵測目標核酸。 1 8 ·如申請專利範圍第丨7項之套組，其中偵測探針含有 複數標示或複數偵測配位體。 1 9 ·如申請專利範圍第丨2項之套組，其中偵測探針爲複 數偵測探針，各偵測探針能夠雜交至目標核酸之不同 區域’藉此利用該偵測探針以偵測后標核酸。 20 ·如申請專利範圍第1 9項之套組，其中各偵測探針含 有複數標示或複數偵測配位體。 21 .如申請專利範圍第1 1項之套組，其中捕獲部分含有 捕獲探針，其能夠雜交至目標核酸，或雜交至已結合 目標核酸之吊鈎捕獲探針上。 22. 如申請專利範圍第11項之套組，其中捕獲部分含有 捕獲配位體結合部分，其能夠結合至捕獲探針之捕獲 配位體，捕獲探針能夠雜交至目標核酸，以至捕獲部 分藉此間接結合至目標核酸。 23. 如申請專利範圍第22項之套組，其進一步含有捕獲 1286160 探針。 24 .如申請專利範圍第1 1、1 3、1 4、1 7、1 8或20項中任 一項之套組，其中各標示爲非放射性。 2 5 .如申請專利範圍第1 5或1 6項之套組，其中捕獲部分 含有抗體或抗體片段，其能夠結合至各捕獲配位體。 26 . —種測試樣品溶液中目標核酸存在之檢棒分析法，其包 含： 將樣品溶液與檢棒接觸以引起樣品溶液藉由毛細作 用移至檢棒之捕獲帶，因此可使樣品溶液中目標核酸於 捕獲帶中被捕獲；其特徵爲 (i )使用能夠雜交至目標核酸之偵測探針來偵測目標核 酸；當偵測探針已雜交至目標核酸時，含有複數標 示之偵測探針可直接偵測目標核酸；或當偵測探針 已雜交至目標核酸時，含有複數偵測配位體之偵測 探針可被偵測配位體結合部分結合，藉此間接偵測 目標核酸；或 (i i )使用複數的不同偵測探針偵測目標核酸，每一不 同偵測探針能夠雜交至目標核酸之不同區域，使能 利用該偵測探針偵測目標核酸；或 (i i i )使用複數的不同捕獲探針捕獲目標核酸，每一 不同捕獲探針能夠雜交至目標核酸之不同區域，藉 此使目標核酸被捕獲至檢棒之捕獲部分，而該捕獲 部分已固定於檢棒且能結合捕獲探針。 27.如申請專利範圍第26項之檢棒分析法，其包括將樣 1286160 品溶液與申請專利範圍第1至1 〇項中任一項之檢棒 接觸以引起樣品溶液藉由毛細作用移至檢棒之捕獲 帶，藉此使樣品溶液中目標核酸於捕獲帶中被捕獲及 偵測到。