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CN1452663A - 检棒分析中改良的检测信号及捕获 - Google Patents

检棒分析中改良的检测信号及捕获 Download PDF

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CN1452663A CN01815307A CN01815307A CN1452663A CN 1452663 A CN1452663 A CN 1452663A CN 01815307 A CN01815307 A CN 01815307A CN 01815307 A CN01815307 A CN 01815307A CN 1452663 A CN1452663 A CN 1452663A
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Abstract

本发明叙述改良的检棒分析以测试样品溶液中目标核酸的存在。且提供检棒，其包含接触端以接触样品试剂，及位于远离接触端的捕获带的捕获部分以捕获目标核酸。将样品溶液与接触端接触，使得样品溶液通过毛细作用移至捕获带，且以多种不同的标记的检测探针检测，这些探针各能够杂交目标核酸的不同区域，检测信号由此增强。在其它方法中，将多种不同的捕获探针添加入样品溶液中，然后于捕获带被捕获部分结合而间接捕获目标核酸。目标核酸的捕获由此而增强。亦述及实施这种方法的试剂盒及检棒。

Description

检棒分析中改良的检测信号及捕获
本发明涉及改良检棒(dipstick)核酸检测的灵敏度，本发明的检棒用以测试样品溶液中目标核酸的存在，例如鉴定病患是否感染致病微生物，如砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)。
用于检测样品溶液中目标核酸存在的一些常规测试依赖利用聚合酶链式连锁反应(PCR)扩增目标核酸。此反应可检测小量的目标核酸，然而得到结果前需耗时数小时，但因通常希望可尽快得到结果，例如使病人等待的时间减至最少，故此为其显著缺点。这种方法的进一步缺点是需要昂贵的专家设备进行反应以及相当高成本的试剂。
相反，检棒可检测未扩增的目标核酸，不需任何专家设备且能比基于PCR的方法更快速地得到结果。病人就可于同时接受治疗，故特别有益于不喜欢或不能日后复诊的病人。检棒分析的成本也显著低于PCR基础的测试。
US 5,310,650所述的典型常规检棒中，单链DNA捕获探针固定于硝化纤维素滤器上远离过滤器末端(接触端)的捕获区。捕获探针序列互补于欲测目标核酸第一区域的序列。标记的单链DNA检测探针固定于硝化纤维素滤器上捕获区及滤器接触端间的探针区。检测探针含有互补于目标核酸第二区域序列(不同于第一区域)的序列。
在认为含有目标DNA的样品溶液中检测目标DNA时，将硝化纤维素滤器的接触端接触样品溶液。样品溶液通过毛细作用进入滤纸并经过探针区及捕获区。当样品溶液经过探针区时，可使检测探针移动并使其与样品溶液一起朝向捕获区上升。然后移动的检测探针能杂交到样品溶液中存在的任何目标DNA的第二区域。
当杂交的检测探针及目标DNA到达捕获区时，目标DNA的第一区域能杂交到固定的捕获探针。由此在目标核酸、捕获探针及标记的检测探针之间形成三重复合物。捕获区出现标记时说明样品溶液中存在目标DNA。
至于第二类常规检棒，标记的DNA检测探针未固定于硝化纤维素滤器上，而是在允许检测探针杂交到样品溶液中任何目标核酸的条件下将检测探针加入到样品溶液中。然后将硝化纤维素滤器的接触端接触样品溶液且杂交检测探针的任何目标核酸在捕获区被捕获探针捕获。
然而，已发现常规检棒的核酸检测的灵敏度甚低，尤其当目标核酸为双链时。因此，在样品溶液中目标核酸的存在有时并不能被检测。认为环状双链目标核酸事实上并不能使用常规检棒测试检测，因此需要改进目标核酸的检棒检测灵敏度。
根据本发明的第一方面，其提供多种不同检测探针在检棒分析中的用途，以测试在样品溶液中目标核酸的存在，各检测探针能够杂交目标核酸的不同区域，由此允许利用检测探针检测目标核酸。
在此使用的术语“检棒分析”是指使用检棒的任何分析，其中样品溶液与检棒接触以使样品溶液通过毛细作用移至检棒的捕获带，由此允许样品溶液中的目标核酸于捕获带中被捕获并检测。
根据本发明的第一方面，其亦提供试剂盒以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包含：
i)检棒，其包括：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；及
捕获部分，固定于层析片上远离接触端的捕获带，该捕获部分能够直接或间接结合目标核酸，及
ii)多种检测探针，各检测探针能够杂交目标核酸的不同区域，并由此允许利用检测探针检测目标核酸。
根据本发明的第一方面，其亦提供检棒用以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包括：
层析片，其具有接触端以接触样品溶液；
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分，该捕获部分能够直接或间接地结合目标核酸；及
多种检测探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的探针带上，每一检测探针能够杂交目标核酸不同区域，由此允许利用检测探针检测目标核酸。
使用检测探针检测目标核酸，每一检测探针可包含标记，允许利用检测探针直接检测目标核酸，或每一检测探针可包含检测配体，允许利用检测探针间接检测目标核酸。每一检测探针可包含多种标记或多种检测配体。
如果检测探针包含检测配体，使用检测探针间接检测目标核酸可通过使用标记的检测配体结合部分而实现。在一些实施方案中，检测配体结合部分能被多重标记，例如多重标记的抗体能够结合检测配体。
在此使用的术语″层析片″是指通过毛细现象运送溶液的任何多孔带状物质。
本发明第一方面的检棒及试剂盒可用于检测目标核酸的方法中，其相似于上述那些常规检棒分析，在那些方法中，能够杂交目标核酸的捕获探针被固定于检棒的捕获带上。然而，通过一些其它的安排，目标核酸能被捕获至捕获带，而其亦在本发明的范围内。
固定于捕获带的捕获部分能够通过碱基配对或非碱基配对相互作用，直接或间接地结合目标核酸。
例如捕获部分可包含捕获探针，其能够直接杂交目标核酸或结合了目标核酸的吊钩捕获探针。该吊钩捕获探针包含可杂交目标核酸的第一区域，及可杂交捕获探针的第二区域。可添加吊钩捕获探针至样品溶液，而使其能够结合样品溶液中的目标核酸，且当样品溶液通过毛细作用上移至检棒时，其可被捕获探针捕获。
捕获部分或者可为捕获配体结合部分，其能够结合偶联了捕获探针(结合于目标核酸)的捕获配体，由此允许捕获部分间接结合目标核酸。例如捕获部分可为抗体或抗体片段。在此种安排下，可在样品溶液通过毛细作用迁移上检棒之前，添加捕获探针至样品溶液中，并使其杂交其中的目标核酸。
捕获探针、吊钩捕获探针及检测探针能各自含有至少一种核酸或核酸类似物。当探针含有多于一种核酸或核酸类似物，优选其杂交在一起。
根据本发明第二方面，其提供检测探针在检棒分析中的用途，以测试在样品溶液中目标核酸的存在，该检测探针能够杂交目标核酸。其中检测探针包含多种标记，当检测探针已杂交了目标核酸时可直接检测目标核酸，或其中检测探针包含多种检测配体，当检测探针已杂交了目标核酸时，其可被检测配体结合部分结合并由此允许间接检测目标核酸。
根据本发明的第二方面，其亦提供试剂盒以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包含：
i)检棒，其包括：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分，该捕获部分能够直接或间接结合目标核酸，及
ii)检测探针，其能够杂交目标核酸，其中检测探针包含多种标记，允许使用检测探针直接检测目标核酸，或检测探针包含多种检测配体，允许使用检测探针间接检测目标核酸。
根据本发明的第二方面，其亦提供检棒用以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包含：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分，该捕获部分能够直接或间接结合目标核酸，及
检测探针，其可释放地固定于层析片的接触端与捕获带之间，该检测探针能够杂交目标核酸，其中检测探针包含多种标记，允许使用检测探针直接检测目标核酸，或检测探针包含多种检测配体，允许使用检测探针间接检测目标核酸。
本发明第二方面的捕获部分能包含捕获探针，其能够直接地杂交目标核酸或已结合目标核酸的吊钩捕获探针，或者，该捕获部份可包含捕获配体结合部分，其能够结合已结合目标核酸的捕获探针的捕获配体。
如果捕获部分包含能够结合捕获配体的捕获配体结合部分，则本发明的试剂盒或检棒能进一步包含含有捕获配体的捕获探针。
根据本发明第三方面，其提供多种不同检测探针在检棒分析中的用途，以测试在样品溶液中目标核酸的存在，每一测探针能够杂交目标核酸的不同区域，由此目标核酸被固定于检棒上且能够结合捕获探针的捕获部分捕获至检棒上。
根据本发明的第三方面，其亦提供试剂盒以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包含：
i)检棒，包括：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；及
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分；
ii)多种捕获探针，各捕获探针能够杂交目标核酸的不同区域，且当捕获探针已杂交了目标核酸时，各捕获探针能够被捕获部分结合；及可选地
iii)检测探针，能够杂交目标核酸，并由此允许使用检测探针直接检测目标核酸，该检测探针可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的探针带，或检测探针与检棒相分离。
根据本发明的第三方面，其亦提供检棒以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包含：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分；
多种捕获探针，可释放地固定于层析片上接触端与捕获带之间的探针带，各捕获探针能够杂交目标核酸的不同区域，且当捕获探针已杂交了目标核酸时，各捕获探针能够被捕获部分结合。
本发明第三方面的各捕获探针能包含捕获配体，其能被捕获部分结合。
本发明第三方面的各捕获探针能包含多种捕获配体，其中每个能被捕获部分结合。
根据本发明第四方面，其提供捕获探针在检棒分析中的用途，以测试在样品溶液中目标核酸的存在，该捕获探针能够杂交目标核酸，其中捕获探针包含多种捕获配体，其能被检棒的捕获配体结合部分结合，由此允许将目标核酸捕获至检棒上。
根据本发明的第四方面，其亦提供试剂盒以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包含：
i)检棒，其包括：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；及
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分；
ii)捕获探针，其能够杂交目标核酸，其中捕获探针偶联多种捕获配体，后者当捕获探针已杂交了目标核酸时，各自能被捕获部分结合；及可选地
iii)检测探针，能够杂交目标核酸，并由此允许使用检测探针检测目标核酸，该检测探针可释放地固定于层析片上接触端与捕获带之间的探针带，或该检测探针与检棒相分离。
根据本发明的第四方面，其亦提供检棒以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包含：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分；
捕获探针，其可释放地固定于层析片上接触端与捕获带之间的探针带，捕获探针能够杂交目标核酸，其中捕获探针包含多种捕获配体，后者当捕获探针已杂交了目标核酸时，各自能被捕获部分结合。
本发明第四方面的试剂盒的检测探针包含标记，允许使用检测探针直接检测目标核酸，或包含检测配体，允许使用检测探针间接检测目标核酸。
包括含一或多个检测配体的本发明试剂盒及检棒能进一步包含已标记的检测配体结合部分，用以在检棒的捕获带上检测结合目标核酸的检测探针。
优选标记为非放射性，合适的标记例子包括纺织染料、如胶体金的金属溶胶，及如有色乳胶粒子的有色粒子。适合的配体的例子包括生物素(例如通过抗生物素抗体，或通过含标记的链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的部分而可被检测)、萤光素(例如通过标记的抗萤光素抗体而可被检测)及2，4-二硝苯酚(DNP)(例如通过抗DNP抗体而可被检测)。
须知，发明的试剂盒能进一步包含在样品溶液中检测目标核酸所需的任何试剂。
适当地，本发明的试剂盒及检棒能用于下列类型的检棒分析中，以测试样品溶液中目标核酸的存在：
1)提供检棒，其包含层析片，后者具有接触端及固定于远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获探针能够杂交目标核酸。在检测探针杂交目标核酸的条件下，将检测探针(或多种不同检测探针)与样品溶液接触。样品溶液与检棒的接触端接触，以使样品溶液通过毛细作用移至检棒的捕获带，由此允许目标核酸及检测探针(或探针)随着样品溶液一起移至捕获带，而目标核酸于捕获带被捕获。然后在捕获带检测检测探针(或探针)。检测探针(或探针)存在于捕获带指示目标核酸存在于样品溶液中。
在本分析的变化中，检测探针(或探针)可以可释放地固定在检棒的接触端与捕获带之间，而不与检棒相分离。当样品溶液与检棒的接触端接触，以使样品溶液通过毛细作用移至捕获带时，检测探针(或探针)被释放入样品溶液，而使释放的检测探针(或探针)在样品溶液移向捕获带时能杂交其中的目标核酸。
在本分析的进一步变化中，检测探针(或探针)可与样品溶液分离，并与检棒的接触端接触。这通常在检棒的接触端已与样品溶液接触后进行。检测探针(或探针)能直接地与捕获带接触，或检测探针(或探针)能于分离的探针溶液中与检棒的接触端接触而使探针溶液通过毛细作用移至捕获带。
2)提供检棒，其包含层析片，后者具有接触端及固定于远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获部分能够结合杂交了目标核酸的捕获探针。在捕获探针(或探针)杂交目标核酸的条件下，将捕获探针(或多种不同捕获探针)与样品溶液接触。样品溶液与检棒的接触端接触，以使样品溶液通过毛细作用移至检棒的捕获带，由此允许目标核酸及捕获探针(或探针)与样品溶液一起移至捕获带，且目标核酸通过捕获部分结合捕获探针而在捕获带被捕获。随后在捕获带检测目标核酸。可使用如分析(1)描述的检测探针(或探针)检测目标核酸。检测探针(或探针)可同捕获探针一起加于样品溶液，或与捕获探针分别加入(以任何顺序)。或者，检测探针(或探针)可释放地固定至检棒上接触端与捕获带之间，或如分析(1)所述可分别地与捕获带接触。
在分析(2)的变化中，捕获探针(或探针)不与样品溶液混合，而是可释放地固定至检棒的接触端与捕获带之间。当检棒的接触端与品溶液接触，以使样品溶液通过毛细作用移至捕获带时，将捕获探针(或探针)释放入样品溶液，而使释放的捕获探针(或探针)在样品溶液移向捕获带时能杂交其中的目标核酸。目标核酸可使用检测探针(或探针)检测，后者可与样品溶液接触，可以可释放地固定至检棒的接触端与捕获带之间，或分别地与捕获带接触。
在分析(2)的进一步变化中，捕获探针(或探针)可在样品溶液通过毛细作用达到捕获带之前(或特别地于同时)与捕获带接触。此将允许捕获探针(或探针)在捕获带被捕获部分结合，而使目标核酸能被捕获。捕获探针(或探针)可以是分离的捕获探针溶液，其可以通过直接应用于捕获带或通过捕获探针溶液与检棒的接触端接触并使捕获探针(或探针)通过毛细作用移至捕获带而分别地与捕获带接触。随后检棒的接触端与样品溶液接触而使目标核酸通过毛细作用移至捕获带。再次，能使用检测探针(或探针)检测目标核酸，后者可以与样品溶液接触，可以可释放地固定至检棒的接触端与捕获带之间，或者分别地与捕获带接触。作为检测探针(或探针)在分析(2)中的用途的另一种形式，目标核酸能于样品中直接被标记，例如通过共价附着标记于目标核酸。这可以通过将前体标记与样品溶液接触，并在前体标记共价附着目标核酸的条件下，孵育样品溶液与前体标记。
分析(2)的捕获部份可为能够杂交捕获探针的通用捕获探针，或捕获部分能够通过非碱基配对相互作用结合捕获探针。例如当捕获探针包含一或多种捕获配体时，则捕获部分为捕获配体结合部分。
当检棒分析使用一种以上的能够杂交目标核酸的探针时，则优选将所有探针添加至样品溶液，且杂交完成于单一步骤中。这样简化分析，且使得施行更容易且更快速。现已发现使用单一步骤杂交分析的目标核酸的检测灵敏度大致上相当于在多步骤中完成杂交的检测灵敏度。多步骤杂交可通过用不同探针相继对样品溶液中的目标核酸杂交而完成，或通过将检棒与各含不同探针的不同溶液接触而完成。一般来说，后一种多步骤杂交方法在检棒接触不同探针溶液之间将需要加以清洗。虽然有优选多步骤杂交的情况，但须知较简单而快速的单一步骤杂交通常优选。
更优选样品溶液含有合适的组成允许在单一杂交步骤发生杂交反应，并允许非碱基配对相互作用发生(例如于检测配体及检测配体结合部分之间，以及于捕获配体及捕获配体结合部分之间)，且允许通过毛细作用运送包含目标核酸及一或多种杂交的探针及(可选地)配体结合部分的复合物至检棒上。使用这种样品溶液，须知在样品溶液直接接触检棒的接触端之前(不需事前稀释或改变样品溶液)，杂交反应能发生于单一步骤，且任何配体-配体结合部分交互作用可以发生。当样品溶液向捕获带迁移时，如需要则任何配体-配体结合部分交互作用可附带地或另外地发生于检棒上。由此利于简单而快速的目标核酸的检棒检测。
本发明者已发现这些结果以含具有盐、去污剂及如BSA或奶粉的封阻蛋白的标准杂交缓冲液(如SSPE缓冲液或Tris缓冲液)的样品溶液而完成。已发现使用这种分析的目标核酸的检测灵敏度同其它检棒分析大约相等或更好。
优选目标核酸上捕获探针和检测探针的结合区域相隔至少10个核苷酸。
根据本发明，其亦提供本发明的检棒或试剂盒的用途，用以测试样品溶液中目标核酸的存在，优选目标核酸为砂眼衣原体核酸。
根据本发明，其亦提供探针以检测或捕获目标核酸，其包含能够杂交目标核酸的核酸或核酸类似物，其中核酸或核酸类似物偶联多种标记，而允许当探针已杂交了目标核酸时直接检测目标核酸，或其中核酸偶联多种配体，当探针已杂交了目标核酸时，其能被配体结合部分结合以检测或捕获目标核酸。
为了连接配体或标记至核酸或核酸类似物，有时候必须使用修饰物(modifier)，其包含能够与核酸或核酸类似物反应的第一反应基团，及能够与配体或标记反应的第二反应基团。
例如第一反应基团可包含能够与核酸或核酸类似物的羟基反应的亚磷酰胺。如果配体或标记包含羧基，则第二反应基团可包含伯胺基。连结配体或标记至核酸或类似物的5’-OH或3’-OH的适合修饰物例子为6-(三氟乙酰氨基)己基-(2-氰乙基)-(N’，N-二异丙基)-亚磷酰胺(C6-TFA)。图5显示一些其它适合连接配体或标记至核酸或类似物的内部OH-基的修饰物的化学结构，这些修饰物进一步包含与磷酸基反应的第三反应基团(被保护的OH基)，由此通过亚磷酰胺与被保护的OH基反应而使核苷酸连接在一起，图5显示与生物素反应后的化学结构。
一旦修饰物已经与核酸或核酸类似物及配体或标记反应而连结核酸或核酸类似物至配体或标记，则反应修饰物在此被称为”连接子”。
对于多种标记或配体中的每一种标记或配体，连接子可共价地偶联标记或配体至核酸或核酸类似物，因而形成梳状结构(见图4)。
多种标记或配体能被分支的连接子共价地偶联于核酸或核酸类似物，因而形成叉状构造(见图4)。
连接子优选包含非核苷酸，优选聚乙二醇。
优选配体或标记由间隔臂(spacer)偶联于核酸或核酸类似物。为了连结配体或标记至间隔臂，有时必须使用修饰物(modifier)，其包含能与间隔臂反应的第一反应基团及能与配体或标记反应的第二反应基团，合适的调节剂例子为C6-TFA。
一旦修饰物已经与间隔臂及配体或标记反应而连结间隔臂至配体或标记，则反应修饰物在此被称为”连接子”。
优选的间隔臂包含核苷酸或六乙二醇磷酸。
优选标记为非放射标记。
本发明的实施方案现参考附图以实施例叙述，其中：
图1说明测试样品溶液中目标核酸存在的方法；
图2概要地说明实施例1的实验构成；
图3概要地说明实施例2的实验构成；
图4概要显示偶联多检测配体的检测探针的两种不同安排；及
图5显示用以与检测探针反应的连接生物素检测配体的连接子实例的化学结构；
图6显示探针标记对分析灵敏度的影响；及
图7显示单一步骤杂交分析的结果。
下列实施例涉及砂眼衣原体(CT)隐性质粒的DNA片段的检测，CT为最常见的性传染性疾病的病因，CT传染病可引起不孕或当怀孕时形成自然流产、死产或产后子宫内膜炎。在新生儿方面，CT传染病可引起视盲及慢性呼吸道疾病。大约10％感染的男性及高于70％感染的女性并不表现CT感染的症状。由此，CT感染的正确诊断非常重要，以便可开始疾病的早期治疗。
在下列实施例1及3至5中，使用检棒10在样品溶液14中检测双链CT目标核酸12。检棒10包含具有接触端18以接触样品溶液14的硝化纤维片16，及固定于硝化纤维片16的捕获带22(位于远离接触端18的另一端)的捕获探针20。抗生物素抗体-染料缀合物24可释放地固定于硝化纤维片的缀合带26(介于接触端18及捕获带22之间)，捕获探针20能够杂交目标核酸12单链(第一链)的第一序列。
各能杂交双链目标核酸12的第一链不同区域的检测探针28及帮手探针30随后添加至样品溶液14中。检测探针28包含偶联生物素的核酸(使用的方法为本领域技术人员所熟知)。包含检测探针28及帮手探针30的样品溶液14加热至足够将双链目标核酸12的互补链相互分离，至少分离第一链上检测探针28及帮手探针30结合的区域，之后冷却而允许检测探针28及帮手探针30能够杂交双链目标核酸第一链，检测探针及帮手探针杂交第一链避免第二链再退火(re-annealing)至第一链，至少在第一链上检测探针28及帮手探针30结合的区域中。
检棒10的接触端18随后与样品溶液14接触，样品溶液14及任何被检测探针28及帮手探针30杂交的目标核酸12通过毛细作用上升至检棒10，当样品溶液14通过缀合带26时，其带动抗生物素抗体-染料缀合物24，释放的抗生物素抗体-染料缀合物24随后能结合检测探针28的生物素，该检测探针28与目标核酸12杂交。
在抗生物素抗体-染料缀合剂24、检测探针28、帮手探针30及目标核酸12之间形成复合物随后移至检棒10的捕获带22，在那里复合物的目标核酸可杂交固定的捕获探针20。认为帮手探针30使目标核酸容易杂交检棒上的捕获探针20。
捕获探针20固定于捕获带22上，其方式使其并不能在样品溶液14通过捕获带22时被带动。由此，结合捕获探针的复合物遗留在捕获带，且可被捕获带中抗生物素抗体-染料缀合物中所存在的染料检测出。
如果样品溶液中没有CT目标核酸，则检测探针28不能在捕获带22上被捕获，故无法在捕获带上见到染料。如果样品溶液中有CT目标核酸，但没有充足的目标核酸在捕获带被捕获，则样品溶液中存在的目标核酸将不会被检测到。
上述对目标核酸的捕获称作直接探针捕获。下列实施例2中，使用抗体捕获技术。在此技术中，抗体替代捕获探针而固定于检棒的捕获带上。捕获探针偶联能被抗体结合的捕获配体(如生物素)，且与帮手及检测探针一起添加至样品溶液中。捕获探针与帮手及检测探针同时杂交目标核酸。检测探针偶联染料粒子。
在捕获、帮手及检测探针已经杂交目标核酸后，检棒的接触端与样品溶液接触。包含目标核酸、捕获探针、帮手探针及检测探针的复合物随后于捕获带被固定于捕获带的抗体捕获。样品溶液中目标核酸的存在通过捕获带中出现染料粒子被检测出。由此，捕获探针杂交目标不在检棒上，而在样品溶液中。
已发现如果目标核酸上捕获探针杂交区域与检测探针杂交区域之间隔小于26个核苷酸，则目标核酸检测的灵敏度会降低。由此，优选这些区域之间隔至少为26个核苷酸，且最好为至少200个核苷酸。
实施例中所使用的探针选自下列探针序列：
HP SEQ ID No 1： 5′GAT AAA ATC CCT TTA CCC ATG AAA
HP SEQ ID No 1′：5′CTT GCT GCA AAG ATA AAA TCC CTT
HP SEQ ID No 2：5′TAA AAT GTC CTG ATT AGT GAA ATA AT
HP SEQ ID No 3：5′TCG GTA TTT TTT TAT ATA AAC ATG AAA A
HP SEQ ID No 4：5′TGC AAG ATA TCG AGT ATG CGT TGT TA
HP SEQ ID No 5：5′AAA GGG AAA ACT CTT GCA GA
HP SEQ ID No 6：5′TCT TTT CTA AAG ACA AAA AAG ATC CTC GAT
SEQ ID No 1：5′TGC AAC TCT TGG TGG TAG ACT TTG C
SEQ ID No 2：5′GCG CAC AGA CGA TCT ATT TTT TGC A
SEQ ID No 3：5′CGG GCG ATT TGC CTT AAC CCC ACC A
SEQ ID No 4：5′CCA AGC TTA AGA CTT CAG AGG AGC G
SEQ ID No 5：5′CAT GCG TTT CCA ATA GGA TTC TTG G
SEQ ID No 6：5′CAC AGT CAG AAA TTG GAG TGC TGG C
SEQ ID No 15：5′CTT GCT GCT CGA ACT TGT TTA GTA C
SEQ ID No 16：5′AGA AGT CTT GGC AGA GGA AAC TTT T
SEQ ID No 17：5′CTA GAA TTA GAT TAT GAT TTA AAA GGG
SEQ ID No 18：5′TTC ATA TCC AAG GAC AATAGA CCA A
SEQ ID No 19：5′TGA TCT ACA AGT ATG TTT GTT GAG T
SEQ ID No 20：5′TGC ATA ATA ACT TCG AAT AAG GAG AAG
SEQ ID No 21：5′TCC CTC GTG ATA TAA CCT ATC CG
SEQ ID No 22：5′CAG GTT GTT AAC AGG ATA GCA CGC
SEQ ID No 23：5′CTC GTT CCG AAA TAG AAA ATC GCA
SEQ ID No 24：5′GGT AAA GCT CTG ATA TTT GAA GAC
SEQ ID No 25：5′CTG AGG CAG CTT GCT AAT TAT GAG T
生物素不能直接与检测或捕获探针反应。在下列实施例中要使生物素共价地偶联检测或捕获探针，连结含反应基团的连接子的生物素与检测或捕获探针的核苷酸，或与连结检测或捕获探针的间隔臂的核苷酸一起反应。使用PerSeptive Biosystem Expedite 8909合成器将连接子的反应基团与核苷酸或间隔臂反应。连接子可为直线型或分支结构的核苷酸或优选非核苷酸形式(图5A及B)。更优选连接子包含聚乙二醇(图5C)。
实施例1
实验构成
实验构成概要地显示于图2。
捕获形式：使用由BSA固定于检棒上的探针Seq ID No 23的直接探针捕获；
检测形式：包含探针Seq ID No 21、22、24或25的一或多种检测探针，以1012拷贝，每一探针偶联生物素，且被抗生物素抗体-染料缀合物检测；
帮手探针：HP SEQ ID No 3及HP SEQ ID No 4，1012拷贝；
目标：872bp双链DNA，以1010拷贝。
结果
    1检测 Seq ID No 21 Seq ID No 22 Seq ID No 24  Seq ID No 25
    信号     0     0     0.5     0.5
2检测 Seq IDNo 21及22  Seq IDNo 21及24  Seq IDNo 21及25  Seq IDNo 22及24  Seq IDNo 22及25  Seq IDNo 24及25
  信号 3.0  3.0  3.0  3.0  2.5  3.5
    3检测     Seq ID No 21，22及24
    信号             4.0
    4检测     Seq ID No 21，22，24及25
    信号            4.5
这些结果显示增加检测探针的数目可增加目标核酸的检测灵敏度。
实施例2
实验构成
捕获形式：抗体捕获-抗生物素抗体固定于检棒上。偶联生物素的捕获探针Seq ID Nos 21，22，23，24，及25以1012拷贝；
检测形式：检测探针包含由BSA偶联染料粒子的探针Seq ID No18；
帮手探针：HP SEQ ID No 5及HP SEQ ID No 6，这些帮手探针杂交目标核酸的区域邻接于Seq ID No 18辨识区域；
目标：872bp ds DNA，以1011至108拷贝。
结果
捕获探针 Seq IDNo 21  Seq IDNo 22  Seq IDNo 23  Seq IDNo 24  Seq IDNo 25 全部
信号   1     0     1     1     1  5
(目标，以1011拷贝)
这些结果显示使用多种检测探针可增强目标核酸检测的灵敏度。
实施例3
实验构成
捕获形式：直接探针捕获(cp)，使用固定于检棒上Seq ID No22或Seq ID No 23；
检测探针：连结于包含反应基(亚磷酰胺)的连接子的生物素检测配体，与偶联于检测探针(dp)Seq ID No 21的间隔臂，或分别与各自偶联于检测探针(dp)Seq ID No 21不同部位的二个间隔臂反应。使用不同长度及形式的间隔臂。检测探针以1012拷贝存在。
检测形式：抗生物素抗体-染料缀合物；
帮手探针：HP SEQ ID No 2及HP SEQ ID No 3(这些帮手探针杂交目标核酸的区域邻于Seq ID No 21辨识区域)或HP SEQ ID No3及HP SEQ ID No 4(这些帮手探针杂交目标核酸的区域邻接于SeqID No 23辨识区域)，以1012拷贝。
目标DNA：416bp ds DNA片段。
结果
    捕获探针     Seq ID No 22     Seq ID No 23
    目标DNA拷贝     1010     109     1010     109
    dp-N6-B5’     4.0     0.0     3.0     0.0
    dp-N6-B-N3-B5’     4.0     1.5     4.0     1.5
    dp-N6-B-N6-B5’     4.5     2.0     4.5     2.0
    dp-N6-B-SN3 SN3-B5’     4.5     2.0     4.0     2.0
    BN6-dp-N6B5’     4.0     1.0     3.0     0.5
B＝偶联了连接子的生物素
N＝核苷酸间隔臂(数字指示核苷酸单体的数目)
S＝六乙二醇磷酸间隔臂
结论
这些结果显示当使用不同长度及形式的间隔臂时，检测信号的强度有轻微的差异，但这些差异并不足以显著地改变检测的灵敏度。
其它实验显示，比较使用多种分支连接子将多种生物素检测配体连结至检测探针的单一位置，与使用分离的连接子将各个生物素检测配体连结至检测探针的不同位置(这些不同类型分别称为“梳状”或“叉状”结构-见图4)，并未发现检测灵敏度有显著差异。然而，使用叉状结构较不优选，因为连接多种检测配体的探针产率通常少于具有梳状结构的。
实施例4
实验构成
捕获形式：直接探针捕获(cp)固定于检棒上的Seq ID No 18；
检测探针：检测探针包含偶联一或多个生物素检测配体的Seq IDNo 21的探针。各生物素检测配体由六核苷酸间隔臂偶联于其探针，且使用1012拷贝检测探针。检测形式：抗生物素抗体-染料缀合物；
帮手探针：HP SEQ ID No 5及HP SEQ ID No 6(这些帮手探针杂交目标核酸的区域邻接于Seq ID No 18辨识区域)；HP SEQ IDNo1及HP SEQ ID No 2(这些帮手探针杂交目标核酸的区域邻接于Seq ID No 21辨识区域)，以1012拷贝。
目标DNA：872bp ds DNA片段或10186bp质粒DNA。
结果
    目标DNA拷贝     2×1010     5×109
    1×B     0.0     0.0
    2×B     1.5     0.0
    3×B     2.0     0.5
    4×B     3.0     1.0
    5×B     3.5     1.5
    6×B     4.5     2.5
    7×B     4.5     2.5
    8×B     4.0+     2.5
B＝偶联了连接子的生物素
结论
这些结果显示增加每个检测探针的生物素检测配体的数量可增加目标核酸的检测灵敏度。比较每个检测探针有三个以上生物素检测配体与每个检测探针有单一生物素检测配体，前者产生放大大于4倍(4-fold)的检测信号。在此实施例使用的条件下，每个检测探针有6及7个生物素检测配体时可获得最大的信号放大作用。
实施例5：探针标记对分析灵敏度的影响
实验构成
捕获形式：寡核苷酸探针捕获Seq：CGT CTG TTG TGT GAC TCTGG固定于检棒膜上；
检测探针：一或多个生物素标记的检测探针Seq：CTC AAT AAAGCT TGC CTT GA；
检测形式：抗生物素抗体-胶体金缀合物；
目标核酸：RNA扩增子，120nt，通过对HIV阳性样品的NASBA扩增反应合成。一次扩增反应获得约1011拷贝RNA目标分子。
结果：见图6
结论多生物素标记的检测探针获得分析灵敏度大于两个数量级的改进。
实施例6
砂眼衣原体的单一步骤核酸检棒分析检测
实验构成
试剂：
捕获形式：由BSA载体固定于检棒膜上的寡核苷酸探针捕获；
检测形式：多生物素标记的检测探针；抗生物素抗体-胶体金缀合物；
样品制备：于PBS缓冲液中制备砂眼衣原体(Ct)原粒体细胞的浓度为106拷贝/μl至103拷贝/μl，且于100℃加热20分钟；
杂交/检棒工作缓冲液：标准杂交缓冲液含盐、去污剂及如BSA或奶粉的封阻蛋白。
方法：
检测探针、帮手探针及5×106至103拷贝的EB稀释于杂交缓冲液并配制成80μl，且于100℃加热7分钟。之后混合物短暂离心以收集所有液体，且与20μl抗生物素抗体-胶体金混合，整个100μl混合物吸至检棒上，使其显示出信号。
结果及讨论
结果示于下表且图7显示约104拷贝的Ct EB可以在少于一小时内(包含制备步骤)以单一步骤核酸检棒分析检测。
虽然此检棒检测分析具有大约相当于夹心式杂交分析(sandwichhybridisaion assays)的检测灵敏度，但其具有快速及简单性的主要优点。
例如公布于PCT WO93/1322的夹心式杂交分析检测Ct为复杂的多成分微滴定板式分析，其不能于5小时内完成，这种分析为多步骤分析，需要以确定的顺序渐次加入其成分并孵育，且于添加每一新成分后须要清洗步骤。
本发明的核酸检棒分析主题可于单一步骤内完成，且不需要不同步骤以添加成分及清洗。此夹心式杂交分析并不需要多于一种的溶液条件以使其有利于杂交及其它亲合配对形式，相同的溶液条件也能十分适合于各成分经由检棒膜而自由移动。
图例说明
图2
210-捕获探针
240-帮手探针
250-检棒膜
260-抗-生物素抗体/染料缀合物
图3
310-偶连生物素的捕获探针
320-检测探针-染料缀合物
330-827bp dsDNA目标
340-帮手探针
350-固定于检棒膜的抗生物素抗体
图4
A)梳子样类型
B)叉子样类型
实圈＝检测配体
Br＝产生分支的单体
图6
探针标记对灵敏度的影响
图7
砂眼衣原体的单一步骤核酸检棒分析检测
数字指示砂眼衣原体原粒体的数量
*NC：负对照
图8
砂眼衣原体的单一步骤核酸检棒分析检测

Claims (47)

1.测试样品溶液中目标核酸存在的试剂盒，其包含：
i)检棒，其包括：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分；
ii)多种捕获探针，各捕获探针能够杂交目标核酸的不同区域，且当捕获探针已杂交了目标核酸时，各捕获探针能够被捕获部分结合；及可选地
iii)检测探针，能够杂交目标核酸，并由此允许使用检测探针检测目标核酸，该检测探针可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的探针带，或者，该检测探针与检棒相分离。
2.测试样品溶液中目标核酸存在的检棒，其包括：
层析片，其具有接触端以接触样品溶液；
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分；及
多种捕获探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的探针带上，每种捕获针能够杂交目标核酸不同区域，且当捕获探针已杂交了目标核酸时，各捕获探针能够被捕获部分结合。
3.根据权利要求第1项的试剂盒或根据权利要求第2项的检棒，其中各捕获探针包含能被捕获部分结合的捕获配体，以结合捕获探针至捕获部分。
4.根据权利要求第3项的试剂盒或检棒，其中各捕获探针包含多种各自能被捕获部分结合的捕获配体。
5.根据权利要求第1至4项中任一项的试剂盒或检棒，其中检测探针包含标记，允许利用检测探针直接检测目标核酸，或其中检测探针包含检测配体，允许利用检测探针间接检测目标核酸。
6.根据权利要求第5项的试剂盒或检棒，其中检测探针包含多种标记或多种检测配体。
7.根据权利要求第1至4项中任一项的试剂盒或检棒，其中检测探针为多种检测探针，各检测探针能够杂交目标核酸的不同区域，由此允许利用检测探针检测目标核酸。
8.根据权利要求第7项的试剂盒或检棒，其中各检测探针包含多种标记或多种检测配体。
9.测试样品溶液中目标核酸存在的试剂盒，其包含：
i)检棒，其包括：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；及
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分；
ii)捕获探针，其能够杂交目标核酸，其中捕获探针包含多种捕获配体，当捕获探针已杂交了目标核酸时，各捕获配体能够被捕获部分结合；及可选地
iii)检测探针，其能够杂交目标核酸，并由此允许利用检测探针检测目标核酸，该检测探针可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的探针带，或者该检测探针与检棒相分离。
10.测试样品溶液中目标核酸存在的检棒，其包含：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分；及
捕获探针，其可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的探针带，该捕获探针能够杂交目标核酸，其中捕获探针包含多种配体，当捕获探针已杂交了目标核酸时，各捕获配体能够被捕获部分结合。
11.根据权利要求第9项的试剂盒或根据权利要求第10项的检棒，其中检测探针包含标记，允许利用检测探针直接检测目标核酸，或其中检测探针包含检测配体，允许利用检测探针间接检测目标核酸。
12.根据权利要求第11项的试剂盒或检棒，其中检测探针包含多种标记或检测配体。
13.根据权利要求第9项的试剂盒或根据权利要求第10项的检棒，其中检测探针为多种检测探针，各检测探针能够杂交目标核酸的不同区域，并由此允许利用检测探针检测目标核酸。
14.根据权利要求第13项的试剂盒或检棒，其中各检测探针包含多种标记或检测配体。
15.测试样品溶液中目标核酸存在的试剂盒，其包含：
i)检棒，其包括：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；及
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分，该捕获部分能够直接或间接结合目标核酸，及
ii)多种捕获探针，各捕获探针能够杂交目标核酸的不同区域，由此允许利用检测探针检测目标核酸。
16.测试样品溶液中目标核酸存在的检棒，其包含：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分，该捕获部分能够直接或间接结合目标核酸；及
可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的探针带的多种检测探针，各检测探针能够杂交目标核酸的不同区域，由此允许利用检测探针检测目标核酸。
17.根据权利要求第15项的试剂盒或根据权利要求第16项的检棒，其中各检测探针包含标记，允许利用检测探针直接检测目标核酸，或其中各检测探针包含检测配体，允许利用检测探针间接检测目标核酸。
18.根据权利要求第17项的试剂盒或检棒，其中各检测探针包含多种标记或多种检测配体。
19.测试样品溶液中目标核酸存在的试剂盒，其包含：
i)检棒，其包括：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；及
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分，该捕获部分能够直接或间接结合目标核酸，及
ii)能够杂交目标核酸的检测探针，其中检测探针包含多种标记，允许利用检测探针直接检测目标核酸，或其中检测探针包含多种检测配体，允许利用检测探针间接检测目标核酸。
20.测试样品溶液中目标核酸存在的检棒，其包含：
层析片，其具有接触端以接触样品试剂；
固定于远离接触端的捕获带的捕获部分，该捕获部分能够直接或间接结合目标核酸；及
可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的探针带的检测探针，该检测探针能够杂交目标核酸，其中检测探针包含多种标记，允许利用检测探针直接检测目标核酸，或其中检测探针包含多种检测配体，允许利用检测探针间接检测目标核酸。
21.根据前述权利要求中任一项的试剂盒或检棒，其中捕获部分包含捕获探针，其能够杂交目标核酸，或杂交结合目标核酸的吊钩捕获探针。
22.根据权利要求第15至20项中任一项的试剂盒或检棒，其中捕获部分包含捕获配体结合部分，其能够结合捕获探针的捕获配体，该捕获探针能够杂交目标核酸，而使捕获部分由此能间接结合目标核酸。
23.根据权利要求第22项的试剂盒或检棒，其进一步包含捕获探针。
24.根据权利要求第5、6、8、11、12、14或17至20项中任一项的试剂盒或检棒，其中各标记为非放射性。
25.根据权利要求第3、4、9、10或22项中任一项的试剂盒或检棒，其中捕获部分包含抗体或抗体片段，其能够结合各捕获配体。
26.根据前述权利要求中任一项的检棒的用途，为测试样品溶液中目标核酸的存在。
27.根据权利要求第26项的用途，其中目标核酸为砂眼衣原体核酸。
28.检测或捕获目标核酸的探针，其包含能够杂交目标核酸的核酸或核酸类似物，其中核酸或核酸类似物偶联多种标记，当探针已杂交了目标核酸时，允许直接检测目标核酸，或者其中核酸偶联多种配体，当探针已杂交了目标核酸时，其能被配体结合部分结合而检测或捕获目标核酸。
29.根据权利要求第28项的探针，其中对于多种标记或配体中的每一个标记或配体，连接子(如在此定义)共价地偶联该标记或配体至核酸或核酸类似物。
30.根据权利要求第28项的探针，其中多种标记或配体被分支连接子(如在此定义)共价地偶联于核酸或核酸类似物。
31.根据权利要求第29或30项的探针，其中该或各连接子包含非核苷酸，优选聚乙二醇。
32.根据权利要求第29至31项中任一项的探针，其中该或各连接子由间隔臂共价地偶联于核酸或核酸类似物。
33.根据权利要求第32项的探针，其中间隔臂包含核苷酸或六乙二醇磷酸。
34.根据权利要求第28至33项中任一项的探针，其中标记为非放射性。
35.根据权利要求第28至34项中任一项的探针在检棒分析中的用途，测试样品溶液中目标核酸的存在。
36.多种不同捕获探针在检棒分析中的用途，以测试样品溶液中目标核酸的存在，各捕获探针能够杂交目标核酸的不同区域，由此允许固定于检棒上且能够结合捕获探针的捕获部分将目标核酸捕获至检棒上。
37.多种不同检测探针在检棒分析中的用途，以测试样品溶液中目标核酸的存在，各检测探针能够杂交目标核酸的不同区域，由此允许使用检测探针检测目标核酸。
38.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
提供权利要求第15项所详述的检棒；
将样品溶液与多种检测探针接触，各检测探针能够杂交目标核酸的不同区域，由此允许使用检测探针直接或间接地检测目标核酸，在检测探针杂交目标核酸的条件下，将检测探针与样品溶液孵育；
将检棒的接触端与样品溶液接触，使得样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此允许目标核酸与检测探针与样品溶液一起移至捕获带，且目标核酸于捕获带被捕获；及
检测捕获带上的检测探针。
39.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
提供权利要求第16至20项所详述的检棒；
将检棒的接触端与样品溶液接触，使得样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此允许样品溶液中的目标核酸于捕获带被捕获，且释放各检测探针至样品溶液，以使各检测探针能够杂交目标核酸；及
检测捕获带上的各检测探针。
40.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
提供权利要求第19项所详述的检棒；
将样品溶液与能够杂交目标核酸的检测探针接触，其中检测探针包含多种标记，允许利用检测探针直接检测目标核酸，或其中检测探针包含多种检测配体，允许利用检测探针间接检测目标核酸，在检测探针杂交目标核酸的条件下，将检测探针与样品溶液孵育；
将检棒的接触端与样品溶液接触，使得样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此允许目标核酸与检测探针与样品溶液一起移至捕获带，且目标核酸于捕获带被捕获；及
检测捕获带上的检测探针。
41.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品试剂，及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获部分，该捕获部分能够直接或间接结合目标核酸；
b)将层析片的接触端与样品溶液接触，使得样品溶液通过毛细作用移至捕获带，而使样品溶液中的目标核酸于捕获带被捕获部分捕获；
c)两者之一：(i)将捕获带与多种检测探针接触，各检测探针能够杂交目标核酸的不同区域，并由此允许使用检测探针检测目标核酸；或(ii)将捕获带与能够杂交目标核酸的检测探针接触，并由此允许使用检测探针检测目标核酸，其中检测探针包含多种标记，允许利用检测探针直接检测目标核酸，或其中检测探针包含多种检测配体，允许利用检测探针间接检测目标核酸；
d)从层析片的捕获带上去除未结合的检测探针；及
e)检测捕获带上各检测探针的存在。
42.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
提供层析片，其具有接触端的以接触样品试剂，及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获部分；
样品溶液与多种检测探针接触，各检测探针能够杂交目标核酸的不同区域，且当捕获探针已杂交于目标核酸，各检测探针能够被捕获部分结合；
将样品溶液与层析片的接触端接触，使得样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此允许包含目标核酸及捕获探针的复合物通过捕获部分结合捕获探针而于捕获带被捕获；及
检测捕获带上检测探针的存在。
43.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
提供层析片，其具有接触端以接触样品试剂，及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获部分；
将样品溶液与能够杂交目标核酸的捕获探针接触，其中捕获探针包含多种捕获配体，当捕获探针已杂交了目标核酸时，各捕获配体能够被捕获部分结合；
将样品溶液与层析片的接触端接触，使得样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此允许包含目标核酸及捕获探针的复合物通过捕获部分结合捕获探针而于捕获带被捕获；及
检测捕获带上检测探针的存在。
44.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
提供层析片，其具有接触端以接触样品试剂；及固定于层析片上远离接触端的的捕获带的捕获部分；及可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的多种捕获探针，每种捕获探针能够杂交目标核酸的不同区域，且当捕获探针已杂交了目标核酸时，各捕获探针能够被捕获部分结合；
将样品溶液与层析片的接触端接触，使得样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此从层析片上释放捕获探针，而使当样品溶液向捕获带移动时，其可杂交样品溶液中的目标核酸，并允许包含目标核酸及捕获探针的复合物通过捕获部分与捕获探针的结合而在捕获带被捕获；及
检测捕获带上目标核酸的存在。
45.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
提供层析片，其具有接触端以接触样品试剂；及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获部分；及捕获探针，能够杂交目标核酸，该捕获探针可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间，其中捕获探针包含多种捕获配体，当捕获探针已杂交了目标核酸时，各捕获配体能够被捕获部分结合；
将样品溶液与层析片的接触端接触，使得样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此从层析片上释放捕获探针，而使当样品溶液向捕获带移动时，其可杂交样品溶液中的目标核酸，并允许包含目标核酸及捕获探针的复合物通过捕获部分与捕获探针结合而在捕获带被捕获；及
检测捕获带上目标核酸的存在。
46.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
提供检棒，其包含具有接触端的层析片以接触样品试剂，及固定于层析片上远离接触端的的捕获带的捕获部分；
提供多种捕获探针，每种捕获探针能够结合捕获部分，且能杂交目标核酸的不同区域；
将多种捕获探针结合在捕获部分；
将样品溶液与层析片的接触端接触，使得样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此允许样品溶液中的目标核酸通过目标核酸与多种捕获探针的结合而在捕获带被捕获；且
检测捕获带上目标核酸的存在。
47.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
提供检棒，其包含的层析片具有接触端以接触样品试剂，及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获部分；
提供多种捕获探针，每种捕获探针能够结合捕获部分，且能杂交目标核酸的不同区域；
将多种捕获探针结合至捕获部分；
将样品溶液与层析片的接触端接触，使得样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此允许样品溶液中的目标核通过目标核酸与多种捕获探针的结合而在捕获带被捕获；及
检测捕获带上目标核酸的存在。
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