TWI285111B - VP1 of foot-and-mouth disease virus - Google Patents

Description

1285111 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】

本發明係關於使用純化之VP1多胜肽來保護動物免受口蹄疫 病毒之感染。 【先前技術】 口蹄疫（foot-and mouth disease，FMD)持續地對國内外的家畜 造成威脅，其病原為口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus， FMDV)。口蹄疫病毒屬於微小核糖核酸病毒科（picornaviridae) 中的Aphthovirus屬，其病毒顆粒的二十面體蛋白殼(capsid)係由 VP1、VP2、VP3及VP4四種蛋白質的60個重複片段組成，其内 含有單股RNA基因組；顆粒的外殼係由三種較大的結構蛋白 VP 1、VP2及VP3構成，較小的VP4蛋白位於内部（Acharya et al· (1989) Nature 337(6209) : 709-716)。 【發明内容】 本發明係關於使用純化之VP1多胜版(polypeptide)來保護動 物免受口蹄疫病毒之感染。 在一方面，本發明係關於一種包含一個或多個口蹄疫病毒之 VP1蛋白質單體的純化水溶性多胜肽；其中前述VP1蛋白質包含 SEQ ID NO:2或6之胺基酸序列。，，純化，，多胜肽係指該多胜肽中 不含其他生物巨分子且乾重純度至少達65%(換句話說，純度為 65%至100%之間的任何比例）。多胜肽的純度可藉由任何適當的 標準方法量測，例如，管柱色層分析、聚丙醯胺電泳或HPLC分 析。VP1蛋白質可為天然產生、重組或合成之多胜肽。可維持野 生型（wild-type)VPl蛋白質生物活性的野生型VP1蛋白質變異體 (例如，野生型VP1蛋白質片段)也包含在本發明的範圍中。本發 明多胜肽的一個實施態樣係為包含兩個VP1蛋白質單體的多胜 1285111 肽，亦即VP1蛋白質雙體。前述單體可教·達詰—「有如—，’驀百曼疏 鍵連結單體。 在另一方面，本發明係關於一種包含兩個或多個口蹄疫病毒 之VP1蛋白質單體的純化非水溶性多胜肽。前述單體可被連結， 例如，藉由雙硫鍵連結單體。 本發明之多胜肽可用於生產抗體、檢測病毒感染及製造疫 苗。本發明之疫苗包含一藥物學上可接受之載體及一有效量之本 發明多胜狀。 本發明進一步係關於一種製造水溶性多胜肽的方法。該方法 包含：解開（unfold)非水溶性多胜狀’其中前述非水溶性多胜肽 包含一個或多個口蹄疫病毒之VP1蛋白質單體；及重新摺疊 (refold)該多胜肽。其中前述VP1蛋白質單體包含SEQ ID N0: 2 或6之胺基酸序列。例如’非水溶性多胜狀可藉由溶解在包含尿 素的溶液中解開。解開的多胜肽可被重新摺疊’例如’加入十二 烷硫磺酸鈉（SDS)再進行膠體過濾管柱色層分析，可使多胜肽重 新摺疊。 本發明亦關於一種製造多胜肽的方法。該方法包含··在細胞 中表現包含兩個或多個口蹄疫病毒VP1蛋白質單體之非水溶性 多胜肽，及從細胞中收集該多胜肽。為了幫助收集多胜肽，該多 胜肽可被溶解於包含尿素的溶液中。其中前述VP1蛋白質單體包 含SEQ ID NO·· 2或6之胺基酸序列。 此外，本發明係關於一種誘發對象免疫反應的組合物，該組 合物包含有效量之本發明多胜肽。前述方法對於製造VP1抗體及 保護對象免受口蹄疫病毒感染相當有用。 “有效篁”係指可產生預期結果之本發明多胜狀劑量，例如， 該劑量可使對象產生抗體或保護目標對象免受口蹄疫病毒感染。 本發明之貫施方法及貫施態樣係進一步詳細描述於下文

1285111 中。本發明之其他特徵、目的及優點皆可由實施方式及申請專利 範圍中了解。 【實施方式】 本發明係根據一項不在預期中的發現：水溶性VPi可藉由 解開及重新摺疊該蛋白質而獲得。另一項也不在預期中的發 現：雙體VP1在維持其抗原性的情況下，具有優於單體VP1的 熱穩定性。無論是單體或雙體，分離之VP1都具有引發VP1中 和抗體及保護動物免MFMDV感染的能力。 因此，本發明係關於一種包含一個或多個口蹄疫病毒之 VP1蛋白質單體的純化水溶性多胜肽。該多胜肽係可根據下列 實施例所述之方法，或任何本技術領域已知可達相同目的之方 法而製備。 例如’將VP1基因複製至載體上並使其在細胞中表現。當 使用大腸桿菌（E.coli)細胞時，表現出來的VP1蛋白質如同内含 體（inclusion body)。非水溶性VP1蛋白質可溶於包含8M尿素 的緩衝溶液中，為了製備水溶性VP1蛋白質，溶解的蛋白質可 在8M尿素存在下藉由色層分析純化，解開的蛋白質可在sds 存在下藉由通過膠體過濾管柱重新摺疊。非水溶性VP1可被包 覆後使用’例如，包覆在微球中。多聚體VP1可藉由分離天然 產生的多聚體或藉由連結VP1單體(例如，使用氧化劑連結）而 製備。 本發明之多胜肽可用於產生抗VP1抗體。VP1抗體依序可 用於診斷口蹄疫及評估任何治療方式對口蹄疫的醫學治療療 效，例如，可藉由檢測對象檢體中存在的口蹄疫病毒來診斷或 評估。 製造單株抗體、多株抗體及其片段的方法已是本技術領域 1285111 蟲 :τ·,· ....... ί 「^πγτγ .….....j 年只 π；·|^:ϋ^ν：；:ίχ 的習知技術，例如可參考，Harlow and ilaffHXTWS)，Xniito&ies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York。特別是，不同的宿主動物可藉由注射包含本發明多胜肽 之組合物而免疫；宿主動物可包含兔子、小鼠、天竺鼠、豬及 大鼠。依宿主種類的不同，可使用不同的佐劑來增進免疫反應， 前述佐藥包含，但不限於，弗氏佐劑（完全及不完全）；礦物膠， 例如氫氧化紹；表面活性物質如溶血卵填脂（lysolecithin)、 Pluronic多元醇、聚陰離子(polyanion)、胜肽、乳化油、無脊椎 動物血氰蛋白（keyhole limpet hemocyanin)及雙氮苯盼 (dinitrophenol) 〇 抗體包含多株抗體、單株抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab 片段、F(ab’)2片段及使用Fab表現庫產生的分子。 單株抗體係為對抗某一特殊抗原之同種抗體群，可藉由前 述多胜肽及標準融合瘤技術製備。這些抗體可為任何種類之免 疫蛋白球，包含IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其次型。產生單 株抗體的融合瘤可在體内或體外培養，融合瘤具有在體外產生 高濃度抗體的能力，是一種相當好的生產單株抗體的方法。 此外，也可使用產生嵌合抗體的技術，係藉由連結一種具 適當抗原特異性動物之抗體分子基因與另一具適當生物活性動 物之抗體分子基因來獲得嵌合抗體。嵌合抗體係為一不同部分 來自不同動物種類的分子，例如，嵌合抗體的可變區來自一種 動物，且其免疫蛋白球固定區域來自另一種動物。 或者，產生單鏈抗體的技術可用來生產抗VP1單鏈抗體。 單鏈抗體的形成係經由胺基酸架橋連結Fv區域的重鏈及輕鏈 片段，進而產生單鏈多胜肽。 具有辨識並與特殊抗原決定基（epitope)結合能力的抗體片 段可由已知的技術產生。例如’這些片段包含，但不限於，可 1285111 y.:: ' v.._, ‘ .. 乂丨r..· i：t ：- ；. ： 藉由胃蛋白酶(pepsin)消化抗體分子產生的F(ab，)2片段，及可藉 由減少F(ab’)2之雙硫架橋產生之Fab片段。 本發明之多胜肽亦可用於製造保護動物免受口蹄疫感染之 疫苗。這些疫苗，例如，可依據下列實施例所述之方法或任何 本技術領域已知可達相同目的之方法製備。 本發明之疫苗包含有效量之本發明多胜肽及藥物學上可接 受之載體，例如磷酸緩衝溶液或碳酸溶液。載體的選擇係根據 提供的模式、路徑及標準藥物學方法為基礎。適當的藥物載體、 稀釋劑和使用時藥物學上的必需物質皆描述在Remington，s Pharmaceutical Sciences中。如果有必要，佐劑亦可包含在本發 明之疫苗中；前述佐劑例如為··霍亂毒素、不耐熱之大腸桿菌 腸毒素(LT)、脂質體、免疫刺激複合物（ISCOM)、或免疫刺激序 列寡去氧核苷酸(ISS-ODN)。 易受口蹄疫病毒感染的對象可被辨識並提供本發明之疫 苗。疫苗的劑量係依據，例如，提供的多胜肽類別、是否同時 提供佐劑、佐劑的種類、提供的模式及頻率，該劑量係可由熟 習本技術領域人士決定。若有必要，可重複提供本發明之疫苗， 提供疫苗的次數可由熟習本技術領域人士決定，例如，可以提 供一次起始劑量（priming dose)的免疫注射並於之後隔週提供三 次加強劑量（booster dose)的追加注射；追加注射可在第一次免 疫注射後4至8週進行，第二次追加注射可在8至12週時進行， 皆使用相同的配方；可從對象取得血清或T細胞來測試vpi蛋 白質疫苗或口蹄疫病毒引起的免疫反應。檢測抗體的、細胞毒 性T細胞（cytocoxic T-cell)對抗VP 1蛋白質或口蹄疫病毒感染 的方法都是本技術領域的已知方法。必要時亦可額外給予追加 注射。藉由改變多胜肽含量、疫苗的劑量及提供的頻率，可使 免疫反應流程最佳化，進而引起最大的免疫反應。 1285111

在大量提供本發明之疫苗前，必須進行毒性及功效測試。 在一功效測試的例子中，受測對象可經由口服或非經腸方式供 給本發明之疫苗，在初始接種或選擇性追加接種後，實驗組對 象及接受偽疫苗之控制組對象皆接受L〇95劑量之口蹄疫病毒 測試，實驗除了以死亡為終點之外，也可以其他事件為終點。 如果接受疫苗的實驗組對象死亡率低於接受偽疫苗的控制組對 象，即表示本發明疫苗具有功效。死亡率的差異必須具有統計 學上的顯著差異。 下述實施例僅為本發明之部分實施態樣，並非用於限定本 發明所揭露之其他内容。無需進一步詳細闡述，任何熟悉本技 術領域之人士即可根據本說明書揭露之内容利用本發明，並達 到其最大效用。本說明書中所引述的公開資料皆已參考其全文 方式併入本發明中。 材料及方法 在大腸桿菌中表現VP1 藉由 PCR 放大質體 pIBSYl-VPl(shieh et al. (2001) vaccine 19(28-29): 4002-4010)中的 VP1 基因，引子為 5，-GTGATGCTCGAGCAGAAGCTGTTTTGCGGGT-3，（SEQ ID NO: 4 )及 5，-CCGGGATCCACCACCTCTGCGGGTGACT-3’ (SEQ ID NO: 5)，其分別引入N端之BamH I位置及C端之 Xho I位置。為了便利純化及檢測大腸桿菌衍生之重組 VPl(rVPl)，分別在VP1基因的N端及C端貼上T7標籤及His 標籤。在限制酶反應後，放大的基因被插入 pET24a(+)(Novagene，WI)的 BamH I 及 Xho I 位置之間，然後轉 型至NovaBlue勝任細胞中。經確認的正向克隆在AB1 377於 自動定序儀中以桑格氏定序法（Sanger dideoxy method，Sanger 1285111 96. 6· U+ j]曉：.:

et al· (1997) Proc· Natl· Acad· Sci· USA 74(12): 5463-5467)定

序。從正向克隆中分離出來的質體PVP1/Q15被用來轉型至大 腸桿菌BL21(DE3)勝任細胞中。細菌在37°C培養搖晃槽中培 養至0D6G()量測細胞密度達0.6 ;然後加入最終濃度ImM之異 丙基一D-硫乳吡喃糖（IPTG)來誘導表現，並在收集前讓細胞另 外成長3小時。PVP1/Q15中的VP1核酸序列及其互補序列（SEQ ID NO: 1及3)及胺基酸序列（SEQ ID NO: 2)係如下所示：

CCACCACCTC GGTGGTGGAG T T S AACTACGGTG TTGATGCCAC Y G G GTTCATATTG CAAGTATAAC 工 L TGTTGGACCT ACAACCTGGA L D L CGAACGGCCA GCTTGCCGGT TAT GGGCGATCTC CCCGCTAGAG D L ACACTACCAA TGTGATGGTT T T N CTGCCTTACA GACGGAATGT P Y T CAGTAAGTAC GTCATTCATG K Y TGTTAGCTCA ACAATCGAGT L A Q GCCATCAAGG 17 34 50 67 84 100 117 134 150

1 ATGGCTAGCA TGACTGGTGG ACAGCAAATG GGTCGCGGAT TACCGATCGT ACTGACCACC TGTCGTTTAC CCAGCGCCTA MAS Μ T G G QQMG R G S

51 TGCGGGTGAG TCTGCGGACC CCGTGACTGC CACCGTCGAG ACGCCCACTC AGACGCCTGG GGCACTGACG GTGGCAGCTC AGE S A D P V T A T V E N

101 GTGAGACACA AGTCCAGAGG CGCCAGCACA CGGACAGTGC CACTCTGTGT TCAGGTCTCC GCGGTCGTGT GCCTGTCACG ETQ V Q R R QHTD S A F

151GACAGGTTCG TGAAAGTCAA GCCAAAGGAA CAAGTTAATG CTGTCCAAGC ACTTTCAGTT CGGTTTCCTT GTTCAATTAC DRFVKVKPKEQVNV 201 GATGCAGATC CCTGCCCACA CCTTGGTAGG GGCGCTCCTG CTACGTCTAG GGACGGGTGT GGAACCATCC CCGCGAGGAC M Q 工 PAHTLVGALLR 251CCTACTACTT CTCTGACCTG GAGCTGGCCG TCAAGCACGA GGATGATGAA GAGACTGGAC CTCGACCGGC AGTTCGTGCT Y Y F S DL E LAVK HE G

301ACCTGGGTCC CAAACGGCGC CCCTGAGACA GCACTGGACA TGGACCCAGG GTTTGCCGCG GGGACTCTGT CGTGACCTGT TW VPNGAPETALDN 351CCCAACAGCT TACCACAAGG AACCCCTCAC ACGGCTGGCG GGGTTGTCGA ATGGTGTTCC TTGGGGAGTG TGCCGACCGC PTAYHKEPLTRLAL 401CGGCTCCACA CCGTGTCTTA GCGACCGTCT ACAACGGGAG GCCGAGGTGT GGCACAGAAT CGCTGGCAGA TGTTGCCCTC A P H R V L A TVYN GSS

451GGTGACACCA GCACTAACAA CGTGAGAGGT GACCTTCAAG CCACTGTGGT CGTGATTGTT GCACTCTCCA CTGGAAGTTC GDT S T N N VRGD LQV 501 GAAGGCAGAA AGAACTCTGC CTACCTCCTT CAACTTCGGT 11 167 1285111 CTTCCGTCTT TCTTGAGACG GATGGAGGAA GTTGAAGCCA CGGTAGTTCC ^… KAE R TL P TSFN FGA IKA184 551CAACTCGTGT TACTGAACTA CTCTACAGAA TGAAGAGAGC CGAGACATAC GTTGAGCACA ATGACTTGAT GAGATGTCTT ACTTCTCTCG GCTCTGTATG TRVTELLYRMKRAE T Y 200 601TGTCCCAGGC CCCTTCTCGC CATTCAACCG AGTGACGCTA GACACAAGCA ACAGGGTCCG GGGAAGAGCG GTAAGTTGGC TCACTGCGAT CTGTGTTCGT CPRPLLAIQPSDAR Η K Q 217 651GAGGATTGTG GCACCCGCAA AACAGCTTCT GCTCGAGCAC CACCACCACC CTCCTAACAC CGTGGGCGTT TTGTCGAAGA CGAGCTCGTG GTGGTGGTGG RIVAPAKQLLLEHH HHH 234

701 ACCAC TGGTG

H 重新摺疊及純化裎庠 重新懸浮細菌細胞，並在TEN緩衝液中以微喷均質機 (Μ-110Y cell Disruption)打破細胞以獲得重組VP 1，細胞與TEN 緩衝液（50mM，ρΗ8·0，ImM EDTA，0·1Μ NaCl)的比例約 1:30(w/v)。離心細胞溶胞產物，以含〇·5%去氧膽酸(deoxycholate) 之TEN緩衝液清洗碎片三次，之後再以TEN缓衝液清洗三次。 在新鮮的結合緩衝液(20mM Tris-HCl，pH 7.9, 0.5MNaCl，8M 尿 素）中重新懸浮碎片，使蛋白質溶於其中；然後將該溶液加入金 屬螯合親和管柱中（5χ7·6 cm，Chelating Sepharose Fast Flow， Amersham Pharmacia Biotech)。再以兩倍體積之結合緩衝液沖 洗後，以0-0.2M之喃嗤（imidaole)梯度溶液沖提蛋白質，收集 包含rVPl蛋白質的溶離份，然後加入最終濃度1%之SDS。接 著將蛋白質溶液加入Superdex 200管柱(2·6 X 85cm)中，該管 柱預先以包含 25mMTris-HCn，pH8.0, ImMEDTA，O.lMNaCl 及0.05%SDS(TENS)之緩衝液平衡。以SDS-PAGE及辨識並收 集包含rVPl蛋白質的溶離份，然後將收集部分通過可移除清潔 劑之管柱(Extracti-GelR，Pierce，IL)，並根據製造商的建議移除 12 1285111 〔- 86,rn； SDS。 合成胜肽 使用ABI胜肽合成儀及Fmoc化學反應來合成多胜肽P-29 (NGSSKYGDTSTNNVRGDLQVLAQKAERTL) ( SEQ ID NO： 6)，P-29是典型的口蹄疫病毒O/Taiwan/97品種的VP1蛋白質 135-159胺基酸殘基。使用質譜儀及胺基酸組成分析儀來辨識胺 基酸序列。

ELISA 使用ELISA量測抗體的滴定量及抗原性，量測方法係如先 前文獻所述（Shieh et al· (2001) Vaccine 19(28-29) : 4002-4010)， 並作必要之微幅變動。簡言之，在合成鍵結於平盤上的抗原-抗體複合物之後，以包含0.1% Tween-20(PBST)之磷酸緩衝溶 液(PBS)清洗平盤三次，然後加入適當濃度的生物素化第二抗體 (biotinylated secondary antibody)，在 37〇C 反應 1 小時。接著， 清洗平盤並加入鏈狀抗生物素-過氧化氫酶 (streptavidin-peroxidase，稀釋比例 1 : 3000)，在室溫下培養 1 小時。清洗平盤，然後加入酵素基質3,3,5,5，-四甲基聯苯胺 (Sigma)，在室溫反應10分鐘。最後，加入等體積的in H2S04 來停止反應’並以ELISA讀取機測量45Onm的吸收值。 IYP1的S-羧甲基化 在lmg/ml的rVPl溶液(TENS緩衝液）中加入DTT，調整 濃度至10mM，並使該反應在室溫下進行4小時。接著，在每 一毫升的蛋白質溶液中加入20//1新鮮的iM硤乙酸(iodoacetic acid)，該混合物置於暗處30分鐘。加入iM DTT至溶液的最終 13 1285111 —ir[rr 年 J.1 Rf?- 濃度為40mM DTT ’藉此停止反應。在室溫下以TEN1S緩衝液 透析該蛋白質溶液，TENS緩衝液需置換2次，然後將該蛋白 質溶液保存於4°C下。 檢測溫度對rVP 1抗原返^影響 藉由ELISA來判別溫度對Γγρ 1的影響。簡言之，使ryp 1 分別在39、48、57、66及75°C下加熱30分鐘，然後在4°c下 冷卻並放置隔夜；分別將前述rVPl加入表面披覆老鼠抗 His-Tag免疫球蛋白的微量滴定盤中，37°C培養1小時；鍵結 在平盤上的rVPl以ELISA方法偵測，使用豬抗rVPl免疫球蛋 白作為一抗，及生物素化羊抗豬免疫球蛋白作為二抗。相對抗 原活性係定義為··加熱變性抗原之吸收值除以未變性之抗原吸 收值。 檢測中和抗體 檢測方法係如先前文獻所述（Shieh et al. (2001) V^eeine 19(28-29): 4002-4010)。簡言之，從測試動物取得之血清在56 。(：反應30分鐘以去除活性；將血清樣本或對照組血清（5〇μ1)加 入96孔組織培養盤每一列的末端，然後沿著平盤以兩倍序列稀 釋血清。在每一孔中加入50μ1的lOOTCID^病毒懸浮液，震動 混合1分鐘。在37°C、5% C〇2的環境下培養9〇分鐘後，在每 一孔中加入1〇〇 # 1 BHK-21細胞懸浮液（1〇6細胞/毫升），細胞 係懸浮於含8%胎牛血清的Eagle s MEN培養液中。在37°c、 含5% C〇2飽和水蒸氣下培養48小時後決定滴定量，並以 滴定終點時，血清/病毒混合物中血清的最終稀釋濃度來表示。 使用不成對T測試法來分析抗體滴定量是否具有顯著差異。 1285111 τ細胞增生檢測 〜‘ —

為了判斷注射rVPl是否刺激Τ細胞反應，故進行Τ細胞 增生檢測。懸浮於對照組緩衝液之T細胞及豬的rVPl-免疫組 係分別以 1.077g/ml Ficoll-Plaque PLUS 溶液（Pharmacia)提高密 度及純化。每一組的T細胞（5x106細胞/毫升）在96孔平盤中培 養，並以rVPl(5、10或20/zl/ml)刺激。該平盤在37°C下培養 4天，然後在每孔中加入10" 1 BrdU標記溶液（l〇mM PBS，pH 7·4 ; Roche cell proliferation ELISA，colorimetric kit)培養 4 小 時。呈色檢測步驟係根據製造商的建議進行。 猪的免疫反應及病毒測試 每組取4隻不具生殖力之無特定病原菌（SPF)之台灣公或母 豬隻（3個月大，約25公斤重），頸部肌肉注射起始劑量，其係 含有以等體積完全弗氏佐劑乳化的rVPl單體或雙體（3mg/豬）。 兩隻豬施打緩衝液作為負控制組。在第28天及第56天時，每 隻豬給予2mg的追加注射，追加注射之rVpi係乳化於 Montanide ISA 206(Seppic，France)佐劑中。收集免疫動物第 〇、 42及77天時的血清以供分析。第二次追加施打的三週後，在 所有豬隻的右前腳踩處注射0.5ml之TCID5G( 口蹄疫病毒 O/Taiwan/97)。監測豬隻的口蹄疫症狀14天，症狀包含體溫連 續超過40 C三天、跛行、豬鼻產生水泡及腿部出現冠狀條紋α 結果 rVPl的表現、分離及重新趨辱 使用pET表現系統在大腸桿菌中表現從台灣感染豬隻取得 之〇型口蹄疫病毒（〇/台灣/97)的VP1基因。重組vpi(rVpi)w 15 1285111 内含體的形式表現’並溶於包含8M尿素的緩衝溶液中。萃取 之rVPl係在8M尿素存在下以單一步驟金屬螯合親和性色層分 析純化。在不同的緩衝溶液中或蒸餾水等都會導致rVpl蛋白質 沉澱。為了避免溶解度不佳的問題，在重新摺疊程序中使用 SDS，以幫助蛋白質在膠體過濾管柱中繼續進行重新摺疊。從 Superdex-200色層分析管柱中沖提出兩部分主要溶離份，分別 稱為A峰及B峰。 SDS PAGE濃度分析顯示rVPl的表現量約占全部大腸桿菌 蛋白質的6%。該誘導的rVPl在經過單一步驟金屬螯合親和性 色層分析純化後，純度可大於90%。在非還原情形下以SDS PAGE決定A峰及B峰的顯著相對分子量，分別為58,0〇〇及 29,000。八峰中的蛋白質大小約是B峰中蛋白質的兩倍大。兩 個溶離份在西方墨點法中都會與豬的抗口蹄疫病毒抗體作用。 Edman定序法確認了在兩峰中rVPl前10個胺基酸殘基的一致 性。 在還原的情況下，大部分的A峰中的rVPl消失而移向b 峰的位置。當B峰中的rVPl被Cu+2催化K3Fe(CN)6氧化劑 (Graceffa (1989) Biochemistry 28 ： 1282-1287)氧化並以 Superdex-200管柱再次進行色層分析時，大部分的rVPl被沖提 於A峰溶離份中。這些結果說明了 A峰係為以分子間雙硫鍵鍵 結兩rVPl單體所形成的rVPl雙體。 溫度對rVPl抗原性的私響 rVPl單體4VC下反應30分鐘後，該單體對豬抗rVPl抗 體的反應能力會下降。當溫度上升超過66°C時，超過70%的 rVP 1早體喪失其抗原性。比較之下，在同樣的溫度下只有約 50%的雙體rVPl會喪失其抗原性。此，結果說明rVPl雙體的 16

1285111 構型相較於rVPl單體具有較佳的熱穩定性 豬隻中所誘發的抗艚反應 ELISA的結果顯示由rVPl雙體（豬隻編號No. 545-548)及 rVPl單體（豬隻編號ν〇·553_556)所引起的豬隻免疫反應，不但 可誘發豬隻產生抗rVP1抗體，並產生可與Ρ-29(與VP1的胺基 酸殘基13Μ59 —致）反應的抗體（表一）。就引發抗rvPl及抗 P-29抗體反應的能力而論，rVPl單體及rVPl雙體兩者間並沒 有顯著差異（Ρ> 〇·1)。為了避免rVPl單體在體内因還原或氧化 反應而轉變為雙體，或rVPl雙體轉變為單體，在本實驗中使 rVP1進行S-羧曱基化。表一顯示以S-綾甲基化rVpi產生免疫 反應的緒隻(No.549-552)也可分別誘發抗rVPl及抗P-29抗體， 其抗rVPl抗體的滴定量略高於rVPl單體及雙體的滴定量，而 抗P_29抗體的滴定量則略低於rVpi單體及雙體的滴定量，兩 者間沒有顯著差異(p> 0.1)。

17 1285111 厂一——一、.·%, 表一雙體、單體及s -羧甲基化(CM-單體yVFrirmi 反應及對抗口蹄疫病毒之功效 抗原 豬隻編 號 抗 rVPl 抗體滴 定量 (logio) 抗 p-29 抗體滴 定量 (logio) 中和抗 體滴定 量 (logio) 保護 rVPl雙體 545 4.48 2.34 <0.48 保護 546 5.66 3.60 1.51 保護 547 5.26 3.48 1.65 保護 548 5.20 2.65 1.96 保護 平均 5.31 3.28 1.63 100%保護 CM-單體 549 5.36 2.81 1.51 保護 550 5.93 3.18 0.90 部分保護 551 4.93 2.18 <0.48 保護 552 5.71 3.53 0.90 保護 平均 5.62 3.15 1.09 75%保護 RVP1單體 553 5.45 4.08 2.26 保護 554 5.81 2.70 <0.48 保護 555 4.78 3.45 1.20 保護 556 5.39 3.11 1.65 保護 平均 5.49 3.62 1.78 100%保護 緩衝液控 制組 557 <1 <1 <0.48 未保護 558 <1 <1 <0.48 未保護 平均 <1 <1 <0.48 0%保護

保護：沒有觀測到病症；部分保護：在右後腳跟上有一個小水 泡0 18 1285111 在...豬隻中_發中和抗體並保讜其免受口踏疬威牵 單體及雙體rVPl可使四隻動物中的三隻產生中和抗體，而 負控制組則無法使豬隻產生中和抗體。存活測試的研究顯示·· 以rVPl單體或雙體誘發免疫反應的豬隻全部沒有口蹄疫病症 (表一），而負控制組的豬隻則無法受到保護。豬隻對s_致甲基 化rVPl單體(CM-單體）產生的免疫反應也能使四隻動物中的二 隻誘發中和抗體。這些CM-單體誘發免疫反應的平均中和滴定 量（l〇giG=1.09)略低於 rVPl 雙體（l〇g10=L63)或 rVPl 單體（1〇gi。 = 1.78)的滴定量，但其差異並沒有統計學上的顯著意義（p> 0.1)。存活實驗顯示四隻CM-單體免疫豬隻中有三隻可因此受 到保護，而四隻中有一隻僅受到部分保護。此結果說明單體及 雙體rVPl都可作為豬隻抗口蹄疫病毒的疫苗。 魏隻對的T細胞反應 從測試組豬隻血液中分離的T細胞在體外分別以5、1〇及 20/zl/ml的rvpi給予刺激。當接種疫苗豬隻的τ細胞被10// Ι/ml的rVPl刺激時，可獲得最佳反應。在負控制組中，τ細胞 不會增生，而存在中和抗體的接種疫苗豬隻則顯示明顯的T細 胞增生反應（表二；p<〇〇5)。有趣的是，從口蹄疫測試中受到 保護且無法偵測到中和抗體的三隻豬隻（豬隻編號Νο·545， 551 ’ 554)中獲取的τ細胞亦顯示增生反應，而僅受到部分保護 的褚隻（豬隻編號Ν〇·550)，其Τ細胞顯示所顯示的增生反應是 所有接種疫苗豬隻中的最低量。 19 1285111 表二 體外τ細胞增生反應，τ細胞係分別取自注射缓衝 液、雙體rVPl、單體rVPl及S-羧曱基化（CM-單體)rVPl的豬 隻 抗原 豬隻編號 刺激指數a 平均±標準差 rVPl雙體 545 2.0 2·0±0·14 546 1.8 547 2.1 548 2.1 CM-單體 549 1.5 1.5810.22 550 1.3 551 1.7 552 1.8 rVPl單體 553 1.4 1·58±0·13 554 1.6 555 1.6 556 1.7 緩衝液控制組 557 1.0 1.05 558 1.1

a增生反應係在體外以lOgg/ml rVPl單體刺激豬隻T細胞 而決定。刺激指數：與rVPl共同培養後之平均吸收值/不與rVPl 共同培養後之平均吸收值。 20 1285111 年 其他實施癌樣 在本說明書中所揭露的所有特徵都可能與其他方法結合，本 說明書中所揭露的每一個特徵都可能選擇性的以相同、相等或相 似目的特徵所取代，因此，除了特別顯著的特徵之外，所有的本 說明書所揭露的特徵僅是相等的基因序列或相似特徵中的一個 例子。 根據本說明書所揭露的内容，任何熟習本技術領域之人士皆 可基於本發明之特色，在不脫離本發明精神與目的下，對本發明 做不同的更動與修飾，使其適用於不同的情況與對象，因此，其 他實施態樣也包含在本發明之申請專利範圍内。 【圖式簡單說明】 無

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Claims (1)

1285111 ί + «As ft 13^1 · Α.Λί»·--η·«υv*e·* .· ..... 、申請專利範圍· 1. 一種純化之水溶性多胜肽，包含：一個或多個口蹄疫病毒之 VP1蛋白質單體； 其中前述VP1蛋白質單體包含SEQIDNO: 2之胺基酸序列。 2.如申請專利範圍第1項所述之多胜版，其中前述多胜版包含一 個口蹄疫病毒之VP1蛋白質單體。 3.如申請專利範圍第1項所述之多胜肽，其中前述多胜肽包含兩 個口蹄疫病毒之VP1蛋白質單體。 4.如申請專利範圍第3項所述之多胜肽，其中前述單體係藉由雙 硫鍵連結。 5. —種純化之非水溶性多胜肽，包含：兩個或多個口蹄疫病毒之 VP1蛋白質單體 其中前述VP1蛋白質單體包含SEQIDNO: 2之胺基酸序列。 6.如申請專利範圍第5項所述之多胜肽，其中前述單體係藉由雙 硫鍵連結。 7. —種疫苗，包含： 一藥物學上可接受之載體；及 一有效量之申請專利範圍第1項所述之多胜肽。 8.如申請專利範圍第7項所述之疫苗，其中前述多胜肽包含一個 口蹄疫病毒之VP1蛋白質單體。 9.如申請專利範圍第7項所述之疫苗，其中前述多胜肽包含兩個 口蹄疫病毒之VP1蛋白質單體。 10.如申請專利範圍第9項所述之疫苗，其中前述單體係藉由雙硫 鍵連結。 11. 一種疫苗，包含： 一藥物學上可接受之載體；及 一有效量之申請專利範圍第5項所述之多胜版。 22 1285111 12. 如申請專利範圍第11項所述之疫苗，其中前述單體係藉由雙 硫鍵連結。 13. —種製造可溶性多胜肽的方法，包含： 解開（unfold)非水溶性多胜肽，其中前述非水溶性多胜肽 包含一或多個口蹄疫病毒之VP1蛋白質單體；及 重新摺疊（refold)前述多胜肽，藉此產生一水溶性多胜 肽； 其中前述VP1蛋白質單體包含SEQ ID NO: 2之胺基酸 序列。 14. 如申請專利範圍第13項所述之製造可溶性多胜肽的方法，其 中前述解開步驟包含：使非水溶性多胜肽溶解於包含尿素的溶 液中。 15·如申請專利範圍第14項所述之製造可溶性多胜版的方法，其 中前述重新摺疊步驟包含：在前述多胜狀中加入十二烧硫石黃酸 鈉（sodium dodecyl sulfate)，然後以膠體過濾管柱色層分析。 16. —種製造可溶性多胜肽的方法，包含： 在細胞中表現一非水溶性多胜肽，其中前述非水溶性多胜 肽包含兩個或多個口蹄疫病毒之VP1蛋白質單體；及從細胞中 收集多胜肽； 其中前述VP1蛋白質單體包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序 列。 17. 如申請專利範圍第16項所述之製造可溶性多胜肽的方法，其 中前述收集步驟包含：使非水溶性多胜肽溶解於包含尿素的溶 液中。 18. —種誘發對象免疫反應的組合物，包含： 有效量之申請專利範圍第1項所述之純化之水溶性多胜 狀0 23 1285111 19. 如申請專利範圍第18項所述之誘發對象免疫反應的組合物， 其中前述多胜肽包含一個口蹄疫病毒之VP1蛋白質單體。 20. 如申請專利範圍第18項所述之誘發對象免疫反應的組合物， 其中前述多胜肽包含兩個口蹄疫病毒之VP1蛋白質單體。 21. 如申請專利範圍第20項所述之誘發對象免疫反應的方法，其 中前述單體係藉由雙硫鍵連結。 22. —種誘發對象免疫反應的組合物，包含： 有效量之申請專利範圍第5項所述之純化之非水溶性多 胜肽。 23. 如申請專利範圍第22項所述之誘發對象免疫反應的組合物， 其中前述單體係藉由雙硫鍵連結。

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