TWI392739B - 用於製備纖維狀蛋白質之方法以及纖維狀蛋白質之應用 - Google Patents
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Description
本發明是有關於將未折疊原態蛋白質(native protein)折疊為纖維狀結構(fibrillar structure)的方法，且本發明也發現使用纖維狀結構蛋白質可以誘發細胞凋亡(apoptosis)及作為疫苗的佐劑(adjuvant)。
先前研究已經發現在糖化(glycation)(Bouma等人發表於J Bio Chem
278(43)：41810-41819：2003)、高溫培養(Sagis等人發表於Langmuir
20(3)：924-927：2004)、或超音波震盪(Stathopulos等人發表於Protein Sci
13(11)：3017-3027：2004)後，某些蛋白質會形成纖維狀結構。然而，這些方法通常需要高濃度蛋白質、激烈的震盪、原纖維種粒(fibril seed)的協助，且時間很長，有時甚至需要在特定溫度下培育一個月左右。此外，除非溶液中有纖維狀聚集體形成並沉澱析出，否則這些方法不能將纖維狀蛋白質從非-纖維狀蛋白質中分離出來。
本發明揭露了一種可以球狀蛋白質結構改變至纖維狀蛋白質結構的方法。此方法包括：提供球狀蛋白質、於含該球狀蛋白質的溶液中添加皂化劑、及再
將這些含有蛋白質的溶液通過一孔洞大小允許分離至少為70 kDa分子量蛋白質的分子分級管柱(molecular sizing column)等步驟。在此態樣中此方法並包含以含皂化劑之溶液沖提(elute)出纖維狀蛋白質的步驟。
另外，本發明也揭露一種用以製造佐劑的方法。此方法包括提供一蛋白質、及改變該蛋白質為纖維狀結構的步驟。
本發明前述之特徵及目的由後文及配合附圖詳述而說明，其中相似的符號為代表相似的元件。
本發明是有關生產纖維狀蛋白質的製程及使用纖維狀蛋白質治療的方法，此製程具有容易控制、產物均質及能夠量產等優點。此外，利用此製程生產的纖維化蛋白質不需原纖維種粒(fibril seed)的協助，即使只有微量蛋白質也可使用於此製程。如用於本文之"蛋白質"包含一種或更多蛋白質、蛋白質片段、多胜肽或胜肽。蛋白質包含合成、天然存在或用基因重組方法產生的蛋白質。
依據本發明，揭露一種用來改變球狀蛋白質結構為纖維狀蛋白質結構的方法。此方法以一簡單且快速的方式將原態蛋白質(不論其序列)轉換為纖維狀結
構。此方法包括提供一蛋白質及讓上述蛋白質通過孔洞大小為允許分離至少70 kDa分子量蛋白質的分子分級管柱，並以含皂化劑的溶液沖提出蛋白質等步驟。
在一說明實施例中，此方法包括提供一球狀蛋白質、形成含該球狀蛋白質的溶液、添加皂化劑至含該球狀蛋白質的溶液、及讓此溶液通過孔洞大小為允許分離至少70 kDa分子量的蛋白質之分子分級管柱等步驟。
在另一說明實施例中，此方法包括提供一球狀蛋白質、形成含該球狀蛋白質的溶液、添加皂化劑至含該球狀蛋白質的溶液、及在低濃度皂化劑存在下將溶液通過孔洞大小至少為允許分離70 kDa分子量的蛋白質之分子分級管柱的步驟。
在本發明另一態樣中，揭露了一種將未折疊蛋白質結構改變為纖維狀蛋白質結構的方法。此方法包括：提供一未折疊的蛋白質，並在尿素存在下將蛋白質通過分子分級管柱。在例示實施例中，此方法包括步驟：提供一在大腸桿菌表現的未折疊蛋白質溶於8 M尿素中，並在皂化劑存在下讓蛋白質通過孔洞大小小於允許分離70 kDa分子量蛋白質的分子分級管柱。
球狀蛋白質(globular proteins)，也稱為球體蛋白質(spheroportein)，其結構乃屬二類主要蛋白質三級結構(teritary structure)之一。球狀蛋白質通常具水可溶性且在水中可形成扁球體分子，其具有複雜的二
級結構，包含如α-雙螺旋(α-helices)、β-片(β-sheets)及迴圈(loop)等二級結構單元(secondary structure motif)。另一種主要三級結構之蛋白質為纖維狀蛋白質或纖維蛋白質，纖維狀蛋白質一般不易溶解並具有瘦長的形狀，具有較簡單二級結構且是由一種二級結構單元所組成。
在說明實施例中，球狀蛋白質可以為一白蛋白、纖維網蛋白、口蹄疫病毒的重組外套蛋白質VP1(rVP1)、口蹄疫病毒的重組外套蛋白質VP2(rVP2)、口蹄疫病毒的重組外套蛋白質VP3(rVP3)、或VP1、VP2、VP3及/或VP4的前驅蛋白質P1(precursor protein P1)。蛋白質也可以是包括VP1、VP2、VP3、及/或VP4部份的嵌合蛋白質，例如VP42同時包括部分的VP2及VP4。也可使用其他球狀蛋白質，包含天然存在蛋白質及合成寡胜肽兩者。球狀蛋白質一般溶解於溶液體內。在說明實施例中，球狀蛋白質溶解於磷酸鹽緩衝液(PBS)。
介面活性劑(surfactant)，在本文中也稱為皂化劑(detergent)，是降低水的表面張力及提高有機化合物溶解性的物質。皂化劑可以是離子性，包含陽離子、陰離子及兩性離子皂化劑，皂化劑也可以是非離子性的。皂化劑在蛋白質中扮演打斷蛋白質內非共價鍵的角色，藉此使蛋白質轉化，而喪失原態形狀或構形。在說明實施例中，使用的皂化劑為十二烷基硫酸鈉
(SDS)，自Sigma公司購得。在其他說明實施例中，亦使用自Calbiochem公司購得的皂化劑為N-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate。
似澱粉狀蛋白質(Amyloids)為纖維交錯-β蛋白質聚集體。許多蛋白質能夠轉化為似澱粉狀原纖維，具有纖維狀型態、原絲次結構、交錯-β繞射圖案、β-結構數量增加、可與剛果紅結合及可與ThT結合等性質。在說明實施例中，將球狀蛋白質轉換成似澱粉狀原纖維(amyloid-like fibril)，被轉化的蛋白質可藉由其似澱粉狀性質而被辨識出來。
本發明利用色層分析法(Chromatography)將纖維狀蛋白質自溶液中分離，色層分析法包含粒度排除、親和力、及離子交換等，一般使用管柱，亦可使用其他方法如薄層色層等。但利用管柱將球狀蛋白質轉換為纖維狀，是比較快速、穩定、有效、且連續的方式，同時使用管柱的製程較易擴大其製程規模。
在說明實施例中使用的色層分析法為粒度排除色層分析技術(size exclusion chromatography)，其珠體孔洞大小至少為允許分離約70 kDa分子量之蛋白質之大小。珠體孔洞大小可依球狀蛋白質的不同特性而變化，例如其大小。孔洞大小控制蛋白質進入珠狀基體，從而引發機械力協助蛋白質進行未折疊/折疊及增進原纖維整體性的。在說明實施例中，使用的分子分
級管柱(molecular sizing column)為Superdex 200。在其他說明實施例中，使用的分子分級管柱為HW55S。
管柱色層分析法中，可使用含低濃度皂化劑的緩衝溶液沖提管柱。在某些態樣中，分子分級管柱是以含25 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、0.1 M NaCl及0.05%SDS的緩衝溶液沖提。在其他說明實施例中，分子分級管柱以含25 mM Tris-HCL、pH 8.0、1 mM EDTA、0.1 M NaCl、及0.05% N-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate的緩衝溶液沖提。沖提液可以區分收集，將含有纖維狀蛋白質的區分量收集在一起。此集中的區分可進一步以過濾純化並分離出纖維狀蛋白質，例如在磷酸鹽緩衝液透析以移除SDS或Zwittergents等皂化劑。
在本發明另一態樣中，揭露一種治療癌症的方法。此方法包括提供一蛋白質、改變蛋白質為纖維狀結構、及將一治療有效量之纖維狀結構蛋白質投藥予需要的患者等步驟。蛋白質轉化為纖維狀形式增加其在目標細胞的細胞毒性。
在說明實施例中，癌症是腎臟、乳房、肺、前列腺、肝、或卵巢癌症。用來治療癌症的蛋白質為白蛋白(albumin)、纖維網蛋白(fibronectin)、rVP1、rVP2、rVP3、P1、或由部分VP1、VP2、VP3及/或VP4所組成的嵌合蛋白質。在說明實施例中，纖維狀蛋白質藉由調控Akt信號途徑誘發癌細胞之細胞凋亡。在某些
例子中，纖維狀蛋白質藉由調控黏合素(integrin)α5β1或αvβ3，導致Akt的去活化作用。在其他例子中，纖維狀白蛋白結合黏合素引起細胞凋亡，主要是經黏合素/FAK/Akt/GSK-3β/caspase-3訊息傳遞路徑。
在說明實施例種，此纖維狀蛋白質可以以組成物一部份來投藥。此組成物可以是多種形式包含粉末、乳膏、凝膠、油膏、軟膏、溶液、藥片、膠囊、噴液、及貼片。再利用賦形劑及載劑以傳送組成物至病人。這些載體包含可溶劑、稀釋劑及分散介質。這些載體為可生物相容、治療上可接受的，且不改變纖維狀蛋白質的治療特性。輔藥、佐劑及其他成份也可包含於此組成物。
組成物的投藥可經由多種方法到達身體的不同部位而完成，包含靜脈、皮內、皮下、口服(例如，吸入)、經皮膚(即，局部)、經黏膜、腹膜內、腫瘤內、及直腸內投藥。(例如，吸入)、經皮膚(即，局部)、經黏膜、腹膜內、腫瘤內、及直腸內投藥。
"治療有效量"是指在合理的利害比較下，在任何藥物治療上可產生預期效應的施用量。此有效量可能因某些因子而產生不同的變化，如疾病的種類或治療時疾病的病症、被投藥的特定標的器官的構造、病人個體大小、或疾病或症狀的嚴重性。本領域具有通常知識者不需要過度實驗即可憑經驗決定特定化合物的有效量。
治療癌症的蛋白質可依於疾病的嚴重性及癌細胞所需的細胞毒性來選擇。在說明實施例中，若要選擇對癌細胞具有較高細胞毒性的，則應選擇具RGD單元(motif)及/或較高分子量的蛋白質。
在本發明另一態樣中，揭露一種用以生產疫苗的方法。此方法包括提供一蛋白質、並改變蛋白質為纖維狀結構等步驟。此纖維狀結構蛋白質可以抗特定疾病的疫苗投藥予患者。
在本發明另一態樣中，揭露一種用以生產疫苗或免疫佐劑的方法。此方法包括提供一蛋白質，及改變該蛋白質為纖維狀結構等步驟。佐劑本身可不具有任何特定抗原效果，但可刺激免疫系統，提高對疫苗的反應。在說明實施例中，蛋白質經由類鐸受體2(toll-like receptor 2,TLR2)活化先天性免疫反應(innate immune response)。纖維狀蛋白質活化TLR2以誘導細胞激素(cytokine)產生，然而在其原態蛋白質則無此功能。
在其他實施例中，抗原可轉化為纖維狀形式而同時具有抗原及佐劑效果，使得製造疫苗時不需要額外的佐劑就可強化免疫反應。
為了更完整的瞭解本發明可配合下列特定實施例及圖示而獲得。描述之實施例及圖示僅為舉例說明
之用而非用於限定本發明之範疇。即使實施例的說明可能有形式的改變或實質相等物的取代，這只是權宜之計，而不影響專利範圍的大小。雖然在本文使用特定的詞，此些詞為用於合理的描述而非用於限制的目的。如在上文中說明之本發明的潤飾及變化可在未偏離本發明之精神及範疇下完成，且因此些限制應僅受限於後附申請專利範圍所限定者。
材料及方法
材料
。Phospho-Ser473
Akt抗體購自Cell Signaling Technology公司。N-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate購自Calbiochem公司。纖維網蛋白(Fibronectin,FN)、抗-肌動蛋白抗體(anti-actin antibody)、抗-黏合素α5β1多株抗體(anti-integrin α5β1 polyclonal antibody)(功能抑制抗體)、辣根過氧酶-耦合抗-鼠IgG二級抗體(horseradish peroxidase-coupled anti-mouse IgG secondary antibodies)、辣根過氧酶-耦合 抗-兔IgG二級抗體(horseradish peroxidase-coupled anti-rabbit IgG secondary antibodies)及MTT試驗組購自Chemicon International公司。牛血清蛋白購自Bio Basic公司。硫代黃素T(Thioflavin,ThT)及十二烷基硫酸鈉(soudium dodecyl sulfate,SDS)購自Sigma公司。
重組蛋白質VP1及VP3的表現及純化。
VP1及
VP3為口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiease virus,FMDV)之外套蛋白質組成分。重組蛋白質VP1，在E.coli
.表現後，並依前述的製程純化及再折疊(refold)(Yang等人發表於Journal of Gene Medicine
7：708-717：2005)。VP3基因以PCR從plBSY1-P1質體中放大，引子為5'-CCGGGATCCAAGCTTGGGATTTTCCCCGTGGCA-3'及5'-CCGCTCGAGTTGGGTTCGGGCGTCGAC-3'，其分別於N-終端引入Bam
Hl辨識酶切割位及於C-終端引入Xho
l辨識酶切割位。在限制酶水解後，此放大的基因接合在pET24a(+)(Novagene,WI)之Bam
Hl及Xho
l位置間並轉形(transform)入DH5α勝任細胞(competent cell)。可辨識的陽性株(positive clone)以定序方法確定後，轉形入E.coli
.BL21(DE3)勝任細胞(competent cell)。重組蛋白質VP3，在E.coli
.表現後，依前述製程純化及再折疊(Yang等人發表於Journal of Gene Medicine
7：708-717：2005)。
牛血清蛋白纖維狀蛋白質的製備。
20 mg牛血清蛋白(購自Bio Basic公司)溶解於10 ml磷酸鹽緩衝液，接著加入SDS(10%；w/v)直至其達到最終濃度為1%。在水超音波振盪器震盪後，將此含有SDS-蛋白質溶液加入Superdex-200管柱(2.6 cm x100 cm，購自Amersham Biosciences公司)，其先以含25 mM
Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、0.1 M NaCl及0.05%SDS的緩衝溶液平衡。收集含牛血清蛋白的區分。此收集的區分接著用磷酸鹽緩衝液透析以除去SDS。纖維黏連蛋白之纖維狀蛋白質(Fibronection fibrillar protein)亦使用相同的程序製備。
穿透式電子顯微鏡(TEM)。
以穿透式電子顯微鏡分析纖維狀蛋白質，將1 mg/ml蛋白質加入至200-篩目覆碳銅格網。移除過量的樣本且風乾該格網。蛋白質-承載格網以1%(W/V)磷鎢酸(phosphotungstic acid)負染色1分鐘。穿透電子顯微相片乃是在20,000-150,000x放大倍率，以75 Kv在HitachiH-7000電子顯微鏡下觀察得到。
硫代黃素T(ThT)螢光。
硫代黃素T(ThT)為似澱粉狀性質(amyloid-like properties)的標記之一。為測量螢光，將濃度漸增之蛋白質(1 μM、3 μM、及5 μM)與20 μM硫代黃素T中共同培育。在室温培育1小時後，以Wallac VICTOR2
1420多標示計數器(multilabel counter)(購自Perkin Elmer life science公司)測量螢光，每個測試進行三重複。激發及放射波長分別為355 nm與535nm。由緩衝液造成的硫代黃素T背景訊號會由對應的量測值中減去。
細胞株及治療。
BHK-21細胞(來自倉鼠腎臟)及T47D細胞株(人類乳管癌)在以10%胎牛血清(FBS)、2 mM L-麩醯胺、100單位/ml盤尼西林、及100 μg/ml鏈
黴素補充之Dulbecco氏改質之Eagle氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)中於37℃保存。細胞在單層培養基中過夜。細胞以磷酸鹽緩衝液清洗兩次及並以無胎牛血清之DMEM中的蛋白質處理一段時間。部分細胞接著在指定的時間點以0.2 ml分解緩衝液(購自Pierce公司)溶解，並取20 μl試樣以西方漬染法(Western blotting)分析Akt磷酸化作用(Akt phosphorylation)。
細胞存活試驗。
細胞存活由MTT比色試驗測定。將呈指數生長的細胞(BHK-21細胞為1 x104
；T47D細胞株為1.25x104
)接種於96-井盤中含10%胎牛血清的DMEM內，於培養24小時後，在無胎牛血清的DMEM培養基中加入一系列濃度的纖維狀蛋白質，於37℃處理8小時。處理後，MTT溶液加至每一井(0.5 μg/ml)並培育4小時。活細胞數目直接與甲濳(formazen)生成量成正比，甲濳在溶於異丙醇後，可於ELISA平板讀取器內以光譜儀在560 nm測定而得。
SDS-PAGE及免疫轉印分析。
樣品在Hoefer垂直凝膠設備(購自Amersham Biosciences公司)中，以10%SDS-PAGE凝膠分離，接著以電泳傳送至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride membranes)(購自Pall公司)。此膜在PBST中以含5%之脫脂奶粉阻隔處理1小時，並在阻隔緩衝液中與初級抗體(5-10μ
g/ml)培養。接著以PBST清洗，以辣根過氧酶-共軛二級抗
體(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody)(購自Chemicon公司)培養。抗體藉由曝露至Biomax ML膜(購自Eastman Kodak公司)以化學發光劑(SuperSignal West Pico，購自Pierce公司)檢測。
圖式
第1圖。Superdex-200管柱分析而非Superdex-75管柱分析促進纖維狀蛋白質的形成。
穿透式電子顯微鏡照片顯示BSA-S200呈纖維狀結構(如圖A)而BSA-S75呈球狀結構(如圖B)。牛血清蛋白為對照組，亦呈現球狀結構(如圖C)。圖D及E分別為VP1-S200及VP3-S200，兩種表現於E.coli.
之重組蛋白質且於Superdex-200管柱中再折疊，以穿透式電子顯微鏡分析呈原纖維狀結構。圖F為濃度漸增的BSA-S200在20 μM澱粉狀蛋白質-專一染料ThT中培育，與牛血清蛋白及BSA-S75相比，BSA-S200濃度越高會導致ThT螢光量增加。實驗進行三重複，數據以平均值±S.D.(n=3)表示。
第2圖。似澱粉狀蛋白質原纖維的形成與皂化劑或珠狀基體無關。
穿透式電子顯微鏡照片顯示BSA-Zwit(如圖A)及BSA-HW55S(如圖B)的纖維狀結構。
第3圖。纖維狀蛋白質誘發細胞凋亡是經由Akt信號途徑。
BHK-21細胞在無血清培養基中以不同濃度之牛血清蛋白、BSA-S75、BSA-S200、BSA-Zwit、
或BSA-HW55S處理8小時。處理後，利用MTT試驗測定細胞存活。數據以平均值±S.D.(n=3)表示。(圖A)BHK-21細胞以或不以抗-α5β1抗體預處理30分鐘，接著以3 μM BSA-S200處理一段指定時間。處理後，細胞溶解液(cell lysate)藉由使用抗-磷-Akt(p-Akt)初級抗體的西方漬染法分析。(圖B及C)為T47D細胞株以或不以抗-α5β1抗體預處理30分鐘，接著在無血清培養基中以不同濃度BSA-S200處理8小時。處理後，以MTT試驗測定細胞存活率。數據以平均值±S.D.(n=3)表示。
第4圖。RGD單元與纖維狀蛋白質分子量對BHK-21細胞的細胞毒性的影響。
(圖A)為BHK-21細胞在無血清培養基中分別以0.5 μM VP1-S200、VP3-S200、BSA-S200、FN-S200、或FN處理8小時。處理後，由MTT試驗測定細胞存活率。數據以平均值±S.D.(n=3)表示。(圖B)為BHK-21細胞在無血清培養基中以增加濃度之VP3-S200處理8小時。處理後，由MTT試驗測定細胞存活率。數據以平均值±S.D.(n=3)表示。
結果
管柱珠孔洞大小及珠狀基體對似澱粉狀蛋白質原纖維的形成的影響。
牛血清蛋白(BSA)為球狀蛋白質。將SDS加至BSA牛血清蛋白溶液，將其加入施用
至Superdex-200管柱(孔洞大小達600 KDa)，接著以含25 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、0.1 M NaCl、及0.05% SDS的緩衝溶液沖提。從Superdex-200管柱(BSA-S200)取得的BSA牛血清蛋白質以穿透式電子顯微鏡(TEM)分析呈現纖維狀結構，如穿透式電子顯微鏡(TEM)分析所顯示(圖1A)，且以澱粉狀蛋白質專一染料硫代黃素T(ThT)分析時發現螢光增加且隨著劑量螢光越強 依賴方式測得之澱粉狀蛋白質專一染料硫代黃素T(ThT)的螢光增加(圖1F)。為研判管柱珠孔洞大小在原纖維的形成上的影響，在此研究中使用具有僅為3-70 kDa MW範圍的較小孔洞大小Superdex-75管柱(表1)。穿透式電子顯微鏡TEM分析顯示由Superdex 75(BSA-S75)沖提出的BSA牛血清蛋白，似BSA牛血清蛋白，顯示球狀結構(圖1B及1C)且並未增強澱粉狀蛋白質專一染料ThT的螢光(圖1F)。重組蛋白質VP1(rVP1)及重組蛋白質VP3(rVP3)表現於E.coli
.中，以尿素萃取並以親和性管柱純化，亦使用皂化劑進行色層分析，並透過前述Superdex-S200管柱進行再折疊。穿透式電子顯微鏡TEM數據顯示VP1-S200(圖1D)及VP3-S200(圖1E)呈現纖維狀結構。同時也分析管柱珠基體大小對纖維狀蛋白質的形成的影響也被檢測。結果發現HW55S小珠和Superdex-200(孔洞大小達700 KDa)具有相似的小珠性質但基體組成份不同，在(表1)互做比較。以TEM
穿透式電子顯微鏡觀察，由HW55S管柱分析(BSA-HW55S)沖提出的BSA牛血清蛋白呈現纖維狀結構(圖2B)。這些數據顯示具有孔洞大小大於允許分離約70 kDa分子量蛋白質之大小的分子分級管柱如Superdex-200(S200)及HW55S，可以促進似澱粉狀纖維狀蛋白質的形成。
皂化劑對似澱粉狀蛋白質原纖維形成的影響。
N-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate為在廣pH範圍中保有兩性離子性質的皂化劑，推測其並非不可逆地結合至陰離子或陽離子化合物。經由Superdex-200管柱，N-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfo
nate對纖維狀牛血清蛋白形成的影響也被研究。N-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate加至牛血清蛋白溶液(1% N-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate)，藉由及/或經過Superdex-200管柱之通道進行再折疊，由含有25 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、0.1 M NaCl、及0.05%N-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate的緩衝溶液進行沖提。結果發現經由Superdex-200管柱以N-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate(BSA-Zwit)沖提取得的牛血清蛋白在穿透式電子顯微鏡下呈現纖維狀結構(圖2A)。這些數據顯示皂化劑如SDS及N-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate與小珠的孔洞大小對於形成纖維狀蛋白質方面都扮演著重要的角色。
纖維狀蛋白質藉由去活化Akt而誘發細胞死亡。
如之前已經顯示的，rVP1對BHK-21細胞以及多種癌細胞株具細胞毒性。為檢測由我們的方法取得之纖維狀蛋白質是否對細胞具細胞毒性，BHK-21細胞在無血清培養基中以不同濃度的BSA-S200、BSA-Zwit或BSA-HW55S處理。發現BSA-S200、BSA-Zwit、及BSA-HW55S在劑量依賴方式中都造成細胞死亡(圖
3A)。BSA-Zwit在所有的測試中呈現最強的細胞毒性，在0.5 μM濃度下，BSA-Zwit誘發將近100%細胞毒性，而同樣濃度下，BSA-S200誘發35%細胞毒性及BSA-HW55S誘發10%細胞毒性。BSA-Zwit、BSA-S200及BSA-HW55S的IC50
分別為0.2 μM、0.75 μM及大於10 μM。如對照組，發現使用兩球狀蛋白質、原態牛血清蛋白及BSA-S75對細胞毒性，即使有，也是極少(圖3A)。為說明是否纖維狀蛋白質誘發細胞死亡乃是經由Akt信號途徑，BHK-21細胞以抗-α5β1抗體或未以抗-α5β1抗體預處理30分鐘，接著在一段指定時間內以3 μM BSA-S200處理。數據顯示BSA-S200如rVP1-S200及rVP3-S200，在一時間依賴方式中去活化Akt。除此之外，BSA-S200對Akt的抑制效用可藉由增加抗-α5β1抗體之濃度的預處理而回復(圖3B)。
此外，抗-α5β1抗體對由纖維狀蛋白質誘發的細胞死亡的影響也被測試。先將T47D細胞株(乳房癌症細胞株)以濃度漸增的抗-α5β1抗體預處理30分鐘，接著以BSA-S200在無血清培養基中培育8小時。結果發現，以抗-α5β1抗體預處理的T47D細胞株，隨著抗-α5β1抗體的濃度越高，BSA-S200對T47D細胞株的毒性越弱(圖3C)。這些數據顯示，纖維狀蛋白藉由調控Akt信號途徑對癌細胞產生細胞毒性。
RGD單元及纖維狀蛋白質分子量對細胞之細胞毒性的影響。
RGD單元為黏合素的配位基，以上實驗
已證實，纖維狀蛋白質乃是藉由調控黏合素/Akt信號途徑，誘發細胞死亡。纖維網蛋白為具有RGD單元且450 kD分子量之蛋白質，當在SDS存在下由Superdex200(FN-S200)沖提出來時亦呈現纖維狀結構(數據未顯示)。比較在BHK-21細胞上的VP1-S200、FN-S200、rVP3-S200及BSA-S200四種纖維狀蛋白質的細胞毒性(如圖4A所示)，發現具RGD單元的纖維狀蛋白質，如rVP1-S200及FN-S200，比不具RGD單元如BSA-S200及rVP3-8200更具細胞毒性。此外，具較高分子量的纖維狀蛋白質比具低分子量者的更具細胞毒性。FN-S200(MW=450 kD)比VP1-S200(MW=26 kD)更具細胞毒性(圖4A)。BSA-S200(MW=66 kD)比VP3-S200(MW=26 kD)更具細胞毒性(第4A圖)。雖然VP3-S200在0.5 μM濃度未顯示任何細胞毒性如圖4A所示，但較高濃度的VP3-S200則顯示以劑量依賴方式誘發細胞毒性(圖4B)。綜合來看，具RGD單元及較高分子量的纖維狀蛋白質對細胞具有比無RGD單元及較低分子量者有較高的細胞毒性。
在活體外及活體內使用纖維狀蛋白質rVP1做為抗癌的研究。
在活體外重組蛋白質VP1(rVP1)抑制癌細胞的生長比阿黴素(doxorubicin)及紫衫醇(taxol)更有效。使用MTT試劑評估rVP1在活體外的細胞毒性，發現rVP1的IC50
值遠低於阿黴素在四種不同肺癌細胞株及一種卵巢癌細胞株之中的IC50
值，上述細胞株包
括A549、H146、H23、H23/0.3、及SK-OV-3細胞，以及正常的肺纖維母細胞細胞株(WI-38)。在以rVP1處理的SK-OV-3細胞亦可見到高於以阿黴素及紫衫醇處理之抑制作用。同時也發現rVP1對於BNL細胞的IC50
值，低於對正常鼠類肝細胞株(AML 12細胞)，此說明rVP1對鼠類HCC細胞有比對正常肝細胞具有更高的細胞毒性。
以rVP1處理可抑制腫瘤生長且延長具HCC之鼠的生存。
BNL細胞以皮下注入BALB/c鼠，在大約在腫瘤誘發二週後可檢查到腫瘤體積為250 mm3
。四組鼠給予腫瘤內注射rVP1(25 mg/kg、75 mg/kg、或100 mg/kg)或磷酸鹽緩衝液，每週三次，持續3星期。以rVP1處理的老鼠的腫瘤體積遠小於未處理的老鼠，rVP1劑量越高顯示越好的效果。在對照組與治療組間的腫瘤體積差異經統計分析具有顯著性的差異(25 mg/kg，P<0.05；75 mg/kg及100 mg/kg，P<0.001)。
在另一相似但只有二組鼠的實驗中，以rVP1(75 mg/kg)處理鼠的腫瘤體積亦遠小於接受磷酸鹽緩衝液的對照組鼠。以rVP1或磷酸鹽緩衝液處理的鼠之平均存活分別為11.5及13.5週。在二組間在存活率上的差異以log-rank檢定法計算，且結果經統計分析為具有顯著性的差異。
rVP1的處理提高具有人類卵巢腫瘤之裸鼠的存活率。
rVP1的治療是經由2-階段腹膜內注射進行治
療。具人類卵巢腫瘤的裸鼠在腹膜內注射SK-OV-3細胞誘發腹水後四小時接受第一次注射，且以不同劑量的rVP1(15、50、150 mg/kg)注射，每48小時注射一次，共注射10次。在10天的中斷後再重新開始處理，且重複rVP1的注射每48小時5次。與控制組比較，接受rVP1注射(15及50 mg/kg)的老鼠具有較高存活率。
討論
一般用於製造澱粉狀蛋白質原纖維的方法需在37℃熟化一段時間。大部分的案例，熟化的時間由數天至數週。報告已經顯示SDS可以加速原纖維的形成；然而其仍然需要在37℃激烈攪拌過夜、在室溫培育2天、或需要原纖維種粒的幫助。此外，所有的這些方法屬於批次生產。
在本發明中，發展一種管柱方法，在皂化劑(SDS或N-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate)存在下，在無原纖維種粒下，仍可促進纖維狀蛋白質形成(圖1A、D、及E；2A及B)。而且，使用管柱製程可以快速、穩定、有效、及連續的將球狀蛋白質轉換至纖維狀形式。此外，此製程也易於放大。之前的實驗已經證明許多具有多樣結構的蛋白質，包括疾病及非疾病相關的蛋白質，都能夠形成澱粉狀蛋白質。本發明發現具有不同序列及結構之不同蛋白質可
用於此管柱層析製程且可轉換為纖維狀蛋白質，例如BSA-S200、rVP1-S200、rVP3-S200及FN-S200(圖1A、D及E)。為了找到管柱-誘發原纖維形成的最佳條件，進行有關在此製程中可能影響原纖維形成的某些因子之研究。
結果建議珠之孔洞大小在管柱-誘發原纖維形成扮演一重要角色。Superdex-200管柱具有比Superdex-75管柱大的珠孔孔洞(表1)。至於為何比Superdex75孔洞小之管柱不易促進原纖維形成(圖1B)，可能是因為有限的珠孔洞大小限制蛋白質進入珠狀基體，因此造成缺乏提供蛋白質未折疊/折疊及增進原纖維整體性之機械力。綜言之，機械力與皂化劑確實在管柱-誘發原纖維形成中扮演重要角色。
黏合素為組成胞膜受體家族(integral membrane receptors)，其作用如細胞粘著分子。每一黏合素為α-及β-次單位以非共價鍵鍵結而成的雜二聚體(heterdimer)。在哺乳類物種中，黏合素家族由24個不同雜二聚體(heterodimers)組成，每一個黏合素都分佈於可區別的組織。黏合素參與許多作用，包括在細胞及細胞外間質(extracellar matrix)間的黏合作用及訊息傳遞途徑的誘導作用，也調控多種過程，包含細胞增殖、型態、遷移、及細胞凋亡。
之前的研究已經證明澱粉狀原纖維(amyloid fibrils)對神經元細胞具細胞毒性。之前的研究也證明
α2β1及αVβ1黏合素信號途徑作為引起由澱粉狀蛋白質-β-誘發的神經毒性的媒介。在本發明中發現纖維狀蛋白質藉由調控黏合素α5β1，活化Akt途徑，而誘發癌細胞死亡(圖3B及3C)。
澱粉狀蛋白質，不論其來源為何，對神經元細胞具細胞毒性。澱粉狀蛋白質誘發細胞毒性的機制可能和脂質膜與似澱粉狀蛋白質的胜肽的互動有關。然而，纖維狀蛋白質對癌細胞的細胞毒性的影響尚未被報導。我們發現SDS幫助管柱誘發的纖維狀蛋白質(column-induced fibrillar protein)在人類癌細胞株中呈現細胞毒性(圖3C)。BSA-S200，在T47D細胞株中於2 μM濃度導致細胞存活率降低70%(圖3C)。
最後，具RGD單元的纖維狀蛋白質與不具RGD單元者對細胞毒性的影響。結果發現RGD單元為黏合素的配位基，其調控多種功能如細胞遷移、粘著、或增殖。實驗結果顯示具有RGD單元之纖維狀蛋白質比不具RGD單元的纖維狀蛋白質，對細胞呈現更多的細胞毒性(圖4A)，此外亦發現纖維狀蛋白質分子量對於纖維狀蛋白質誘發的細胞毒性也會有影響(圖4A)。
材料及方法
材料。
磷-Try576/577
FAK(phospho-Try576/577
FAK)、磷-Ser473
Akt(phospho-Ser473
Akt)、及磷-Ser9
GSK-3β(phospho-Ser9
GSK-3β)的抗體購自Cell Signaling Technology公司(美國麻州比佛利市)。磷-Tyr397
FAK(phospho--Tyr397
FAK)的抗體購自Biosource公司(美國加州卡密里洛市)。N-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate購自於Calbiochem公司(美國加州聖地牙哥)。黏合素α5β1蛋白質(integrin α5β1 protein)、抗-β-肌動蛋白抗體(anti-β-actin antibody)、抗-黏合素α5抗體(anti-integrin α5 antibody)、抗-黏合素α5β1抗體(anti-integrin α5β1 antibody)(功能抑制抗體)、辣根過氧酶-耦合之抗-鼠IgG二級抗體(horseradish peroxidase-coupled anti-mouse IgG secondary antibodies)、辣根過氧酶-耦合之抗-兔IgG二級抗體(horseradish peroxidase-coupled anti-rabbit IgG secondary antibodies)、及MTT試驗組係購自於Chemicon公司(美國加州天美克拉市)。抗-BSA抗體(anti-BSA antibody)購自Molecular Probes公司(美國奧勒岡州優琴市)。牛血清蛋白購自Bio Basic公司(加拿大)。Aβ25-35
，購自於Sigma公司(美國密蘇里州聖路易斯市)，溶解於無菌二次蒸餾水並在使用前於37℃熟化3天。硫代黃素T(ThT)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、4',6'-二甲脒基-2-苯基吲哚二乳酸酯(4’,6’-Diamidino-2-phenylindole dilactate,DAPI)及其他化學品假如沒有特別說明係Sigma公司(美國密蘇
里州聖路易斯市)得。Superdex-200、Superdex75購自Amersham Biosciences公司(瑞典Uppsala市)，HW55S凝膠過濾珠從TOSOH公司(日本東京都港區)取得。
纖維狀牛血清蛋白(F-BSA)的製備。
20 mg牛血清蛋白(購自Bio Basic公司)溶解於10 ml含1% SDS(w/v)之磷酸鹽緩衝液。再將此牛血清蛋白溶液震盪5分鐘後，加入Superdex-200管柱或HWS55管柱(2.6 cm x 100 cm)，先以緩衝溶液(25 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、0.1 M NaCl、及0.05%SDS)平衡。收集含牛血清蛋白的區分。收集的區分接著用磷酸鹽緩衝液透析以除去SDS。
穿透式電子顯微鏡(TEM)。
為了以穿透式電子顯微鏡分析纖維狀蛋白質，將1 mg/ml蛋白質加入200-篩目覆碳銅格網。移除過量的樣本且風乾該格網。蛋白質-承載格網以1%(WN)磷鎢酸負染色1分鐘。穿透式電子顯微相片乃是在20,000-150,000x放大倍率，以75 Kv在Hitchi H-7000電子顯微鏡下觀察得到。
硫代黃素T(ThT)螢光。
為了螢光測量，濃度漸增之蛋白質(10 μM、20 μM、及40 μM)在20 μM ThT中培育。在室温培育1小時後，以Wallac VICTOR2
1420多標示計數器(Multilabel Counter)(購自Perkin Elmer life science公司)測量螢光，實驗進行三重複。激發及放射波長分別為355 nm及535 nm。由緩衝液造成的ThT背景訊號會由對應的量測值中減去。
細胞株及處理。
BHK-21細胞(獲自倉鼠腎臟；ATCC CRL-1632)及T47D細胞(獲自人類乳管癌；ATCC HTB-133)在以10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、2 mM L-麩醯胺(L-glutamine)、100單位/ml盤尼西林(penicillin)、及100 μg/ml鏈黴素(streptomycin)補充之Dulbecco氏改質之Eagle氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)中於37℃保存。簡言之，細胞接種24小時後進行處理，細胞以磷酸鹽緩衝液清洗兩次及並以無胎牛血清之DMEM中的蛋白質處理一段指定時間。接著細胞在指定的時間點以0.2 ml溶解緩衝液(購自Pierce公司)溶解，並取30 μg樣品以西方漬染法分析FAK、Akt及GSK-3β
磷酸化作用。
細胞存活試驗。
細胞存活以MTT比色試驗測定。將呈指數生長的細胞(BHK-21細胞為1 x 104
；T47D細胞為1.25x104
)置於96-井盤中含10%胎牛血清的DMEM內並培育24小時。在無血清DMEM中，以一系列濃度的纖維狀蛋白質於37℃進行細胞處理8小時。處理後，MTT溶液加至每一井(0.5 mg/ml)並培育4小時。活細胞數目與甲濳(formazen)生成量成正比，甲濳在溶於異丙醇後，可於ELISA平板讀取器內以光譜儀在560 nm測定而得。
SDS-PAGE及免疫轉印分析。
細胞溶解液(cell lysate)在Hoefer垂直凝膠設備(購自Amersham Biosciences公司)中，以10%SDS-PAGE凝膠溶解，接
著再以電泳傳送至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride membranes)(購自Pall公司)。此膜以5%脫脂奶粉於含5 mM Tris-HCl、pH 7.4、136 mM NaCl、0.1%Tween-20(TBST緩衝液)溶液中阻隔處理1小時，並在阻隔緩衝液中與初級抗體(5-10μ
g/ml)培養。此膜接著以TBST中清洗，接著以辣根過氧酶-共軛二級抗體(購自Chemicon公司)培育。這些抗體乃是藉由曝露至Biomax ML膜(購自Eastman Kodak公司)以化學發光劑(SuperSignal West Pico，購自Pierce公司)檢測。
免疫沉澱試驗。
將蛋白質A/G珠(購自Santa Cruz Biotechnology公司)藉由抗黏合素α5β1抗體塗佈一層黏合素α5β1，取等體積(20μl)的蛋白質A/G，一組有塗佈黏合素α5β1，一組沒有。接著將這兩組蛋白質珠在4℃分別與球狀牛血清蛋白(G-BSA)或纖維狀牛血清蛋白(F-BSA)培育過夜。培養後，免疫複合物以磷酸鹽緩衝液清洗三次並藉由與抗-黏合素α5及抗-牛血清蛋白抗體進行免疫轉印而顯示出來。
硫胱胺酸蛋白脢-3(Caspase-3)活性試驗。
根據製造商提供的指示，caspase-3活性的測試乃是藉由螢光物質z-DEVD-AMC(購自Upstate Biotechnology公司)斷裂來分析。簡言之，收穫的細胞以磷酸鹽緩衝液清洗二次，並在溶解緩衝液(購自Pierce公司)進行細胞溶解，該溶解緩衝液乃是補充蛋白質分解酶抑制劑混合物(購自Sigma公司)的。溶解液(cell lysate)在4℃以
12,000 x g離心15分鐘，且上清液的蛋白質濃度用Bio-Rad蛋白質試驗測定。50 μg細胞溶解液的量在72 μM z-DEVD-AMC中在室溫培育15分鐘後分析硫胱胺酸蛋白脢-3活性(三重複)。z-DEVD-AMC的斷裂乃是以螢光平板讀取器(flurescence plate reader)在380 nm激發後量測在460 nm放射值而決定。
圖示
第5圖。纖維狀牛血清蛋白之細胞凋亡作用。
(圖A)BHK-21細胞以1 μM G-BSA(BSA)或F-BSA(BSA-S200)培育3小時。細胞在螢光顯微鏡下觀察，且其細胞核以DAPI染色(在所有鑲板中放大倍率x400)。(圖B)BHK-21細胞以40 μM Aβ25-35
培育3小時。細胞在螢光顯微鏡下觀察，且其細胞核以DAPI染色(在所有鑲板中放大倍率x400)。(圖C)BHK-21細胞在無血清培養基中以0.8 μM G-BSA或F-BSA培育15小時，接著進行硫胱胺酸蛋白脢-3活性分析。硫胱胺酸蛋白脢-3活性以材料及方法中所提及的方法測量螢光基質(fluorogenic substrate)。數據以平均值±三重複實驗的標準差表示。
第6圖。纖維狀牛血清蛋白(F-BSA)及黏合素α5β1間的互動。
(圖A)T47D細胞株以或不以抗黏合素α5β1抗體預處理30分鐘，接著在無血清培養基中以不同濃度之F-BSA(BSA-S200)處理8小時。處理後，細胞存活由MTT試驗測定。數據以平均值±S.D.(n=3)表示。
(圖B)黏合素α5β1蛋白質藉由抗-黏合素α5β1抗體而連接至蛋白質A/G珠，並接著以F-BSA(BSA-S200)或原態牛血清蛋白(G-BSA)培育過夜。免疫複合物的分離乃是藉由SDS-PAGE和以抗-黏合素α5及抗-牛血清蛋白抗體進行免疫轉印(IB)。
第7圖。纖維狀牛血清蛋白(F-BSA)經黏合素FAK/Akt途徑誘發細胞毒性。
(圖A)在一段指定時間內，BHK-21細胞在無血清培養基以3 μM F-BSA處理，且細胞溶解液使用抗-磷-FAK(Tyr576/577
)或抗-磷-FAK(Tyr397
)為初級抗體的西方漬染法進行分析。(圖B)BHK-21細胞以或不以抗-α5β1抗體預處理30分鐘，接著在一段指定時間，在無血清培養基中以3 μM F-BSA處理。處理後，細胞溶解液藉由使用抗-磷-Akt(p-Akt)及抗-磷-GSK-3β
(p-GSK-3β
為初級抗體(primary antibody)的西方漬染法分析。為求標準化，以β-肌動蛋白做為內部對照組。(圖C)BHK-21細胞在無血清培養基中以濃度漸增之原態牛血清蛋白處理1小時且細胞溶解液使用抗-磷-Akt(p-Akt)為初級抗體進行西方漬染法分析。(圖D)BHK-21細胞在無血清培養基中以或不以抗-α5β1抗體預處理1小時，且細胞溶解液乃是以使用抗-磷-Akt(p-Akt)為初級抗體進行西方漬染法分析。
結果
纖維狀牛血清蛋白誘發BHK-21細胞的細胞凋
亡。為了解釋F-BSA-誘發的細胞毒性是否與細胞凋亡有關，量測DAPI染色及硫胱胺酸蛋白脢-3活性。結果顯示，相較於牛血清蛋白及澱粉狀蛋白質(圖5B)，纖維狀牛血清蛋白會誘發細胞核凝結(圖5A)及增加硫胱胺酸蛋白脢-3的活性(圖5C)。綜言之，實驗結果顯示F-BSA誘發細胞凋亡。
纖維狀牛血清蛋白經由黏合素/FAK/Akt/GSK-3β途徑而誘發細胞死亡。
除了對BHK-21細胞具毒性外，F-BSA亦對癌細胞如T47細胞(一種乳癌細胞株)也具有細胞毒性，如圖6A所示。為了探討F-BSA誘發的細胞凋亡是否經由黏合素，其已知可調控多種程序包含細胞增殖、型態、遷移、及細胞凋亡。將T47D細胞以濃度漸增之抗-α5β1抗體預處理30分鐘，接著在無血清培養基中以F-BSA(例如BSA-S200)培育8小時。細胞存活率結果指出，以抗-α5β1抗體預處理的T47D細胞，F-BSA對細胞的毒性有減低的效果(圖6A)。進一步以免疫沈澱法探討F-BSA及黏合素之間的交互作用，由對照組或與黏合素α5β1蛋白質結合的小珠與牛血清蛋白或F-BSA的培育結果顯示，F-BSA而非牛血清蛋白結合至黏合素α5β1(圖6B)。
接著探討在黏合素信號傳遞途徑之串階(cascade)中有關的分子如局部黏合激酶(focal adhesion kinase,FAK)、Akt及GSK-3β，是否受F-BSA影響。結果顯示
F-BSA會使FAK在397乾酪胺酸位置(Tyr397)進行脫磷反應，且此反應是以時間依賴方式進行，但不是在FAK的576/577(Tyr576/577)乾酪胺酸的位置進行脫磷(圖7A)；同時，西方染漬法亦顯示F-BSA，以時間依賴方式去除Akt以及GSK-3β上的磷酸根(圖7B)，且F-BSA在Akt及GSK-3β磷酸化的作用也可以因濃度漸增的抗-α5β1抗體預處理細胞而回復(圖7B)。相較之下，原態牛血清蛋白和抗-α5β1抗體不影響Akt的磷酸化反應(圖7C及7D)。因此，以上這些結果都說明F-BSA經由黏合素/FAK/Akt/GSK-3β
/caspase-3途徑誘發細胞凋亡。
討論
雖然原態牛血清蛋白不是黏合素的配位基(圖6B)，但纖維狀的牛血清蛋白(F-BSA)卻可藉由結合至黏合素α5β1而造成細胞凋亡(圖5及6)。F-BSA藉由結合至黏合素α5β1造成FAK(Tyr 397)、Akt及GSK-3β的去磷酸化而調控細胞凋亡。在此發明中產生的F-BSA去活化黏合素信號途徑的機制，似乎不同於Aβ所誘發的機制。
雖然牛血清蛋白不具有RGD單元，RGD單元是黏合素的獨特結合單元，但纖維狀牛血清蛋白卻可以結合至黏合素，其機制似乎與是否含有RGD的單元不具有完全相關性。甚至我們發現，雖然有些蛋白質，含有RGD單元具有細胞毒性，但其他如纖維網蛋白，也
具有RGD單元，但纖維網蛋白不具細胞毒性(Fornaro等人發表於Journal of Biological Chemistry
278(50)：50402-504011：2003)。
材料及方法
材料。
抗TLR2之抗體購自Abcam公司。抗-TLR2單株抗體(一拮抗抗體)購自eBioscience公司。對照組IgG、纖維網蛋白(fibronectin,FN)、及辣根過氧酶-耦合抗-兔IgG二級抗體購自於Chemicon公司。牛血清蛋白(BSA)購自Bio Basic公司。抗-牛血清蛋白抗體購自Invitrogen公司。硫代黃素T(ThT)及十二烷基硫酸鈉(SDS)購自於Sigma公司。
重組蛋白質VP3之表現與純化。
VP3為口蹄疫病毒(FMDV)之外套蛋白質組成份。VP3基因以PCR從pIBSY1-P1質體中放大，引子為5'-CCGGGATCCAAGCTTGGGATTTTCCCCGTGGCA-3'及5'-CCGCTCGAGTTGGGTTCGGGCGTCGAC-3'(Yang等人發表於The Journal of Gene Medicine
7：708-717：2005)，其分別於N-終端引入Bam
Hl辨識酶切割位及於C-終端引入Xho
l辨識酶切割位。為了加速由E.coli
衍生的重組蛋白質之VP3純化及分析，分別在VP3基因的N-及C-端接附T7標幟及His標幟。在限制
酶水解後，將此放大的基因接合在pET24a(+)(Novagene,WI)之Bam
Hl及Xho
l位置間並轉形(transform)入DH5α勝任細胞(competent cell)。可辨識的陽性株(positive clone)以定序方法確定。由陽性株之質體pVP3轉形於E.coli
BL21(DE3)勝任細胞。基因重組的VP3(rVP3)在於E.coli.
表現後，依照Wang等人發表於Vaccine
21：3721-3729：2003中的製程純化。
以管柱層析法製備纖維狀蛋白質。
為了製備BSA-S200及FN-S200，以10 ml磷酸鹽緩衝液-溶解之蛋白質(2 mg/ml)溶液，加入SDS(10%；w/v)直至其達到最終濃度為1%，震盪5分鐘後，將含SDS-蛋白質溶液加入Superdex-200管柱(2.6 cm x 100 cm，購自Amersham Biosciences公司)，先以含25 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、0.1 M NaCl、及0.05%SDS的緩衝溶液平衡，再收集含蛋白質的區分。此收集的區分接著以磷酸鹽緩衝液透析4.5小時(3次；1.5小時/次)以除去SDS。
穿透式電子顯微鏡(TEM)。
對於以穿透式電子顯微鏡分析以或未以管柱層析處理的蛋白質，等量蛋白質施用至200-篩目覆碳銅格網。移除過量的樣本且風乾該格網。蛋白質-承載格網以1%(WN)磷鎢酸負染色1分鐘。穿透式電子顯微相片乃是在20,000-150,000x放大倍率，以75Kv在Hitachi H-7000電子顯微鏡下觀
察。
硫代黃素T(ThT)螢光。
為了螢光測量，將濃度漸增之蛋白質於20 μM ThT中培育。在室温培育1小時後，在Wallac VICTOR2
1420多標示計數器(購自Perkin Elmer life science公司)測量螢光，每個測試進行三重複。激發及放射波長分別為355 nm與535nm。由緩衝液造成的ThT背景訊號會由對應的量測值中減去。
細胞株。
小鼠巨噬細胞細胞株RAW264.7及人類胚胎腎臟細胞株(HEK 293T)保存於37℃，於添加10%胎牛血清(FBS)、2 mM L-麩醯胺、100單位/ml盤尼西林及100 μg/ml鏈黴素的Dulbecco氏改質之Eagle氏培養基(DMEM)中，及於含有5% CO2
潮濕空氣下。
SDS-PAGE及免疫轉印分析。
樣品在Hoefer垂直凝膠設備(購自Amersham Biosciences公司)中以10%或12%SDS-PAGE凝膠分離，接著以電泳傳送至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride membrane)(購自Pall公司)。此膜在PBST中以5%之脫脂奶粉阻隔處理1小時，並在阻隔緩衝液中與初級抗體(5-10 μg/ml)培養。此膜接著以PBST清洗，接著以辣根過氧酶-共軛二級抗體(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody)(購自Chemicon公司)培育。抗體的檢測乃是藉由曝露至Biomax ML膜(購自Eastman Kodak公司)以化學發光劑檢測
(chemiluminescence)(SuperSignal West Pico，購自Pierce公司)。
免疫沈澱試驗。
RAW 264.7細胞的溶解是在補充蛋白酶抑制劑的混合物(protease inhibitor mixture)(購自Sigma-Aldrich公司)的冷細胞溶解緩衝液(購自Pierce公司)中進行。等量之蛋白質A/G珠以或未以rVP3-S200覆蓋，此小珠接著與RAW 264.7細胞溶解液在4℃培育過夜，產生的小珠以離心方式收集並以冷溶解液清洗三次。免疫複合物內之蛋白質乃是藉由在SDS試樣緩衝液中沸騰而沖提出來，並以SDS-PAGE與專一抗體免疫轉印(immunoblotted)進行分析。
免疫螢光及共焦顯微鏡。
RAW 264.7細胞之次集生單層(subconfluent monolayer)生長於24-井組織培養皿內的12-mm蓋玻片上，以牛血清蛋白或BSA-S200在4℃中處理1小時，於無胎牛血清補充之Dulbecco氏改質之Eagle氏培養基(DMEM)培育。培育後，以磷酸鹽緩衝液清洗並以4%聚甲醛(paraformaldehyde)固定，固定後，除去聚甲醛，將此單層細胞與初級抗體在室溫培育1小時。進行雙重標示(double labeling)時，細胞與二種抗體一起培育。初級抗體的稀釋比例如下：抗-TLR2(1/10.0)及抗-牛血清蛋白(1/200)。再以PBST清洗三次後，將細胞在室溫下與螢光共軛之二級抗體(secondary antibody)，羊抗-兔IgG(goat anti-rabbit IgG)(1/500；Alexa Fluor
488；購自Molecular Probes公司)或羊抗-鼠IgG(goat anti-mouse IgG)(1/500；Alexa Fluor 555；購自Molecular Probes公司)培育30分鐘。培育後，將此蓋玻片以PBST清洗三次，並放置在LSM 510 META共焦顯微鏡上檢測。
螢光酶報導基因試驗。
人類TLR2在人類胚胎腎細胞(HEK293T)中短暫表現並接著檢測其對樣品的反應。HEK293T細胞的轉染是在pRK-FLAG-TLR2進行，將含有人類TLR2基因或pcDNA3.1空載體做為對照組；pNFkB-Luc含有螢光酶報導基因，受到NF- k
B結合DNA序列而調節。此螢光酶基因僅有當NF- k
B結合至DNA序列時才會表現。為使轉染效率標準化，細胞以pcDNA3.1-β-gal共轉染(cotransfected)。將質體Lipofectamine2000(購自Invitrogen公司)藉由轉染方式(transfection)導入至HEK293T細胞中。簡言之，HEK293T細胞在96-井板中於37℃培育過夜，濃度為2.5x104
細胞/井，培養基為0.1ml以10%熱去活的胎牛血清(FBS)、100單位/ml盤尼西林及100 μg/ml鏈黴素補充之Dulbecco氏改質之Eagle氏培養基(DMEM)。培養基在即將轉染前以Opti-MEMI(購自Invitrogen公司)替換。轉染混合物之製備係藉由在25 μl之OPTI-MEMI培養基稀釋0.3 μl Lipofectamine2000，在該培養基中於室溫培育20分鐘後接著在25 μl OPTI-MEMI加入0.1μg質體DNA(0.01μg/井的pRK-FLAG-hTLR2或
pcDNA3.1做為空載體、0.07μg/井的p5xNFkB-luc報導質體(購自Stratagene公司)及0.02 μg/井的pcDNA3.1-βgal)。DNA-Lipofectamine 2000混合物接著加至細胞並温和振盪混合。在5% CO2
於37℃培育24小時後，細胞以樣品刺激。如陽性對照組，細胞以TLR2配位基Pam3CSK4(購自InvivoGen公司)刺激6小時後，細胞溶解並使用螢光酶試驗系統(購自Promega公司)檢測螢光酶活性。細胞以100 μl磷酸鹽緩衝液清洗二次並以100 μl被動細胞溶解緩衝液(passive lysis buffer)(購自Promega公司)溶解。取20 μl細胞溶解液測量螢光酶活性。每一樣品螢光酶活性標準化至β-半乳糖苷酶(β-galatosidase)活性。實驗數據乃是以被空載體轉染之未受刺激的對照細胞活性的倍數來表示。
細胞激素以ELISA定性分析。
表現TLR2之短暫轉染的HEK293T細胞以及小鼠巨噬細胞細胞株RAW 264.7分別以TLR2-專一配位基或纖維狀蛋白質刺激6或24小時。收集細胞培養基上清液並使用細胞激素-專一性ELISA(購自Biosource International公司之IL-6、IL-8及TNF-α ELISAs)進行分析。
圖示
第8圖。Superdex-200管柱分析促進纖維狀蛋白質的形成。
穿透式電子顯微鏡照片顯示由superdex200管柱分析製備的BSA-S200、rVP3-S200、及FN-S200
之纖維狀結構(圖B、C、及E)。做為對照組的是原態之牛血清蛋白及FN，在穿透式電子顯微鏡照片顯示呈現球狀結構(圖A及D)。由圖F及G顯示BSA-S200或FN-S200與20μM澱粉狀蛋白質-專一染料ThT培育後，與原態牛血清蛋白或FN比較時，得到提高ThT螢光的結果。這些數值得自於三次獨立量測。最終數據以平均值±S.D.(n=3)表示。
第9圖。纖維狀蛋白質與TLR2交互作用。
(圖A)，來自RAW 264.7細胞溶解液與固定於蛋白質A/G珠之rVP3-S200培育過夜或只與蛋白質A/G珠培育過夜；蛋白質A/G珠-結合蛋白質由SDS-PAGE分離並與抗-TLR2抗體或抗-FMDV抗體免疫轉印。牛血清蛋白或BSA-S200在4℃以0.3 μM濃度吸附至RAW 264.7單層(RAW 264.7monolayer)。接著如材料及方法所述進行IF染色，牛血清蛋白或BSA-S200以抗-牛血清蛋白抗體染色並以Alexa Fluor 488(綠)顯現(visualized)(圖B及E)，而TLR2以抗-TLR2抗體染色並以Alexa Fluor 555(紅)顯現如圖C及F。在合併影像(圖G)中的箭號指向一些共定位區域(co-localized area)。
第10圖。藉TLR2纖維狀蛋白質的訊號。
HEK293/TLR2細胞以(圖A)0.3 μM rVP1；(圖B)0.2 μM牛血清蛋白、BSA-S200、FN、或FN-S200，刺激6小時後，細胞溶解，測量NFK
B報導螢光酶量(圖C)，HEK293/TLR2細胞以Pam3CSK4(0.5 μg/ml)或增加濃
度的SDS刺激6小時後，溶解細胞，測量NFK
B報導螢光酶(NFK
B reporter luciferase)量。(圖D)HEK293/TLR2細胞以10 μg/ml中和之抗-TLR2抗體預處理1小時，或以對照組IgG預處理1小時。細胞接著與Pam3CSK4(0.5 μg/ml)、BSA-S200(0.2 μM)、FN-S200、或rVP3-S200(0.2 μM)培育6小時後，溶解細胞，測量NFKB報導螢光酶量。這些數值來自於3個獨立量測。最終數據以平均值±S.D.(n=3)表示。
第11圖。纖維狀蛋白質-誘發細胞激素的產生是經由TLR2。
(圖A)RAW 264.7細胞以不同濃度之牛血清蛋白或BSA-S200培育24小時後，使用ELISA分析培養基的IL-6。(圖B)HEK293/TLR2細胞以10 μg/ml中和之抗-TLR2抗體或對照組IgG預處理1小時。細胞接著以Pam3CSK4(0.5 μg/ml)、BSA-S200(0.2 μM)、FN-S200、或rVP3-S200(0.2 μM)培育6小時後，使用ELISA分析培養基的IL-8。(圖C)RAW 264.7細胞以10 μg/ml中和之抗-TLR2抗體或對照組IgG預處理1小時，接著以BSA-S200(0.2 μM)或FN-S200(0.2 μM)培育24小時後，使用ELISA分析培養基的IL-6。這些數值來自於3個獨立測量。最終數據以平均值±S.D.(n=3)表示。
結果
蛋白質在通過Superdex-200管柱後呈現似澱粉狀蛋白質纖維狀性質。
使用穿透式電子顯微鏡及硫代
黃素T(ThT)試驗分析蛋白質在經Superdex-200管柱管柱層析後的結構特性，穿透式電子顯微鏡分析顯示BSA-S200、rVP3-S200及FN-S200呈現纖維狀結構(圖10B、10C、及10E)。相反地，原態的牛血清蛋白及FN呈現球形結構(圖8A及8D)。似澱粉狀蛋白質原纖維的螢光發射專一染料ThT，將該染料與蛋白質培育。數據顯示BSA-S200及FN-S200以劑量依賴方式增進ThT的螢光發射(圖8F及8G)。
纖維狀蛋白質與TLR2交互作用。
使用免疫沈澱流程進行分析rVP3-S200與RAW 264.7細胞上的TLR2結合作用。在此流程中RAW細胞溶解液會暴露於覆蓋有rVP3-S200的小珠或對照珠之中。連結rVP3-S200的小珠與RAW細胞溶解液的培育結果顯示rVP3-S200會結合至TLR2，而對照組則不會(圖9A)。為了更進一步探討BSA-S200是否與TLR2共定位(colocalized)，進行免疫螢光-共焦顯微鏡檢視。將牛血清蛋白或BSA-S200在4℃加至RAW 264.7細胞1小時，並以共焦顯微鏡測定牛血清蛋白或BSA-S200的定位。結果顯示BSA-S200會與TLR2共定位，而牛血清蛋白則不會(圖9B-G)。
纖維狀蛋白質活化TLR2。
以rVP1-S200(0.3 μM)、BSA-S200(0.2 μM)或FN-S200(0.2 μM)刺激使人類細胞大量表達過度表現TLR2，會導致的刺激作用造成NF K
B的顯著活化作用，但牛血清蛋白與FN的球
狀形式則否(圖10A及10B)。為了更進一步探討調查TLR2的專一性，將TLR2-表現細胞(之HEK293T細胞)以抗-TLR2抗體預處理1小時，細胞接著以Pam3CSK4(0.5 μg/ml)、BSA-S200(0.2 μM)、FN-S200(0.2 μM)、或rVP3-S200(0.2 μM)刺激。Pam3CSK4為一已知之TLR2的配位基(ligand)，可且做為一陽性對照組。於在6小時培育後，細胞溶解、測定NF K
B活化作用。結果發現以抗-TLR2的預處理的細胞顯著降低NF K
B活性，以異型(isotype)抗體預處理的對照組則否(圖10D)。另外，因為本發明中使用SDS製備纖維狀蛋白質，所以也測試SDS對TLR2活化作用的影響。數據顯示隨著SDS增加濃度，對TLR2的活化並無影響(圖10C)。需注意，以SDS處理後通過Superdex-75管柱(BSA-S75)沖提出的牛血清蛋白，顯示會活化TLR2，但相較BSA-S200為低。
纖維狀蛋白質誘發細胞激素的釋放。
RAW 264.7細胞以不同濃度之牛血清蛋白或BSA-S200培育24小時後，使用ELISA分析培養基的IL-6。發現BSA-S200而不是牛血清蛋白，以劑量依賴方式誘發IL-6產生(圖11A)。同時也利用TLR2阻斷抗體(TLR2 blocking antibody)評估TLR2在細胞激素產生的關係。表現TLR2的HEK293T細胞(圖11B)及RAW 264.7細胞(圖11C)以抗-TLR2抗體或對照組IgG預處理1小時，接著以Pam3CSK4(0.5 μg/ml)、BSA-S200(0.2 μM)、
FN-S200(0.2 μM)、或rVP3-S200(0.2 μM)刺激細胞並測量IL-8及IL-6產生。結果顯示BSA-S200、FN-S200及rVP3-S200的存在導致表現TLR2之HEK293T或RAW 264.7細胞產生的IL-8及IL-6量增加。另一方面，抗-TLR2抗體而非對照組IgG的預處理會顯著地降低細胞激素的生產(圖11B及11C)。
討論
免疫沈澱及免疫螢光研究顯示纖維狀蛋白質會結合至TLR2(圖9)。TLR2為類鐸受體(toll-like receptors)之一，負責調節細胞對與微生物共享之保守分子模式(conserved molecular patterns)反應。TLR2可以辨識多種配位基(Miyake.發表於Seminars in Immunology
19：3-10：2007；Kaisho等人發表於Biochimica et Biophysics Acta
1589：1-13：2002)、促進巨噬細胞產生細胞激素(Tsuji等人發表於Infection and Immunity
68：6883-6890：2000；Basu等人發表於The Journal of Biological Chemistry
279：7370-7377：2004)。在此發明中發現以管柱誘發產生的纖維狀蛋白質在RAW 264.7細胞中以劑量依賴方式誘發IL-6產生(圖11A)。RAW 264.7(圖11C)或TLR2表現之HEK293T細胞(圖10C及11B)以抗-TLR2抗體的預處理後，會減少由纖維狀蛋白質誘發之細胞激素產生。這些數據顯示以管柱誘發產生的纖維狀蛋白質為TLR2的促進劑，並誘發免疫細胞釋放細胞激素。
數種研究已說明類鐸受體(toll-like receptors)做為佐劑受體(Hawkins等人發表於The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics
300：655-661：2002)。譬如佛恩得佐劑(Freund adjuvant)誘發在鼠的肝中表現誘發TLR2表現(Lim.發表於International Immunopharmacology
3：115-118：2003)。另外TLR2可調節媒介其脂蛋白配位基-脂蛋白的佐劑活性(Ishii等人發表於Journal of clinical Immunology
27：363-371：2007)。同時TLR2及TLR4也相亦有關於BCG-CWS的免疫反應，BCG-CWS為分枝桿菌(mycobacteria)的組成份，為一種有效的免疫佐劑(Tsuji等人發表於Infection and Immunity
68：6883-6890：2000)。本發明是此研究有關於發現纖維狀蛋白質經由活化經由TLR2的活化作用而誘發細胞激素產生的纖維狀蛋白質的發現。將抗原轉化為纖維狀形式可增加抗原的抗原性。而且，不需額外佐劑。
在這些類鐸受體中，TLR2辨識廣泛範圍的配位基，如格蘭氏陽性細胞壁(Yoshimura等人發表於J Immunol
163：1-5：1999)、脂聚醣(lipopolysaccharides,LPS)(Bainbridge等人發表於Cellular Microbiology
8：120-129：2006；Reife等人發表於Cellular Microbiology
8：857-868：2006；Jotwani等人發表於European Journal of Immunology
33：2980-2986：2003)、孔蛋白(porin)(Massari等人發表於J Immunol
176：2373-2380：2006；Singleton等人發表於J Immunol
174：3545-3550：2005)、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)(Tsuji等人發表於Infection and Immunity
68：6883-6890：2000；Uehori等人發表於Infection and Immunity
71：4238-4249：2003)、脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan)(Underhill等人發表於Proc Nat Acad Sci
96：14459-14463：1999；Means等人發表於J Immunol
163：3920-3927：1999；Tapping等人發表於Journal of Endotoxin Research 9：264-268：2003)、酚可溶之調控蛋白(phenol-soluble modulin)(Najjar等人發表於J Immunol
166：15-19：2001)、病毒粒子(virions)(Compton等人發表於Journal of Virology
77：4588-4596：2003)、醣環己六醇磷脂質(glycoinositolphospholipids)(Campos等人發表於J Immunol
167：416-423：2001)、醣脂類(glycolipid)(Opitz等人發表於The Journal of Biological Chemistry
276：22041-22047：2001)、脂質A(Onier等人發表於International Journal of Cancer
81：755-760：1999；Onier等人發表於Clinical & Experimental Metastasis
17：299-306：1999)、醣脂蛋白(Lopez等人發表於J Immunol
170：2409-2416：2003)、脂蛋白/脂胜肽(Ozinsky等人發表於Proc Nat Acad Sci
97：13766-13771：2000；Hirschfeld等人發表於J Immunol
163：2382-2386：1999)、酵母聚糖
(zymosan)(Underhill等人發表於Nature
401：811-815：1999)、熱休克蛋白質(HSP)(Ohashi等人發表於J Immunol
164：558-561：2000；Asea等人發表於The Journal of Biological Chemistry
277：15028-15034：2002)、細胞外間質(extracelluar matrix,ECM)組成份(雙多醣或玻尿酸)(Schaefer等人發表於The Journal of Clinical Investigation
115：2223-2233：2005；Jiang等人發表於Nature Medicine
11：1173-1179：2005)、高移動性基匣1(high-mobility group box 1,HMGB1)(Park等人發表於The Journal of Biological Chemistry
279：7370-7377：2004)、細菌或病毒蛋白質(Basu等人發表於The Journal of Biological Chemistry
282：1039-1050：2007)、脂磷多醣(lipophosphoglycan,LPG)(Becker等人發表於Molecular and Biochemical Parasitology
130：65-74：2003)、巨噬體活化脂胜肽-2(MALP-2)(Takeuchi等人發表於International Immunology
13：933-940：2001；Schneider等人發表於Gut
53：355-361：2004)、熱致死細菌或酵母(Flo等人發表於J Immunol
164：2064-2069：2000；Netea等人發表於J Immunol
172：3712-3718：2004；Taylor等人發表於The Journal of allergy and Clinical Immunology
117：1148-1154：2004)、外膜蛋白質A(Jeannin等人發表於Nature Immunology
1：502-509：2000)、可溶因子(Wyllie等
人發表於J Immunol
165：7125-7132：2000；Henneke等人發表於J lmmunol
167：7069-7076：2001)、及脂壁酸(lipoteichoic acid,LTA)(Schwandner等人發表於The Journal of Biological Chemistry
274：17406-17409：1999；Han等人發表於Infection and Immunity
71：5541-5548：2003；Schroder等人發表於The Journal of Biological Chemistry
278：15587-15594：2003)。研究亦顯示由TLR2辨識的多種配位基為歸因於雜二聚體與其他TLR、TLR1或TLR6的形成(Bauer等人發表於Proc Nat Acad Sci
98：9237-9242：2001；Sugawara等人發表於Microbiology and Immunology
47：327-336：2003；Takeuchi等人發表於Gene
231：59-65：1999)。已建議TLR1/TLR2的雜二聚體可辨識三醯基化之脂蛋白，同時TLR2/TLR6辨識二醯基化之脂蛋白(Takeuchi等人發表於J Immunol
169：10-14：2002)。
雖然方法及試劑以依目前認為最實用及最佳實施例描述，需瞭解本發明之揭露不限制於文中所揭露之實施例，實施例可能經過熟悉技藝者潤飾及轉用。本發明欲涵括申請專利範圍之技術思想與範疇中不同的潤飾及相似配置，該範圍應依最廣的解釋以涵括所有潤飾及類似結構。本發明包含下列申請專利範圍之任何及所有實施例。
圖1A-E為多種蛋白質的穿透式電子顯微鏡照片。
圖1F為圖示說明硫代黃素T(ThT)相對不同濃度的BSA-S200之螢光量。
圖2A為BSA-Zwit的穿透式電子顯微鏡照片。
圖2B為BSA-HW55S的穿透式電子顯微鏡照片。
圖3A為圖示說明細胞毒性與不同濃度之多種蛋白質之關係。
圖3B為一說明在Akt上且不同濃度之抗-α5β1抗體的BSA-S200之影響的西方染漬照片。
圖3C為圖示說明細胞毒性與不同濃度之BSA-S200與抗-α5β1抗體之關係。
圖4為一長條圖圖示說明，細胞毒性與多種蛋白質的RGD單元與分子量的關係。
圖5A-B為BHK-21細胞與多種蛋白質培育的顯微鏡照片。
圖5C是圖示說明caspase-3活性。
圖6A為圖示說明細胞毒性與不同濃度BSA-S200之關係。
圖6B為說明結合蛋白α5β1蛋白質與BSA-S200及原態牛血清蛋白結合的免疫轉印照片。
圖7A-D為以F-BSA及抗-黏合素α5β1抗體處理
之BHK-21細胞的西方染漬。
圖8A-E為顯示多種蛋白質結構的穿透式電子顯微鏡照片。
圖8F-G為圖示說明ThT螢光量與不同濃度之BSA-S200及FN-S200之關係。
圖9A為一說明結合抗-TLR2抗體及抗-FMDV抗體至源自RAW 264.7細胞的溶解液的免疫轉印照片。
圖9B-G為牛血清蛋白及BSA-S200的免疫螢光染色照片。
圖10A-D說明以多種蛋白質處理之細胞的NFKB報導螢光酶量。
圖11A-C為圖示說明不同濃度之多種蛋白質培育的RAW 264.7細胞之IL-6與IL-8表現。
Claims (27)
- 一種製造纖維狀蛋白質的方法，該方法包括：提供一分離或純化之球狀蛋白質；形成含該分離或純化之球狀蛋白質的溶液；在含有該分離或純化之球狀蛋白質的溶液內加入一皂化劑，該皂化劑係選擇自十二烷基硫酸鈉(SDS)及n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate其中一者；將該溶液加入至孔洞大小允許分離至少70kDa分子量蛋白質之分子分級管柱，以促進該分離或純化之球狀蛋白質形成該纖維狀蛋白質；及由該管柱中沖提出該纖維狀蛋白質，其中所沖提出的該纖維狀蛋白質具有纖維狀的結構。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該分離或純化之球狀蛋白質為下列蛋白質其中之一：白蛋白；纖維網蛋白；口蹄疫病毒的重組外套蛋白質VP1(rVP1)；口蹄疫病毒的重組外套蛋白質VP2(rVP2)；口蹄疫病毒的重組外套蛋白質VP3(rVP3)；VP1、VP2、VP3、及VP4的前驅蛋白質P1；及含有選自由VP1、VP2、VP3及VP4組成之組群中之至少二種蛋白質部分的嵌合蛋白質。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，更包括：分離被沖提之該纖維狀蛋白質。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，更包括：移除該皂化劑。
- 一種用以生產疫苗佐劑的方法，該方法包括：提供一分離或純化之球狀蛋白質；形成含該分離或純化之球狀蛋白質的溶液；在含有該分離或純化之球狀蛋白質的溶液內加入一皂化劑，該皂化劑係選擇自十二烷基硫酸鈉(SDS)及n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate其中一者；將該溶液加入至一孔洞大小允許分離至少70kDa分子量蛋白質之分子分級管柱，以促進該纖維狀蛋白質由該分離或純化之球狀蛋白質形成；由該管柱沖提出該纖維狀蛋白質；及結合該纖維狀蛋白質及一抗原以形成該疫苗。
- 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該纖維狀蛋白質活化TLR-2。
- 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該纖維狀蛋白質誘發與TLR-2相關之細胞激素之產生。
- 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該細胞激素為IL-6及IL-8之一。
- 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該纖維狀蛋白質係一疫苗佐劑。
- 一種製造纖維狀蛋白質的方法，該方法包括：提供一分離或純化之球狀蛋白質；形成含該分離或純化之球狀蛋白質的溶液；在含有該分離或純化之球狀蛋白質的溶液內加入皂化劑n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate；將該溶液加入至一孔洞大小允許分離至少70kDa分子量蛋白質之分子分級管柱，以促進該纖維狀蛋白質由該分離或純化之球狀蛋白質形成；及由該管柱沖提出該纖維狀蛋白質。
- 如申請專利範圍第10項所述之方法，更包括：分離被沖提之該纖維狀蛋白質。
- 如申請專利範圍第11項所述之方法，更包括：移除該皂化劑。
- 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該分離或純化之球狀蛋白質包括白蛋白。
- 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中係於含有該分離或純化之球狀蛋白質的溶液內加入該皂化劑直至最終濃度為1%。
- 一種用以製造一纖維狀蛋白質的方法，該方法包括：提供一分離或純化之球狀白蛋白；形成含該分離或純化之球狀白蛋白的溶液；在含有該分離或純化之球狀白蛋白的溶液內加入一皂化劑，該皂化劑係選擇自十二烷基硫酸鈉(SDS)及n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate其中一者；將該溶液加入至一孔洞大小允許分離至少70 kDa分子量蛋白質的分子分級管柱，以促進該纖維狀蛋白質由該分離或純化之球狀白蛋白形成；沖提該管柱中的該纖維狀蛋白質，其中所沖提出的該纖維狀蛋白質具有纖維狀的結構。
- 如申請專利範圍第15項所述之方法，更包括：分離被沖提之該纖維狀蛋白質。
- 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中係於含有該分離或純化之球狀白蛋白的溶液內加入該皂化劑直至最終濃度為1%。
- 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該皂化劑包括十二烷基硫酸鈉(SDS)。
- 一種醫藥組合物，包括有效量的如申請專利範圍第1項所述之方法製成的纖維狀蛋白質以及一醫 藥上可接受的載體。
- 一種用以引發癌細胞凋亡的醫藥組合物，其包括有效量的如申請專利範圍第1項所述之方法製成的該纖維狀蛋白質，以及一醫藥上可接受的載體。
- 如申請專利範圍第20項之用以引發癌細胞凋亡的醫藥組合物，其中一癌細胞與該纖維狀蛋白質接觸時，該纖維狀蛋白質係結合至該癌細胞的黏合素。
- 如申請專利範圍第21項之用以引發癌細胞凋亡的醫藥組合物，其中該纖維狀蛋白質結合至該黏合素時，抑制細胞中Akt訊息傳遞路徑。
- 如申請專利範圍第21項之用以引發癌細胞凋亡的醫藥組合物，其中所述的該纖維狀蛋白質結合至該黏合素時，活化細胞的procaspase9、-7或-3。
- 一種治療癌症的醫藥組合物，其包括有效量的如申請專利範圍第1項所述之方法製成的該纖維狀蛋白質，以及一醫藥上可接受的載體。
- 如申請專利範圍第24項之治療癌症的醫藥組合物，其中一癌細胞與該纖維狀蛋白質接觸時，該纖維狀蛋白質係結合至該癌細胞的黏合素。
- 如申請專利範圍第25項之治療癌症的醫藥組合物，其中該纖維狀蛋白質結合至該黏合素時，抑制細胞中Akt訊息傳遞路徑。
- 如申請專利範圍第25項之治療癌症的醫藥組合物，其中所述的該纖維狀蛋白質結合至該黏合素 時，活化細胞的procaspase9、-7或-3。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW200540181A (en) * | 2004-06-08 | 2005-12-16 | Academia Sinica | Apoptosis-inducing polypeptides |
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|---|---|---|---|---|
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2009
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI285111B (en) * | 2003-05-29 | 2007-08-11 | Academia Sinica | VP1 of foot-and-mouth disease virus |
| TW200540181A (en) * | 2004-06-08 | 2005-12-16 | Academia Sinica | Apoptosis-inducing polypeptides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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