TWI270348B - Use of acid-stable proteases in animal feed - Google Patents

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1270348 A7 ------ B7 _ 五、發明說明（/ ) 枝術背暑 本發明係關於酸安定性蛋白酶用於動物飼料之用途〈 活體內〉’以及該等蛋白酶用於處理植物蛋白質之用途〈 試管內〉。 蛋白質爲動物及人類之必須營養因子。大部分的家畜 和很多人類是從植物蛋白質來源獲得必須的蛋白質。重要 的植物蛋白質來源有，例如油籽作物，豆類及榖類。 當如黃豆粕被包含於單胃動物，例如豬及家禽，之飼 料時’黃豆粕固體中有一顯著的部分無法被消化。例如在 小豬及成長的豬隻中明顯的迴腸的蛋白質消化率僅有大約 80%。 單胃動物和很多魚類的胃顯示很強的酸性pH値。然 而大部分的蛋白質的消化是發生在小腸。因此需要一種在 通過胃後能存活的酸安定性蛋白酶。 枝術背景 將蛋白酶用於動物飼料或用於處理植物蛋白質已見於 下列文獻： WO95/28850揭示i.a.—種包括植酸酶及蛋白水解酵素 之動物飼料添加物。多種蛋白水解酵素被具體說明於第7 頁。 W〇96/05739揭示一種包括木聚糖酶和一種蛋白酶之 酵素飼料添加物。合適的蛋白酶被列舉在第25頁。 W095/02044揭示i.a·衍生自棘孢麵黴（Aspergillus aculeatus)之蛋白酶，以及其用於動物飼料之用途。 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .19--------T------- 1270348 A7 __B7_ 五、發明說明（3 ) 蛋白酶，相對於其在最適溫度之蛋白酶活性，在pH 9.0， 15°C和80°C之間的蛋白酶活性； (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 發明夕詳細說明 本文所用蛋白酶（protease) —詞，係指可水解肽鍵之 酵素（具蛋白酶活性）。蛋白酶又稱爲例如肽酶（ peptidases)，蛋白酶（proteinases)，肽水解酶（peptide hydrolases)，或蛋白水解酵素（proteolytic enzymes) 〇 用於本發明較佳之蛋白酶爲內生型，其係作用於多肽 鏈的內部（肽鏈內切酶）。肽鏈內切酶顯示在胺基-及羧基 -末端阻斷之肽基質之活性，其與討論中之蛋白酶的特異 性有關。 上述蛋白酶之定義包括任何屬於EC目錄（NO IUBMB，1992之酵素命名法1992)中EC 3·4酵素組群（ 包括其13個次-次類中任一者）之酵素，並隨著定期補充 與更新，見於例如全國資訊網（www ) httn-//www nhem.qmw.ac.uk/iubmb/enzvme/index.html 〇 蛋白酶基於其催化機制分成下列類別：絲胺酸蛋白酶 (S)，半胱胺酸蛋白酶（C)，天冬胺酸蛋白酶（A)， 金屬蛋白酶（M)，及未知的或尙未分類的蛋白酶（U)， 見於 A· J. Barrett，N· D· Rawlings, J. F· Woessner 編著，學 術出版社（1988 )之蛋白水解酵素手冊（Handbook of Proteolytic Enzymes )，特別是一般介紹的部分。 本文所揭示之奴氏菌屬（NocardioPsis)蛋白酶係絲胺 酸蛋白酶。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1270348 A7 _____B7___ 五、發明說明（屮） 在一特定具體實施例中，根據本發明所用之蛋白酶爲 絲胺酸蛋白酶。絲胺酸蛋白酶一詞係指如前述手冊所定義 之絲胺酸肽酶及其族（clans)，於該手冊1988年版本中 ，絲胺酸肽酶及其族被討論於第1-175章。絲胺酸蛋白酶 可被定義爲肽酶，其催化機制決定於絲胺酸殘基上之羥基 ，其係用作攻擊肽鍵之親核物質。根據本發明所用之絲胺 酸蛋白酶的例子爲上述手冊定義之SA族之蛋白酶，例如 S2家族（Streptogdsin)，例如S2A次-家族（α _分解蛋 白酶） 蛋白酶之活性可利用任何分析法測量，於其中使用一 種基質，其含有與討論中之蛋白酶的特異性有關之肽鍵。 分析-ΡΗ及分析_溫度同樣被適用於討論中之蛋白酶。分析 -pH値的例子爲ΡΗ5，6，7，8，9，10或11。分析-溫度 的例子爲 25，30，35，37，40，45，50，55，60，65，或 70〇C 0 蛋白酶基質的例子爲酪蛋白及pNA-基質，例如Sue-AAPF-pNA (例如可從 Sigma S-7388 得到）。此 pNA-基 質中之大寫字母係指一個字母的胺基酸碼。另一個例子爲 Protazyme AK (由Megazyme T-PRAK製得呈錠劑的天青 苯胺染料（azurine)染色之交聯酪蛋白）·。對pH-活性及 pH-安定性之硏究而言，PNA-基質較佳。然而，對溫度一 ， V . 活性硏究而言，Protazyme AK-基質較佳。 蛋白酶分析之例子被描述於實驗部分。.、（ 根據本發明所使用之蛋白酶之來源並未有限定。函;it, -'、· 6 I紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------tr--------- 1270348 A7 ___B7 ___ 五、發明說明（夂） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，蛋白酶一詞不僅包括天然或野生型蛋白酶’而且也包括 其任何顯示蛋白酶活性之突變體、變異體、片段等等’以 及合成的蛋白酶，例如shuffled蛋白酶’及保留（ consensus)蛋白酶。該等基因工程蛋白酶可如此技藝一般 所習知者製備，例如利用定點誘變（site-directed Mutagenesis)，利用PCR(使用含有所欲突變之PCR片 段作爲PCR反應中引物之一），或是利用隨機突變。保留 (consensus)蛋白質之製備描述於例如EP 897985。 根據本發明所使用之酸安定性蛋白酶的例子爲 、. (i) 衍生自奴氏菌（Nocardiopsis sp·) NRRL 18262 及白色奴氏菌（Nocardiopsisalba)之蛋白酶； (ii) 具有與（〇中任一之蛋白酶至少6〇，65，70， 75，80，85，90，或至少95%胺基酸同一性之蛋白酶； (iii) 具有與序列辨識編號·· 1，及/或序列辨識編號 :2中之任一者至少60，65，70，75，80，85，90，或至 少95%同一性之蛋白酶； 對於同一性百分比之計算，可利用此技藝所知道的任 何電腦程式，該等電腦程式的例子有Clustal V algorithm ( Higgins, D. G., and Sharp, P.M. (1989), Gene (Amsterdam), 73, 237-244);及GCG第8版程式套裝（威斯康辛套裝 之程式手冊（Program Manual for the Wisconsin Package) ，第 8 版，Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison，Wisconsin，USA 5371 1 )提供之 GAP 程式（ Needleman，S.B·及 Wunsch，C.D·，（1970)，分子生物學期刊 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） ’ ’ 1 . . j ； 1270348 A7 _B7_____ 五、發明說明（έ ) (Journal of Molecular Biologly ) , 48, 443 — 453 ) o 當以Clustal V algorithm計算兩個蛋白質序列間同一 性之百分比時，使用一PAM 250殘餘重量表，以及 Lasergene 成套軟體（DNASTAR Inc.，1228 South Park Street，Madison, Wisconsin 53715，US)中 MegAlign 程式 ，v4.03之默認設定。多重校準之默認設定係gap penalty 爲10及gap length penalty爲10。下列設定被用來計算兩 個蛋白質序列間同一性之百分比：Ktuple爲1，gap penalty 爲3，視窗爲5，及5對角儲存。 當使用GAP，應用下列設定作多肽序列比較：GAP creation penalty 爲 5.0 及 GAP extension penalty 爲 0·3 〇 在一特定具體實施例中，根據本發明所使用之蛋白酶 爲微生物的蛋白酶，該微生物的一詞係指該蛋白酶係衍生 自或源自一微生物，或者是衍生自微生物之一類似物、片 段、變異體、突變體、或合成的蛋白酶。其可以在原始的 野生型微生物菌株、另一微生物菌株、或植物中產生或表 現；亦即此一名詞包括野生型、天然存在的蛋白酶之表現 ，以及重組的，基因工程的或合成的蛋白酶在任何宿主的 表現。 本文所用微生物一詞包括古生菌，細菌，真菌，病毒 等等。

微生物的例子有細菌，例如放線菌門（phylum Actinobacteria) phy· ηον·的細菌，如綱I的：放線菌（ Actinobacteria)，如次綱 V 的：Actinobacteridae，如目 I 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .9 訂—------ 1270348 A7 _B7 __ 五、發明說明（7 ) 的：放線菌目（Actinomycetales)，如次目ΧΠ的：鏈孢 子囊目（Streptosporangineae)，如科II的：奴氏菌科（ Nocardiopsaceae )，如屬 I 的··奴氏菌屬（Nocardiopsis ) ，如奴氏菌NRRL 18262及白色奴氏菌（Nocardiopsis alba );或其顯示蛋白酶活性之突變體或變異體。此分類法係 以Bergey之系統細菌學手冊（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)，第 2 版，2000，Springer (出 版前之非正式樣本：Road Map to Bergey’s)爲基礎。 另外的微生物例子有真菌，如酵母菌或絲狀真菌。 在另一具體實施例中，該蛋白酶爲一植物蛋白酶。植 物來源之蛋白酶的一個例子爲來自瓜類水果果肉之蛋白酶 (Kaneda 等人，J· Biochem· 78, 1287- 1296 ( 1975 )。 動物一詞包括所有的動物，包括人類。動物的例子爲 非反芻動物，及反芻動物，例如牛、羊和馬。在一特定具 體實施例中，該動物爲非反芻動物。非反芻動物包括單胃 動物，如豬（pig或swine)(包括但不限於小豬，成長的 豬和牡豬）；家禽例如火雞和雞（包括但不限於肉雞（ boiler chicken)，產卵雞）；年輕的小牛；及魚（包括但 不限於鮭魚）。 飼料或飼料組成物一詞意指任何適於或意欲讓動物攝 食之化合物，製劑，混合物，或組成物。 根據本發明之使用，蛋白酶可在飮食之前、之後、或 同時餵予動物；較佳爲後者。 在本發明上下文中，酸安定性一詞係指·純蛋白酶酵素 9 尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐) ---- -^----»I ---------IT--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 ______B7_____ 五、發明說明（《） 在相當於a28Q= l_〇之稀釋液，於下述緩衝液中 100 mM 琥珀酸，100 mM HEPES，100 mM CHES， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 100 mM CABS，1 mM CaCl2，150 mM KC卜 0·0”/〇 Triton® X-100，pH 3.5， 在37°C培養2小時後之蛋白酶活性至少爲參考活性之40% ，其係利用如本文中實施例2C所描述之分析法測得（基 質：Suc-AAPF-pNA，pH 9.0，25°C )。 在上述酸安定性定義之特定具體實施例中，蛋白酶活 性爲參考活性之至少45，50，55，60，65，70，75，80， 85，90，95 或至少 97%。 參考活性一詞係指同一蛋白酶以純的形式，在相當於 Α28〇=1·〇之稀釋液，於下述緩衝液中：100 mM琥珀酸， 100 mM HEPES，100 mM CHES，100 mM CABS，1 mM CaCl2，150 mM KC1，0.01% Triton® X-100，pH 9·0，在 5 °C培養2小時後之蛋白酶活性，其中該活性係如上所述測 定。 換言之，測定酸安定性之方法包括下列步驟： a)欲測試之蛋白酿樣品（以純的瑕式’ A28q= 1.〇)被 分成兩等份試樣（I及II); 1〇等份試樣1在37°(：及？1^3.5培養2小時； cO測量等份試樣I之殘餘活性（pH9·0及25°C); d) 等份試樣II在5°C及pH 9.0培養2小時； e) 測量等份試樣II之殘餘活性（pH 9.0及25°C); f) 計算相對於等份試樣II之殘餘活性的等份試樣I之 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1270348 A7 _ 一 _B7__ 五、發明說明（1 ) 殘餘活性之百分比。 或者，在上述酸安定性之定義中，步驟b)緩衝液pH 値可爲 1·〇，1.5，2.0，2.5，3.0，3.1，3.2，3.3，或 3·4。 在上述酸安定性定義有關上述可選擇之步驟b)緩衝 液pH値之其他可選擇的具體實施例中，當與參考値比較 ，該殘餘蛋白酶活性係至少5，10，15，20，25，30，35 ，40 ， 45 ， 50 ， 55 ， 60 ， 65 ， 70 ， 75 ， 80 ， 85 ， 90 ， 95 或 至少97% 〇 在可選擇的具體實施例中，pH 6.0，6.5，7.0，7.5 , 8.0，或8·5之pH値可應用至步驟d)緩衝液。 在上述酸安定性定義中，A28Q= 1.0 —詞意指該純蛋白 酶之濃度（稀釋液）可使在1公分光徑之比色杯於280 nm 之光吸收，相對於緩衝液空白對照，提高1.0。 又在上述酸安定性定義中，純蛋白酶一詞係指A28q/ A26〇比値高於或等於1·70之樣品（見實施例2E)，且其藉 由掃描一考馬斯染色SDS-PAGE凝膠，測得對應於該蛋白 酶之帶具有其掃描強度的至少95% (見實施例2A)。或 者，該A28G/ A26G比値係高於或等於1.50，1.60，1.65 , 1.70，1·75，1.80，1.85，或高於或等於 1·90。 然而’根據本發明之使用，該蛋白酶不需要那麼純； 例如它可以含有其它酵素，甚至其它蛋白酶，在此例中， 它可稱作蛋白酶製劑。但是，一個定義明確的蛋白酶製劑 爲有利的。例如，一個實質上沒有其它蛋白酶干擾或污染 之蛋白酶較易被正確地給藥至飼料中。正確地給藥一詞特 11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） ' " I------III ---I I--It------------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 __________B7______ 五、發明說明（) 別是指得到一致且固定的結果之目的，及基於所欲效果之 最理想劑量的能力。 在一特定具體實施例中，呈添加入飼料中之形式，或 被包含於一飼料添加物中之蛋白酶係定義明確的。定義明 確係指以尺寸-排阻層析法（size-exclusion chromatography )測定時，該蛋白酶製劑爲至少50%純的（見實施例8) 〇 在其他特定具體實施例中，該蛋白酶製劑以此方法測 定時爲至少 60，70，80，85，88，90，92，94，或至少 95 %純的。 或者’定義明確一詞係指該蛋白酶製劑於一適當的尺 寸-排阻管柱之劃分分離顯示只有一個主要的蛋白酶成分。 熟練的工作者將知道如何選擇適當的尺寸_排阻層析柱 。他可起始自例如在一來自Amersham Pharmacia Biotech 之HiLoad26/60 Superdex75pg管柱上劃分分離製劑（見實 施例8)。如果尖峰未被淸楚分離，則可試不同的管柱（ 例如，具一經修正之管柱顆粒大小及/或柱長），及/或他 可修正樣品體積。藉由簡單且一般的嘗試錯誤法，從而達 成一具足夠解析力（淸楚分離的尖峰）之管柱，以此爲基 礎如實施例8所述進行純度的計算。 蛋白酶製劑可（a)直接加入飼料（或直接用於植物蛋 白質之處理過程），或（b)可用於製造一或多種中間的組 成物，例如隨後加入飼料之飼料添加物或預混物（或用於 處理過程）。不論是根據前述（a)或（b)使用，前述之 12 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐) " ' - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) AW:-------1T---------線▲ 1270348 B7 五、發明說明（Η ) 純度係指原始蛋白酶製劑的純度。 具有此量級純度之蛋白酶製劑尤其可利用重組的製造 方法獲得，鑒於他們不是那麼容易得到，且當蛋白酶係以 傳統發酵法製造時，亦容易遭受到非常高的批與批之間之 變異性。 此種蛋白酶製劑當然可與其它酵素混合。 在一特定具體實施例中，根據本發明所用之蛋白酶， 除了爲酸安定的，亦具有接近中性的pH -活性最適値。 接近中性的pH-活性最適値一詞意指下列一或多者： 該pH-最適値在pH 6.0 — 11.0之間，或pH 7.0 — 11.0之間 ，或 pH 6.0— 10.0 之間，或 pH 7.0 — 1〇.〇 之間，或 pH 8·0 一 11·〇之間，或pH 8.0 — 10.0之間（見本文中實施例2Β 及圖2)。 在另一特定具體實施例中，根據本發明所用之蛋白酶 ，除了爲酸安定的，亦爲耐熱性的。 耐熱性的一詞意指下列一或多者：溫度最適値在至少 50°C，52°C，54°C，56°C，58t，60°C，62°C，64°C，66 °C，68°C，或至少70°C，參考本文中實施例2D及圖3。 在又一特定具體實施例中，根據本發明所用之蛋白酶 ，依照本文中實施例4之試管內模型，能夠溶解植物蛋白 質。 本文所用植物蛋白質一詞係指任何化合物，組成物， 製劑或混合物，其包括至少一衍生自或源自植物之蛋白質 ，包括修飾性蛋白質和蛋白質-衍生物。在特定具體實施 13 尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱1 ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -0 --訂---------線 1270348 A7 ___B7_ 五、發明說明（Q ) 例中，該植物蛋白質的蛋白質含量爲至少10，20，30，40 ，50，或 60% ( w/w ) 0 植物蛋白質可衍生自植物蛋白質來源，例如豆類及穀 類，如來自豆科（Fabaceae，Leguminosae )，十字花科， 藜科，及木本科之植物的材料，例如黃豆粕，羽扇豆粗粉 ，及油菜籽粕。 在一特定具體實施例中，該植物蛋白質來源爲來自一 或多種豆科植物之材料，例如黃豆，羽扇豆，豌豆，或豆 〇 在另一特定具體實施例中，該植物蛋白質來源爲來自 —或多種藜科植物之材料，例如甜菜（beet，sugar beet) ，菠菜或美國野藜。 植物蛋白質來源的其它例子爲油菜籽，及甘藍。 黃豆爲一較佳的植物蛋白質來源。 植物蛋白質來源的其它例子爲榖類，例如大麥，小麥 ，黑麥，燕麥，玉米（maize，corn)，米，及高梁。 根據本發明之以至少一種酸安定性蛋白酶處理植物蛋 白質，會增加植物蛋白質的溶解。 下列爲利用本發明蛋白酶可得到之溶解了的蛋白質百 分比的例子：至少 74.0%，74.5%，75.0%，75.5%，7&0 %，76.5%，77.0%，或至少77.5%，參考本文中實施例4 之試管內模型。 蛋白質的溶解一詞基本上意指使蛋白質成爲溶液。該 溶解可能是由於蛋白酶居間之蛋白質從通常複合的天然組 14 I氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------- -------r---i --------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 ____B7______ 五、發明說明（β ) 成物，如飼料，的其它成分的釋放。溶解可經由對照於不 經蛋白酶處理之樣品之可溶性蛋白質量之增加來測量（見 本文實施例4)。 在一處理方法之特定具體實施例中’該討論中之蛋白 酶係對植物蛋白質或蛋白質來源，影響（或作用於）或施 加它的溶解影響力。爲了達到這個目的，植物蛋白質或蛋 白質來源典型地被懸浮於一溶劑，例如水性溶劑，如水中 ，並注意根據討論中之酵素的特性調整pH及溫度値。例 如，該處理可發生在一 pH値，在該pH値該實際蛋白酶之 相對活性爲至少50，或60，或7〇，或80，或90%。同樣 地，例如，該處理可發生在一溫度，在該溫度該實際蛋白 酶之相對活性爲至少50，或60，或7〇 ,或80，或90% ( 這些相對活性係如本文中實施例2所定義）。持續該酵素 反應直至達到所欲的結果。之後可以或不需藉由不活化酵 素來停止該酵素反應，例如藉由〜熱處理步驟。 在另一本發明處理方法之特定具體實施例中，該蛋白 酶作用爲緩效的（sustained)，意即，例如蛋白酶被加至 植物蛋白質或蛋白質來源’但是它的溶解影響力可說是直 到之後被需要時’ 一旦合適的溶解條件被建立，或一旦任 何酵素抑制劑被失活才被啓動’或任何其它已可被應用來 延遲酵素作用之方法。 在一具體實施例中，該處理爲動物飼料或用於動物飼 料之植物蛋白質之預處理’即該蛋白質在攝食前被溶解。 增進動物飼料之營養價値一詞係指增進蛋白質之可利 15 尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X 297公釐）^-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1270348 B7 五、發明說明（丨t ) 用性’從而導致增加的蛋白質萃取，較高的蛋白質產率， 及/或增進蛋白質的利用。因此增加了飼料的營養價値，以 及增進了動物的生長率及/或體重增加及/或飼料轉換（即 相對於增加的體重之飼料攝取量）。 蛋白酿可以任何形式加入飼料中’其可爲相當純的蛋 白酶’或與其它欲添加入動物飼料之成分成爲混合物，換 言之’呈動物飼料添加物的形式，例如所謂之動物飼料預 混物。 動物飼料添加物 除了酸安定性蛋白酶之外，本發明動物飼料添加物含 有至少一種脂溶性維生素，及/或至少一種水溶性維生素， 及/或至少一種微量礦物質，及/或至少一種巨量礦物質。 另外，選擇性的，飼料添加物成分爲著色劑，香味化 合物，安定劑，及/或至少一種選自植酸酶EC 3· 1· 3. 8或 3· 1· 3· 26 ;木聚糖酶EC 3· 2· 1· 8 ;聚半乳糖酶EC 3· 2. 1· 89 ;及/或β -聚葡萄糖酶EC 3· 2· 1· 4之其它酵素（EC 係指酵素分類，根據NC-IUBMB， 1992之酵素命名法 1992 )，亦參見全國資訊網 ( WWW ) http://www.chem.qmw.ac.Uk/iubmb/er17yme/index.ht^j 〇 在一特定具體實施例中，這些其它的酵素爲定義明確 的（如前述對蛋白酶製劑之定義及例示，i.a·參考實施例 8) 〇 通常脂溶性和水溶性維生素，以及微量礦物質形成欲 加入飼料之所謂預混物之一部分，而巨量礦物質則通常被 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------^---I --------訂--------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 ___ 五、發明說明（β ) 分開加入飼料。這些組成物型式之任一者，當以本發明酸 安定性蛋白酶強化時，均爲本發明之動物飼料添加物。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在一特定具體實施例中，本發明動物飼料添加物意欲 以 0.01—10 % ;更特別爲 0·05 —5·0 % ;或 0.2—1.0 % 之程度（％係指每100克飼料中添加物克數）被包含於（ 或規定使其被包含於）動物飮食或飼料中。這特別是對預 混物而言。 因此，動物飼料添加物例如預混物中個別成分之濃度 ，可藉由將同一成分在最終飼料中濃度，分別乘上10 -10000 ; 20 — 2000 ;或100— 500而得到（參照前述三個百 分比包含間距）。 該等個別的飼料及飼料添加物成分之合適的最終濃度 (即飼料中濃度）之基準表示於下表Α。 下列爲這些成分之非限制性例示： 脂溶性維生素的例子有維生素A，維生素D3，維生素 E，及維生素K，例如維生素K3。 水溶性維生素的例子爲維生素B12，生物素及膽鹼， 維生素B1，維生素B2，維生素B6，菸鹼酸，葉酸，及泛 酸鹽（panthothenate)，例如 Ca-D-泛酸鹽。 微量礦物質的例子有鎂，鋅，鐵，銅，碘，硒，及鈷 〇 巨量礦物質的例子爲鈣，磷，及鈉。 這些成分之營養需求量，以家禽及小豬/豬爲例，列於 下表A中。營養需求量係指這些成分應以所示濃度提供於 17 ^^尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱3 — 1270348 A7 __— __B7 _ 五、發明說明（Μ ) 飮食中。這些數據係依照： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) NRC，豬的營養素需求量，第9修訂版1988，豬的營 養學次委員會，動物營養學委員會，農業局，國家硏究會 ，國家學術出版社，華盛頓，D，C，1988 ;及 NRC，家禽的營養素需求量，第9修訂版1994，家禽 營養學次委員會，動物營養學委員會，農業局，國家硏究 會，國家學術出版社，華盛頓，D，C，1994。 或者，本發明動物飼料添加物包括至少一種表A具體 說明的個別成分。至少一種係指一種或更多種的，一，或 二，或三，或四等等，直到所有的十三種，或直到所有的 十五種個別成分。 更具體地，此至少一種個別成分係以一種可提供其飼 料中濃度在表A中欄4，或欄5，或欄6所示範圍內的量 ，被包含於本發明添加物中。 如上述說明，相對應之飼料添加物濃度可藉由將這些 範圍之間距範圍乘上10- 1〇0〇〇;2〇_2〇〇〇;或1〇〇一 500 而得到。舉例而言，考慮到維生素A於預混物的含量要相 當於10- 10000 IU/公斤之飼料含量。此運用可導致下列間 距：每公斤添加物100 — 108 IU ;或200— 2xl07 m ;或 1000- 5X106 IU。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297^5^ 1270348 A7 B7 五、發明說明（/7 )

表A 營養素需求量一及較佳範圍 每kg飮食 提供之營養素 家禽 小猪勝牡豬 範圍1 範圍2 範圔3 脂溶雛生素 維生素 A/[IU] -5000 1300-4000 10—10000 50—8000 100-6000 維生素 MIU] 一 1100 150—200 2—3000 5 - 2000 10 -1500 維生素 E/[IU] -12 11 一 22 0.02-100 0.2-80 0.5-50 維生素 K/[mg] 0.5 -1.5 -0.5 0. 005-10,0 0.05-5.0 0.1 ~3.0 水溶雖生素 BiVfmg] 一 0.003 0.005 - 0.02 0. 0001-1.000 0.0005- 0.500 0.001 -0.100 生物素/[mg] 0.100 -0.25 0.05 - 0.08 0.001 — 10.00 0.005 — 5.00 0.01- 1.00 膽鹼/[mg] 800— 1600 300—600 1 — 10000 5 - 5000 10—3000 微量礦物質 賴mg] -60 2.0—4.0 0.1-1000 0.5-500 1.0 —100 鋅/[mg] 40—70 50 -100 1 一 1000 5-500 10 - 300 鐵/[mg] 50 - 80 40-100 1-1000 5-500 10—300 銅/[mg] 6-8 3.0—6.0 0.1-1000 0.5 — 100 1.0-25 碘/[mg] 一 0.4 -0.14 0.01 — 100 0Ό5 -10 0.1 —1.0 硒/[mg] 一 0.2 0.10-0.30 0.005 -100 0.01 —10.0 0.05-1.0 巨量礦物質 mm 8-40 5-9 0.1-200 0.5-150 1-100 磷，呈可利用的 磷/[g] 3—6 1.5-6 0.1-200 0.5-150 1-50 -------l·———MW (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂— 19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1270348 A7 __ ____B7___ 五、發明說明（β ) 動物飼料細成物 動物飼料組成物或飮食具有一相當高的蛋白質含量。 根據前述國家硏究會（NRC)出版物，家禽及豬之飮食可 以下列表B，欄2-3所示爲特徵。魚類飮食可以表B，欄 4所示爲特徵。此外，該等魚類飮食通常具有一粗脂肪含 量200- 310克/公斤。這些魚類飮食係以鮭魚屬之魚的飮 食爲例示，並以Τ· V· R· Pillay編著，Blackwell科學出版 有限公司1900年之飼養或栽培水中動植物，原則及實務（ Aquaculture, principles and practice) ; John Ε· Halver 編著 ，學術出版公司1989年之魚類營養學（Fish nutrition)第 二版爲其設計基礎。 根據本發明之動物飼料組成物具有一粗蛋白質含量50 - 800克/公斤，而且更包括至少一種本文所主張之蛋白酶 〇 而且，或是或者（除了上述所示之粗蛋白質含量）， 本發明之動物飼料組成物具有10- 30 MJ/公斤之可代謝之 能量含量；及/或0.1 - 200克/公斤之鈣含量；及/或0.1 -200克/公斤之可利用的磷含量；及/或0.1 - 100克/公斤之 甲硫胺酸含量；及/或0.1 - 150克/公斤之甲硫胺酸加上半 胱胺酸含量；及/或〇·5 - 50克/公斤之離胺酸含量。 在特定之具體實施例中，可代謝之能量，粗蛋白質， 鈣，磷，甲硫胺酸，甲硫胺酸加上半胱胺酸，及/或離胺酸 之含量係在下面表Β範圍2，3，4，或5任一者之範圍內 (R· 2-5) 〇 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1270348 A7 B7 -------1 —•丨 --------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 五、發明說明（θ ) 粗蛋白質係如動物營養學（Animal Nutrition)第4版 第 13 章（P. Mcdonald，R. A. Edwards 及 J. F. D. Greenhalgh 編著，Longman Scientific and Technical，1988 ，：ISBN 0-582-40903-9 )所述，以氮（N)乘上一係數 6.25來計算，即粗蛋白質（克/公斤）=N (克/公斤）X 6.25。該氮之含量係以Kjeldahl氏法測定（A.O.A.C·， 1984，官方分析法第14版，官方分析化學家學會，華盛頓 DC)。 可謝代之能量的計算可根據NRC出版豬的營養素需求 量（Nutrient Requirements of Swine ) ( 1988 )第 2 -6 頁 ，以及歐洲家禽飼料之能量値表（European Table of Energy Values for Poultry Feedstuffs)，Spelderholt 家禽硏 究及延長之中心，7361 DA Beekbergen，荷蘭。Grafisch bedrijfPonsen & looijen bv，Wageningen。ISBN 90-71463-12-5 〇 在完整的動物飮食中，鈣，可利用的磷，及胺基酸之 飮食含量係基於飼料表來計算，例如Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7 0 在一特定具體實施例中，本發明之動物飼料組成物包 含至少一種如前述所定義之植物蛋白質或蛋白質來源。 在更進一步之特定具體實施例中，本發明動物飼料組 成物包含0- 8〇%玉米；及/或0- 80%高粱；及/或0—7〇 21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1270348 A7 五、發明說明（ %小麥；及/或0~7〇%大麥；及/或〇_3〇%燕麥；及/或〇 一 40%黃豆粕；及/或〇_ 1〇%魚粉；及/或〇_2〇%乳淸。 動物飮食可被製造成例如糊狀飼料（masll feed)(非 k狀的）或粒狀飼料。典型地，將磨成粉的飼料予以混合 ’並根據對討論中之種類之詳述加入足量之必須維生素和 礦物質。酵素可呈固體或液體酵素配方加入。例如，固體 酵素配方典型地係在混合步驟之前或期間加入；而液體酵 素製劑典型地係在製粒步驟之後加入。該酵素亦可倂入飼 料添加物或預混物中。飮食中最終酵素濃度係在每公斤飮 食中有0·01 — 200毫克酵素蛋白質之範圔內，例如，每公 斤動物飮食中酵素蛋白質在5 - 30毫克之範圍。 動物飼料組成物的例子顯示於實施例7。 本紙張尺標準額$冗^一(-210 χ 297公楚 '讓—--------^----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表Β 二Η匕里 7 Ρ 家W ί α mr/jm MM •軍E圈1[目 R.1 R.2 R.3 R.4 RT5 - Whm 最小値 最大値 最f値 愚大値 可代謝之 12.1 12.9 14- 10— 11 一 11 一 12- 能Κ， 一 一 25 30 28 26 25 MJ/kg 114 13.5 粗蛋白質 124- 120- 300— 50— 75 — 100- 110 - 120— * g/kg 280 240 480 800 700 600 500 490 鈣， 8—40 5-9 10— 0.1- 0.5 - 卜100 4—50 g/kg 15 200 150 一 可利用的 2.1- 1.5-5.5 3-12 0.1- 0.5 — 1 一 1 一 50 1 一 25 磷，g/kg 6.0 200 150 ^ 100 甲硫胺酸 3.2— 一 12- 0.1- 0.5 — 1-50 1 一 30 * g/kg 5.5 16 100 75 甲硫胺酸 4一9 13-6.8 一 0.1- 0.5 — 1-80 加半胱胺 150 125 酸，g/ks 離胺酸， 2.5 — 6 —14 12 - 22 0.5 - 50 0.5—40 1-30. g/kg 11 22 1270348 A7 _______ 五、發明說明（>1 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在本發明用於處理植物蛋白質之方法的特定具體實施 例中，亦包括另一添加植酸酶之步驟。而於另外的特定具 體實施例中，除了以植酸酶及蛋白酶合倂處理之外，亦可 添加另外的酵素，其中，這些酵素係選自包括其它蛋白酶 ，植酸酶，脂肪分解酵素，及葡萄糖苷酶/醣酶酵素之族群 。該等酵素的例子示於WO95/28850。 該蛋白酶當然應以一有效量施用，即以一足以增進溶 解及/或增進飼料營養價値的量施用。目前預期酵素係以一 種或多種的下列數量（劑量範圍）施予：0.01 - 200 ;或 0·01- 100 ;或 0.05 — 100 ;或 0.05 - 50 ;或 0.10 — 10-所 有的這些範圍均爲每公斤飼料中之蛋白酶蛋白質毫克數（ ppm) 0 爲測定每公斤飼料中之蛋白酶蛋白質毫克數，將蛋白 酶自飼料組成物中純化，而該經純化的蛋白酶之比活性係 利用相關分析測定（見於蛋白酶活性，基質，及分析的部 分）。該飼料組成物本身之蛋白酶活性亦利用相同分析法 測定，而以這兩個測定爲基礎，計算每公斤飼料中蛋白酶 蛋白質毫克數劑量。 - 相同的原理用於測定飼料添加物中蛋白酶蛋白質毫克 數。 當然，如果有一可利用的用於製備飼料添加物或飼料 之蛋白酶之樣品，則測定該樣品之比活性（不需要將蛋白 酶從該飼料組成物或添加物中純化出來）。 許多植物含有抗營養因子，例如植物凝血素及胰蛋白 23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1270348 A7 ____ B7_ 五、發明說明卜> ) 酶抑制劑。黃豆中最重要的抗營養因子爲植物凝血素黃豆 凝集素（lectin soybean agglutinin，SBA)和黃豆胰蛋白酶 抑制劑（soybean trypsin inhibitor，STI) 〇 植物凝血素爲具有相當大特異性之結合至特定含醣分 子之蛋白質，且當攝取後他們變成結合至腸的上皮細胞。 這會導致減少上皮細胞之可行性及減少營養素的吸收。 SBA爲一糖基化、具亞單位分子量約30kDa之四聚體 的植物凝血素，且對N-乙醯半乳糖胺具高度親合力。 胰蛋白酶抑制劑影響腸的蛋白水解作用，減低蛋白質 可消化性，且亦增加從胰臟分泌消化酵素，導致呈消化酵 素形式之胺基酸的減少。胰蛋白酶抑制劑的一個例子爲鮑 曼-伯克抑制劑（Bowman-Birk inhibitor)，其具有約8 kDa之分子量，含有7個雙硫橋聯和兩個對胰蛋白酶類及 胰凝乳蛋白酶類蛋白酶具特異性之抑制環。其它例子有所 謂之孔尼兹抑制因子（Kunitz Inhibitors of Factors)(例 如黃豆孔尼茲胰蛋白酶抑制劑，其包含一個對胰蛋白酶類 之蛋白酶的結合位置，並具有約20 kDa之分子量）。 根據本發明所用之蛋白酶已顯示可水解抗營養因子如 SBA植物凝血素，以及胰蛋白酶抑制劑，鮑曼-伯克抑制劑 及黃豆孔尼茲因子。見實驗部分，實施例5。 因此，本發明亦係關於酸安定性蛋白酶於水解或減少 抗營養因子的量之用途，抗營養因子例如SBA植物凝血素 以及胰蛋白酶抑制劑，如鮑曼-伯克抑制劑及孔尼茲因子如 黃豆孔尼茲因子。 24 -------^---Γ --------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1270348 A7 ___B7___ 五、發明說明（W ) 奮施例1 篩選酸安定性蛋白醃 分析大量的蛋白酶在pH 3之安定性，其目的在於確認 具有通過單胃動物酸性的胃所必需的安定性的蛋白酶。 該等蛋白酶已以一般的層析法純化，例如離子交換層 析法，疏水性作用層析法（hydrophobic interaction chromatography )及尺寸-排阻層析法（size exclusion chromatography)(見於例如蛋白質純化，原理，高解析 方法及應用（Protein Purification, Principles，High Resolution Methods, and Applcations )。編者：Jan -Christer Janson，Lars RyciSn，VCH 出版社，1989 ) 〇 蛋白酶活性測定如下：蛋白酶在25°C，pH 9.5，以 1.67% Hammarsten氏酪蛋白培養30分鐘，然後加入TCA (三氯醋酸）至最終濃度爲2% (w/w)，將混合物過濾以 移除沉積物，分析濾液中之游離初級胺基（以比色分析法 測定，以OPA (〇-phthal-dialdehyde)爲基礎，藉由測量在 340 nm的光吸收，使用一絲胺酸標準物（Biochemische Taschenbuch teil II，Springer-verlag (1964)第 93 和第 102 頁）。一個酪蛋白蛋白酶單位（CPU)被定義爲在標準情 況下，即在25°c及pH 9.5，每分鐘釋放1 mm〇i TCA-可溶 性初級胺基之酵素的量。 將蛋白酶於水中稀釋至活性爲0.6 CPU/升，分成兩等 份，而每一等份接著再分別以pH 3、1〇〇 mM檸檬酸鹽緩 衝液及pH 7、100 mM磷酸鹽緩衝液稀釋至〇·3 CPU/升。 25 $紙張尺度適用中國國家標準（cSs)A4規格（210 X 297公釐) '丨' B — -------1----^ I ---------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 _ B7___ 五、發明說明（舛） 經稀釋之樣品在37°C培養1小時，並將20μ1樣品施加至 含有1%脫脂牛乳之1%瓊脂醣平板的孔洞中。該平板（ pH 7.0)於37°C下隔夜培養並測量透明區域。 一些蛋白酶在此試驗中表現良好，而下列兩種現已被 定性：說明於實施.0LH白色奴氏菌(NocardioPsis alba) — ..........… —— ……..— ---------------- 及奴氏菌（Nocardiopsissp·) NRRL 18262蛋白酶。白色奴 氏菌之菌株已爲專利程序之目的，依國際認可微生物之寄 存的布達佩斯條約，分別寄存於 待改寫 ： [Centraalbureau voor Schimmelcultures, P.O. Box 273，3740 AG Baarn，荷蘭，（CBS)，及 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig，德國，如下： 寄存日期·· to follow

CBS編號：白色奴氏菌（Nocardiopsis alba)編號TO FOLLOW 實施例2 奴氐菌靨（Nocardiopsis)蛋白醃之製備，定件及比鉸硏究 發酵 將白色奴氏菌（Nocardiopsis alba)由胰陳酵母洋菜平 板接種至搖動燒瓶中，每個燒瓶含有1〇〇毫升具下列組成 之HG-23培養基：於蒸餾水中，燕麥片45克/升，酵母萃 取物2克/升，磷酸氫二鈉12克/升，磷酸二氫鉀6克/弁， 普盧藍尼克（Pluronic) PE 6100 〇·2毫升/升。該菌株在 37°C下發酵9天。 26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------l·—ίΛ^ — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------^9*. 1270348 A7 ___B7__ 五、發明說明（/) 純化 該培養液在1升之燒杯中於10000 X g離心30分 鐘。將上澄液合併然後進一步藉由通過一 Seitz K-250深之 濾板過濾而予以澄淸。將該淸澈的濾液在3kDa截止聚醚 楓卡式盒（Filtron)上超過濾來濃縮。濃縮的酵素於G25 Sephadex 管柱（Amersham Pharmacia Biotech)上被轉移至 50 mM H3B〇3，5 mM 3, 3’一二甲基戊二酸，1 mM CaCl2， pH 7 (緩衝液A )，並施加至以緩衝液A平衡之 Bacitracin 瓊脂醣管柱（Upfront Chromatography A/S )。 在以緩衝液A淸洗Bacitracin管柱移除未連結蛋白質之後 ，用添加有25% 2-丙醇和i Μ氯化鈉之緩衝液A將蛋白酶 自管柱中洗脫出來。將具蛋白酶活性之劃分分離物集合起 來，並在 G25 Sephadex 管柱（Amersham Pharmacia Biotech)上藉層析轉移至 20 mM CH3C00H/Na0H，1 mM CaCl2，pH 4.5 (緩衝液B)。將該緩衝液交換的蛋白酶集 合物施加至以緩衝液B平衡之SOURCE 30S管柱（ Amersham Pharmacia Biotech )。在用緩衝液 B 淸洗 SOURCE 30S管柱之後，用具有一漸增的線性NaCl梯度（ 0至0.25 M)之緩衝液B洗脫蛋白酶。測試來自管柱各劃 分分離物之蛋白酶活性，並以SDS-PAGE分析含有蛋白酶 之劃分分離物。集合純的劃分分離物並用於進一步之定性 〇 奴氏菌NRRL 18262之蛋白酶係以習知之方法製備， 大體上如前述對奴氏菌屬蛋白酶之描述。’ 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 一*- -------1----I ---------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 ___B7 __ 五、發明說明（灿） 銳 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衍生自白色奴氏菌之蛋白酶被發現具有分子量Mr=21 kDa ( SDS-PAGE )，及測定出下列部份的（胺基末端（ MVS))胺基酸序列：ADIIGGLAYTMGGRCSV (序列辨 識編號：2)。 衍生自奴氏菌NRRL 18262之蛋白酶具有下列188胺 基酸序列：

ADIIGGLAYTMGGRCSVGFAATNAAGQPGFVTAGHCGRVGTQVTIGNGRGVFEQSV

FPGNDAAFVRGTSNFTLTNLVSRYNTGGYAAVAGHNQAPIGSSVCRSGSTTGWHCGTIQARG

QSVSYPEGTVTNMTRTTVCAEPGDSGGSYISGTQAQGVTSGGSGNCRTGGTTFYQEVTPMVN

SWGVRLRT (序列辨識編號：1)。 此定性之目的在於硏究他們相較於Sub. Novo，Sub. Novo (Y217L)及 SAVINASE™ 之 pH-安定性，pH-活性 及溫度-活性之量變曲線。

Sub· Novo係來自解澱粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)之枯草桿菌蛋白酶，而 Sub. Novo ( Y217L)爲其突變體，其揭示於WO96/05739。Sub· Novo 係以一般方法自野生型菌株培養中製備及純化，而該突變 體係如EP 130756實施例1 一 2及15 - 16所述製備。 衍生自Bacillus clausii (先前之遲 緩芽孢桿菌（Bacillus lentus) NCIB 10309)之枯草桿菌蛋 白酶，商業上可得自 Novozymes A/S，Krogshoejvej，DK-2880 Bagsvaerd，丹麥。其製備已描述於美國專利第 3723250 號。 28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐〉 1270348 A7 __ B7_____ 五、發明說明（>1 )

窨施例2A 番白酺檨品SDS-PAGE_純度之測定 蛋白酶樣品之SDS-PAGE純度係由下列步驟測定： 40μ1蛋白酶溶液（A28〇濃度=0·〇25 )於冰上的 Eppendorf試管中與1〇μ1 50% (w/v) TCA (三氯醋酸）混 合。於冰上半小時後，將該試管予以離心（5分鐘，0°C， 14.000 X g)並將上澄液小心移除。將20μ1 SDS-PAGE樣 品緩衝液（ 200μ1 Tris-甘胺酸SDS樣品緩衝液（2x)( 125mM Tris/HCl，pH 6.8，4% (w/v) SDS，50 ppm 溴酸藍 ，20% (v/v)甘油，LC2676 來自 NOVEX™) +160μ1 蒸餾 水+ 20μ1$-疏基乙醇+ 20μ1 3M未緩衝之Tris Base ( sigma T_1503 )加入沉澱物並將試管煮沸3分鐘。將該試 管予以短暫離心並將1〇μ1樣品加至購自NOVEXTM2 4-20%梯度Tris-甘胺酸預澆鑄凝膠（基於Laemmli chemistry 之聚丙醯胺梯度凝膠但在凝膠中不含有SDS (Laemmli，英 國（1970)自然（Nature)，第 227 卷第 680 — 685 頁） EC60255 )。電泳於兩個緩衝液貯存槽中均以THs-甘胺酸 分離膠體緩衝液（2.9克Tris Base，14.4克甘胺酸，1·〇克 SDS，蒸餾水定容至1升）在150V固定電壓進行，直到溴 酚藍追蹤染料達到凝膠底部。電泳後，該凝膠以1〇〇毫升 蒸餾水藉由溫和搖盪被沖洗3次，每次5分鐘。然後該凝 膠與Gelcode®藍色染料試劑（得自PIERCE之膠狀考馬斯 G-250產品，PIERCE目錄編號24592)溫和搖盪1小時 ，然後以蒸餾水藉由溫和搖盪8至16小時且更換蒸餾水數 29 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------l·---ίΛ^--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 ___ B7 __ 五、發明說明（4 ) 次予以淸洗。最後，該凝膠在兩張玻璃紙間乾燥。乾的凝 膠以Arcus II掃描儀掃描，其係得自AGFA，配有 Fotolook 95 ν2·08 軟體及藉由下列設定（Fotolook 95 ν2·08 的設定）之檔案/取得指令，輸入視窗之影像評估軟體 CREAMtm (目錄號碼 990001 和 990005，Kem-En-Tec， 丹麥）：原始的=反射的，模式=顏色RGB，掃描解析度 = 240 ppi，輸出解析度=1201pi，比例因數=100%，範圍 =具球狀選擇之矩形圖且最小値=0而最大値= 215，色調 曲線=無，淸晰=無，去掃描=無，及風味=無，由此產 生SDS-PAGE凝膠之*.img圖片檔，其係用於CREAMtm 之評估。該*.img圖片檔係以選單指令分析/1-D評估。以 泳道放置工具（Lane Place Tool)將兩條掃描線置於*.img 圖片檔上：一樣品掃描線和一背景掃描線。樣品掃描線係 置於樣品泳道（sample lane)(具討論中之蛋白酶）的中 間，從剛好低於施用狹縫到剛好高於溴酚藍追蹤染料位置 。背景掃描線係與樣品掃描線平行放置，但是是在圖片 SDS-PAGE凝膠上沒有施用樣品的位置，背景掃描線之起 點和終點係垂直於樣品掃描線之起點和終點。背景掃描線 代表凝膠之真正的背景。掃描線的寬度和形狀未被調整。 ，沿著掃描線之強度現以具介質敏感性之1-D/掃描選單指 令記錄。利用1 - D/編輯選單指令，將背景掃描自樣品掃 描減去。然後選擇1 - D/結果選單指令，然後以CREAMTM 軟體計算蛋白酶尖峰之面積％，作爲蛋白酶SDS-PAGE純 n*r* 度。 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 * 297公爱)' '~' ------i----r --------訂---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 __B7___ 五、發明說明（>1) 全部的蛋白酶樣品具有高於95%之SDS-PAGE純度 i ... 〇 ............... 實施例2B pH-活件分析 使用 Sue-AAPF-pNA (Sigma® S-7388 )以得到 pH-活 性量變曲線。 分析緩衝液：1〇〇 mM琥珀酸（Merk 1.00682)，100 mM HEPES ( Sigma Η-3375 ) ^ 100 mM CHES ( Sigma C-2885 )，100 mM CABS (Sigma C-5580)，1 mM 氯化鈣 ，150 mM氯化鉀，0.01% Tdton⑧X-100，以鹽酸或氫氧化 鈉調整至 pH 3·0，4.0，5.0，6·0，7·0，8·0，9·0，10·0，或 11·0〇 分析溫度：25t：。 將300μ1蛋白酶樣品（稀釋於0.01% Triton® X-100中 )與1.5毫升各個pH値之分析緩衝液混合，使得混合物之 pH値爲分析緩衝液之pH値。藉由加入1.5毫升pNA基質 (50毫克溶於1·0毫升DMSO，且進一步以0.01% Tritor^X-100稀釋45χ)開始反應，且於混合後，以分光 光度計監測A4Q5之增加，作爲在討論中pH値之蛋白酶活 .性的測量。以其它pH値之分析緩衝液重複此分析試驗， 並將活性測量値作成相對活性對pH之圖表。將相對活性 以最高活性（pH-最適値）標準化，換言之，將pH-最適 値之活性設爲1，或1〇〇°/。。將蛋白酶樣品稀釋以確保所有 的活性測量値均落於此分析劑量-反應曲線之線性部分。 31 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 __B7 _ 五、發明說明（知） 眚施例2C PH-安定性分析 使用 Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388)以得到 pH-安 定性量變曲線。 分析緩衝液·· 100 mM琥珀酸，100 mM HEPES，100 mM CHES，100 mM CABS，1 mM 氯化鈣，150 mM 氯化 鉀，0.01% Triton® X-100，以鹽酸或氫氧化鈉調整至pH値 2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0， 10.0，或 11·0。 各蛋白酶樣品（於1 mM琥珀酸，2 mM氯化鈣，100 mM氯化鈉，pH 6.0中且A280之光吸收> 1〇 )於各測試pH 値之分析緩衝液中稀釋至a28〇= 1.0。經稀釋之蛋白酶樣品 在37°C培養2小時。培養之後，蛋白酶樣品稀釋於100 mM 琥珀酸，100 mM HEPES，100 mM CHES，100 mM CABS，1 mM 氯化鈣，150 mM 氯化鉀，0·01% Triton® X-100，pH 9.0中，使所有樣品之pH値爲9.0。 在下列活性測量中，溫度爲25°C。 將300μ1經稀釋之蛋白酶樣品與1.5毫升pH 9.0分析 緩衝液混合，並藉由加入1.5毫升pNA基質（50毫克溶於 1.0毫升DMS0，且進一步以0.01% Triton②X-100稀釋 45x)開始活性反應，且於混合後，以分光光度計監測A405 之增加，作爲（殘餘）蛋白酶活性的測量。在不同的pH 値進行37°C的培養，並將活性測量値作成殘餘活性對pH 之圖表。將殘餘活性以一平行培養（對照組）之活性標準 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------l·—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂----- 1270348 A7 --------Β7____ 五、發明說明（纠） 化，對於平行培養，該蛋白酶在活性測量前，如同其它培 養一樣，以pH 9.0之分析緩衝液稀釋至α28()= 1.〇，且在5 °C培養2小時。在活性測量前將蛋白酶樣品稀釋以確保所 有的活性測量値均落於此分析之劑量-反應曲線的線性部分 〇 實施例2D 温度-活件分析 使用Protazyme AK錠劑以得到溫度量變曲線。 Protazyme AK錠劑是由Megazyme製成呈錠劑之天青色苯 胺染料（azurine)染色的交聯酪蛋白。 分析緩衝液·· 100 mM琥珀酸，10〇11^11£?£8，100 mM CHES，100 mM CABS，1 mM 氯化鈣，150 mM 氯化 鉀，0.01% Triton® X-100，以氫氧化鈉調整至卩《9.0。 將Protazyme AK錠劑藉由溫和攪拌懸浮於2.0毫升 0.01% Triton® X-100。500 μΐ 該懸浮液與 500 μΐ 分析緩衝 液於Eppendorf試管中混合並置於冰上。加入20 μΐ蛋白酶 樣品（稀釋於0.01% Triton X-100)。該分析係藉由將 Eppendorf試管移至設在分析溫度之Eppendorf熱攪拌器而 開始。該試管在Eppendorf熱攪拌器上，在它的最高振盪 .速度下培養15分鐘。藉由將試管移回冰浴停止分析培養。 該試管於冰-冷的離心機中離心數分鐘並用分光光度計讀取 上澄液之A65Q。一緩衝液盲試樣被包含於此分析中（代替 酵素）。A65q(蛋白酶）一 A65〇(盲試樣）爲蛋白酶活性之測量 値。在不同的溫度下進行分析，並將該等活性測量値以相 33 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐） ------：-------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 ______B7___ 五、發明說明（〇) 對活性對培養溫度作圖。將相對活性以最高活性（溫度-最 適値）標準化。將蛋白酶樣品稀釋以確保所有的活性測量 値均落於此分析劑量-反應曲線之近線性部分。 活性最適値（pH-和溫度活性）之綜述見於表1。pH-安定性，pH-活性，及溫度-活性量變曲線見於圖1 -3，蛋 白酶在酸性pH_値之pH-安定性數據之詳細比較見於表2 表1

表2 冬種蛋白醯之pH-安定件，介於2-0至5.0之藺 蛋白酶 pH 2.0 pH 2.5 pH 3.0 pH 3.5 pH 4.0 pH 4.5 PH 5.0 . 奴氏菌 NRRL 18262 0.779 1.000 1.029 0.983 0.991 1.019 1.004] 白色奴氏菌 0.929 0.993 1.009 1.005 0.969 1.037 0.992. Sub. Novo 0.007 0.003 0.000 0.000 0.024 0.784 0.942^ Sub. Novo (Y217L) 0.000 0.000 0.002 0.003 0.350 0.951 0.996^ Savinase® 0.001 0.001 0.001 0.003 0.338 0.929 0.992^ 34 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公爱） -------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 ____B7___ 五、發明說明（33 )

實施例2E 經純化的蛋白醃樣品之光吸收純度_ A280^A260比値之測定 經純化的蛋白酶樣品之A28Q/A26()比値測定如下。 A26Q表示蛋白酶樣品相對於一緩衝液空白對照於1公 分光徑比色杯中在260mn之光吸收。A28Q表示同一蛋白酶 樣品相對於一緩衝液空白對照於1公分光徑比色杯中在 280 nm之光吸收。 從實施例2得到的經純化的蛋白酶之樣品以緩衝液稀 釋直到分光光度計Am之讀數在它的反應曲線之線性部分 範圍內。A28Q/A26()比値係由這些讀數決定：對於奴氏菌 NRRL 18262爲1.83，而對於白色奴氏菌爲1.75。 實施例3 衍生自奴氏菌NRRL 18262之蛋白醃降解薈豆粕（SBM) 不溶件部分的能力 測試來自奴氏菌NRRL 18262之蛋白酶使SBM不溶性 /不消化性部分成爲可被消化酵素及/或添加的外源性酵素 使用的能力。 將它的能力與如W095/02044所述製備之兩種天門冬 .胺酸鹽蛋白酶，蛋白酶I和蛋白酶II，比較。該文獻亦揭 示了他們於飼料之用途。蛋白酶I是一種麴菌胃蛋白酶（ Aspergillopepsin) II型蛋白酶，而蛋白酶II是一種麹菌胃 蛋白酶I型蛋白酶（兩者均爲天門冬胺酸鹽蛋白酶，換言 之，非枯草桿菌蛋白酶），其係來自棘孢麹黴（ 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) 一 -------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 _B7___ 五、發明說明Uf )

Aspergillus aculeatus)(參考依據前述之蛋白水解酵素手 冊（Handbook of Proteolytic Enzymes ))。 測試基質，即所謂黃豆殘餘物，係以一種模仿單胃動 物消化道之方法製造，其包括一在pH 2之胃蛋白酶處理， 及一在pH 7之胰酶處理。 在胰酶處理步驟中，加入高劑量之一個範圍的商業酵 素用以降解可爲現行商業酵素使用之SBM成分。 加入下列酵素，其均爲商業上可得自Novozymes A/S ，丹麥：ALCALASETM 2·4 L，NEUTRASEtm 0·5 L， FLAVOURZYMEtm 1000 L，ENERGEXTM L，BIOFEED™ Plus L，PHYTASE N0V0TM L。所使用的 SBM 爲一用於飼 料之標準48%蛋白質SBM，其已製成粒狀。 在處理之後，只有總蛋白質的5%被留在所產生的黃 豆殘餘物中。 FITC標記方法 該殘餘物隨後以FITC (分子探針，F-143)標記如下 :將黃豆殘餘物（25克溼，〜5克乾）懸浮於100毫升〇·1 Μ碳酸鹽緩衝液，pH 9，並在40°C攪拌1小時。將該懸浮 液冷卻至室溫並在暗處以螢光素5-異硫氰酸鹽（FITC)隔 .夜處理。未偶聯之探針以超過濾（10.000 Mw截止）移除 〇 FITC -分析 使用經FITC標記之黃豆殘餘物測試蛋白酶降解黃豆 殘餘物之能力，其係利用下列分析法：在37°C將0.4毫升 36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------------訂---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 蛋白酶 FITC ( +/-20000) 奴氏菌NRRL 18262 92900 蛋白酶I -9200 蛋白酶II 一 1200 37 A7 B7 五、發明說明（V) 蛋白酶樣品（具A28G=(M)與0.4毫升FITC-黃豆殘餘物 (1〇毫克/毫升於0.2 Μ磷酸鈉緩衝液，pH 6.5，之懸浮液 )混合，並在培養〇小時後及在22小時後，測量相對之螢 光單位（RFU 485/535nm;激發/監測波長）。在測定RFU 之前，將樣品在20.000 XG離心1分鐘並將250微升上澄 液轉移至一黑色微量滴定盤（micro-titer tray )。使用 VICTOR 1420多標記計數器（試管內，丹麥）進行測量。 RFU經Iain D. Johnson槪括說明於：螢光技術入門，螢光 探針及硏究化學品手冊，分子探針（Introduction to Fluorescence Techniques, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes) ，Richard P.

Haugland，第 6 版，1996 (ISBN 0—9652240—0-7) 〇 藉由添加0.4毫升緩衝液代替酵素樣品來製備盲樣品 〇 RFU樣品= ARFU樣品一ARFU盲樣品，其中ΔΙΙΡυ = RFU(22 小時）-RFU(0 小時） 所產生的FITC値（RFU μ値）顯示於下表3。該 FITC値一般具誤差幅度+ /— 20.000。和蛋白酶I及蛋白酶 II相反的，衍生自奴氏菌NRRL 18262之蛋白酶會降解黃 .豆殘餘物至一顯著的程度。 m 蛋白酿降解黃豆殘餘物之能力 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝--------訂--------- 1270348 A7 B7 五、發明說明) 眚施例4 衍Φ自奴氏茼NRRL 18262之蛋白醃的試管內試驗 衍生自奴氏菌NRRL 18262之蛋白酶，與衍生自芽孢 桿菌（Bacillus sp.) NCIMB 40484 (，，PD498，，，如 W0 93/ 24623實施例1所述製備）之蛋白酶，以及 FLAVOURZYMEtm (來自米麴菌（Aspergillus oryzae)之 含蛋白酶酵素製劑，商業上可得自於Novozymes A/S， Bagsvaerd，丹麥），一起測試其在試管內消化系統（模擬 單胃動物之消化作用）中溶解玉米-SBM (玉米-黃豆粕） 蛋白質的能力。對於空白處理，係將玉米-SBM在缺乏外 源性蛋白酶下培養。 試管內模型少槪要 加入燒瓶中的成分 時間過程 (分鐘） 10g 玉米-SBM ( 60 : 40) + HC1/胃蛋白酶(3000U/g 飮食)+ 蛋白酶（0.1 mg酵素蛋白質/g飮食 或 3.3 mg FLAVOURZYME™ / g 飮食），T=40〇C， ρΗ=3.〇 t=0 NaOH，T=40°C，pH 6 t=60 NaHCCV胰酶（8.0mg/g 飮食），T=40〇C , pH 6-7 t=80 停止培養並取得樣品，T=0〇C t=320 38 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------tr·丨 1270348 A7 _____JB7__ 五、發明說明（W ) 某質 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用10克之玉米-SBM比例爲6 : 4 (w/w)之玉米—SBM 飮食。蛋白質含量在SBM爲43% (w/w)而在玉米粗粉中 爲8.2% (w/w)。在10克玉米一 SBM飮食中蛋白質之總量 爲2.21克。 消化酵素 胃蛋白酶（Sigma P- 7000 ; 539 U/毫克，固體），胰 酿（Sigma P— 7545 ; 8xU.S.P· ( US Pharmacopeia) ) 〇 酵素蛋白質測宏 蛋白酶酵素蛋白質的量係以A28〇値及胺基酸序列（胺 基酸組成物）爲基礎，利用S. C. Gill & P.H. von Hippel， 分析生物化學（Analytical Biochemistry) 182，3 19 - 326 (1989)槪述之原理來計算。 試管內模型之實驗走驟· 1·稱取10克基質到100毫升燒瓶中。 2·在時間0分鐘，於混合下，將含有胃蛋白酶（ 3000 U/克 飮食）之46毫升HC1 (0.1M)和1毫升蛋白酶（0.1毫 克酵素蛋白質/克飮食，除了 ？1^¥01；112¥3^1^爲3·3 毫克/克飮食）加至該燒瓶。該燒瓶在40°C下培養。 ,3·在時間20- 25分鐘，測量PH。 4·在時間45分鐘，加入16毫升H20。 5·在時間60分鐘，加入7毫升NaOH ( 0·4 M)。 6·在時間80分鐘，加入含有胰酶（8.0毫克/克飮食）之 NaHC03 ( 1 Μ) 5 毫升。 39 本紙張尺度適用中國國家標，準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） 1270348 A7 __ B7 _ 五、發明說明（劝） 7. 在時間90分鐘，測量pH。 8. 在時間300分鐘，測量pH。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 9·在時間320分鐘，移除30毫升等份部份並予離心（ 10000 Xg，10 分鐘，0°C )。 10·測定在上澄液中之總可溶性蛋白質。 蛋白質之測定 利用Kjeldahl氏法（氮的百分比之測定；A.O.A.C.( 1984)官方分析法第14版，官方分析化學家學會，華盛頓 DC)分析上澄液之蛋白質含量。 計算 對於所有的樣品，試管內蛋白質溶解度係利用下列方 程式計算。 飮食樣品中蛋白質的量：10克的22.1% = 2.21克。 如果全部的蛋白質被溶解於75毫升的液體中，則上澄 液中蛋白質的濃度會是2.21克/75毫升《2.95%。 要注意的是該上澄液亦包括消化性及外源性酵素。爲 了要測定溶解度，每當可能的時候，應將來自消化性及外 源性酵素之蛋白質自上澄液之蛋白質濃度減去。 來自胰酶（X毫克/克飮食）及胃蛋白酶（Y U/克 飮食）之蛋白質％ = ((X毫克胰酶/克飮食X10克飮食X0.69 X 100% ) / ( 1000毫克/克X75克））+ ( (YU胃蛋白酶/克飮 食 X10 克飮食 xo.57 X 100% )/( 539 U/毫克 X 1000毫克/克X75克））， 40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公愛） A7 1270348 _B7_____ 五、發明說明（31 ) 其中，0.69和0.57係指所用胰酶及胃蛋白酶製劑中蛋 白質含量（換言之，當參照上述Kjeldahl氏法測定時，胰 酶之69%，和胃蛋白酶之57%爲蛋白質，其係藉由參照上 述Kjeldahl氏法測定）。 來自外源性酵素之蛋白質％ (Z毫克EP/克飮食）= (Z毫克EP/克飮食X10克飮食χιοο% ) / ( 1000 毫克/克X75克） 上澄液中經校正之蛋白質％ =分析所得之上澄液中蛋 白質％ —（來自消化酵素之蛋白質％ +來自外源性酵素之 蛋白質°/〇) 蛋白質溶解（％ )= (上澄液中經校正之蛋白質％ X100% ) /2.95 % 下列結果顯示相較於空白對照，及相較於芽孢桿菌 NCIMB 40484蛋白酶，衍生自奴氏菌NRRL 18262之蛋白 酶在蛋白質溶解上具有顯著較佳之效果。 41 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------h——--------訂！----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 48 03 A7B7 五、發明說明（w) 酵素 溶解了的P (麵的％ ) SD N 一 盲試樣（無外源性 酵素） 73.8C 0.87 10 ^ +衍生自奴氏菌 NRRL 18262之蛋白 酶 11S 0.50 +衍生自芽孢桿菌 NCIMB 40484 之蛋 白酶 75.6b 1.52 + FLAVOURZYMEm 74. lc 0.23 Γ%先閱讀背面之>i音？事項再填寫本頁} a，b，。：在同一欄中未共同使用同一上標字母的數値爲顯著不同 的，p< 0.05。SD爲標準偏差；η爲觀察的數量。 實施例5 植物凝血素SBA及黃豆鮑曼-伯克與孔尼兹 作用 測試來自奴氏菌NRRL 18262及芽孢桿菌ncimb 40484之蛋白酶水解黃豆凝集素（SBA)以及黃豆鮑曼-伯 克和孔尼茲胰蛋白酶抑制劑之能力。 在 pH 6.5，37°C 下，將純的 SBA ( Fluka 61763 )，鮑 曼-伯克抑制劑（Sigma T-9777)或孔尼茲抑制劑（來自黃 丑之胰蛋白酶抑制劑，Boehringer Mannheim 109886)與蛋 白酿一起培養2小時（蛋白酿：抗營養因子=1 ·· 10 ’以 AMO爲基礎）。培養緩衝液·· 50 mM二甲基戊二酸，150 mM 氯化鈉，1 mM 氯化鈣，0.01% Triton X-100，pH 6.5 〇 · ’ · 42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） • 、 . :- - 1270348 A7 B7 五、發明說明（Μ ) 蛋白酶降解SBA及蛋白酶抑制劑的能力係由在SDS-PAGE凝膠上，該天然SBA或胰蛋白酶抑制劑區帶的消失 以及低分子量降解產物的出現來評估。凝膠係以考馬斯藍 染色並藉掃描測定區帶強度。 該結果，如抗營養因子降解之百分比，顯示於下表4 〇 可考慮的是，降解黃豆中抗營養因子的能力亦可在將 黃豆粕與候選蛋白酶予以培養後，以對抗SBA，鮑曼_伯克 抑制劑或孔尼茲抑制劑之抗體，應用Western技術來評估 (見於 WO98/56260)。 表4 蛋白酶 衍生自 SBA 鮑曼-伯克 抑制劑 孔尼茲 抑制劑 奴氏菌NRRL 18262 75 25 100 芽孢桿菌NCMB 21 41 100 40484 眚施例6 酸安定性奴氏茼屬（Nocardiopsis)蛋白醃對肉鍵生長成果 之影響 該試驗是根據法國官方對以活的動物進行實驗之指示 進行。由商業的孵卵所提供以性別區分之i天大（day-old )的肉雞（’Ross PM3，）。 將雞收容於置於環境控制房間中之金屬線層架式雞籠 中。飼料及自來水係隨意供給的。 43 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐〉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·1111111 ^ · I I I I 1 I I I ^ 1270348 A7 ________ 五、發明說明（Ιφ> ) 在第8天，將雞依體重分成六隻一組，其被分配至對 照處理，得到不含酵素之實驗用飮食，或者是分配至酵素 處理，得到每公斤飼料補充有100毫克蛋白酶之酵素蛋白 質的實驗用飮食。 每一種處理以12組重複之，每種性別6組。每組在第 8及第29天稱重。測定期間之飼料消耗量，並計算體重之 增加及飼料轉換率。 實驗用飮食是以玉米澱粉及黃豆粕（44%粗蛋白質） 爲主要成分作基礎（表5)。該飼料在約7〇°C製粒（模結 構：3X20毫米）。適量之蛋白酶以一固定量的水稀釋’ 並噴灑於粒狀飼料上。對於對照處理，用適量的水以同樣 的方法來作處理。 關於統計評估，使用SAS成套軟體（SAS Institute Inc.，1985 )之GLM步驟進行二因素變異數分析（因素： 處理和性別）。處理平均値間之不同係以Duncan試驗分 析，並指出顯著的處理效果（P < 〇·〇5)。預期會有一增加 的體重的獲得，及/或增進的飼料轉換，及/或增進的黃豆 粕營養價値（考慮到玉米澱粉爲一高度可消化的成分）。 參考資料 EEC ( 1986 ) · Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la methode de calcul de la valeur energetique des aliments composes destines a la volaille. Journal Officiel des Communautes Europeennes, L130, 53 — 54. SAS Institute Inc. ( 1985 ) : SAS<D使用者指南，第 5 44 本紙張尺度適用中國國家標準（ί：β)Α4規格（210 χ 297公釐)~"" ~ !!费·— 訂·--------I. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 B7 五、發明說明（(^ ) 版，Cary NC 〇 實驗用飮食之組成 成分（％ )= 玉米澱粉 45.80 黃豆粕441 44.40 動物脂 3.20 黃豆油 1.00 DL-甲硫胺酸 0.18 MCP 0.76 鹽 0.05 黏結劑 1.00 維生素及礦物質預混物 3.55 Avatec® 15% CC2 0.06 分析的含量： 粗蛋白質（％ ) 19.3 ΜΕ,Ν-校正的（MJ/kg) 3 12.2 臟肪（¾ ) 5.3 分析的含量：90.6%乾物質，45.3%粗蛋白質，2.0%粗脂肪， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------訂------ 4.9%粗纖維 2相當於每公斤飼料90毫克拉薩里菌素-Na作爲抗球蟲的 3以分析的營養素含量爲基礎計算（EC-eqiiati〇ri;EEC，1986) 45 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1270348 A7 ______B7___五、發明說明（_) 飼料成分供應者 玉米殿粉：尺(^1^1^3?1^代3，下-62136 1^311：€111,法國 黃豆粕 44 : Rekasan GmbH，D-07338 Kaulsdorf，德國 動物脂：Fondoirs Gachot SA· F-67100 Strasbourg，法國 黃豆油·· Ewoco Sarl，F-68970 Guemar，法國 DL-甲硫胺酸：Produit Roche SA，F-92521 Neuilly-sur-Seine ，法國 MCP : Brenntag Lorraine，F—54200 Toul，法國 鹽：Minoterie Moderne，F—68560 Hirsingue，法國 黏結劑：Minoterie Moderne，F-68560 Hirsingue，法國 預混物（AM vol Chair NS 4231 ) · Agrobase, F-01007 Bourg-en-Bresse，法國 Avatec : ProduitRoche SA, F-92521 Neuilly-sur-Seine，法國 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----訂----I---I — 46 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1270348 A7 ___ B7 ___ 五、發明說明（吖） 眚施例7 闲於火雞及鮭魚屬之魚的補充有酸安定性奴氏菌屬（ Nocardiopsis )蛋白酿之預混物及飮會 製備下列組成物之預混物（每公斤之含量）： 5000000 IE 維生素A 1000000 IE 維生素D3 13333 Mg 維生素E 1000 mg 維生素K3 750 mg 維生素B1 2500 mg 維生素B2 1500 mg 維生素B6 7666 mg 維生素B12 12333 mg 菸鹼酸 33333 mg 生物素 300 mg 葉酸 3000 mg Ca- D-泛酸鹽 1666 mg Cu 16666 mg Fe 16666 mg Zn 23333 mg Μη 133 mg Co 66 mg I 66 mg Se 5.8 % 鈣 於此預混物中加入來自奴氏菌NRRL 18262之蛋白酶 .(如實施例2所述製備），其量相當於每公斤10克蛋白 酶酵素蛋白質。 如下所述製備具有下表（以Leeson and Summers， 1997爲基礎，但使用AGROSOFT®最佳化程式，在不含肉 粉下重新計算）所示之組成物及每公斤含1〇〇毫克蛋白酶 47 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格<210 X 297公釐） .彳.Wv .' 丨 ...Ά :爷..- ------^—^丨 裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 ____-----—五、發明說明（Μ ) 酵素蛋白質之粒狀火雞起始飮食（starter)及生長飮食（ grower diet ) · 於階式混合器.內混合輾碎的玉米、黃豆粕、魚粉及植 物脂。加入石灰石、磷酸鈣及鹽，以及10克/公斤飮食之 量的上述預混物，再予混合。將所得混合物造粒。（蒸氣 調質後接著造粒步驟） 成分 起始飲食， g/kg 生長飮食 g/kg 完成品（Finisher) 玉米 454.4 612.5 781.0 黃豆粕 391 279 61.7 魚粉 70 29.9 70 植物脂 21 21 46 石灰石 19 16.9 9 磷酸鈣 30 25.9 16.8 鹽（NaCl) 2 2 2 維生素及礦物質預 混物 10 10 10 離胺酸 1.3 1.49 甲硫胺酸 1.3 1.3 3.6 計算的營養素 粗蛋白質g/kg 279 213 152 可代謝之能量 MJ/kg 12.3 12.7 14.1 鈣，g/ kg 15.8 12.7 9 可利用的磷，g/kg 8.2 6.4 4.6 離胺酸，g/kg 17.6 12.8 7.5 甲硫胺酸，g/kg 6.1 4.9 6.9 ------!·裝------！訂——------Φ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 兩種用於鮭魚屬之魚的飮食，大體上依照前面之槪述 亦予以製備。實際的組成顯示於下表（依照Refstie等人（ 48 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） """ 1270348 A7 B7 五、發明說明（) 1988 )，飼養或栽培水中動植物（Acluaculture)，卷162 ，第301 - 302頁）。使用Agrosoft®飼料最佳化程式重新 計算估計的營養素含量。 將依實施例2所述製得之衍生自白色奴氏菌的蛋白酶 ，以相當於每公斤100毫克蛋白酶酵素蛋白質的量加入飮 食中。 成分 具魚粉之 -般飲食 具黃豆粕之 辦飲食 小麥 245.3 152 魚粉 505.0 310.0 黃豆粕 一 339.0 魚油 185,0 200.0 DL-甲硫胺酸 13.9 23.0 磷酸二氫鈣 一 2.0 維生素及礦物質預混物+ 50.8 50.8 讎物黏結劑及還原蝦紅 素 計算的營養素（根搛新鮮 重量） 粗蛋白質g/kg 401 415 麵旨肪g/kg 232 247 可代謝之能量MJ/kg 16.9 16.5 錦 g/kg 13.9 9.8 磷 g/kg 10.8 9.0 離胺酸g/kg 27.7 26.7 甲硫胺酸g/ kg 24.4 31.6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） -----------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 ___ __B7____ 五、發明說明（辦） 奮施例8 含蛋_白醃酵素產品之純度的測宏 含蛋白酶酵素產品，例如蛋白酶製劑如商業的多成分 酵素產品，其純度可以基於在尺寸-排阻管柱上劃分分離含 蛋白酶酵素產品的方法來測定。尺寸-排阻層析法亦即已知 之凝膠過濾層析法，係以具有尺寸大小可使蛋白質分子分 離之孔徑分佈的多孔凝膠基質（裝塡於一管柱中）爲基礎 。相對小的蛋白質分子可自周圍溶液擴散進入凝膠，而較 大的分子因其尺寸大小被阻止以同樣程度擴散進入凝膠。 結果，蛋白質分子根據他們的大小被分離，而較大的分子 會比較小的分子先洗脫出管柱。 蛋白質濃度分析 含蛋白酶酵素產品之蛋白質濃度係以來自PIERCE之 BCA蛋白質分析套組（與PIERCE目錄號碼23225相周） 測定。Bicinchoninic acid (BCA)之鈉鹽爲一安定的水溶 性化合物，其可在鹼性環境與亞銅離子（Cu1+)形成強烈 的紫色錯合物。BCA試劑形成BCA蛋白質分析套組能監 測在蛋白質與鹼性Cu2+反應（雙縮脲反應）中產生的亞銅 離子之基礎。從此反應產生的顏色係穩定的，且與增加的 .蛋白質濃度係成比例的方式增加（Smith，P. K.等人（1985 )，分析生物化學（Analytical Biochemistry )，卷 150， 第76- 85頁）。BCA作用溶液係由混合50份試劑A與1 份試劑B製得（試劑A爲PIERCE目錄號碼23223，於鹼 性碳酸鹽緩衝液中含有BCA及酒石酸鹽；試劑B爲 50 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝-------丨訂--------- 1270348 A7 ____B7__ 五、發明說明（V]) PIERCE 目錄號碼 23224，含有 4°/。CuS04*5H20)。將 300μ1樣品與3.0毫升BCA作用溶液混合。在37°C30分鐘 後，該樣品冷卻至室溫並讀取A49〇作爲樣品中蛋白質濃度 之測量。牛血淸白蛋白（PIERCE目錄號碼23209)之稀釋 液被包含於此分析中作爲標準品。 樣品前處理 如果含蛋白酶酵素產品爲一固體，先在5°C將該產品 溶解/懸浮於20倍體積之100 mM H3B〇3，10 mM 3, 3’-二 甲基戊二酸，2mMCaCl2, PH6 (緩衝液A)至少15分鐘 ，又如果該酵素在此階段爲一懸浮液，則將該懸浮液通過 〇·45μ過濾器過濾以產生一澄淸溶液。從此處起，該溶液被 當作一液體含蛋白酶酵素產品。 如果含蛋白酶酵素產品爲一液體，先將該產品在5°C 於6— 8000 Da截止SpectraPor透析管（光譜醫學工業（ Spectrum Medical Industries)目錄號碼 132 670)對 100 倍 體積緩衝液A+150mMNaCl (緩衝液B)透析至少5小時 ，以移除可給予液體含蛋白酶酵素產品高黏度之配方化學 品，其對尺寸-排阻層析法爲有害的。 如果在透析期間產生沉澱物，將該經透析的含蛋白酶 ，酵素產品通過一 〇.45μ過濾器過濾。利用前述之蛋白質濃 度分析法測定經透析的酵素產品中蛋白質濃度，並將酵素 產品以緩衝液Β稀釋，以產生具有5毫克/毫升蛋白質濃度 之適於尺寸-排阻層析法之樣品。如果在透析之後酵素產品 具有低於5毫克/毫升之蛋白質濃度，則直接使用它。 51 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1270348 A7 ____ B7__ 五、發明說明（列） R寸-棑阻層析法 300 毫升 HiLoad26/60 Supei:dex75pg 管柱（Amersham

Pharmacia Biotech)以緩衝液B平衡（流速· 1毫升/分&& )。將1.0毫升含蛋白酶酵素樣品施加至該管柱，並以緩 衝液B洗脫管柱（流速：1毫升/分鐘）。由管柱出口收集 2.0毫升劃分分離物，直到所有施加之樣品均從管柱洗脫出 。對所收集的劃分分離物以適當的分析法分析其蛋白質含 量（見上述蛋白質濃度分析）及分析蛋白酶活性。適當的 分析法的一個例子爲Suc_AAPF-pNA分析（見實施例2B )。其它適當的分析法有，例如CPU分析（見實施例1) ，及Protazyme AK分析（見實施例2D)。調整蛋白酶活 性分析之條件，例如pH，以測量劃分分離樣品中儘可能多 的蛋白酶。前述分析之條件爲適合的條件的例子。其它適 合的條件於前述關於測量蛋白酶活性之部份提及。在一個 或多個蛋白酶分析中具有活性之蛋白質尖峰被定義爲蛋白 酶尖峰。蛋白酶尖峰之純度的計算，係以該尖峰蛋白質的

I 量除以全部確認了的蛋白酶尖峰之總蛋白質量。 含蛋白酶酵素產品純度的計算，係以酸安定性蛋白酶 尖峰之蛋白質的量，除以全部利用前述步驟確認了的蛋白 .酶尖峰之蛋白質的量。 如申請專利範圍所請之發明可依照前述說明書及即可 獲得之參考文獻與起始材料而得以實施。然而申請人爲了 專利程序的目的，在2001年6月22曰於台灣新竹食品工 業發展硏究所完成下列寄存：白色奴氏菌（N〇cardiopsis 52 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇< 297公爱)----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ---I----訂· —----I I . 3 5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270348 A7 ___B7 五、發明說明（d) alba)，寄存編號 CCRC 910176。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1270348 A7 B7 五、發明說明（i：>) 10094.ST25.txt 序列表

<110> F. Hoffmann-La Roche AG < 120> 用於動物飼料中之酸安定性蛋白酶 <130> 10094.204-wo <140> DK 2000 00200 <141> 2000-02-08 <160> 2 <17〇> Patentln 第3.0版 ι

<210> 1 <211> 188 <212> PRT <213〉 奴氏菌（Nocardiopsis sp.) NRRL 18262 <400> 1

Ala Asp lie lie Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Giy Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15

Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gin Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30

Ala Gly His Cys Gly Arg Val Giy Thr Gin Val Thr lie Gly Asa Gly 35 40 45

Arg Gly Val Phe Glu Gin Ser Val Phe Pro Gly Asa Asp Ala Ala Phe 50 55 60

Val Arg Giy Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80

Asn Thr Gly Gly Tvr Ala Ala Val Ala Gly His Asn Gin Ala Pro lie 85 90 95

Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110

Thr lie Gin Ala Arg Gly Gin Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val 115 120 125

Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140

Gly Ser Tyr lie Ser Gly Thr Gin Ala Gin Gly Val. Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 54 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------. 1270348 A7 B7 五、發明說明U3 ) 10094.ST25.txt

Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gin Glu Val Thr 165 170 175

Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr 180 185 <210> 2 <211> 17

<212> PRT <213〉白色奴氏菌（Nocardiopsisalba) <400> 2

Ala Asp lie lie Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 15 10 15

Val 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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Claims (1)

1. B8 C8 D8 ± 六、申請專利範圍 修止 严補尤 1. 一種至少一種酸安定性蛋白酶於動物飼料之用途， 其中該蛋白酶與序列辨識編號：1具有至少70%之同一性 ，且其中該蛋白酶在37°C及pH 3.5下培養.2小時後之殘餘活 性爲在5°C及pH 9.0下培養2小時後之殘餘活性的至少40% ，該蛋白酶是以純的形式培養，A28G = 1.0，且該殘餘活性 是在pH 9·0及25°c下於Sue-AAPF-pNA上測量。 2. —種至少一種酸安定性蛋白酶於製備動物飼料用之 組成物的用途，其中該蛋白酶與序列辨識編號：1具有至 少70%之同一性，且其中該蛋白酶在37°C及pH 3.5下培 養2小時後之殘餘活性爲在5°C及pH 9.0下培養2小時後 之殘餘活性的至少40% ，該蛋白酶是以純的形式培養， Α280 = 1·0,且該殘餘活性是在pH 9.0及25〇C下於Suc-AAPF-pNA上測量。 3. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該蛋白酶與 序列辨識編號：1具有至少80%之同一性。 4. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中蛋白酶係衍 生自奴氏菌科（Nocardiopsaceae)之細菌，或其突變體或 變異體。 5. 根據申請專利範圍第4項之用途，其中蛋白酶係衍 生自奴氏菌屬（Nocardiopsis)菌株，或其突變體或變異體 〇 6. 根據申請專利範圍第2項之用途，其中該蛋白酶與 序列辨識編號：1具有至少80%之同一性。 7. 根據申請專利範圍第2項之用途，其中蛋白酶係衍 m 請 先 閲 讀 背 案: 疹 ι£ 丨隻 否 變 更 原 實 質 I 頁 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 1270348 頜 」_ 利範圍 生自奴氏菌科之細菌，或其突變體或變異體。 8. 根據申請專利範圍第7項之用途，其中蛋白酶係衍 生自奴氏菌屬菌株，或其突變體或變異體。 9. 根據申請專利範圍第1-8項中任一項之用途，其該 蛋白酶之劑量爲每公斤飼料0.01 - 200毫克蛋白酶酵素蛋 白質。 10· —種增進動物飼料營養價値的方法，其中至少一 種酸安定性蛋白酶被加入飼料中，且其中該蛋白酶與序列 辨識編號：1具有至少70%之同一性，且其中該蛋白酶在 37°C及pH 3_5下培養2小時後之殘餘活性爲在5°C及pH 9.0下 培養2小時後之殘餘活性的至少40%，該蛋白酶是以純的形 式培養，A28〇= 1.0，且該殘餘活性是在pH 9.0及25°C下於 Suc-AAPF-pNA上測量。 11·根據申請專利範圍第10項之方法，其中該蛋白酶 與序列辨識編號：1具有至少80%之同一性。 12. 根據申請專利範圍第10項之方法，其中蛋白酶係 衍生自奴氏菌科之細菌，或其突變體或變異體。 13. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中蛋白酶係 衍生自奴氏菌屬菌株，或其突變體或變異體。 14. 一種動物飼料添加物，包括 (a) 至少一種酸安定性蛋白酶；及 (b) 至少一種脂溶性維生素，及/或 (c) 至少一種水溶性維生素，及/或 (d) 鎂，鋅，鐵，銅，碘，硒及鈷中之至少一種，及 2 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐） ---------------------------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,ν-tl 1270348 η Α8 Β8 C8 D8 • ，ύ 、歹請專利範圍 ----------------------Ί«·_^------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) /或其中該蛋白酶與序列辨識編號：1具有至少70%之同一 性，且其中該蛋白酶在37t及pH 3·5下培養2小時後之殘餘 活性爲在5°C及pH 9.0下培養2小時後之殘餘活性的至少4〇 %，該蛋白酶是以純的形式培養，Α28ο=1·〇，且該殘餘活 性是在pH 9.0及25°C下於Sue-AAPF-ρΝΑ上測量。 15.根據申請專利範圍第14項之動物飼料添加物，其 中該蛋白酶與序列辨識編號：1具有至少80%之同一性。 16·根據申請專利範圍第14項之動物飼料添加物，其 中蛋白酶係衍生自奴氏菌科之細菌，或其突變體或變異體 Π·根據申請專利範圍第I6項之動物飼料添加物，其 中蛋白酶係衍生自奴氏菌屬菌株，或其突變體或變異體。 18·根據申請專利範圍第14-17項中任〜項之動物飼 料添加物，其中該蛋白酶的量相當於每公斤飼料預期添加 〇_〇1 — 200毫克蛋白酶蛋白質。 19_根據申請專利範圍第14-18項中任一項之動物飼 料添加物，其進一步包括植酸酶，木聚糖酶，聚半乳糖酶 ，及/或β-聚葡萄糖酶。 20· —種動物飼料組成物，具有粗蛋白質含量50 -800克/公斤及包括至少一種酸安定性蛋白酶，其中該蛋白 酶與序列辨識編號：1具有至少70%之同〜性，且其中該 蛋白酶在37°C及pH 3.5下培養2小時後之殘餘活性爲在5 °C及pH 9·0下培養2小時後之殘餘活性的至少40%，該蛋 白酶是以純的形式培養，A28Q = 1.0，且該殘餘活性是在ρΗ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 12,70348 A8 B8 C8 D8 丰請專利範圍 9.0 及 25°C 下於 Suc-AAPF-pNA 上測量。 21. 根據申請專利範圍第20項之動物飼料組成物，其 中該蛋白酶與序列辨識編號：1具有至少80%之同一性。 22. 根據申請專利範圍第20項之動物飼料組成物，其 中蛋白酶係衍生自奴氏菌科之細菌，或其突變體或變異體 〇 23. 根據申請專利範圍第22項之動物飼料組成物，其 中蛋白酶係衍生自奴氏菌屬菌株，或其突變體或變異體。 24·根據申請專利範圍第20-23項中任一項之動物飼 料組成物，其中該蛋白酶之量爲每公斤飼料0.01 - 200毫 克蛋白酶蛋白質。 25. —種處理植物蛋白質之方法，包括加入至少一種 酸安定性蛋白酶到至少一種植物蛋白質或蛋白質來源的步 驟，其中該蛋白酶與序列辨識編號：1具有至少70%之同 一性，且其中該蛋白酶在37°C及pH 3.5下培養2小時後之殘 餘活性爲在5°C及pH 9.0下培養2小時後之殘餘活性的至少 40%，該蛋白酶是以純的形式培養，A28G= 1.0，且該殘餘 活性是在pH 9.0及25°C下於Sue-AAPF-pNA上測量；其限 制條件爲該至少一種植物蛋白質或蛋白質來源不是棉織物 上之新鮮菠菜萃取物。 26·根據申請專利範圍第25項之方法，其中該蛋白酶 與序列辨識編號：1具有至少80%之同一性。 27·根據申請專利範圍第25項之方法，其中蛋白酶係 衍生自奴氏菌科之細菌，或其突變體或變異體。 4 請 先 閲 讀 背 I 項 再 塡 寫 本 頁 訂 線

   本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 12^0348 B8 ί/j H C8 Π-FO- 六、申請專利範圍 28·根據申請專利範圍第27項之方法，其中蛋白酶係 衍生自奴氏菌屬菌株，或其突變體或變異體。 29·根據申請專利範圍第25-28項中任一項之方法， 其中黃豆係被包含於該至少一種植物蛋白質來源之中。 ----------------------·!«衣—— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) *1Τ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐)