CN104968211A - 具有蛋白酶活性的多肽在动物饲料中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽以及具有蛋白酶活性的分离的多肽在动物饲料中的用途。本发明还涉及编码这些蛋白酶的分离的核酸序列在具有蛋白酶活性的分离的多肽的重组产生中的用途以及编码这些蛋白酶的分离的核酸序列。本发明还涉及包含这些核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，包括植物和动物细胞，以及产生和使用这些蛋白酶的方法，尤其在动物饲料中使用这些蛋白酶的方法。

Description

具有蛋白酶活性的多肽在动物饲料中的用途

对序列表的引用

本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，以及具有蛋白酶活性的分离的多肽在动物饲料中的用途。本发明还涉及编码这些蛋白酶的分离的核酸序列在具有蛋白酶活性的分离的多肽的重组产生中的用途以及编码这些蛋白酶的分离的核酸序列。本发明还涉及包含这些核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞(包含植物和动物细胞)，以及生产和使用(尤其在动物饲料中使用这些蛋白酶)这些蛋白酶的方法。

发明背景

在动物饲料中使用蛋白酶(体内)，和/或这类的蛋白酶用于处理植物性蛋白(体外)的用途中，注意的是蛋白对于动物和人类是必需营养因子。人类和牲畜通常从植物蛋白质来源获得必要的蛋白质。重要的植物性蛋白来源是例如油籽作物、豆类和谷类。

当例如大豆粉包含在单胃动物如猪和家禽的饲料中时，相当比例的大豆粉未被有效地消化(在小猪、生长猪和家禽如肉仔鸡、蛋鸡和公鸡中的表观回肠蛋白消化率仅是80％左右)。

动物的胃肠道是由一系列各自呈现不同pH环境的段组成。在单胃动物如猪和家禽以及许多类型的鱼中，胃是具有潜在地低至1-2的pH的强酸性的，而肠具有一个6-7左右的更中性的pH。除胃和肠之外，家禽在胃之前还具有一个嗉囊。嗉囊中的pH主要由消化的饲料决定并且因此典型地位于pH 4-6的范围内。通过一种蛋白酶消化蛋白可发生在整个消化道中，其条件是该蛋白酶是有活性的并存活于该消化道的条件下。因此，以下这样的蛋白酶是特别令人希望的：它们是高度地酸稳定的并且所以可以在胃环境中存活，并且同时在靶动物的消化道的宽范围的生理pH下是有效地有活性的。

由于动物饲料通常以粒状形式配制，其中在造粒过程中应用蒸汽，因此在暴露于所述蒸汽处理之后用于动物饲料中的蛋白酶仍能够保持是有活性的也是令人希望的。

为了生产用于工业使用的蛋白酶，重要的是生产高产量的蛋白酶，使得可获得足够量的该产品以能够以有利的价格提供该蛋白酶。

相关技术说明

分离自糖多孢菌属的S1组的蛋白酶在本领域中是已知的。奥林利克(Oliynyk)等人已经在‘产红霉素细菌红色糖多孢菌NRRL23338的全基因组序列(Complete genome sequence of theerythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraeaNRRL23338)’，2007，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)25:447-453中披露了一种来自红色糖多孢菌的丝氨酸蛋白酶，该丝氨酸蛋白酶已经被提交至EMBL/GenBank(登录号EMBL：AM420293，在本文中SEQID NO:1)。氨基酸序列以Uniprot编号A4F726登记(在本文中SEQ IDNO:2)并且成熟氨基酸序列披露于SEQ ID NO:5中。

卢卡斯(Lucas)等人已经向EMBL/Genbank提交了一种来自新疆糖单孢菌(Saccharomonospora xinjiangensis)XJ-54的蛋白酶(Uniprot：I0V8H8，SEQ ID NO:8)，该蛋白酶与SEQ ID NO:5具有76.5％序列同源一致性。卢卡斯(Lucas)等人已经向EMBL/Genbank提交了一种来自弱代谢糖单孢菌YIM 90007的内肽酶(Uniprot：G4J6Q2，SEQ IDNO:9)，该内肽酶与SEQ ID NO:5具有74.7％序列一致性。

卢卡斯(Lucas)等人已经向EMBL/Genbank提交了一种来自黄色韩国生工菌(Kribbella flavida)的胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(Uniprot：D2PRB9，SEQ ID NO:10)，该胰凝乳蛋白酶样蛋白酶与SEQ ID NO:5具有74.7％序列同源一致性。帕蒂(Pati)等人已经在“绿色糖单孢菌模式菌株(P101)的全基因组序列(Complete genome sequence ofSaccharomonospora viridis type strain(P101))”，2009，基因组科学标准(Stand.Genomic Sci.)1:141-149中披露了一种来自绿色糖单孢菌的丝氨酸蛋白酶(Uniprot：C7MV18，SEQ ID NO:11)，该丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:5具有73.8％序列同源性。斯特罗贝尔(Strobel)等人已经在‘西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis)DSM 44229T的全基因组序列以及与另一个完全测序的假诺卡氏菌科的比较’，2012，BMC基因组学(BMC Genomics)，13:465-465中公开了2种来自西班牙糖丝菌DSM 44229的蛋白酶，这2种蛋白酶与SEQ ID NO:5具有74.3％和73.6％序列同一性(Uniprot分别为：K0JWC2，SEQ ID NO:12和K0JQQ4，SEQ ID NO:13)。

下一个最近鉴定的糖多孢菌属蛋白酶被提交到EMBL/Genbank(Uniprot A4FNQ0)，该蛋白酶与SEQ ID NO:5具有69.6％序列一致性。其他酶与SEQ ID NO:5具有少于74％的序列一致性。

WO 05/052146和WO 05/052161描述了多种用于动物饲料的丝氨酸蛋白酶，该丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO:5的蛋白酶具有67％-73％一致性。

WO 95/28850披露了一种植酸酶与一种或多种微生物蛋白水解酶组合以改善植物性蛋白的溶解度。WO 01/58275披露了枯草杆菌蛋白酶家族的酸稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途。WO 01/58276披露了衍生自拟诺卡氏菌属NRRL 18262的酸稳定性蛋白酶(10R蛋白酶)连同一种衍生自白拟诺卡氏菌DSM 14010的蛋白酶在动物饲料中的用途。WO 04/072221、WO 04/111220、WO 04/111223、WO 05/035747以及WO 05/123911披露了与10R蛋白酶相关的蛋白酶及其在动物饲料中的用途。WO 04/072279披露了其他蛋白酶在动物饲料中的用途。WO 04/034776披露了一种枯草杆菌蛋白酶/角蛋白酶，来自地衣芽孢杆菌的PWD-1，在家禽饲料中的用途。WO 04/077960披露了一种通过采用一种细菌或真菌蛋白酶来增加草料或谷物在反刍动物中的消化率的方法。

包含一种蛋白酶的并且销售以用于在动物饲料中使用的商业产品包含ProAct(DSM NP/诺维信公司(Novozymes))、(丹尼斯克公司(Danisco))、(丹尼斯克公司)、(丹尼斯克公司)、Allzyme^TM(奥特奇公司(Alltech))、(生物资源有限公司(BioResources,Int.)、Poultrygrow^TM(杰夫公司(Jefo))和DP100(诺伟思公司(Novus))。

发明概述

本发明涉及用于动物饲料的、具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％序列一致性；

(b)一种多肽，该多肽由在中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：

(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；

(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；和/或

(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；

(d)与SEQ ID NO:5多肽具有至少80％序列一致性的SEQ IDNO:5的多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

本发明还涉及具有蛋白酶活性并且与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％序列一致性的变体多肽，这些变体多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)SEQ ID NO:5的多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括至少一个取代、缺失和/或插入；以及

(b)(a)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

本发明涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸、包含这些多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、以及重组宿主细胞，并涉及产生这些多肽的方法。

本发明还涉及本发明的分离的多肽的组合物、用于制备一种用于在动物饲料中使用的组合物的方法，用于提高动物饲料的营养价值的方法，以及处理有待在动物饲料组合物中使用的蛋白的方法。

序列表综述

SEQ ID NO:1是如分离自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2的DNA序列(EMBL:AM420293)。

SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是与赛威蛋白酶(Savinase)信号肽融合的合成地优化基因的DNA序列。

SEQ ID NO:4是如从SEQ ID NO:3推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是来自红色糖多孢菌的成熟S1蛋白酶2的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6是10R蛋白酶(WO 05/035747，SEQ ID NO:1)的DNA序列。

SEQ ID NO:7是10R蛋白酶(WO 05/035747，SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8是来自新疆糖单孢菌XJ-54的蛋白酶的氨基酸序列(Uniprot：I0V8H8)。

SEQ ID NO:9是来自弱代谢糖单孢菌YIM 90007的内肽酶的氨基酸序列(Uniprot：G4J6Q2)。

SEQ ID NO:10是来自黄色韩国生工菌DSM 17836的胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的氨基酸序列(Uniprot：D2PRB9)。

SEQ ID NO:11是来自绿色糖单孢菌的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列(Uniprot：C7MV18)。

SEQ ID NO:12是来自西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis)DSM 44229T的链霉菌蛋白酶(Streptogrisin)C样蛋白的氨基酸序列(Uniprot：K0JWC2)。

SEQ ID NO:13是来自西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis)DSM 44229T的链霉菌蛋白酶(Streptogrisin)C样蛋白的氨基酸序列(Uniprot：K0JQQ4)。

SEQ ID NO:14是迟缓芽孢杆菌分泌信号。

序列的一致性矩阵：

附图简要说明

图1示出了如分离自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2与蛋白酶10R相比的在37℃下对Suc-AAPF-pNA底物的pH-活性曲线。

图2示出了如分离自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2与蛋白酶10R相比的pH-稳定性曲线(在37℃下2小时后的残余活性)。

图3示出了如分离自红色糖多孢菌的在pH 7.0下的S1蛋白酶2与在pH 6.5下的蛋白酶10R相比的对Protazyme AK温度活性曲线。

图4示出了如分离自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2和10R蛋白酶与蛋白酶10R相比的在pH 9.0、25℃下对10种Suc-AAPX-pNA底物的P1-特异性。

图5示出如分离自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2与蛋白酶10R相比的对大豆-玉米粉的活性(OD₃₄₀x稀释因子)。

定义

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从成熟的剪接的mRNA分子逆转录制备的DNA分子，该mRNA分子是从真核细胞中获得。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，它直接指定变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括生产多肽涉及的任何步骤，包括但不局限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指包括编码一种多肽的一种多核苷酸并可操作地连接至提供其表达的其他核苷酸的线性或环形DNA分子。

片段：术语“片段”意指使一个或多个(若干个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。在一个方面，一个片段含有至少163个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸11至173)或至少173个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸6至178)；或相应地，对于SEQ ID NO:4而言，一个片段含有至少163个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:4的氨基酸11至173)或至少173个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:4的氨基酸6至178)；或相应地，对于SEQ ID NO:5而言，一个片段含有至少163个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:5的氨基酸11至173)或至少173个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:6的氨基酸5至178)。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导、等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指相对于自然界中发现的那种多核苷酸通过人工手动修饰的多核苷酸。在一个方面，该分离的多核苷酸是至少1％纯的，例如至少5％纯的，更多至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的，至少90％纯的，以及至少95％纯的，如通过琼脂糖电泳所确定的。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的、或其任意组合。

分离的多肽：术语“分离的多肽”意指被人手修饰的多肽，相对于在自然中发现的多肽。在一个方面，该多肽是至少1％纯的，例如至少5％纯的，至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的，以及至少90％纯的，如通过SDS-PAGE所确定的。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，基于还预测SEQ ID NO:2的-194至-154是一个信号肽的SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(ProteinEngineering)10:1-6)预测程序，该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至183。在另一方面，基于使用埃德曼(Edman)降解和整体分子量分析的测序，该成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸1至183。SEQ IDNO:4的氨基酸-180至-154是赛威蛋白酶信号肽。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的一种多核苷酸。在一方面，基于通过埃德曼(Edman)降解和整体分子量分析的确定，该成熟多肽编码序列是SEQID NO:1的编号中的核苷酸683至1231和SEQ ID NO:3的编号中的核苷酸541至1089。此外，基于预测程序SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)，预测SEQ IDNO:1的编号中的核苷酸101至223编码一种信号肽并且SEQ ID NO:3的编号中的核苷酸1至81编码赛威蛋白酶信号肽。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指从天然存在的基因中分离的、或以一种方式被修饰成包含在自然界中不会另外存在的核酸区段的、或合成的单链或双链核酸分子。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”含义相同。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。

蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。本发明的蛋白酶是内肽酶(EC 3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型，然而三种主要的活性类型是：胰蛋白酶样，其中在Arg或Lys后在P1处存在酰胺底物的切割；糜蛋白酶样，其中切割发生在P1处，在疏水性氨基酸中的一个之后；以及弹性蛋白酶样，具有在P1处Ala之后的切割。

可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。pH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。pH值测定的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。温度测定的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。普通蛋白酶底物的实例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血红蛋白。在经典的安森(Anson)和米尔斯基(Mirsky)方法中，将变性的血红蛋白用作底物并且在用所讨论的蛋白酶孵育测定后，确定三氯乙酸可溶的血红蛋白的量用作蛋白酶活性的量度(安森(Anson)，M.L.和米尔斯基(Mirsky)，A.E.，1932，普通生理学杂志(J.Gen.Physiol.)16:59以及安森(Anson)，M.L.，1938，普通生理学杂志(J.Gen.Physiol.)22:79)。

用于本发明的目的，使用描述于“材料与方法”中的测定确定蛋白酶活性，如动力学Suc-AAPF-pNA测定、Protazyme AK测定、动力学Suc-AAPX-pNA测定以及邻苯二甲醛(OPA)。对于Protazyme AK测定，当用该蛋白酶孵育时，不可溶Protazyme AK(天青精-交联的酪蛋白)底物释放蓝色并且确定该颜色作为蛋白酶活性的量度。对于Suc-AAPF-pNA测定，当用该蛋白酶孵育时，无色的Suc-AAPF-pNA底物释放黄色的对硝基苯胺并且确定该黄色作为蛋白酶活性的量度。

本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:5的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度。使用版本6.1.0。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，同上)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼和翁施，1970，同上)来测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性的程度。使用版本6.1.0。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

严谨度条件：不同的严谨度条件定义如下。

术语“非常低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“中严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“中-高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。

序列：术语“子序列”意指使一个或多个(若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有蛋白酶活性的片段。在一个方面，一个子序列含有至少489个核苷酸(例如SEQ ID NO:1的核苷酸713至1201或SEQ ID NO:3的核苷酸571至1059)。在另一个方面，一个子序列含有至少519个核苷酸(例如SEQ ID NO:1的核苷酸698至1216或SEQ ID NO:3的核苷酸556至1074)。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外来的或不需要的核苷酸的多核苷酸制品，并且其存在的形式适于在基因工程改造的多肽生产系统内进行使用。因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组关联的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选地，该多核苷酸是按重量计至少90％纯的，例如至少92％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、以及至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选以一种基本上纯的形式存在。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指这样一种制品，该制品包括与其天然关联或重组关联的按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽物质。优选地，该多肽按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该多肽来实现。

变体：术语“变体”意思指具有蛋白酶活性并且与SEQ ID NO:5具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性，在一个或多个(若干个)位置处包含一个或多个(若干个)氨基酸残基的改变(即取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除例如占据1-5个位置的1-5个氨基酸残基；并且插入意指邻近于占据一个位置的氨基酸添加例如1-5个氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:5的多肽的至少20％、例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。变体还可以是一种与SEQ ID NO:5具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的天然存在的蛋白酶。

发明详细说明

具有蛋白酶活性的多肽

具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，这些底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。

术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如在此使用的术语“亲本蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包括属于EC 3.4酶组(包括其十八个亚类中的每一个)的任何酶。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(SanDiego)的NC-IUBMB学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版于1994，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)223:1-5；1995，欧洲生物化学杂志232:1-6；1996，欧洲生物化学杂志237:1-5；1997，欧洲生物化学杂志250:1-6；以及1999，欧洲生物化学杂志264:610-650的增刊1-5。命名会定期得以增补和更新；参见例如万维网(WWW)于http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。

本发明提供了具有蛋白酶活性的多肽在动物饲料组合物中的用途。本发明还提供了编码这些多肽的多核苷酸。本发明的蛋白酶是S1肽酶家族的丝氨酸蛋白酶。本发明的蛋白酶展现了出人意料的pH特性，这使得它们成为用于在动物饲料中使用的感兴趣的候选物。因此本发明的蛋白酶在宽pH范围为5-11内在Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA上是最有活性的而在在Suc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA上具有合理的活性，并且在pH范围为6-11中展现尤其高的活性。它们在宽生理pH范围为pH 3-7之内对饲料相关的大豆粉-玉米粉底物具有活性并且经受低至4的pH 2小时后仍保留多于90％的活性。

本发明和根据本发明使用的蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：

(a)属于EC 3.4.21酶组的蛋白酶；和/或

(b)S1肽酶家族的丝氨酸蛋白酶；

如在1993，生物化学杂志(Biochem.)J.290:205-218和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.4(2011年1月31日)(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于罗林斯(Rawlings)，N.D.，巴雷特(Barrett)，A.J.和贝特曼(Bateman)，A.，2010，“MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:the peptidase database)”，核酸研究(Nucl.Acids Res.)38:D227-D233中。

为了测定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S1家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可对所有蛋白酶类型进行测定，而不论其是天然或野生型蛋白酶；还是经基因工程改造或合成的蛋白酶。

本发明的蛋白酶是内肽酶(EC 3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型：三种主要的活性类型是：胰蛋白酶样，其中在Arg或Lys后在P1处存在酰胺底物的切割；糜蛋白酶样，其中切割发生在P1处，在疏水性氨基酸中的一个之后；以及弹性蛋白酶样，具有在P1处Ala之后的切割。

S1家族的肽酶包含按His、Asp、Ser顺序的催化三联体。该催化三联体的任意氨基酸的突变将导致酶活性的变化或损失。如分离自红色糖多孢菌(SEQ ID NO:5)的S1蛋白酶2的催化三联体的氨基酸可能是位置His-32、Asp-56和Ser-137。

本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:5的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以及至少100％的蛋白酶活性。

本发明提供具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明的蛋白酶是S1肽酶家族的丝氨酸蛋白酶。本发明的蛋白酶展现了pH特性，尤其是pH稳定性特性，这使它们作为用于动物饲料和其他应用的候选物具有实质性利益。

本发明涉及选自下组的具有蛋白酶活性的分离的多肽在动物饲料中的用途，该组由以下各项组成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(b)一种多肽，该多肽由在中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：

(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；

(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；

(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)一种多肽，由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码；

(d)与SEQ ID NO:5多肽具有至少80％序列一致性的SEQ IDNO:5的多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入；并且

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

本发明涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不多于三十六个氨基酸，例如相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。

本发明还涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽相差不多于三十六个氨基酸，例如相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。

本发明进一步涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID NO:5的成熟多肽相差不多于三十六个氨基酸，例如相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少85％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少86％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少87％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少88％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少89％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少90％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少91％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少92％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少93％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少94％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少95％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少96％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少97％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少98％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少99％序列一致性。

本发明的一个实施例是用于在动物饲料中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有100％序列一致性。

本发明还涉及具有蛋白酶活性并且与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％序列一致性的分离的多肽，这些多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)SEQ ID NO:5的多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入；以及

(b)(a)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少85％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少86％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少87％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少88％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少89％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少90％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少91％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少92％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少93％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少94％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少95％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少96％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少97％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少98％的序列一致性的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或一种由多核苷酸编码的与SEQID NO:5的多肽具有至少99％的序列一致性的多肽。

本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的氨基酸序列、其等位基因变体或者由它们组成；或是从N端和/或C端缺失例如30、25、20、15、10或5个氨基酸并具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面，该多肽包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的多肽或由其组成。在另一个优选的方面，该多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至193、SEQ ID NO:4的氨基酸1至193和/或SEQ ID NO:5的氨基酸1至193或由其组成。

本发明还涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸在中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)SEQ IDNO:3的成熟多肽编码序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交(J.萨姆布鲁克(Sambrook)，E.F.弗里奇(Fritsch)和T.马尼亚蒂斯(Maniatis)，1989，分子克隆实验手册(Molecular Cloning,A LaboratoryManual)，第2版，冷泉港，纽约)。

SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3的多核苷酸或其子序列以及SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其片段可以用于设计核酸探针，用以根据本领域中众所周知的方法从不同属或种的菌株中鉴定并且克隆出编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。具体地说，这类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定并分离其中的相应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少14，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以筛选从这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3同源的克隆或DNA或其子序列，优选地在DNA印迹中使用载体材料。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高严谨度条件下与标记的核酸探针杂交，该标记的核酸探针对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；其全长互补链；或其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下该核酸探针杂交的分子。

在一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列。在另一个方面，该核酸探针是其片段。在另一个方面，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽或其片段的多核苷酸。在另一个优选的方面，该核酸探针是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，高至非常高严谨度条件定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA中，以及对于非常低和低严谨度在25％甲酰胺中，对于中和中-高严谨度在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严谨度在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在65℃(高严谨度)和在70℃(非常高严谨度)使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针而言，严谨度条件被定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(1962，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:1390)的计算法所计算的T_m之下大约5℃至大约10℃，在每毫升0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特(Denhardt)溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。最后，将载体材料在所计算的T_m之下5℃至10℃，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤1次(持续15分钟)并且使用6X SSC洗涤2次(每次15分钟)。

本发明还涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽具有蛋白酶活性，由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码。

本发明还涉及具有蛋白酶活性并且与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性、包含SEQ IDNO:5或其同源序列的至少一个或多个(若干个)氨基酸的至少一个取代、缺失和/或插入的变体多肽。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少86％序列一致性。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少87％序列一致性。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少88％序列一致性。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少89％序列一致性。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少90％序列一致性。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少91％序列一致性。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少92％序列一致性。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少93％序列一致性。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少94％序列一致性。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少95％序列一致性。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少96％序列一致性。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少97％序列一致性。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少98％序列一致性。

在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少99％序列一致性。

在另一实施例中，具有氨基酸取代、缺失和/或插入的本发明的变体多肽(SEQ ID NO:5)的位置总数不多于36，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36。氨基酸变化可以是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺失；小氨基-或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端蛋氨酸残基；具有多达约20-25个残基的一种小连接肽；或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组氨酸段(poly-histidine tract)、一种抗原表位或一种结合域。

本发明还涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽具有蛋白酶活性，由与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码。

在另一个实施例中，本发明还涉及用于在动物饲料中使用的变体，这些变体包含SEQ ID NO:2或其同源序列的一个或多个(或若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入。在SEQ ID NO:2中具有氨基酸取代、缺失和/或插入的位置总数不多于36，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36。氨基酸变化可以是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺失；小氨基-或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端蛋氨酸残基；具有多达约20-25个残基的一种小连接肽；或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组氨酸段(poly-histidine tract)、一种抗原表位或一种结合域。

在另一个实施例中，本发明还涉及用于在动物饲料中使用的变体，这些变体包含SEQ ID NO:4或其同源序列的一个或多个(或若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入。在SEQ ID NO:4中具有氨基酸取代、缺失和/或插入的位置总数不多于36，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36。氨基酸变化可以是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺失；小氨基-或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端蛋氨酸残基；具有多达约20-25个残基的一种小连接肽；或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组氨酸段(poly-histidine tract)、一种抗原表位或一种结合域。

在另一个实施例中，本发明还涉及用于在动物饲料中使用的变体，这些变体包含SEQ ID NO:5或其同源序列的一个或多个(或若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入。在SEQ ID NO:5中具有氨基酸取代、缺失和/或插入的位置总数不多于36，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36。氨基酸变化可以是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺失；小氨基-或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端蛋氨酸残基；具有多达约20-25个残基的一种小连接肽；或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组氨酸段(poly-histidine tract)、一种抗原表位或一种结合域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。预期不会实质上改变特异性活性的最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

一种亲本多肽中的必需氨基酸可以根据本领域中已知的程序来鉴定，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与亲本多肽相关的多肽的一致性分析推断必需氨基酸的一致性。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一部分在另一种多肽的一部分的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合蛋白还可以使用内含肽技术构建，其中融合在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，《工业微生物与生物技术杂志》(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，《生物技术杂志》(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，《生物技术》(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，《生物技术》9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，《生物化学》(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，《生物技术》13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，《蛋白质：结构、功能以及遗传学》(Proteins:Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，《药物发现世界》(Drug Discovery World)4:35-48。

实施方式

在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现了有益的热特性如热稳定性、蒸汽稳定性等，和/或pH特性如酸稳定性、pH最佳值等。

本发明的一个实施例是与蛋白酶10R相比在pH 6与9之间、在37℃下具有改善的蛋白酶活性的用于在动物饲料中使用的分离的多肽。

本发明的一个另外的实施例是与蛋白酶10R相比具有在15℃和60℃之间，诸如在25℃和50℃之间或在15℃、在25℃、在37℃、在50℃或在60℃下改善的蛋白酶活性的用于在动物饲料中使用的分离的多肽。

本发明的另一个实施例是与蛋白酶10R相比在40℃下，在pH 3.0与5.0之间，诸如在pH 3.0、4.0或5.0下，对大豆-玉米粉具有改善的蛋白酶活性的用于在动物饲料中使用的分离的多肽。

酸度/碱度特性

在本发明的某些实施例中，就pH而言，本发明的蛋白酶展现了有益的特性，例如酸稳定性、pH最佳值等。蛋白酶在一个低的pH下的稳定性是有益的，这是因为该蛋白酶可以在穿越胃之后在肠中具有活性。在本发明的一个实施例中，该蛋白酶在pH 4下2小时之后保留>90％的活性，如使用实例3中所述的方法确定的。

温度-活性

可如在实例3中所述的确定该蛋白酶的温度-活性曲线。在低温度(30℃-40℃)下的活性对于在动物中蛋白的消化可以是有利的。

在一个实施例中，本发明包含一种蛋白酶，当与在60℃下的蛋白酶的活性(比较实例3)相比时，该蛋白酶具有在25℃下0.15或更高的相对活性、在37℃下0.40或更高的相对活性、或在50℃下0.75或更高的相对活性的pH 7.0下的温度活性曲线。

pH-活性

可以如在实例3中所述的确定该蛋白酶的pH-活性曲线。在pH 6-8下的活性对于蛋白质在动物的肠中的消化可以是有利的。

在一个实施例中，本发明包含一种用于在动物饲料中使用的蛋白酶，当与在pH 9下的蛋白酶的活性相比时，该蛋白酶在37℃下具有在pH 7下0.50或更高的相对活性或在pH 8下0.80或更高的相对活性的pH-活性曲线(比较实例3)。

热稳定性

可如在实例5中所述的确定热稳定性，即使用DSC测量来确定经纯化的蛋白酶蛋白的变性温度(T_d)。Td指示了该蛋白的热稳定性：T_d越高，热稳定性越高。因此，在一个优选的实施例中，本发明的蛋白酶具有一个T_d，该T_d高于参照蛋白酶的T_d，其中T_d是对经纯化的蛋白酶样品(优选地具有至少90％或95％的纯度，如通过SDS-PAGE确定的)确定的。

在优选实施例中，如通过残余活性，变性温度T_d，所提供的这些热特性(例如加热稳定性、温度稳定性、热稳定性、蒸汽稳定性、和/或造粒稳定性)，或本发明的蛋白酶的其他参数高于相应的值(如SEQID NO:5的蛋白酶的残余活性或T_d)，更优选地是它的至少101％，或者它的至少102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、或者至少110％。甚至更优选地，本发明的蛋白酶的参数(如残余活性或T_d)的值是SEQ ID NO:5的蛋白酶的值的至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、或至少190％。

在仍另外的具体实施例中，本发明的热稳定的蛋白酶具有至少50℃的熔化温度T_m(或变性温度T_d)，如通过在实例10(即在20mM乙酸钠，pH值4.0)中所述的差示扫描量热法(DSC)所确定的。在仍另外的具体实施例中，该T_m是至少51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或至少100℃。

蒸汽稳定性

蒸汽稳定性可以如在实例6中所述的，通过确定在85℃或90℃下蒸汽处理一个短的时间之后蛋白酶分子的残余活性来确定。

造粒稳定性

造粒稳定性可如在实例7中所述的，通过使用与饲料预混合的酶颗粒来确定。由该混合器用蒸汽将该饲料调节至95℃。在调节之后，将该饲料加压成丸并确定残余活性。

具有蛋白酶活性的多肽的来源

可以从任何属的微生物获得具有蛋白酶活性且有待根据本发明而使用的多肽。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面中，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是具有蛋白酶活性的来自例如放线菌门内的一种革兰氏阳性细菌或来自例如变形菌门内的一种革兰氏阴性细菌的多肽。

在一个方面，该多肽是来自放线菌纲，例如来自放线菌目，或来自假诺卡氏菌亚目(Pseudonocardineae)，或来自假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)，或来自糖多孢菌属，或来自红色糖多孢菌种的细菌的蛋白酶。

将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些类群的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用上述探针，从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水，等等)分离的微生物鉴定并获得该多肽。用于从自然生境分离微生物的技术是本领域熟知的。随后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合DNA样品获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用这种或这些探针检测到编码一种多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员众所周知的的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸。

用来分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从这样的基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods and Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从芽孢杆菌属的一种菌株或来自芽孢杆菌目的另一种或相关生物中克隆多核苷酸，并且因此，例如可以是多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或物种变体。

本发明还涉及包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性程度(其条件是它与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列不100％相同)并且编码具有蛋白酶活性的多肽的多核苷酸或由其组成的分离的多核苷酸。

本发明进一步涉及与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性程度的多核苷酸或由其组成的分离的多核苷酸，这些分离的多核苷酸编码具有蛋白酶活性的多肽。

修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与该多肽基本上相似的多肽可能是必需的。术语“实质上类似”于该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优pH等方面不同的变体。该变体可以基于以SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，这些分离的多核苷酸在中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列、(iii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列、(iv)包含SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列、或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的全长互补链杂交；或如在此所定义的其等位基因变体和子序列(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

在一个方面，该多核苷酸包含SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，编码具有蛋白酶活性的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的片段的SEQ ID NO:1的子序列，或编码具有蛋白酶活性的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的片段的SEQ IDNO:3的子序列，例如SEQ ID NO:3的核苷酸541至1089的多核苷酸，或由其组成。

核酸构建体

本发明还涉及包括与一个或多个(若干个)控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸的核酸构建体，其中该控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中在与该控制序列相容的条件下的表达。

可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子序列，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。启动子序列包括介导多肽表达的转录控制序列。该启动子可以是在选择的宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(ScientificAmerican)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。

用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从以下基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶、以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，包含曲霉中一种编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由来自曲霉中一种编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包含修饰的启动子，包含来自黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由来自构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导子替代)；及其突变的、截短的、以及杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的合适转录终止子序列。终止子序列与编码多肽的多核苷酸的3’-末端可操作地连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子可以用于本发明中。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是一个前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何聚腺苷酸化序列。

丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶。

有用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中描述。

控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5’末端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外来信号肽编码序列。可替代地，外来信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯(Romanos)等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。

该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。

在多肽的N-末端处信号肽序列和前肽序列都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。

也可能令人希望的是添加调节序列，该调节序列允许相对于宿主细胞的生长而调节多肽的表达。调节系统的实例是引起将响应于化学或物理刺激(包含调节性化合物的存在)而开启或关闭的基因表达的那些系统。原核系统中的调控序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包含一个或多个(若干个)合宜的限制性位点以允许在这样的位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可替代地，通过将该多核苷酸或者包括该序列的核酸构建体插入到用于表达的适当载体中可以表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

载体优选地包含允许便于选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等的一个或多个(若干个)选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

用于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或该载体中通过同源或非同源重组而整合到该基因组中的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO 00/24883披露的方法完成。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括与指导本发明多肽产生的一个或多个(若干个)控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌菌、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。特别优选的宿主细胞是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。

例如通过原生质体转化(参见例如，常(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子和普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或者杜博楠(Dubnau)和大卫多夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、通过电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者通过接合(参见，例如凯勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169:5271-5278)可以实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞中。例如通过原生质体转化(参见例如，哈那汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见，例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)可以实现将DNA引入到大肠杆菌细胞中。可以例如通过原生质体转化和电穿孔(参见，例如贡(Gong)等人，2004，微生物学报(Folia Microbiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、通过接合(参见，例如马卓德(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)或通过转导(参见，例如伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)实现将DNA引入到链霉菌属细胞之中。例如通过电穿孔(参见，例如崔(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或通过接合(参见，例如皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)可以实现将DNA引入到假单胞菌属细胞中。例如通过天然感受态(参见，例如佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，传染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、通过原生质体转化(参见，例如卡特(Catt)和约里克(Jollick)，1991，微生物(Microbios)68:189-207)、通过电穿孔(参见，例如布克莱(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)或通过接合(参见，例如克莱怀尔(Clewell)，1981，微生物学综述(Microbiol.Rev.)45:409-436)可以实现将DNA引入到链球菌属细胞中。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门(如霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安-倍氏菌物辞典(Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际CAB，大学出版社，剑桥(Cambridge)，英国中所定义的)以及卵菌门(Oomycota)(如在霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文，第171页中所引用的)和所有有丝分裂孢子真菌(霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，为了本发明的目的，酵母应如在酵母生物学与活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)，F.A.，帕斯莫尔(Passmore)，S.M.和达文波特(Davenport)，R.R.编著，应用细菌学研讨会系列第9期(Soc.App.Bacteriol.Symposium SeriesNo.9)，1980)中所述进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一个细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且(b)回收该多肽。在优选的方面，细胞属于芽孢杆菌属。在一个更优选方面，该细胞是芽孢杆菌-19138。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一个本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该多肽。

使用本领域熟知的方法，在适合产生该多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，以及在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

以下的“核酸构建体、表达载体、重组宿主细胞和用于生产蛋白酶的方法”中提供了更多的细节。

可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法可包括使用特异抗体、形成酶产物、或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可以通过常规程序，包括，但不局限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀，从营养培养基中回收该多肽。

可以通过本领域已知的多种方法纯化该多肽，该方法包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，蛋白纯化(Protein Purification)，编者J.-C.詹森(Janson)和拉尔斯赖登(Lars Ryden)，VCH出版公司，纽约，1989)，以便获得基本上纯的多肽。

在一个可替代的方面中，不回收多肽，而是使用表达多肽的本发明宿主细胞作为多肽的来源。

植物

本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分、或植物细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生该多肽。该多肽可以从植物或植物部分回收。可替代地，可以按原样将包含该多肽的植物或植物部分用于改善食品或饲料的质量，例如，改善营养价值、适口性、以及流变性质，或用以破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉层和种皮。

同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。

表达多肽的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞：将编码多肽的一个或多个(若干个)表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体宜为包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。而且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的宿主细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。

调节序列(如启动子和终止子序列以及任选地信号或转运序列)的选择(例如)基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码多肽的基因的表达可以是组成性的或可诱导的，或可以为发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，例如种子或叶。调节序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(Plant Physiology)86:506描述。

对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、和稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell)21:285-294；克里斯滕森(Christensen)等人，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689；张(Zhang)等人，1991，植物细胞(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards(爱德华兹)和Coruzzi(科鲁兹)，1990,Ann.Rev.Genet.(遗传学年鉴)24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织)(Ito(伊藤)等人，1994,Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)24:863-878)，种子特异性启动子，例如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu(吴)等人，1998,Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学)39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad(康拉德)等人，1998,J.Plant Physiol.(植物生理学杂志)152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen(陈)等人，1998,Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学)39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO91/14772中所述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993，植物生理学(PlantPhysiol.)102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，该启动子可以通过非生物处理来诱导，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动子的物质来诱导，例如乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脱落酸和赤霉酸)、以及重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现多肽在植物中的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子与编码多肽的多核苷酸之间的内含子。例如，许等人，1993，见上文，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。

可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(加塞尔(Gasser)等人，1990，科学244:1293；波特里库斯(Potrykus)，1990，生物/技术8:535；岛本(Shimamoto)等人，1989，自然338:274)。

目前，根癌土壤杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物的所选方法(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)19:15-38)，并且还可被用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物常常使用其他的转化方法。目前，用于产生转基因单子叶植物所选择的方法是对胚性愈伤组织或发育胚的粒子轰击(用转化DNA包被的显微金或钨颗粒)(克里斯托(Christou)，1992，《植物杂志》(Plant J.)2:275-281；岛本(Shimamoto)，1994，《生物技术当前观点》(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；瓦西尔(Vasil)等人，1992，《生物/技术》10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由奥米儒勒(Omirulleh)等人，1993，植物分子生物学21:415-428所描述。根据本披露使用的另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204中所述的那些(这二者都通过引用以其全文结合在此)。

在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

除用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可以通过将具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可以将编码多肽的构建体通过杂交引入具体植物品种，而根本无需直接转化那个给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。这种后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体或根据本发明制备的DNA构建体的一部分。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。这类步骤的非限制性实例进一步在美国专利号7,151,204中明确地表达。

植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。

可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有助于产生该多肽的条件下培养包括编码该多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；并且(b)回收该多肽。

组合物

本发明还涉及包含本发明的蛋白酶的组合物。优选的是，这些组合物富含这样一种蛋白酶。术语“富含”指示该组合物的蛋白酶活性已经增加，例如，以至少1.1的一个富集因子。

该组合物可以包含本发明的蛋白酶作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。可以例如通过微生物(如细菌或真菌)或通过植物或通过动物产生另外的一种或多种酶。这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。该蛋白酶可以根据本领域中已知的方法稳定化。

用途

本发明还针对用于使用具有蛋白酶活性的多肽或其组合物(用于例如动物饲料)的方法。

动物饲料

本发明还针对用于在动物饲料中使用具有蛋白酶活性的蛋白酶的方法，并涉及包括本发明蛋白酶的饲料组合物和饲料添加剂。

术语动物包括所有动物，包括人。动物的实例为非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如，动物，如绵羊、山羊、和牛，例如，肉牛、奶牛和牛犊。在具体实施例中，动物为非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如，猪(包括，但不限于，小猪，成长猪，和母猪)；家禽，如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡和蛋鸡)；马(包括但不限于热血马、冷血马和温血马)、小牛；和鱼(包括但不限于，鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；和甲壳动(包括但不限于虾和对虾)。

术语饲料或饲料组合物意思指适于或者意在由动物摄入的任意化合物、制剂、混合物或组合物。

在根据本发明的用途中，可在饮食之前，之后或同时给动物饲喂蛋白酶。优选后者。

在具体实施例中，明确限定了处于往饲料中添加的蛋白酶或当包含在饲料添加剂中时的形式的蛋白酶。明确限定指的是如经大小排阻色谱法(参见WO 01/58275的实例12)测定的，蛋白酶制剂至少为50％纯。在其他具体实施例中，如经此方法测定的，蛋白酶制剂至少为60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％、或至少为95％纯。

明确限定的蛋白酶制剂是有利的。例如，对于实质上不受其他蛋白酶干扰或污染的蛋白酶而言，更容易确定它在饲料中的正确剂量。术语正确剂量具体指得到一致和恒定的结果的目标，和基于所希望的效果能够优化剂量。

然而，为了在动物饲料中使用，蛋白酶不必那么纯；可以例如包括其他酶，此时可将其称为蛋白酶制品。

该蛋白酶制剂可以(a)直接加入饲料(或者直接用于蛋白处理过程)，或者(b)它可以用于一种或多种随后加入饲料(或者用于处理过程中)的中间组合物，如饲料添加剂或者预混合物的生产。不论是否根据上述(a)或(b)来使用，上文所述的纯度指的都是原始蛋白酶制剂的纯度。

具体地说，使用重组生产方法即可获得纯度为上述数量级的蛋白酶制剂，然而，当通过传统的发酵方法生产蛋白酶时，要想获得这些蛋白酶制剂却并非易事，而且，批次与批次之间会有较高的差异。

这类蛋白酶制品当然可以与其他酶混合。

该蛋白可以是一种动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉；或者其可以是一种植物性蛋白。

本文所用术语植物性蛋白指的是包含至少一种衍生自或源自植物的蛋白，包含修饰的蛋白和蛋白衍生物的任何化合物，组合物，制品或混合物。在具体实施例中，这些植物性蛋白的蛋白含量至少为10％、20％、30％、40％、50％或60％(w/w)。

植物性蛋白可以衍生自植物性蛋白来源，如豆类和谷类，例如得自蝶形花科(豆科)，十字花科，藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉，羽扇豆粉和油菜籽粉。

在具体实施例中，植物性蛋白来源是得自蝶形花科的一种或多种植物，如大豆，羽扇豆，豌豆或蚕豆的材料。

在另一个具体实施例中，植物性蛋白来源是得自藜科的一种或多种植物，如甜菜，糖甜菜，菠菜或奎奴亚藜的材料。

植物性蛋白来源的其他实例为油菜籽、向日蔡籽、棉籽和卷心菜。

大豆为优选的植物性蛋白来源。

植物性蛋白来源的其他实例为谷类，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻、黑小麦和高粱。

在处理过程的具体实施例中，所讨论的这种或这些种蛋白酶影响这些蛋白如植物性蛋白或蛋白来源(或对其发挥作用或施加水解或降解影响)。为了达到此目的，一般将蛋白或蛋白来源悬浮于溶剂，例如含水溶剂，如水中，并适当关注所讨论的酶的特征，以调节pH和温度值。例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的pH值下进行处理。类似地，例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的温度下进行处理。上述活性百分比指示是相对于最大活性而言的。持续进行酶促反应直至获得所需结果，然后可以通过例如热-处理步骤灭活酶来终止反应，或者也可以不终止反应。

在本发明处理过程的另一个具体实施例中，蛋白酶作用被维持，这意味着例如将蛋白酶加入这些蛋白，但其水解影响可以说尚未开启，直到后来当有此需求时，一旦建立了适当的水解条件，或一旦灭活了任何酶抑制剂，或不论使用何种其他方式延迟了酶的作用，才会开启其水解影响。

在一个实施例中，处理是预-处理动物饲料或用于动物饲料的蛋白，即这些蛋白是在摄入之前被水解的。

术语改善动物饲料的营养价值指的是提高饲料中的营养的可利用性。在本发明中，改善营养价值具体指的是改善饲料的蛋白部分的可利用性，从而导致蛋白提取的增加，较高的蛋白产量，和/或蛋白利用的改善。当饲料的营养价值增加时，蛋白和/或氨基酸消化率增加，并且该动物的生长速率和/或体重增加量和/或饲料转化(即相对于体重增加的饲料摄取量)可被改善。

能以任何形式将蛋白酶添加至饲料中，如它是相对纯的蛋白酶，或与欲添加至动物饲料的其他组分的混合物，即以动物饲料添加剂的形式，例如所谓的动物饲料预混物。

在另一方面，本发明涉及用于动物饲料的组合物，如动物饲料和动物饲料添加剂，如预混合物。

除本发明的蛋白酶外，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种脂溶性维生素和/或至少一种水溶性维生素和/或至少一种微量矿物质和/或至少一种大量矿物质。

另外，可任选的，饲料添加成分是着色剂例如类胡萝卜素如β-胡萝卜素、虾青素、和叶黄素；稳定剂；生长改善添加剂和芳香化合物/调味品，例如甲氧甲酚，茴香脑，十-、十一-和/或十二-内酯，紫罗酮、鸢尾酮、姜辣素、哌啶、亚丙基苯酞、亚丁基苯酞、辣椒素和/或丹宁酸；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸(PUFA)；产活性氧种类；另外，可以使用一种支持物，其可包含例如按重量计40％-50％的木质纤维、按重量计8％-10％的硬脂酸、按重量计4％-5％的姜黄粉、按重量计4％-58％的迷迭香粉、按重量计22％-28％的石灰岩、按重量计1％-3％的树胶如阿拉伯树胶、按重量计5％-50％的糖和/或淀粉以及按重量计5％-15％的水。

本发明的一种饲料或饲料添加剂还可包含选自以下各项之中的至少一种其他的酶：植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；另外的蛋白酶(EC 3.4)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶如，例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。

在具体实施例中，这些其他酶被明确定义(如上对蛋白酶制剂定义的)。

抗微生物肽(AMP)的实例是CAP18、林可霉素(Leucocin)A、Tritrpticin、Protegrin-1、死亡素(Thanatin)、防卫肽、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽、和Ovispirin如Novispirin(Robert Lehrer(罗伯特·莱勒)，2000)、菌丝霉素(Plectasins)以及他汀类，包含在WO 03/044049和WO03/048148中所披露的化合物和多肽，以及以上的保留了抗微生物活性的变体或片段。

抗真菌多肽(AFP)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉的肽，连同其保留了抗真菌活性的变体和片段，如在WO94/01459和WO 02/090384中披露的。

多不饱和脂肪酸的实例为C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚麻酸。

产生活性氧的种类的实例为化学品，如过棚酸盐、过疏酸盐或过碳酸盐；和酶，如氧化酶、加氧酶和合成酶。

通常，脂溶性和水溶性维生素，以及微量矿物质形成部分所谓的意在加入饲料中的预混合物，而大量矿物质通常单独加入饲料。这些组合物的任一个类型，当富含于本发明的蛋白酶时，都是本发明的动物饲料添加剂。

在具体实施例中，本发明的动物饲料添加剂以0.01％至10.0％，更具体0.05％至5.0％或0.2％至1.0％(％指g添加剂/100g饲料)的水平包含(或规定为必须包含)在动物饮食或饲料中。具体地说，对预混物也是如此。

下文列出了这些组分的非-排他性实例：

脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E、以及维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如Ca-D-泛酸盐。

微量矿物质的实例为锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。

大量矿物质的实例为钙、磷和钠。

在WO 01/58275的表A中，列出了这些组分的营养需求(以家禽和仔猪/猪为例)。营养需求指的是应在饮食中提供指定浓度的这些组分。

在可替代的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含WO 01/58275中的表A所详细说明的单个组分中的至少一种。至少一种指的是一种或两种或三种或四种等直至所有十三种，或直至所有15种单个组分中的任一种，一种或多种。更具体地，本发明的添加剂包含该至少一种单个组分，其含量能使其在饲料中的浓度落入表A第4或第5或第6栏所示的范围。

在仍另外的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含以下维生素中的至少一种，优选地以在以下的表1中所详细说明的饲料内浓度范围提供(分别对于小猪饮食和肉仔鸡饮食)。

表1：一般性维生素建议

维生素	小猪饮食	肉仔鸡饮食
			维生素A	10,000-15,000IU/kg饲料	8-12,500IU/kg饲料
维生素D3	1800-2000IU/kg饲料	3000-5000IU/kg饲料
			维生素E	60-100mg/kg饲料	150-240mg/kg饲料
维生素K3	2-4mg/kg饲料	2-4mg/kg饲料
			维生素B1	2-4mg/kg饲料	2-3mg/kg饲料
维生素B2	6-10mg/kg饲料	7-9mg/kg饲料
			维生素B6	4-8mg/kg饲料	3-6mg/kg饲料
维生素B12	0.03-0.05mg/kg饲料	0.015-0.04mg/kg饲料
			烟酸(维生素B3)	30-50mg/kg饲料	50-80mg/kg饲料
泛酸	20-40mg/kg饲料	10-18mg/kg饲料
			叶酸	1-2mg/kg饲料	1-2mg/kg饲料
生物素	0.15-0.4mg/kg饲料	0.15-0.3mg/kg饲料
			氯化胆碱	200-400mg/kg饲料	300-600mg/kg饲料

本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白含量。家禽和猪饮食的特征如WO 01/58275，表B第2-3栏所示。鱼食可被表征为该表B第4栏中所示的。此外，这类鱼食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。

WO 01/58275相当于US 09/779334，被列入本文作为参考。

根据本发明的动物饲料组合物具有的粗蛋白含量为50-800g/kg，此外还包含至少一种本文所要求的蛋白酶。

此外，或替代地(对于以上所示的粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。

在具体实施例中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量落入WO 01/58275，表B，范围2、3、4或5中的任何一个中(R.2-5)。

粗蛋白以氮(N)乘以系数6.25计算，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)X 6.25。通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)测定氮含量(A.O.A.C.，1984，官方分析方法(Official Methods of Analysis)第14版，官方分析化学家集(Association of Official Analytical Chemists)，华盛顿特区)。

可代谢能量可根据NRC出版物猪的营养需求(Nutrientrequirements in swine)，第九次再版1988，国家研究委员会农业部动物营养协会猪营养分会。美国国家科学院出版社，华盛顿特区，第2-6页和欧洲家禽饲养材料能量值表(European Table of Energy Values forPoultry Feed-stuffs)，斯克得霍特(Spelderholt)家禽研究与推广中心，7361DA贝克贝亨，荷兰，Grafisch bedrijf Ponsen&looijen公司，瓦赫宁恩，ISBN 90-71463-12-5计算。

完整的动物食料中钙、有效磷和氨基酸的饮食含量根据如Veevoedertable 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde wan voedermiddelen，CentralVeevoederbureau，Runderweg 6,8219pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7计算。

在具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含如上定义的至少一种植物性蛋白。

本发明的动物饲料组合物还可以包含动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉，通常量为0-25％。本发明的动物饲料组合物还可以包含具有可溶物的干酒糟(Dried Distillers Grains)，通常量为0-30％。

在另一具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％的大麦；和/或0-30％的燕麦；和/或0-40％的大豆粉；和/或0-25％的鱼粉；和/或0-25％的肉和骨粉；和/或0-20％的乳清。

可将动物饮食制备成例如糊状饲料(非丸状)或丸状饲料。通常，混合研磨的饲料并根据所讨论的这些种类的说明加入必需维生素和矿物质的足够量。以固体或液体酶配制品的形式加入酶。例如，对于糊状饲料，在成分混合步骤前或期间可加入固体或液体酶配制品。对于丸状饲料，在饲料成分步骤前或期间还可加入该(固体或液体)蛋白酶/酶制剂。典型地，在造粒步骤之后加入一种液体蛋白酶/酶制剂。也可以将酶掺入饲料添加剂或预混物。

饮食中最终的酶浓度是在0.01-200mg酶蛋白/kg饮食范围内，例如在0.5-25mg酶蛋白/kg动物饮食的范围内。

当然，应该以有效量，即足以改善饲料的水解、消化性和/或改善营养价值的量使用蛋白酶。目前期望以下述量(剂量范围)中的一种或多种施用酶：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50或0.10-10-所有这些范围都是每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数(ppm)。

为了测定每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数，从饲料组合物中纯化蛋白酶，并且使用相关试验(参见蛋白酶活性，底物和试验)测定经纯化的蛋白酶的比活性。使用相同试验测定该饲料组合物的蛋白酶活性，并且在这两次测定的基础上计算出以每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数计的剂量。

使用相同的原理测定饲料添加剂中的蛋白酶蛋白mg数。当然，如果可获得制备饲料添加剂或饲料所用蛋白酶的样品，可由该样品测定比活性(无需从饲料组合物或添加剂中纯化蛋白酶)。

核酸构建体、表达载体、重组宿主细胞和用于生产蛋白酶的方法

本发明还涉及包含编码本发明的蛋白酶的这类多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。

本发明还涉及产生蛋白酶的方法，包含(a)对包含这种多核苷酸的重组宿主细胞进行培养；并且(b)回收该蛋白。

该蛋白质对于宿主细胞而言可以是天然的或异源的。术语“蛋白”在此并不是指特定长度的编码产物并且，因此，包含肽、寡肽和蛋白。术语“蛋白质”还涵盖组合形成编码的产物的两个或更多个多肽。这些蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。

优选地，该蛋白是一种蛋白酶。例如，该蛋白可以是一种水解酶，例如蛋白水解酶或蛋白酶。该基因可以从任何原核、真核或其他来源获得。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。

实例

材料与方法

蛋白酶测定法

1)Suc-AAPF-pNA测定

pNA底物：Suc-AAPF-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1400)。

温度：室温(25℃)

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、及11.0。

将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD₄₀₅的增加作为蛋白酶活性的量度。

2)Protazyme AK测定

底物：Protazyme AK片(交联和染色的酪蛋白；来自麦格酶公司(Megazyme))

温度：受控的(测定温度)。

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0、及11.0。

通过温和搅拌，将一片Protazyme AK悬浮于2.0ml 0.01％TritonX-100中。将500μl的这种悬浮液和500μl的测定缓冲液分散在艾本德离心管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％TritonX-100中)。通过将艾本德离心管转移至设定为测定温度的艾本德恒温混匀仪(Eppendorf thermomixer)来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400转/分钟)下孵育15分钟。通过转移该管返回至冰浴停止孵育。随后将管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μl上清液转移至微量滴定板。读取OD₆₅₀作为蛋白酶活性的量度。在测定法中包含空白缓冲液(buffer blind)(代替酶)。

3)Suc-AAPX-pNA测定

pNA底物：Suc-AAPA-pNA(Bachem L-1775)

Suc-AAPR-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1720)

Suc-AAPD-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1835)

Suc-AAPI-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1790)

Suc-AAPM-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1395)

Suc-AAPV-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1770)

Suc-AAPL-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1390)

Suc-AAPE-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1710)

Suc-AAPK-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1725)

Suc-AAPF-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1400)

温度：室温(25℃)

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 6.0或pH 9.0。

将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD₄₀₅的增加作为蛋白酶活性的量度。

邻苯二甲醛(OPA)测定法

这一测定检测伯胺并且因此可以将肽键由一种蛋白酶的切割测量为蛋白酶处理的样品与对照样品之间的吸光度的差异。基本上根据尼尔森(Nielsen)等人(尼尔森(Nielsen)，PM，彼得森(Petersen)，D，达姆麦妮(Dampmann)，C.用于确定食物蛋白水解程度的改进方法(Improved method for determining food protein degree of hydrolysis)，2001，食品科学杂志(J Food Sci)，66:642-646)进行该测定。

将500μl样品通过100kDa微量浓缩(Microcon)离心过滤器(60min，11,000rpm，5℃)过滤。将这些样品在去离子水中稀释大约(例如10倍、50倍或100倍)，并将25μL的每份样品装载到96孔微量滴定板中(5个重复)。将200μl OPA试剂(100mM四硼酸二钠十水合物，3.5mM十二烷基硫酸钠(SDS)，5.7mM二硫苏糖醇(DDT)，6mM邻苯二甲醛)分配在所有孔中，振荡该板(10sec，750rpm)并且在340nm下测量吸光度。

菌株

编码来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1的核苷酸序列由奥林利克(Oliynyk)等人公布于‘产生红霉素的细菌红色糖多孢菌NRRL23338的全基因组序列(Complete genome sequence of theerythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraeaNRRL23338)’中，2007，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)25:447-453并且将该基因在登录号EMBL：AM420293下提交至EMBL/GenBank。根据奥林利克(Oliynyk)，‘使用的菌株NRRL23338是红色糖多孢菌NRRL2338的模式菌株的原始形式，现在该菌株在NRRL数据库中被列为白色NRRL23338(NRRL23338white)’。NRRL数据库指示(在对应于白色NRRL 23338的NRRL编号B-24071下)‘白色菌落变体分离自来自第二冻干的安瓿的生长’。用于NRRL2338的参考文献引用US 2,653,899，其中指出在1952年或之前从菲律宾群岛的怡朗市(IlonioCity)获得作为土壤样品的红色糖多孢菌NRRL2338的原始样品。

实例1：来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2的表达

基于被鉴定为SEQ ID NO:1的公开的核苷酸序列，由Gene Art(基因技术生物园公司(GENEART AG BioPark)，约瑟夫-恩格特大街(Josef-Engert-Str.)11号，93053，雷根斯堡，德国)合成具有SEQ IDNO:3的合成基因。如在WO 12/025577中所述，使用ClaI和MluI限制酶切位点将该合成基因亚克隆进芽孢杆菌属表达载体中。在每ml补充有6μg氯霉素的LB板上选择转化体。选择包含整合的表达构建体的重组体枯草芽孢杆菌克隆并且将其指定为来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2。将其在500mL带挡板的锥形瓶(Erlenmeyer flask)中的旋转摇床上培养，每个锥形瓶包含补充有34mg/l氯霉素的100ml基于酪蛋白的培养基。将该克隆在26℃、在225rpm下培养5天。收获包含上清液的酶并如实施例2中所述的将该酶进行纯化。

实例2：来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2的纯化

将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余芽孢杆菌宿主细胞。将0.2μm滤液转移至在G25葡聚糖凝胶柱(来自GE医疗公司)上的20mM Tris/HCl、1mM CaCl₂(pH 8.0)。将经G25葡聚糖凝胶转移的滤液施加到Q-sepharose FF柱(来自GE医疗公司)上，该柱以20mM Tris/HCl、1mM CaCl₂(pH 8.0)平衡。在将柱用平衡缓冲液洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0->0.5M)经五个柱体积进行洗脱。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定法)，并且合并峰级分。将固体(NH₄)₂SO₄添加至来自Q-sepharose FF柱的池至最终2.0M(NH₄)₂SO₄浓度并且将盐调节的池施加到100mM H₃BO₃、10mMMES、2mM CaCl₂、2.0M(NH₄)₂SO₄(pH 6.0)平衡的苯基-Toyopearl柱(来自东曹公司(TosoHaas))。在用平衡缓冲液洗涤该柱之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性(NH₄)₂SO₄梯度(2.0-->0M)进行洗脱超过五个柱体积。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定法)，并且合并峰级分。将自苯基-Toyopearl柱的池用50mM柠檬酸/NaOH、1mM CaCl₂(pH 4.0)稀释3次，并且将该pH用1M HCl调节至pH 4.0。将经调节的池施加至XpressLine ProA柱(来自UpFront层析公司(UpFrontchromatography))，该柱以50mM柠檬酸/NaOH、1mM CaCl₂(pH 4.0)平衡。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用50mMTris/NaOH(pH 9.0)逐步洗脱。将来自柱的部分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定)，并且通过SDS-PAGE来对活性部分进行分析。将级分(在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上的仅见到一条带)合并并且用于进一步表征。

实例3：来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2的表征

将Suc-AAPF-pNA测定法用于获得pH-活性曲线和pH-稳定性曲线(在指示的pH值下2小时之后的残余活性)。对于pH-稳定性曲线，将蛋白酶在不同测定缓冲液中稀释10x以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37℃下孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH 9.0测定缓冲液中，将蛋白酶孵育物的pH调节至相同的pH值。在pH 9.0下，测量相对于样品的残余活性，将该样品在稳定条件(5℃，pH 9.0)下保持。使用Protazyme AK测定法以获得在pH 7.0下的温度-活性曲线。使用Suc-AAPX-pNA测定法和十种不同的Suc-AAPX-pNA底物以获得这些酶在pH 9.0下的P1-特异性。结果示于表2-5和图1-4中。

表2：如使用Suc-AAPF-pNA测定确定的在37℃下的pH-活性曲 线

pH	来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2	蛋白酶10R
			2	0.00	-
3	0.00	0.00
			4	0.01	0.02
5	0.06	0.07

6	0.25	0.21
			7	0.56	0.44
8	0.86	0.67
			9	1.00	0.88
10	0.95	1.00
			11	0.84	0.93

注释：活性是相对于酶的最佳pH而言。

表3：如使用Suc-AAPF-pNA测定确定的pH-稳定性曲线(在37℃ 下2小时之后的残余活性)

注释：活性是相对于样品的残余活性，将该样品保持在稳定条件(5℃，pH 9.0)下。

表4：如使用Protazyme AK测定而确定的温度活性曲线

注释：活性是相对于该酶在pH 7.0或6.5下的最适温度而言。

表5：如使用Suc-AAPX-pNA测定而确定的在25℃下对10 Suc-AAPX-pNA底物的P1-特异性

注释：活性是相对于该酶的最佳底物(Suc-AAPF-pNA)而言。

来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2的其他特征

抑制剂：PMSF和CI-2A。

通过埃德曼降解确定N末端序列为：ADVIGGD。

如通过SDS-PAGE所确定的相对分子量大约是M_r＝21kDa。

通过完整分子量分析确定的分子量是18379.4Da。

成熟序列(来自MS数据、埃德曼降解数据和DNA测序)：

ADVIGGDAYYIGSGSRCSVGFSVQGGFVTAGHCGNQGDSTSQPSGTFEGSSFPGNDYGWVRTASGENPVPLVNDYQGGTVGVAGSSEAAEGASICRSGSTTGWHCGTVEAKNQTVRYPQGTVEGLTRTNVCAEPGDSGGSWLSGDQAQGVTSGGSGDCTSGGTTYFQPVNEILQAYGLTLLTQ

来自这一成熟序列的计算的分子量是18379.6Da。

实例4：大豆-玉米粉活性测定法

采用使用大豆-玉米粉作为底物的终点测定以获得在pH 3-7时该蛋白酶的pH-活性曲线。

底物：将大豆粉-玉米粉以30:70比例混合。

测定缓冲液：制备包含100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mMCHES，100mM CAPS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100的9种缓冲液并使用HCl或NaOH调节至一个pH值这样使得在将大豆-玉米粉底物(1g)与测定缓冲液(10mL)混合之后给出一种浆体，该浆体的终pH是以下pH之一：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0以及11.0。

在添加蛋白酶并在40℃下孵育(500rpm)3小时之前将底物浆体(2mL)混合30min。将蛋白酶(200mg酶蛋白/kg干物质)溶解于100μl 100mM乙酸钠缓冲液(9.565g/L NaOAc，1.75g/L乙酸，5mMCaCl₂，0.01％BSA，0.01％吐温20，pH 6.0)中并且添加。将样品离心(10min，4000rpm，0℃)并且将收集的上清液使用邻苯二甲醛(OPA)测定法进行分析。

结果示于下表6和图5中。来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2对大豆-玉米粉的蛋白水解活性随着pH从pH 3增加至pH 7而增高。然而来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2在pH 6-7下是与的蛋白酶10R一样活性的，其在pH 3-5下显示稍许较高的活性，表明来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2可能在单胃动物的整个胃肠道中在水解蛋白方面具有更有效的潜能。

表6：在40℃在pH3.0至7.0下对大豆-玉米粉的蛋白酶活性(OD ₃₄₀ x稀释因子)

图5示出来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶2与10R蛋白酶相比，对大豆-玉米粉的活性(OD₃₄₀x稀释因子)。

实例5：热稳定性

将蛋白酶的蛋白样品的等分部分(如实例2中所述的经过纯化的)脱盐或使用预装PD-10柱改变缓冲液为20mM乙酸钠，pH 4.0或在4℃下以2-3h步骤针对2x 500ml 20mM乙酸钠，pH 4.0进行透析，随后是一个过夜步骤。将该样品进行0.45μm过滤并用缓冲液稀释至大约2A280单位。在差示扫描量热法(DSC)中使用该透析缓冲液作为参照。使用真空吸引器对这些样品进行脱气并搅拌大约10分钟。

以1.5℃/min的恒定扫描速率从20℃-90℃在MicroCal VP-DSC上进行DSC扫描。使用MicroCal原点软件(Origin software)(4.10版本)进行数据处理，并将变性温度T_d(也称为熔解温度T_m)定义为温度自记曲线的峰尖端的温度。

实例6：蒸汽稳定性

可以使用以下测定法评价蒸汽处理后该蛋白酶的残余活性。

在这些试验中，使用修改设置从而该蒸汽是从蒸汽发生器中提供的并被导入到箱中。当温度达到约93℃-94℃时，通过抽屉将放置在板上的这些样品插入到该箱中。插入这些样品后，温度即降低4℃。当温度停留在大约恒定的90℃时，孵育30秒。其后，将该板快速从该箱中移出，将这些样品放置在冰上，重悬浮并针对蛋白酶活性使用Suc-AAPF-pNA或邻苯二甲醛(OPA)测定法进行评价。将每个酶样品与未经过蒸汽处理的相似样品进行对比以计算残余活性。

实例7：造粒稳定性测试

如美国专利号4,106,991，实例1中所述的方式进行酶粒化。将获得的颗粒在流化床中干燥至含水量低于1％并过筛以获得具有250μm至850μm粒子范围的产物。最终，将该产物用棕榈油和碳酸钙以如在美国专利号4,106,991，实例22中所述的方式进行包衣。

在小型卧式搅拌器中，大致地将50g酶颗粒与10kg饲料预混合10分钟。在大型卧式搅拌器中将该预混合物与90kg饲料混合10分钟。将该饲料从该搅拌器中以大约300kg/小时的速率导至调节器(带有蒸汽注入的串联搅拌器)。该调节器通过注入蒸汽将该饲料加热至95℃(在排气口进行测量)。在该调节器中的停留时间是30秒。将该饲料从该调节器中导至配备有3.0x 35mm水平冲模的西蒙黑森(SimonHeesen)压力机中并将其压缩成具有15mm左右的长度的丸。在压缩后，将这些丸放置在冷气机中并冷却15分钟。

使用Suc-AAPF-pNA测定法，在造粒之前测量蛋白酶活性，并在造粒之后测量该饲料粒中的蛋白酶活性。通过将粒状饲料中的蛋白酶活性相对于非粒状饲料中的活性相对比以确定造粒稳定性。

Claims (28)

1.一种具有蛋白酶活性的分离的多肽的用途，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；

(b)一种多肽，该多肽由在中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：

(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；

(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；和/或

(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(d)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％序列一致性的SEQ IDNO:5的多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性；

该用途是在动物饲料中。

2.如权利要求1所述的用途，其中该多肽包括SEQ ID NO:2或由其组成。

3.如权利要求1所述的用途，其中该多肽包括SEQ ID NO:4或由其组成。

4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中该多肽是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的一个片段，其中该片段具有蛋白酶活性。

5.一种变体多肽，该变体多肽具有蛋白酶活性并且与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列一致性，该变体多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)SEQ ID NO:5的多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括至少一个取代、缺失和/或插入；以及

(b)(a)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

6.一种包含具有蛋白酶活性的分离的多肽的组合物，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；

(b)一种多肽，该多肽由在中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：

(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；

(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；和/或

(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(d)一种变体，该变体包含SEQ ID NO:5的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

7.一种编码如权利要求1-6中任一项表明的多肽的分离的多核苷酸，其条件是它与SEQ ID NO:1或其成熟多肽编码部分不100％相同。

8.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求7所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内的产生的一个或多个(若干个)控制序列。

9.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求7所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。

10.如权利要求9所述的宿主细胞，其中该宿主是一种细菌，如芽孢杆菌属；一种真菌，如曲霉属；或一种酵母菌，如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或亚罗酵母属。

11.如权利要求9所述的宿主细胞，其中该宿主是一种芽孢杆菌，诸如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽胞杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌。

12.如权利要求9所述的宿主细胞，其中该宿主是一种链霉菌，诸如浅青紫链霉菌、天蓝链霉菌、除虫链霉菌、或灰色链霉菌。

13.一种产生如权利要求1-6中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且

(b)回收该多肽。

14.一种产生具有蛋白酶活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求9-12中任一项所述的宿主细胞；并且

(b)回收该多肽。

15.用一种多核苷酸转化的一种转基因植物、植物部分或植物细胞，该多核苷酸编码如权利要求1-6中任一项所述的多肽。

16.一种产生具有蛋白酶活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下，培养如权利要求15所述的转基因植物或植物细胞；并且

(b)回收该多肽。

17.如权利要求1-6中任一项表明的至少一种多肽在以下各项中的用途：

在动物饲料中；

在动物饲料添加剂中；

在用于在动物饲料中使用的组合物的制备中；

用于改善动物饲料的营养价值；

用于增加动物饲料中的可消化和/或可溶性蛋白；

用于增加动物饮食中的蛋白的水解程度；和/或

用于处理蛋白。

18.一种用于改善动物饲料的营养价值的方法，其中向该饲料中添加至少一种如权利要求1-6中任一项表明的多肽。

19.一种动物饲料添加剂，包含：

至少一种如权利要求1-6中任一项表明的多肽；以及

至少一种脂-溶性维生素，和/或

至少一种水-溶性维生素，和/或

至少一种微量矿物质。

20.如权利要求19所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂进一步包含以下各项中的一种或多种：淀粉酶；植酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶，β-葡聚糖酶，或其任何混合物。

21.一种动物饲料，包含如权利要求18或19所述的动物饲料添加剂。

22.根据权利要求21所述的动物饲料，具有50至800g/kg的粗蛋白含量。

23.一种用于处理蛋白的方法，该方法包含将如权利要求1-6中任一项表明的至少一种多肽添加至至少一种蛋白或蛋白来源中的步骤。

24.如权利要求23所述的方法，其中大豆包含在该至少一种蛋白来源中。

25.如权利要求1-6中任一项所述的至少一种多肽在动物饲料中的用途。

26.一种动物饲料组合物，包含至少一种如权利要求1至6中任一项表明的多肽。

27.如权利要求26所述的动物饲料组合物，其中该组合物包含一种或多种另外的酶。

28.如权利要求26所述的动物饲料组合物，其中这些另外的酶选自下组，该组包括：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物。