TWI267551B - DNA vaccine-PCV - Google Patents
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1267551 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（ 一本發明係有關於能將會導致PMWS症候群（豬多重系統性 消耗症候群或斷奶後消耗症候群）之豬環狀病毒， Porcine CircoVirus)的免疫原編碼並表現出來的質體結構、 免疫方法及DNA疫苗，以及製備與調配這些疫苗之方法。 所有在此引用的文獻，以及所有文獻中引用的文獻在此皆 做爲參考資料。 PCV最初是在豬腎細胞株（ρκ/15)所發現之無細胞致病性 污染物。该病毒與雞貧血病毒（CAV，Chicken Anaemia Virus)及PBFDV病毒（赛它新喙及羽毛病病毒（psciuacine Beak and Feather Disease Virus))共同分類爲環狀病毒屬 (Circoviridae)。這些病毒係小型無鞘膜病毒（由η至24 nm)，其共同特徵係含一；1.76至2.31個仟鹼基（kb)之環狀單股 DNA型式的基因組。起初認爲該基因組可編碼出一約3〇 kDa之多肽[陶德（Todd)等人，Arch. Virol·，1991，117 : 129_ 135]。然而最近的研究卻顯示出更複雜之轉譯作用[米漢 (Meehan) Β·Μ·等人，j· Gen. Virol·，1997，78 : 221-227]。此 外，此三種已知環狀病毒之核芬酸序列或一般抗原決定位 並無明顯已知的同源性。 分離自PK/15細胞之PC V被認定爲非病原性。其序列係得 知於 B.M.米漢等人，j. Gen. Virol.，1997，（78) : 221-227。 最近某些人認爲PCV病毒株可爲病原性且與PMWS症候群有 關[G.P.S.那亞（Nayar)等人，Can. Vet· J·，1997，38 : 385-387 及克拉克（Clark) E.G.，Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997 : 499-501]。那亞等人利用PCR技術自有PMWS症候群之豬隻 ______ -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) "" ^--------^---------^9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1267551 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（2 ) 中檢測出PCV DNA。 在具有PMWS症候群症狀之豬隻身上發現直接對抗環狀病 毒之單源及多源抗體的事實顯示出這些環狀病毒與由ΡΚ-1 5 細胞培養物所分離出之豬環狀病毒的相異處[艾蘭（Allan) G.M.等人，Vet. Microbiol·，1999，66 ·· 115-123]。 於加拿大、美國及法國所發現之PMWS症候群的臨床特徵 爲體重逐漸減輕及如呼吸急促、呼吸困難及黃疸之表現。 自病理學的觀點而言，其呈現爲淋巴球或肉芽腫浸潤、淋 巴腺病及較少見的肝炎及淋巴球或肉芽腫腎炎[克拉克 E.G. ^ Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997 ： 499-501 ； La Semaine 編號 26，supplement to La Semaine
Veterinaire 1996 (834) ； La Semaine Veterinaire 1997 (857)： 54 ; G.P_S.那亞等人，Can. Vet· J.，1997，38 : 385-387]。 這些由北美及歐洲獲得之環狀病毒非常類似，其核铝酸 序列有超過96%以上相同，但將這些環狀病毒與分離自 PK-1 5細胞之豬環狀病毒作比較時，其核甞酸序列僅有80〇/〇 以下相同。根據這點，可建議2個病毒亞群，與PMWS症候 群有關之環狀病毒稱爲PCV-2，而分離自PK-15細胞之豬環 狀病毒稱爲 PCV-ι。（米漢Β·Μ·等人，J. Gen· Virol.，1998， 79 : 2171-2179 ; WO-A-9918214)。 本專利申請人已發現能编碼及表現PC V-2免疫原的質體結 構可用來使豬免疫以對抗PMWS症候群。 PC V-2免疫原可與pC V_；i免疫原合併運用來免疫這些動物 以便同時對抗PCV-2。 -5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1267551 A7 B7 五、發明說明（3 ) 以幸父不推薦的方法而言，PC V-1免疫原亦可單獨運用。 本發明之主旨係能編碼及表現PC V-1或PC V-2免疫原之質 體結構，特定言之爲PCV-1之開放密碼（〇RF)1&/或2，及 PVC-2之ORF 1及/或2 (ORF指之開放密碼）。 不T而喻，本發明自動地包含能編碼及表現相同的核菩 故序列的為體’亦即未改變所考慮基因或由此基因所編碼 的多肽之功能或株（strain)特異性（如1型株及2型株）的序 列。自編碼中退化分離出的序列自然也包括在内。 用於實例之PCV-2序列係衍生自前述米漢等人（Strain
Imp· 1010 ; 〇RF 1 核芸酸 398-1342 ; 0RF2核甞酸 1381-314， 且個別相當於1998年9月25日之US 09/161，092中的ORF4及 ORF13，以及 WO-A-9918214 中的 COL4 及 COL13)。其它 PCV-2株及其序列可見於WO-A-9918214，名稱爲Impl008、 Imp999、Impioi 1-48285 及 Imp 1011-48121 ;以及 A.L·漢默 (Hamel)等人、J· Virol. 1998年 6月，第 72 卷，6: 5262-5267 [名爲健變克（GenBank) AF027217];以及I.莫洛柔夫 (Morozov)等人，J.臨床Microb.，1998年 9月，第 36 卷，9: 253 5-2 541 ;及健變克 AF086834、AF086835及 AF086836;皆 可提供相同的ORF序列。 本發明亦包含能在高度嚴苛狀況下融合雜交入所考慮基 因之核苷酸序列中的等同序列。除等同序列外，亦包括能 保留完整序列之免疫原性之基因片段。 1型及2型之全基因組的相似性約爲75%。ORF1約爲 86%，ORF2約爲66%。相反地，基因組及型2中之ORF的相 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂---- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1267551 A7 B7 五、發明說明（4 ) 似性通常高於95%。 以0RF1而言，凡與lmpi〇i〇株之orfi序列相似性相當於 或大於88%，特定言之大於90%，較佳爲大於92%或95% 者，或以ORF2而言，凡與ImplOlO株之ORF2序列相似性相 當於或大於80%，特定言之大於85%，較佳爲大於90%或 95%者，亦可作爲如本發明之等同序列。 如米漢（1998)之ORF1及ORF2可編碼預期分子量分別爲 37.7 kD及27.8 kD之蛋白質。ORF3及ORF4 (如米漢等人， 1998年，分別相當於WO-A-9918214中的ORF7及ORF10)可 編碼預期分子量分別爲11· 9及6.5 kD之蛋白質。這些ORF序 列亦可由基因銀行AF 05 5 3 92取得。其亦可與質體合併並依 照本發明單獨使用或與如ORF1及/或ORF2聯合運用。 其餘揭露於US 09/161，092( 1998年9月25日）的ORF 1-3及 5、6、8-9、11-12 (WO-A-9918214 中的 COL 1-3 及 5、6、 8-9、11-12)可用於在此所述之狀況，其可混合運用或互相 運用或如在此所述者與ORF 1及2共同運用。 本發明同樣包含上述傾向之等同序列的用法，特定言之 爲來自各種在此所舉出之PCV-2株的ORF。以相似性來説， 可確定來自擁有一 ORF2及/或一 ORF1之PCV株的序列爲等 同序列’其擁有如上述與相對的株丨〇丨〇之〇RF的相似性。 對米漢之ORF3而言，我們可以説其對於Impl〇1〇株的〇RF3 之相似性必須比如同等或大於8〇%，特定言之爲大於85〇/〇， 幸义佳爲大於90%或95%。對如米漢（1998年）的ORF4而言， 其對於ImplOlO株之ORF4的相似性可等同或大於86<)/。，特定 -7- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
n n an .I an n n 一口T 扉 aw t MM 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267551 A7 B7 五、發明說明（5 言之爲大於90%，較佳爲大於95%。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 至於基因組核菩酸序列（如揭露於W〇-a_99 182 14者），使 用“準軟體（如麥克維克特（Mac Vector® ))測定ORF係例行 技術。同樣地，株1010基因組的排列及與株1〇1〇 〇RF之比 較可使熟於該技藝之人士容易地測定其它株（如w〇-A_99 1 82 14所揭露者）基因組上的〇RF。運用軟體或作排列並非過 份的貫驗’其並可直接提供相同〇RF。 貝植一巧在此意欲包含任何多核甞酸序列型式之Dna轉 錄單位，包括可表現之PCV序列及其在活體内表現所需之 成分。較佳爲環狀質體型式（超螺旋或其它）。直鏈型式亦 包含於本發明之範圍中。 本發明之主題更特定了之係稱爲pJpi〇9 (含〇RF2 基因，圖 l)、pjpin (含PCV_2之〇RF1基因，圖 2)、 (含 PCV-1 之 〇RF2 基因，圖 3)及 pJpi21 (含 pcvuiQRH 基 因，圖4)之質體。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 每-個質體包括-個啓動基因，以控制宿主細胞内的插 )基因之表現。其通常爲一強眞核啓動基因，且特定言之 A來自人誠藏科來源或視需要纟它來源（如鼠或天竺鼠） 之巨細胞病毒早期啓動基因CMV]E。啓動基因更普遍係源 自病母或細胞任一者。除CMV-IE之外的病毒啓動基因有 SV40病毒早期或晚期啓動基因或勞司氏肉瘤（r_ ^繼) 病毒LTR啓動基因。啓動基因亦可得自產生該基因的病毒 中’如忒基因〈特足啓動基因。以細胞啓動基因而言，應 提及細胞θ木基因I啓動基因’如堞司敏（d_⑷啓動基 -8 -
本紙張尺度適时關家標準（CNS)A4規格（210x 297公爱I 1267551
五、發明說明（6 、’或是肌動蛋白啓動基因。當有數種基因在同一質體上 時，其可安排成爲同一轉綠單位或二種不同單位。 質體亦可包括其它轉綠調節元件，如插入序列型之安定 序列’較佳爲兔β ·血球蛋白基因之插入序列π (藩烏言 (van 〇0yen)等人，science，1979年，206: 337-344)，由組 織血纖維蛋白溶酶原活化基因所編碼之蛋白質的訊號序列 (tPA ;蒙特勾莫利（M〇ntg〇mery)等人，cell. Mol· Biol. 1997年，43: 285-292)，及聚腺嘌呤化訊號（p〇iyA)，其特 定言之係來自牛生長激素（bGH)基因（US-A-5, 122,458)或兔 β -血球蛋白基因。 本發明之主題亦爲免疫原製備物及DN Α疫苗，其包括至 少一種如本發明、可編碼及表現pC V-i或pc V-2免疫原之一 的質體，較佳爲上述ORF中之一種，另加入一種獸醫學可 接受之賦形劑或稀釋劑，並可視需要再加入獸醫學可接受 之佐劑。 本發明之主題特定言之係免疫原製備物及疫苗，其含至 少一種可編碼且表現PC V-1或PC V-2免疫原之一的質體，組 合物以佐劑調配，特定言之爲下式含四級铵鹽之陽離子脂 肪： ch3 r^o-ch.-ch-ch.-n —r2-x 0R1 CH3 其中Ri係具12至18個碳原子之飽和或不飽和直鏈脂基，R2 -9- 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---- 禮· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267551 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（ 係另一包括2至3個碳原子之脂基，且X係一羥基或胺基。 其較佳爲0“111£(义（2-羥乙基）-队沁二甲基-2,3-雙（十四 坑氧基）-1-丙銨；WO-A-9634109)，且較佳爲與中性脂肪^禺 合（如較佳爲DOPE (二油醯磷脂醯乙醇胺））以形成DMRie_ DOPE。較佳地，含該佐劑之質體混合物於使用前（且較佳 爲對動物投藥前）才製備，如此所製備的混合物可形成複合 物，並持續自10至60分鐘，特定言之爲3〇分鐘。 當加入DOPE 時，DMRIE:DOPE之分子數比例較佳範圍 爲由95: 5至5: 95，更佳爲1:1。 質體：DMRIE或DMRIE-DOPE佐劑之重量比率範圍特定 言之爲由50: 1至1:1〇，特定言之爲由1〇:工至1: 5，較佳 由 1 : 1至 1 : 2。 如本發明其它之有利方法可使用佐劑，該佐劑化合物可 選自丙晞酸或甲基丙烯酸之聚合物及順丁晞二奸及鍵缔美 衍生物之共聚物。較佳者爲特定與糖類或聚醇之聚醯基酸 交聯的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物。這些化合物被稱爲卡 玻末（？]^1：11^111：〇卩&，第8卷，]^〇.2，6月，1996年）。为於卞 技藝之人士亦可參考US-A-2, 909, 462 (併入參考資料），其 中描述該與多羥基化化合物交聯之丙烯酸聚合物，其中= 羥基化化合物具有至少3個羥基，較佳爲不多於8個，至少 有3個經基之氫原子被具有至少2個碳原子之不飽和脂基代 替。較佳的殘基爲含2至4個碳原子者，如Γf 即G埽基、烯丙基 及其它醯類不飽和基。該不飽和基本身即可处人# 1 ^把含其它取代 10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 2清先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 裝 1267551 A7 B7 五、發明說明（8 ) 基，如甲基。特別適用之產品爲卡爾玻波（Carbopol®) (GF 古德力奇（Goodrich)，俄亥俄州，US A)。其係與烯丙基蔗 糖或烯丙基戊赤蘚糖醇（allylpentaerythritol)交聯。其中應 提及者爲卡爾玻波® 974P、934P及971P。 於順丁晞二酐及鏈晞基衍生物之共聚物中，較佳者爲 EMAs® (孟山透（Monsanto))，其係順丁烯二酐及乙烯的共 聚物，可爲直鏈或交聯，如與二乙晞醚交聯。可參考J.菲 爾茲（Fields)等人，Nature，186: 778-780，6 月 4 日，1960 年（併入參考文獻）。以其結構觀點而言，丙晞酸或甲基丙 烯酸與EMAs®之聚合物較佳由下式之基本單元所組成： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝
Ri «2 一C —- ~i^z)x-C —(CH2) 訂---- 其中 -RAR2，其可相同或相異，代表Η或Ch3 -x = 0或1，較佳爲x = 1 -y = 1或 2，x+y=2 至於EMAs®，x = 〇且y = 2。對於卡玻末，χ = y = 這些聚合物溶於水中後會導致酸性溶液，較佳爲將之中 和至生理pH値，以產生佐劑溶液，讓眞正疫苗得以併入。 P过後再將聚合物之談基分離爲C〇〇·型式。 對於該種佐劑而言，較佳爲在蒸餾水（較佳爲於氣化鈉存 在下）中製備佐劑（特定言之爲卡破末）之溶液，獲得之溶液 着· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
1267551 A7 B7 五、發明說明（9 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲酸性pH。添加一或多份含有氯化銅的水（較佳爲生理食鹽 水（NaCl 9克/升））將該常備溶液稀釋至所需量（以獲得所需 之最終濃度），或接近其所需量，同時或隨後進行中和作用 (pH 7· 3至7.4，較佳爲利用NaOH)。該生理pH値的溶液可以 原貌與質體混合，特定言之可貯存於冷凍乾燥、液體或冷 凍型式。 最終疫苗組合物之聚合物濃度爲0. 0 1 %至2%重量/體積， 較佳爲0.06至1%重量/體積，更佳爲0. 1至0. 6%重量/體積。 於一特定具體實施例中，免疫原或疫苗之製備物含有可 編碼及表現PCV-2 ORF1及ORF2之質體或質體混合物。 本發明亦可同時混合對抗豬環狀病毒及對抗其它豬病原 之疫苗，特定言之爲可能與PMWS症候群相關的疫苗。可舉 出之實例有：假性狂犬病病毒、豬流行性感冒病毒、 PRRS、豬小病毒、豬瘟病毒、胸膜肺炎放射桿菌 (Actinobacillus pleuropneumoniae) 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
因此本發明之主題爲質體混合物，其中包含能編碼及表 現豬免疫原的至少一種如本發明之質體及至少一種其它質 體（選自如假性狂犬病（Aujeszky ’ s disease)病毒（假性狂犬 病病毒或PRV)之醣蛋白質gB及gD、豬流型性感冒病毒 H1N1之血球凝集素及核蛋白、豬流型性感冒病毒H3N2之血 球凝集素及核蛋白、立利司塔德（Lelystad)及USA株之PRRS 病毒的ORF5及ORF3基因、豬小病毒之VP2蛋白質、豬瘟病 毒（HCV)之E1及E2蛋白質、胸膜肺炎放射桿菌（見於如 WO-A-9803658之質體）之消除（deleted) apxl、apxll及 apxIII -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1267551 A7
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（1〇 ) 基因。 將這些質體混合物加入獸醫學可接受賦形劑或稀釋劑 中’可視需要加入如前述之獸醫學可接受佐劑，從而形成 免疫原製備物或多價DNA疫苗。這些製備物或多價疫苗特 定言之可有利地以如上述之陽離子脂肪調配，特定言之爲 DMRIE ’且較佳爲與中性脂肪（D〇pE)結合以形成DMRIE-DOPE。 如本發明所製備或加入如上述之佐劑之製備物或單價或 多仏DNA疫苗，亦可有利地加入細胞動力素（較佳爲豬 源）’特定言之爲豬GM-CSF。欲添加豬GM-CSF (顆粒巨嗟 細胞-聚落刺激因子；克拉克s c·等人，Science，1987年， 230: 1229 ;葛蘭特（Grant) S· M·等人，Drugs，1992年，53· 5 16)特定言之可利用將豬gM-CSF蛋白質、或可編碼及表現 褚 GM-CSF 基因（inumaril s.及 Takamatsu H. Immunol. Cell
Bi〇l·，1995, 73: 474-476)之質體併入製備物或疫苗中來完 成。較佳地，將插入豬GM_CSF基因的質體與編碼pcv免疫 原或其它豬免疫原的質體分開。 特定言之，編碼及表現豬01^481；的質體可爲質體pJp〇58 (圖 5) 〇 如本發明之免疫原製備物及單價或多價DnA疫苗亦可混 以至少一種可直接對抗至少一種不同或相同之豬病原的慣 用疫田（滅毒、不活化或次單位疫苗）或基因重組疫苗（病毒 媒介物）。本發明特定言之可供混以含佐劑之慣用疫苗 毒活疫苗、不活化或次單位疫苗）。對於不活化或次單位疫 c請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 裝 ----訂--- -13· 1267551 A7 B7 五、發明說明（11 ) 苗而言’可提及者，特定言之，有單獨含氧化鋁凝膠或與 皂素混合做爲佐劑者，或調配成水中油乳劑形式者。 本發明之主題亦爲一種免疫方法，其能引發豬對如本發 明環狀病毒之免疫反應。其主題特定言之爲一種對豬有效 之免疫方法。這些免疫及接種方法包括投予前述製備物或 單價或多價DN A疫苗之一。這些免疫及接種方法包括一次 或多次連續投予這些製備物或DNA疫苗。本免疫或接種方 法中的製備物及DNA疫苗可利用先前技藝所建議的各種適 於聚核苷酸接種之投藥途徑來給予，特定言之爲肌肉注射 及皮内途徑，並可利用已知投藥技術，特定言之爲經由具 有注射針之注射器進行液體噴射[佛司（Furth)等人，
Analytical Bioch.，1992 年，205 : 3 65-3 68]或注射塗被有 DNA 的金顆粒[譚（Tang)等人，Nature，1992 年，356: 152-154]。 本方法不僅可對成豬投藥，亦可用於幼豬及懷孕豬；對 於後者，其可，特定言之，給予新生豬被動免疫（移行抗 體）。較佳地，母豬於繁殖前、及/或交配前、及/或懷孕期 間接種。有利地，於交配前至少接種一次且較佳於懷孕時 再接種一次，如於懷孕中期（約懷孕6-8週）及/或於懷孕末期 (約懷孕1 1 -1 3週）。因此，有利的攝生法爲交配前接種一次 及於懷孕期時補強接種一次。之後，其可於每次交配前及/ 或於懷孕期間（約懷孕中期及/或末期）再接種一次。較佳者 係於懷孕期間再接種。 小豬，如由免疫母豬（如在此所述之接種）所生者，於出 -14- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) π裝 訂---1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 α* /\ 1/ 0 N 3 V 干 ,1 - i
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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（12 ) 生後則幾週内接種，如於出生後第1及/或2及/或3及/或4及/ 或5週接種。較佳爲小豬首先於出生後第1週或第3週（如斷 奶時）接種。有利地，該小豬於2至4週後再補強一次。 用於如本發明疫苗之DNA量係介於約10微克及約2000微 克’且較佳爲介於約5〇微克至約1 〇〇〇微克。熟於該技藝之 人士應也精確定義出運用於每次免疫或接種計劃的DNA之 必須有效量。 劑量可介於0.5至5毫升，較佳介於2至3毫升。 較佳免疫或接種方法包括經由藉肌肉注射途徑投予如本 發明之DNA疫苗。 本發明將藉非限制性示範具體實施例詳細描述’並參考 圖表，其中： 圖1 :質體pJP109 圖2 ··質體pjpill 圖3 :質體pJP120 圖4 :質體PJP121 圖5 ··質體pJP〇58 序列表序列確認（SEQ ID) 序列確認編號1 :寡核：y：酸JP779 序列確認編號2:寡核：y：酸JP780 序列確認編號3 ··寡核:y：酸JP78 1 序列確認編號4:寡核：y：酸JP782 序列確認編號5 :寡核省:酸JP783 序列確認編號6:寡核甞酸JP784 -15- _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) F:-裝--------訂--- 華 i1267551 A7 B7 五、發明說明（13) 序列確認編號7 :寡核：y：酸JP785 序列確認編號8:寡核苷酸JP786 序列確認編號9 :寡核：y：酸RG972 序列確認編號10:寡核：y：酸RG973 實例 用來選殖ORF的PCV-2株係如沉著於ECACC者，其登入號 碼爲 V97100219 (Impl008)、V97100218 (Impl010)&(Imp999) \ (其係登入於 10月 2日，1997年）、V9801 1608 (ImplOll-48285) 及V9801 1609 (Impl011-48121)(其係登入於 1 月 16 日，1998 年” 這些實例係以Imp 1010株建構。熟悉本技藝者可應用同樣 方法於其它PCV-2株之上。 實例1 ··建構質體pJP109 將含有PCV-2病毒基因組，型式爲一 EcoRI片段（B.米漢等 人 J. Gen· Virol· 1998. 79 2 17 1-2 179)之 pGEM7Z-Imp 1 〇 1 〇 史敦（Stoon)-EcoRI 14號質體以EcoRI消化以便於瓊脂糖凝 膠電泳後分離出1768鹼基對（bp)之EcoRI-EcoRI片段。該片 段係自我-連結。 將PCV-2病毒株1010-史敦之ORF2基因（B·米漢等人，j Gen· Virol· 1998· 79· 2171-2179;基因銀行序列登入編號 AF05 5 3 92)擴展擴大，此係利用由自我-連結EcoRI-EcoRJ片 段構成之模板，藉聚合酶連鎖反應（PCR)技術作用於下列寡 核甞酸·· JP779 (序列確認編號1)(35 mer): -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —----------裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tr— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267551 Α7 Β7 五、發明說明（ 5fCATCATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG3, 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 Μ 本 頁 及JP780(序列確認編號2)(36 mer): 5,TACTACTACAGATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC3, 而產生730 bp之PCR片段。使用Sail及Bglll消化該片段以便 經由瓊脂糖凝膠電泳分離出715 bp之Sall-Bglll限制片段。 再將該片段與事先以Sail及Bglll消化的質體pVR1012 [哈爾 替嚷（Hartikka) J.等人，Human Gene Therapy。1996 年，7· 1205-1217)連結，以獲得質體pJP 109 ( 5567 pb)(圖 1)。 實例2 :建構質體pJPlll 將質體pGem7Z-Impl010-史敦（見於實例1)(Β·米漢等人， J. Gen. Virol. 1998. 79· 2171-2179)與下列寡核甞酸進行 聚合酶連鎖反應： JP781 (序列確認編號3)(35 mer): 5fCATCATCATGTCGACATGCCCAGCAAGAAGAATGG3T 及圩782 (序列確認編號4)(36 11^1：): 5,TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTCATATGG3, 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 而產生一 970 bp含PC V-2病毒之ORF1基因的PCR片段。使用 Sail及Bglll消化該片段，經由瓊脂糖凝膠電泳後分離出955 bp之Sall-Bglll限制片段。該片段再與質體pVR1012 (實例1) 連結以獲得質體pJPlll (5810 bp)(圖2)。 實例 3 :建構質體 pJP120 (PCV-1 ORF2) 使用質體pPCVl(B.米漢等人J· Gen. Virol. 1997· 78· 22 1-227)與下列寡核芬酸進行聚合酶連鎖反應： JP783 (序列確認編號5)(35 me〇 : -17 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1267551 A7 B7 五、發明說明（ 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5 丨 CATCATCATGTCGACATGACGTGGCCAAGGAGGCG3， 及JP784 (序列確認編號6)(40 mer): 5，TACTACTACAGATCTTTATTTATTTAGAGGGTC 丁丁 TTAGG3， 而產生一 730 bp含PCV-1病毒（PK-15株，基因銀行序列登入 編號U49186)之ORF2基因的PCR片段。使用Sail及Bglll消 化該片段以經由瓊脂糖凝膠電泳後分離出715 bp之Sail-Bglll限制片段。該片段再與質體pVR1012 (實例1)連結以獲 得質體PJP120 ( 5565 bp)(圖 3)。 實例 4 :建構質體 pJP121 (PCV-1 ORF1) 將含？(：¥1病毒基因組之質體？？(：¥1(型式爲1^1片段）（6· 米漢等人J· Gen. Virol. 1997，78，221-227)以 PstI消化以便 經由瓊脂糖凝膠電泳後分離出1759鹼基對（bp)之Pstl-PstI片 段。將該片段自我·連結。 將 PCV-1 病毒株PK-15 (B·米漢等人，J. Gen. Virol· 1997, 78，221-227 ;基因銀行序列登入編號U49186)之ORF1基因 擴大，此係利用由自我-連結Pstl-PstI片段所構成之模板， 藉聚合酶連鎖反應（PCR)技術作用於下列寡核替酸： JP785 (序列確認编號7)(35 mer): 5,CATCATCATGTCGACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG3, 及评786 (序列確認編號8)(36 11^1·): 5’TACTACTACAGATC 丁丁 CAGTAATTTATTTTATATGG3' 而產生一 965 bp、含PCV-1病毒之ORF1基因（PK-15株）的 PCR片段。使用Sail及Bglll消化該片段以便經由瓊脂糖凝膠 電泳後分離出946 bp之Sall-Bglll限制片段。再將該片段與 -18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 % 填 t 1267551 A7 B7 五、發明說明（16) 質體PVR1012 (實例1)連結以獲得質體pjpi21 ( 5804 bp)(圖 4) ° 實例5 :建構質體pjp058 (表現豬GM-CSF) 由頸靜脈採集豬血至含EDTA之試管。於Ficoll梯度上離 心以獲得單核細胞，再於RPMI 1640培養基（Gibco-BRL)中 進行生體外培養，並添加刀豆素（concanavaline A)(西格馬 (Sigma))直到最終濃度爲約5微克/毫升以便加以刺激。於 刺激72小時後採集淋巴胚細胞，並以抽取組“微小全RNA分 離組（Micro-Scale Total RNA Separator Kit)，，（可隆帖克 (Clontech))、經由製造商建議方式抽取這些細胞之完整 RNA。藉“第一股 cdNA合成組（lst_Strand cDNA Synthesis Kit”（柏金艾瑪（Perkin Elmer))進行反轉錄反應，再將由這 些豬淋巴胚細胞所抽出之全RNA與下列寡核嘗酸進行聚合 酶連鎖反應： RG972 ( 33 mer):(序列確認編號9) 5,TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG3, 及RG973 ( 34 mer):(序列確認編號10) 5TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTGGGCTGGTT3， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 而產生一段約450鹼基對（bp)之PCR片段。使用Notl消化該 片段以便經由瓊脂糖凝膠電泳分離出450 bp之Notl-Notl片 段。該片段再與質體pVRl 012連結（實例1 )，較佳以Notl消 化並脱去磷酸，產生質體pJP058 ( 5405 bp)(圖5)。檢驗被 選殖入質體PJP058之pGM-CSF基因序列並發現其與基因銀 行資料庫所提供者相同（登入編號D21074)。 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1267551 Α7 Β7 五、發明說明（17) 實例6 :產生豬接種用之純化質體 以前述實例1至5中的質體pJP109、pJPlll、pJP058、 pJP120及 pJP121 將大腸桿菌（Escherichia coli) K12 (DH10B 或SCSI株）轉化。將個別由此5種質體所得之5種轉化clones 於+ 37°C搖動下、於路立亞肉汁（Luria-Broth(LB))培養基中 分別培養。於指數期末採集細菌培養物並以鹼化溶解技術 萃取質體。萃取之質體再經如山布拉克（Sambrook)等人所 描述之技術（分子生物學：實驗室手册，第2版，1989年， Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY) 以氟化絶梯度法純化。最後經溴化乙鍵（ethidium bromide) 萃取並於絕對酒精存在下沉澱後，將純質體再懸浮於TE緩 衝溶液（1毫當量Tris/EDTA，pH 8.0)以獲得含每毫升2毫克 質體之備用stock溶液。這些stock溶液使用前係貯存於_20°C 下。 實例7:PCV-2病毒之ORF 1及2的表現控制 爲控制PCV-2 ORF2及PCV-2 ORF1基因表現之產物，將其 個別選殖入質體pJP109及pJPlll，利用力波費克它命普拉 司（Lipofectamine Plus® )轉移感染組（吉伯可（Gibco) -BRL， 目錄編號10964-013)、依照製造商的建議使用方法將這些質 體轉移感染入CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary)細胞（ATCC 編號C C L - 61)中。轉移感染後4 8小時，沖洗轉移感染細胞， 並以95%冰丙酮落液於室溫下固定3分鐘。五種對pcV-2 ORF1蛋白質（F199 1D3GA 及 F210 7G5GD)及 〇RF2 蛋白質 (F190 4C7CF，F190 2B1BC及 F190 3A8BC)特定之單源抗體 -20 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） '" 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 寫 本 頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267551 A7 B7 五、發明說明（18) 被用作第一抗體。以Cy3標示的抗-鼠IgG conjugate被用來 顯示特定標示。在質體pJP 109轉移感染之細胞可觀察到3個 PCV-2 0RF2單株之PCV-2特定螢光，但質體pJPlll·轉移感 染者則無。反之，在質體pJP 111轉移感染之細胞上可觀察 到兩個PCV-2 ORF1單株之PCV-2特定螢光，但質體pJP109 所轉移感染者則無。在單獨以質體pVRl012轉移感染或未轉 移感染之CHO細胞上並無PCV-2單株之螢光。 PCV-2病毒之特定多株血清可獲致相同的表現結果。於此 例中，使用一螢光標示抗-豬IgG結合（conjugate)來檢測特定 螢光。在單獨以質體pVRl012轉移感染或未轉移感染之CH0 細胞上並無該多株血清之螢光。 實例8 :以naked DNA接種豬隻 8.1. 1日齡小豬 於計劃之D0天將多組經由剖腹生產所得的小豬置於獨立 單位内。於2日齡，藉肌肉注射途徑將各種質體之疫苗溶液 接種這些小豬。以無菌生理食鹽水（0. 9% NaCl)稀釋備用溶 液以製備疫苗溶液。 接種小豬時係： 單獨使用質體PJP109 或使用質體pJP109及pJPlll之混合物 或使用質體pJP109及pJP058之混合物 或使用質體pJP109、pJPl 11及pJP058之混合物。 疫苗溶液包括500微克之各個質體。 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 訂.-------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267551
劑量：經由肌肉途徑注射之疫 苗溶液總量爲2毫升。在實 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 務中，對接種日齡（1 -2日）的小諸 2 X 1毫升）。 二次疫苗注射之間隔爲二週，g ^ 即叶劃中之D2曰及D14曰。 在計劃之D21日進行病原攻擊，细丄 、 卓、、二由口鼻給予強毒PCV-2 株之病毒懸浮液。隨後監視小緒3例 猪3週’覜察小豬有無斷奶後 多重系統性消耗症候群之特定薛忠—^ 疋^床症狀出現。監測的病徵 有·· 肛溫：取初14日每天測量，认益店l I 於届原攻擊後第3週内測量二 次0 重量：病原攻擊前將小豬稱重且於病原攻擊後3週内每週 稱重一次。 採集血液樣本以測試病毒血症及抗體：於D2、〇14、 D21、D28、D35及D42採集血液樣本。 屍體解剖：於D42日，將存活豬安樂死人道毀滅且進行屍 體解剖以尋找解剖病理學病灶，且由肝、淋巴結、脾、腎 及胸腺製作組織製備物以尋找這些組織之病灶。 8.2. 5-7週齡小豬 對5至7週齡、不再具有特定pCV-2病毒移行抗體的小豬， 經肌肉注射途徑接種： 單獨的質體PJP109， 或質體pJP109及pJPlll之混合物 或質體PJP109及pJP〇58之混合物 或質體pJP109、pJPlll及pjp〇58之混合物 頌部二側各注射1毫升（: C請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 訂i #· 22- 本紙張尺度適用中國國家標準〈CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1267551 A7 B7 五、發明說明（20 ) 疫苗劑量與實例8. 1相同（每種質體500微克）。疫苗溶液係 以肌肉注射途徑注射2毫升（一次投予2毫升至頸部肌肉）。 二次接種間隔爲21日（D0及D21)。於最後一次接種後14日 (D35)進行病原攻擊、藉肌肉注射投予強毒PCV-2株病毒懸 浮液。 隨後監測這些豬8週，觀察有無小豬斷奶後多重系統性消 耗症候群之特定臨床症狀發生。病原攻擊後小豬之臨床檢 測法與描述於實例8. 1者相同，但總觀察期爲8週。 實例9:以DMRIE-DOPE調配之DNA來接種豬 可使用DMRIE-DOPE調配之質體DNA溶液來代替實例8中 之無鞘膜（naked)質體DNA溶液。在0.9% NaCl中製備1毫克 /毫升之DNA溶液（含如實例6之一或多種質體）。將DMRIE-DOPE之冷凍乾燥物加入適量無菌蒸餾水以製備一 0.75毫當 量之DMRIE-DOPE溶液。 以等量的0.9% NaCl之1毫克/毫升DNA溶液稀釋0.75毫當 量DMRIE-DOPE溶液以形成質體DNA-陽離子脂肪複合物。 經由配有26G針頭的注射筒，沿著裝有陽離子脂肪溶液之試 管壁，慢慢加入DNA溶液以避免形成泡沫。俟二種溶液混 合後即開始溫和搖動。最後可獲得一包括0.375毫當量之 DMRIE-DOPE及500微克/毫升DNA之組合物。 前述所有操作中的所有溶液皆須爲室溫。免疫豬隻前， 於室溫下進行30分鐘之DNA/DMRIE-DOPE複合物形成。 隨後如描述於實例8. 1及8.2之狀況接種豬隻。 實例10 :小豬接種及結果 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂---- # 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267551 Α7 Β7 五、發明說明（21 弟1次試驗： 將多組包含3或4隻於第0日剖腹生產的小豬置於分離欄 中。小豬於第2日單獨以pjpi〇9或以PJP109及PJP1U質體混 合物免疫，而控制組則使用生理溶液。每一質體以無菌生 理溶液（NaCl 0.9%)稀釋至250微克/微升之最終濃度。以肌 肉途徑注射2毫升、兩個1毫升注射點（頸部兩側各一注射 點）。於第14日第二次注射投予疫苗或安慰劑。小豬對dna 接種之耐受良好，且未發現有免疫副作用之證據。於第Η 曰、’二口鼻技丁 PCV-2病毒懸浮液，每邊鼻孔1毫升，對小豬 作病原攻擊。於病原攻擊後小豬每週稱重一次。於第17、 21、22、24、27、29、31、34、37、41、44 日記綠肛溫。 第44曰收集每隻豬之排泄物抹片拭樣以便檢測pc v_2排毒。 以定量PCR檢測並定量病毒。於第45日進行屍體解剖及組織 樣本收集以供病毒分離。 •臨床症狀： 各組間之平均增加體重及平均體溫並無明顯差異。 •屍檢病灶： 豬剖檢時可發現之肉眼病灶僅有支氣管淋巴腺病。病灶 係依下列標準評分。 〇 =無可見之淋巴結增大 1 =輕微淋巴結增大，限於支氣管淋巴結 2 -中度淋巴結增大，限於支氣管淋巴結 3 =嚴重淋巴結增大，延展至支氣管、下頷下、肩胛上 及氣璞部淋巴結。 " - - 24 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑽χ 297公爱）
1267551 A7 B7 五、發明說明（22 ) std係標準偏差之縮寫 N係每一組之動物數目 組別 淋巴腺病評分 平均 std N pJP109 1.2 1.3 4 pJP109 + pJPlll 2.0 1.7 3 控制組 3.0 0.0 3 N =每一組中之小豬數目 於以pJP109免疫之4隻小豬中的3隻及以pjpi〇9及pJP111質 體混合物免疫之3隻小豬中的1隻可觀察到淋巴結病灶減 少。由於高標準偏差値，故差異並不明顯（p> 0.05)。 •淋巴結組織所含病毒量： 由支氣管及腸系膜淋巴結製備之組織均漿中進行定量病 毒之再分離。 所呈現之數據相當於組織均漿中之病毒力價轉換爲對數 log10 値0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) r-裝--------訂---- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 PCV-2力價 組別 支氣管淋巴結 腸系膜淋巴結 平均 Std 平均 std N PJP109 0.9 0· 8 0.9 0.8 4 PJP109 -f pJPlll 0.7 0.6 0.2 0.2 3 控制組 2.0 1. 1 1.8 1. 1 4 支氣管淋巴結似乎含最多感染病毒。於以pJP 109或 pJP109+pJPlll質體混合物免疫小豬之支氣管及腸系膜淋巴 結可觀察到病毒含量減少。在質體混合物組中，該項減少 明顯（p仝0 · 0 5)。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） #· 1267551 A7 B7 23 五、發明說明（ •病毒排泄： 病原攻擊後利用PCR(根據PCV-2 orf2之擴大）評估排泄物 拭樣之PC V-2排毒。每次分析一式三份的2毫升樣本。未免 疫之控制組在病原攻擊前無PCV-2排毒，病原攻擊後產生排 毒之情事確定P C R分析的正確性。 數値以對數log10表示（2微升樣本中之PCV-2 DNA分子 數）。 PCV-2 DNA分子之Log10數 組別 平均 std N pJP109 3.3 0.3 4 pJP109 + pJPlll 2.9 0.7 3 控制組 3.6 0.6 4 各組間差異並不明顯（p > 0. 05)。 第2次試驗： 14曰齡普通小豬（每組8隻）於第0曰及第20曰以2次投予以 DMRIE DOPE調配之PJP109及pJPlll質體混合物免疫。藉肌 肉途徑每次投予2毫升注射至耳後之頸部。該疫苗組合物爲 每毫升之生理溶液（0.9% NaCl)含250微克質體及0.375毫當 量 DMRIE DOPE。 控制組小豬注射生理溶液。 於第3 2日對小豬作經口鼻途徑之病原攻擊，以注射筒將5 毫升、105·8 TCID50/毫升力價之PCV-2病毒懸浮液注入每一 鼻孔中。 監測小豬之臨床症狀··衰弱、嘔吐、呼吸困難、咳嗷、 厭食及體溫過高（於病原攻擊後28日内每日記綠肛溫）生長 26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項a
I I I I I 訂 I I I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267551 A7 B7 五、發明說明（24) 緩慢（小豬於第32、40、46、53、60日稱重）。如下列標準 評分症狀：附錄1 (每隻小豬的分數相當於不同日期觀察得 分之總合） 於第60日進行屍體解剖，以下列標準評分病灶：附錄2 (每隻小豬的分數相當於所觀察各器官之評分總合） 收集組織樣本，特定言之爲淋巴結。 於第32、39、42、46、49、53、56、60日收集直腸拭樣 以追蹤病毒排泄。 •臨床症狀： 與控制組相較之下，免疫組小豬可觀察到明顯臨床症狀 的減少。於控制組1之小豬死於PMWS症候群，而免疫組則 無小豬死亡。 臨床評分
組別 平均 std N 免疫組 13.5 7.1 8 控制組 29.3 15.6 8 (p< 0.01克魯司高-華利斯（Kruskal-Wallis)試驗） 於免疫組小豬可觀察到病原攻擊後體溫過高持續期間明 顯減少（p S 0. 0 5)。 肛溫k 40°C之持續期間（曰） 組別 平均 std N 免疫組 1.9 2.0 8 控制組 8.4 3.9 8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 病原攻擊後免疫組及控制組間每日體重增加差異不明 顯。 •展解病灶： -27 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1267551 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（25 ) 與控制組相較，免疫組小豬可觀察到明顯的病灶減少， 特定言之即淋巴腺病（p S 0.05)。 整體病灶及淋巴腺病評分 組別 平均 std N 整體病灶 免疫組 7. 6 3.3 8 控制組 13.1 7. 5 8 淋巴結評分 免疫組 3.1 2.7 8 控制組 5.7 2. 9 8 淋巴結組織之病毒含量： 以免疫化學測定腸系膜及縱膈膜淋巴結之病毒含量。 以下列標準評分 -0 =無螢光 -1 =器官切片上有一些螢光焦點 -2 =每一視野約有1焦點 -3=整個器官呈現螢光。 於免疫組可觀察到明顯病毒含量減少（p S 0.05)。 組別 腸系膜淋巴結 病毒含量 縱膈膜淋巴結 平均 std 平均 std N 免疫組 0. 5 0.6 1.3 0.2 8 控制組 1.8 0.8 2.0 0· 8 8 •病毒排泄 藉PCR評估排泄物拭樣以測試PCV-2排毒。結果評分如下 列標準： 0 =無PCV-2 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) T n n« I an ^ ί 0 i n n n ϋ * 華 1267551 A7 異實例 五、發明說明（26 ) 1 =有PCV-2 PCV- .2 ° 與控制組相比之下 ，免疫 組病毒排 病毒排泄 平均持 續期間 (曰） 組別 平均 std N 免疫 組 1.2 2· 1 8 控制 組 11.4 6.3 8 期明顯減少 應清楚瞭解本發明之申請專利範圍並不限於上述指定之 特定具體實施例，其亦包含不偏離本發明範圍及精神之變 附綠1 :臨床症狀評分表
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 呼吸困難 0否，1中度；2高度 咳漱 0否，1是 厭食 0否，1是 體溫過高 0 否，1 2 40°C ; 2 之 41°C 生長 0否，1第X週之DWGs j DWG且〉每日100克 2當週DWG S每日1〇〇克 死亡 0否，X死前一天的分數 各項症狀得分總合即當日評分 第 週之 -29 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1267551 A7 B7 五、發明說明（27 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 附綠2 :肉眼病變評分 皮膚（顏色） 正常 0 白 1 黃 2 肥胖 正常 0 痩 1 非常痩 2 惡病質 3 黏膜 正常 0 白 1 黃 2 皮下結缔組織 正常 0 明亮 1 黃色 2 神經節 正常 0 1大型且/或充血 1 >1大型且/或充血 2 > 1非常大 3 胸液 正常 0 明亮 1 可見 2 心 正常 0 病變 1 肺 正常 0 病變S 4 1 病變〉4幺6 2 病變> 6 3 胸膜 正常 0 病變 1 腹水 正常 0 明：¾ 1 可見 2 腹膜 正常 0 病變 1 -30- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 奢· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1267551 A7 B7 五、發明說明（28 ) 胃 正常 0 病變 1 潰瘍 2 小腸 正常 0 病變 1 大腸 正常 0 病變 1 皮爾氏斑（peyers plaques) 正常 0 於小腸可見1處 1 於小腸可見2處 2 非常明顯 3 肝 正常 0 病變 1 腎 正常 0 病變 1 膀胱 正常 0 病變 1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ----訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 _-31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1267551 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
B7_五、發明說明（29 ) 序列表 <110> MERIAL < 120> DNA疫苗-PCV < 130> DNA疫苗 PCV < 140> numero brevet < 14 1 > date depot brevet <160> 10 <170〉Patentln Ver. 2. 1 <210> 1 <211〉 35 <212> ADN <213〉人造序列 <220> <223>人造序列描述：寡核甞酸 <400> 1 catcatcatg tcgacatgac gtatccaagg aggcg 35 <210> 2 <211〉 36 <212> ADN <213>人造序列 <220〉 <223>人造序列描述：寡核瞀酸 <400> 2 tactactaca gatctttagg gtttaagtgg ggggtc 36 <210> 3 <211> 35 <212> ADN (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂--- # •32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1267551 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（3Q ) <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：寡核甞酸 <400〉3 catcatcatg tcgacatgcc cagcaagaag aatgg 35 <210> 4 <211> 36 <212> ADN <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：寡核甞酸 <400> 4 tactactaca gatcttcagt aatttatttc atatgg 36 <210> 5 <211> 35 <212> ADN <213>人造序列 <220〉 <223>人造序列描述··寡核甞酸 <400> 5 catcatcatg tcgacatgac gtggccaagg aggcg 35 <210〉 6 <211> 40 <212〉ADN <213>人造序列 <220> < 223>人造序列描述：寡核甞酸 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂---- # 1267551 A7 B7 五、發明說明（31 ) <400> 6 tactactaca gatctttatt tatttagagg gtcttttagg 40 <210> 7 <211> 35 <212> ADN <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：寡核甞酸 <400> 7 catcatcatg tcgacatgcc aagcaagaaa agcgg 35 <210> 8 <211〉 36 <212> ADN <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：寡核甞酸 <400〉 8 tactactaca gatcttcagt aatttatttt atatgg 36 <210> 9 <211> 33 <212> ADN < 2 1 3 >人造序列 <220> <223>人造序列描述：寡核苷酸 <400> 9 tatgcggccg ccaccatgtg gctgcagaac ctg 33 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) r-裝 # 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267551 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_ 五、發明說明（32 ) <210> 10 <211> 34 <212〉ADN <213>人造序列 <220〉 <223〉人造序列描述：寡核甞酸 <400> 10 tatgcggccg ctacgtatca cttctgggct ggtt 34 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格.(210 χ 297公釐） « a·— n i·— BIB— n tmMB an Bn ϋ· n Mmmmw n IΗ· n·· t§ l ϋ ϋ· ^ I ϋ— tammm emmt ϋ temw —.1 n I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Claims (1)
- 8 8 8 8^ A B c D. I26JSS ii424號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(93年7月) 六、申請專利範圍 、 ----------： ^ :.' W 么，二0'今、 1· 一種免疫製備物，其包括一複合物少一種質體， 其能在豬寄主活體内編碼及表現選自包括豬冠狀病毒 PCV-2之開放讀框（〇rf)1及PCV-2之0RF2;及佐劑，其包 含如下式之陽離子脂質： ch3 R, - 〇>ch2-ch-ch2-n — R2-x · 〇R, ch3 其中Ri係一種具有12至18個碳原子之飽和或不飽和直 鏈脂基，R2係包括2至3個碳原子之脂基，且X係一經基 或胺基。 2·如申請專利範圍第1項之免疫製備物，其特徵為陽離子 脂肪係（N-(2-羥乙基）-N，N-二曱基-2,3-雙（十四烧氧 基）-1-丙銨（DMRIE)。 3·如申請專利範圍第2項之免疫製備物，其特徵為DMRIE 係與中性脂肪偶合。 4·如申請專利範圍第3項之免疫製備物，其特徵為dmrie 係與二油醯磷脂醯乙醇胺（dope)偶合。 5.如申請專利範圍第1項之免疫製備物，其特徵為$佐齊1 包括卡玻末（carbomer)。 6·如申請專利範圍第1項之免疫製備物，其特朽 W為另包括 緒細胞動力素。 7·如申請專利範圍第6項之免疫製備物，其特與1 寸徵為豬細胞 動力素係GM-CSF。 64633-9307l6.DOC - 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1267551 A8 B8 C8 "'唯丨· .....D8 六、申請專利範圍 "一""" - 8. 如申請專利範圍第6或7項之免疫製備％，其特徵為其 另包括可編碼及表現豬細胞動力素之質體。 9. 如申請專利範圍第w之免疫製備物，其特徵為該佐劑 包括諸細胞動力素及選自包括DMRIE 、 D M R I E / D 〇 P E及卡玻末群組之佐劑。 1 〇.如申請專利範圍第i至7項中任一項之免疫製備物，其 特徵為其另包括一質體，其可編碼及表現得自非PCV_ 2之豬病原劑之免疫原。 11.如申請專利範圍第1至3項中任一項之免疫原製備物， 其中該製備物包括至少一種包含及表現pcv_2之 ORF 1之質體。 1 2 ·如申請專利範圍第！至3項中任一項之免疫原製備物， 其中該製備物包括至少一種包含及表現PCV-2之 ORF2之質體。 1 3 ·如申請專利範圍第i至3項中任一項之免疫原製備物， 其中該製備物包括至少一種包含及表現PCV — 2之 ORF 1及ORF2之質體。 1 4 ·如申請專利範圍第1至3項中任一項之免疫原製備物， 其中該製備物包括至少二種質體，一種包含及表現 PCV-2之ORF1 ，及一種包含及表現PCV-2之 ORF2。 1 5 ·如申請專利範圍第5項之免疫原製備物，其中 DMRIE:DOPE之莫耳濃度比為95:5至5:95。 1 6 ·如申請專利範圍第1 5項之免疫原製備物，其中 -2- 64633-9307l6.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1267551 DMRIE:DOPE之莫耳濃度比為1:1。 1 7 .如申請專利範圍第3項之免疫原製備物，其中質體： DMRIE之重量比為50:1至1:10。 1 8 .如申請專利範圍第3項之免疫原製備物，其中質體： DMRIE之重量比為10:1至1:5。 1 9 .如申請專利範圍第3項之免疫原製備物，其中質體： DMRIE之重量比為1:1至1:2。 2 0 .如申請專利範圍第5項之免疫原製備物，其中質體： DMRIE-DOPE 之重量比為 50:1 至 1:10。 2 1 .如申請專利範圍第5項之免疫原製備物，其中質體： DMRIE-DOPE之重量比為10:1至1:5。 2 2 .如申請專利範圍第5項之免疫原製備物，其中質體： DMRIE-DOPE之重量比為1:1至1:2。 2 3 .如申請專利範圍第8項之免疫原製備物，其中該製備 物包括編碼及表現豬細胞動力素，其為G Μ - C S F之質 體。 64633-930716.DOC -3-
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