JP2005058234A

JP2005058234A - Ｂ型肝炎検査用のｐｃｒプライマーセット及びそれを利用したｂ型肝炎検査方法

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Publication number: JP2005058234A
Application number: JP2004231611A
Authority: JP
Inventors: Young-Sun Lee; 英善李; Jung-Im Han; 程任韓; Jung-Joo Hwang; 貞周黄; Mi-Kyung Kim; 美卿金; Yoon-Kyoung Cho; 允卿趙; Hee-Kyun Lim; 熹均林; Young-A Kim; 玲雅金
Original assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Current assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Priority date: 2003-08-14
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2005-03-10
Also published as: US7344837B2; EP1507011A1; CN1626677A; CN100345980C; US20050037414A1; KR20050018511A; KR100647277B1

Abstract

【課題】Ｂ型肝炎検査用のＰＣＲプライマーセット及びそれを利用したＢ型肝炎検査方法を提供する。
【解決手段】特定の塩基配列を有するプライマーよりなる群から選択されたプライマーセット、前記プライマーセットを利用してＰＣＲする段階を含むＢ型肝炎検査方法及び前記プライマーセットを含むＢ型肝炎検査キットである。これにより、Ｂ型肝炎が迅速で正確に診断できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、配列番号１ないし配列番号４０の塩基配列を有するプライマーよりなる群から選択されたプライマーセット、前記プライマーセットを利用してＰＣＲを行なう段階を含むＢ型肝炎ウィルスの検出方法、及び前記プライマーセットを含むＢ型肝炎ウィルスの検出キットに関する。

Ｂ型肝炎は、全世界的に蔓延する代表的なウィルス性感染疾患である。これは全世界的に死亡順位９位を占める最もありふれた感染疾患のうち一つであり、約３億以上の人口が慢性Ｂ型肝炎ウィルス保菌者であって、これによる慢性肝炎、肝硬変、肝ガンなどによって年間１００万人ほどが死亡する。韓国の場合、全人口の約５ないし１０％がＢ型肝炎ウィルス保菌者であることが知られている。

Ｂ型肝炎ウィルス（Hepatitis B Virus：ＨＢＶ）は、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇの３種類の抗原蛋白質を含有するウィルス蛋白質から構成されるウィルスであって、そのＤＮＡはコア抗原（ＨＢｃＡｇ）と呼ばれる蛋白質構造で保護され、コアは表面抗原またはＳ抗原（ＨＢｓＡｇ）として知られている外皮蛋白質によって取り囲まれている。

現在、Ｂ型肝炎に対する診断方法では、肝機能検査を通じてＴ蛋白質、アルブミン、Ｔビリルビン、ｓＧＯＴ、ｓＧＰＴ、ｒ−ＧＰＴ、またはアルカリホスファターゼ（Alkaline Phosphatase：ＡＬＰ）などの数値を検査する方法、酵素免疫検査法を通じて血清学的にＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇなどの有無を確認する方法などが広く使われている。しかしながら、これらの方法は、進行した後のＢ型肝炎には有効であるが、早期診断が難しく、その信頼性も高くないという問題点があった。

したがって、最近では、ハイブリッドキャプチャー検査法(hybrid capture assay)、分岐鎖ＤＮＡ検査法(branched DNA assay)及びポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction：ＰＣＲ）を利用した遺伝子検査法が広く利用されており、特に、ＰＣＲを利用した遺伝子検査法は、その感受性が高く、迅速であり、またウィルスの増殖程度を確認することによってＢ型肝炎疾患に対する薬理作用を確認できるという長所のため、最近に広く好まれる方法のうち一つである。

ＰＣＲは、特定の核酸配列に相補的な塩基よりなるプライマーセットを利用して、その間にある遺伝子を短時間で数百から数千コピーにまで増幅させる方法であって、これは当該分野に公知のものである。ＰＣＲにおいて、増幅標的核酸配列の対応ストランドに相補的な２つの核酸プライマーは、標的核酸配列の変性したストランドにハイブリッド形成条件下でアニーリングし、一般的に熱に安定であるＤＮＡポリメラーゼにより前記ハイブリッド形成したプライマーの末端で伸長し始めて、ＤＮＡ二重鎖が得られる。次いで、標的核酸配列を増幅させるために前記過程を反復する。核酸プライマーが前記標的核酸配列とハイブリッド形成しなければ、対応する増幅されたＰＣＲ産物も得られない。この場合、前記ＰＣＲプライマーは、ハイブリッド形成プローブとしての役割を担う。

前記のように増幅された核酸産物は、多様な方式で、例えば、標識したプライマーを使用して増幅されたストランドの標識ヌクレオチドを観察することによって検出されうる。標識付けられたプライマーは、放射性物質、蛍光染料、ジゴキシゲニン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アクリジウムエステル、ビオチン及びナタ豆ウレアーゼ(jack bean urease)で標識したプライマーであってもよいが、これらに限定されない。また、標識していないプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物を、電気泳動後に染料により視覚化することによって検出してもよい。

しかしながら、このようなＰＣＲ方法を利用したＢ型肝炎の診断は、遺伝子増幅時間が２ないし３時間ほどかかり、ＰＣＲ方法自体に対する問題点として偽陽性または偽陰性があり、多様な遺伝子型があるため正確に診断することが困難であるという問題点があった。したがって、その正確度を高めるためにＰＣＲ及びハイブリダイゼーションと共に用いて検査する方法が示唆されているが、これも検査時間が過度に長くなり、コスト面でも安くないという問題点があった。

本発明が解決しようとする目的は、Ｂ型肝炎ウィルスを迅速にかつ正確に検出できる、即ち、Ｂ型肝炎を迅速にかつ正確に診断できるプライマーセット、前記プライマーセットを利用してＰＣＲを行なう段階を有するＢ型肝炎ウィルスの検出方法、及び前記プライマーセットを含むＢ型肝炎ウィルス検出用キットを提供することである。

前記目的を達成するために本発明は、下記（ａ）〜（ｖ）のプライマーセットよりなる群から選択されるＰＣＲプライマーセットを提供する：（ａ）配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｂ）配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号３の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｃ）配列番号４の塩基配列を有するプライマーと配列番号５の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｄ）配列番号４の塩基配列を有するプライマーと配列番号６の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｅ）配列番号４の塩基配列を有するプライマーと配列番号７の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｆ）配列番号８の塩基配列を有するプライマーと配列番号７の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｇ）配列番号９の塩基配列を有するプライマーと配列番号１０の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｈ）配列番号１１の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｉ）配列番号１３の塩基配列を有するプライマーと配列番号１４の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｊ）配列番号１５の塩基配列を有するプライマーと配列番号１６の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｋ）配列番号１７の塩基配列を有するプライマーと配列番号１８の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｌ）配列番号１９の塩基配列を有するプライマーと配列番号２０の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｍ）配列番号２１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２２の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｎ）配列番号２３の塩基配列を有するプライマーと配列番号２４の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｏ）配列番号２５の塩基配列を有するプライマーと配列番号２６の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｐ）配列番号２７の塩基配列を有するプライマーと配列番号２８の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｑ）配列番号２９の塩基配列を有するプライマーと配列番号３０の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｒ）配列番号３１の塩基配列を有するプライマーと配列番号３２の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｓ）配列番号３３の塩基配列を有するプライマーと配列番号３４の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｔ）配列番号３５の塩基配列を有するプライマーと配列番号３６の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｕ）配列番号３７の塩基配列を有するプライマーと配列番号３８の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｖ）配列番号３９の塩基配列を有するプライマーと配列番号４０の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット。

また、本発明は個体から得られた核酸試料を前記プライマーセットを利用してＰＣＲにより増幅する段階を含むＢ型肝炎ウィルスの検出方法（Ｂ型肝炎の検査方法）を提供する。

望ましくは、前記ＰＣＲは変性段階ならびにアニーリング及び伸張段階よりなる２段階ＰＣＲであり、所要時間は３０分以内である。

望ましくは、前記ＰＣＲは０.２μＭ〜１μＭ濃度の各プライマーと０.０１ｐｇ〜１μｇの鋳型ＤＮＡを使用して行われ、マイクロＰＣＲチップ上で行われる。

望ましくは、前記ＰＣＲは８６〜９７℃で１〜３０秒間の変性条件及び６０〜７０℃で６〜３０秒間のアニーリング及び伸張条件で行われる。

また望ましくは、前記マイクロＰＣＲチップは、一面にはシリコンエッチング法で作製されたＰＣＲ反応チャンバーを含み、他方の面には前記ＰＣＲ反応チャンバーを加熱するための加熱器を含むシリコン基板と、入口及び出口を有するガラス基板と、を含む。

また、本発明は前記プライマーセットを含むＢ型肝炎ウィルスの検出キット（Ｂ型肝炎検査キット）を提供する。

本発明によるプライマーセットを用いることにより、Ｂ型肝炎ウィルスを迅速に、正確にかつ高い信頼性で検出できる、即ち、Ｂ型肝炎を迅速に、正確にかつ高い再現性をもって検出できるため、当該プライマーセットを利用したＢ型肝炎検査方法及びＢ型肝炎検査キットは迅速、正確かつ高い再現性でＢ型肝炎ウィルスを検出できる。

本発明の第一は、下記（ａ）〜（ｖ）のプライマーセットよりなる群から選択されるＰＣＲプライマーセットを提供する：（ａ）配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｂ）配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号３の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｃ）配列番号４の塩基配列を有するプライマーと配列番号５の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｄ）配列番号４の塩基配列を有するプライマーと配列番号６の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｅ）配列番号４の塩基配列を有するプライマーと配列番号７の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｆ）配列番号８の塩基配列を有するプライマーと配列番号７の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｇ）配列番号９の塩基配列を有するプライマーと配列番号１０の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｈ）配列番号１１の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｉ）配列番号１３の塩基配列を有するプライマーと配列番号１４の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｊ）配列番号１５の塩基配列を有するプライマーと配列番号１６の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｋ）配列番号１７の塩基配列を有するプライマーと配列番号１８の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｌ）配列番号１９の塩基配列を有するプライマーと配列番号２０の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｍ）配列番号２１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２２の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｎ）配列番号２３の塩基配列を有するプライマーと配列番号２４の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｏ）配列番号２５の塩基配列を有するプライマーと配列番号２６の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｐ）配列番号２７の塩基配列を有するプライマーと配列番号２８の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｑ）配列番号２９の塩基配列を有するプライマーと配列番号３０の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｒ）配列番号３１の塩基配列を有するプライマーと配列番号３２の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｓ）配列番号３３の塩基配列を有するプライマーと配列番号３４の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｔ）配列番号３５の塩基配列を有するプライマーと配列番号３６の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｕ）配列番号３７の塩基配列を有するプライマーと配列番号３８の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；（ｖ）配列番号３９の塩基配列を有するプライマーと配列番号４０の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセットに関するものである。本発明のプライマーセットは、Ｂ型肝炎ウィルスを迅速にかつ正確に検出できる、即ち、Ｂ型肝炎を迅速にかつ高い再現性をもって診断するのに使用できる。

したがって、発明の第二は、個体から得られた核酸試料を、本発明のプライマーセットを利用してＰＣＲにより増幅する段階を含むＢ型肝炎ウィルスの検出方法（Ｂ型肝炎の検査方法）に関するものである。

上記方法において、ＰＣＲの方法や条件は、Ｂ型肝炎ウィルスを迅速にかつ正確に検出できるものであれば特に制限されることなく、公知の方法や条件を同様に使用できるが、ＰＣＲは、変性段階ならびにアニーリング及び伸張段階よりなる２段階ＰＣＲであることが好ましく、特に８６〜９７℃で１〜３０秒間の変性条件及び６０〜７０℃で６〜３０秒間のアニーリング及び伸張条件で行われることが好ましい。また、ＰＣＲにかかる時間もまた、特に限定されないが、検査にかかる手間や患者への負担を考慮すると、３０分以内であることが好ましい。ＰＣＲは、マイクロＰＣＲチップ上で行われることが好ましい。ＰＣＲがマイクロＰＣＲチップ上で行われる場合には、マイクロＰＣＲチップは、一面にはシリコンエッチング法で作製されたＰＣＲ反応チャンバーを含み、他方の面には前記ＰＣＲ反応チャンバーを加熱するための加熱器を含むシリコン基板と、入口及び出口を有するガラス基板と、を含むことが好ましい。さらに、ＰＣＲで使用される各プライマーの濃度や鋳型ＤＮＡの量もまた、特に制限されず、公知を同様の濃度や量が使用できるが、好ましくは、ＰＣＲは、０.２μＭ〜１μＭ濃度の各プライマーと０.０１ｐｇ〜１μｇの鋳型ＤＮＡを使用して行なわれる。

また、本発明の第三は、本発明のプライマーセットを含むＢ型肝炎ウィルスの検出キット（Ｂ型肝炎検査キット）に関するものである。なお、本発明のキットは、本発明のプライマーセットを使用することを特徴とするものであり、それ以外の構成要件（例えば、他の試薬の種類や量、指示説明書など）は、特に制限されず、従来の同様の要件が使用できる。

本発明の理解を助けるために本明細書に使われた用語を定義すれば、次の通りである。「核酸」とは、一つのヌクレオチドのペントースの３’側が隣接するペントースの５’側にホスホジエステル結合によって連結される分子を意味し、ヌクレオチド残基は、特定の配列、すなわち、線状配列として表わされる。

「標的核酸」または「核酸標的」とは、関心のある特定核酸配列を意味する。したがって、「標的」は、他の核酸分子にまたは大きい核酸分子内に存在できる。本明細書において、前記標的核酸は、望ましくはＨＢＶの遺伝子内の２以上のヌクレオチド配列である。

「核酸プライマー」は、本発明の方法に使われるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはまたＰＣＲの増幅用プライマーとしても使用されうるが、本明細書では増幅プライマーを単に「プライマー」という。ここで、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合のような変形された結合を含むこともある。

本発明によるＰＣＲプライマーセットの標的ＤＮＡは、ＨＢＶのコア部分に遺伝子変異がほとんどない遺伝子部分断片であるため、診断を非常に正確に行なうことがきで、また、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦのような多様な遺伝子型に対する診断が可能である。また、通常的に、２ないし３時間がかかるＰＣＲ機器を使用した場合にはもとより、３０分以内に実験できる速いＰＣＲ機器を使用した場合にも診断の正確性、再現性が優秀である。

図１は、本発明によるＰＣＲプライマーセットの標的となるヌクレオチド配列を含むＨＢＶのゲノム配列及び前記ゲノム配列内で本発明による配列番号１ないし配列番号８のプライマーが結合する位置を概略的に表した図面である。図面に示されていないが、配列番号９ないし配列番号１２及び配列番号２３ないし配列番号２６のプライマーはＨＢＶ遺伝子の表面遺伝子領域に結合し、配列番号１３ないし配列番号２２及び配列番号２７ないし配列番号４０のプライマーはＨＢＶ遺伝子のＸ遺伝子領域に結合する。

図２は、本発明によるＰＣＲプライマーセットを用いて検出できるＡ〜Ｆの遺伝子型の系統図である。このような遺伝子型系統図は、相互の配列の相同性が高いゲノム群であり、かつ各ゲノム群のゲノムは他のゲノム群には存在しない特定の遺伝子領域を共通して有する。

以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１：プライマーの調製
プライマーは、色々な突然変異配列を有するＨＢＶ遺伝子を増幅できると同時に、このＨＢＶ遺伝子を他のウィルス遺伝子と区別できるように設計される必要がある。このために、（１）ＨＢＶゲノム特性を調査及び分析し、（２）遺伝的によく保存され、環境などによる変化がほとんどないＨＢＶゲノム領域をプライマー候補領域として選定し、さらに（３）このようなＨＢＶゲノムの領域に基づいてプライマーを設計した。

１.１ＨＢＶゲノム特性の調査及び分析
図１に示されるように、ＨＢＶゲノムは、３.２ｋｂのサイズであって、４種類の遺伝子、Ｓ，Ｃ，Ｐ，Ｘを含む。

Ｓ遺伝子でコード化されるＨＢｓＡｇは、血清型のサブタイプを決定するための血清学上の抗原性部位である。すなわち、モノクローナル抗体に対する免疫反応を目的として共通の決定基“ａ”（１２４〜１４７番目のアミノ酸残基）とサブタイプの特異的な決定基“ｄｗ，ｄｒ，ｙｗ，ｙｒ”（１２２番目のアミノ酸（ｄ＝リジン，ｙ＝アルギニン）、１６０番目のアミノ酸（ｗ＝リジン，ｒ＝アルギニン））を有する。ＨＢｓＡｇの全てのサブタイプの共通の決定基である“ａ”は、抗ＨＢｓ反応の主要領域であって、ＨＢＶにおいて様々な突然変異の形態で存在する。ＨＢＶの遺伝子型の分類において、完全なウィルスゲノムを比較する（Ａ〜Ｄの遺伝子型では８％、Ｆの遺伝子型では１４％）。新しい遺伝子型を探す標準物質として、Ｓ遺伝子の塩基配列を使用する(Magnius LO et al., Intervirology, 1995; 38(1-2):24-34)。

Ｃ遺伝子でコード化されるＨＢｅＡｇとＨＢｃＡｇとは、臨床的に重要な遺伝的多形を有する。ＨＢｅＡｇは、宿主細胞の免疫体系によって認識されるＨＢＶの重要な蛋白質マーカであって、宿主細胞による免疫反応を回避するための遺伝的多形が存在する。その中でも、特にプレコア(preCore)の未成熟な終結を引き起こすプレコア(preCore)突然変異（「翻訳停止コドン突然変異」と称される）がよく知られている(Li JS. et al., J. Virol., 1993 Sep;67(9):5402-10及びOkamoto H. et al., J. Virol., 1990 Mar;64(3):1298-303)。

Ｐ遺伝子でコード化されるＨＢＶポリメラーゼは、逆転写活性を有し、このような逆転写活性は、ヌクレオシド類似体であり、ＨＩＶ感染症の治療にも使われるラミブジンによって抑制される。長期的な薬剤の投与は、逆転写活性に関連したＹＭＤＤモチーフの選択的な突然変異を誘発することが知られている(Tipples GA. et al., Hepatology, 1996 Sep;24(3):714-7)。

前記のように、既知のＨＢＶゲノムの突然変異及び遺伝子型を調べた後、よく保存された遺伝子領域をプライマーの候補領域として選定した。

１.２プライマーの候補領域の選定
遺伝子型Ａ〜Ｇの遺伝子型の現在知られている遺伝子群を、ＧｅｎｅＢａｎｋ及び特許文献で検索した。これらの遺伝子群の塩基配列間の相同性及び突然変異部位についての分析を実施して、各遺伝子型ごとに相同性が９０％以上である領域をプライマーの候補領域として選定した。

図２は、ＨＢＶのＡ〜Ｆの遺伝子型の系統図、および本発明によるＰＣＲプライマーセットを設計するためのプライマー候補領域として選択された各遺伝子型の９０％以上の相同性領域を表す図面である。

１.３プライマーの設計
ｉ）ｒａｐｉｄＰＣＲのためのプライマーの必要条件
ｒａｐｉｄＰＣＲ用のプライマーを設計するためには、色々な条件を満足させることが要求される。ＰＣＲは、温度を効果的に変化させることによって酵素の活性を最大にすることを利用するものである。すなわち、温度と酵素活性とがＰＣＲの主要な因子であり、既存のＰＣＲ方法では、３段階、すなわち、変性、アニーリング及び延長段階を、温度を変化させることによって行なっている。

本発明では、ポリメラーゼによる重合にかかる時間を最小限にするために、従来のアニーリング段階及び伸張段階を同時に行い、また、高い合成収率を維持するために、高い融解温度（Ｔｍ）を有するプライマーが使用された。

したがって、本発明のプライマーを、ＰＣＲ産物のサイズが少なくとも１００〜２００ｂｐほどの差を有するように設計した。加えて、本発明のプライマーを、下記条件を満足するように、設計した：特定領域だけを増幅すること、ＰＣＲ産物を次の分析段階で使用できるように十分量のＰＣＲ産物を作製すること、ＰＣＲ反応時にプライマー間の干渉がないこと、高いＴｍ値を有すること、ヘアピン構造がないこと、プライマーの自家二量体の形成やプライマー対の二量体の形成がないこと、一つの塩基が逐次繰り返しが４回以下であること、マイクロサテライト存在しないこと、反復配列がないことなど。プライマーは、ＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏｒ^ＴＭ(Advanced Gene Computing Technologies,Inc)によって設計した。

ｉｉ）プライマーの選定
設計されたプライマーの詳細な配列は、プライマーの候補領域が９０％の相同性があるに基づいて、ＣｌｕｓｔａｌＸソフトウェアを使用して分析した。

候補領域に対して１００％の相同性のあるプライマーが、望ましいプライマーとして選定される（例えば、プライマー１３）。一方、候補領域に対して１００％の相同性はないが、重要な増幅部位に使用されたプライマー（例えば、プライマー１４）は、配列が決定された後ヌクレオチドのミスマッチ部位の塩基代わりに縮重塩基を有するように設計した。

このように設計されたプライマーの配列及び特性を下記表２に要約する。

実施例２：ＰＣＲ実験
ＰＣＲ実験間の差を最小限にするために、まずＤＮＡ試料だけを除いた試薬を混ぜて、実験に必要な量だけの２倍に濃縮したマスター混合物を作り、次に、これを、ＤＮＡ試料と１：１の体積比で混合して、ＰＣＲ混合物を得た。

マスター混合物の組成は、下記の通りである。

２.１公知のＰＣＲチューブを利用したＰＣＲ実験
前記のように作られたＰＣＲ混合物を、ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈＰＴＣ−１００機器に入れて、９５℃で２０秒、５８℃で３０秒、７２℃で４０秒のＰＣＲサイクルを４０回反復した。

最適なプライマーを選定するために、プライマーの種類（プライマー１〜５）、実験温度（５０℃、５３℃、５６℃、５９℃）、及びＭｇＣｌ_２濃度（２.５ｍＭ、３.５ｍＭ）を変えて、ＰＣＲ実験を行ない、これらの実験パラメーター間の相関関係を図３に示す。

図３は、各プライマーの濃度に対する相互作用プロット−データ平均を表したものであり、この実験結果によると、コントロールとして使用されたプライマー５に比べて、他のプライマー間の性能差はほぼ同じであった。

２.２ｒａｐｉｄＰＣＲ実験
前記のように作られたＰＣＲ混合物の、アニーリングと伸長温度での性能とを分析し、最適なＰＣＲ時間を得るために２段階温度実験を実施した。実験結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。なお、図４Ａにおいて、「normal PCR」とは、当業者に既知の一般的な公知のＰＣＲ法を意味し、「gradient PCR」とは、ＰＣＲ装置（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ^Ｒ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製）を用いた温度勾配ＰＣＲ(temperature gradient PCR)法（詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐを参照）を意味する。図４Ａ及び図４Ｂによれば、本発明によるプライマーは、Ｔｍが高いため、高いアニーリング温度でも高い増幅効率を示す。また、このアニーリング温度は伸張のための温度範囲内に入ることが分かる。

また、このような結果に基づいて、ＰＣＲにかかる最適な時間を得るために（ＰＣＲにかかる最小反応時間を最適化するために）、３段階ＰＣＲ（９５℃で２０秒、５８℃で３０秒、７２℃で４０秒）と２段階ＰＣＲ（９５℃で２０秒、６８℃で３０秒）との比較実験を行い、結果を図４Ｃに示す。その結果、図４Ｃに示されるように、２段階温度実験でも同じ性能を表すことを確認した。

図４Ａは、アニーリング温度に対するＰＣＲ産物の濃度を表すものであり、図４Ｂは、伸張温度に対するＰＣＲ産物の濃度を表すものである。

２．３ウィルス間交差反応性
本発明によるプライマーが他のウィルスとも反応するか否かを分析した。まず、Ｂｌａｓｔｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ）を利用して公知の塩基配列間の比較分析を実施した結果、本発明によるプライマーは、ＨＢＶにだけ１００％の相同性を示した。下記の５種類のウィルス及びヒトｇＤＮＡを使用してＰＣＲを行った結果、交差反応性は認められなかった。このような交差反応性の実験結果を下記表４に要約する。

２.４検出限界の分析
国際標準ＨＢＶＤＮＡを使用して、本発明によるＰＣＲ方法の検出限界を分析し、その結果を下記表５に要約する。

血清中に国際標準ＨＢＶＤＮＡが存在するＤＮＡ試料は、ＱｉａｇｅｎＭｉｎＥｌｕｔｅＫｉｔを利用して抽出及び精製した。ＰＣＲを行うために、２倍に濃縮されたマスター混合物を作製し、これをＤＮＡ試料と１：１の体積比で混合してＰＣＲ混合物を得た。

マスター混合物の組成は、下記の通りである。

ＰＣＲ反応は、９１℃で１秒、６３℃で１５秒の条件で行なった。

２.５マイクロチップ上でのＰＣＲ実験
本発明によるプライマーが熱伝達速度及び異なる温度間の温度勾配によるＰＣＲへの効果を確認するために、公知のＰＣＲチューブの代わりにマイクロＰＣＲチップ上に、ＰＣＲ実験を行った。使われたマイクロＰＣＲチップは、シリコン素材であって、熱伝導度が既存のチューブに比べて数百倍速いので、反応物への熱の伝達が速く、温度の傾斜速度が速く、少量のＤＮＡ試料の使用による熱の伝達が最大化できるという長所がある。

図５Ａ及び図５Ｂは、本実施例で使われたマイクロチップの上面図及び断面図（図５Ａ）、ならびに底面図（図５Ｂ）を概略的に示す図面である。図５Ａ及び図５Ｂを参照すれば、本発明による方法で使われるマイクロチップは、シリコン基板１及びガラス基板２を含む。シリコン基板１の一方の面にはＰＣＲ反応を行うためのマイクロチャンバー３がシリコンエッチング法で製作されており、他方の面には前記マイクロチャンバー３を加熱するためのマイクロヒーター４が形成されている。マイクロヒーター４は、ＰＣＲを精密に制御するためにマイクロ温度センサー７による温度制御を受ける。前記シリコン基板１は、試料流入口（入口）５及び試料排出口（出口）６が形成されたガラス基板２によって覆われており、試料流入口５を介してシリコン基板１で形成されたマイクロチャンバー３中に流入された試料は、マイクロヒーター４によって加熱されて、ＰＣＲが行われる。反応完了後には、試料は、試料排出口６を通じて排出される。

マイクロＰＣＲチップを使用してＰＣＲ実験を行うために、通常のＰＣＲチューブなどで同じＰＣＲ混合物を調製した。ここで、プライマーセットは、より小さなＰＣＲ産物を製造し、高いＴｍ値を有する表２のＧＳ０４プライマーセットを選択して評価実験を実施した。各マイクロＰＣＲチップに、１μｌのＰＣＲ混合物をロードし、９１℃で１秒、６３℃で１５秒のＰＣＲサイクルを４０回反復して実験した。実験結果物は、Ｌａｂｃｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して定量し、増幅物を２％ＴＡＥアガロースゲルで同定した。

図６は、増幅後の２％ＴＡＥアガロースゲルでの電気泳動結果を示すものである。ここで、１０^６及び１０^４は、ＨＢＶ鋳型のコピー数を示す。ＮＴＣ（鋳型のないコントロール(No Template Control)）はＰＣＲの陰性対照群であり、ＳＤ（標準(Standard)）は電気泳動の陽性対照群である。

また、図７Ａ及び図７Ｂは、本発明によるマイクロＰＣＲチップ上でＰＣＲ反応を行った場合と従来の通常のＰＣＲ機器上でＰＣＲ反応を行った場合との所要時間に対するＰＣＲ産物の濃度を比較して示す図面である。図７Ａ及び図７Ｂを参照すれば、従来の通常のＰＣＲ機器を使用した場合には、４０.８８ｎｇ／μｌのＰＣＲ産物を得るのに９０分の時間がかかるが、一方、本発明によるマイクロＰＣＲチップ上でＰＣＲ反応を行う場合には、４０.５４ｎｇ／μｌのＰＣＲ産物を得るのに２８分の時間がかかるのみであった。すなわち、本発明によるＰＣＲ方法を用いて所定の濃度のＰＣＲ産物を得るのにかかる時間は、従来の技術を用いてほぼ同じ濃度のＰＣＲ産物を得るのにかかる時間の約３分の１程度に過ぎなかった。

２.６迅速性及び正確性
本発明によるＰＣＲ方法と従来のＰＣＲキットを利用する方法（比較例１：Ｃｈｉｒｏｎ（ＰｒｏｃｌｅｉｘＵｌｔｒｉｏ^ＴＭ）、比較例２：Ｒｏｃｈｅ（ＡＭＰＬＩＮＡＴＭＰＸ））との迅速性及び正確性を比較し、その結果を下記表７に表した。

２．７再現性
本発明によるＰＣＲ方法の再現性を、日付別及び作業者別に比較し、その結果を下記表８及び表９に表した。

また、本発明と比較例１とによるＰＣＲ方法の再現性を日付別及び作業者別に比較し、その結果を下記の表１０に表した。

２.８特異性
本発明による肝炎検査キット及び従来のキット（比較例３：韓国内で販売中である臨床診断キットのうち一つであるソルゼント（Ｓｏｌｇｅｎｔ^ＴＭ））を使用して、韓国人１００人に対して、肝炎の診断検査を行なった。その結果を図８に示した。

図８を参照すれば、従来の肝炎検査キットでは、非特異的な反応を表すバンドが観察されたが、本発明による肝炎検査キットでは非特異的な反応を表すバンドは全く観察されなかったことが分かる。

実施例３：臨床試験
被検者を、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶＤＮＡ（Ｄｉｇｅｎｅ社）に対して陽性を表す患者群と、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇに対して陰性を表す場合を正常群に分けた。本臨床試験は、患者群の１１８人の被検者と、正常群の６１人の被験者に対して行い、その試験結果を下記表１１に表した。

ＤＮＡ試料を、ＱｉａｇｅｎＭｉｎＥｌｕｔｅＫｉｔを使用して被検者の血清から抽出及び精製し、ＰＣＲを行うために、２倍濃縮されたマスター混合物を作って、これをＤＮＡ試料と１：１の体積比で混合して、ＰＣＲ混合物を得た。

マスター混合物の組成は、下記の通りである。

試験結果によると、患者群で偽陰性と判断される場合が１１８人のうち３人（約２.５％）、正常群で偽陽性と判断される場合が６１人のうち１人（約１.６％）であった。これから、本発明の診断キットはＢ型肝炎の感染を非常に正確に診断できることが分かった。

また、下記表１３は、本発明による診断キットの感受性、特異性、及び有効性を総合して表したものである。

本発明のＰＣＲプライマーセット、当該プライマーセットを利用したＢ型肝炎ウィルスの検出方法（Ｂ型肝炎の検査方法）、及び当該プライマーセットを含むＢ型肝炎ウィルスの検出キットは、迅速、正確かつ高い再現性でＢ型肝炎ウィルスを検出でき、Ｂ型肝炎の診断に好適に適用されうる。

本発明によるＰＣＲプライマーセットの標的となるヌクレオチド配列を含むＨＢＶゲノム配列及び前記ゲノム配列が本発明による配列番号１ないし配列番号８のプライマーと結合する位置を概略的に示す図面である。ＨＢＶのＡ〜Ｆの遺伝子型の系統図、および本発明によるＰＣＲプライマーセットを設計するためのプライマー候補領域として選択された各遺伝子型の９０％以上の相同性領域を表す図面である。本発明によるプライマーを用いてＭＪＲｅｓｅａｒｃｈＰＴＣ−１００機器を使用して９５℃で２０秒、５８℃で３０秒、７２℃で４０秒で４０回反復してＰＣＲ反応を行った後の、各プライマーに対して濃度に対する相互作用プロット−データ平均を表す図面である。本発明によるプライマーを使用して２段階ＰＣＲ実験を行なった場合の、アニーリング温度に対するＰＣＲ産物の濃度（Ａ）を表したグラフである。本発明によるプライマーを使用して２段階ＰＣＲ実験を行なった場合の、伸長温度に対するＰＣＲ産物の濃度（Ｂ）を表したグラフである。本発明によるプライマーを使用して通常の３段階ＰＣＲ実験を行なった場合と２段階ＰＣＲ実験を行なった場合でのアニーリング温度に対するＰＣＲ産物の濃度を比較したグラフである。図５Ａ及びＢは、本発明で使われたマイクロチップの上面図及び断面図（図５Ａ）、ならびに底面図（図５Ｂ）を概略的に示す図面である。本発明によるプライマーを使用してマイクロチップ上で２段階ＰＣＲ反応を行った後の、増幅結果を２％ＴＡＥアガロースゲル上で確認した図面である。図７Ａは、ほぼ同じＤＮＡ濃度を得るためにかかるＰＣＲ反応時間を本発明と従来の技術とで比較したグラフであり、図７Ｂは、図７Ａの濃度値のみを表す拡大したグラフである。本発明による肝炎検査キット及び従来のキットを使用して電気泳動上で分子量マーカを基準として韓国人１００人に対して診断した結果を表す図面である。

符号の説明

１シリコン基板、
２ガラス基板、
３マイクロチャンバー、
４マイクロヒーター、
５試料流入口、
６試料排出口、
７マイクロ温度センサー。

Claims

下記プライマーセットよりなる群から選択されるＰＣＲプライマーセット：
（ａ）配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｂ）配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号３の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｃ）配列番号４の塩基配列を有するプライマーと配列番号５の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｄ）配列番号４の塩基配列を有するプライマーと配列番号６の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｅ）配列番号４の塩基配列を有するプライマーと配列番号７の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｆ）配列番号８の塩基配列を有するプライマーと配列番号７の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｇ）配列番号９の塩基配列を有するプライマーと配列番号１０の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｈ）配列番号１１の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｉ）配列番号１３の塩基配列を有するプライマーと配列番号１４の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｊ）配列番号１５の塩基配列を有するプライマーと配列番号１６の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｋ）配列番号１７の塩基配列を有するプライマーと配列番号１８の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｌ）配列番号１９の塩基配列を有するプライマーと配列番号２０の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｍ）配列番号２１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２２の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｎ）配列番号２３の塩基配列を有するプライマーと配列番号２４の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｏ）配列番号２５の塩基配列を有するプライマーと配列番号２６の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｐ）配列番号２７の塩基配列を有するプライマーと配列番号２８の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｑ）配列番号２９の塩基配列を有するプライマーと配列番号３０の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｒ）配列番号３１の塩基配列を有するプライマーと配列番号３２の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｓ）配列番号３３の塩基配列を有するプライマーと配列番号３４の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｔ）配列番号３５の塩基配列を有するプライマーと配列番号３６の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；
（ｕ）配列番号３７の塩基配列を有するプライマーと配列番号３８の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット；及び
（ｖ）配列番号３９の塩基配列を有するプライマーと配列番号４０の塩基配列を有するプライマーとよりなるプライマーセット。
個体から得られた核酸試料を請求項１に記載のプライマーセットを利用してＰＣＲにより増幅する段階を含むＢ型肝炎ウィルスの検出方法。
前記ＰＣＲは、変性段階ならびにアニーリング及び伸張段階よりなる２段階ＰＣＲである、請求項２に記載の方法。
前記ＰＣＲの所要時間は、３０分以内である、請求項２または３に記載の方法。
前記ＰＣＲは、マイクロＰＣＲチップ上で行われる、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記ＰＣＲは、０.２μＭ〜１μＭ濃度の各プライマーと０.０１ｐｇ〜１μｇの鋳型ＤＮＡを使用して行われる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記ＰＣＲは、８６〜９７℃で１〜３０秒間の変性段階ならびに６０〜７０℃で６〜３０秒間のアニーリング及び伸張段階よりなる、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記マイクロＰＣＲチップは、
一面にはシリコンエッチング法で作製されたＰＣＲ反応チャンバーを含み、他方の面には前記ＰＣＲ反応チャンバーを加熱するための加熱器を含むシリコン基板と、
入口及び出口を有するガラス基板と、
を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
請求項１によるプライマーセットを含むＢ型肝炎ウィルスの検出キット。