TWI248361B - Ginsenoside prepared brain cell and nerve cell protective drug - Google Patents

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1248361 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 五、發明說明（1 ) [發明之詳細說明] 本發明有關做為細胞保護劑有用的人參脊Rbl或其 鹽。再詳言之，本發明有關含有人參苷Rbi或其鹽而成之 細胞凋亡或細胞凋亡狀細胞死抑制用醫藥組成物，以及含 有人參苷或其鹽而成之細胞死抑制基因產物Bc1_Xl之 表現促進用醫藥組成物，更詳言之，本發明有關含有人參 脊Rh或其鹽而成之靜脈内投與用製劑之醫藥組成物。 本來，腦中風（腦血管障礙）之治療方法，隨腦梗塞、 腦栓塞、腦出血、暫時性腦缺血發作、蛛網膜下出企等而 有異。因此，就現況而言，如不做腦之CT(電腦斷層）檢查 則無法樹立其有效的治療對策。例如血栓溶解劑祇能應用 在腦梗塞、腦栓塞之治療，而嚴禁使用在腦出血之病情。 然而，腦中風係一種必須儘可能迅速進行病灶部分的保護 神經細胞之處理，否則以後會帶來永久性之高層次機能障 礙，或影響其生命或預後之嚴重病症，所以係一種必須分 和必爭方式展開治療之疾病。極端而言，連進行腦之CT 檢查中的時間，對於腦中風病患而言，可謂係減少康復機 曰之要因急性腦中風之治療，不僅是一種對於中風病變 之戰爭，說是跟發病後時間之戰爭，也不言過其實。但很 遺憾的是現在不論腦中風之病型（腦梗塞、腦出血、腦栓塞、 蛛網膜下出血、暫時性腦缺血發作）為何型，尚無迅速投與 疑為腦中風病患而有顯著藥效之藥劑存在。 、 另方面，人參苷Rbl係具有下列化學構造式所示化合物，

(請先閱讀背面之注意事項再 -裝___ 本頁： .' -線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248361 , A7 B7 五、發明說明（2 )

而係依據柴田氏等人之報告（參考Shibata S.，et al·， Economic and medicinal plant research，World Scien-tific， Philadelphia，pp. 217-284, 1985)等已成為周知之物質。 人參苷111)1做為親神經作用，已往祇有依腹腔内投與 之鎮靜作用之報告（參考Yoshimura H.et al·，Eur.J. Pharmacol.，146,291-297,1988)，然而其作用機制迄今完全 未詳明。另外，在中樞神經系上，有人參苷Rbi和人參苷 Rgi之混合物（或10·6至10_7M濃度之人參苷Rh，或人參 苷Rg〇可活化含乙醯膽鹼神經細胞，對於阿耳滋海默氏病 可能有效之報告（參考美國專利之US，A，5，137,878; composition and method for treatment of senile dementia) ? 然而乙醯膽鹼細胞之機能障礙很難謂係阿耳滋海默氏病之 主要症狀，因此，上述假說尚存很多有待研討之問題。 並且，有關人參苷Rh單獨之神經細胞保護作用，在 本發明研究者從事人參苷Rh之研究以前幾乎未被解明。 本發明研究者長期使用長爪沙鼠之暫時性前腦缺血模式調 查研究人參苷Rlh對於含乙醯膽鹼神經細胞以外，尚有否 (請先閱讀背面之注意事項再9本頁) . 丨線- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 ：< 297公釐） 2 310449 1248361 A7

五、發明說明（3 ) (請先閱讀背面之注音？事項再 能發揮保護效果之問題。上述腦缺血模式動物，如維持腦 溫為37 C之狀態下遮斷總頸動脈血流3至5分鐘時，則隨 著遮斷血流時間，在缺血後一星期以内，其海馬CA1錐體 神經細胞（不含乙醯膽鹼）將發生變性脫落（此稱為遲發性神 經細胞死），並證明該動物之學習行動機能也會降低（參考

Wen T’C· et al·，Acta Neuropathol.，91，15-22, 1996)。換言 之’長爪沙鼠之暫時性前腦缺血模式可以反映人類之暫時 性腦缺血發作之病態。 a»T· 本發明研究者在長爪沙鼠之腹腔内事前每日單次注入 一星期之人參苷RbjiOmg/kg或20mg/kg)，結果證明因總 頸動脈血流遮斷5分鐘所致遲發性神經細胞死和學習行動 障礙顯著性輕減之事實（參考Wen T.-C. et al·，Acta Neuropathol·，91，15-22，1996)。然而，總頸動脈血流遮斷 5分鐘或3分鐘直後，注入人參苷Rbi於腹腔内也看不到 -I線. 效果（參考 ’ Wen T，C. et al.，Acta Neuropathol.，91，15-22 1996; Lim J.-H· et·，Neurosci· Res·，28，191-200，1997)。因 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此，由於推測到該時刻末梢（腹腔内）投與之人參苷Rh之 腦内移動率和移動速度可能非常低，就保護海馬CA1錐體 神經細胞之觀點而言，認為臨床上應用人參苷Rbi之可能 性幾乎是零。 代替上述之末梢（腹腔内）投與方式，有在總頸動脈血 管遮斷3分鐘或3.5分鐘之直後。將人參苷Rbi持續直接 注入腦室内’能抑制遲發性神經細胞死亡和學習行動障礙 之報告（參考 Lim J.-H. et al·，Neurosci· Res·，28，191-200 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 3 310449 1248361 A7

1997)。另外，腦中風易發病高血壓自然發病（SH_sp)鼠之 中央大腦動脈皮膚系（MCA)永久閉塞模式（腦梗塞鼠）上， 如將人參苷Rb!在MCA永久閉塞直後開始持續注入腦室 内。則確知大腦皮質梗塞病灶顯著性縮小，該動物之場所 學習障礙也有減輕之現象之事實（參考Zhang B. et al.5 J. 五、發明說明（4 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Stroke Cerebrovasc. Dis·，7，1_9, 1998) 〇 然而，跟其他肽系成長因子同樣（參考Sakanaka Μ· et al Proc· Natl· Acad· Sci. USA，95, 4635-4640，1998; Wen T:c et al·，J· Exp· Med·，188, 635-649, 1998)，即使人參苷 Rb/ 在直接投與腦室内有藥效，從投與路徑之問題而言，應用 人參苷在人類之暫時性腦缺血發作或腦梗塞病例上被 認為是不可行的。 另外，就人參苷Rh之末梢（腹腔内）投與有關神經細 胞保遵作用之機制’本發明研究者，曾經報告如將低濃度（1 至l〇〇fg/ml)之該藥劑，事前混入培養液中，則可以減輕因 羥基自由基誘導劑（硫酸亞鐵）所造成之神經細胞之壞死現 象（參考 Lim J.-H. et al·，Neurosci· Res·，28，191-200，1997; Zhang B·，et al·，J· Stroke Cerebrovasc. Dis·，7，1-9，1998)。 本發明研究者曾推測人參甘Rb i藉由消除經基自由基，而 減少細胞膜之過氧化脂質，而保護培養神經細胞。然而目 前為止，尚不見有人證明這項假說。 另一方面，有高濃度（0·11至llpg/ml)之人參苷Rbi可 以輕減楚胺酸之神經毒性而預防神經細胞死之報告（參考 Kim Y.-C·，et al·, J· Neurosci· Res” 53, 426-432，1998)，或 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 4 310449 (請先閱讀背面之注意事項再^^本頁) 士 . i線- 1248361 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（S )據培養實驗，500μΜ(550μ§/ιη1)之高濃度之人參脊Rl^可能 預防細胞凋亡狀神經細胞死之報告（參考田中知明等人，Tk Ginseng Review，24, 61 _65, 1998)，惟據本發明研究者之培 養實驗，已知高濃度之人參苷Rbl，反而顯示神經毒性之事實（參考 Lim J.-H·，et al·，Neurosci，Res.，28，191-200 1997; Zhang Β· et al·，J· Stroke Cerebrovasc. Dis·，7 ι·9 1998)〇 ’ 同時，如此高濃度之人參苷Rbl在生物體内之細胞外 液中再顯現，不僅極為困難，考慮成本或發生副作用之可 能性等，在生物體内投與大量之人參苷Rbi幾乎是行不通 的。事實上，從本發明研究者到現在為止之實驗結果可知， 高用量之人參苷對於生物體不一定有好效果，好藥效（參考 Zhang B.，et al·，J· Stroke corebrovasc· Dis·，7，1_9 1998) 〇 換&之，到自刖為止，人參杳Rb i對於神經細胞保護 作用之機制尚未被充分瞭解。如人參苷Rbi之作用機制得 以解明，當可期待發現該藥劑之新穎效果、應用可行性等。 另外，人參苷Rh在生物體内是否能實際抑制細胞凋亡狀 細胞死也尚未明瞭。 本發明研究者使用1 fg/ml到1 的世界上罕見的 低濃度領域的人參苷Rb!，發現藉由促進細胞死抑制基因 產物Bcl-XL之表現之增加，而能抑制細胞凋亡狀神經細胞 死之現象。換言之，本發明發現人參苷Rb!係世界上唯一 存在之非肽性之Bcl_xL表現增加劑。又，i〇ofg/nU濃度之 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格⑵ο x 297公爱7 5 310449 (請先閱讀背面之注音？事項再本頁) · •線· 1248361

五、發明說明（6 人參苷Rbi，稍微能看到其過氧化脂質生成之抑制效果， 惟在更低濃度領域則看不到該效果。由此確知已往有關人 參脊Rbi之作用機制之假說為不妥當的事實。更進一步， 也發現在生物體内人參苷Rbi能抑制細胞凋亡狀神經細胞 死而完成本發明。 本發明研究者發現人參脊Rh藉由靜脈内投與，可展 現以前完全想像不到的優異的腦梗塞抑制作用和場所學習 障礙改善作用之事實，而完成本發明。 本發明之目的在提供藉由靜脈内投與，能展現優異的 腦梗塞治療效果和腦血管性痴呆抑制作用，且藉促進細胞 死抑制基因Bc1-xl之表現而能保護細胞之藥物。 又’本發明之目的在提供做為細胞保護劑有用之人參 苷或其鹽之有效投與用製劑。更詳言之，本發明可提 供含有人參苷Rt^或其鹽而成之細胞凋亡或細胞凋亡狀細 胞死抑制用醫藥組成物，或含有人參苷或其鹽而成之 細胞死抑制基因產物Bc1_Xl之表現促進用醫藥組成物。又， 本發明也提供含有人參苷Rbl4其鹽而成之腦、神經疾病 之治療、預防或處理等有用之靜脈内投與用製劑。 [發明之揭示] 本發明有關含有低濃度之人參苷Rbi或其鹽而成之細 胞〉周亡或細胞;周亡狀細胞死抑制作用醫藥組成物。 又’本發明有關含有人參苔或其鹽而成之細胞死 抑制基因產物Bcl-xL之表現促進用醫藥組成物。 上述本發明之醫藥組成物以製成靜脈内投與製劑為較 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 線· 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 6 310449 1248361 A7 B7 五、發明說明（7 ) 且’但也可以採用其他之任意之投與路徑。 本發明有關含有人參苷Rbi或其鹽宜以低濃度而成之 腦、神經疾病之治療、預防或處理等用之醫藥組成物，較 佳為靜脈内投與用製劑。 又’本發明有關由上述靜脈内投與用製劑而成之腦、 神經疾病之治療、預防或處理劑 '或腦細胞或神經細胞保 遵劑、上述疾病之治療、預防或處理方法、以及製造上述 醫樂品用之人參苷或其鹽之使用。 [圖面之簡單說明] 第1圖表不水迷路試驗之結果。第丨圖之左側表示第 2週之結果，而右側表示第4週之結果。又，第丨圖中之 黑圓點（_)表示施與偽手術之大老鼠者，空心圓點（〇）表示 手術後僅投與生理食鹽水者，黑方格（_)表示投與 之人參苷^卜者，空白方格（□)表示投與6邸8/日之人參苷 Rlh 者。 第2圖表示大腦皮質梗塞比率。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 第3圖表不大腦皮質梗塞病灶之照片。A表示投與生 理食鹽水之例舉，B表示投與人參苷Rbi之例舉。 第4圖表示整理實施例之結果的模式圖。 第5圖表示人參苷Rbl對於膜脂質過氧化防止效果非 常小的結果。 第6圖表示人參杳Rbl抑制因石肖普納（簡稱為)之 神經細胞死（細胞瑪亡）之情形之圖。第6圖之左側表示未 經SNP處理之結果，而右側表示經SNp處理者，塗黑者名 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱_)一 7 (請先閱讀背面之注音？事項再本頁) ΊΓ· 310449 1248361 A7 B7 五、發明說明（8 ) 示在SNP處理刖後添加人參脊Rh者，劃有斜線者表示在 SNP處理後添加人參脊Rbi者。 第7圖表示使用人參苷Rl^之Bcl-xL之mRNA之表現 增強效果，以照片代替圖面表示者。 第8圖表示使用人參苷Rbii Bcl_xL對蛋白質之西方 黑潰分析（Western blot analysis)之結果以照片代替圖面表 示者。 第9圖表示將使用人參苷Rb!之Bcl-xL對蛋白質之西 方墨潰分析之結果予以定量化之曲線圖。 第10圖中之（A)、（B)和（C)表示人參苷Rl^在成熟腦中 抑制病態的細胞/周亡狀神經細胞死，以照片代替圖面而表 示者。第10圖中之（D)表示將其結果予以定量化之曲線圖。 [實施本發明之最佳形態] • 本發明之人參普Rb i具有前記化學式所示構造，可按 照例如柴田等人之方法（參考Shibata S.，et al·，Economic and medicinal plant research, World Scientific， Philadelphia，pp· 217-284, 1985)分離、精製而得。據上述 方法所精製之人參苷Rh，藉薄層層析法和核磁氣共振譜 碟認其純度可達98%以上（參考Kawashima Y. and Samukawa K.9 J. Med. Pharmacol. Soc. Wakan-Yaku, 3, 235-236, 1986)。本發明之人參苷Rh以使用高純度者為宜，惟也可 以採用由藥用人參等含有人參杳Rb i之天然物萃取之混合 物。 本發明所使用之人參苷Rlh可使用游離狀者，惟亦可 (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

•線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 8 310449 1248361 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ------B7 --__ 五、發明說明（9 ) 做為適當的鹽使用之。另外，亦可做為如水和物般之溶劑 化合物使用之。 本發明所使用之人參普Rbi之濃度，以低濃度為宜。 具體而言，細胞外液濃度在lng/mlj^，較佳為—Μ 以下，更佳為lOOfg/mM下濃度。本發明之人參苷叫做 為靜脈内投與用製劑使用時，以調製製劑濃度之病患者患 部之細胞外液濃度在上述濃度範圍為宜。本發明之醫藥組 成物或製劑’其濃度在病患者患部之細胞外液濃度為】至 = 〇fg/ml程度仍能獲得充分之藥效。宜以低濃度使用人參 苷Rlh乃係本發明之特點之一。 本發明之另一特點係以靜脈内投與用製劑使用人參苷 。值得驚奇的發現乃係經由靜脈内投與的人參苷和 已往丄由末梢（腹腔内）投與者不同，而迅速地傳遞到腦、 神經系之事實。本發明之靜脈内投與用製劑，祇要經由血 管内投與，較隹為直接經由靜脈内投與。可為單次靜脈内 注入用製劑，亦可為靜脈内持績投與用製劑。又，可為添 加到點滴用組成物等靜脈投與製劑中使用之劑型也無妨。 本發明之人參苷Rbi係藉靜脈内投與可將腦梗塞病灶 縮小到非投與群之1/4之程度，而且具有增強細胞死抑制 因子Bcl-xL表現之劃時代的作用機制，可保護腦的神經細 胞，可做為神經保護藥劑利用在急性期、慢性期之腦梗塞 之外，腦出血、蛛網膜下出血、腦栓塞之急性期或慢性期， 或暫時性腦缺企發作。 換&之，本發明之人參苷Rbi係對於疑患腦中風的病 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐)--- 310449 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) £ ·. --線· -H 1 -I - 1248361 A7 B7 消 五、發明說明（10 ) 患者’在急救車中也可以點滴靜脈注射可能之藥劑。大家 周知腦缺血這種病症，不僅和腦梗塞、亦和心不全、重度 貧血、呼吸障礙、心臟停止、心室顫動等伴隨發生。從防 止這些病症並保護病患者之腦部以改善康復後之狀態而 泛，本發明之人參脊Rbi而成之醫藥組成物乃極為有效者。 另外’由本發明之人參脊而成之醫藥組成物，對 招致細胞凋亡狀神經細胞死之其他一次性和二次性神經變 性疾病（阿耳滋海默氏病、畢克氏病、脊髓小腦變性症、帕 金森氏病、舞蹈病、青光眼、老人性黃斑變性症、肌萎縮 性側索硬化症、愛滋腦症、肝性腦症、腦炎、腦性麻痺、 視網膜色素變性症、頭部外傷、脊髓損傷、一氧化碳中毒' 網膜剝離、新生兒假死、糖尿病性視網膜症、末梢神經障 礙等）等，可藉增強Bcl-XL蛋白質之表現，而期待其藥效。 本發明之人參苷Rb,製劑之特點中，不能忽視乃係不 具副作用之事實。例如做為一氧化氮供體之未經SNp處理 之一般培養神經細胞中，如添加人參苷Rbi也完全不會影 響其代謝活性，僅對經SNp處理而受傷害之神經細胞，低 濃度的（1至100fg/ml)人參苷Rbi將加以保護之故（參照實 施例3)，可知人參苷Rbi對於正常的神經組織之機能不致 給與影f，而祇能在病變部分發#優異之藥效。就這一點 而言，較之正在做為神經保護藥劑開發之麵胺酸受體拮抗 藥，可謂具有更優異之特點。 ° 另外關於人參苷叫之腦室内投與，已有不影響腦 ^、腦血流、血壓之^(參 et al.9 Neurosci. Res. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)^格⑵f 297公釐） 10 310449 (請先閱讀背面之注音？事項再本頁) £ -I線- L. ·

-I I I 1 n _ 1248361 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（11 ) 28? 191-200? 1997; Zhang B.? et al.9 J. Stroke Cerebrovasc. Dis·，7, 1-9, 1998)。當然，本發明者在這次之各試驗例中， 仔細觀察經投與本發明之人參苷以比之動物時，也未發現 有副作用之存在。 本發明之人參苷Rbi在中大腦動脈（MCA)永久閉塞鼠 (體重約為300g)上，一日投與劑量6pg以及60pg即能使 腦梗塞病灶縮小，改善場所學習障礙（腦血管性痴呆）。因 此’依據上述試驗結果，體重60kg之人類腦中風病患者之 投與劑量。以體重單位計算一曰1.2mg至12ing範圍。然 而，一般動物隨體重增加，體重單位所必需藥劑投與量會 減少之情形來看，1.2mg以下之用量可能有足夠之功效。 本發明之醫藥組成物在人類腦中風病患者之一曰投與量， 視病患個人之差異或病情而異，通常在〇 · 1 mg以上，較佳 為lmg以上，更佳為i〇mg以上。本發明之醫藥組成物副 作用少，所以投與量之上限可以提升到相當高量，但1曰 投與量在1 g以下，較佳為0.1 g以下。 本發明之醫藥組成物之投與方法，以靜脈投與為宜， 可將前述投與劑量分批或連續投與之。本發明之有效成分 的人參苷Rh係屬於皂苷之一種，可按照一般方法進行製 劑。例如本發明之水溶性醫藥組成物可將其凍結乾燥結晶 用生理食鹽水、蒸餾水、磷酸緩衝液、葡萄糖液等溶解而 製成靜脈投與製劑。也可以做成脂肪乳劑、脂質體製劑以 供使用。靜脈投與時，製劑濃度如非太高濃度，可調製成 任意濃度使用。例如做成〇·〇1至10mg/ml，較佳為0 J至 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 太 ί 言 Γ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 11 310449 1248361 A7 B7 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 社 印 製 五、發明說明（I2 ) lmg/ml程度以投與。 另外，本發明之動物實驗中，於左中大腦動脈皮質（MCA) 永久閉塞後’將人參替Rb i，按靜脈内持續注入2 8日而試 驗。實際上，急性期腦中風病例在臨床上發病係2週以内 病變進展者相當多，所以在這期間投與人參苷Rbi也能期 待充分效果。又，隨著人參苷Rh之實用化，可推測到今 後對於腦中風病患者之腦血管重建術，再灌流術之適用範 圍將會增廣。 本發明係將過去罕見的低濃度的人參苷Rbi藉由促進 B c 1 X L蛋白質之增加’而抑制細胞〉周亡或細胞〉周亡狀細胞 死之發現首先向世界報告者。人參苷Rbi以低濃度而藉由 促進Bcl-xL蛋白質之增加，能抑制細胞凋亡或細胞凋亡狀 細胞死之事實，乃告訴我們人參苷不僅對於中樞神經疾病， 連同伴生細胞凋亡之末稍組織之疾病（例如移植臟器後之抗 拒反應，心肌、肝臟、腎臟之缺血再灌流障礙，心肌梗塞、 末梢動脈閉塞症、末梢循環不全、褥床、自身免疫症、免 疫不全症）等也有藥效。同時，對於這些末梢組織之病症， 可以使用較神經疾病所用量更為少量之人參苷即能充 分發揮其效果、藥效。 其次，就本發明之低濃度之人參杳Rbi之作用詳細說 明如下。 首先，本發明研究者對於人參苷Rbi之靜脈内注入之 作用加以研討。為此，例如使用12至13週齡之雄 鼠（體重約為250至300g)。該動物係在12小 τ關家辟（CNS)A4規格咖χ 297公餐） 310449 (請先閱讀背面之注意事項再^本頁) . ，線. 12 1248361 A7 B7 五、發明說明（13 ) 暗室中飼養’使之自由飲食水和飼料。該動物之左中大腦 動脈皮質（MCA)加以凝固、切離。mca永久閉塞直後，將 人參苷Rlh加以單次靜脈内注入（6叫或60叫），然後利用 亞瑟迷你滲透壓泵持續靜脈内注入（6pg/日或6〇με/曰）28 曰。 另外’對於MCA閉塞對照動物（缺血對照動物）和施以 偽手術之動物則投與同量之生理食鹽水。 MCA永久閉塞後，按照常法（參考Zhang B· et al·，J.

Stroke Cerebrovasc· Dis·，7，1-9，1998)分別在第 2 週和第 4 週實施4日之水迷路試驗，並判斷sh-SP鼠之場所學習能 力。 其結果表示於第1圖。第1圖之左側表示第2週之結 果’而右側表示第4週之結果。另外，第1圖中之黑圓點（籲） 表示施予偽手術之試驗鼠，空心圓點表示手術直後僅 投與生理食鹽水者，黑方格（)表示投與6pg/日之人參苷 Rlh ’而空白方格（□)表示投與6〇pg/日之人參苷Rbi者。 如第1圖所示，MCA永久閉塞後（腦梗塞後）之場所 學習障礙’較之生理食鹽水注入腦梗塞群獲得顯著性之改 善。特別是MCA閉塞後第2週和第4週之水迷路試驗， 低用量之人參苷Rbi*別在第3天和第4天之試驗，而高 用量之人參苷在第2週之第4天和第4週之第3天， 第4天皆顯示顯著性之學習能力之改善效果。又，第4週 之第1天’咼用量，低用量都能確認顯著性之效果。又，SH-SP 鼠之游泳速度在各群中看不到顯著性差別。 (請先閱讀背面之注意事項再 訂_ · -I線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用ϋ家標準（c^4規格咖x 297公釐） 13 310449 1248361 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（Μ ) 第4週的水迷路試驗結束後，使用水合氯醛麻醉SH-SP鼠’以含有4%多聚甲醛之〇 im〇i碟酸緩衝液經心性 灌流固定之。然後，摘出該動物之腦，將大腦皮質梗塞病 灶加以照像。在照片利用畫像解析裝置計測左大腦半球面 積和左大腦皮質梗塞面積，左大腦皮質梗塞面積除以左大 腦半球面積而得大腦皮質梗塞比率（％)，其結果表示於第 2圖。 如第2圖所示，人參苷！^!^靜脈内投與腦梗塞群較之 生理食鹽水投與腦梗塞群，其大腦皮質梗塞比率顯著性之 減少。該大腦皮質梗塞比率乃依據梗塞面積而算出者，其 比率之平均值，由在人參苷Rbi靜脈内投與群降為生理食 鹽水杈與群之5〇°/❹以下之事實，可知實際之梗塞體積，藉 由人參苷Rb!之靜脈内投與而縮小到四分之一程度。 第3圖A表示生理食鹽水投與腦梗塞病灶之實例，第 3圖B表示人參苷Rbi(6gg/日）投與腦梗塞病灶之實例。 又，第4圖表示整理本試驗結果之模式圖。生理食鹽 水才又與群的服梗塞病灶仍然維持大面積，而在水迷路試驗 中到達目的終站需要長時間，惟相對於此，本發明之人參 苷Rl^扠與群。其病灶康復並縮小其結果在水迷路試驗中， 也在短時間内到達目的終站。 已往使用長爪沙鼠之暫時性前腦缺血模式之論文（參考 Wen T’C· et al。Acta Neuropathol·，91，15-22, 1996)中記 載，在缺血負荷前實施人參苷Rbi之腹腔内投與（i〇mg/kg/ 日或20mg/kg/日），祇能救回大約3〇%之海馬cai錐體神 (請先閱讀背面之注意事項再 I I ^^本頁) · --線- 本紙張尺度翻巾國國家標準（CNS)A4規格（21G X 297公釐） 14 310449 1248361 A7

五、發明說明（) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經細胞。當然，在缺血後即使投與人參苷Rbl在長爪沙鼠 腹腔内亦完全無效。並且，經腹腔内投與之人參苷Rbl之 1曰量，以長爪沙鼠體重（70g左右）估計，係用到〇 7至i 4mg 之高劑量，因此再從人參苷尺比之投與效率、效果之觀點 判斷時’人參苷Rbi之靜脈内投與較之腹腔内投與遠為優 異之投與方法，並且對病人之應用也容易。如周知，在人 體上以腹腔内投與藥物之方法’除一部分例外（例如腹膜灌 流等），幾乎很少實施。 又’本實施例中所使用之MCA永久閉塞動物（腦梗塞 鼠）確實較之長爪沙鼠之暫時性前腦缺血模式更為重病而 且也比較接近人類病態之模式。所以，該MCA永久閉塞 動物上’腦金管閉塞後藉靜脈内投與人參脊而顯現顯 著效果之事實，明示人參苷Rb!之少量靜脈内注入之有用 性、方便性以及經濟性。 另一方面，在MCA永久閉塞動物之腦室内直接注入 人參苷Rh而調查其效果之已往論文（參考21^叫8.6131·,】· Stroke Cerebrovasc· Dis·，7, 1-9, 1998)中記載，MCA 閉塞 後僅以〇.6pg/曰之用量將人參苷持續注入腦室内始見 顯著性之腦梗塞抑制效果，然而該效果係較之本實施例中 所示之人參苷Rb〗靜脈内投與效果同樣或更低劣者。又， 人參苷Rh之腦室内投與有關前述論文中記載，按其他用 量（6pg/日，0.06gg/日）在MCA永久閉塞後將人參苷Rh持 續注入腦室内也完全看不到腦梗塞抑制效果，因此，認為 人參苷之腦室内投與之有效濃度範圍極為狹小，很難 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 15 310449 (請先閱讀背面之注意· i 事項再 本頁) · 線· 1248361 A7 五、發明說明（l6 ) 實用’並且考慮到人體上之應用時，人參苷之腦室内 注入之危險性和效能之間加以斟酌時，事際上，其實施幾 乎是不可能的。 一般而言’認為神經保護因子係在直接投與腦室内或 腦實質内時’將發揮最大效果，而靜脈内投與或腹腔内投 與時則受到腦血液閥門之遮斷，其效果、效能將會大減或 消失。因此，人參苷Rl^之靜脈内投與之效果、效力，從 前述腹腔内投與或腦室内投與之實驗結果判斷，亦屬完全 料想不到的結果。 然而如本實驗例所明示，發現人參苷Rbi之靜脈内投 與較之腦室内投與，在更廣域濃度範圍下，能使MCa永 久閉塞鼠之腦梗塞病灶更有效地縮小，並改善該動物之學 習能力之事實。又，人參苷Rbl係藥用人參中所含有之精 製皂苷，惟因經口投與時血液中完全無法檢驗出來，因此 過去事實上人參苷Rh本身之藥理作用曾被否定。所以， 據本實驗例明示，靜脈内投與之人參苷Rbi不同於藥用人 參，係具有獨自之效果、功能以及用途之事實。 其次’本發明研究者就人參苷Rbi之神經細胞膜脂質 之過氧化防止效果進行試驗。 按照彭氏等人之方法（參考Peng H. et al.，j cei*eb

Blood Flow Metab·，18, 349-360，1998)，將胎生第 日 大老鼠大腦皮質神經細胞在無血清培養液中維持3日之 後，換成含有或不含有人參脊Rb!之新鮮培養液， m ’丹培養 48小時。然後換以含有硫酸亞鐵和抗壞血酴而T a 吸π不含人參苷 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 310449 (請先閱讀背面之注意事項再 -裝--- 本頁) --線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248361 A7 B7 五、發明說明（Π ) (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

Rb!之新鮮培養液並維持2小時，使之發生經基自由基而 對神經細胞膜產生氧化傷害。所產生之神經細胞膜過氧化 脂質，係藉由十二烷基硫酸鈉溶解細胞之後，測定硫巴比 妥酸（簡稱為TBA)之固定量的吸光度以求得。 本實驗之目的在研討人參苷Rbi以能抑制硫酸亞鐵所 造成神經細胞壞死之濃度範圍（〇〗至1〇〇fg/ml)，能否防止 細胞膜脂質之過氧化問題。 其結果表示於第5圖。由該實驗結果可知人參苷尺、 所造成神經細胞膜脂質過氧化防止效果僅在丨〇〇fg/ml之濃 度下有微弱顯現，然而在能減輕硫酸亞鐵之自由基障礙的 0.1至10fg/ml之濃度範圍，則無法確認有脂質過氧化防止 效果。因此，人參香係如已往論文（參考Lim j _H et al， Neurosci. Res., 285 191-200, 1997; Zhang B.? et al.? J. Stroke

Cerebrovasc· Dis·，7, 1-9, 1998)所報告確能在 〇」至 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 lOOfg/ml濃度領域減輕自由基之神經毒性，但隨之亦能抑 制過氧化脂質之生產的已往的假說，由本試驗結果確知是 不正確的。因此，本實驗結果顯示人參苷Rbi的新作用機 制之解析確有其必要性。 因此，本發明研究者進行人參苷Rh對於神經細胞死 (細胞凋亡）之抑制作用之判定實驗。 細胞死係從形態學上的特徵可大別為壞死（necr〇sis)和 細胞凋亡（apoptosis)兩類。雖然，對神經細胞死已有壞死 概念之定論，另一方面，細胞凋亡在病態的成熟腦有觀察 到類似之現象，但像淋巴球上所能見到的典型特徵者卻非 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 17 310449 1248361 A7

五、發明說明（IS ) 常干見。所以本說明書中，將不同於壞死而慢慢進行之神 經細胞死定義為「神經細胞之細胞凋亡」，或「細胞凋亡狀 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 神經細胞死」。 本發明研究者最近發現將培養神經細胞短時間暴露在 一氧化氮供體之硝普鈉（SNP)時，可誘發神經細胞之細胞凋 亡（參考 Toku K·，et al·，J· Neurosci· Res·，53, 415-425， 1998)。該培養實驗中已觀察到典型的細胞凋亡之特徵，所 以決定利用本實驗方法以判定人參苷Rbi之細胞凋亡抑制 效果。 胎生第17日之大老鼠大腦皮質神經細胞在無血清培養 基中維持4日至5日之後，換成含有人參苷Rbi或不含有 人參甘Rb!之新鮮培養基並培養2 4小時。然後，在培養基 中以10分鐘時間添加1〇〇μΜ濃度之SNP。再於含有人參 甘Rb i之培養液中維持神經細胞16小時，並以氧化還原色 素之阿拉瑪藍測定其細胞生存率。 上述硫酸亞鐵負荷實驗中，人參苷Rbi乃事前投與在 培養基，然後判定其結果。但本實驗中，係在SNP負荷前 後和負荷後添加人參苷Rh於培養基中，並調查其效果。 其結果表示於第6圖。第6圖之右側表示經SNP處理 者，圖中塗墨者係在SNP處理之前後添加人參苷Rbi者， 圖中畫有斜線者乃於SNP處理後添加人參苷Rbi者。 如第6圖所示，明瞭未經一氧化氮供體之硝普鈉（snp) 處理時，人參苷Rh之對於培養神經細胞之代謝活性不起 顯著性之影響，如施與SNP處理時，將發生神經細胞死（細 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 18 310449 (請先閱讀背面之注音？- 另"-- 事項再ipi本頁) 訂·· 線· 1248361 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（19 ) 胞凋亡），惟人參苷Rh以1至100fg/ml之濃度範圍内， 於SNP處理前後和處理後投與時，均可將神經細胞之細胞 凋亡加以顯著性抑制。 證實人參苷Rh在細胞外液濃度1至1 〇〇fg/ml這種過 去從來未有之低濃度能抑制神經細胞之細胞凋亡之本實驗 結果，正是本發明研究者領先世界而證實人參苷Rbi可利 用在病態的細胞凋亡狀神經細胞死之治療用途者。 其次，就人參苷Rl^對Bcl-xL表現之作用進行其解析 實驗。 Bc1-Xl基因係表現在成熟腦，免疫系組織，循環系組 織為首之很多組織中，並已證實細胞生存上扮演重要角色 之事實（參考 Adams J.M. and Cory S·，Science，281，1322-1326, 1998; Boise，L.H·，et al·，Cell，74, 597-608, 1993; Gottschalk A· R·，et al·，Proc· Natl· Acad· Sci. USA，91， 7350-7354，1994; Gonzalez-Garcia M·，et al·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，92, 4304-4308, 1995) 〇 因此，調查本發明之人參苷Rh能否增加Bc1-Xl基因 之表現。實驗方法參考溫氏等人之報告（〜0111\_(：.€131·，】· Exp· Med·，188，635-649，1998)而進行，以 Ofg/ml，lfg/ml 和100fg/ml濃度之人參苷Rb! 24小時前處理之培養神經細 胞中萃取總RNA。經過Dnase處理過之總RNA 3pg中， 使用寡dT引體（primer)及逆轉錄酶（Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase)形成 cDNA。基因增幅 反應（PCR)乃使用Taq聚合酶而按照下列條件進行。即， (請先閱讀背面之注意事項再9本頁) 霞0, · 線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 19 310449 1248361 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（2〇 ) (1)94°C，2 分鐘，（2)94°C，1.5 分鐘；5Vr . ς ν35 C，1·5 分鐘；72〇c， 2分鐘做為一循環，對於進 j j -人循玉衣，石_ 動 蛋白則20次循環，（3)72r，2分鐘。 PCR生成物以3%瓊脂糖膠電泳處理，再利用淳化乙錠 染色使之可視化。又，内部標準使用心肌動蛋白之爪麗 之表現，其結果示於第7圖。 又，為調查人參苷尺…能否增強Bc1_Xl蛋白質在神 經細胞中之表現’使用抗Bc1_Xl蛋白質抗體進行西方墨 潰法。人參苷Rb】之存在或不存在下，培養大老鼠大腦皮 質神經細胞48小時後，以電泳用試料緩衝液溶解細胞並 進行電泳處理。然後將電泳產物轉錄在硝基纖維素膜並進 行西方墨潰。其結果示於第8圖。 更進一步，將和抗Bcl-xL蛋白質抗體反應之部分用 畫像解析裝置定量化後，其結果示於第9圖中。 如第7圖所示，用lfg/ml或l〇〇fg/ml之人參苷Rbi 處理過之培養神經細胞中，其Bel-XL之mRNA之表現較 之對照組有增加。另外，在能發揮神經細胞死抑制效果之 人參脊之濃度1至i〇〇fg/ml之範圍内，使神經細胞 之白質表現量顯著性增加達約5〇%(參照第8圖、 第9圖）。 現在為止，促進神經細胞中之Bcl_xL蛋白質之表現 增強用之生理活性物，據報告有0.6至15. Ong/ml濃度範 圍之間白素（interleukin)3(參考 Wen T，C. et al·，J. Exp. Med·，188, 635-649, 1998)。人參苷 Rbi 之 Bcl-xL 蛋白質表 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 20 310449 (請先閱讀背面之注意事項再3本頁) -裝 Ϊ線· 1248361 A7 B7 五、發明說明（21 ) 現之促進作用，較之間白素3在更低濃度下就能發揮，而 且較之間白素3之祇能增加Bcl-xL蛋白質之表現10%左 右’遠為強大。又，間白素3必須直接投與在腦室内才能 顯現其神經細胞保護作用，而人參苷以^藉前述靜脈内投 與實驗（參考實施例1)已證明由靜脈内投與就能保護腦之 神經細胞，所以人參苷Rbi係末梢投與可能的非肽性向神 經藥劑中，到目前為止，係世界上唯一的Bc1-Xl蛋白質 之表現增強劑。已往，從來未被預料到非肽系藥劑會較之 肽系因子（間白素3)具有更強力的Be l-xL蛋白質之表現增 強作用。據本發明研究者所知能稍微增強神經細胞上之 之表現的肽系因子，祇有間白素3而已。 腺粒體（mitochandria)相關蛋白之Bcl-xL係被認為藉 和Apaf 1結合而阻礙Apaf 1和Procaspase 9間之結合（參 考 Adams J.M· and Cory S.，Science，281，1322-1326， 1998)。如Bcl-xL蛋白質減少或其機能降低時，被認為Apafi 會自Bc1-Xl蛋白離解，伴隨從粒線體有細胞色素c之漏 逸 ’ Procaspase 9 會活化（參考 Adams J.M· and Cory S·， Science，281，1322-1326, 1998)。一 旦細胞質内之 Procaspase 9被活化’接著就會有caspase 9和Caspase 3將被活化， 而藉运些蛋白分解酵素之作用，細胞自行融解而至死亡（細 胞〉周亡）之過程將會被加速。大概，在Procaspase 9被活 化之階段’很可能就決定了細胞死亡之命運，所以藉Bc1-Xl 蛋白之表現增加劑（即人參眘Rh)阻止pr〇caSpaSe 9之活 化，可推測為防止細胞死亡之最好方法。 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) --線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國 21 310449 1248361 A7 五、發明說明（22 ) 更進一步’為解析人參苷Rh對於腦内細胞凋亡狀神 經細胞死亡之抑制效果，調查實際在成熟腦中發生之病態 細胞凋亡狀神經細胞死亡能否藉人參苷Rh之投與而減輕 之可能性。模式動物係使用長爪沙鼠之3分鐘前腦缺血模 式而進行。該動物據報告3分鐘缺血負荷後經過i星期， 其海馬CA1領域錐體神經細胞大約有半數會變性脫落（參 考 Sakanaka M· et al·，proe Natl Aead Sci USA，95， 463 5 4640，1998)。然而，本發明研究者藉Tunei染色法確 認於上述時刻，所殘餘之神經細胞中，細胞凋亡狀細胞死 之指標的核之碎片化尚在進行之事實（參考Wen T _c 心， J. Exp. Med·，188, 635-649, 1998; Peng H. et al·，j. Cereb， Blood Flow Metab·，18, 349-360, 1998)。因此，利用該模式 動物藉Tunel染色法研討3分鐘缺血後第7日之細胞凋亡 狀神經細胞死能否由人參苷Rbi之腦室内投與而得以抑制 之問題。 在吸入麻醉下，長爪沙鼠經3分鐘之前腦缺血負荷處 理直後，以單次注入2.5ng或25ng之人參苷尺卜於其腦室 内，此後利用迷你滲透壓泵將人參苷Rbi(6〇ng/日或6〇〇ng/ 曰）持績注入腦至内達一星期。3分鐘缺血後第丨週後，將 長爪沙鼠在戊巴比妥麻醉下，利用含有4〇/〇聚甲醛之璘酸緩 衝液經心性灌流固定，再摘出腦部。摘出腦以石蠟包埋之 後，製成5μπι厚度之石蠟切片，按照一般方法實施Tunel 染色，對照動物則投與同量之生理食鹽水。 其結果示於第10圖。第10圖（A)表示對照動物，（B) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) ---------- 22 310449 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) ·- 線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248361

五、發明說明（23 ) 表示投與60ng/曰之人參苷Rbi者，（c)表示投與6〇〇ng/曰 之人參苷者。 如第10圖（A)所示，負荷3分鐘之前腦缺血的長爪沙 鼠之海馬CA1領域，在第i週後顯現大量之Tunel陽性神 經細胞’確知該細胞在細胞凋亡狀細胞死之過程中，3分 鐘前腦缺血負荷直後起注入人參苷Rbi於腦室内時，投與 60ng/日（第1〇圖，600ng/日（第1〇圖隨注入用量而 Tunel陽性神經細胞顯著性減少（第1〇圖⑺））。上述現象表 示實施例3、4中之培養實驗結果也能適用在成熟腦上。另 外’已有人參苷Rh對於腦血流或腦溫不致有影響之報告（參 考 Lim J._H· et al·，Neurosci. Res·，28, 191-200, 1997; Zhang B·，et al·，J. Stroke Cerebrovasc· Dis·，7，1_9，1998) 〇 由上述實驗結果確知含有人參苷尺比或其鹽而成之靜 脈内投與用製劑以極為低濃度下，對於腦血管性痴呆、腦 梗塞、腦中風、暫時性腦缺血發作等腦、神經疾病之治療、 預防或處理有效之事實。 另外，也確知低濃度，即細胞外液濃度在lng/ml以下， 更詳έ之，lpg/ml以下，更進而言之，即1至之 低濃度的人參苷Rh或其鹽具有細胞凋亡或細胞凋亡狀細 胞死之抑制作用。更確知人參苷Rbi或其鹽具有細胞死抑 制基因產物Bcl-xL表現促進作用。 又，本發明所使用之人參苷Rbi或其鹽為周知之藥 用人參之成分，乃係副作用極少之物質。 所以’本發明可提供臨床上有效的腦、神經疾病之治 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 23 310449 (請先閱讀背面之注音？事項再 丨 I 本頁) i線. 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 1248361 五、發明說明（24 ) 療、預防或處理劑。本發明之腦、神經疾病之治療、預防 或處理劑以調製成為人參苷Rbi或其鹽在患部組織中之細 胞外液濃度為lng/ml以下，更詳言之，在lpg/ml以下， 再詳言之，1至100fg/ml的靜脈内投與用製劑為最佳。更 具體而言，本發明乃提供調製成為人參苷Rbl或其鹽在病 患部組織中之細胞外液濃度在lng/ml以下，再詳言之，為 lpg/ml以下，更詳言之，為i至1〇〇fg/ml2靜脈内投與用 製劑而成之腦、神經疾病之治療、預防或處理劑，以及腦 細胞或神經細胞保護劑。 [實施例] 以下藉具體的試驗例詳細說明本發明，但本發明不受 該具體例舉之侷限無庸說明。 實兔例1 (人參苷《^靜脈内注入實驗） 使用12至13週齡之sh-SP雄大老鼠（體重為25〇至 3OOg)做為試驗動物。該動物在12小時為一循環之明暗室 中飼養，任其自由飲食水和飼料。其血壓為2〇3 i±6 9mm Hg,下述實驗乃依據日本愛媛大學醫學院附屬動物實驗 設施之動物實驗指針而進行。在吸入麻醉下，維持直腸溫 度於37±0.2°C下，將SH_SP鼠之左中大腦動脈皮質（mca) 加以凝固、切離。 MCA永久閉塞直後，在左大腿靜脈將人參苷之 生理食鹽水溶解液（1μ8/μ1或〇 1μ8/μ1)6〇μ1(以人參苷Rbi 計，60叫或6Hg)做單次注入。然後，埋在背部皮下之亞瑟 it係颜聽itH管自單次注入人參苷Rbl部位插入 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS：)A4規格咖X 士公餐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) _ ;線· 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 1248361 A7 B7 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 五、發明說明（25 ) 左大腿靜脈並予留置。該迷你滲透壓泵事前充滿以人參苷 Rbi之生理食鹽水溶解液，以60μg/曰或6pg/曰之用量將人 參苷Rb!自大腿靜脈持續28日注入之。又，人參脊Rbi溶 解液之流量為0.25μ1/小時。MCA永久閉塞之對照動物（即 缺血對照動物）和進行偽手術動物僅投與相同量之生理食鹽 水。 MCA永久閉塞後，按照一般方法（參考zhang B. et al。J. Stroke Cerebrovasc· Dis·，7，1-9，1998)，分別在第 2 週和第 4週實施4日的水迷路試驗，藉以判斷SH-SP大老鼠之場 所學習能力。 其結果示於第1圖。第1圖左側為第2週之結果，而 右側為第4週之結果。又，第1圖中之黑點（#)表示施與 偽手術之大老鼠，空心圓點（〇）表示手術後僅投與生理食 鹽水者，黑方格（)表示投與6pg/曰之人參苷Rbi者，空 白方格（□)表示投與60pg/日之人參苷Rbi者。資料均以平 均值土標準誤差而表示’並依據Anova和Fisher之PLSD 進行其統計解析。 又’ SH-SP大老鼠之游泳速度在各群間沒有顯著性差 異。 第4週之水迷路試驗結束後，以水合氣醛麻醉sh-SP 大老鼠下，將含有4%聚甲醛之〇· 1 mol構酸緩衝液做經心 性灌流固定。然後，摘出該試驗動物之腦，拍攝大腦皮質 梗塞病灶之照片。在照片上使用畫像解析裝置計測左大腦 半球面積和左大腦皮質梗塞面積，由左大腦皮質梗塞面積 本紙I尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 310449 (請先閱讀背面之注意事項再 -. I I 本頁) 訂： 線- 1248361 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ----------BZ______ 五、發明說明（26 ) ' ' 除以左大腦半球面積而計算得大腦皮質梗塞比率…），其 結果示於第2圖。資料均以平均值土標準誤差而表示。並 依據Mann-WhitneyU試驗進行其統計解析。 第3圖A表示生理食鹽水投與腦梗塞病灶，第3圖 B表不投與人參苷RbJ^g/日）之腦梗塞病灶之實例。 又，第4圖表示整理本實驗結果之模式圖。生理食鹽 水投與群其腦梗塞病灶部分依然很大，且水迷路試驗中到 達目的終站需要很長時間，相對的，本發明之人參苷 投與群，其病灶部分顯示康復而縮小，其結果水逑路試驗 中很短時間就能到達目的之終點。 复施例-(使用人參杳Rbi之神經細胞膜脂質之過氧化 防止效果判定實驗）： 胎生第17日之大老鼠大腦皮質神經細胞在無血清培 養液中維持3曰以後’換成含有人參脊〇 · 1 fg/ml， lfg/m卜 l〇fg/ml、100fg/ml 以及 1〇〇〇fg/mg 或不含有（〇fg/inl) 之新鮮培養液中，再埯養48小時。然後換成含有硫酸亞 鐵及抗壞血酸而不含有人參苷Rbi之新鮮培養液中再維持 2小時’使羥基自由基發生並對神經細胞膜給與氧化傷 害。所產生之神經細胞膜過氧化脂質即以十二烷基硫酸鈉 溶解細胞後，藉由硫巴比妥酸（TBA)固定量之吸光度測定 求之。其結果如第5圖所示。結果，使用人參苷Rbi之神 經細胞膜脂質過氧化防止效果，僅在l〇〇fg/ml之濃度認 出有輕微之顯現，惟在減輕因硫酸亞鐵之自由基傷害之0J 至l〇fg/ml濃度領域，則未認出脂質過氧化防止效果。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 26 310449 (請先閱讀背面之注意事項再 -1 11 本頁} Α^τ --線· 消 1248361 A7 B7 五、發明說明（27 ) 兔座例』(使用人參苷Rh之神經細胞死（細胞）抑制作用 判定實驗）： 胎生第17曰之大老鼠大腦皮質神經細胞在無血清培 養基中維持4曰或5曰後，換成含有人參苷Rh lfg/m卜 l〇〇fg/ml和i〇〇pg/ml或不含人參苷Rbi(〇fg/ml)之新鮮培 養基培養24小時。然後使用1〇分鐘時間添加一氧化氮供 體之硝普鈉（SNP)l〇〇pM濃度在培養基中。然後，再換成 5有人參苷Rbi之培養液中維持神經細胞16小時，使用 氧化還原色素之阿拉瑪藍測定細胞生存率。 其結果表示於第6圖。第6圖之左側表示未施與snp 處理之結果。由該結果可知人參苷Rbi對於神經細胞之活 性不致給與很大影響。第6圖之右側表示施與處理 者’塗黑者係在SNP處理之前後添加人參苷者，書 有斜線者係在SNP處理後添加人參苷Rbi者。資料以平 均值土標準誤差表示，依據An〇va和Fisha之pLSD進行 統計解析。星號⑺表示騎未添加人參苷叫時之顯著 性差（*表示Ρ<〇·〇5，“表示p<Q Q1)。 如第6圖所示可知，如未處理一氧化氮供體之硝普鈉 ⑽m，人參脊Rbl對於培養神經細胞之代謝活性不會 有顯著性之影響。但經SNP處理時，會發生神經細胞死(細 胞瑪亡但人參苷叫在i至100fg/mk濃度範圍内， 於SNP處理前後以及處理後投與時，均對於神經細胞之 細胞凋亡已加以顯著性之抑制。 [施例4 (人參苷Rb,之Bel X ^ ____1 Cl Xl表現作用解析實驗）： 本紙張尺㈣財關家標準（CNS)A4驗⑽χ挪公髮 -----Κ----------裝---- (請先閱讀背面之注意事項再ml本頁} --線. n I H - 27 310449 1248361 A7 B7 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 五、發明說明（28 ) 為調查人參苷Rh能否增加Bcl-xL基因之表現，依 據溫氏等人之報告所記載方法 Med·，188, 635-649, 1998)，從以 〇fg/mi，lfg/ml 以及 1〇〇fg/ml 之人參苷Rb!經24小時前處理之培養神經細胞萃取總 RNA。再由DNase處理過之總rnA 3pg使用寡dT引體及 逆轉錄酶（Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase)生成CDNA。再用基因增幅反應（PCR)將之增 幅。上述PCR係使用Taq聚合酶按照下列條件進行之。即， (1)94°C，2 分鐘，（2)以 94°C，1.5 分鐘，· 55°C，1.5 分鐘； 72°C，2分鐘為1循環，對於Bc1_Xlr 25循環，冷·肌動 蛋白行20循環，（3)72°C，2分鐘。 PCR產物以3%瓊脂糖膠行電泳，以溴化乙錠染色使之 可視化。又’内部標準使用沒-肌動蛋白之mRNA之現。 其結果表不於第7圖。 又’為調查人參脊Rh能否增強Bcl-xL蛋白質在神經 細胞中的表現，使用抗Bc1-Xl蛋白質抗體實施西方墨潰法。 人參苷Rh存在下或不存在下，培養大老鼠大腦皮質神經 細胞48小時後，以電泳用試料緩衝溶解細胞，進行電泳。 然後將電泳產物轉錄在硝基纖維素膜而進行西方墨潰，其 結果表示於第8圖。 再將與抗Bcl_xL蛋白質抗體反應之分離部分（band)以 畫像解析裝置加以定量化，其結果表示於第9圖。統計解 析法依據Anova和Fisher之PLSD而行之。圖中之星號（*) 表示對於未添加人參苷Rbl時之顯著性差表示p<〇〇1)。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) ' ------ 28 310449 (請先閱讀背面之注咅？事 項再 本頁) · 線- 1248361 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（29 ) 如第7圖所示，以lfg/ml或1〇〇fg/ml之人參苷Rbi 處理之培養神經細胞，其Bci_Xl之mRNA之表現較之對 照群增加。另一方面，人參苷Rbi在能發揮神經細胞死抑 制效果之1至l〇〇fg/ml濃度範圍下，顯著性增加神經細 胞之Bc1-xl蛋白質表現量達大約5〇0/〇之量（參照第9圖）。 1典例5 (使用人參苔Rbi之腦内細胞凋亡狀神經細胞 死抑制效果之解析）： 吸入麻醉下，對長爪沙鼠加以3分鐘之前腦虛血負荷 之直後’將2.5ng或25ng之人參苷Rbi以單次注入其腦 至内’然後使用迷你滲透壓泵將人參脊Rbi(60ng/曰或 600ng/日）持續注入腦室内達1星期。3分鐘缺血後第1週， 將長爪沙鼠在戊巴比妥麻醉下以含4〇/〇聚甲醛之構酸緩衝 液進行經心性灌流固定，並摘出腦。摘出腦用石蠟包埋之 後’製成5 μηι厚度之石墩切片，再按照一般方法實施Tunel 染色。對照動物投與相同量之生理食鹽水。 其結果示於第10圖。第1〇圖（D)之統計解析法係依 據Mann-WhitneyU試驗法進行者。第1〇圖（a)表示對照 動物，（B)表示投與60ng/曰之人參苷Rbi者，（c)表示投與 600ng/曰之人參苷尺比者。 如第10圖（A)所示，負荷3分鐘之前腦缺血之長爪沙 鼠’其海馬CA1領域在第1週後出現大量之Tunel陽性神 經細胞，可知該細胞已在細胞凋亡狀細胞死過程中，3分 鐘前腦缺金負荷直後起’注入人參脊Rb〗於腦室内時，如 60ng/日（第10圖（B))，600ng/日（第1〇圖（〇)隨注入用量 (請先閱讀背面之注意事項再 -裝—— 本頁) 訂·· 參 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 29 310449 1248361 A7 B7 五、發明說明（3〇 )

Tunel陽性神經細胞顯著性減少（第1〇圖（〇))。這表示實例 3、4中之培養實驗結果也能適用於成熟腦之可能。又，已 有人參苷Rh對於腦血流或腦溫不會有很大影響之報告（參 考 Um J，H· et al·，Neurosci· Res，28, 191 2〇〇, i997; zha叩 Β·, et al·，J. Stroke Cerebrovasc· Dis·，7，1-9，1998)。 [產業上利用之可能性] 本發明提供一種由低濃度之人參苷Rb】之靜脈内投與 用製劑而成之不僅對於急性期•慢性期之腦梗塞且對於腦 出血、蛛網膜下出血、腦塞栓之急性期或慢性期、或暫時 性腦缺血發作等都極為有效的腦、神經疾病之治療、預防 劑、以及神經保護藥。亦即，人參苷Rbi有關之本發明係 提供一種疑為腦中風之病患者在急救車t亦能使用之點滴 靜脈内注入用藥物。在實際急性期腦中風病例而言，發病 後2週内多數會有病變之進展，因此，該時期裡（例如^日 或14曰）投與本發明之人參苷Rbi就能期待充分之效果。 另外，藉人參苷尺^之實用化，對於腦中風病患者施與腦 血管再創術，再灌流術之可行性也會增加。 又，本發明之醫藥組成物具有Bci_xl蛋白質之表現增 強作用’對於伴生細胞凋亡狀神經細胞死之其他一次性及 二次性神經變性疾病（例如阿耳滋海默病、畢克氏病、脊髓 小腦變性病、帕金森氏病、舞蹈病、青光眼、肌萎縮性側 11索硬化症、老人性黃斑變性症、愛滋腦症、肝性腦症、糖 尿病性視網膜症、腦炎、腦性麻痒、視網膜剝離 '頭部外 傷、脊聽損傷、脫髓疾病、新生兒假死、末梢神經障礙、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21G X 297公釐） όΌ 310449 — — — — — Γ — — — — -11 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) --線· 1248361 Α7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ---------B7 —_______ 五、發明說明（Η ) 網膜色素變性症等）等也有效用。 又本發明之醫藥組成物提供一種幾乎無副作用，安 全性極南之藥劑。 本發明乃發現人參苷能以過去未見過之低濃度藉 促進Bcl-xL蛋白質之增加而具有抑制細胞凋亡或細胞凋亡 狀細胞死者，此乃暗示人參苷Rbi不僅對於中樞神經疾病， 還能對於伴生細胞凋亡或細胞凋亡狀細胞死之末梢組織之 疾病（例如臟器移植後之抗拒反應，心不全、心肌症、心肌、 肝臟、腎臟等之缺血再灌流障礙、舌痛症、心肌梗塞、輻 射線障礙、末梢動脈閉塞症、末梢循環不全、褥創、角臈 才貝傷、自體免疫症、免疫不全症等）或移植用臟器、組織之 保護上也有功效。對於上述末梢組織之疾病，可使用較之 神經疾病上所使用之劑量更少量的人參苷R b ^就能期得充 分的效果和效能。另外，本發明之醫藥組成物不僅可藉靜 脈内投與，尚可利用為點鼻藥、吸入藥、舌下錠、坐藥、 局部注入劑、皮膚外用劑、經口投與劑、點眼藥、局部塗 布劑、肌肉注射藥 '皮下注射劑、皮内注射藥等方式使用。 更進一步亦可利用阻止在消化器官分解之載劑，或可促進 在消化器官中吸收之載劑中混入、封入或結合人參苷 之後’將本發明之醫藥組成物做為經口投與劑使用。 (請先閱讀背面之注咅？事項再 -. I I 本頁) · ' 線· 本紙張尺度適用中國^ii^NS)A4規格⑽χ 297公爱） 31 310449

Claims (1)

1248361 米Ml hS3()7號專利申請案 I ’ I申清專利範圍修正未如v i,〔，引 r ‘、一； ：.、ί丨 ί i ) .. —wr^.v,. …一一-'，， (94年9月6曰） ，種用於治療、預防或處置細胞死抑制基因產物Bc1_Xl 之表現低所引起之疾病之靜脈内投與用醫藥組成物，包 含人麥苷Rb〗或其鹽以及靜脈内投與用载劑該人笑苻 灿或其鹽之投與量為i.67mg/kg/日以下，或者以能使 人參甘或其鹽在患部之細胞外濃度成為ing/mi以 下之量投與。 其中，該細胞係 2·如申請專利範圍第1項之醫藥組成物 腦細胞或神經細胞。 係單次靜脈内注 3·如申請專利範圍第1項之醫藥組成物 入用製劑或靜脈内持續投與用製劑。 係以人參苻Rb, 4·如申請專利範圍第i項之醫藥組成物 或其鹽在患部之細胞外濃度成為1至100fg/m】之量投 與。 經濟部中央標準局員工福利委員會印製 5· —種用於治療、預防或處置伴生細胞凋亡或細胞凋亡狀 細胞死之末梢組織之疾病或者抑制細胞凋亡或細胞凋 亡狀細胞死之靜脈内投與用醫藥組成物，包含人參符 或其鹽及靜脈内投與用載劑，該人參苷Rbi或其鹽 之投與量為1·67 mg/kg/日以下，或者以能使人參苷 或其鹽在患部之細胞外濃度成為lng/ml以下之量投與。 6 ·如申凊專利範圍第5項之醫藥組成物，其中，該細胞係 腦細胞或神經細胞。 3i0449(修正版) 「5^) A4ST2U) X 297公S) 1248361 7. 如申請專利範圍第5項之醫藥組成物，係單回靜脈内注 入用製劑或靜脈内持續投與用製劑。 8. 如申請專利範圍第5項之醫藥組成物，係以人參符叫 或其鹽在患部之細胞外濃度成為1至100fg/ml之量投 與。 種用夂/σ療、預防或處置腦及神經疾病之靜脈内投與 用醫藥組成物，包含人參苻Rbl或其鹽及靜脈内投與用 載劑，該人參苻Rbl或其鹽之投與量為l67mg/kg/日 以下，或者以能使人參苷Rb,或其鹽在患部之細胞外濃 度成為lng/ml以下之量投與。 10. 如申請專利範圍第9項之醫藥組成物，其中，腦及神經 疾病係腦血管性痴呆、腦梗塞、腦中風或暫時性腦缺血 發作。 11. 如申請專利範圍第9項之醫藥組成物，其中，該細胞係 腦細胞或神經細胞。 12. 如申請專利範圍第9項之醫藥組成物，係單回靜脈内注 入用製劑或靜脈内持續投與用製劑。 13·如申請專利範圍第9項之醫藥組成物，係以人參符 或其鹽在患部之細胞外濃度成為i至l〇〇fg /ml之量投 與0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公繁）