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CN1331698A - 含有人参皂甙Rb1的脑细胞或神经细胞保护剂 - Google Patents

含有人参皂甙Rb1的脑细胞或神经细胞保护剂 Download PDF

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CN1331698A
CN1331698A CN99814933A CN99814933A CN1331698A CN 1331698 A CN1331698 A CN 1331698A CN 99814933 A CN99814933 A CN 99814933A CN 99814933 A CN99814933 A CN 99814933A CN 1331698 A CN1331698 A CN 1331698A
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CN
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ginsenoside
brain
salt
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pharmaceutical composition
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CN99814933A
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阪中雅广
田中润也
佐藤康二
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Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Corp
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Publication date
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Abstract

本发明提供了有效地施用人参皂甙Rb1或其盐作为细胞保护剂的制剂。更具体地说,本发明提供了用于抑制编程性细胞死亡或类编程性细胞死亡的,含有人参皂甙Rb1或其盐药物组合物;或提供了用于促进细胞死亡抑制性基因产物Bcl－xL表达的,含有人参皂甙Rb1或其盐药物组合物。进一步地,本发明提供了适于静脉内用药的,含有人参皂甙Rb1或其盐的制剂。上述药物组合物中人参皂甙Rb1或其盐的浓度是在损伤组织细胞外液中为低浓度,优选为1ng/ml或更少,更优选为1－100fg/ml。这些组合物能促进细胞死亡抑制性基因产物Bcl－xL的表达,和抑制编程性细胞死亡或类编程性细胞死亡。上述适于静脉内用药的制剂可用于治疗、预防或处理很多疾病,特别是用于治疗、预防或处理脑和神经疾病。

Description

说明 书 含有人参皂甙Rb1的脑细胞或神经细胞保护剂
技术领域
本发明涉及用作细胞保护(cytoprotective)剂的人参皂甙Rb1或其盐。更具体地说，本发明涉及用于抑制编程性细胞死亡或类编程性细胞死亡的细胞死亡的含有人参皂甙Rb1或其盐的药物组合物，或用于促进细胞死亡抑制性或抗编程性细胞死亡的基因产物Bc1-xL的表达的药物组合物。更具体地说，本发明涉及适合于静脉内用药的，含有人参皂甙Rb1或其盐的药物组合物。
背景技术
最初，脑中风(大脑血管疾病)的治疗方法不同于脑梗塞、脑栓塞、脑出血、短暂局部缺血发作和蛛网膜下腔出血的治疗，严格地说，除了进行脑CT检查之外，没有有效的对策。例如，只有在发生脑梗塞和脑栓塞时可使用血栓溶解剂，以及在治疗脑出血时需要注意禁忌症。但是，如果不尽可能在早期对损害部位进行保护神经细胞或神经元的治疗，脑中风是可能导致更高级功能性活动永久性障碍的严重疾病，或者会威胁患者的生命。因此，不能有片刻的迟缓，应该立即开始治疗。甚至进行CT检查的时间也是脑中风患者恢复的可能性减少的一个重要的因素。的确，急性脑中风的治疗不仅是与脑中风损伤的斗争，而且由发病开始也是与时间的竞赛。不幸的是，目前不论是哪种类型的脑中风(脑梗塞、脑出血、脑栓塞、蛛网膜下腔出血和短暂大脑缺血发作)，如果在脑中风发作后及时给药，已知也没有多少药物对急性症状有效。
人参皂甙Rb1是具有下式化学结构的化合物：
人参皂甙Rb1是已知的化合物，例如参见Shibata等人文献(Shibata等人，经济和药用植物研究，世界科学(World Scientific)，Philadelphia，pp.217-284，1985)。
人参皂甙Rb1经腹膜内给药已有报道，它具有使脑镇静的作用(Yoshimura H.等人，欧洲药理学学报(Eur.J.Pharmacol.)，146，291-197，1988)，但没有说明作用机制。在中枢神经系统，人参皂甙Rb1和人参皂甙Rg1的混合物(或人参皂甙Rb1或人参皂甙Rg1在细胞外的浓度为10-6M-10-7M)有可能提高其对阿尔茨海默氏症的某些作用，其结果是激活含乙酰胆碱的神经细胞(USP5,137,878：治疗老年痴呆的组合物和方法)。但因为不能认为阿尔茨海默氏症的主要原因是含乙酰胆碱的神经细胞有功能障碍，这种假设还存在许多需要解决的问题。
此外，在我们研究人参皂甙Rb1的应用之前，没有人提到过单独使用人参皂甙Rb1时具有神经细胞保护或神经保护作用。到目前为止我们的研究指出，在沙鼠前脑暂时缺血模型里，人参皂甙Rb1对不是含乙酰胆碱的神经细胞具有保护作用。这就证明了在此前脑暂时缺血的动物模型里，颈总动脉双边阻塞3-5分钟，同时保持脑温37℃时，根据损伤时间的不同在缺血一周内会导致海马CA1锥体细胞(不含乙酰胆碱)的神经元损伤(此事件被称为延迟的神经元死亡)，缺血动物的学习行为功能受到破坏(Wen T.-C.等人，神经病理学学报(ActaNeuropathol.)，91，15-22，1996)。这些事实说明在沙鼠前脑暂时缺血模型里反映了人的暂时缺血发作(TIA)所出现的病理症状。
我们还证明了给沙鼠腹膜腔每天一次施用人参皂甙Rb1(10mg/kg或20mg/kg)，共施用一周时，可明显预防由于颈总动脉阻塞5分钟所引起的延迟的神经元死亡和学习能力缺失(Wen T.-C.等人，神经病理学学报(Acta Neuropathol.)，91，15-22，1996)。但是，在颈总动脉发生阻塞3或5分钟后在腹膜内施用人参皂甙Rb1没有作用(Wen T.-C.等人，神经病理学学报(Acta Neuropathol.)，91，15-22，1996；Lim J.-H.等人，神经系统科学研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1997)。由于在脑的外围(腹膜内)施用人参皂甙Rb1后转移的速度和后送的速度非常慢，因此，在此阶段就保护海马CA1锥体细胞神经元而言，人参皂甙Rb1没有临床应用价值。
有报道说，在颈总动脉发生阻塞3或5分钟后立即开始在脑室内灌输人参皂甙Rb1，而不是如上文所述由外围(腹膜内)给药，可抑制延迟的神经元死亡和学习能力缺失(Lim J.-H.等人，神经系统科学研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1997)。进一步的，给左大脑中动脉(MCA)皮质分支发生阻塞的自发高血压脑中风(SH-SP)大鼠在发生MAC永久阻塞后立即由脑室内灌输人参皂甙Rb1，可大大减少大脑皮质上的梗塞面积，并可改善由缺血引起动物的位置导向失能(Zhang B.等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)。
即使由脑室内灌输人参皂甙Rb1时是有效的，但似乎也不可能用人参皂甙Rb1治疗人的暂时大脑缺血发作(TIA)和脑梗塞，和其它肽生长因子类似，这是因为给药途径的问题(Sakanaka M.等人，美国国家科学会学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95，4635-4640，1998；Wen T.-C.等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，188，635-649，1998)。
关于由外围(腹膜内)给药人参皂甙Rb1的神经保护机理，我们的报告提到在与低浓度(1-100fg/ml)的人参皂甙Rb1混合前，培养介质可减少由羟基自由基诱导剂(硫酸亚铁)引起的神经元坏死(Lim J.-H.等人，神经系统科学研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1997；Zhang B.等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)。我们推测人参皂甙Rb1可减少细胞膜脂过氧化物，其结果可排除羟基自由基，以保护培养的神经细胞，但是至今这一假设没有得到证实。
某些人报道了在培养试验中人参皂甙Rb1具有神经保护作用。例如，高浓度(0.11-11μg/ml)人参皂甙Rb1可减少谷氨酸盐介导的神经毒性，从而可防止神经元细胞死亡(Kim Y.-C.，等人，神经系统科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)，53，426-432，1998)，500μM左右的高浓度(550μg/ml)人参皂甙Rb1能够防止类编程性细胞死亡的神经细胞死亡(Tanaka T.等人，人参综述(The Ginseng Review)，24，61-65，1998)。但是，按照我们的培养试验结果，高浓度的人参皂甙Rb1显示出神经毒性提高(Lim J.-H.等人，Neurosci.Res.，28，191-200，1997；Zhang B.等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)。
另外，还不了解体内细胞外液中这些高浓度的人参皂甙Rb1，据我们推论给体内大量的人参皂甙Rb1以保持细胞外的高人参皂甙Rb1浓度不可能有多大价值和不利效果。实际上，由我们的试验结果看，高剂量的人参皂甙Rb1并不是总能够得到较好的效力和有效性(ZhangB.等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)。
结论是，还不能阐明人参皂甙Rb1的神经保护机理。如果人参皂甙Rb1的作用机理是清楚的，就可发现新功能和有实用价值的相同药剂。更进一步的，还不能阐明人参皂甙Rb1实际上是否可在低浓度抑制类编程性细胞死亡的神经细胞死亡。
在世界范围内从未报道过我们所发现的，以如1fg/ml-100fg/ml这样低的浓度范围，通过提高抑制细胞死亡的基因产物Bc1-xL的表达抑制类编程性细胞死亡的神经细胞死亡。也就是说，在本发明中我们发现了人参皂甙Rb1是世界上仅有的非肽类Bc1-xL表达促进剂。虽然浓度为100fg/ml的人参皂甙Rb1对脂质体过氧化物的形成略有抑制作用，但是在较低浓度范围内没有观察到这种作用。因此，此前所提出的有关人参皂甙Rb1作用机理的假设是不适当的。我们进一步发现人参皂甙Rb1可抑制体内的类编程性细胞死亡的神经细胞死亡，从而完成了本发明。
也就是说，我们发现将人参皂甙Rb1经静脉内给药对脑梗塞显示了没有想到的优异效果，并可改善由梗塞所引起的失能。
本发明的目的是提供对患有脑梗塞的患者具有优异治疗效果、对脑血管性痴呆有抑制作用、以及通过促进抑制细胞死亡的基因产物Bc1-xL的表达保护细胞的药物或药物组合物。
本发明的另一目的是提供能够有效地将人参皂甙Rb1或其盐作为细胞保护剂用药的制剂。
更具体地说，本发明进一步的目的是提供了用于抑制编程性细胞死亡或类编程性细胞死亡的、含有人参皂甙Rb1或其盐的药物组合物，或用于促进细胞死亡抑制性基因产物Bc1-xL的表达的、含有人参皂甙Rb1或其盐的药物组合物。
本发明进一步的目的是提供了用于治疗、预防和处理脑和神经疾病的，适合于静脉内给药的，含有人参皂甙Rb1或其盐的制剂。
发明的公开
本发明涉及用于抑制编程性细胞死亡或类编程性细胞死亡的，含有低浓度人参皂甙Rb1或其盐的药物组合物。
本发明还涉及含有低浓度人参皂甙Rb1或其盐的，用于促进细胞死亡抑制性基因产物Bc1-xL表达的药物组合物。
本发明进一步的目的是提供了用于治疗、预防和处理脑和神经疾病的，适合于静脉内给药的，含有人参皂甙Rb1或其盐的制剂。
本发明的药物组合物优选是用于静脉内的制剂，但是也可选择使用其它用药途径。
本发明还涉及含有人参皂甙Rb1或其盐，优选在损伤处为低细胞外浓度的人参皂甙Rb1或其盐的药物组合物，该组合物用于治疗、预防或处理脑和神经疾病；更优选的，本发明涉及用于治疗、预防和处理上述疾病的，适合于静脉内给药的，含有人参皂甙Rb1或其盐的制剂。进一步地，本发明涉及用于治疗、预防和处理脑和神经疾病，适合于静脉内给药的上述制剂，涉及脑细胞或神经细胞的保护剂或制剂，涉及治疗或预防这些脑疾病的方法，以及人参皂甙Rb1或其盐在制备这些药物组合物中的应用。
附图说明
图1说明了水迷宫试验的结果。图1的左图说明了MCA阻塞第二周的水迷宫试验结果；图1的右图说明了MCA阻塞第四周的水迷宫试验结果。图1中，实心圈(●)表示大鼠假性操作的结果；空心圈(○)表示MCA阻塞的大鼠仅用生理盐水灌输的结果；实心方块(■)表示每天以6μg剂量的人参皂甙Rb1灌输的MCA阻塞大鼠的试验结果；空心方块(□)表示每天以60μg剂量的人参皂甙Rb1灌输的MCA阻塞大鼠的试验结果。
图2是大脑皮质梗塞比例的图示。
图3是说明大脑皮质梗塞损伤的照片。A：用生理盐水灌输的MCA-梗塞大鼠；和B：每天以6μg剂量的人参皂甙Rb1灌输的MCA阻塞大鼠。
图4是综合下文实施例1试验结果的图示。
图5说明了人参皂甙Rb1对膜脂过氧化作用只有很小的防治作用。
图6说明了人参皂甙Rb1对硝普钠盐(SNP)引起的神经细胞死亡(编程性细胞死亡)的抑制作用。图6的左图中是没有进行SNP处理的结果，右图是经过SNP处理的结果。实心柱说明了在SNP处理前和后都加入人参皂甙Rb1的结果；斜线柱说明了在SNP处理后加入人参皂甙Rb1的结果。
图7是照片，而不是图片，说明了人参皂甙Rb1上调Bc1-xL mRNA的表达。
图8是照片，而不是图片，说明了用人参皂甙Rb1处理的神经元中Bc1-xL蛋白的免疫印迹。
图9是用人参皂甙Rb1处理的神经元中Bc1-xL蛋白的免疫印迹法的定量分析结果图。
图10(A)，(B)and(C)是显微照片，而不是图片，说明了在成熟的脑中，人参皂甙Rb1对病态类编程性细胞死亡的神经元死亡的抑制作用。图10(D)是上述结果的定量图示。
实施本发明的最佳模式
本发明的人参皂甙Rb1是上文通式表示的化合物。用Shibata等人所述的方法(Shibata等人，Economic and medicinal plant research，世界科学(World Scientific)，Philadelphia，pp.217-284，1985)可分离或纯化人参皂甙Rb1。用此方法纯化的人参皂甙Rb1的纯度大于98％，可用薄层色谱或核磁共振谱确认(Kawashima Y.and Samukawa K.，医学药理学杂志(J.Med.Pharmacol.Soc.)，Wakan-Yaku，3，235-236，1986)。优选使用本发明高纯的人参皂甙Rb1，但也可使用由天然产物或天然植物如含有人参皂甙Rb1的药用人参萃取得到的混合物。
本发明的人参皂甙Rb1可以其游离的形式使用，也可以其适当的盐的形式使用。也可使用其溶剂化物如水合物。
本发明使用的人参皂甙Rb1的浓度优选的是低浓度，更具体地，在损伤处细胞外液中的浓度是1ng/ml或更低，优选1pg/ml或更低，更优选100fg/ml或更低。优选对本发明人参皂甙Rb1的静脉用制剂进行调节以使人参皂甙Rb1在患者损伤组织的细胞外液中的浓度保持在上述浓度范围内。本发明药物组合物或制剂在患者损伤组织的细胞外液中的浓度即使只有1-100fg/ml，也足以能够达到很好的效果。本发明的一个特征是人参皂甙Rb1在患者损伤组织细胞外液中的浓度优选是低浓度的。
本发明的另一特征是人参皂甙Rb1是以静脉内给药制剂的形式使用的。令人十分惊奇的是，在将人参皂甙Rb1以静脉内给药时不同于由外围(腹膜内)给药人参皂甙Rb1，它可快速转移至中枢神经系统。本发明的静脉内给药制剂可以直接用于血管内，优选用于静脉内，并可选择一次性静脉输液，或连续的静脉输液。也可以制成制剂加入静脉给药制剂如滴注输液的组合物。
与非用药的对照组相比，本发明人参皂甙Rb1的静脉内给药可将脑中风面积减少大约1/4，并且具有独特的作用机理，可提高细胞死亡抑制因子Bc1-xL的表达，也可保护脑神经或神经元。因此，可用作神经保护剂，不仅可用于急性或慢性的脑中风，而且可用于急性或慢性的脑出血、蛛网膜下腔出血、脑栓塞或短暂大脑缺血发作(TIA)。
也就是说，本发明的人参皂甙Rb1是可以静脉内给药的药物或药物组合物，可在救护车中给疑有脑中风的患者滴注。已知脑缺血的病理症状不仅是由脑梗塞引起的，还可能由心脏衰竭、严重的贫血、呼吸功能失调、心脏停搏和心室纤颤引起，为了保护脑不受上述疾病的危害和改进患有上述疾病的患者的预后状况，含有人参皂甙Rb1的药物组合物是十分有效的。
在伴随有类编程性细胞死亡的细胞死亡的原发或继发神经变性疾病(阿尔茨海默氏症、Pick病、脊髓小脑的退化、帕金森症、舞蹈症、青光眼、老年性黄斑变性、肌萎缩侧索硬化、AIDS性脑病、肝性脑病、脑炎、大脑性瘫痪、视网膜色素退化、头(脑)损伤、脊髓损伤、一氧化碳中毒、视网膜脱离、新生儿窒息、糖尿病性视网膜炎、周围神经疾病等)的治疗中，预期本发明含有人参皂甙Rb1的药物组合物具有通过Bc1-xL蛋白表达显示出有效性。
进一步的，不应忽略的是，本发明含有人参皂甙Rb1的药物制剂的特定特征是没有任何副作用。例如，即使把人参皂甙Rb1加入没有经过氧化氮(NO)供体硝普钠盐(SNP)处理的正常培养神经细胞或神经元中，它对神经元的代谢活性也没有影响。而且，在低细胞外浓度(1-100fg/ml)下的人参皂甙Rb1仅仅保护由于SNP处理所损伤的神经细胞(参见实施例3)。因此人参皂甙Rb1不会影响正常神经元的功能，但可对损伤组织有良好的效果。在目前开发的神经保护剂中，这一点是人参皂甙Rb1比谷氨酸盐受体拮抗剂更值得强调的优异特性。
还有报告说，据观察人参皂甙Rb1的脑室内用药不会影响脑温、脑血流和脑压(Lim J.-H.等人，神经系统科学研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1998)。在对使用了本发明人参皂甙Rb1的动物进行仔细观察的过程中没有发现有副作用。
在以每天6μg或60μg给发生MCA永久阻塞的大鼠(体重大约为300g)使用本发明的人参皂甙Rb1时，结果是减少了脑梗塞面积和改善了由于缺血引起的失能(脑血管痴呆)。以这些试验为基础，计算出患有脑中风的人类患者(体重60kg)的剂量为1.2 mg-12mg/天。但是，通常由于动物体重的增加，单位体重所需要的剂量减少，所以，剂量为1.2mg或更少时就可产生足够的效果。根据个体的差异和患者疾病的状况，本发明药物组合物的日剂量是0.1mg或更多，优选1mg或更多，更优选10mg或更多。因为本发明药物组合物只有很小的副作用，因此可以其剂量的上限大剂量给药，剂量的上限是每天1g或更少，优选0.1g或更少。
本发明药物组合物的给药方法优选的是静脉内给药，上文所述的给药量可以是连续的或是多次的。本发明的活性组分人参皂甙Rb1是一种皂甙，可用常规方法制药。例如，本发明含水的药物组合物可以通过将冻干的结晶溶解于生理盐水、蒸馏水、磷酸盐缓冲溶液或葡萄糖溶液制剂成静脉内给药制剂。也可使用脂质微球或微脂粒制剂。除了在特别高的情况下，静脉内使用的制剂中人参皂甙Rb1或其盐的浓度可以调节至例如0.01-10mg/ml，优选0.1-1mg/ml。
在本发明的动物试验中，在动物发生左大脑中动脉的皮质分枝的永久阻塞(MCA)之后，连续经静脉内给药28天。在急性期，根据脑中风的实际状况，在中风发生后二周内脑损伤常常会恶化，至少是在此期间内希望施用的人参皂甙Rb1有足够的作用。应用人参皂甙Rb1的实际效果是可用于脑血管的复原和扩大再灌输手术。
本发明试图揭示编程性细胞死亡或类编程性细胞死亡的细胞死亡的抑制作用，其结果是促进了在损伤组织中低细胞外浓度的人参皂甙Rb1对Bc1-xL蛋白的表达，这在过去是未知的。在损伤组织中低细胞外浓度的人参皂甙Rb1通过上调Bc1-xL蛋白的表达，可抑制编程性细胞死亡或类编程性细胞死亡的细胞死亡，上述事实说明人参皂甙Rb1不仅对中枢神经系统(CNS)疾病有效，而且对伴随有编程性细胞死亡的外周组织疾病(例如，器官移植后的排斥，心脏、肺和肾缺血的再灌输损伤，心肌梗塞，外周动脉阻塞，周围循环衰竭，褥疮，自身免疫疾病和免疫缺陷)有效。而且，为了治疗外周组织疾病，比脑疾病治疗用量更少的人参皂甙Rb1就可提供足够的效果和效力。
下面将详细解释本发明低浓度人参皂甙Rb1的作用。
首先，测试了静脉灌输人参皂甙Rb1的作用。例如，为达到此目的，使用12-13周龄的，体重为250-300g的雄性SH-SP大鼠。将动物养育在有空调的室内，进行12：12小时的亮-暗循环，随意供应水和食物。使左大脑中动脉(MCA)的皮质分支凝固，切下。在MCA发生阻塞后立即将溶于生理盐水的人参皂甙Rb1一次静脉内给药(6μg或60μg)，随后，使用Alza小型渗透泵继续静脉内给药人参皂甙Rb1(每天6μg或60μg)，共28天。
MCA发生阻塞的对照动物(缺血对照动物)和假性操作动物施用相同量的生理盐水。
在MCA发生阻塞之后，按照常规方法(Zhang B.等人，J.StrokeCerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)，在第2周和第4周分别进行水迷宫试验各4天，测试SH-SP大鼠的位置导向能力。
结果如图1所示。图1的左图是永久MCA阻塞后第二周的试验结果；右图是MCA阻塞后第四周的试验结果。图1中，实心圈(●)表示大鼠假性操作的结果；空心圈(○)表示MCA阻塞大鼠仅施用生理盐水的结果；实心方块(■)表示每天给MCA阻塞大鼠以6μg剂量施用人参皂甙Rb1的试验结果；空心方块(□)表示每天给MCA阻塞大鼠以60μg剂量施用人参皂甙Rb1的试验结果。
如图1所示，与仅施用生理盐水的脑梗塞组相比，由于输入了人参皂甙Rb1，永久MCA阻塞后(脑梗塞之后)的位置导向失能(placenavigation disability)得到显著改善。特别是在MCA阻塞后第2周和第4周进行的水迷宫试验中，低人参皂甙Rb1剂量组在MCA阻塞后的第3天和第4天，高人参皂甙Rb1剂量组在第2周的第3天和第4周的第3和第4天显著改善学习失能。高剂量和低剂量组在第4周的第1天各自都有显著的影响。在SH-SP大鼠的游泳速度试验中，四个组没有显著差别。
在水迷宫实验的第4周，将SH-SP大鼠用水合氯醛麻醉，用含有4％多聚甲醛的0.1mol磷酸盐缓冲溶液穿心灌输和固定，切下脑，并将发生梗塞的脑皮质部分照相。用图象分析仪测量照片上的左大脑半球的面积和左脑皮质梗塞的损伤面积。左脑皮质梗塞面积除以左大脑半球面积，可计算出脑皮质梗塞的比率(％)。结果如图2所示。
如图2所示，将静脉给药人参皂甙Rb1的脑梗塞组和只给生理盐水的脑梗塞组相比，前者脑梗塞的比率显著降低。由于脑皮质梗塞的比率是以梗塞面积为基础进行计算的，与只给生理盐水的试验组相比，使用静脉给药人参皂甙Rb1的试验组梗塞比率的平均值减少到50％或更低，静脉给药人参皂甙Rb1的试验组梗塞实际体积的减少大约是1/4。
图3A和图3B分别给出了施用生理盐水的试验组，和施用人参皂甙Rb1(6μg/天)的试验组的脑梗塞的实际情况。
图4是归纳了本发明试验结果的图示。施用生理盐水的大鼠，残留的梗塞面积大，在水迷宫试验中大鼠逃逸到终点平台上需要较长时间。相反，在给以本发明人参皂甙Rb1的试验组，梗塞的面积可以复原或减少，其结果是，在水迷宫试验中仅用短时间大鼠就可逃逸至终点平台。
根据本发明人以前的报告，用沙鼠的短暂前脑缺血模型(Wen T.-C.，等人，神经病理学学报(Acta Neuropathol.)，91，15-22，1996)，即使是在缺血之前用人参皂甙Rb1腹膜内给药(10 mg/kg/天或20 mg/kg/天)，也只有大约30％的海马CA1锥体神经元能够免除伤害。另外，在缺血发生后将人参皂甙Rb1腹膜内给药没有效果。而且，根据沙鼠体重(大约70g)进行测量，经腹膜内联合给药人参皂甙Rb1时的日剂量可高达0.7mg-1.4mg，从人参皂甙Rb1给药的效力和效果的观点考虑，与腹膜内用药相比，将人参皂甙Rb1由静脉内给药是最好的方法，并且很容易给人实施。正如我们所知道的，腹膜内用药并不是常常给人使用的方法，只有少数除外(如腹膜灌洗等)。
本发明实施例中所使用的永久性MCA阻塞动物(脑梗塞大鼠)比短暂前脑缺血的沙鼠模型显然更为严格，它们提供了更接近人类脑梗塞疾病的模型。因此，在脑血管阻塞后开始静脉灌注人参皂甙Rb1，对永久性MCA阻塞大鼠显示出显著的优异效果，这清楚地说明了以低剂量静脉灌注人参皂甙Rb1具有有效、便利和经济的优点。
另一方面，在前述的报告中，人参皂甙Rb1可直接注入永久性MCA阻塞动物的脑室(Zhang B.，等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)，在永久性MCA阻塞发生后，只有以每天0.6μg的剂量连续注入脑室才能观察到对脑梗塞有明显的抑制作用；与本发明实施例中所述的静脉内给药人参皂甙Rb1的作用相等或略小。在前述将人参皂甙Rb1在脑室内用药的报告中，在永久性MCA阻塞发生后，以另外剂量(每天6μg或0.06μg)人参皂甙Rb1连续注入脑室，没有观察到治愈的效果。因此，在脑室内施用人参皂甙Rb1的有效剂量范围很窄，其实际临床应用很困难。而且，将危险性和所能得到的利益综合考虑，将人参皂甙Rb1注入脑室的方法似乎也不可能用于人。
一般来说，将药物直接用于脑室或用于脑主质时神经保护因子或药剂有最好的效果，而在静脉或腹膜内用药时，由于阻止神经保护剂进入脑主质的血脑屏障的作用，其效果和效力大大减少或完全消失。因此，基于腹膜内或脑室内施用人参皂甙Rb1的试验结果，在静脉内施用人参皂甙Rb1的效果和效力是完全无法预料的。
但正如本发明所阐明的，在静脉内施用人参皂甙Rb1可有效地减少永久性MCA阻塞大鼠的脑梗塞的面积，其剂量范围比在脑室内用药时更宽，并可改善MCA阻塞动物的学习功能。人参皂甙Rb1是纯化的皂甙，含于药用人参，但是由于其口服用药后无法由血液中测出，人参皂甙Rb1的药物作用基本是被否定的。但是，按照本发明的实例，清楚地说明了在静脉内施用人参皂甙Rb1是有效的，其效力和应用不依赖于药用人参。
下面，用试验测定人参皂甙Rb1对神经细胞膜脂过氧化的预防作用。
按照Peng等人的方法(Peng H.等人，脑血液流动代谢杂志(J.Cereb.Blood Flow Metab.)，18，349-360，1998)，胚胎龄17的大鼠的脑皮质神经元在无血清培养介质中保持3天，然后，用含或不含人参皂甙Rb1的新鲜介质替代上述介质，将神经元再孵化48小时。然后，将介质转换成含有硫酸亚铁和抗坏血酸，但是不含人参皂甙Rb1的新鲜介质，将神经元培养物保持2小时以产生羟基自由基，并对神经元膜造成氧化作用伤害。通过光度法测定所生成的神经元膜脂过氧化物，测定用十二烷基硫酸钠溶解细胞后固定的硫代巴比妥酸(TBA)的量。
本发明试验的目的是测定在抑制硫酸亚铁引起的神经细胞坏死所需要的0.1-100fg/ml的浓度范围内，人参皂甙Rb1能不能预防细胞膜脂的过氧化作用。
图5的试验结果表明，只有在浓度为100fg/ml时人参皂甙Rb1对细胞膜脂的过氧化略有预防作用，在0.1-10fg/ml没有观察到它们对细胞膜脂的过氧化有预防作用，所述的预防作用是其中由硫酸亚铁所引起的自由基损伤减少。因此，正如前述报告(Lim J.-H.，等人，神经系统科学研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1997；Zhang B.，等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)所述的，浓度为0.1-100fg/ml时人参皂甙Rb1确实减少了自由基的神经毒性。但是，后来发现人参皂甙Rb1也可以抑制脂过氧化物形成的假设是不正确的。因此，本试验说明了有必要对人参皂甙Rb1作用的新机理进行分析。
为此目的，我们测定人参皂甙Rb1对神经细胞死亡的抑制作用(编程性细胞死亡)。
根据细胞的形态学特征，细胞的死亡可粗略地分成坏死和编程性细胞死亡。关于神经细胞死亡，坏死的概念已经确定。但是，作为神经元编程性细胞死亡的概念，如在淋巴细胞中所观察到的典型特征很少被注意到，虽然在病态条件下成熟的脑细胞中也有类似的现象。因此，在本说明书中，在神经细胞死亡的渐变过程中它们不同于坏死，被定义为“神经细胞的编程性细胞死亡”或“神经细胞的类编程性细胞死亡”。
最近发现，培养的神经细胞(或神经元)短时间暴露于氧化氮(NO)供体和硝普纳盐(SNP)时，可诱导神经细胞的编程性细胞死亡(Toku K.，等人，神经系统科学研究学报(J.Neurosci.Res.)，53，415-425，1998)。在此培养试验中可观察到编程性细胞死亡的典型特征，通过此系统可判断出人参皂甙Rb1对编程性细胞死亡的抑制作用。
在取自胚胎龄17的大鼠脑皮质神经细胞(神经元)于无血清培养介质中培养4或5天后，然后，用含或不含人参皂甙Rb1的新鲜介质替代上述介质，将神经元孵化24小时。然后，用10分钟将浓度为100μM的SNP加入介质，使神经细胞(神经元)保持在含人参皂甙Rb1的介质中16小时。用氧化还原作用指示剂alamar蓝测定神经细胞的生存率。
在前述加入硫酸亚铁的试验中，预先在培养介质中加入人参皂甙Rb1，测定其结果。在此试验中可在SNP加入之前和之后加入人参皂甙Rb1，或者只在加入SNP之后加入人参皂甙Rb1，然后测定其效果。
图6给出了试验结果。图6的右图中是用SNP处理的结果。实心柱说明了在SNP处理前和后均加入人参皂甙Rb1的结果；斜线柱说明了只在SNP处理后加入人参皂甙Rb1的结果。
如图6的左图所指出的，在未用氧化氮(NO)供体、硝普纳盐(SNP)处理的情况下，人参皂甙Rb1对培养神经细胞的代谢活性没有显著作用。SNP处理的结果是没有加入人参皂甙Rb1的发生了神经细胞死亡(编程性细胞死亡)(图6的右图中左起第一柱)，但是浓度为1-100fg/ml的人参皂甙Rb1大大抑制了神经细胞的编程性细胞死亡，在SNP处理前和后用药的情况或是仅仅在SNP处理后用药的情况下都是如此。
本试验的结果是证明了低浓度，如1-100fg/ml的人参皂甙Rb1可抑制剂细胞外液中神经细胞的编程性细胞死亡，甚至是在以前知道的很低的浓度下。这就从实际上说明了人参皂甙Rb1有可能被用于处理或治疗病理性的类编程性细胞死亡的神经细胞死亡，这在世界上尚属首次。
下面说明可分析人参皂甙Rb1对Bc1-xL表达的作用的试验。
Bc1-xL基因存在于很多组织如成熟的脑、免疫系统和循环系统中，并且被证明它们对细胞的生存起着重要的作用(Adams J.M.和Cory S.，科学(Science)，281，1322-1326，1998；Boise，L.H.，等人，细胞(Cell)，74，597-608，1993；Gottschalk A.R.，等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，91，7350-7354，1994；Gonzalez-Garcia M.，等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，92，4304-4308，1995)。
本发明研究了人参皂甙Rb1是不是可以提高Bc1-xL的表达。试验技术是按照Wen等人所述进行的(Wen T.-C.，等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，188，635-649，1998)。总RNA由培养的神经细胞中萃取得到，该细胞被浓度为0fg/ml，1fg/ml和100fg/ml的人参皂甙Rb1处理24小时。用低聚脱氧核苷酸引物和反转录酶(Moloney鼠白血病病毒反转录酶)由脱氧核糖核酸酶处理的总RNA(3μg)制备cDNA。使用Taq聚合酶，在下述条件下进行基因扩增反应(聚合酶链反应，PCR)：(1)94℃，2分钟；(2)94℃，1.5分钟；55℃，1.5分钟；72℃，2分钟构成一个循环，对Bc1-xL进行25个循环，对B-肌动蛋白进行20个循环；和(3)72℃，2分钟。
在3％琼脂糖凝胶上用电泳测定PCR产物，用溴化乙锭染色使之可见。用B-肌动蛋白mRNA的表达作为内标。结果见图7。
为了研究人参皂甙Rb1是不是可以提高神经细胞中Bc1-xL蛋白的表达，用抗Bc1-xL蛋白抗体免疫印迹法进行试验。将大鼠脑皮质神经元在有或没有人参皂甙Rb1的情况下培养48小时后，将神经元(神经细胞)溶解于用于电泳分析的样品缓冲液中进行电泳分析。将电泳的产物转移至硝化纤维素膜上进行免疫印迹法分析，结果如图8所示。
进一步的，用图象分析仪对和抗Bc1-xL蛋白抗体反应的带进行定量，结果如图9所示。
如图7所示，在用1fg/ml或100fg/ml人参皂甙Rb1处理的培养神经细胞中，和对照组(0fg/ml)相比，Bc1-xL mRNA的表达提高了。浓度为1-100fg/ml范围内的人参皂甙Rb1对类编程性细胞死亡的神经细胞死亡具有抑制作用，大大提高了神经元的Bc1-xL蛋白表达的数量，差不多可达到50％(图8和图9)。
在神经细胞或神经元有助于Bc1-xL蛋白表达的活性物质中，浓度为0.6-15.0ng/ml的白细胞介素3已有报道(Wen T.-C.，等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，188，635-649，1998)。与白细胞介素3相比，很低的浓度下的人参皂甙Rb1可上调Bcl-xL蛋白的表达，Bc1-xL蛋白的表达的提高比白细胞介素3提高大约10％。只有在直接用于脑室之内时，白细胞介素3才表现出神经保护作用，但是前述试验已经证明静脉施用人参皂甙Rb1也可保护脑神经细胞或脑神经元(实施例1)。因此，在非肽类亲神经性的物质中，目前在世界上人参皂甙Rb1是仅有的一种可由外围给药的Bc1-xL蛋白表达增长剂。迄今为至，没有人能够预测出能够有助于Bc1-xL蛋白的表达的，显示出比肽因子(白细胞介素3)具有更有效的活性的非肽类药物。在神经细胞中能使Bc1-xL蛋白的表达略有提高的肽因子，我们仅知道白细胞介素3。
据说，作为与Apaf 1结合的结果，与Bc1-xL蛋白有关的线粒体能够抑制Apaf 1与procaspase 9的结合(Adams J.M.和Cory S.，科学(Science)，281，1322-1326，1998)。如果Bc1-xL蛋白减少或功能衰退，可由Bc1-xL蛋白释放出Apaf 1以活化procaspase 9，并伴随着来自线粒体的细胞色素C的损耗(Adams J.M.和Cory S.，科学(Science)，281，1322-1326，1998)。一旦细胞质的procaspase 9被活化，接着caspase 9和caspase 3也被活化，通过这些蛋白酶的作用加速了细胞的自体溶解，从而进入编程性细胞死亡的过程。在活化procaspase 9的阶段，细胞可能出现死亡，因此，通过提高Bc1-xL蛋白的表达(人参皂甙Rb1)，防止或抑制procaspase 9的活化是预先排除细胞死亡的一种聪明的方法。
为了分析人参皂甙Rb1对脑内类编程性细胞死亡的神经元死亡的抑制作用，本发明人测试了在成熟的脑中实际出现的类编程性细胞死亡的神经元死亡是否可以因为施用了人参皂甙Rb1而减少。使用沙鼠的3分钟前脑缺血模型作为动物模型。有报道说，在3分钟缺血后的第一周，大约产生一半的海马CA1锥体神经元(Sakanaka M.，等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95，4635-4640，1998)。但是，应用TUNEL染色法，本发明人发现在此瞬间，在保留的神经细胞中，作为类编程性细胞死亡的神经元死亡标志的神经细胞核的碎片仍然在继续变化(Wen T.-C.，等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，188，635-649，1998；Peng H.，等人，脑血液流动代射杂志(J.Cereb.BloodFlow Metab.)，18，349-360，1998)。用此动物模型，采用TUNEL染色的方法测试了3分钟缺血模型在第7天的类编程性细胞死亡的神经元死亡是否可被静脉内施用人参皂甙Rb1所抑制。
在用吸入法麻醉使沙鼠前脑3分钟缺血后立即以2.5ng或25ng的剂量由静脉内一次施用人参皂甙Rb1，随后用微型渗透真空泵将人参皂甙Rb1(60ng/天或600ng/天)连续注入脑室，共一周。在沙鼠前脑3分钟缺血一周后，在戊巴比妥麻醉下，沙鼠用含有4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲溶液穿心灌注和固定，将脑切下。将脑置于石蜡中，切成5μm厚的石蜡切片。按照常规方法进行TUNEL染色。对照动物灌注相等量的生理盐水。
结果见图10。图10(A)说明了对照组动物的试验结果；(B)为以剂量60ng/天施用人参皂甙Rb1的动物的试验结果；和(C)为以剂量600ng/天施用人参皂甙Rb1的动物的试验结果。
如图10(A)所示，在造成前脑3分钟缺血的沙鼠的海马CA1区域，在缺血一周后出现大量的TUNEL-阳性神经元，这说明神经元在以类编程性细胞死亡的方式死亡。在3分钟前脑缺血后立即在脑室内施用人参皂甙Rb1的结果是以剂量依赖关系的方式大大地减少了TUNEL-阳性神经细胞[Fig.10(B)，10(C)，10(D)]。这说明实施例3和4的培养试验结果可应用于体内。已有报告说，人参皂甙Rb1不能影响脑血流或脑温(Lim J.-H.，等人，神经系统科学研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1997；Zhang B.，等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)。
上述试验结果说明用于静脉内施用的，含有人参皂甙Rb1或其盐的制剂在很低的浓度下使用时是有效的，可用于治疗、预防或处理脑和神经疾病，如脑血管痴呆、脑梗塞、脑中风和暂时性脑缺血发作(TIA)。
已经证明在1ng/ml或更低，更具体地是1pg/ml或更低，更具体地是在1-100fg/ml的浓度下，人参皂甙Rb1或其盐能够抑制编程性细胞死亡或类编程性细胞死亡。进一步地，已经发现人参皂甙Rb1或其盐可促进抑制细胞死亡的基因产物Bc1-xL的表达。
已知人参皂甙Rb1或其盐是药用人参的一种组分，其毒性很低。
本发明提供了可临床使用的脑和神经疾病的治疗剂或预防剂。本发明的脑和神经疾病的治疗或预防剂优选是静脉内使用的制剂。更具体地，本发明静脉内使用的制剂以及脑细胞或神经细胞保护剂含有人参皂甙Rb1或其盐，并可调节其在受损组织中的细胞外浓度，使人参皂甙Rb1或其盐在受损组织中的细胞外浓度保持在1ng/ml或更低，优选1pfg/ml或更低，更优选在1-100fg/ml。
实施例
下面用具体实施例对本发明进行解释，但本发明并不局限于这些
实施例之内。实施例1(静脉内灌输人参皂甙Rb1的试验)
使用12-13周龄的雄性SH-SP大鼠，体重250-300g。动物在室内放养，形成照明12小时和黑暗12小时的循环，随机供应水和食物。动物的血压为203±6.9mmHg。按照Ehime University School of Medicine的“动物试验指南”进行下述试验。将SH-SP大鼠的左中脑动脉(MCA)的皮质分枝凝固，并切下，在吸入麻醉的同时使其直肠温度保持在37±2℃。
在MCA永久阻塞后，立即在左股静脉一次性注射含有浓度为1μg/μl或0.1μg/μl人参皂甙Rb1的60μl生理盐水；然后用导管连接到Alza微型渗透真空泵，该泵植入每只动物背部皮下，由一次性注射人参皂甙Rb1的部位插入相同的静脉。在所述的微型渗透真空泵中预先充满含有人参皂甙Rb1的生理盐水，将人参皂甙Rb1以60μg/天或6μg/天的剂量通过置于左股静脉的导管连续输入血液，共28天。含有人参皂甙Rb1的溶液的流速是每小时0.25μl。
MCA永久阻塞的对照动物(缺血对照动物)和假性操作动物施用相同剂量的生理盐水。
在MCA永久阻塞之后，按照常规的方法(Zhang B.等人，J.StrokeCerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)，各自在第二周和第四周的第4天进行水迷宫试验，测定SH-SP大鼠的位置导向能力。
结果如图1所示。图1的左图说明了MCA阻塞第二周的水迷宫试验的结果；图1的右图说明了MCA阻塞第四周的水迷宫试验的结果。图1中，实心圈(●)表示大鼠假性操作的结果；空心圈(○)表示MCA阻塞的大鼠仅用生理盐水灌输的结果；实心方块(■)表示每天以6μg剂量的人参皂甙Rb1灌输的MCA阻塞大鼠的试验结果；空心方块(□)表示每天以60μg剂量的人参皂甙Rb1灌输的MCA阻塞大鼠的试验结果。数据以平均值±SE表示。统计分析用ANOVA＋Fisher的PLSD方法进行。
在四个试验组中游泳速度没有观察到显著差别。
在第四周终止水迷宫试验以后，将SH-SP大鼠用水合氯醛麻醉，用含有4％多聚甲醛的0.1mol磷酸盐缓冲溶液穿心灌输和固定，切下脑，并将发生梗塞的脑皮质部分照相。用图象分析仪测量照片上的左大脑半球的面积和左脑皮质梗塞的损伤面积。左脑皮质梗塞面积除以左大脑半球面积，可计算出脑皮质梗塞的比率(％)。结果如图2所示。
图3A和图3B分别说明了用生理盐水灌输和每天以6μg人参皂甙Rbl灌输组大脑皮质梗塞损伤的实际情况。
图4是归纳了本试验结果的图示。在施用生理盐水的大鼠中留下的脑梗塞较大，在水迷宫试验中，大鼠逃逸到目标平台的时间较长。相反，施用本发明人参皂甙Rb1的大鼠，其梗塞面复原和减少，其结果是，大鼠逃逸到目标平台所用的时间短。实施例2(人参皂甙Rb1对神经元膜脂过氧化的预防作用)
胚胎龄17的大鼠的脑皮质神经元在无血清培养介质中保持3天，然后，用含有人参皂甙Rb1的新鲜介质替代上述介质，浓度为0.1fg/ml，lfg/ml，10fg/ml，100fg/ml和1000fg/ml，或者不含人参皂甙Rb1(0fg/ml)，将神经元再孵化48小时。然后，将介质转换成含有硫酸亚铁和抗坏血酸，但是不含人参皂甙Rb1的新鲜介质，将神经元培养物保持2小时以产生羟基自由基，并对神经元膜造成氧化作用伤害。通过光度法测定所生成的神经元膜脂过氧化物，测定用十二烷基硫酸钠溶解细胞后固定的硫代巴比妥酸(TBA)的量。
结果见图5。由试验结果可知，只有在浓度为100fg/ml时人参皂甙Rb1对细胞膜脂的过氧化略有预防作用，在0.1-10fg/ml没有观察到它们对细胞膜脂的过氧化有预防作用，所述的预防作用是其中由硫酸亚铁所引起的自由基损伤减少。实施例3 [确定人参皂甙Rb1对神经细胞死亡(编程性细胞死亡)的抑制作用的试验]
将取自胚胎龄17的大鼠脑皮质神经细胞(神经元)于无血清培养介质中培养4或5天，然后，用含有人参皂甙Rb1的新鲜介质替代上述介质，浓度为1fg/ml，100fg/ml和100pg/ml，或者不含人参皂甙Rb1(0fg/ml)的新鲜介质替代上述介质，将神经元孵化24小时。然后，用10分钟将氧化氮(NO)供体、浓度为100μM的硝普纳盐(SNP)加入介质，使神经细胞(神经元)保持在含人参皂甙Rb1的介质中16小时。用氧化还原作用指示剂alamar蓝测定神经细胞的生存率。
图6给出了试验结果。图6的左图给出了未用SNP处理的结果；人参皂甙Rb1对没有SNP处理的神经元的代谢活性没有影响。图6的右图中是用SNP处理的结果。实心柱说明了在SNP处理前和后均加入人参皂甙Rb1的结果；斜线柱说明了只在SNP处理后加入人参皂甙Rb1的结果。数据以平均值±SE表示。统计分析用ANOVA＋Fisher的PLSD进行。星号表示相对于没有加入人参皂甙Rb1的情况具有显著的差异(*p＜0.05，**p＜0.01)。
图6的左图给出了用氧化氮(NO)供体、硝普纳盐(SNP)处理的结果，人参皂甙Rb1对培养的神经细胞的代谢活性没有显著影响。作为SNP处理的结果，没有加入人参皂甙Rb1的发生了神经细胞死亡(编程性细胞死亡)(图6的右图中左起第一柱)，但是浓度为1-100fg/ml的人参皂甙Rb1大大抑制了神经细胞的编程性细胞死亡，在SNP处理前和后用药的情况或是仅在SNP处理后用药的情况下都是如此。实施例4(分析人参皂甙Rb1对Bc1-xL表达的作用的试验)
为了研究本发明的人参皂甙Rb1是不是可以提高Bc1-xL基因的表达，按照Wen等人的试验技术进行(Wen T.-C.，等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，188，635-649，1998)，总RNA由培养的神经细胞中萃取得到，该细胞被浓度为0fg/ml，1fg/ml和100fg/ml的人参皂甙Rb1处理24小时。用低聚脱氧核苷酸引物和反转录酶(Moloney鼠白血病病毒反转录酶)由脱氧核糖核酸酶处理的总RNA(3μg)制备cDNA。用PCR进行cDNA的扩增。PCR是用Taq聚合酶，在下述条件下进行的：(1)94℃，2分钟；(2)94℃，1.5分钟；55℃，1.5分钟；72℃，2分钟构成一个循环，对Bc1-xL进行25个循环，对β-肌动蛋白进行20个循环；和(3)72℃，2分钟。
在3％琼脂糖凝胶上用电泳测定PCR产物，用溴化乙锭染色使之可见。用β-肌动蛋白mRNA的表达作为内标。结果见图7。
此外，为了研究人参皂甙Rb1是不是可以提高神经细胞中Bc1-xL蛋白的表达，用抗Bc1-xL蛋白抗体免疫印迹法进行试验。将大鼠脑皮质神经元在有或没有人参皂甙Rb1的情况下培养48小时后，将神经元(神经细胞)溶解于用于电泳分析的样品缓冲液中进行电泳分析。将电泳的产物转移至硝化纤维素膜上进行免疫印迹法分析，结果如图8所示。
进一步的，用图象分析仪对和抗Bc1-xL蛋白抗体反应的带进行定量，结果如图9所示。统计分析按照ANOVA＋Fisher的PLSD方法进行。图中的星号表示相对于没有加入人参皂甙Rb1的情况具有显著的差异(**p＜0.01)。
如图7所示，在用1fg/ml或100fg/ml人参皂甙Rb1处理的培养神经细胞中，和对照组(0fg/ml)相比，Bc1-xL mRNA的表达提高了。浓度为1-100fg/ml范围内的人参皂甙Rb1对类编程性细胞死亡的神经细胞死亡具有抑制作用，大大提高了类编程性细胞死亡的神经细胞中Bc1-xL蛋白表达的数量，差不多可达到50％(参见图9)。实施例5(分析人参皂甙Rb1对脑内类编程性细胞死亡的神经元死亡的抑制作用)
在用吸入法麻醉下使沙鼠前脑3分钟缺血后立即以2.5ng或25ng的剂量在静脉内一次施用人参皂甙Rb1，随后用微型渗透真空泵将人参皂甙Rb1(60ng/天或600ng/天)连续注入脑室，共一周。在沙鼠前脑3分钟缺血一周后，在戊巴比妥麻醉下，沙鼠用含有4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲溶液穿心灌注和固定，将脑切下。将脑置于石蜡中，切成5μm厚的石蜡切片。按照常规方法进行TUNEL染色。对照动物灌注相等量的生理盐水。
结果见图10。在图10(D)用Mann-Whitney的U-试验方法进行了统计分析。图10(A)说明了对照组动物的试验结果；(B)为以剂量60ng/天施用人参皂甙Rb1的动物的试验结果；和(C)为以剂量600ng/天施用人参皂甙Rb1的动物的试验结果。
如图10(A)所示，在造成3分钟前脑缺血的沙鼠的海马CA1区域，在缺血一周后出现大量的TUNEL-阳性神经元，这说明神经元在以类编程性细胞死亡的方式死亡。在3分钟前脑缺血后立即在脑室内施用人参皂甙Rb1的结果是以剂量依赖关系的方式大大地减少了TUNEL-阳性神经细胞[Fig.10(B)，10(C)，10(D)]。这说明实施例3和4的培养试验结果可应用于体内。已有报告说，人参皂甙Rb1不能影响脑血流或脑温(Lim J.-H.，等人，神经系统科学研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1997；Zhang B.，等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)。
工业实用性
本发明提供了用于治疗、处理或预防脑和神经疾病特别有效的，含有人参皂甙Rb1的制剂，该制剂在损伤部位为低细胞外浓度，所述的脑和神经疾病例如急性或慢性脑梗塞、脑出血、蛛网膜下腔出血、脑栓塞或短暂大脑缺血发作的症状；本发明还提供了神经保护剂或静脉内用药的制剂，其中含有在损伤部位为低细胞外浓度的人参皂甙Rb1。也就是说，关于人参皂甙Rb1，本发明提供了可用于给疑有脑中风的患者在静脉内滴注输液的药物，甚至在救护车中也可使用。在急性脑中风的情况下，发作后的二周内其损伤往往会恶化，如果在此期间(例如1天或14天)施用本发明的人参皂甙Rb1，预期可达到足够的效果。进一步的，在临床医学、外科血管成形术和/或给脑中风患者再灌注方面实际应用的结果可能还会扩大。
含有本发明人参皂甙Rb1或其盐的药物组合物可提高Bc1-xL蛋白的表达，因此对伴随有类编程性细胞死亡的神经细胞死亡的其它原发或继发的神经变性疾病(阿尔茨海默氏症、Pick病、脊髓小脑退化、帕金森症、舞蹈症、青光眼、肌萎缩侧索硬化、老年性黄斑变性、AIDS性脑病、肝性脑病、糖尿病性视网膜炎、脑炎、大脑性瘫痪、视网膜脱离、头或脑损伤、脊髓损伤、脱髓鞘病、新生儿窒息、周围神经疾病、视网膜色素退化等)是有效的。
本发明的药物组合物提供了高安全性的药物，因为它几乎没有副作用。
本发明公开了通过在损伤部位的低细胞外浓度的人参皂甙Rb1促进Bc1-xL蛋白的表达，人参皂甙Rb1可抑制编程性细胞死亡或类编程性细胞死亡的细胞死亡，这在过去是未知的。这个事实说明人参皂甙Rb1不仅对中枢神经系统(CNS)是有效的，而且对伴随有编程性细胞死亡或类编程性细胞死亡的细胞死亡的外围组织疾病(例如，器官移植后的排斥、心力不足或心脏衰竭、心肌病、心脏缺血的再灌注损伤、肝和肾病、舌痛、心肌梗死、放射性损伤、外周动脉阻塞、周围循环衰竭、褥疮、角膜损伤、自身免疫病和免疫缺陷)或在器官移植之后保护器官和组织也是有效的。在治疗或处理外周组织疾病时，人参皂甙Rb1的用量小于给CNS疾病所使用的量就可达到足够的效果和效力。此外，本发明含有人参皂甙Rb1或其盐的药物组合物不仅可用作静脉内使用的制剂，而且还可用作鼻的滴剂、吸入剂、舌下片剂、栓剂、局部应用的制剂、皮肤外用的制剂、口服制剂、眼睛用滴剂、局部应用的扩散剂、肌内注射剂、皮下注射剂和皮内注射剂。另外，本发明的药物组合物还可用作口服给药的制剂，通过将人参皂甙Rb1与载体混合、装入胶囊或相结合制成口服制剂，所述的载体在消化道中可抑制分解或促进吸收。

Claims (20)

1.适于静脉内用药的药物组合物，该组合物含有人参皂甙Rb1或其盐以及载体。
2.按照权利要求1的药物组合物，其中人参皂甙Rb1或其盐在损伤组织细胞外液中的浓度为1ng/ml或更低。
3.按照权利要求2的药物组合物，其中所述的细胞是脑细胞或神经细胞。
4.按照权利要求1-3中任意一项的药物组合物，该组合物包括一次性静脉内施用的或静脉内连续施用的制剂。
5.按照权利要求1-4中任意一项的药物组合物，包括促进细胞死亡抑制性基因产物Bc1-xL表达的药物组合物。
6.按照权利要求1-4中任意一项的药物组合物，包括抑制编程性细胞死亡或类编程性细胞死亡的细胞死亡的药物组合物。
7.按照权利要求1-4中任意一项的药物组合物，包括用于治疗、预防或处理脑和神经疾病的药物组合物。
8.按照权利要求7的药物组合物，其中所述的脑和神经疾病是大脑血管痴呆、脑梗塞、脑中风或短暂脑缺血发作。
9.用于治疗、预防或处理脑和神经疾病的制剂，其中含有人参皂甙Rb1或其盐。
10.按照权利要求9的用于治疗、预防或处理脑和神经疾病的制剂，其中所述的脑和神经疾病是大脑血管痴呆、脑梗塞、脑中风或短暂脑缺血发作。
11.脑细胞或神经细胞保护性药剂或制剂，其中含有人参皂甙Rb1或其盐。
12.用于促进细胞死亡抑制性基因产物Bc1-xL的药剂或制剂，其中含有人参皂甙Rb1或其盐。
13.用于抑制编程性细胞死亡或类编程性细胞死亡的细胞死亡的药剂或制剂，其中含有人参皂甙Rb1或其盐。
14.按照权利要求9-13中任意一项的用于治疗、预防或处理的制剂或药剂，其中人参皂甙Rb1或其盐在损伤组织细胞外液中的浓度为1ng/ml或更少。
15.按照权利要求14的用于治疗、预防或处理的制剂或药剂，其中人参皂甙Rb1或其盐在损伤组织细胞外液中的浓度为1-100fg/ml。
16.治疗、预防或处理脑和神经疾病的方法，该方法包括施用有效量的人参皂甙Rb1或其盐。
17.按照权利要求16的治疗、预防或处理疾病的方法，其中所述的脑和神经疾病是大脑血管痴呆、脑梗塞、脑中风或短暂脑缺血发作。
18.按照权利要求16或17的治疗、预防或处理疾病的方法，其中所述的施用是静脉内给药。
19.人参皂甙Rb1或其盐在制备用于治疗、预防或处理脑和神经疾病的制剂中的应用。
20.按照权利要求19的应用，其中用于治疗、预防或处理脑和神经疾病的制剂是静脉内施用的制剂。
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