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TW202536364A - 具有聚焦系統的共焦拉曼顯微光譜測量裝置與方法 - Google Patents

具有聚焦系統的共焦拉曼顯微光譜測量裝置與方法

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TW202536364A
TW202536364A TW113142333A TW113142333A TW202536364A TW 202536364 A TW202536364 A TW 202536364A TW 113142333 A TW113142333 A TW 113142333A TW 113142333 A TW113142333 A TW 113142333A TW 202536364 A TW202536364 A TW 202536364A
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point
optical
microscope objective
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TW113142333A
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艾曼尼 薩格杜德達米尼
亞歷山大 葛果里耶夫
史帝芬尼 杜瑞
塞希爾 隆迪奧
奧利佛 亞奇
艾曼紐 弗羅伊紐克斯
奧瑞里恩 席弗瑞
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法商堀場法國公司
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Abstract

本發明關於一種共焦拉曼顯微光譜測量裝置(100)，包括：雷射光源(1)；顯微鏡物鏡(3)，具有光軸，配置成將激發雷射光束(10)聚焦到樣品(5)上及；系統，用於聚焦該樣本。 根據本發明，聚焦系統包括：光學分光器(11)；影像檢測器(13)；像散光學系統(12)；處理器，包含影像處理系統(15)及回授裝置(16)；光學分光器(11)自適應於擷取反射光束的一部份(21)，像散光學系統(12)自適應於將反射光束的部分(21)投射到影像檢測器(13)上的點中，且影像處理系統(15)自適應於從點影像計算聚焦誤差訊號。

Description

具有聚焦系統的共焦拉曼顯微光譜測量裝置與方法
本發明關於共焦拉曼顯微光譜測量方法及裝置技術領域。
更具體地，本發明關於一種用於共焦拉曼顯微光譜測量裝置的聚焦系統和方法。
眾所周知，拉曼光譜測量裝置使得非侵入性地分析樣品的化學成分成為可能。當與傳統顯微鏡結合使用時，就得到拉曼顯微光譜測量裝置，它提供透過結合空間解析度和光譜解析度對亞微米尺寸物件進行化學檢查的可能性。使用放置在光學顯微鏡和拉曼光譜儀輸入端之間的共焦光闌，可以僅讓來自顯微鏡物鏡焦平面的光通過：從而獲得共焦拉曼顯微光譜測量裝置。
存在許多用於顯微鏡裝置的聚焦(或自動聚焦)裝置和方法。
主動自動聚焦方法依賴一個或多個輔助光學裝置來評估樣品與顯微鏡物鏡的焦平面之間的距離。最普遍的主動自動對焦方法是基於使用相位遮罩或多色光源與多色光學系統相結合，或者也基於使用可變焦距的液體透鏡。
與主動自動對焦方法相反，被動自動對焦方法不需要任何輔助光學裝置。被動自動對焦方法是基於分析在不同物鏡到樣本距離處拍攝的影像的演算法。DFF(焦點深度)和DFD(散焦深度)方法是最常用的。為對聚焦函數進行建模，人們提出不同的演算法，例如索貝爾梯度(Sobel gradient)、帶通濾波器、拉普拉斯能量或小波轉換(wavelet transform)。被動自動對焦方法可以獲得非常高的準確度。然而，考慮到建構聚焦函數需要大量不同距離的影像，這些方法非常耗能，需要大量的儲存容量和計算時間，這限制它們的應用。此外，這些方法很慢：確定樣本並將其定位在自動對焦點所需的持續時間通常為幾秒鐘。
此外，這些方法通常需要根據所使用的顯微鏡物鏡的放大倍率進行調整。現在，通常希望透過改變物鏡的放大倍率來分析不同尺度的樣品，例如從5x變為10x、50x或100x放大倍率物鏡。現在，樣品和物鏡之間的工作距離會根據所使用的物鏡而變化。當工作距離很小時，激發雷射光束和後向散射拉曼光束發散強烈，這使得設定更加複雜。
對於具有表面粗糙度的樣品，例如岩石或錠劑(tablet)形式的藥物，必須在盡可能靠近拉曼顯微光譜測量點並且理想地在測量點本身處進行聚焦。
本發明的目的之一是提出一種可整合到共焦拉曼顯微光譜儀中的聚焦裝置，其能夠快速且高準確度地將顯微鏡聚焦到拉曼測量點，並且不會干擾檢測拉曼訊號，其強度非常低。
為彌補現有技術的上述缺陷，本發明提出一種共焦拉曼顯微光譜測量裝置，包括：雷射光源，自適應於發射激發雷射光束；樣品保持器，自適應於接收待分析樣品；顯微鏡物鏡，具有光軸，其被配置為接收該激發雷射光束並將其聚焦在朝向樣品的焦平面中；該顯微鏡物鏡自適應於收集由該樣品反射的光束並且將該反射光束透過共焦開口傳送至拉曼光譜儀；位移系統，自適應於改變該顯微鏡物鏡和該樣品保持器之間沿該光軸的距離；以及系統，用於聚焦在該樣本。
根據本發明，聚焦系統包括；光學分光器，設置在該顯微鏡物鏡和該共焦開口之間的該反射光束的路徑上；像素矩陣影像檢測器，包括至少NxM個像素，其中，N是大於2的整數且M是大於2的整數；像散光學系統，設置在該光學分光器和該影像檢測器之間以及處理器，包含影像處理系統和回授裝置；該光學分光器自適應於擷取該反射光束的一部分，該像散光學系統自適應於將該反射光束的該部分投射到該影像檢測器上的點，該影像檢測器被配置為獲取該點的影像，並且該影像處理系統自適應於計算聚焦誤差訊號，並且該回授裝置自適應於從該聚焦誤差訊號中推導出沿該光軸施加到該位移系統的位移值和方向，以將該激發雷射光束聚焦在該樣品上。
這樣的聚焦系統使得可以透過使用與拉曼光譜測量相同的激發源來快速且精確地確定樣品上的聚焦。
根據本發明的容器的其他非限制性和有利的特徵，單獨地或根據所有技術上可能的組合，如下： -將該誤差訊號與校準曲線進行比較，該校準曲線是透過沿該光軸掃描一系列距離處的該位移及計算該系列的每個位置的該聚焦誤差訊號而獲得； -該影像處理系統自適應於確定與該影像中的該點相對應的橢圓且該處理器自適應於由此推導出該橢圓的該長軸V1、該橢圓的該短軸V2的測量值且其中，該聚焦誤差訊號等於4/π.tan -1(V1/V2)-1； -該影像處理系統基於該點影像的主成分分析； -該影像處理系統是基於該點影像中的輪廓的檢測； -該影像處理系統被配置為對該點影像應用濾波以產生濾波影像，確定該濾波影像上該點的最大輪廓並從最大輪廓確定該橢圓； -應用於該點影像以產生濾波影像的該濾波是高斯濾波或形態梯度濾波； -該光學分光器包括具有平面且平行的面的板、具有平面的楔形板或分光立方體； -配置在該光學分光器和該像散光學系統之間的空間遮罩，該遮罩被佈置和配置為遮斷該板中的內反射光束； -該像散光學系統包括：一個柱面透鏡或兩個具有交叉光軸的柱面透鏡，至少一個以非零入射角定向的凹面或凸面球面鏡，至少一個複曲面鏡，至少一個拋物面鏡，至少一個繞其光軸樞轉的簡單透鏡，至少一個偏離該光軸的中心的透鏡，多個柱面透鏡、多個球面透鏡和柱面透鏡，至少一個鮑威爾透鏡、至少一個稜鏡、或微透鏡矩陣； -該裝置包括包括具有尖端的局部探針近場裝置，該近場裝置與聚焦在該尖端上的激發雷射光束組合，該裝置被配置為檢測該樣品、該尖端和該激發雷射光束之間的局部相互作用。
本發明也關於一種共焦拉曼顯微光譜測量方法，包括以下步驟： -發射激發雷射光束， -將顯微鏡物鏡的焦平面中的激發雷射光束聚焦到配置在樣品保持器上的待分析樣品， -透過該顯微鏡物鏡收集由該樣品反射的光束，並將該反射光束透過共焦開口傳送至拉曼光譜儀， -使用自適應於改變該顯微鏡物鏡和該樣品保持器之間的距離的位移系統聚焦在該樣品上，該聚焦步驟包括以下步驟： -使用配置在該顯微鏡物鏡和該共焦開口之間的該光學分光器分離該反射光束，以提取該反射光束的一部分並將其引導至配置在該光學分光器和該像素矩陣影像檢測器之間的像散光學系統，該影像檢測器包括至少NxM個像素，其中N是大於2的整數，M是大於2的整數， -透過該像散光學系統將該反射光束的該部分投射到該影像檢測器上的點上， -取得該影像檢測器上的該點的影像， -處理該影像以計算聚焦誤差訊號並確定包括位移值和方向的聚焦誤差訊號，該聚焦誤差訊號施加到該位移系統以將該激發雷射光束聚焦在該樣品上。
顯然，本發明的不同特徵、替代方案和實施例可以根據各種組合彼此關聯，只要它們彼此不相容或排他即可。
圖1示意性地顯示共焦拉曼顯微光譜測量裝置100。共焦拉曼顯微光譜測量裝置100包括雷射光源1、顯微鏡物鏡3、自適應於容納待分析樣品5的樣品保持器4、共焦開口7和拉曼光譜儀8。顯微鏡物鏡3具有平行於正交XYZ參考系的Z軸配置的光軸6。
裝置100包括位移系統9，其被佈置和配置為修改顯微鏡物鏡3和樣品保持器4之間沿著光軸6的距離。例如，位移系統9包括機動化平台，其自適應於以亞微米空間解析度沿著Z軸移動樣本保持器4。在一示例性實施例中，樣品保持器4安裝在多軸位移台上，以沿著軸X、Y和Z位移樣品5，以便能夠以順序方式在多個位置處對樣品進行拉曼測量。
首先將簡要解釋共焦拉曼微型光譜儀的操作。雷射光源1發射激發雷射光束10。顯微鏡物鏡3將激發雷射光束10朝向樣品5聚焦在焦平面24中。樣品5上點18處的反射產生沿著與激發光束10相反的方向傳播的反射光束。顯微鏡物鏡3收集由樣品反射的光束20。作為非限制性示例，濾波器2使得可以分離激發光束10和反射光束20，以便將反射光束20透過共焦開口7傳輸至拉曼光譜儀8。
根據一特定實施例，拉曼顯微光譜測量裝置還包括具有尖端的局部探針近場裝置。事實上，尖端增強拉曼光譜(Tip-Enhanced Raman Spectroscopy, TERS)可以使用限制在金屬尖端末端處的漸消電磁波(evanescent electromagnetic wave)來放大拉曼訊號(參見專利文獻FR1653182)。近場裝置與聚焦在尖端上的激發雷射光束組合，該裝置被配置為檢測樣本、尖端和激發雷射光束之間的局部相互作用。舉例來說，STM-TERS顯微鏡(或掃描穿隧顯微鏡)結合掃描穿隧顯微鏡和尖端增強拉曼光譜儀。在另一個示例中，AFM-拉曼顯微鏡結合原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)和拉曼光譜儀。存在不同類型的尖端，其適合於每種類型的近場顯微鏡或每個尖端增強光譜裝置的功能，並且可能適合於應用的功能。
裝置100也包括用於聚焦於樣本的系統。這裡的聚焦系統包括配置在顯微鏡物鏡3和共焦開口7之間的反射光束20的路徑上的光學分光器(optical beam splitter)11、像素矩陣影像檢測器13、配置在光學分光器11和影像檢測器13之間的像散光學系統12及包括影像處理系統15和回授裝置16的處理器。光學分光器11被整合到顯微鏡主體上。較佳地，像散光學系統12和影像檢測器13透過對環境光不透明的光學機械安裝件機械連接到顯微鏡主體。因此，包含在其光學機械安裝件中的像散光學系統12和影像檢測器13的模組可以輕鬆安裝在現有的共焦拉曼顯微鏡上。此模組包括例如有線連接，用於向影像檢測器13供電並將由影像檢測器13取得的影像傳輸到處理器以進行影像處理。
更詳細地，光學分光器11包括例如配置在反射光束20的路徑上的板。此板相對於反射光束20的光軸傾斜例如45度。光學分光器11被佈置和配置為提取反射光束的一部分21。光學分光器11例如包括板。在一示範性實施例中，板設有平坦且平行的面。然而，這樣的板容易產生寄生干擾(spurious interference)。作為替代，光學分光器11包括具有平坦面的柱狀板(prismatic plate)。例如，兩個平面之間的角度介於0.5度和10度之間。作為一種選擇，該板在其面向雷射源的一側以及可能在該板的兩個面上具有抗反射塗層。採用抗反射塗層，使得板對反射光束具有高透射係數，並且具有低反射係數以提取一小部分反射光束。
有利地，聚焦系統包括配置在光學分光器11和像散光學系統12之間的空間遮罩17，遮罩17被佈置和配置為遮斷板中的內反射光束。特別地，當光學分光器11包括具有平坦且平行或柱狀面的板時，反射光束在板內部的內反射容易透過產生寄生干涉而擾亂點影像。光束為單色雷射光束，來自板的直接折射和內反射的光束彼此相干，因此當兩束光束疊加在影像檢測器上時形成干涉。有利地，遮罩17被佈置和配置在分光板11的輸出處，以便遮斷已經在板中經歷內反射的光束的一部分，同時僅讓在面向顯微鏡物鏡的板的面上的反射光束通過。
遮罩17使得抑制影像檢測器13上的點影像中的寄生干擾為可能。作為非限制性示例，板11是平均厚度為5mm、具有平行面且沒有抗反射塗層的玻璃板。此板相對於反射光束20傾斜45度。該板有利地具有例如反射光束20的3%的反射係數。這樣，光學分光器11只接收反射光束的一小部分，而反射光束的主要部分透射通過板以被引導向共焦開口7和拉曼光譜儀8。
作為替代，光學分光器11包括分光立方體。
在所有示例性實施例中，光學分光器11提取反射光束的一部分21以將其引導至像散光學系統12。
像散光學系統12例如包括柱面透鏡(cylindrical lens)。作為替代，像散光學系統12包括串聯配置在光路上的兩個柱面透鏡，並且它們的光軸彼此交叉，即彼此垂直並且垂直於反射光束的部分21的光軸。作為替代或補充，像散光學系統12包括至少一個以非零入射角定向的凹面或凸面球面鏡、至少一個複曲面鏡(toric mirror)、至少一個拋物面鏡、至少一個繞光軸旋轉的簡單透鏡、至少一個偏離光軸中心的透鏡、多個柱面透鏡、多個球面和柱面透鏡、至少一個鮑威爾透鏡(Powell lens)、至少一個稜鏡、或微透鏡矩陣。有利地，像散光學系統12放置在距顯微鏡物鏡約20cm的光學距離。在一個示例中，使用兩個串聯排列的平凸柱面透鏡，焦距為50mm，放置在距離顯微鏡物鏡20cm的位置。
像散光學系統12配置在距影像檢測器13固定距離處。像散光學系統12被配置為將反射光束的部分21投射到影像檢測器13上的點。影像檢測器13為像素矩陣類型，且包含至少NxM個像素，其中N為大於2的整數，M為大於2的整數。例如，影像檢測器13是包含3088*2064像素的相機。影像檢測器13包括例如放置在距離像散光學系統45mm處的Basler攝影機。影像檢測器包括例如CCD類型的相機，其能夠以50Hz(即每20ms)的頻率擷取影像。
圖2示意性地示出像散光學系統12的操作。為解釋圖2，我們假設樣本在點18處包括由激發光束10照射的十字。這裡，未示出顯微鏡物鏡3。像散光學系統沿著切向軸和矢狀(sagittal)軸具有不同的光焦度(optical power)。像散光學系統形成點18的影像。十字的一個分支的圖像在矢狀平面S中是清晰的，而十字的另一個分支的圖像在切面T中是清晰的。矢狀平面和切面沿著光束的縱向光軸彼此相距距離D。因此，當影像檢測器13位於切面T時，十字的影像例如在水平分支上是清晰的，而在十字的垂直分支上是模糊的。相反，當影像檢測器13位於矢狀平面S時，十字的影像在垂直分支上清晰，而在十字的水平分支上模糊。當影像檢測器13位於切面T和矢狀面S的中間時，十字影像在兩個分支上具有相同的清晰度。
如上所述，影像檢測器13配置在與像散光學系統12固定距離處。例如，像素矩陣影像檢測器13配置在與顯微鏡物鏡的焦平面24光學共軛的矢狀平面S和切面T中間。有利地，影像檢測器的像素線平行於矢狀軸且像素列平行於像散光學系統12的切向軸。透過顯微鏡物鏡3以激發光束10照射樣品，以形成來自圓形點18的反射光束20。影像檢測器13被配置為取得透過像散光學系統12的反射光束的部分21形成的點的影像14。當樣本的點18位於顯微鏡物鏡3的焦平面24中時，影像檢測器13上的點影像14是圓形的。相反，當樣本的點18相對於顯微鏡物鏡3的焦平面24偏移距離Z時，影像檢測器13上的點影像14通常具有橢圓形形狀。距離Z也稱為聚焦誤差。橢圓的方向會根據相對於焦平面24的聚焦誤差的符號而改變。
與大多數自動聚焦系統相反，這裡，相同的雷射光源1用於共焦拉曼測量和聚焦。這種配置提供幾個優點。首先，這種配置使得能夠精確地聚焦到共焦拉曼顯微光譜測量的測量點。與其他自動對焦系統相反，使用相同的雷射光源還可以避免另一個光源對拉曼訊號的任何干擾。此外，可以在測量期間或剛好測量之前進行聚焦，從而大大縮短聚焦的持續時間。與先前的自動對焦系統相反，此解決方案不需要預先掃描。此外，聚焦誤差符號的確定使得可以確定要應用的回授方向和值，這使得與其他現有技術相比能夠更快地聚焦。
圖3示出影像檢測器13所取得的點影像14的示例。投射到影像檢測器13的反射光束的部分21在此形成點雲19，在此由清晰背景上的灰點表示。
影像14被傳送到處理器的影像處理系統15。
根據本公開，點影像14的分析使得可以計算接近檢測到的影像中的點形狀的橢圓的參數並且由此推導出聚焦誤差訊號，表示為FES。橢圓的長軸表示為V1，橢圓的短軸表示為V2，且橢圓的長軸與影像檢測器13的像素的X軸之間的角度表示為ALPHA。
聚焦誤差訊號取決於V1/V2比率，其公式如下：FES=4/π.tan -1(V1/V2)-1。聚焦誤差訊號包括在值-1和值+1之間。對於完美的像散光學系統和非漫反射樣品，當顯微鏡處於最佳焦點時，點18的影像是圓形的，對應的FES值為0。
圖4示出作為樣品的點18相對於顯微鏡物鏡3的焦點24的距離的函數的聚焦誤差訊號FES的理論曲線23。當樣品上的照射點18位於與像散光學系統12的矢狀平面或切面光學共軛的平面中時，聚焦誤差訊號FES位於曲線23的A點、B點。在點A和B之間，可以透過反轉曲線23，基於聚焦誤差訊號確定樣本相對於最佳聚焦點(FES=0)的位置。因此，可以計算沿著光軸6施加到位移系統9以將激發雷射光束10聚焦在樣本上的位移值和方向。特別有利的是，在點C1和C2之間延伸的長度L的聚焦區域對應於FES變化為線性的軸向位移。L是針對給定放大倍率計算的。曲線23可以針對具有反射表面的樣品獲得，例如拋光的矽晶圓、拋光的金屬板或平板玻璃。
對於由焦距為50mm的第一柱面透鏡和焦距為50mm的第二柱面透鏡組成的像散光學系統12，其放置在距顯微鏡物鏡x100的光學距離20cm處，工作區域表示Δz，曲線23上的A點和B點之間沿Z軸約為8μm。在「最佳焦點」位置，光學計算軟體(例如Zemax)可以評估最佳焦點處雷射點的直徑(FES=0)。
然而，相同的原理可用於不同的物鏡，位移範圍適應於顯微鏡物鏡的放大倍率的函數。因此，對於顯微鏡物鏡x50，沿著Z軸的工作區域Δz約為39 μm。對於顯微鏡物鏡x10，沿著Z軸的工作區域Δz約為1000 µm。最後，使用顯微鏡物鏡x5，沿著Z軸的工作區域Δz約為3700 µm。
基於橢圓的參數，處理器使得可以計算聚焦誤差訊號FES。預先校準聚焦誤差訊號以獲得曲線23，該曲線一方面取決於顯微鏡物鏡和像散光學系統，另一方面取決於所考慮的樣品，特別是其表面粗糙度。基於聚焦誤差訊號FES和校準曲線23的計算，處理器計算要施加到位移系統9的回授訊號，以改變顯微鏡物鏡3與樣品架4之間沿光軸6的距離，將樣品置於最佳焦點(FES=0)處。因此，可以利用單一位移來執行激發雷射光束的聚焦。然後立即在點18處執行拉曼測量，該點對應於最佳焦點(FES=0)，無需更改光學系統且無需更改光源(並且無需移動XY工作台)。因此，聚焦非常快：可以在不到一秒的時間內完成，例如200毫秒或300毫秒內。
現在將描述能夠確定橢圓的參數的不同影像處理方法。
在第一實施例中，使用「主成分分析」(Principal Component Analysis, PCA)。PCA是一種使用協方差(covariance)矩陣測量每個變數(此處為像素)與其他變數(此處為影像的其他像素)如何關聯的方法，協方差矩陣包括使用特徵向量(eigenvector)的資料傳播方向。特徵值是應用於特徵向量的係數，它賦予向量長度。主成分分析在此適於確定由影像檢測器13所取得的點影像14的橢圓的參數。
更精確地說，採用基於OTSU演算法的自適應臨限值來消除影像14中不夠亮的像素。得到強度大於或等於臨限值的座標(X，Y)的像素列表，此列表對應於點的像素。這裡參數(X，Y)是影像檢測器13的像素座標。
主成分是資料的協方差矩陣的特徵向量。協方差矩陣是一個方陣，給出應用自適應臨限值後X和Y之間的協方差。
設A為由矩陣A表示的線性變換。如果存在向量使得 A X=λ X 則 λ 稱為A的特徵值以及對應的(右)特徵向量X。
計算特徵向量並依特徵值排序。
如此確定的兩個特徵值是： • V1最大特徵值，對應於橢圓的長軸，且 • V2最大特徵值，對應於橢圓的短軸。
然後，計算橢圓長軸相對於水平面(在影像檢測器13上)的角度ALPHA：
其中rad2deg表示角度從弧度到度的轉換。
像素(先前選取的列表X，Y)的協方差矩陣表示為A。
所得的比率V1/V2是橢圓的長軸與短軸的比值。
若角度ALPHA小於90度，則V1和V2的值不變。如果角度ALPHA大於90度，則V1和V2的值互換。
圖5示出透過PCA方法處理點的影像14的示例。圖5A)顯示一個矩形框，其中內切有點，以及由PCA演算法確定一個長軸V1、短軸V2和角度ALPHA的橢圓。矩形框包圍橢圓。在圖5的影像5B)中示出由影像檢測器所取得的點影像的區域的縮放，其中所獲取的像素的強度對應於內切點的框框。換句話說，影像5B對應於被裁剪以去除所有像素的強度低於臨限值的區域的原始影像。所有最亮的像素(即強度高於或等於臨限值)都位於框內。在影像5A)中，該矩形框以及疊加到該框的PCA確定的橢圓的可視化使得可以直觀地驗證橢圓參數的計算。
主成分分析(PCA)使得可以獲得良好的結果，特別是對於具有反射表面的樣品，例如拋光的矽晶片、拋光的金屬板或平板玻璃。
在第二實施例中，使用另一種影像處理演算法。圖6示意性地示出根據第二實施例的方法的各個步驟。此方法包括使用影像檢測器13取得點影像14的第一步驟30。該第一步在任何實施例中都是相同的。
然後，對點影像14應用濾波步驟40，例如高斯濾波，以獲得濾波影像。這種過濾透過模糊影像的各個部分來使它們變得均勻，從而協調影像的細節。
作為一個選項，過濾步驟40包括自適應臨限值排序的步驟45。步驟45包括例如為經濾波的影像建構像素強度直方圖，例如在從0延伸到255的標度上。直方圖通常有兩個峰值：第一個峰值對應於最暗的像素，第二個峰值對應於最亮的像素(即點)。然後，僅保留第2個峰值，將第2個峰值中的像素強度設為255，將所有其他像素的強度設為0。由此獲得自適應排序濾波影像。
在步驟50，然後將影像處理步驟套用於濾波後的影像，或分別應用於適應排序的濾波後的影像，以確定點的最大輪廓。為此，使用例如OpenCV庫的FindContours函數計算所有可能的輪廓，所得輪廓按區域排序，並保留按區域排列的最大輪廓。
在步驟60，使用OpenCV函式庫的fitEllipse函數確定接近最大輪廓的橢圓。該演算法在Andrew W. Fitzgibbon, R.B.Fisher出版物中進行描述。買家的圓錐曲線擬合指南，Proc，第五屆英國機器視覺會議，伯明翰，第513-522頁，1995年。推導出該橢圓的參數ALPHA、V1和V2。
在步驟70，計算比率V1/V2並由此推導出聚焦誤差訊號FES。
作為一個選項，透過圍繞點的框的方法以考慮所有點像素的方式對橢圓參數V1和V2計算進行驗證(關於第一實施例描述)。
在步驟75，處理器計算要施加在位移系統9的回授訊號。
在步驟80，位移系統改變顯微鏡物鏡3和樣品保持器4之間沿著光軸6的距離，以將樣品放置在最佳焦點處(FES=0)。
在步驟90，樣本處於最佳焦點(FES=0)並且在焦點處取得拉曼光譜測量。
視情況而定，在步驟95，位移系統改變激發雷射光束在樣本上的(X，Y)位置。在新的測量點重複聚焦方法。
圖7示出根據第二實施例的處理點影像的主要步驟的示例。影像7A)示出由影像檢測器13取得的點影像14。影像7B)示出對影像6A)應用高斯濾波器(步驟40)之後所獲得的濾波影像。影像7C)示出在對濾波後的影像7B)應用自適應排序(步驟45)之後所獲得的影像。影像7D)示出在計算濾波影像中的最大輪廓的步驟50之後獲得的最大輪廓(並且可能透過自適應排序來排序)。影像7E)示出在步驟60確定的接近最大輪廓的橢圓。影像7F)將產生的橢圓與該點周圍的矩形框進行比較。
根據第二實施例的影像處理方法，在反射樣本上給出比第一實施例更好的結果。然而，在操作範圍的末端(圖4的曲線23上的點A和B)可能難以確定輪廓。
根據第二實施例的變型，自適應臨限值排序步驟45被形態梯度(morphological gradient)步驟46取代。形態梯度是膨脹和侵蝕之間的差異。
膨脹在於將影像A與核(kernel)(B)進行卷積，核可以有任何形狀或尺寸，通常是正方形。核B有一個定義的錨定點，通常是內核中心。
當在未濾波的影像上掃描核B時，計算核B覆蓋的最大像素值，並用該最大值取代錨定點的位置處的影像像素。膨脹操作的效果是使影像的發光區域增大。
侵蝕與擴張相反。侵蝕基於給定核的表面上局部最小值的計算。
當在膨脹影像上掃描核B時，計算B覆蓋的最小像素值，並且用該最小值替換錨定點下方的影像像素。透過計算擴張影像的像素值與侵蝕影像的像素值之間的差值來獲得所謂的「形態梯度」影像。
以下步驟類似。
第二實施例的替代實施例給出非常好的結果，特別是對於反射樣品，而且對於粗糙或散射樣品，例如藥物錠劑和岩石。
根據本揭露的處理使得可以獲得低於物鏡景深的具有優異準確度的聚焦。圖8顯示使用x100物鏡時聚焦誤差訊號(FES)與沿光軸的聚焦誤差的函數關係的實驗曲線。例如，使用景深為190 nm的x100物鏡，沿著Z軸可獲得40 nm量級的聚焦準確度。而且，對焦非常快。一步獲得具有位移值和方向的聚焦誤差訊號的計算結果，並將其施加到位移系統。根據所使用的位移系統的類型、要進行的位移的值以及可達到的位移速度，可以在小於一秒內，例如在200ms至500ms內進行聚焦。本揭露的聚焦系統和方法既非常準確又非常快速。即使在高顯微鏡物鏡放大倍率(例如x50或x100)下，聚焦系統和方法也能給出良好的結果，其中反射光束仍然高度發散。
100:共焦拉曼顯微光譜測定裝置 1:雷射光源 3:顯微鏡物鏡 5:樣品 4:樣品保持器 7:共焦開口 8:拉曼光譜儀 6:光軸 9:位移系統 10:光束 24:焦平面 20:光束 2:濾波器 11:光學分光器 12:像散光學系統 13:影像偵測器 15:影像處理系統 16:回授裝置 21:部分 17:遮罩 18:點 C:影像 D:影像 E:影像 F:影像 G:影像 H:影像 14:影像 19:雲 V1:長軸 V2:短軸 ALPHA:角度 23:曲線 C1:點 C2:點 L:長度 Δz:工作區域 30:步驟 40:步驟 45:步驟 50:步驟 60:步驟 70:步驟 75:步驟 80:步驟 90:步驟 95:步驟 Z:距離 S:矢狀平面 T:切面
此外，本發明的各種其他特徵從參考示出本發明的非限制性實施例的附圖進行的所附描述中顯現出來，並且其中：
[圖1]為本發明具有聚焦系統的共焦拉曼光譜儀的示意圖；
[圖2]是透過像散(astigmatic)透鏡形成十字影像的立體圖；
[圖3]是結合像散光學系統的影像檢測器上反射點的影像示例；
[圖4]是示出聚焦誤差訊號(focusing error signal, FES)作為沿光軸的散焦的函數的理論曲線；
[圖5]示出對點影像進行主成分分析的方法，以檢測運動的輪廓(圖A)和點的放大圖(圖B)為例；
[圖6]示意性地示出分析點影像的第二種方法的不同步驟；
[圖7]顯示圖6的方法中，在點影像上(影像7A)、在高斯濾波之後(影像7B)、自適應臨限值排序之後(影像7C)、確定最大輪廓後(影像7D)、透過橢圓近似最大輪廓(影像7E)、透過點周圍的方塊進行檢查(影像7F)的應用示例；
[圖8]是聚焦誤差訊號(FES)作為沿光軸的聚焦誤差的函數的實驗曲線。
1:雷射光源
2:濾波器
3:顯微鏡物鏡
4:樣品保持器
5:樣品
6:光軸
7:共焦開口
8:拉曼光譜儀
9:位移系統
10:光束
11:光學分光器
12:像散光學系統
13:影像偵測器
14:影像
15:影像處理系統
16:回授裝置
17:遮罩
18:點
20:光束
21:部分
24:焦平面
100:共焦拉曼顯微光譜測定裝置
X,Y:軸
Z:距離

Claims (12)

  1. 一種共焦拉曼顯微光譜測量裝置(100)，包括： 雷射光源(1)，自適應於發射激發雷射光束(10)； 樣品保持器(4)，自適應於接收待分析樣品(5)； 顯微鏡物鏡(3)，具有光軸(6)，其被配置為接收該激發雷射光束(10)並將其聚焦在朝向該樣品(5)的焦平面(24)中； 該顯微鏡物鏡(3)自適應於收集由該樣品反射的光束(20)並且將該反射光束透過共焦開口(7)傳送至拉曼光譜儀(8)； 位移系統(9)，自適應於改變該顯微鏡物鏡(3)和該樣品保持器(4)之間沿該光軸(6)的距離；以及 系統，用於聚焦該樣本； 其特徵在於： 該聚焦系統包括； 光學分光器(11)，設置在該顯微鏡物鏡(3)和該共焦開口(7)之間的該反射光束(20)的路徑上； 像素矩陣影像檢測器(13)，包括至少NxM個像素，其中，N是大於2的整數且M是大於2的整數； 像散光學系統(12)，設置在該光學分光器(11)和該影像檢測器(13)之間以及處理器，包含影像處理系統(15)和回授裝置(16)； 該光學分光器(11)自適應於擷取該反射光束的一部分(21)，該像散光學系統(12)自適應於將該反射光束的該部分(21)投射到該影像檢測器(13)上的點，該影像檢測器(13)被配置為獲取該點的影像(14)，並且該影像處理系統(15)自適應於計算聚焦誤差訊號，並且該回授裝置(16)自適應於從該聚焦誤差訊號中推導出沿該光軸(6)施加到該位移系統(9)的位移值和方向，以將該激發雷射光束(10)聚焦在該樣品(5)上。
  2. 根據請求項1所述的裝置，其中，將該誤差訊號與校準曲線(23)進行比較，該校準曲線是透過沿該光軸掃描一系列距離處的該位移及計算該系列的每個位置的該聚焦誤差訊號而獲得。
  3. 根據請求項1或2所述的裝置，其中，該影像處理系統(15)自適應於確定與該影像(14)中的該點相對應的橢圓且該處理器自適應於由此推導出該橢圓的該長軸V1、該橢圓的該短軸V2的測量值且其中，該聚焦誤差訊號等於4/π.tan -1(V1/V2)-1。
  4. 根據請求項3所述的裝置，其中，該影像處理系統(15)是基於該點影像(14)的主成分分析。
  5. 根據請求項3所述的裝置，其中，該影像處理系統(15)是基於該點影像(14)中的輪廓的檢測。
  6. 根據請求項3所述的裝置，其中，該影像處理系統(15)被配置為對該點影像(14)應用濾波(40)以產生濾波影像，確定該濾波影像上該點的最大輪廓(50)並從該最大輪廓確定該橢圓(60)。
  7. 根據請求項6所述的裝置，其中，應用於該點影像以產生濾波影像的該濾波(40)是高斯濾波或形態梯度濾波。
  8. 根據請求項1至7中任一項所述的裝置，其中，該光學分光器(11)包括具有平面且平行的面的板、具有平面的楔形板或分光立方體。
  9. 根據請求項8所述的裝置，包括：配置在該光學分光器(11)和該像散光學系統(12)之間的空間遮罩(17)，該遮罩被佈置和配置為遮斷該板中的內反射光束。
  10. 根據請求項1至9中任一項所述的裝置，其中，該像散光學系統(12)包括：一個柱面透鏡或兩個具有交叉光軸的柱面透鏡，至少一個以非零入射角定向的凹面或凸面球面鏡，至少一個複曲面鏡，至少一個拋物面鏡，至少一個繞其光軸樞轉的簡單透鏡，至少一個偏離該光軸的中心的透鏡，多個柱面透鏡、多個球面和柱面透鏡，至少一個鮑威爾透鏡、至少一個稜鏡、或微透鏡矩陣。
  11. 根據請求項1至10中任一項所述的裝置，包括具有尖端的局部探針近場裝置，該近場裝置與聚焦在該尖端上的該激發雷射光束組合，該裝置被配置為檢測該樣品、該尖端和該激發雷射光束之間的局部相互作用。
  12. 一種共焦拉曼顯微光譜測量方法(100)，包括以下步驟： -發射激發雷射光束(10)， -將顯微鏡物鏡(3)的焦平面(24)中的該激發雷射光束(10)聚焦到配置在樣品保持器(4)上的待分析樣品(5)， -透過該顯微鏡物鏡(3)收集由該樣品反射的光束(20)，並將該反射光束透過共焦開口(7)傳送至拉曼光譜儀(8)， -使用自適應於改變該顯微鏡物鏡(3)和該樣品保持器(4)之間的距離的位移系統(9)聚焦在該樣品上，該聚焦步驟包括以下步驟： -使用配置在該顯微鏡物鏡(3)和該共焦開口之間的該光學分光器(11)分離該反射光束，以提取該反射光束的一部分(21)並將其引導至配置在該光學分光器(11)和該像素矩陣影像檢測器(13)之間的像散光學系統(12)，該影像檢測器(13)包括至少NxM個像素，其中N是大於2的整數，M是大於2的整數， -透過該像散光學系統(12)將該反射光束的該部分(21)投射到該影像檢測器(13)上的點上， -取得該影像檢測器(13)上的該點的影像(14)， -處理該影像(14)以計算聚焦誤差訊號並確定包括位移值和方向的聚焦誤差訊號，該聚焦誤差訊號施加到該位移系統(9)以將該激發雷射光束(10)聚焦在該樣品(5)上。
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